Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение моноклональных антител к питомегаловирусу человека и их применение для изучения питомегаловирусной инфекции

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение моноклональных антител к питомегаловирусу человека и их применение для изучения питомегаловирусной инфекции"

РГ6 од

На' правах рукописи

¡МАКАРОВА Наталья Евгеньевна

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К 1ШТОМЕГАЛОВИРУСУ ЧЕЛОВЕКА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ЛЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ПИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКПИИ

03.u0.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва. 1695

Работа выполнена в НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ

профессор, доктор биологических наук

А.А.Кущ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

профессор, доктор медицинских наук доктоэ биологических наук

Г.Т.Сухих М.Л.Христова

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: /

Институт эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалии РАМН, г.Москва

•

Зашита диссертации состоится "чк41<л1995г. в ¡Ь' час. на заседании Специализированного Совета Д 001.20.01 НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН (123098. Москва, ул.Гамалеи.16).

Автореферат разослан

»0*5»

1995г.

Ученый Секретарь Специализированного Совета, доктор медицинских наук

Н.П.Косякова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Цитомегаловирус человека (ЦМВ) является причиной многих тяжелых заболеваний, приводящих к серьезным последствиям и нередко к смерти: у новорожденных - вследствие вертикальной трансмиссии, инфицирования в постнатальный период (Демидова и др.,1976; Alt' ord et al.,1981); v взрослых пациентов - в состоянии иммунной супрессии (у больных с синдромами иммунодефицита, после трансфузии, трансплантации органов) (Чешик и др.,1990; Но,1991).

Широкое распространение ЦМВ среди населения, отсутствие типичных симптомов, частое течение цитомегаловирусной инфекции без клинических проявлений делают актуальной проблему быстрой специфичной диагностики цитомегалии.

Моноклональные антитела (МКА), направленные к вирусным антигенам, обладающие высокой специфичностью и гомогенностью, оптимально подходят для выявления вирусных антигенов, а также являются экспериментальным инструментом при изучении структуры и функции вирусных белков. Наиболее эффективным иммунобиотехнологическим препаратом для лабораторной диагностики цитомегалии являются, по мнению исследователей, МКА к сверхранним белкам вируса, которые позволяют выявлять ЦМВ на самых ранних стадиях инфекции ISwenson and Kaplan,1985; Sinzger et al.,1983).

В нашей стране в настоящее время не выпускаются коммерческие антитела, позволяющие эффективно и с высокой чувствительностью выявлять антиген ЦМВ. В тоже время такие препараты необходимы для диагностики и мониторинга цитомегалии, так как широко используемые серологические тесты для определения специфических антител к ЦМВ не являются достаточными и эффективными для постановки диагноза (Stagno et al.,1984: Weber,1993).

Способность ЦМВ вызывать латентную и персистентную инфекции в организме человека <Rapp,1983), возможная связь с онкогенными заболеваниями (Giraldo et al., 1980; Stevenson and Macnab, 1989), строгая видовая специфичность вызывают интерес к изучению взаимодействия вируса и клетки хозяина. Отсутствие адекватной модели ЦМВ-инфекции на экспериментальных животных затрудняет или делает невозможным изучение ЦМВ инфекции in vivo в настоящее время. В связи с этил важное значение приобретает анализ биохимических и биологических процессов, происходящих при раз.личных формах ЦМВ инфекции, развивающихся в пермиссивных и не-пермиссивных клеточных культурах. Такие данные необходимы для понимания природы патогенеза ЦМВ инфекции человека.

Цель U задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение моноклональных антител (МКА) к сверхранним белкам цитомегаловируса человека (ЦМВ) и разработка на их основе методов детекции вирусных белков, а также сравнительное исследование действия ЦМВ на пермиссив-ные и непермиссивные клеточные культуры in vitro.

Для достижения этой цели ставились следующие задачи: 1.Получить гибридомные линии, стабильно продуцирующие МКА, направленные к белкам ЦМВ.

".Определить специфичность МКА в отношении белков, кодируемых сверхранними генами ЦМВ.

3.Изучить свойства МКА в различных иммунологических реакциях.

4.Установить возможность использования МКА для идентификации антигена ЦМВ после заражения клеток пермиссивной культуры клиническим материалом.

5.Провести сравнительный цитоморфологический и иммуноцитохимический анализ действия ПМВ на пролиферацию пермиссивных и непермиссивных клеток.

Основные положения, выносите на ащиту.

1.Получены гибридомы, продуцирующие МКА, активно взаимодействующие с антигеном ПМВ в иммунохимических и иммунологических реакциях и специфичные к сверхраннему вирусному белку - 1Ер72.

2.Показана принципиальная возможность использования полученных МКА для выявления ЦМВ в инфицированных клетках.

3.Выявлены различия в действии ЦМВ на пролиферацию пермиссивных и непермиссивных клеток.

Яаутаая новизна и практическая ценность.

[.Получены гибридомы, продуцирующие МКА, направленные к белкам ЦМВ. Установлена специфичность МКА в отношении сверхраннего белка 1Ер72 ЦМВ.

".Показана возможность использования полученных МКА для детекции антигена ЦМВ иммуноцитохимическими методами как в модельных клеточных системах, так и в инфицированных клетках человека. 3.Впервые, показано, что ЦМВ индуцирует нарушения хромосом, формирование К-митозов и остановку деления пермиссивных клеток при сохранении двухполюсного веретена деления. Это означает, что механизм формирования К-митозов под действием ЦМВ не связан с повреждением фибриллярного компонента аппарата деления.

Апробация диссертации. Материалы диссертационной работы были представлены на Международной европейской конференции по клинической вирусологии (Швеция. 1994г.), на Международной конференции по клеточной биологии (Германия. 1995г.i и на Пятой международной конференции по цитомегаловирусу (Швеция. 1995); фрагменты работы докладывались на ученом совете Института медицинской микробиологии и эпидемиологии Университета г.Лейпцига (Германия. 19у4г.>. Б завершенном виде диссертационная работа прошла предварительную экспертизу на заседании отдела ''Молекулярная вирусология" НИИ вирусологии им.Л.И.Ивановского РАМН 11 мая 1995 года.

