Анализ связывания биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами

Дмитриев, Дмитрий Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ связывания биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Анализ связывания биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами"

На правах рукописи

Дмитриев Дмитрий Александрович

связывания биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, в ЗАО «НПП Иммунотех» и в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

кандидат химических наук доцент

Осипов Александр Павлович

доктор биологических наук Иванов Юрий Дмитриевич

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор,

Максименко Александр Васильевич

доктор биологических наук, профессор,

Говорун Вадим Маркович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук

Защита состоится «I«./» 2005' г. ъ{-С- часов на заседании

Диссертационного совета Д 001.01ii.01 при Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, д. 10, корп. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Научно-исследовательского института биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, д. 10, корп. 1.

Автореферат разослан »200Гг.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

ВВЕДЕНИЕ

Гибридомная технология, наряду с обычными моноклрнальными антителами (МКА), позволяет получать биспецифические моноклонапьные антитела (БИАТ), конструируемые методами клеточной инженерии. Достоинство этого метода заключается в возможности получать совершенно однородные молекулы БИАТ, сохраняющие структуру «полумолекул» родительских антител (рис. 1). Основное различие БИАТ (класса ^О и обычных моноклональных антител состоит в следующем. Молекула МКА имеет два антигенсвязывакмцих сайта. БИАТ также имеют два сайта связывания, но их специфичность различна: первый из сайтов специфичен к одному антигену, второй - к другому (рис. 1).

V Y

б в

Рисунок 1. Связывание антител с антигенами, а) Биспецифические моноклонапьные антитела связываются с двумя разными антигенами; б) и в) родительские моноклонапьные антитела связываются с двумя одинаковыми антигенами.

Актуальность проблемы. БИАТ могут служить «мостиком» между антигеном и маркерной молекулой (например, ферментом). Именно поэтому многие исследователи считают их конъюгатами нового поколения, поскольку теперь нет необходимости метить МКА. Большой массив публикаций свидетельствует о высокой эффективности БИАТ в твердофазных системах. Вместе с тем, отсутствуют работы, в которых теоретически и экспериментально сравнивались бы свойства БИАТ и обычных МКА при связывании с иммобилизованным антигеном. Исследование вопроса о связывании БИАТ с иммобилизованным антигеном не только имеет большое значение для использования этого класса биомолекул, но и представляет определенный интерес с точки зрения изучения взаимодействия МКА с иммобилизованными антигенами.

С иммобилизованным антигеном МКА (класса IgG) могут связываться как одним антигенсвязывающим сайтом, моновалентно, так и двумя антигенсвязывающими сайтами одновременно, бивалентно, а БИАТ (класса IgG) представляют собой моновалентные молекулы в отношении каждого из антигенов. При использовании МКА в иммуногистохимии, иммуноблотшнге, иммуноферментном анализе (ИФА) и других твердофазных системах необходима количественная оценка процесса связывания антител с иммобилизованным антигеном. Для характеристики связывания МКА особенное значение имеют две величины: аффинность, характеризующая степень сродства антитела к данному эпигону антигена, и авидность, или общая мера стабильности комплекса антиген-антитело. Различие между аффинностью и авидностью может быть обусловлено способностью антител (например, класса IgG) бивалентно взаимодействовать с иммобилизованным антигеном. За счет бивалентного связывания происходит значительное возрастание эффективности связывания антител с антигеном на твердой фазе. Из-за стерических факторов не все антитела способны связываться с иммобилизованным антигеном бивалентно. Наличие бивалентного связывания антител с иммобилизованным антигеном необходимо доказывать не только для каждой пары

антитело—антиген, но и для каждого клона антител к данному антигену. Ранее бивалентное связывание антител с иммобилизованным антигеном доказывали и изучали путем сравнения нативных антител и их Fab фрагментов - относительно небольших фрагментов антител, которые включают антигенсвязывающий сайт и образуются в результате обработки антител папаином. Fab фрагменты могут связываться с иммобилизованным антигеном только моновалентно и, таким образом, служат в качестве инструмента для количественной оценки аффинности. Сравнительный анализ связывания с иммобилизованным антигеном нативных антител и их Fab фрагментов является классической иммунологической моделью для апробации новых методов исследования. Следует отметить, что упомянутое сравнение не является достаточно полноценным. Несовершенство подобного сравнения заключается в том, что структура Fab фрагментов отлична от структуры нативных молекул антител. Имеются данные, что Fe участок может иметь значение для антигенсвязывающей способности антител (например, он может влиять на гибкость молекулы).

С другой стороны, бивалентное связывание антител с иммобилизованным антигеном можно изучать путем сравнения констант связывания антител в растворе и на твердой фазе. При этом константа связывания антител в растворе служит в качестве инструмента для количественной оценки аффинности. Однако, иммобилизация антигена на твердой фазе (например, на поверхности иммунного планшета) часто приводит к частичному изменению конформационной структуры белка, изменяющей его антигенсвязывающие свойства. Таким образом, аффинность антител, измеряемая в растворе, не является истинной для экспериментов, в которых антитела связываются с иммобилизованным антигеном. На наш взгляд, идеальной моделью для оценки аффинности моновалентного связывания могут служить БИАТ. Структура «полумолекул» БИАТ тождественна структуре «полумолекул» нативных родительских антител (рис. 1), И за исключением одного из вариабельных участков и первичная, и третичная структура БИАТ совпадает со структурой нативных родительских антител (в том случае, когда обе «полумолекулы» БИАТ относятся к одному подклассу IgG).

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось количественное изучение взаимодействия родительских моноклональных и биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1) Получить аффинно-очищенные моноклональные и образованные от них биспецифические моноклональные антитела. В качестве антигенов были выбраны следующие протеины: пероксидаза хрена (HRP), миоглобин человека (Мб) и иммуноглобулин G человека (hlgG).

2) Теоретически рассмотреть равновесные и кинетические закономерности взаимодействия обычных моноклональных антител и образованных от них биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами.

3) Экспериментально изучить характер и определить количественные характеристики иммунологического взаимодействия на примере трех клонов обычных антител: антимиоглобиновых (анти-Мб), антипероксидазных (анти-HRP) и антител против IgG человека (анти-hIgG); и двух клонов образованных от них биспецифических антител (биспецифические антитела, несущие сайты связывания с миоглобином и пероксидазой хрена (анти-Мб/HRP), и биспецифические антитела, несущие сайты связывания с IgG человека и пероксидазой хрена (анти-hIgG/HRP)). Провести сравнение с использованием иммуноферментного, радиоиммунологического методов и с помощью оптического биосенсора, основанного на принципе «резонансное зеркало» (IAsys). Соотнести результаты, полученные тремя методами.

4) Апробировать иммунологическую модель, предполагающую сравнительный анализ связывания родительских моноклональных антител и биспецифических моноклональных антител, для определения типа взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентного или бивалентного). В качестве инструмента для оценки аффинности моновалентного связывания использовать биспецифические моноклональные антитела.

5) Изучить возможность бивалентного связывания биспецифических моноклональных антител с различными антигенами одновременно иммобилизованными на твердой фазе.

Научная новизна и научно-практическая значимость исследования. В

результате проведенного исследования впервые теоретически и экспериментально были сравнены свойства БИАТ и обычных МКА при связывании с иммобилизованным антигеном. Изучение этого вопроса имеет большое значение для использования БИАТ во всех твердофазных системах. Экспериментально эффективность связывания БИАТ с иммобилизованными антигенами в сравнении с родительскими антителами изучалась ранее только одной группой исследователей, к сожалению, их результаты не интерпретируются существующей теорией.

Впервые предложена и апробирована иммунологическая модель, предполагающая сравнительный анализ связывания родительских МКА и БИАТ, для определения типа взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентного или бивалентного).

Также впервые с помощью иммуноферментного метода показано существование бивалентного связывания БИАТ с двумя антигенами, одновременно адсорбированными на твердой фазе.

Важный методический аспект имеет сравнительный анализ связывания родительских МКА и БИАТ с иммобилизованным антигеном с помощью современного оптического биосенсора 1А5уз, основанного на принципе «резонансное зеркало». Это метод нового поколения, который в близком будущем придет на смену традиционному ИФА, который используется для количественной оценки иммунологических взаимодействий в настоящее время.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на международной конференции: «Биокатализ-2002» (Москва-2002).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано б печатных работ.

Структура диссертации. Диссертация изложена на_страницах и содержит

следующие разделы: введение, обзор литературы, экспериментальная часть, результаты и обсуждение, выводы и список литературы (122 источника). Работа содержит 5 таблиц и

25 иллюстраций._

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Получение аффинио-очищениых моноклональных и образованных от них биспецифических моноклональных антител

1.1. Клеточные линии

Изначально, при получении МКА в качестве антигена был выбран миоглобин, поскольку тест-системы (например, сэндвич-метод) определения миоглобина могут играть важную роль в ранней диагностике инфаркта. Иммуноглобулин О "человека был выбран, поскольку множество исследовательских и клинических тест-систем (например, тестирование СПИДА) определяют наличие в крови человека антител к какому-либо

антигену, При получении БИАТ в качестве второго антигена была выбрана пероксидаза, так как.рИАТ могут служить «мостиком» между антигеном и ферментом (например, пероксидазой). Именно поэтому многие исследователи считают их конъюгатами нового поколения, поскольку теперь нет необходимости метить МКА.

Таблица 1. Характеристика антител использованных в работе

Клеточная линия Изотип антител Специфичность антител

Гибридомы родители

36F9 75G5 14D6 IgGl IgGl IgGl Антипероксидаза (HRP) Анти-IgG человека (hlgG) Антимиоглобин (Мб)

Тетрадомы

75G5x36F9 14D6x36F9 IgGl/lgGl IgGl/IgGl Анти-hIgG/HRP Анти-Мб/HRP

1.2. Приготовление аффинных носителей

Антигены (Мб, HRP и hlgG) ковалентно связывали с BrCN-сефарозой в соответствии с рекомендациями фирмы "Farmacia". 1 мг антигена конъюгировали со 100 мг BrCN-сефарозы. Перед конъюгацией необходимое количество BrCN-сефарозы 4В предварительно промывали 15 мин раствором НС1 (рН=2.0) для удаления стабилизирующих добавок декстрана и лактозы. Активированную сефарозу промывали большим избытком дистиллированной воды, суспендировали в 5 объемах (по отношению к весу сухой сефарозы) 0,1 М ЫаНСОэ с 0,5 М NaCl и добавляли конъюгируемый белок, растворенный в минимальном объеме того же буфера. Реакцию проводили при мягком перемешивании на круговом смесителе (30 об/мин) в течение ночи при 4°С. Содержимое пробирки центрифугировали (5 минут, 1000g, 5°С) и определяли в надосадочной жидкости количество несвязавшегося лиганда по оптической плотности при 280 нм. Активные группы инактивировали добавлением глицина (3-5 мг/мл) с последующим перемешиванием на круговом смесителе при комнатной температуре в течение двух часов. Для удаления нековапентно адсорбированного белка проводили холостую хроматографию с полученным сорбентом: вначале пропускали PBS, затем 0,1 М уксусную кислоту (до рН 2,2 доводили НС1) и затем PBS. Эффективность конъюгирования белка с сефарозой указанным методом достигала 96%.

1.3. Аффинная очистка моноспецифических антител

Моноспецифические антитела (анти-HRP, анти-Мб и анти-hIgG) очищали из асцитных жидкостей (полученных в лаборатории нейроиммунологии ИВНД и НФ РАН под руководством Ю.С. Массино) соответствующих гибридом с помощью одностадийной аффинной хроматографии. Предварительно IgG асцитных жидкостей осаждали сульфатом аммония (0,5 г/мл, 12 ч, 5 С). Осадок, полученный после центрифугирования (4000 об/мин., 5°С, 20 мин.), растворяли в 15 - 30 мл PBS и пропускали через колонку с иммуносорбентом (размер колонки: диаметр 5 мм, высота 15 мм) со скоростью 15 мл/час. Иммуносорбент промывали тем же буфером до исчезновения поглощения при 280 нм. Антитела элюировали 0,1 М уксусной кислотой рН 2,2 (доводили НС1). Элюат нейтрализовали концентрированным аммиаком. Показано, что аффинноочшценные

антитела сохраняют свою иммунологическую активность, так как при повторной аффинной хроматографии более 99% антител вновь связывалось с аффинным носителем.

1.4. Аффинная очистка биспецифических антител

Аффинную очистку биспецифических антител из асцитных жидкостей проводили в две стадии: путем последовательных аффинных хроматографий. Все БИАТ нашей панели несли сайт связывания с пероксидазой. Первый этап очистки БИАТ - аффинная хроматография на НЯР-сефарозе. Второй этап очистки - хроматография на соответствующем антиген-сефарозном носителе (так, для антител со специфичностью анти-Ь^О/ЖР второй этап - хроматография на Ь^С-сефарозе). Все процедуры аффинной хроматографии совпадают с процедурами, описанными в разделе 1.3. В результате фракционирований для каждого БИАТ было получено три субфракции активных антител. Сводные данные о количественном составе активных продуктов секреции тетрадом приведены в таблице 2.

Таблица 2. Результаты аффинной очистки продуктов секреции гибридных гибридом из _асцитной жидкости_

Тетрадома Специфичность биспецифических антител Антитела в асцитной жидкости

Наименование антител мг/мл асцита %"

14Б6х36Р9 Анти-Мб/ГОР Биспецифические антитела 0,31 17

Антипероксидазные антитела 0,84 47

Аншмиоглобиновые антитела 0,65 36

Сумма активного ^О (биспецифические+ антипероксидазные+ антимиоглобиновые антитела) 1,80 100

7505х36Р9 Анти-Ы^/НИР Биспецифические антитела 2,93 36

Антипероксидазные антитела 2,74 33

Антитела к 1{5й человека 2,52 31

Сумма активного 1§С (биспецифические +антипероксидазные антитела к 1йО человека) 8,19 100

" - % по отношению к суммарному активному (100%).

2. Теоретический анализ связывания антител с антигеном 2.1. Анализ равновесного связывания антител с антигеном в растворе. В растворе наблюдаемая равновесная константа ассоциации (Ка^) взаимодействия антитело-антиген описывается следующим образом:

Ка58 ~ ([АЬ]0-ВДХВД -[В])' (М"'} (1)

где [АЬ]о - общая концентрация антител, (М); [В] - концентрация связанных антител, (М); [А§]о - общая концентрация антигена, (М). При этом обычно не учитывается то обстоятельство, что молекула антитела (подкласса ^й) несет два антигенсвязывающих сайта. Наиболее часто при анализе данных по взаимодействию антитело-антиген используют координаты Скэтчарда:

§) = Ка5ЛА8]0-Ка88[В], (2)

где [И] - концентрация свободных антител, иногда обозначаемая [АЬ], (М), |Т]=[АЬ]=[АЬ]о-[В]. Иногда данные представляют в более простой форме - в виде прямых связывания, в координатах [В] от [АЪ]о. При низких значениях [В] (следовательно [^]о>:>[В]) уравнение 1 может быть преобразовано: г,.,, Ка53 [А§]0

Координаты [В] от[АЬ]о (уравнение 3) часто используют в твердофазном ИФА, причем концентрацию связанных антител ([В]) представляют не в концентрационных единицах молярности, а в пропорциональных им единицах оптического поглощения.

2.2. Теоретический анализ связывания антител с иммобилизованным антигеном

На поверхности твердой фазы может существовать смесь бивалентно и моновалентно связанных молекул антител класса 1(гО (рис. 2).

- -< - А

Рисунок 2. Модель бивалентного связывания антител.

Процесс моновалентного связывания характеризуется равновесной константой ассоциации (КО:

V _ _

[АЬА8]5 2[АЬ][Аё];

-.(М-1)

(4)

где к) - кинетическая константа ассоциации антигенсвязывающего сайта антитела с антигеном, (М*'с"'); к_1 - кинетическая константа диссоциации моновалентного комплекса, (с"1); [Ag]s - концентрация свободных антигенов на поверхности, (б - индекс, обозначающий поверхностную концентрацию (моль/см2), а отсутствие индекса означает концентрацию в растворе (М)); [АЬА0]5 - концентрация моновалентного комплекса антитело-антиген. Процесс превращения моновалентного комплекса в бивалентный характеризуется равновесной константой ассоциации (Кг):

К2=^- = 2[АЬА8*]° , (см2/моль) (5)

где кг - кинетическая константа превращения моновалентного комплекса в бивалентный, (см2моль"'с"'); к.2 - кинетическая константа диссоциации бивалентного комплекса до моновалентного, (с"1); [АЬА®]5 - концентрация бивалентного комплекса антитело-антиген. Статистический фактор два (2) возникает из-за того, что в уравнениях записывается не концентрация антител, а концентрация антигенсвязывающих сайтов антител.

Однако для количественной характеристики взаимодействия МКА с иммобилизованным антигеном используется упрощенная модель. В этой модели взаимодействие антитело-антиген рассматривается как гомогенный, равновесный, одноступенчатый процесс с однородной валентностью связывания. При этих допущениях применяются уравнения 1, 2 и 3. Теперь совместим модель бивалентного связывания (уравнения 4 и 5) с упрощенной моделью уравнения 1, тогда выражение для наблюдаемой равновесной константы ассоциации (К,ю) будет иметь следующий вид:

Кясс — "

1 к

_ "-ass

= [AbArAbirA^bAglS =Ki(2 + K2[Agjs), (М-.} (6)

где - наблюдаемая равновесная константа диссоциации (М); к^ - наблюдаемая кинетическая константа ассоциации, (М"'с"'); к^ - наблюдаемая кинетическая константа диссоциации, (с-1). Константы связывания антител с иммобилизованным антигеном (К^, Какя и кй155) являются эффективными, потому что могут зависеть от условий проведения эксперимента (например, от концентрации антигена на твердой фазе ([А§]3)). 2,3. Соотношение бивалентно и моновалентно связанных антител При наличии бивалентного связывания родительских МКА с иммобилизованным антигеном из уравнения 5 можно вычислить соотношение бивалентно и моновалентно связанных антител:

[АЪАё2]5 К2[Аё]5

[AbAg]s

(7)

Соотношение бивалентно и моновалентно связанных антител можно вычислить из уравнения б, зная значение Км* для биспецифических антител, равное К|, и значение Kass для родительских МКА.

2.4. Кинетический анализ связывания антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе

При определении кинетических констант ассоциации (k„ss) и диссоциации (kdiss) антител с иммобилизованным антигеном используется та же упрощенная модель, как и в уравнениях 1, 2 и 3 предполагающая гомогенное, одностадийное связывание с однородной валентностью. В этом случае скорость образования комплекса антиген-антитело выражается следующим уравнением:

^ = kaJAb][Ag]-kdiss[B], (8)

где [Ag] - концентрация свободного антигена ([Ag]=[Ag]o - [В]), at- время (с). Кроме того, предполагается, что антитела находятся в избытке по отношению к антигену ([АЬ]о > > [Ag]o) и концентрация антител практически не меняется со временем ([Ab]~[Ab]a=const). Взаимодействие антиген-антитело происходит при условии

1 = -ка8ДВ]. (12)

, прсвдопсрвого порядка реакции, и в этом случае решение уравнения 8 записывается следующим образом:

[В] = Их 0 ~ е-коп1), (9)

где [В]» - равновесная концентрация комплекса антиген-антитело при данной 'концентрации антител ([АЬ]), которая равна:

гш - ГАЬКАбЗо по.

^-[АЫ-ЬК^- (10)

-А к«, в уравнении 9 наблюдаемая константа скорости реакции (с"1), которая равна:

к0П=ка88[АЬ] + кШм. (11)

Каждой концентрации антител ([АЬ]) соответствуют определенные значения к«, и [В]®. Из линейной зависимости уравнения 11 (ко п от [АЬ]) определяется ка»< Теоретически к^м также может быть определена из уравнения 11.

Если считать диссоциацию необратимой, то есть предположить, что она происходит в достаточно большом объеме, и повторного связывания освободившихся антител не происходит, то тогда диссоциация описывается следующим уравнением:

¿[В]_

Решение этого уравнения записывается следующим образом:

[В] = [В]0е-к«-'5 (13)

где [В]о - концентрация комплекса антиген-антитело в начальный момент времени.

2.5. Использование бивалентной модели для предсказания теоретически ожидаемых изменений наблюдаемой равновесной константы ассоциации (Х^ц), параметров прямых связывания и наблюдаемых кинетических констант в зависимости от преимущественного характера связывания антител с иммобилизованным антигеном

Если бивалентное связывание МКА по каким-либо причинам невозможно и МКА связываются только моновалентно (то есть в уравнении 6 К2=0), то Ка5, для родительских МКА будет равна 2К\ (смотри уравнение 6). Кая для БИАТ, у которых к данному антигену только одно плечо, в координатах Скэтчарда будет равна Кь Таким образом, если бивалентное связывание невозможно, К*» для родительских МКА (2К0 будет в два раза больше, чем КИ5 для БИАТ (К]). Если бивалентное связывание МКА возможно, то значение К^, как следует из уравнения б, будет значительно больше 2К1 (Ка55»2К1).

Как показано ранее (раздел 2.1) кривую связывания (зависимость [В] от [АЬ]о) при низких значениях [В] можно линеаризовать в прямую. В координатах уравнения 3 ([В] от [АЬ]о), коэффициент (тангенс угла наклона) прямой связывания равен Ка^УО+К^^о). При отсутствии бивалентного связывания наблюдаемая равновесная константа ассоциации (КшЯ) для родительских МКА, равная 2К), будет в два раза превышать Каза для БИАТ, равную Кь Коэффициент прямой связывания родительских МКА будет равен 2К][>^]о/(1+2К1[А$]о), а коэффициент прямой связывания БИАТ будет составлять К1[А§]о/(1+К1[Ад]о). Величина [Ag]o одинакова для родительских МКА и БИАТ. Следовательно, при отсутствии бивалентного связывания отношение коэффициентов прямых родительских МКА и БИАТ будет равно (2+2Kl[Ag]oУ(l+2Kl[Ag]o). Преобразовав это выражение, получаем 1+1/(1+2К|[А£]о). Очевидно, что это отношение не может превышать 2 и не может быть меньше 1. Если соотношение коэффициентов прямых связывания родительских МКА и БИАТ превышает 2, то это свидетельствует о наличии бивалентного связывания МКА с иммобилизованным антигеном.

Вышеприведенные уравнения позволяют также сравнить кинетические параметры связывания родительских MICA, и БИАТ. Наблюдаемая кинетическая константа ассоциации (к^) для БИАТ равна ki из уравнения 4. Для родительских МКА величина kass в большинстве случаев не зависит от наличия или отсутствия бивалентного связывания и равна 2ki. Наблюдаемая кинетическая константа диссоциации (kdiss) для БИАТ равна k-i. Значение kj,ss для родительских антител выводится го уравнения б:

kdiss = K2[Ag¿/2 + r (14)

Таким образом, диссоциация комплекса с родительскими МКА, которые могут бивалентно связываться с иммобилизованным аитигеном, существенно меньше, чем диссоциация комплекса с БИАТ. Если бивалентное связывание МКА с иммобилизованным антигеном по каким-либо причинам невозможно, то диссоциация комплексов с родительскими МКА и с БИАТ будет одинакова.

3. Экспериментальный анализ связывания антител с иммобилизованным

антигеном

Как показано теоретически, обычные МКА более эффективно взаимодействуют с иммобилизованным антигеном, чем образованные от них БИАТ. Для доказательства на экспериментальном уровне необходимы и достаточны, МКА связывающиеся с иммобилизованным антигеном преимущественно моновалентно, и МКА связывающиеся с иммобилизованным антигеном преимущественно бивалентно, и полученные от них биспецифические антитела.

Связывание антител с иммобилизованными антигенами было проанализировано тремя методами: ИФА, радиоиммунологическим (РИА) и с помощью биосенсора IAsys. Эти три метода были выбраны по следующим причинам. Иммуноферментный метод является наиболее распространенным, дешевым и простым в использовании, он активно используется в прикладных областях. Радиоиммунологический метод обладает широким диапазоном измеряемых концентрации (>104) и хорошей воспроизводимостью результатов. Этот метод является наиболее точным при определении наблюдаемой равновесной константы ассоциации (Каи). Оптический биосенсор, основанный на принципе «резонансное зеркало» (IAsys), обладает важным преимуществом по сравнению с классическими методами анализа, какими являются РИА и ИФА, биосенсор дает возможность быстрого определения не только наблюдаемой равновесной константы ассоциации (Kass), но и наблюдаемых кинетических констант ассоциации и диссоциации (kass и

kdiss).