Публикация результатов исслелования. Основные положения диссертации отражены в трех опубликованных научных работах, одна статья принята в печать и будет опубликована в 1у95 году.

Структура и объем работ. Лиссертационная работа состоит иs введения, обвора литературы (4 глаЕЫ). описания материалов и методов, результатов собственных исследований (4 главы), обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включашего 329 источников отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 164 стоаницач машинописного текста, содержит в таблиц и 17 рисунков.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИМЫ И МЕТОДЫ

Лля проведения исследований использовали штамм aD 169 цитомегадови-оуса 111МБi человека, любезно поедсставленный про®. D. Emanuel. 3ioan Kettering Cancer Center. N.Y. . США.

Б работе были применены следующие клеточные культуры: первично трип-синивированные Фибробласты легкого эмбрионов человека (ФЛЭЧ''>. перевиваемая линия почек африканской зеленой мартышки Vero, мышиная миелома NS0. Культивирование клеток осуществлялось общепринятыми методами.

Культивирование вируса и определение индаекиионной активности проводили по стандартным методикам.

Зля иммунизации мышей BALE/с использовали лизат ПМВ-инфицированных клеток '1'ЛЭЧ и ядерную Фракцию зараженных клеток.

Гибридизацию клеток миеломы со спленоиитамн гипериммунных мышей для получения гибридомных культур проводили по метолу, предложенному Kohler arid Milstein iiü75').

- б -

Выделение иммуноглобулинов (Ig) из АЖ проводили путем высаливания 50% раствором сульфата аммония с последующей хромотографией на протеин А-сефарозе.

Определения концентрации белка в препаратах проводили по методу Bredford et al. (1984).

Специфичность МКА в отношении белков ПМВ проводили методом иммуноб-лота i'Towbin et al.,1979).

Реакцию твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА) осуществляли в соответствии с методом Engvall and Perlmann (1978). Для сенсибилизации на твердую фазу наносили внеклеточный вирусный антиген. В ряде опытов использовали панели из иммуноферментной тест-системы на антитела к ЦMB "Enzygnost Anti-CMY/IgS" (фирмы Behring, Германия).

Приготовление конъюгатов МКА с пероксидазой хрена проводили методом перийодатного окисления по Wilson and Nakane. 1978.

Константы связывания определяли по методу Schots et al. (1988).

Конкурентный твердофазный иммуноферментный анализ был выполнен по стандартному протоколу с использованием антигена, сорбированного на дно панелей из коммерческой диагностической иммуноферментной тест-системы на антитела к ПМВ "Enzvgnost Anti-CMV/IgG".

Определение субкласса МКА и типа легких цепей в составе Ig проводили методом тИФА с помощью набора "Mouse-Hybridoma-Subtyping Kit" (фирма Boehringer Mannheim, Германия),

Морфологический анализ митотических клеток выполняли на цитологических препаратах клеток, окрашенных карболовым фуксином.

Непрямой иммунофлюоресцентный анализ клеток (нИФ) и клеточный вариант ИФА осуществляли стандартными методами.

Выделение лейкоцитов из периферической крови здоровых и больных людей проводили по методу van der Bij et al.(1988).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение гибридомных клеточных линий, продуцирующих МКА к белкам 4MB, скрининг ашшпел. В результате серии опытов по гибридизации клеток миеломы NS0 со спленоцитами мышей, иммунизированных согласно различным протоколам, были отобраны 26 гибридомных культур, продуцирующих МКА к белкам ЦМВ. Скрининг гибридомных культур на присутствие антител к белкам ЦМВ проводили методом тИФА при сорбировании внеклеточного вирусного антигена на дно 96-луночных панелей. Дополнительно использовали метод нИФ, позволяющий выявлять антитела к сверхранним и ранним вирусным белкам. Титр МКА в культуральной жидкости для продуцирующих клонов варьировал от 1:4 до 1:16 в реакции нИФ и от 1:10 до 1:50 - в

реакции тИФА (таблица 1). Стабильность продукции антител была подтверждена при получении массовых культур гибридом вплоть до их криокон-сервации.

Асцитные жидкости (AS) были получены от всех 26 гибридомных культур. Продукция МКА гибридомными клетками повьшалась при их культивировании in vivo в брюшной полости мышей BALB/c. Титры специфических антител в АЖ увеличивались в 2,5-20 раз по сравнению с титрами в культуральной жидкости в реакции нИФ и в 20-4000 - в реакции тИФА (таблица 1).

Изучение свойств полученных МКД. Активность МКА в реакциях нИФ и ггМФА. Взаимодействие полученных МКА с зараженными клетками было изучено в реакции нИФ. Опыты показали, что все клоны продуцируют AT, способные окрашивать клетки ФЛЭЧ, инфицированные ЦМВ. В качестве контроля были использованы незараженные клетки. Об активности МКА в реакции нИФ судили по титру AT как в КЖ, так и АЖ. Наибольшей активностью обладали AT F1-A5, F1-B8 и F3-D5 (таблица 1).

Ряд клонов продуцировали МКА, взаимодействующие с белками ЦМВ в реакции тИФА при сорбции внеклеточного вирусного АГ на твердую фазу. Титры AT, проявляющих активность в реакции тИФА, указаны в таблица 1.

МКА, обладающие наиболее высоким титром в реакции тИФА (F1-A6, F2-E7, F2-F4 и F4-B8), были проанализированы на специфичность в реакции конкурентного тИФА с поликлональной человеческой сывороткой, содержащей AT к ЦМВ. Опыты показали, что поликлональная сыворотка подавляет активность AT клонов F2-E7, F2-F4 и F4-B8, что указывает на ви~ русспецифическую направленность данных МКА. Антитела клона F1-A6 не конкурировали с использованными поликлональными AT за связывание с вирусным АГ. Вероятно, МКА клона F1-A6 направлены к АГ зпитопу, не вступающему во взаимодействие с использованными поликлональными AT.