В настоящей работе была апробирована иммунологическая модель, предполагающая сравнительный анализ связывания родительских моноклональных антител и биспецифических моноклональных антител, для определения типа взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентного или бивалентного). В качестве инструмента для оценки аффинности моновалентного связывания использовали биспецифические моноклональные антитела. Также изучена возможность бивалентного связывания биспецифических моноклональных антител с различными антигенами одновременно иммобилизованными на твердой фазе.

3.1. Изучение связывания родительских и биспецифических антител с адсорбированными на твердой фазе антигенами иммуноферментным методом

Изучали антитела к трем антигенам: миоглобину (Мб), пероксидазе хрена (HRP) и IgG человека (hlgG); три клона обычных моноклональных антител (анти-Мб, анти-hIgG и анти-HRP) и два клона образованных от них биспецифических моноклональных антител (анти-Мб/HRP и анти-hIgG/HRP).

' Эксперимент проводился в три стадии: на первой стадии к иммобилизованному антигену добавлялись родительские или биспецифические антитела; на второй стадии -антимышиные антитела, конъюгированные с биотином; на третьей - авидин, конъюгированный с щелочной фосфатазой (рис. 3). Реакцию проводили с гексагидратом п-нитрофенилфосфата натрия в диэтаноламиновом буфере. Измеряли оптическое поглощение (А405)-

(Ф) у

\фГД

дг

А! А

_ 3 стадия: Авидин, конъюгированный с

ОР—д щелочной фосфатазой

2 стадия: Антимышиные антитела, /''СУ конъюгированные с биотином

1 стадия: Моноспедифические или Биспецифические моноклональные антитела

Антиген, иммобилизованный на твердой фазе

Рисунок 3. Схема проведения эксперимента иммуноферментным методом.___

Одним из используемых в работе антигенов был иммуноглобулин в человека. При этом в используемых нами антимышиных овечьих антителах, меченых биотином, была фракция, которая связывалась также с иммуноглобулином в человека (перекрестное антивидовое связывание). Для устранения этой фракции антимышиные антитела, меченые биотином, аффинно очищались на сефарозе, конъюгированной с иммуноглобулином О человека. Во всех экспериментах использовалась только та фракция антимышиных овечьих антител, меченых биотином, которая не связывалась с сефарозой, конъюгированной с иммуноглобулином в человека. Поскольку все анализируемые антитела относились к подклассу мыши, можно полагать, что все антитела настоящей панели одинаково воспринимались выбранной антивидовой системой тестирования.

Изучали зависимость поглощения (Адо) от общей концентрации антител ([АЬ]о). Поскольку поглощение пропорционально концентрации иммунохимического комплекса ([В]), то теоретические представления о соотношении коэффициентов прямых связывания из уравнения 3, сделанные в разделе 2.5, верны и для коэффициентов, связывающих А405 и [АЬ]р._

1,5 1,2

0,6 0,3 0

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Антитела, нМ

(в)

Рисунок 4. Связывание с адсорбированными миоглобином (а), пероксидазой (б) и IgGl человека (в) родительских и биспецифических моноклональных антител. Анализ данных проводили в координатах А405 от [АЬ]о, аналогичных координатам уравнения 3._

Полученные иммуноферментным методом прямые связывания родительских МКА и БИАТ с антигенами, адсорбированными на твердой фазе, представлены на рис. 4. Можно видеть, что с Мб связывается в 10 раз больше родительских МКА, чем БИАТ (рис. 4 а), коэффициент aj равен 0,95, а коэффициент аг равен 0,09. Существенная разница в связывании родительских МКА и БИАТ наблюдается и для адсорбированной пероксидазы: с HRP связывается в 7.5 раз больше родительских МКА, чем БИАТ. (рис. 4 б), коэффициент аз равен 1,45, коэффициент а4 равен 0,2, а коэффициент as равен 0,18. БИАТ, полученные от разных клонов, но несущие одинаковый сайт связывания с HRP (специфичность анти-Мб/HRP и анти-hIgG/HRP) связываются с пероксидазой практически идентично (рис. 4 б). На основании теоретических представлений о соотношении коэффициентов прямых связывания (см. раздел 2.5) можно сделать вывод о наличии бивалентного связывания с антигенами в случае антимиоглобиновых и антипероксидазных МКА. Вместе с тем, разница в связывании родительских МКА и БИАТ с hlgGl невелика (рис. 4 в). В этом случае соотношение коэффициентов прямых связывания МКА и БИАТ составляет всего лишь 1,3, коэффициент аб равен 3,85, а

коэффициент а7 равен 2,94. Как показано в теоретическом разделе 2.5, это может свидетельствовать об отсутствии бивалентного связывания родительских МКА с иммобилизованным иммуноглобулином в человека (Ь^в!).

= ae[Aj>]„

^5 = а8[АЬ!^ ,в

□ ' А(об - а10[АЬ]0 / $>'

* ' D HRP

ОМ6

® • HRP+M6

-г4

4 8 12 Антитела, нМ

Ajos = а„[АЬ]о Ajo5 = а,г[АЬ]о ^

А4^= а131АЬ]о /а

а HRP

ohlgG D HRP • HRP+blgG

—

1 2 3

Антитела, HM

(а) (б)

Рисунок 5. Связывание биспецифических монокпональных антител: анти-Мб/HRP (а) и анти-hIgG/HRP (б), с адсорбированными антигенами и их смесью в молярном соотношении 1:1. Анализ данных проводили в координатах А405 от [АЬ]о, аналогичных координатам уравнения 3._

Кроме того, для БИАТ (анти-Мб/HRP и анти-hIgG/HRP) было исследовано связывание при одновременной адсорбции на твердой фазе смеси двух антигенов: HRP и Мб; HRP и hlgG (молярное соотношение адсорбируемых антигенов в насыщающем растворе 1:1). Величина коэффициентов прямых связывания показывает, что с двумя антигенами, адсорбированными на твердой фазе, связывается в 2.8 раза больше БИАТ анти-Мб/HRP, чем при индивидуальной адсорбции HRP, и в 6.6 раз больше антител, чем при индивидуальной адсорбции Мб (рис. 5 а), коэффициент ag равен 0,62, коэффициент ад равен 0,22, а коэффициент аю равен 0,09. В то же время для БИАТ анти-hIgG/HRP (рис. 5 б) величина коэффициентов прямых связывания показывает, что с двумя антигенами, адсорбированными на твердой фазе, связывается такое же количество антител, как и при индивидуальной адсорбции hlgG, и в 13 раз больше антител, чем при индивидуальной адсорбции HRP, коэффициент ац равен 2,84, коэффициент ац равен 2,93, а коэффициент а и равен 0,22.

Таким образом, с двумя антигенами (HRP и Мб), одновременно адсорбированными на твердой фазе, БИАТ анти-Мб/HRP связываются гораздо эффективнее, чем с HRP или Мб, адсорбированными индивидуально. Это свидетельствует о том, что часть молекул БИАТ связалась бивалентно: соответствующие сайты связались одновременно с двумя адсорбированными антигенами (рис. 6). Соотношение коэффициентов (рис. 5 а) свидетельствует о наличии бивалентного связывания, даже если предположить, что миоглобин и пероксидаза имеют различные, не пересекающиеся центры связывания на поверхности полистироловых планшетов. Наши данные стоят в одном ряду с более ранними наблюдениями об усилении лизиса клеток и авидности связывания при использовании БИАТ, способных связываться одновременно с двумя различными антигенами клеточной поверхности. А БИАТ анти-hIgG/HRP с двумя антигенами, одновременно адсорбированными на твердой фазе, связываются почти с такой же интенсивностью, как и с индивидуально адсорбированным hlgGl (рис. 5 б). Это

свидетельствует о том, что БИАТ анти-Ь^О/НКР с двумя одновременно адсорбированными антигенами связываются только моновалентно.

Рисунок 6. Схема бивалентного связывания биспецифических моноклональных антител с двойной специфичностью к Мб и к HRP с адсорбированными на твердой фазе антигенами (пероксидазой и миоглобином). _

3.2. Изучение связывания антител с адсорбированными на твердой фазе антигенами радиоиммунологическим методом

С помощью иммуноферментного метода сложно определить равновесные константы связывания антител с иммобилизованным антигеном, поэтому для решения этих задач использовался радиоиммунологический метод. Этот метод является наиболее точным при определении наблюдаемой равновесной константы ассоциации (Кам).

Для экспериментов использовали БИАТ и МКА, меченные USI. Данные РИА по связыванию представляли в координатах: концентрация связанных антител от концентрации общих антител (уравнение 3) или в координатах Скэтчарда (уравнение 2). Данные РИА в координатах уравнения 3 являются аналогом прямых связывания в твердофазном ИФА.

Кривые связывания, представленные на рис. 7 и 8 а, показывают, что существенная разница в связывании с Мб и HRP между родительскими МКА и БИАТ имеет место и при тестировании связывания радиоиммунологическим методом. По величине коэффициентов прямых связывания можно рассчитать, что с Мб на твердой фазе связывается в 5.3 раза больше родительских МКА, чем БИАТ анти-Мб/HRP (рис. 7). С иммобилизованной HRP родительских антипероксидазных МКА связывается в 2.2 раза больше, чем БИАТ анти-Мб/HRP, и в 2.9 раза больше, чем БИАТ анти-hIgG/HRP (рис. 8 а). Соотношение коэффициентов прямых связывания родительских МКА и БИАТ в случае иммобилизованных Мб и HRP больше двух, что позволяет сделать выводы о наличии бивалентного связывания МКА с пероксидазой и миоглобином (раздел 2.5). Для иммобилизованного hlgGl (рис. 9 а) отношение коэффициентов прямых связывания родительских МКА и БИАТ составляет 1.4 (меньше 2). Это может свидетельствовать об отсутствии бивалентного связывания родительских МКА с иммобилизованным hlgGl. Таким образом, данные, полученные РИА, подтверждают выводы сделанные при сравнении связывания МКА и БИАТ твердофазным ИФА.

Биспецифическое моноклональное антитело со специфичностью анти-HRP/Мб

0,50,4-

X 0,3-х

Ё 0,20,10 -

0 2 4 6 Антитела, нМ

Рисунок 7. Связывание с адсорбированным миоглобином родительских и биспецифических моноклональных антител. Анализ данных проводили в координатах уравнения 3.

л 9 1 [В] = 0,32[АЬ]о

X е

8 = 0,06[АЬ]о

§^ о анти-Мб

• анти-Мб/НИР

0,4

0,3

0,1

в у

0,2 ■

в 0,15 •

/ Б

« <* J § 0,1-

* У? $ = 0,05[АЬ]о 0,05 •

О анти-НИР

□ анти-Мб/НИР 0 -

2 4

Антитела, нМ

(а>

о анти-НШР □ анти-Мб/НЯР • анти-Ыдб/НПР о о

0,2 0,4 0,6 [В], нМ

(б)

0,8

Рисунок 8. Связывание с адсорбированной пероксидазой родительских и двух видов биспецифических моноклональных антител. Анализ данных проводили в координатах уравнения 3 (а) и в координатах Скэтчарда (б).

Способность МКА бивалентно связываться с иммобилизованным антигеном во многом зависит от стерического взаимодействия антигенсвязывающего сайта МКА с соответствующим эпитопом антигена. Отсутствие бивалентного связывания с можно объяснить относительно большими размерами молекулы Ь^С (Мг Ь^в в четыре раза больше чем Мг пероксидазы и в 9 раз больше, чем Мг миоглобина). Кроме того, молекулы пероксидазы и миоглобина имеют глобулярную структуру, а молекула имеет более сложную структуру, состоящую из четырех цепей (рис. 1), что также может сказываться на характере связывания. В работе Довера в 1984 году показано, что различные МКА, специфичные к одному антигену, могут показывать различные режимы связывания: и бивалентный, и моновалентный. Следовательно, наличие или отсутствие бивалентного связывания антител с иммобилизованным антигеном необходимо

доказывать не только для каждого антигена, но и для каждого клона-продуцента МКА к данному антигену.

0,5

0,4 0,8 1,2 Антитела, нМ

1 2 М, нМ

(а)

(б)

Рисунок 9. Связывание с адсорбированным hlgGl родительских и биспецифических моноклональных антител. Анализ данных проводили в координатах уравнения 3 (а) и в

координатах Скэтчарда (б).__

Следует отметить, что при представлении прямых связывания в координатах уравнения 3 в твердофазном ИФА различие в связывании между родительскими МКА и БИАТ для иммобилизованных Мб и HRP больше, чем в РИА (рис. 4 а и 4 б, рис. 7 и 8 а). Для того чтобы объяснить это явление, следует учесть, что ИФА (в нашем случае) включает в себя три последовательных инкубации: с родительскими МКА или БИАТ, с антимышиными антителами, меченными биотином, и с авидином, коиъюгированным со щелочной фосфатазой. А в РИА имеет место всего одна инкубация: с мечеными родительскими МКА или БИАТ. При этом возможна диссоциация антител на каждом этапе инкубации, причем при наличии бивалентного связывания родительские МКА будут диссоциировать медленнее, чем БИАТ (раздел 2.5). При наличии бивалентного связывания отношение коэффициентов прямых связывания родительских МКА и БИАТ должно быть больше при многостадийных инкубациях, чем при одностадийной инкубации. При отсутствии бивалентного связывания отношение коэффициентов прямых связывания родительских МКА и БИАТ должно быть одним и тем же при одностадийной (РИА) и многостадийной (ИФА) инкубациях, так как диссоциация комплексов с родительскими МКА и с БИАТ в этом случае будет одинакова (раздел 2.5). Этот вывод подтверждается при сравнении связывания между родительскими МКА и БИАТ с иммобилизованным hlgG 1 (рис. 4 в и 9 а).

Дня определения наблюдаемой равновесной константы ассоциации (KMS) данные, полученные с помощью РИА, были представлены в координатах Скэтчарда (рис. 8 б и 9 б, табл. 3). Как можно видеть из таблицы 3, Kass родительских антипероксидазных антител в 38 раз превышает Kass антипероксидазного сайта БИАТ с двойной специфичностью к HRP и hlgG и в 21 раз превышает KaSS антипероксидазного сайта БИАТ, специфичных к HRP и Мб (рис. 8 б). Следует обратить внимание, что Кдо антипероксидазного сайта БИАТ, специфичных к HRP и Мб, в 1.8 раз превышает K^s антипероксидазного сайта БИАТ со специфичностью к HRP и hlgG, что лежит в пределах погрешности определения Кам твердофазным радиоиммунологическим методом.

Таблица 3. Наблюдаемые равновесные константы ассоциации (Кая) родительских моноклональных и биспецифических моноклональных антител с антигеном, адсорбированным на твердой фазе

Клеточная Антиген на

линия Специфичность твердой фазе К^, М"1

антител

36F9 Анти-HRP HRP (2,0±0,1)Х108

36F9xI4D6 Анти-Мб/HRP HRP (9,6±0,8)х10б

36F9x75G5 Анти-hIgG/HRP HRP (5,3±0,5)х10б

75G5 Анти-hlgG hlgGl (5,9±0,6)Х108

36F9x75G5 Анти-hIgG/HRP hlgGl (2,6±0,2)Х108

Зная соотношение констант, из уравнений 6 и 7 (разделы 2.2 и 2.3) для родительских МКА можно рассчитать соотношение бивалентно и моновалентно связанных антител. Это соотношение составляет 9 и 18, в зависимости от того, значение К,.,., каких БИАТ (анти-Мб/HRP или анти-hIgG/HRP), считать истинной аффинностью антипероксидазного сайта антител. Следовательно, при данной плотности антигена и в данном диапазоне начальных концентраций антител около 90-95% от общего числа связанных родительских МКА ассоциировано бивалентно и только около 5-10% моновалентно.

В случае hlgGl, адсорбированного на твердой фазе (рис. 9 б), Ком родительских МКА в 2.3 раза выше, чем Kass анти-hlgG сайта БИАТ (табл. 3). Соотношение МКА и БИАТ в данном случае подтверждает вывод, сделанный на основе сравнения прямых связывания, об отсутствии бивалентного связывания родительских МКА с иммобилизованным hlgGl. Действительно, теоретически, при отсутствии бивалентного связывания КаИ для родительских MICA должна быть в 2 раза больше, чем Kass для БИАТ (раздел 2.5). Различие между теоретической и экспериментальной величинами К^, лежит в пределах погрешности определения наблюдаемой равновесной константы ассоциации РИА.

3.3. Анализ параметров связывания антител с иммобилизованными антигенами с помощью биосенсора IAsys

Сравнительный анализ связывания родительских МКА и БИАТ с иммобилизованным антигеном с помощью биосенсора IAsys, основанного на принципе «резонансное зеркало», имеет важный методический аспект. На эту тему нами написана протокольная статья, предварительно заказанная у нас одним из редакторов американского журнала иммунологических методов (Journal of Immunological Methods). Важным преимуществом биосенсора IAsys по сравнению с классическими методами анализа, какими являются РИА и ИФА, является возможность быстрого определения не только наблюдаемой равновесной константы ассоциации (Kass), но и наблюдаемых кинетических констант ассоциации и диссоциации (kass и k<¡IS5). Биосенсор позволяет следить за иммунологическим взаимодействием на границе раздела фаз, непосредственно в то время, когда оно происходят, без использования меченых реагентов. Принцип

действия 1А8ув заключается в следующем: поверхность биосенсора освещают лазером, при этом в поверхностном слое возникает быстро затухающее поле, позволяющее детектировать малейшие изменения массы поверхностного слоя биосенсора. Например, при иммунологической реакции антител с иммобилизованным антигеном масса поверхностного слоя увеличивается, и соответствующим образом увеличивается регистрируемый биосенсором сигнал. Регистрируемым сигналом в биосенсоре является угол при котором происходит «резонанс», измеряемый в секундах (в одном градусе 60 минут, в одной минуте 60 секунд).

Анализируемая панель антител включала два типа родительских МКА (анти-НИ-Р и анти-Ь^й) и один тип, полученных от них БИАТ (анти-Ь^О/1111Р). На рисунке 10 представлена суперпозиция нескольких экспериментальных кривых ассоциации антител с антигеном для 5 различных концентраций. Видно, что скорость реакции (коп) увеличивается при увеличении концентрации антител.

100 200 300

Время (с)

Рисунок 10. Пять кривых ассоциации антител (анти-hIgG/HRP) с иммобилизованным антигеном (HRP). Эти данные используются для расчета k<,n для каждой концентрации антител с помощью уравнения 11. Кривые 1-5 соответствуют концентрациям антител равным: 80 пМ; 160 пМ; 240 пМ; 328 пМ и 488 пМ.

Для обработки, преобразования и обсчета экспериментальных данных, полученных с помощью биосенсора IAsys использована специальная программа FASTfit. Уравнение 9, описывающее ассоциацию антител с иммобилизованным антигеном при псевдопервом порядке реакции (раздел 2.4), в программе FASTfit преобразуется следующим образом:

R = R0 + Е(1 - e~kont) (15),

где Ro - сигнал, при t=0. Эта величина специально вводится, чтобы скорректировать изменение концентрации белка в поверхностном слое после добавления раствора антител. Параметр Е называется степенью реакции и аналогичен [В]» в уравнениях 9 и 10.

В настоящих экспериментах диффузионные ограничения не являлись лимитирующим фактором, так как начальная скорость связывания (наклон кривой в первые 20 с ассоциации) не изменялась при изменении интенсивности перемешивания при 40%, 65% и 85%. В то время как при изменении интенсивности перемешивания до 1% начальная скорость связывания падала более чем на порядок.

О 100 200 300

Время (с)

100 200 300 Время (с)

(а)

(б)

Рисунок 11. Анализ ассоциации антител с иммобилизованным антигеном, (а) Сравниваются экспериментальные данные по ассоциации 7 нМ МКА с иммобилизованным (изломанная линия) и кривая уравнения 15 (гладкая линия), (б) Сравниваются экспериментальные данные по ассоциации 1031 нМ БИАТ с иммобилизованным Ы§С1 (изломанная линия) и проведенная кривая уравнения 15 (гладкая линия)._

Рисунок 11 а показывает, что при корректном выборе концентрации антител экспериментальные данные по ассоциации совпадают с кривой уравнения 15. Рассчитанная величина коп равна (1,98±0,09)х10"3 свеличина Е равна 73±2 секунд, величина 1?о равна -0,8±0,1 секунд, величина %2=0,24. Из нашего опыта можно сделать наблюдение о том что, для того чтобы экспериментальная кривая ассоциации хорошо описывалась уравнением 15, ее необходимо получать при относительно невысоких концентрациях антител, при которых сигнал биосенсора не превышает 80 секунд за 5 мин. Оптимальная конечная концентрация антител должна быть близка На рисунке 11 б кривые не совпадают. Рассчитанная величина коп равна (8,44±0,29)х 10"3 с'1, величина Е равна 260±3 секунд, величина Ло равна 39,3+2,7 секунд, величина х2~36,1. При высоких концентрациях антител (>10К(ЦИ), либо при длительном периоде анализа (>5 мин), экспериментальные кривые перестают описываться уравнением 15. При этом более чем на порядок возрастает величина Ло и на два порядка возрастает величина ошибки х2 (рис. 11 б), х2 ~ хи-квадрат, величина, минимизируемая при регрессионном анализе экспериментальных данных. Для двух близких по количеству точек массивов экспериментальных данных, обрабатываемых с помощью определенного уравнения, величина х2 должна быть одного порядка, в том случае если оба массива экспериментальных данных хорошо описываются этим уравнением. В том случае если один массив экспериментальных данных плохо описывается определенным уравнением, по сравнению с другим массивом, величины х2 для этих массивов различаются более чем на порядок. Несовпадение экспериментальных данных с кинетикой псевдо-первого порядка возникает из-за нескольких причин. Первая причина — это гетерогенность антигена. При иммобилизации антиген связывается с матрицей различными своими участками, также происходит частичная инактивация некоторых молекул антигена. Вторая причина — это стерические эффекты в карбоксиметилированном декстране. Ведь

обычно отклонения наблюдаются при высоких концентрациях антител. В некоторых случаях отклонения могут быть связанны с более сложным механизмом иммунологического взаимодействия (например, конформационные изменения, кооперативный эффект, поливалентное взаимодействие) и рассчитываются по более сложным моделям.

4 -

О 150 300 450 Антитела, нМ

(в)

Антитела, нМ

(б)

Рисунок 12. Зависимость к™ от концентрации антител, а) Концентрационная зависимость к™ для связывания родительских антипероксидазных МКА и БИАТ с иммобилизованным HRP. б) Концентрационная зависимость коп для связывания родительских антител против hlgG и БИАТ с иммобилизованным hlgGl._

Для каждого антитела kass рассчитывалась построением линейной зависимости коп от [АЬ]о (уравнение 11). Тангенс угла наклона получаемых прямых равен наблюдаемой кинетической константе ассоциации (ka5s) из уравнения 11. kon для каждой концентрации антител был рассчитан по уравнению 15. Типичные зависимости представлены на рисунках 12 а и 12 б. При высоких концентрациях антител (>10K<j,Sj) получаемая из экспериментальных кривых ассоциации величина ко„ иногда имеет заниженную величину. Это заметно при расчете ka.,s по уравнению 11, так как получаемые при высоких концентрациях антител kon имеют меньшую величину, чем предсказывается другими экспериментальными точками. Подобные значения коП отбрасывались, а окончательная величина kass рассчитывалась из оставшихся данных (табл. 4). Это явление, возможно, объясняется насыщением антигенных эпитопов при высокой концентрации антител.

Экспериментальные данные по диссоциации иммунохимического комплекса обсчитывались с помощью уравнения 13. На рисунке 13 кривые совпадают. Рассчитанная величина каж> равна (8,7±0,1)х1(И с'1, а величина Во равна 58,9±0,1 секунд.