10 типов МКА были проанализированы на специфичность и активность взаимодействия с белками ЦМВ в реакции тИФА с использованием панелей, сенсибилизированных АГ ЦМВ, из диагностической иммуноферментной тест-системы Enzygnost Anti-CMV/IgG фирмы Behring. Результаты показали, что 5 из изученных АГ не проявляли активность в указанной тест-системе, тогда как три МКА (F1-B8, F1-A5 и F3-D5) обладали наибольшей активностью в данной реакции (таблица 1). Нельзя исключить, что МКА Fi-All, F1-C5, F2-C5 не взаимодействуют с внеклеточным АГ ЦМВ в тИФА в следствие слабой активности (максимальный титр в нИФ 1:10). В тоже время МКА Fl-Dl, F2-E7, F3-D8, F4-D11, обладая практически такой же активностью в нИФ, реагируют с АГ ЦМВ в тИФА.

В общей сложности 12 из 26 полученных МКА взаимодействовали с ЦМВ в реакции тИФА при сорбции либо внеклеточного вирусного АГ, либо антигена

ТАБЛИПА 1. ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

N/11 клон нИФ ТЙФА

КЖ АЖ внеклеточный вирусный коммерческая антиген.титр система.титр

КЖ АЖ АЖ

1 П-А5 1: 16 1 160 - 10~б

£ Р1-А6 1: 8 1 100 1: 50 5'10~4 -

3 И-А'И 1: 2 1 10 - -

.4 Р1-В8 1: 16 1 320 - иг7

5 РА-СБ 1: 2 1 10 - -

б Г1-С10 1: 2 1 20 - Н/И

7 Р1-П1 1: 4 1 20 1: 10 2-Ю"2 н/'и

8 П-Н4 •1: 4 1 10 - н/'и

У Р2-А11 1: 2 1 20 - н/и

10 Р2-С5 1: 2 1 10 - -

11 Р2-Е7 ■1: 8 1 20 1: 20 6-Ю"3 н/'и

12 Р2-Р4 1: 4 1 50 1: 50 2'10~5 н/и

13 РЗ-В6 1: 2 1 40 - 10~3

14 РЗ-В8 1: 2 1 10 - н/и

15 73-05 1: 16 1 320 - кг7

16 РЗ-Ш 1: 4 1 20 1: 10 З'Ю""2 н/'и

17 РЗ-С11 1: О 1 20 - н/и

18 Р4-АЗ 1: о с 1 10 - н/'и

19 Р4-В5 1: 2 1 10 - н/'и

20 Р4-В7 1: 4 1 10 - н/'и

21 Р4-В8 1: 2 1 20 1: 50 4-Ю'4 н/и

22 Р4-Ю10 1: 4 1 80 - ю~2

23 Р4-Ш'1 1: 4 1 20 1: 10 3-ю"2 н/и

24 Р4-С5 1: 4 1 40 - н/и

25 Р4-Р5 1: 2 1 20 - н/и

26 Р4-Е7 " 1: 4 1 40 - _

отрицательная реакция н/'и не исследовали

ПМВ, внесенного в лунки коммерческой тест-системы фирмы Behring (таблица Г). При этом 5 типов МКА проявляли активность только в одном из двух вариантов тйФА. Этот факт скорее всего связан с различной формой АГ, используемого для сенсибилизации твердой фазы. Можно предположить, что во внеклеточном АГ. использовавшемся нами, практически отсутствовали неструктурные белки ПМВ, тогда как АГ немецкой фирмы, по-видимому, обогащен клеточными фракциями инфицированных клеток.

На основании полученных данных и в соответствии с целью исследования для дальнейшей работы были выбраны 3 гибридомных клона клона: F1-A5. F1-B8 и F3-D5, продуцировавших МКА, наиболее активные в реакциях н® и тйФА в системе Behring.

Специфичность МКА. Представляло интерес выяснить способность МКА, продуцируемых 3 отобранными клонами, взаимодействовать с типичными представителями семейства Herpesviridae, относящимися к другим подсемействам. Известно, что ПМВ человека относится к подсемейству Betaner-pesvirinae. В качестве представителей подсемейства Aipnaherpesvirinae были выбраны вирусы простого герпеса i и 2 типов íВПГ-i. ВПГ-2'i, в качестве представителя полсемейства Gamnaherpesvirínae - вирус Зпш-тейн-Барра.

Было изучено взаимодействие МКА F1-A5, F1-B8 и F3-D5 в реакции нИФ с клетками почек африканской зеленой мартышки линии v'ero, инфицированными вирусом простого герпеса типа i (штамм УС), а также с клетками клона P3HR-I лимфомы Беркета P3I, экспрессирующими белки вируса Эпш-тейн-Барра. Анализ препаратов показал, что ни в одном из изученных препаратов МКА не обнаружили взаимодействия с антигенами герпесвиру-сов. принадлежащих к этим двум подсемействам.

Анализ специфичности МКА в отношении ПМВ проводили также методом непрямого тйФА. В качестве АГ использовали концентрированные и очищенные препараты ВПГ-i (штамм УС) и ВПГ-2 (штамм 5Н). Проведенные эксперименты продемонстрировали отсутствие связывания полученных МКА с изолированными вирусными частицами ВПГ-i и ВПГ-2.

Таким образом, проведенные опыты позволяют заключить, что изученные МКА не вступают в перекрестные реакции с наиболее распространенными вирусами из двух подсемейств герпесвирусов. Это свидетельствует о специфичности данных МКА в отношении ПМБ.

Идентификация вирусных белков, с которыми взаимодействуют полученные МКА, проводилась методом иммуноблота (ИВ). В качестве антигенов были использованы: внеклеточный вирусный антиген и лизат ЦМВ-инфицированных клеток ФЛЭЧ. Отрицательным контролем служил лизат неинфииированных клеток. Результаты эксперимента представлены на рис.1. Они показали,

что все 3 изученных клона продуцируют МКА. взаимодействующие в реакции ИБ с белками М.м.72к0а и 42кСа. При этом с внеклеточным АГ ни одно из изученных МКА не реагировало, это позволяет заключить, что МКА направлены к неструктурным белками ШИВ.

KDA

90 67 46

123 456 Т 8 9

Рис.1. Специфичность МКА в реакции иммуноблота.