Время (с)

Рисунок 13. Анализ диссоциации иммунохимического комплекса. Сравниваются экспериментальные данные по диссоциации 488 нМ БИАТ с иммобилизованным HRP (изломанная линия) и кривая уравнения 13 (гладкая линия).

Таблица 4. Параметры связывания антител с иммобилизованными антигенами, измеренные с помощью оптического биосенсора.

Специфичность антител Иммобилизованный антиген Оптический бносенсор, IAsys

k„s, M"'c"' kdiss) ^ Kass ^ass^diss»

Аити-HRP HRP (1,9±0,1)х104 (4,0+0,l)xl0"5 (4,8±0,3)xl08

. Анти-hlgG/HRP HRP (8,0±l,0)xl03 (8,ЗД1)хЮ4 (9,6±l,2)xl06

Анти-hIgG hlgGl (I,5±0,2)xl05 (ViO.oxio"4 8 (5,6±0,8)xl0

Анти-hlgG/HRP hlgGl (6,8±0,5)xl04 -4 (3,0±0,l)xl0 (2,3±0,5)xl08

Значение кая антипероксидазных МКА в 2,4 раза больше, чем к«, антипероксидазного сайта БИАТ (табл. 4). А значение ка» родительских МКА против Ь^в в 2,2 раза больше, чем к*« анти-Ь^в сайта БИАТ (табл. 4, рис. 12 6). Теоретически к^ родительских МКА должна быть в 2 раза больше, чем ка53 БИАТ (раздел 2.5). Различие между теоретической и экспериментальной величинами не превышает погрешностей определения (табл. 4). Вместе с тем, к<)1Я антипероксидазного сайта БИАТ в

21 раз больше, чем kdjss антипероксидазных МКА (табл. 4), a K,iS антипероксидазных МКА в 50 раз превышает К^ антипероксидазного сайта БИАТ, что подтверждает вывод, сделанный при анализе иммуноферментным и радиоиммунологическим методами, о том, что антипероксидазные МКА связываются с иммобилизованной HRP бивалентно (раздел 2.5). С другой стороны диссоциация родительских МКА против hlgG и анти-hIgG сайта БИАТ практически одинакова (табл. 4), что подтверждает вывод об отсутствии бивалентного связывания родительских МКА с иммобилизованным hlgGl (раздел 2.5). Кю, родительских MICA против hlgG, определяемая с помощью биосенсора, в 2,4 раза превышает Кк анти-hIgG сайта БИАТ, что близко к теоретически ожидаемому (раздел 2.5).

Следует заметить, что равновесные константы ассоциации (КИ5) антител, определяемые в биосенсоре, хорошо коррелируют с константами, определенными с помощью радиоиммунологического метода (табл. 3 и 4), несмотря на различные способы иммобилизации антигена (ковалентное связывание в биосенсоре и адсорбция на иммунологических планшетах в радиоиммунологическом методе). Это свидетельствует о близости поверхностных концентраций сохранившего иммунологическую активность антигена в обоих методах.

ВЫВОДЫ

1. Получены аффинно-очищенные моноклональные антимиоглобиновые антитела, антипероксидазные антитела, антитела против иммуноглобулина G человека и образованные от них моноклональные биспецифические антитела со специфичностью к миоглобину и пероксидазе хрена и со специфичностью к иммуноглобулину G человека и пероксидазе хрена.

2. Теоретическое рассмотрение закономерностей взаимодействия обычных моноклональных антител и образованных от них биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами позволяет сделать следующие выводы:

а) наблюдаемая равновесная константа ассоциации родительских антител по крайней мере в два раза превышает наблюдаемую равновесную константу ассоциации биспецифических антител вне зависимости от характера связывания с иммобилизованным антигеном, моновалентного или бивалентного;

б) коэффициент (тангенс угла наклона) прямой связывания родительских антител больше, чем коэффициент прямой связывания биспецифических антител вне зависимости от характера связывания с иммобилизованным антигеном;

в) наблюдаемая кинетическая константа ассоциации родительских антител в два раза превышает наблюдаемую кинетическую константу ассоциации биспецифических антител вне зависимости от характера связывания с иммобилизованным антигеном;

г) наблюдаемые кинетические константы диссоциации родительских и биспецифических антител совпадают, если родительские антитела связываются с иммобилизованным антигеном только моновалентно; если же родительские антитела связываются с иммобилизованным антигеном бивалентно, то их наблюдаемая кинетическая константа диссоциации меньше, чем наблюдаемая кинетическая константа диссоциации биспецифических антител.

3. Экспериментальное рассмотрение иммунохимических взаимодействий с участием иммобилизованных антигенов: пероксидазы, миоглобина и иммуноглобулина G человека, аффинно-очищенных моноклональных и образованных от них биспецифических антител с использованием трех различных методов: иммуноферментного, радиоиммунологического и биосенсора IAsys, подтверждает выводы, сделанные при теоретическом рассмотрении закономерностей иммунохимического взаимодействия, и позволяет установить что:

а) антимиоглобиновые и антипероксидазные антитела связываются с иммобилизованным антигеном преимущественно бивалентно;

б) антитела против иммуноглобулина G человека связываются с иммобилизованным антигеном преимущественно моновалентно;

в) 90-95% от общего числа связавшихся с иммобилизованным антигеном антипероксидазных антител ассоциировано бивалентно и около 5-10% моновалентно.

4. Определены наблюдаемые равновесные и кинетические константы ассоциации и диссоциации антипероксидазных антител, антител против иммуноглобулина G человека и образованных от них моноклональных биспецифических антител со специфичностью к миоглобину и пероксидазе хрена и со специфичностью к иммуноглобулину G человека и пероксидазе хрена с иммобилизованными пероксидазой и иммуноглобулином G человека.

5. Предложена и апробирована тремя различными методами иммунологическая модель, предполагающая сравнительный анализ связывания с иммобилизованным антигеном моноклональных антител и образованных от них биспецифических моноклональных антител, для определения характера взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентного или бивалентного),

6. Показано бивалентное связывание биспецифических антител со специфичностью к пероксидазе и миоглобину при одновременной адсорбции на поверхности иммунных планшетов смеси двух антигенов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Dmitriev, D.A., Massino, Yu.S., Smimova, M.B., Segal, O.L., Kolyaskina, G.I., Pavlova, E.V., Osipov, A.P., Egorov, A.M., and Dmitriev, A.D. (2001) The comparison of the ability of monoclonal antibodies directed to different proteins (human IgG, human myoglobin and HRP) and bispecific antibodies derived thereof to bind antigens immobilized on a surface of a solid phase. Clinica Chimica Acta, 309, 57-71.

2. Osipov, A.P., Dmitriev, DA., and Egorov, A.M. Analysis of the binding of bispecific monoclonal antibodies with immobilized antigens (human IgG and horseradish peroxidase) using a resonant mirror biosensor. Biocatalys 2002: Fundamentals and Applications. Moscow, Russia, June 10-15,2002, p. 44.

3. Dmitriev, D.A., Massino, Yu.S., Segal, O.L., Smirnova, M.B., Pavlova, E.V., Gurevich, K.G., Gnedenko, O.V., Ivanov, Yu.D., Kolyaskina, G.I., Archakov, A.I., Osipov, A.P., Dmitriev, A.D., and Egorov, A.M. (2002) Analysis of the binding of bispecific monoclonal antibodies with immobilized antigens (human IgG and horseradish peroxidase) using a resonant mirror biosensor. Journal of Immunological Methods, 261, 103-118.

4. Dmitriev, D.A., Massino, Yu.S., and Segal, O.L. (2003) Kinetic analysis of interactions between bispecific monoclonal antibodies and immobilized antigens using a resonant mirror biosensor. Journal of Immunological Methods, 280, 183-202.

5. Дмитриев, Д.А., Массино, Ю.С., Смирнова, М.Б., Сегал, О.Л, Павлова, Е.В., Коляскина, Г.И., Осипов, А.П., Егоров, A.M., и Дмитриев, А.Д. (2001) Связывание биспецифических моноклональных антител с антигенами, адсорбированными на твердой фазе. Биоорганическая химия, 27,265-274.

6. Дмитриев, ДА., Массино, Ю.С., Сегал, О.Л., Смирнова, М.Б., Павлова, Е.В., Коляскина, Г.И., Гуревич, К.Г., Гнеденко, О.В., Иванов, Ю.Д., Арчаков, А.И., Осипов, А.П., Дмитриев, А.Д., и Егоров, A.M. (2002) Анализ связывания биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами с помощью оптического биосенсора. Биохимия, 67, 1643-1654.

Принято к исполнению 10/06/2005 Исполнено 11/06/2005

Заказ № 929 Тираж: 80 экз..

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дмитриев, Дмитрий Александрович

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Общие представления о биспецифических антителах

2.1.1. История создания биспецифических антител и области их применения

2.1.2. Способы получения биспецифических моноклональных антител

2.1.3. Тестирование биспецифических моноклональных антител

2.1.4. Рекомбинация легких и тяжелых цепей антител в тетрадомах

2.1.5. Антигенсвязывающие свойства биспецифических моноклональных антител

2.1.6. Применение биспецифических моноклональных антител в твердофазных методах

2.2. Принцип работы и устройство биосенсора IAsys

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ связывания биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами"

Гибридомная технология, наряду с обычными моноклональными антителами (МКА), позволяет получать биспецифические моноклональные антитела (БИАТ), конструируемые методами клеточной инженерии [2, 3]. Достоинство этого метода заключается в возможности получать совершенно однородные молекулы БИАТ, сохраняющие структуру «полумолекул» родительских антител (рис. 1). Основное различие БИАТ (класса IgG) и обычных моноклональных антител состоит в следующем. Молекула МКА имеет два антигенсвязывающих сайта. БИАТ также имеют два сайта связывания, но их специфичность различна: первый из сайтов специфичен к одному антигену, второй - к другому (рис. 1).

Ш * Ф W

II II 11 11 a б в

Рисунок 1. Возможная структура комплексов при связывании антител с антигенами, а) Биспецифические моноклональные антитела связываются с двумя разными антигенами; б) и в) родительские моноклональные антитела связываются с двумя одинаковыми антигенами.

Актуальность проблемы. БИАТ могут служить «мостиком» между антигеном и маркерной молекулой (например, ферментом). Именно поэтому многие исследователи считают их конъюгатами нового поколения, поскольку теперь нет необходимости метить МКА [4-7]. Большой массив публикаций свидетельствует о высокой эффективности БИАТ в твердофазных системах [8-16]. Вместе с тем, отсутствуют работы, в которых теоретически и экспериментально сравнивались бы свойства БИАТ и обычных МКА при связывании с иммобилизованным антигеном. Исследование вопроса о связывании БИАТ с иммобилизованным антигеном не только имеет большое значение для использования этого класса биомолекул, но и представляет определенный интерес с точки зрения изучения взаимодействия МКА с иммобилизованными антигенами.

УУ ■"> ■ \ -/Твёрдая фаза / / / / / / / а б в г

Рисунок 2. Возможная структура комплексов при связывании антител и Fab фрагментов с иммобилизованным антигеном, а) Моновалентное связывание моноспецифических антител; б) бивалентное связывание моноспецифических антител; в) моновалентное связывание биспецифических антител; г) моновалентное связывание Fab фрагментов.

С иммобилизованным антигеном МКА (класса IgG) могут связываться как одним антигенсвязывающим сайтом, моновалентно (рис. 2 а), так и двумя антигенсвязывающими сайтами одновременно, бивалентно (рис. 2 б), а БИАТ (класса IgG) представляют собой моновалентные молекулы в отношении каждого из антигенов (рис. 2 в).

При использовании МЕСА в иммуногистохимии, иммуноблоттинге, иммуноферментном анализе (ИФА) и других твердофазных системах необходима количественная оценка процесса связывания антител с иммобилизованным антигеном. Для характеристики связывания МКА особенное значение имеют две величины: аффинность, характеризующая степень сродства антитела к данному эпитопу антигена, и авидность, или общая мера стабильности комплекса антиген-антитело. Различие между аффинностью и авидностью может быть обусловлено способностью антител (например, класса IgG) бивалентно взаимодействовать с иммобилизованным антигеном. За счет бивалентного связывания происходит значительное возрастание эффективности связывания антител с антигеном на твердой фазе [17-28].

Из-за стерических факторов не все антитела способны связываться с иммобилизованным антигеном бивалентно. Наличие бивалентного связывания антител с иммобилизованным антигеном необходимо доказывать не только для каждой пары антитело—антиген, но и для каждого клона антител к данному антигену [21].

Ранее бивалентное связывание антител с иммобилизованным антигеном доказывали и изучали путем сравнения нативных антител и их Fab фрагментов [17-28] - относительно небольших фрагментов антител, которые включают антигенсвязывающий сайт и образуются в результате обработки антител папаином. Fab фрагменты могут связываться с иммобилизованным антигеном только моновалентно (рис. 2 г) и, таким образом, служат в качестве инструмента для количественной оценки аффинности. Сравнительный анализ связывания с иммобилизованным антигеном нативных антител и их Fab фрагментов является классической иммунологической моделью для апробации новых методов исследования [29, 30]. Следует отметить, что упомянутое сравнение не является достаточно полноценным. Несовершенство подобного сравнения заключается в том, что структура Fab фрагментов отлична от структуры нативных молекул антител. Имеются данные, что Fc участок может иметь значение для антигенсвязывающей способности антител (например, он может влиять на гибкость молекулы) [31].

С другой стороны, бивалентное связывание антител с иммобилизованным антигеном можно изучать путем сравнения констант связывания антител в растворе и на твердой фазе [32]. При этом константа связывания антител в растворе служит в качестве инструмента для количественной оценки аффинности. Однако, иммобилизация антигена на твердой фазе (например, на поверхности иммунного планшета) часто приводит к частичному изменению конформационной структуры белка, изменяющей его антигенсвязывающие свойства [33, 34]. Таким образом, аффинность антител, измеряемая в растворе, не является истинной для экспериментов, в которых антитела связываются с иммобилизованным антигеном. На наш взгляд, идеальной моделью для оценки аффинности моновалентного связывания могут служить БИАТ. Структура «полумолекул» БИАТ тождественна структуре «полумолекул» нативных родительских антител (рис. 1). И за исключением одного из вариабельных участков и первичная, и третичная структура БИАТ совпадает со структурой нативных родительских антител (в том случае, когда обе «полумолекулы» БИАТ относятся к одному подклассу IgG) [2, 3, 35, 36].

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось количественное изучение взаимодействия родительских моноклональных и и биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

3) Экспериментально изучить характер и определить количественные характеристики иммунохимического взаимодействия с различными иммобилизованными антигенами, на примере трех клонов обычных антител: антимиоглобиновых (анти-Мб), антипероксидазных (анти-HRP) и антител против IgG человека (анти-hIgG); и двух клонов образованных от них биспецифических антител (биспецифические антитела, несущие сайты связывания с миоглобином и пероксидазой хрена (анти-Мб/HRP), и биспецифические антитела, несущие сайты связывания с IgG человека и пероксидазой хрена (анти-hIgG/HRP)). Провести сравнение с использованием иммуноферментного, радиоиммунологического методов и с помощью оптического биосенсора, основанного на принципе «резонансное зеркало» (IAsys). Соотнести результаты, полученные тремя методами.

4) Апробировать иммунохимическую модель, предполагающую сравнительный анализ связывания родительских моноклональных антител и биспецифических моноклональных антител, для определения типа взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентного или бивалентного). В качестве инструмента для оценки аффинности моновалентного связывания использовать биспецифические моноклональные антитела.

5) Определить условия бивалентного связывания биспецифических моноклональных антител с различными антигенами одновременно иммобилизованными на твердой фазе.

Научная новизна и научно-практическая значимость исследования. В результате проведенного исследования впервые теоретически и экспериментально были сравнены свойства БИАТ и обычных МКА при связывании с иммобилизованными антигенами. Изучение этого вопроса имеет большое значение для использования БИАТ в различных твердофазных системах. Экспериментально эффективность связывания БИАТ с иммобилизованными антигенами в сравнении с родительскими антителами изучалась ранее только одной группой исследователей [37], к сожалению, их результаты не интерпретируются существующей теорией.

Впервые апробирована иммунологическая модель, предполагающая сравнительный анализ связывания родительских МКА и БИАТ, для определения типа взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентного или бивалентного). Теперь для внедрения новых методов исследования предлагается использовать именно эту иммунологическую модель. В то время как обычно используют иммунологическую модель, предполагающую сравнительный анализ связывания антител и их F(ab) фрагментов с иммобилизованным антигеном [29, 30].

Также впервые с помощью иммуноферментного метода показано наличие бивалентного связывания БИАТ с двумя антигенами, одновременно адсорбированными на твердой фазе.

Важный методический аспект имеет сравнительный анализ связывания родительских МКА и БИАТ с иммобилизованным антигеном с помощью современного оптического биосенсора IAsys, основанного на принципе «резонансное зеркало» [29, 38-46]. Это метод нового поколения, который в настоящее время начинает активно использоваться для количественной оценки иммунохимических взаимодействий.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Дмитриев, Дмитрий Александрович

выводы

1. Получены аффинно-очшценные моноклональные антимиоглобиновые антитела (анти-Мб), антипероксидазные антитела (анти-HRP), антитела против иммуноглобулина G человека (анти-hIgG) и образованные от них моноклональные биспецифические антитела со специфичностью к миоглобину и пероксидазе хрена (анти-Мб/HRP) и со специфичностью к иммуноглобулину G человека и пероксидазе хрена (анти-hIgG/HRP).

2. Теоретически разобраны закономерности взаимодействия обычных моноклональных антител и образованных от них биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами. а) Доказано, что наблюдаемая равновесная константа ассоциации родительских антител по крайней мере в два раза превышает наблюдаемую равновесную константу ассоциации биспецифических антител вне зависимости от характера связывания с иммобилизованным антигеном, моновалентного или бивалентного. б) Доказано, что коэффициент кривой связывания родительских антител больше, чем коэффициент кривой связывания биспецифических антител вне зависимости от характера связывания с иммобилизованным антигеном. в) Доказано, что наблюдаемая кинетическая константа ассоциации родительских антител в два раза превышает наблюдаемую кинетическую константу ассоциации биспецифических антител вне зависимости от характера связывания с иммобилизованным антигеном. А наблюдаемые кинетические константы диссоциации родительских и биспецифических антител совпадают, если родительские антитела связываются с иммобилизованным антигеном только моновалентно. Если же родительские антитела связываются с иммобилизованным антигеном бивалентно, то их наблюдаемая кинетическая константа диссоциации меньше, чем наблюдаемая кинетическая константа диссоциации биспецифических антител.

3. Экспериментально взаимодействие антител с иммобилизованным антигеном изучено тремя методами. а) Твердофазным иммуноферментным методом проанализированы коэффициенты кривой связывания обычных моноклональных (анти-Мб, анти-hIgG и анти-HRP) и образованных от них биспецифических антител (анти-Мб/HRP и анти-hIgG/HRP) с антигенами, адсорбированными на поверхности иммунных планшетов. б) Радиоиммунологическим методом определенны наблюдаемые равновесные константы ассоциации родительских (анти-hIgG и анти-HRP) и биспецифических моноклональных антител (анти-hIgG/HRP) с адсорбированными на поверхности иммунных планшетов антигенами. в) С помощью биосенсора IAsys определенны кинетические и равновесные константы ассоциации и диссоциации родительских (анти-hlgG и анти-HRP) и биспецифических моноклональных антител (анти-hlgG/HRP) с ковалентно иммобилизованными антигенами. г) Результаты, полученные тремя различными методами совпадают. Антимиоглобиновые и антипероксидазные антитела связываются с иммобилизованным антигеном преимущественно бивалентно, а антитела против hlgG связываются с иммобилизованным антигеном преимущественно моновалентно.

4. Предложена и апробирована тремя различными методами иммунологическая модель, предполагающая сравнительный анализ связывания с иммобилизованным антигеном обычных моноклональных антител и образованных от них биспецифических моноклональных антител, для определения характера взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентного или бивалентного).

5. Показано бивалентное связывание биспецифических антител со специфичностью к пероксидазе и миоглобину при одновременной адсорбции на поверхности иммунных планшетов смеси двух антигенов. т к

2.3. Заключение

Как подробно теоретически доказано в приложении, обычные МКА более эффективно взаимодействуют с иммобилизованным антигеном, чем ассоциации (Кш, М"1) и наблюдаемой равновесной константой диссоциации (Kdiss, М) следующим образом:

16)

17) образованных от них БИАТ. Следует заметить, что мы рассмотрели самый простой случай взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном, подобный тестированию антигена в иммуноблоттинге или иммуногистохимии. Для более сложных систем анализа, таких как сэндвич-метод или конкурентный анализ, необходимо проводить отдельные исследования сравнительной эффективности БИАТ и МКА.

Основной задачей, ради которой была сделана данная работа, является апробация сравнительного анализа связывания родительских моноклональных антител и биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами для определения типа взаимодействия антител (моновалентного или бивалентного). Изучение бивалентного связывания антител с иммобилизованным антигеном путем сравнения нативных антител и их Fab фрагментов является предметом постоянных исследований и публикации [17-30]. Сравнительный анализ связывания с иммобилизованным антигеном нативных антител и их Fab фрагментов является классической иммунологической моделью для апробации новых методов исследования [29, 30]. Мы предлагаем во всех этих случаях использовать вместо Fab фрагментов, биспецифические моноклональные антитела, так как за исключением одного из вариабельных участков и первичная, и третичная структура БИАТ совпадает со структурой нативных родительских антител (в том случае, когда обе «полумолекулы» БИАТ относятся к одному подклассу IgG) [2, 3].

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4.1. Реагенты и оборудование

В работе были использованы следующие реактивы: изофермент С пероксидазы из корней хрена, RZ>3.0, ("Biozyme", Великобритания); бычий сывороточный альбумин (БСА), о-фенилендиамина гидрохлорид (ОФД), этаноламин, диэтаноламин, гексагидрат п-нитрофеннилфосфата натрия, азид натрия, хлорамин Т, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид (EDC), N-гидроксисукцинимид (NHS), глицин ("Sigma", США); твин 20, 2-меркаптоэтанол ("Ferak Berlin", Германия); трис, додецилсульфат натрия (SDS) ("Serva", Германия); перекись водорода 30% ("Chemapol", Чехословакия); сефадекс G-25, BrCN-Сефароза 4В ("Pharmacia", Швеция); гидроокись натрия, лимонная кислота моногидрат, марки "чда" ("Lachema", Чехословакия); аммиак, уксусная кислота, серная кислота, соляная кислота, марки "осч" ("Мосреактив" Россия); ацетат, гидрокарбонат, карбонат натрия; хлориды натрия и магния; сульфат аммония; одно- и двузамещенные гидраты фосфатов натрия; марок "осч" и "чда" ("Мосреактив", Россия);

125 натрий I («Изотоп», Россия). Иммуноглобулин G человека (подкласс 1) был любезно предоставлен Баталовой Т.Н, Институт имени Габричевского, Москва. Миоглобин человека был предоставлен Массино Ю.С. из института ВНД и НФ РАН, Москва.

Центрифугирование проводили на центрифуге «Весктапп» (Швеция). Для гель фильтрации использовали оборудование "LKB" (Швеция). Спектрофотометрические измерения проводились на плашечном ридере Labsystems (США), спектрофотометре DU 8В ("Becman", США). Для SDS-электрофореза использовали установки и реактивы «Bio-Rad» (США). В качестве маркеров молекулярной массы использовали набор низкомолекулярных стандартов для электрофореза фирмы "Farmacia".

Радиоиммунологические измерения проводили на сцинтиляционном у-счетчике GammaTrac 1191 (США).

4.2. Методы исследований

4.2.1. Клеточные линии

В качестве источников моноспецифических и биспецифических антител использовали панель гибридом и тетрадом, полученных в лаборатории нейроиммунологии ИВНД и НФ РАН под руководством Ю.С. Массино. В работе применяли антитела к трем антигенам: миоглобину (Мб), пероксидазе хрена (HRP) и IgG человека (hlgG); три клона обычных моноклональных антител (анти-Мб, анти-hIgG и анти-HRP) и два клона образованных от них биспецифических моноклональных антител (анти-Мб/HRP и анти-hIgG/HRP). Специфичность продуцируемых антител и их изотипы приведены в таблице 1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дмитриев, Дмитрий Александрович, Москва

1. Littlefield, W. (1964) Selectiion of hybrids from matings of fibroblasts invitro and their presumed recombinations. Science, 145, 709-710.