1-3 - МКА F1-B8: 4-6 - МКА F3-D5: 7-9 - МКА F1-A5:

1.4.7 - лизат неинфицированных клеток:

2.5.8 - лизат ЦМВ-инфицированных клеток:

3.6.9 - внеклеточный вирусный антиген.

Известно, что неструктурный белок с молекулярной массой 72 кОа является первым синтезируемым вирусным белком после проникновения ЦМВ в клетку-мишень и называется сверхранним белком. IEp72 (Blanton and Те-vethia. 1981: Mocarski. 1993"). Можно предположить, что белок р42, с которым также взаимодействуют МКА, является продуктом распада мажорного полипептида или транскрибируется от неидентифицированной альтернативно сплайсируемой РНК. В пользу этого предположения свидетельствуют данные Stenberg1 et al. i!9S9), которые обнаружил взаимодействие антител к пептиду из С-концевой области р72 с белком 38 kDa в реакции им-мунопреципитации.

О конкуренции МКА за связывание с АГ ПМВ судили по результатам тйФА. Оказалось, что МКА трех типов F1-A5, F1-B8 и F3-D5 подавляли связывание каждого из ферментативно меченных МКА. Однако, кривые титрования для изученных МКА не совпадали. Эти данные позволяют предположить, что МКА направлены либо к близко расположенным, либо к перекрывающимся эпитопам вирусного белка.

Иммунологические свойства МКЛ. Константы связывания ш определяли в координатах Скзтчарда. Результаты анализа показали, что наименьшим аффинитетом обладают антитела клона П-В8 (Ка®=1,8'107 М-1), тогда как антитела клонов Р1-А5 и РЗ-05 обладают одинаковым и более высоким сродством к вирусному антигену: константы аффинности 2,8-108 М-1 и 3,0"108 М-1, соответственно.

Определение класса и субкласса тяжелых цепей и типа легких цепей в составе 1е\. синтезируемых гибридомными клеточными линиями, показало, что все полученные МКА принадлежат к иммуноглобулинам класса и

относятся к субклассу 2а. Было также определено, что молекулы синтезируемых 1ег содержат легкую цепь х типа.

Взаимодействие ША с ПМВ-инфииированными клетками. Серия опытов была посвящена анализу взаимодействия МКА с клетками, инфицированными ЦМВ. Помимо нИФ использовали клеточный вариант ИФА. Было установлено, что все изученные МКА обладают способностью специфически взаимодействовать с ЦМВ-инфицированными фибробластами легкого эмбрионов человека (ФЛЭЧ') в обеих иммуноцитохимических реакциях. Окраска была локализована внутри ядер зараженных интерфазных клеток (рис.2'), что характерно для всех

тштi?

А В

A) ЦМВ-кнфицировамша 4ЛЭЧ в различные сроки после заражения:

1 - 24 часа после заражения, МКА F1-B8;

2.3 - 120 часов после заражения, ЖА F1-B8, F1-A5;

4-96 часов после заражения, ЖА F3-D5;

B) отрицательный контроль

Рис.2, Иммунопероксидазное окрашивание

сверхранних белков ЦМВ (Andreoni et al., 1989;. Pizzorno et ai.. 1991: Placbter et al..1993). Изучение цитологических препаратов показало, что все 3 типа МКА гомогенно окрашивают ядра инфицированных ФЛЭЧ. Ранее было показано, что картины окрашивания ядер инфицированных клеток

различаются при использовании МКА к IE1 или IE2 белкам (Plachter et ai.,1993). Наблюдавшееся нами гомогенное окрашивание характерно для МКА, направленных к белку 1Ер72.

Специфическое окрашивание МКА было выявлено также в делящихся клетках в реакции нИФ. при этом отмечалось яркое свечение хромосом. Взаимодействие МКА с митотическими хромосомами в реакции ИФ согласуется с данными об ассоциации 1Ер72 белка с хромосомами iLafemina et ai.,1989). При изучении препаратов зараженных клеток на более поздних стадиях инфекши (10-14 дней после заражения) нами было обнаружено специфическое окрашивание небольшой округлой области, локализованной вблизи ядра. Этот факт не был отмечен другими исследователями. Проведенное нами окрашивание клеток флюоресцирующим красителем DAPI, специфично взаимодействующим с ДНК, выявило присутствие в этой зоне ДНК. Полученные данные позволяют предположить, что IE белок, к которому направлены МКА, может временно входить в состав незрелых вирусных частиц и участвовать в их сборке и/или транспортировке.

для определения возможности выявления вирусного антигена с помощью полученных МКА в ходе БМВ-инфекции была проведена серия экспериментов. Диплоидные клетки ФЛЭЧ заражали ¡1MB человека с различной множественностью i ЮБОЕ/'кл, и. 1Б0Е/кл) и проводили подсчет клеток, экспрессирую-ших клеточно-ассоциированный белок, к которому направлены МКА. в различные сроки после инфицирования. Клетки, содержащие данный антиген, выявляли в реакции нйФ. Результаты проведенного анализа представлены на рис.3. Опыты показали, что при высокой множественности инфицирования i ЮБОЕ/'кл) уже через 1 час после заражения 10% клеток содержали белок р72 в количестве, достаточном для его выявления МКА в реакции нйФ. При множественности инфицирования и.1Б0Е/кл МКА также выявляли данный вирусный антиген, однако, срок накопления необходимого количества белка для его детекции увеличивался до 4-х часов, а число клеток, экспрессируюших данный белок, не превышало 1% В течение инфекции число клеток, содержащих белок 1Ер72, постепенно увеличивалось и достигало максимального значения i80% всей популяции) уже через 1 сутки после заражения при множественности 10 БОЕ/кл. и через 14 суток - при множественности 0.1 БОЕ/кл.. В дальнейшем число положительно окрашенных клеток сохранялось приблизительно на одном уровне вплоть до их гибели.

Таким образом, белок ПМВ, с которым взаимодействуют полученные МКА, может быть выявлен метолом нИФ в инфицированной In vitro дермиссивной клеточной культуре ФЛЭЧ на протяжении всего инфекционного периода. Появление белка е первые часы после инфицирования и присутствие его в

течение всего репликаштонного цикла вируса являются характерными свойствами сверхраннего белка р72 1В1ап1оп ала ТауеШа, 1981: 51еп-Ьеге е1 а!.. 1989: Бгоиаег е1 а!.. 1992"). Способность полученных МКА выявлять р72,делают их преспективным иммунопрепаратом пля лабораторной диагностики ПМБ-инфекции.

Рис. 5. Динамика вы.че-лэния СЕерхраннего белка р72 в ЦМВ-инфпцироЕанных клеткз."-: 1'ЛЭЧ пс данным нИФ после сбрзс'отки МКА Р1-58,

Применение МКА к р72 в лабораторной диагностике ЩВ-инфекшю. МКА к

¡Е белкам нашли широкое применение в лабораторной диагностике цитоме-галии для выявления вирусного АГ. Лля этого используют как предварительное сокультивирование с клиническими образцами, так и непосредственное определение ПМБ в цитологических и гистологических препаратах биопсийных материалов от пациентов IБоррапа е1 а!.. 1992: бопао е1 а!.. 1994).

Белок IЕр7£ обильно представлен в пермиссивно инфицированных клетках. что увеличивает чувствительность его выявления с помошь АТ в различных реакциях (Неггтпзшп е1 а!.. 1987: БЬепЬегд- ег_. а!.. 1989). диагностическая ценность МКА. взаимодействующих с р72 , обусловлена также консерватизмом этого полипептида ¡Ьеппег ег а!.. 1991: БгутлЛш е! а!.. 1992 >.

10 о •

I 4 Я 16 24 48 72 96 12014416819гг1вг40264гая3!г336360384408

время после инфицирования (час)

инфекционная множественность инокулята 10 ЕОЕ/кл. ШЯ инфекционная множественность ижжулята О.ШК/яя.

* - гибель клеток

Высокая активность полученных МКА в реакции нйФ. их способность выявлять антиген ЦМВ на любой стадии инфекции в зараженных клетках in vitro и отсутствие перекрестного реагирования с другими герпесвирусами создало предпосылки для изучения возможности их использования в диагностике ПМВ-инфекции.

С этой целью был проведен сравнительный анализ полученных МКА F3-D5 и коммерческих МКА к ПМВ фирмы ORTHO (США). Выявление ПМВ АГ используемыми антисыворотками проводили метолом нйФ анализа клеток ФЛЭЧ, зараженных различными клиническими образцами. Результаты опытов показали совпадение в 109 случаях из 116 обследуемых, что составляет (94%).

Каждый из существующих в настоящее время подходов в лабораторной диагностике ПМВ-инфекции (определение AT. вирусспешфических АГ и нуклеиновых кислот) характеризуют одну из сторон вирусной инфекции. Зля определения эффективности выявления АГ ПМВ нами совместно с немецкими коллегами из лаборатории вирусологии Института медицинской микробиологии и эпидемиологии Университета г.Лейпцига (Германия') был проведен сравнительный анализ четырех методов, разработанных в настоящее время для диагностической детекции цитомегалии: 1'(определение антител к ЦМВ в сыворотках пациентов. 2>иммуноцитохимический анализ АГ. непосредственно в клетках пациентов. 3)выявление вирусного АГ в клетках ФЛЭЧ, зараженных материалом от больных, с помощью МКА и 4)полимеразная цепная реакция (ПЦР) для выявления ДНК. Всего было проанализировано 45 клинических образцов от 38 пациентов. Среди них 20 пациентов находились после трансплантации костного мозга. 4 - были реципиентами печени. 3-почек и 1-новорожденный.

Полученные результаты показали неоднозначность используемых методов детекции. Так, из 38 обследованных пациентов 33 (87%) были серопози-тивны, и только у 6 (18%) из них были определены вирусспешфические АГ и/или ДНК. В таблице 2 отражает результаты обследования различных клинических материалов, полученных от этих б пациентов. Это подтверждает сомнения в эффективности серологического теста для постановки диагноза ПМВ-инфекиии. что было отмечено ранее рядом авторов (Rasmussen et ai.,1991: Weber et al.. 1993). Положительный результат ПИР не всегда подтверждался другими методами обследования. Это, очевидно, связано с тем, что высокая чувствительность ППР позволяет определить наличие вирусного генома, находящегося не только в состоянии активной экспрессии, но также и в латентном состоянии. По данным многих авторов, положительная реакция ШР не является абсолютным диагностическим критерием (Schmidt et al., 1993; Fernando et al.,1994).

У 3 обследованных пациентов был определен АГ в моче и слюне как не-

ТАБЛИЦА 2. ВЫЯВЛЕНИЕ МАРКЕРОВ ПМВ РАЗЛИЧНЫМИ МЕТОДАМИ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПМВ-ИНФЕК1Ш

пациент материал тесты

1гМ 1втЗ ШР* ИНХ** рроБ р'?'2 СОКУЛЬТИВИО. 0 <МЭЧ 1 нИФ. ррб5')

i -сыБоротка

крови т +

-лейкоциты

пер. кроьи т - Н/и

- эпителиальные

клетки из

осадка мочи + - -г-

-эпителиальные

клетки слюны -t- ~ -г +

-сыворотка

крови -Г -f

-лейкоциты

¡тер. крови - - н/и

-эпителиальные

клетки слюны - - т +

3 -сыворотка

крови т -г

-лейкоциты

пер. крови X - н/ и

4 -сыворотка

крови т +

-лейкоциты

пер. крови т - -г

о -сыворотка

крови - -г

-лейкоциты

пер. крови т - н/ и

0 -лейкоциты

пер. крови Н.-'И - Н/и

- эпителиальные

клетки из

осадка мочи н/и - т

- эпителиальные

клетки слюны Н/ и н/и

т положительная реакция отрицательная реакция н/и не исследовали

долимеразная цепная реакция иммуноцитохимический анализ клеток от больных

посредственно в препаратах эпителиальных клеток, так и в ФЛ'ЭЧ. инфицированных этим материалом. Важно отметить, что у одного из этих пациентов реакция ПНР была отрицательной.

Ни V одного из обслелоЕанных пациентов мы не определили АГ-положительные клетки среди лейкоцитов периферической крови. При этом введение в культуру фибробластов клеток крови от 3-х пациентов в одном случае (пациент М4> позволило выявить экспрессию ДМВ АГ, Эти данные подтверждают более ранние результаты, указывающие на то. что культуральный метод в сочетании с использованием ММ является более чувствительным тестом на вирусный АГ. чем цитохимический анализ непосредственно клеток пациентов (Degree et al.,1994: Настал et ai..l994). Отсутствие AT-положительных лейкоцитов в периферической крови пациента и обнаружение вирусных белков в других биологических материалах этого же больного свидетельствует о меньшей диагностической значимости определения вирусных белков в лейкоцитах периферической крови по сравнению с другими клетками, на что указывает ряд работ (Grefte et а1..1993-. Weber et al.,1994).

Таким образом, наши данные согласуются с результатами других исследователей и указывают на высокую чувствительность и специфичность культурального метода с использованием МКА в диагностике ПМВ-инфекиии IDaiminger et al.,1994i.

С учетом предварительно полученных результатов на базе инфекционной больницы N1 г.Москвы были проведены более широкие исследования по обнаружению ¡1MB в различных группах пациентов. Работа выполнена совместно со старшими научными сотрудниками отдела вирусных гепатитов и клинической вирусологии НИИ вирусологии им Л.И.Ивановского РАМН Ивановой Л.А. и Мартыновой В.Н. Вирусный АГ выявляли в клетках ФЛЭЧ после со-культивирования их с клиническими образцами. Б качестве образцов использовали кровь, мочу, ликвор. пунктаты печени, костного мозга, материалы бронхоскопии, грудное молоко, которые вносили в культуру клеток на ¿4-48 часов. Затем проводили нйФ анализ, используя МКА Fl-Bö и F3-D5. Параллельно у этих больных исследовали сыворотку крови на наличие вирусспеиифических антител классов М и G в реакции нИФ. Пополнительно в ряде случаев определяли наличие ШИВ по специфическому цитопа-тическому действию ШЩП в культуре клеток, которое наблюдали через 1-4 недели после заражения.

Всего было обследовано £90 пациентов с подозрением на ИМБ-инфекцию. Полученные результаты суммированы в таблице 3. ПМВ-АГ был выявлен в различных группах в 24-50Х случаев. Обследование сывороток пациентов на присутствие ¡еМ и TtrG анти-iIMB показало недостаточность данного

ТАБЛИЦА 3. ОБНАРУЖЕНИЕ АНТИГЕНА НМВ И АНТИ-НМВ МЕТОДОМ НЕПРЯМОЙ ИММУНОФ.ПЮОРЕСЦЕНПИИ

контингент больных всего обследовано антитела антиген ПМВ

IsM+lgG IgG

!лимфоаденопатия, лихорадка неясной этиологии 21 3 11 5

з!гепатоз, гепатит неясной р|этиологии о! с хроническая ПМВ- инфекция и 1 5 1 1 1 1 Z 1

ы!отягощенный акушерский е)анамнез 216 14 66 53

¡трансплантация органов 3 1 4 4

¡поражение ЦНС 1 19 5 11 5

д|гепатит неясной этиологии 3 1 2 1

т\обструкционный бронхит и! ¡заболевание крови 1 15 о 1 1 4

теста в диагностике цитомегалии. Так, например, мы наблюдали хроническое течение ПМВ-инфекции на фоне высоких титров igM, на что также указывают ряд авторов (Weber et al.,1992; Weber et al.,1993). Кроме того, нами был выявлен вирусспецифический АГ в клинических образцах при отсутствии специфического иммунного ответа у 25 пациентов (9% случаев >, что также отмечалось в опубликованных работах iStagno et ai.,1985; Fernando et al.,1994). К тому же отрицательная реакция на АГ часто сопровождалась высокими титрами анти-ЦМВ (59 обследованных лиц, 20%), что свидетельствует скорее о вирусоносительстве, чем об активно протекающей инфекции. Эти данные согласуются с имеющимися в литературе о высоких показателях AT v здоровых носителей t'Rasmussen et ai.. 1991;

Braun et al., 1993).

Интересные данные были получены при сопоставлении двух культуральных методов: изолирование вируса и выявление вирусных белков в зараженных клетках ФЛЭЧ методом нМФ. Была установлена высокая корреляция между результатами сравниваемых методов, которая составила в наших опытах 75%. При этом детекция вирусного белка определялась в большем числе случаев. Совпадение результатов указанных методов детекции ЦМВ, приводимое различными авторами, колеблется в пределах от 25% до 93% (Thiele et al., 1987; Schon et al., 1992; Storch et al., 1993). Разброс в значениях корреляции, вероятно, обусловлен различными исследуемыми клиническими образцами, контингентом обследуемых пациентов и применением МКА, направленных как к сверхранним, так и ранним вирусным белкам. Исследователи отмечали также более высокую чувствительность определения ЦШ с помошью МКА по сравнению с традиционным культуральным методом.

Проведенное нами обследование ряда пациентов на протяжении нескольких месяцев позволяют заключить, что выявление АГ полученными МКА коррелирует с клиническими проявлениями инфекции и позволяет проводить мониторинг противовирусной терапии и определять ее эффективность.

Таким образом, анализ результатов позволяет заключить, что полученные нами МКА, направленные к сверхраннему белку 1Ер72, являются специфическим иммунопрепаратом, пригодным для обнаружения АГ ЦМВ методом непрямой ИФ в чувствительных клеточных культурах после их заражения клиническими материалами от пациентов.

Влияние ЦМВ на ттотчсскук активность клеток. ЦМВ может вызывать логическую и абортивную инфекции, а также приводить к злокачественной трансформации клеток i'Boldogh et al., 1985; Smiley et al., 1988). Очевидно, что эти процессы связаны с пролиферацией. Рядом авторов получены данные о том, что ЦМВ может индуцировать деление клеток (Albrecht and Rapp, 1973; St.Jeor et al., 1974; Albrecht et al., 1976). Однако, детальный анализ влияния вируса на пролиферацию клеток остается слабо изученным.

Представляло интерес сравнить митотическую активность пермиссивных и непермиссивных ЦМВ-инфицированных клеток и изучить действие ЦМВ на морфологио митозов при различном течении инфекции. В качестве продуктивно инфицированных клеток использовали диплоидные фибробласты легкого эмбриона человека, в качестве непродуктивно инфицированных - перевиваемую клеточную линию почек африканской зеленой мартышки Vero.

Влияние IIMB на митотическую активность клеток оценивали по изменению митотического индекса в течение 4 суток после инфицирования с множест-

венностью 5-10* БОЕ/'кл. Одновременно проводили морфологический анализ митотических фигур.

Морфологический анализ митотических клеток. В инфицированных культурах ФЛЭЧ и Vero в отличие от контрольных неинфицированных клеток наряду со стандартными митотическими клетками были найдены клетки с аномальными митотическими фигурами. Патология проявлялась главным образом в гиперспирализации хромосом, приводящей к формированию укороченных и утолщенных хромосом, и в их аномальной локализации. Последняя характеризовалась беспорядочным рассеиванием отдельных хромосом в цитоплазме. Такие изменения свойственны К-митотическим клеткам (К-митозов), формирующимся под воздействием колхицина и других митотических ядов (Алов, 1972). По литературным данным, указанный тип морфологической патологии митозов характерен для клеток, зараженных ЦМВ (Блюмкин, 1974; Nachigal and Nachigal, 1976).

В пермиссивной инфицированной культуре ФЛЭЧ в отличие от клеток Vero в некоторых К-метафазах отмечалась фрагментация хромосом. Интересно отметить, что число митотических клеток с фрагментированными хромосомами нарастало по мере развития инфекции. Так, на 2 день в 7% клеток с аномальными митозами наблюдалась указанная патология, в то время как на 4 день после заражения - в 43%.

Это наводит на мысль, что структурные нарушения в митотических клетках и их проявления зависят от природы клеток-мишеней. В пользу этого предположения свидетельствуют данные о том, что в лейкоцитах периферической крови ЦМВ вызывает структурные изменения хромосом, характерные для К-митозов, но, аналогично клеткам Vero, пульверизация хромосом не происходит (Kamiya et al., 1986; Abubakar et al., 1988).

Поолиферативная активность ЦМВ-инфицированных клеток. Подсчет митотических клеток в культуре фибробластов человека показал, что к четвертому дню митотический индекс в эксперименте был в 2,6 раза выше, чем в контроле, и достигал 20 на 1000 клеток (20°/Оо) (рис.4а).

Число клеток с фигурами аномальных митозов возрастало на протяжении инфекционного периода и достигало максимального значения на 4 сутки, когда 97% митозов были патологическими (рис.4в). По мере увеличения числа К-метафаз резко падало число метафазных и анафазных клеток со стандартными митотическими фигурами в инфицированной популяции (рис.4 с). При этом прирост числа клеток в эксперименте был значительно ниже по сравнению с контролем (рис.4д). Это означает, что клетки с патологическими митотическими фигурами не в состоянии завершить деление с образованием двух дочерних клеток.

Наиболее вероятно, что пермиссивные клетки не могут преодолеть мито-

общее число митозов

число патологических митозов

1 2 а 4

вреия после инфицирования, дни

число стандартных митозов

время после, инфицирования, дни

число клеток на мм2

с

вреия после инфицирования, дни

время после инфицирования, дни

Рис.4. Пролиферативная активность ЦМВ-инФицированных клеток ФЛЭЧ. —□— инфицированная культура -— неинициированная культура

гический блок и погибают именно в стадии К-метафазы. Эти данные согласуются с результатами AbuBakar и соавторов (1988')., которые пришли к выводу, что К-метафазные пермиссивно инфицированные клетки блокируются при прохождении первого митотического цикла.

Анализ митотического индекса в инфицированной культуре vero показал, что к 3 дню обшее число митозов было вдвое выше, чем в контрольной популяции, и достигало 16,7°/0о> а к 4 дню число митозов в инфицированной и неинфииированной популяциях составляло 1?,80/00 и 10,8°/оо. соответственно iрис.5ак Количество клеток с патологическими митозами также постепенно увеличивалось и к 4-му дню возрастало до 4,9 °/оо, что составило 28% от обшего числа митозов (рис.бв). Важно отметить, что на фоне увеличения числа патологических митозов в инфицированной культуре Vero, прирост числа меток в этой популяции был не ниже уровня незаряженных клеток (рис.Бд). Эти данные показывают, что ПМВ стимулирует клетки 'vero к вступлению в митоз, причем, большинство митоти-ческих клеток, по-видимому, завершает нормальное деление с образованием двух дочерних клеток.

Полученные нами данные о митотической активности и морфологический анализ митозов ПМВ-зараженных клеток Vero не позволяет сделать однозначные заключения о судьбе К-метафаз непродуктивно инфицированной популяции. Kamiva с соавторами 11986') на основании снижения синтеза ЛНК и уменьшения числа митозов в ПМВ-инфицированных эпителиальных клеток почек кролика высказал предположение о митотическом блоке под влиянием вируса в абортивно инфицированной культуре. Анализ ПМВ-инфицированных клеток vero в тот же период после заражения показал дальнейший прирост числа митотических клеток при уменьшении доли стандартных митозов i рис.5'). Является ли повышение митотического индекса следствием проли-феративной активности или результатом накопления клеток с патологическими митотическими фигурами, "арестованными" в митозе, остается не выясненным и требует дальнейших исследований.

Структура митотического веретена в ПМВ-инфицированных клетках. Известно. что классические К-митозы, образующиеся пол действием митотических ялов, связаны с повреждением и дезорганизацией компонентов митотического аппарата, в том числе веретена деления (Алов, 1972). Чтобы охарактеризовать структуру митотического веретена в ПМВ-инфицированных клетках, проводили окрашивание клеток антителами к oí-тубулину, являющемуся одним из структурных компонентов микротрубочек митотического веретена.

Размеры и форма веретена в клетках ФЛЭЧ и Vero со стандартными митотическими фигурами в контроле и в эксперименте не отличались, б боль-

общее число митозов

число патологических митозов

время после инфицирования, дни

число стандартных митозов

время после инфицирования, дни

число клеток на мм^

, __время после инфицирования, дни

время после инфицирования, дни к -те

Рис.5. Пролиферативная активность ЦМВ-инфицированных клеток Vero.

—□- инфицированная культура

—— неинфицированная культура

¡rvj го

шинстве К-метафазных клеток митотический аппарат сохранялся и был представлен биполярным веретеном. У части клеток были обнаружены незначительные отклонения в строении веретена деления. К таким нарушениям можно отнести: а) обоазование биполярного веретена из меньшего числа микротрубочек: б) большее расстояние между полюсами в К-метафазах, чем е контрольных клетках.

Таким образом, проведенные нами иммуноцитохимические исследования с использованием МКА к «-тубулину показали, что по крайней мере в течение 4-х суток после инфицирования е К-метафазных клетках ФЛЭЧ и Vero присутствует веретено деления. Сохранение веретена деления отличает К-митозы, формирующиеся под действием ПМВ, от сходных митотических фигур. описанных для классического К-митоза. Следовательно, полученные нами данные приводят к заключению, что механизм К-митотического блока, а. следовательно, и внутриклеточные мишени для ПМВ и митотических ялов различны. Действие последних связано с нарушением системы сборки-разборки микротрубочек митотического веретена. По-видимому, можно исключить ранее высказанное предположение об аналогичном воздействие ПМВ на клеточный фибриллярный аппарат lAlbrecnt et al., 1984).

Экспрессия IE р72 в митотических клетках ФЛЭЧ и Vero. Для того, чтобы выяснить, различаются ли клетки со стандартными и аномальными мито-гическими фигурами по экспрессии сверхранних белков, проводили нйФ окрашивание антителами клона F3-D5, направленными к ¡Ed72.

Анализ митотических клеток ФЛЗЧ и vero, содержащих сверхранний белок р72 показал, что окрашивание хромосом обнаруживается в стандартных митотических клетках и во всех клетках с аномальными фигурами митоза. Очевидно, что только клетки, зкспрессируюшие р72. переходят в К-мета-фазное состояние. В отличие от пермиссивной культуры, при двойном окрашивании антителами к р72 и «-тубулину в клетках 'vero отмечались дочерние клетки, содержащие вирусспеиифический АГ и соединенные промежуточным тельцем Флемминга, которое является остатками митотического аппарата. Зто позволяет заключить, что в культуре Vero часть клеток, экспрессируюших IE р72 ПМВ, способны завершить, по крайней мере, один иикл деления.

Такая картина хорошо согласуется с данными DeMarchi С1983). Автор не обнаружил ранних белков ПМВ в пермиссивных клетках, вступающих в S период в ранние сроки после инфицирования, тогда как в большинстве не-пермиссивных клеток, синтезирующих ДНК. ранние вирусные белки присутствуют. По-видимому, наблюдаемая нами стимуляция митотической активности клеток Vero в течение первых суток после инфицирования и увеличение доли стандартных митотических клеток, содержащих 1Ер72, обусловлены

вступлением в митоз главным образом тех клеток, в которых зкспрессиро-ваны сверхранние гены IIMB.

Дальнейшие исследования, направленные на выяснение роли индивидуальных вирусных белков в митогенных функциях ПМВ, изучение механизмов активации клеточной пролиферации и нарушений, возникающих в митотических клетках помогут раскрыть сложное патогенное действие bi-ipvca.

ВЫВОДЫ:

1. Получены 26 гибридомных клонов, продуцирующих МКА, специфично взаимодействующих с АГ детерминантами цитомегаловируса человека. Показана высокая активность взаимодействия МКА. продуцируемых клонами г1-А5, F1-B8 и F8-D5. с АГ ПМВ в реакциях непрямой иммуношлюорес-иенции. твердофазного иммуноферментного анализа и иммуноблота.

2. Установлено, что МКА выявляют АГ ЦМВ на протяжении всего инфекционного периода в клетках, зараженных in vitro. - с первых часов после инфицирования и вплоть до их гибели.

5а.Сравнительный анализ выявления АГ ПМВ в пермиссивных клетках после заражения клиническим материалом с помошью МКА, полученных в нашей лаборатории, и коммерческих диагностических МКА фирмы Ortho показал совпадение результатов в 94% случаев, б.Обследование 290 лип с подозрением на цитомегаловирусную инфекцию выявило АГ в 24-50% случаев в различных группах пациентов показало принципиальную возможность использования полученных МКА в диагностических целях для выявления АГ ПМВ..

4. Установлено, что б начальные сроки после инфицирования индукция вирусом митотического деления ъ непермиссивной культуре е основном связана с увеличением числа стандартных митозов, тогда как в пер-миссивной системе - с накоплением К-меташаз.

5. Изучение митотического аппарата ПМВ инфицированных клеток показало, что остановка митозов не связана с нарушением структуры веретена деления. Это означает, что механизмы появления классических К-мета-Фаз и ПМВ-индуцированных различаются.

- £й -

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1.Makarova N., Kushcn A., Ivanova L., Martinova N., Posevava Т., Ба-rinsiv I., Pustowoit B. Application of monoclonal antibodies to CMV o7Z for virus detection in materials from patients, The fourth .ioint meeting "Progress in clinical virology", Stockholm, 14-18 August, Abstract Book, 1994. p.259.

2.Bistrevskava V., Lobova Т., Makarova N., Kushcn A. The alteration of centrosome structure in cells infected with human cytomegalovirus. ECBO Meeting, Heiderberg, 14-18 April, Abstract Book, 1995, p. .

3.Makarova N., Lobova Т., Bistrevskaya V., Kushch A. Influence of HCMV on the mitotic apparatus of permissive cells. 5th International Cytomegalovirus Conference, Stockholm, 21-24 May, Abstract Book, 1995, p.

4.Макарова H., Кущ A., Иванова JI., Мартынова В., Баринский И., Pustowoit В. Получение моноклональных антител к сверхранним белкам цито-мегаловируса человека и их применение для выявления инфицированных клеток. "Вопросы вирусологии", (в печати).

ими мпс 3.463 т.10 - 95 г. 107078 .Москва, Ново-Басмаянач, 6