2. Milstein, C., and Cuello, A.C. (1983) Hybrid hybridomas and their use inimmunohistochemistry. Nature, 305, 537-548.

3. Milstein, C., and Cuello A. C. (1984) Hybrid hybridomas and the productionof bispecific monoclonal antibody. Immunol. Today, 5, 299-304.

4. Cao, Y., and Suresh, M.R. (1998) Bispecific antibodies as novelbioconjugates. Bioconjug. Chem., 9, 635-645.

5. Fanger, M.W., Morganelli, P.M., and Guyre, P.M. (1992) Bispecificantibodies. Crit Rev Immunol, 12,101-124.

6. Fanger, M.W., and Guyre, P.M. (1991) Bispecific antibodies for targetedcellular cytotoxicity. Trends Biotechnol, 9, 375-380.

7. Self, C.H., and Cook, D.B. (1996) Advances in immunoassay technology.

8. Curr Opin Biotechnol, 7, 60-65.

9. Berkova, N., Karawajew, L., Korobko, V., Behrsing, O., Micheel, В.,

10. Bugari, G., Polesi, C., Beretta, A., Ghelmi, S., and Albertini, A. (1990)

11. Quantitative immunoenzymatic assay of human lutropin, with use of a bispecific monoclonal antibody. Clin. Chem., 36, 47-52.

12. Cao, Y., Christian, S., and Suresh, M.R. (1998) Development of abispecific monoclonal antibody as a universal immunoprobe for detecting biotinylated macromolecules. J. Immunol. Methods., 220, 8591.

13. Karawajew, L., Behrsing, O., Kaiser, G., and Micheel, B. (1988)

14. Production and ELISA application of bispecific monoclonal antibodies against fluorescein isothiocyanate (FITC) and horseradish peroxidase (HRP). J. Immunol. Methods, 111, 95-99.

15. Koelemij, R., Kuppen, P.J., van de Velde, C.J., Fleuren, G.J., Hagenaars,

16. M., and Eggermont, A.M. (1999) Bispecific antibodies in cancer therapy, from the laboratory to the clinic. J. Immunother. 22, 514-524.

17. Kreutz, F.T., and Suresh, M.R. (1997) Novel bispecific immunoprobe forrapid and sensitive detection of prostate-specific antigen. Clin. Chem. 43, 649-56.

18. Segal, D.M., Weiner, G.J., and Weiner, L.M. (1999) Bispecific antibodiesin cancer therapy. Curr. Opin. Immunol., 11, 558-62.

19. Songsivilai, S., and Lachmann, P.J. (1990) Bispecific antibody: a tool fordiagnosis and treatment of disease. Clin. Exp. Immunol., 79, 315-21.

20. Takahashi, M., and Fuller, S. A. (1988) Production of murine hybridhybridomas secreting bispecific monoclonal antibodies for use in urease-based immunoassays. Clin. Chem., 34, 1693-1696.

21. Crothers, D.M., and Metzger, H. (1972) The influence of polyvalency onthe binding properties of antibodies. Immunochemistry, 9, 341-357.

22. Davis, K.A., Abrams, В., Iyer, S.B., Hoffman, R.A., and Bishop, J.E.1998) Determination of CD4 antigen density on cells: role of antibody valency, avidity, clones, and conjugation. Cytometry, 33, 197-205.

23. Dower, S.K., Titus, J.A., DeLisi, C., and Segal, D.M. (1981) Mechanism ofbinding of multivalent immune complexes to Fc receptors. 1. Equilibrium binding. Biochemistry, 20, 6326-34.

24. Dower, S.K., Titus, J.A., DeLisi, C., and Segal, D.M. (1981) Mechanism ofbinding of multivalent immune complexes to Fc receptors. 2. Kinetics of binding. Biochemistry, 20, 6335-40.

25. Dower, S.K., Ozato, К., and Segal, D.M (1984) The interaction ofmonoclonal antibodies with MHC class I antigens on mouse spleen cells. I. Analasys of the mechanism of binding. J. Immunol., 132, 751-758.

26. Hornick, C. L., and Karush, F. (1972) Antibody affinity. III. The role ofmultivalence. Immunochemistry, 9, 325-343.

27. Karulin, A.Yu., and Dzantiev, B.B. (1990) Polyvalent interaction ofantibodies with bacterial cells. Mol. Immunol., 27, 965-971.

28. Kaufman, E.N., and Jain, R.K. (1992) Effect of bivalent interaction uponapperant antibody affinity: experimantal confirmation of theory using fluorescence photobleaching and implications for antibody binding assays. Cancer res, 52, 4157-4167.

29. Mason, D.W., and Williams, A.F. (1980) Kinetics of antibody reactions andthe analysis of cell surface antigens. In: Weir, D.M., editor. Handbook of Experimental Immunology, fourth ed. Blackwell Scientific, Oxford, 38.1-38.17.

30. Mattes, M.J. (1997) Binding parameters of antibodies reacting withmultivalent antigens: functional affinity or pseudo-affinity. J. Immunol. Methods, 202, 97-98.

31. Roubey, R.A., Eisenberg, R.A., Harper, M.F., and Winfield, J.B. (1995)

32. Anticardiolipin" autoantibodies recognise beta 2-glycoprotein I in the absence of phospholipid. Importance of Ag density and bivalent binding. J. Immunol., 154, 954-960.

33. George, A.J.T., French, R.R., and Glennie, M.J. (1995) Measurement ofkinetic binding constants of a panel of anti-saporin antibodies using a resonant mirror biosensor. J. Immunol. Methods, 183, 51-63.

34. Roggenbuck, D., Konig, H., Niemann, В., Schoenherr, G., Jahn, S., and

35. Porstmann, T. (1994) Real-time biospecific interaction analysis of a natural human polyreactive monoclonal IgM antibody and its Fab and scFv fragments with several antigens. Scand J. Immunol., 40, 64-81.

36. Operational aspects of antibody affinity constants measured by liquid-phase and solid-phase assays. J Mol Recogn, 5, 9-18.

37. Frankel, M.E. and Gerhard,, W. (1979) The rapid determination of bindingconstants for antiviral antibodies by a radioimmunoassay. An analysis of the interaction beetween hybrydoma proteins and influenza virus. Mol. Immunol. 16, 101-106.

38. Allard, W.J., Moran, C.A., Nagel, E., Collins, G., and Largen, M.T. (1992)

39. Antigen binding properties of highly purified bispeciflc antibodies. Mol Immunol, 29, 1219-1227.

40. Smirnova, M.B., Dergunova, N.N., Kizim, E.A., Massino, Yu.S., Nikulina,

41. V.A. Segal, O.L., Tereshkina, E.B., Kolyaskina, G.I. and Dmitriev, A.D. (1997) Study of antigen-binding properties of bispecific antibodies. Biochemistry (Moskow), 62, 41-48.

42. Horenstein, A., Poiesi, C., Camagna, M., de Monte, L., Mariani, M.,

43. Albertini, A. and Malavasi, F. (1994) Biosensor analysis of antigenantibody interactions as a priority step in the generation of monoclonal bispecific antibodies. Cell Biophys. 24-25, 109-117.

44. Buckle, P.E., Davies, R.J., Kinning, Т., Yeng, D., Edwards, P.R., Pollard

45. Knight, D., and Lowe, C.R. (1993) The resonant mirror: a novel optical sensor for direct sensing of biomolecular interactions Part II: Applications. Biosensors Bioelectron., 8, 355-363.

46. Cush, R., Cronin, J. M., Stewart, W.J., Maule, C.H., Molloy, J., and

47. Goddard, N.J. (1993) The resonant mirror: a novel optical biosensor for direct sensing of biomolecular interactions Part I: Principle of operation and associated instrumention. Biosensors Bioelectron., 8, 347-353.

48. Davies, R.J., Edwards, P.R.,Watts, H.J., Lowe, C.R., Buckle, P.E., Yeng,

49. D., Kinning, T.M., and Pollard-Knight, D.V. (1994) The Resonant Mirror: a versatile tool for the study of biomolecular interaction. In: Crabb, J.W. (Ed.), Techniques in Protein Chemistry V. Academic Press, London, p. 285-293.

50. IAsys Cuvette System FASTfit Guide. (1993) Fisons Applied Sensor

51. Technology. Cambridge, England.

52. IAsys Cuvette System Methods Guide. (1993) Fisons Applied Sensor

53. Technology. Cambridge, England.

54. IAsys Cuvette System Users's Guide. (1993) Fisons applied sensortechnology. Cambridge, England.44. http ://www. affinity-sensors, со .uk45. http://www.biochem.northwestern.edu/Keck/PDF%20documents/IAsys

55. Yeung, D., Gill, A., Maule, C.H., and Davies, R.J. (1995) Detection andquantification of biomolecular interactions with optical biosensors. Trends Anal. Chem., 14,49-54.

56. Nissonoff, A., and Rivers, M. M. (1961) Recombination of a mixture ofunivalent antibody fragments of different specificity. Arch. Biochem. Biophys., 93, 460-462.

57. Cook, A.G., and Wood P.J. (1994) Chemical synthesis of bispecificmonoclonal antibodies: potential advantages in immunoassay systems. J. Immunol. Methods. 171, 227-37.

58. Ward, E.S., Gussow, D., Griffits, A.D., Jones, P.T. and Winter, G. (1989)

59. Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherihia coli. Nature, 341, 544- 546.

60. Holliger, P., Prospero, Т., and Winter, G. (1993) "Diabodies": smallbivalent and bispecific antibody fragments. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 90, 6444-6448.

61. Pack, P., and Plutckthun, A. (1992) Miniantibodies: Use of amphipathichelices to produce functional, flexibly linked dimeric Fv fragments with high avidity in Escherichia coli. Biochemistry, 31,1579-1584.

62. Coloma, M.J., and Morrison, S.L. (1997) Design and production of noveltetravalent bispecific antibodies. Nat. Biotechnol. 15, 159-63.

63. Hudson, P.J. (1999) Recombinant antibody constructs in cancer therapy.

64. Curr Opin Immunol, 11, 548-557.

65. Kipriyanov, S.M., Dubel, S., Breitling, F., Kontermann, R.E., and Little, M.1994) Recombinant single-chain Fv fragments carrying C-terminal cysteine residues: production of bivalent and biotinylated miniantibodies. Mol. Immunol., 31,1047-58.

66. Kruif, J., and Logtenberg, T. J.(1996) Leucine zipper dimerized bivalentand bispecific scFv antibodies from a semi-synthetic antibody phage display library. Biol. Chem., 271, 7630-4.

67. Muller, K.M., Arndt, K.M., and Pluckthun, A. (1998) A dimeric bispecificminiantibody combines two specificities with avidity. FEBS Letters, 432, 45-48.

68. Pluckthun, A., and Pack, P. (1997) New protein engineering approaches tomultivalent and bispecific antibody fragments. Immunotechnoiogy, 3, 83-105.

69. Santos, A.D., Kashmiri, S.V., Hand, P.H., Schlom, J., and Padlan

70. E.A.(1999) Generation and characterization of a single gene-encoded single-chain-tetravalent antitumor antibody. Clin Cancer Res., 5, 3118s-3123s.

71. Todorovska, A., Roovers, R.C., Dolesal, O., Kortt, A.A., Hoogenboom,

72. H.R., and Hudson, P.J. (2001) Design and application of diabodies, triabodies and tetrabodies for cancer targeting. J. Immunol. Methods, 248, 47-56.

73. Bosslet, K., Stainstraesser, A., Hermentin, P., Kuhlmann, L., Bruynck, A.,

74. Magerstaedt, M., Seemann, G., Schwarz, A., and Sedlacek, H. H. (1991) Generation of bispecific monoclonal antibodies for two phase radioimmunotherapy. Br. J. Cancer, 63, 681-686.

75. Reardan, D.T., Meares, C.F., Goodwin, D.A., Mc.Tigne, T.N., David, G.S.,

76. Stone, M.R., Leung, J.P., Bartholomew, R.M., and Frincke, J.M. (1985) Antibodoes against metal chelates. Nature, 316, 265-268.

77. Чехонин, В.П., Жирков, Ю.А., и Дмитриева, Т.Б. (1995) Направленныйтранспорт психотропных средств через гематоэнцефалический барьер. Моноклональные антитела в нейробиологии. Под ред. М.Б. Штарка, М.В. Старостиной.- Новосибирск: АО "Офсет", 171-182.

78. Cotton, R.G.H., and Milstein, С. (1973) Fusion of two immunoglobulinproducing myeloma cells. Nature, 244, 42-43.

79. Kohler, G., and Milstein, C. (1975) Continuous culture of fused cellssecreting antibody of predefined specificity. Nature, 256, 495-497.

80. Ленинджер, A. (1985) "Основы биохимии", Москва, "Мир", т.2.

81. Wong, J.,Т., and Colvin R. В. (1987) Bi-specific monoclonal antibodies:selective binding and complement fixation to cells that express two different surface antigens. J. Immunol., 139, 1369-1374.

82. Tada, H., Toyoda, Y., and Iwasa S. (1989) Bispecific antibody-producinghybrid hybridoma and its use in one-step immunoassays for human lymphotoxin. Hybridoma, 8, 73-83.

83. Reading, C.L., and Bator, J.M. (1988) Proceedings for the 5th Annual1.dustry Conference and Exhibition, San Francisco, CA.

84. Staerz, U.D., and Bevan, M.J. (1986) Hybrid hybridoma producing abispecific monoclonal antibody that can focus effector T-cell activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83,1453-1457.

85. Tiebout, R.F., Van Boxtel-Oosterhof, F., Strieker, E.A.M., and Zeijlemaker,

86. W. P. (1987) A human hybrid hybridoma. J. Immunol, 139, 3402-3405.

87. Suresh, M.R., Cuello, A.C., and Milstein, C. (1986) Advantages ofbispecific hybridomas in one-step immunocytochemistry and in immunoassays. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 7989-7993.

88. De Lau, W.B.M., Van Loon, A.E., Heije, K., Valerio, D., and Bast,

89. B.J.E.G. (1989) Production of hybrid hybridoma based on HATS -neomycin1 double mutants. J. Immunol. Methods, 117, 1-8.

90. Koolwijk, P., Rosemuller, E., Kees Stad, R., De Lau, W.B.M., and Bast,

91. B.J.E.G. (1988) Enrichment and selection of hybrid hybridomas by percoll density gradient centrifugation and fluorescent-activated cell sorting. Hybridoma, 7, 217-225.

92. Jantcheff, P., Winkler, L., Karawajew, L., Kaiser, G., Bottger, V., and

93. Micheel, B. (1993) Hybrid hybridomas producing bispecific antibodies to CEA and peroxidase isolated by a combination of HAT medium selection and fluorescence-activated cell sorting. J. Immunol. Methods, 163,91-97.

94. De Preval, C., and Fougereau, M. (1976) Specific interaction between VHand Vl regions of human monoclonal immunoglobulins. J. Mol. Biol., 102, 657-678.

95. Hamel, P.A., Klein, M.H., and Dorrington, K.J. (1986) The role of the VLand Vh segments in the preferential reassociation of immunoglobulin subunits. Mol. Immunol., 23, 503-510.

96. Hamel, P.A., Klein, M.H., Smith-Gill, S.J., and Dorrington, K.J. (1987)

97. Relative noncovalent association constant between immunoglobulin H and L chains is unrelated to their expression or antigen-binding activity. J. Immunol., 139, 3012-3020.

98. Hendershot, L.M., Bole, D.G., and Kearney, J.F. (1987) The role of « immunoglobulin heavy chain binding protein. Immunol. Today, 8, 111115.

99. Knarr, G., Gething, M.J., Modrow, S., and Bucher, J. (1995) BIP bindingsequences in antibodies. J. Biol. Chem., 270, 27589-27594.

100. Hendershot, L., Bole, D., Koller, G., and Kearney, J.F. (1987) Assemblyand secretion of heavy chains that do not associate posttranslationally with immunoglobulin heavy chain binding protein. J. Cell. Biol., 104, 761-767.

101. Hendershot, L.M. (1990) Immunoglobulin heavy chain and binding proteincomplexes are dissociate in vivo by light chain addition. J. Cell. Biol., 111,829-837.

102. De Lau, W.B.M., Heije, K., Neefjes, J.J., Oosterwegel, M., Rosemuller, E., * and Bast, B.J.C.G. (1991) Absence of preferential homologous H/Lchain association in hybrid hybridomas. J. Immunology, 146, 906-914.

103. Massino, Y.S., Dergunova, N.N., Kizim, E.A., Smirnova, M.B.,

104. Tereshkina, E.B., Kolyaskina, G.I., and Dmitriev, A.D. (1997) Quantitative analysis of the products of IgG chain recombination in hybrid hybridomas based on affinity chromatography and radioimmunoassay. J. Immunol. Methods, 201, 57.

105. Smith-Gill, S.J., Hamel, P.A., Klein, M.H., Rudikoff, S., and Dorrington,

106. K.J. (1986) Contribution of the Vk4 light chain to antibody specificity for lysozyme and b(l,6) D-galactan. Mol. Immunol., 23, 919-926.

107. Somasundaram, C., Matzku, S., Schuhmacher, J., and Zoller, M. (1993)

108. Development of a bispecific monoclonal antibody against a gallium-67 chelate and the human melanoma-associated antigen p 97 for potential use in pretargeted immunoscintiography. Cancer Immunol. Immunother., 36, 337-345.

109. Hudson, N.W., Mudgett, M., Panka, D.J., and Margolies, M.N. (1987)1.munoglobulin chain recombination among antidigoxin antibodies by hybridoma-hybridoma fusion. J. Immunol., 139, 2715-2723.

110. Morelli, L., Plotkin, L., Leoni, J., Fossati, C.A., and Margni, R.A. (1993)

111. Mol. Immunol., 3, 695-700.

112. Варфаломеев, С.Д., Зайцев, C.B., и Мевх, А.Т. (1985) Физикохимические исследования молекулярных механизмов действия физиологически активных соединений. Рецепция. "Биоорганическая ^ химия" (Итоги науки и техники) ВИНИТИ, Москва, "Мир", т. 3, стр.51.55.

113. Scubitz, К.М, O'Hara, D.S., and Smith, I.W. (1977) Antibody-haptenreaction kinetics: a comparison of hapten interactions with IgG and Fab preparations. J. Immunology, 118,1971-1976.

114. Kranz, D.M., Herron, J.N., and Voss, E.W. (1982) Mechanisms of ligandbinding by monoclonal anti-fluorecyl antibodies. J. Biol. Chem., 257, 6987-6995.

115. Auriol, J., Guesdon, J.L., Masc, J.C., and Nato F. (1994) Development of abispecific monoclonal antibody for use in molecular hybridisation. J. Immunol. Methods, 169, 123-133.

116. Nakane, P.K., and Kawaoi, A. (1974) Peroxidase-labelled antibody. A newmethod of conjugation. J. Histochem. Cytochem., 22, 1084-1099.

117. Klotz, I.M. (1982) Numbers of receptor sites from Scatchard graphs: factsand fantasies. Science,; 217, 1247-1249.

118. Thompson, R.J., and Jackson, A.P. (1984) Cyclic complexes and highavidity antibodies. Trends Biochem. Sci., 9,1-15.

119. Greenbury, C.L., Moore, D.H., and Nunn, L.A.C. (1965) The reaction withred cells of 7S antibody, its subunits and their recombinants. Immunology, 8, 420-431.

120. Lamarre, A., and Talbot, P.J. (1995) Protection from lethal coronavirusinfection by immunoglobulin fragments. J. Immunol., 154, 3975-3984. s 100. Смирнова, М.Б., Никулина, В.А., Сегал, О.JI., Кизим, Е.А., Массино,V

121. Handbook of biochemistry and molecular biology. (1976) Ed. Faseuau,

122. G.O. V. II. P. 383. 3rd ed. CRC Press.

123. Ishikawa, E., Imagava, M., Hashida, S., Yoshitake, S., Hamaguchi, Y.,and Ueno, T. (1983) Enzyme-labelling of antibodies and their fragments for enzyme immunoassay and immunohistochemical staining. J Immunoassay, 4, 209-260.a

124. Greenwood, F.G., Hunter, W.M., and Glover, J.S. (1963) The preparation1 о 1of I-labeled human growth hormone of high specific activity. Biochem J, 89, 114-123.

125. Чард, Т. Радиоиммунологические методы. (1981) Варшавский, Я.,М.1. Ред.) "Мир", Москва.

126. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assemblyof the head of bacteriophage T4. Nature, 277, 680-685.

127. Dmitriev, D.A., Massino, Yu.S., and Segal, O.L. (2003) Kinetic analysisof interactions between bispecific monoclonal antibodies and immobilized antigens using a resonant mirror biosensor. J. Immunol. Meth.,280, 183-202.

128. Leatherbarrow, R.J. (1990) Use linear and non-linear regression to fit t biochemical data. Trends Biol. Sci. 15, 455-458.

129. O'Shannessy, D.J., Brigham-Burke, M., Soneson, K.K., Hensley, P., and

130. Brooks, I. (1993) Detemination of rate and equilibrium binding constants for macromolecular interactions using surface plasmon resonance: use of nonlinear least squares analysis methods. Anal. Biochem., 212,457.

131. Davies, O.L., and Goldsmith, P.L. (1977) Statistical Methods in Researchand Production. Longman.

132. Motulsky, H.J., and Ransnas, L.A. (1987) Fitting curves to data using nonlinear regression: a practical and nonmathematical review. FASEB J. 1, 365-74.

133. Gomes, P., and Andreu, D. (2002) Direct kinetic assay of interactions between small peptides and immobilized antibodies using a surface plasmon resonance biosensor. J. Immunol. Methods, 259, P217-230.

134. O'Shannessy, D.J., and Winsor, D.J. (1996) Interpretation of deviationsfrom pseudo-first order kinetic behavior in the characterization of ligand binding by biosensor technology. Anal. Biochem. 236, 275.

135. Edwards, P.R., Gill, A., Pollard-Knight, D.V., Hoare, M., Buckle, P.E.,1.we, P.A. and Leatherbarrow, R.J. (1995) Kinetics of protein-protein interactions at the surface of an optical biosensor. Anal. Biochem. 231, 210-223.

136. Edwards, P.R., Maule, C.H., Leatherbarrow, R.J., and Winzor, D.J. (1998)

137. Second-order kinetic analysis of IAsys biosensor data: Its use and applicability. Anal. Biochem. 263, 1-17.

138. Gill, A., Leatherbarrow, R.J., Hoare, M., Pollard-Knight, D.V., Lowe, P.A., and Fortune, D.H. (1996) Analysis of kinetic data of antibody-antigen interaction from an optical biosensor by exponential curve fitting. J. Biotechnol. 48, 117-132.

139. Hall, D.R., Gorgani, N.N., Altin, J.G., and Winzor, D.J. (1997) Theoretical and Experimental Considerations of the Pseudo-First-Order Approximation in Conventional Kinetic Analysis of IAsys Biosensor Date. Anal. Biochem. 253, 145-159.

140. Schuck, P., and Minton, A.P. (1996) Analysis of mass transport-limited binding kinetics in evanescent wave biosensors. Anal. Biochem. 240, 262281.

141. Muller, K.M., Arndt, K.M., and Pluckthun, A. (1998) Model and simulation of multivalent binding to fixed ligands. Anal. Biochem. 261, 149-171.

142. Pellequer, J.L., and Van Regenmortel, M. H. (1993) Measurement of kinetic binding constants of viral antibodies using a new biosensor technology. J. Immunol. Methods, 166, 133.

143. Nygren, H., Czerkinski, C., and Stenberg, M. (1985) Dissociation ofantibodies bound to surface-immobilized antigen. J. Immunol, methods, 85, 87.

144. Nygren, H., Werthen, M., and Stenberg, M. (1987) Kinetics of antibodybinding to solid-phase-immobilised antigen. Effect of diffusion rate limitation and steric interaction. J Immunol Methods, 16, 63-71.1. БЛАГОДАРНОСТИ

Информация о работе

Дмитриев, Дмитрий Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Анализ связывания биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы