Антигенсвязывающие свойства бифункциональных моноклональных антител

Смирнова, Мария Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Антигенсвязывающие свойства бифункциональных моноклональных антител
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Антигенсвязывающие свойства бифункциональных моноклональных антител"

На правах рукописи

Л Т £

Смирнова Мария Борисовна

АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ СВОЙСТВА БИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности биохимия (03 00.04)

Москва, 2006

Работа выполнена в Научном центре психического здоровья Российской академии медицинских наук

Научный руководитель доктор биологических наук

Дмитриев А.Д.

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Пронин A.B.

кандидат биологических наук Жердев A.B.

Ведущая организация Научно-исследовательский институт

вирусологии им. Д.И. Ивановского Российской академии медицинских наук

Защита состоится 21 марта 2006 г в часов на заседании диссертационного совета К 002.247 01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им АН Баха РАН по адресу. 119071, Москва, Ленинский проспект, д 33, корп 2

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп 1.

Автореферат разослан 20 марта 2006 г

Ученый секретарь

диссертационного совета у —

кандидат биологических наук д ф Орловский

I. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Наряду с обычными моноклональными антителами (МКА)1 гибридомная технология позволяет получать биспецифиче-ские (бифункциональные) антитела2 (БИАТ), несущие сайты связывания двух различных антигенов (АГ) [Milstem and Cuello, 1983]. БИАТ синтезируются гибридными гибридомами (тетрадомами), которые образуются при слиянии двух родительских гибридом (Рис 1) Молекулы бифункциональных антител образуются в тетрадомах при рекомбинации двух АГ-связывающих сайтов ("полумолекул") Родительские МКА и соответствующий АГ-связывакмций сайт БИАТ имеют одинаковую структуру АГ-связывающих центров (см. Рис. 1) и, как следствие, проявляют одинаковые АГ-связывающие свойства. В работе Алларда с соавторами [Allard et а!., 1992], показано, что при связывании с антигеном в растворе аффинность родительских моноклональных антител равна аффинности соответствующего АГ-связывающего сайта БИАТ.

В практическом плане БИАТ, несущие сайты связывания с тестируемым антигеном и ферментом, (например пероксидазой хрена [ПХ]) могут выполнять роль меченых3 молекул и заменять традиционные конъюгаты (антитела, ковалентно связанные с ферментом). Такие БИАТ могут успешно использоваться в иммуногистохимии, иммуноблоттинге и иммуноферментном анализе (ИФА) и их называют биоконъюгатами нового поколения - см обзор' [Cao and Sures (1998)]. Другим важным приложением БИАТ, включающих сайты связывания с антигеном злокачественной клетки и биологически активным веществом, может быть направленный транспорт лекарств к опухолевым клеткам (направленная химиотерапия) [Webb at al., 1985].

' Список использованных сокращений приводится на последней автореферата

2 БИАТ могут быть также получены химически путем ковалентного связывания АГ-связывающ!": Сигт^ (Р^-фргтеч-т) " д~уу чердентга"::»: антигена" Огч^о ■'•акре ?'т титела в настоящем исследовании не рассматриваются Здесь и ниже термин меченые антитела употребляется нами в широком смысле и может

предполагать любой харакчер маркирования (мел а явЧЗРНСЩ коллоидом и

т п)

БИБЛИОТЕКА СПетарбург 09

зж

Антитела к антигену 1 (Гибридома 1)

Антитела к антигену 2 (Гибридома 2)

Антиген 1

(

Антиген 2

Бифункциональные антитела (Тетрадома)

Рис. 1. Родительские и бифункциональные антитела, образуемые гибридными гибридомами (тетрадомами).

Антитело Антиген • Бифункциональное РаЬ-

\ / антитело фрагмент

Рис. 2. Связывание моноклональных (монофункциональных) и бифункциональных антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе.

а - моновалентное связывание антител с иммобилизованным антигеном;

б - бивалентное связывание антител с иммобилизованным антигеном; в-связывание бифункциональных антител с иммобилизованным антигеном (может быть только моновалентным);

г - связывание РаЬ-фрагмента антител с иммобилизованным антигеном (может быть только моновалентным)

Весьма важной как с практической, так и с теоретической точки зрения является проблема взаимодействия антител (AT) с поверхностными АГ клеток и вирусов, а также с АГ, адсорбированными на твердой фазе. Молекула иммуноглобулина класса IgG несет два АГ-связывающих сайта и может связываться с поверхностными и иммобилизованными АГ как одним антиген-связывающим сайтом (моновалентно, см. Рис. 2, а), так и двумя антигенсвя-зывающими сайтами одновременно (бивалентно, см. Рис 2, б). БИАТ несут два сайта, специфичных к различным антигенам, и, таким образом, могут связываться с адсорбированным АГ только моновалентно (см. Рис. 2, в). При этом следует принять во внимание, что структура молекулы БИАТ, исключая один АГ-связывающий сайт (как первичная, так и третичная) тождественна структуре родительских AT. Таким образом, сравнительный анализ связывания монофункциональных AT и БИАТ с иммобилизованным АГ позволяет корректно оценить характер взаимодействия МКА (моновалентное или бивалентное). Отметим, что до сих пор характер взаимодействия AT с иммобилизованным АГ оценивали путем сравнения параметров связывания нативйой молекулы AT и ее Fab-фрагментов [Greenwood et al, 1963] Эти фрагменты включают антигенсвязывающий сайт и образуются из молекулы IgG после обработки папаином (Рис. 2, г) Очевидно, что для оценки характера взаимодействия AT с АГ Fab-фрагмеш- AT является гораздо менее полноценной молекулой, чем БИАТ

Бесспорно, что бивалентное связывание AT с антигенами существенно

прочнее, чем моновалентное Следовательно (по крайней мере, теоретически), обычные МКА должны обеспечивать более чувствительную детекцию иммобилизованного антигена по сравнению с БИАТ. Вместе с тем, большой массив публикаций свидетельствует об успешном применении БИАТ как меченых молекул в иммуногистохимии, иммуноблотгинге и твердофазном ИФА (эти данные суммированы в обзоре [Cao and Sures, 1998]). Однако постулируемые преимущества БИАТ как меченых молекул по сравнению с обычными конъюгатами представляются весьма спорными. На сегодняшний день, на

наш взгляд, отсутствуют работы, в которых бы корректно сравнивались свойства БИАТ и обычных МКА, конъюгированных с ферментом, как меченых молекул

Цели и задачи исследования. Цель исследования - изучение типа взаимодействия АТ с иммобилизованными АГ (моновалентное или бивалентное) путем сравнительного анализа связывания МКА и БИАТ, содержащих тождественные сайты связывания с АГ, а также сопоставление двух типов меченых молекул традиционных конъюгатов МКА с ферментом и БИАТ, несущих сайт связывания с ферментом.

В задачи работы входило-

1) для определения типа взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентное или бивалентное) соотнести равновесные константы связывания родительских антител и тождественного антигенсвязывающе-го сайта бифункциональных антител;

2) для анализа характера взаимодействия сравнить антитела к антигенам различной молекулярной массы и структуры: миоглобину (мол. массам! 8,6 кДа), пероксидазе хрена (мол масса»40 кДа) и человека (мол масса«160 кДа).

3) сравнить два типа меченых молекул, конъюгаты антимиоглобиновых антител с пероксидазой хрена и бифункциональных антител, несущих тождественный сайт связывания с миоглобином и пероксидазой хрена в твердофазном ИФА и сделать вывод о чувствительности анализа.

Научная новизна и научно-практическая значимость исследования. Для оценки характера взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентное или бивалентное) предложен оригинальный подход, который предполагает сравнительный анализ параметров связывания родительских моноклональных антител и бифункциональных моноклональных антител, несущих тождественный сайт связывания с антигеном

Проведен сравнительный анализ двух типов меченых молекул антител

антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (традиционного конъюгата) и БИАТ, несущих тождественный сайт связывания с тестируемым антигеном и пероксидазой хрена Показано, что бифункциональные антитела в качестве меченых молекул, не дают выигрыша в чувствительности иммуноферментно-го анализа в сравнении с традиционными конъюгатами.

Полученные результаты могут представлять интерес для возможного использования этого нового класса биомолекул

Апробация работы Основные положения работы были доложены на конференции лаборатории иммунохимии Онкологического научного центра РАМН (руководитель лаборатории академик РАН, профессор АбелевГ.И.) По теме диссертации опубликовано 9 работ в рецензируемых журналах.

Структура диссертации. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, приложение, список литературы (122 источника) и выводы. Диссертация иллюстрирована тремя таблицами и девятнадцатью рисунками.

II. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Моноклональные антитела очищали из асцитных жидкостей с помощью ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе БИАТ очищали путем последовательных аффинных хроматографий на антиген-сефарозных носителях: первый этап очистки всех БИАТ - хроматография на ПХ-сефарозе; далее фракцию, связавшуюся с ПХ, очищали на соответствующем АГ-сефарозном носителе Очищенные АТ имели (по результатам БОБ-электрофореза) чистоту более 95% и полностью сохраняли антагенсвязывающую активность (при повторной хроматографии количественно связывались с АГ-сефарозой) Параметры связывания антител (МКА и БИАТ) с иммобилизованными антигенами определяли радиоиммунологическим методом, используя высокосорби-рующие гибкие иммунные планшеты "Ткейек". АТ, меченые ш1, получали хлораминовым методом и очищали путем аффинной хроматографии Концентрацию антител, меченых 1251, определяли иммуноферментным методом, параллельно титруя "холодные" и меченые антитела. Концентрация сорбируе-

мого антигена подбиралась таким образом, что ее дальнейшее увеличение не приводило к увеличению связывания 1251-АТ. Конъюгаты антител с перокси-дазой хрена синтезировали методом Накане [Ыакапе апс! Кашао1, 1974]. Концентрацию активных антител конъюгата определяли иммуноферментным методом с использованием антимышиных антител, меченных щелочной фосфатазой

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Ш.1. Использованные клеточные линии

В качестве источников моноспецифических и БИАТ использовали полученные в лаборатории нейроиммунологии Научного центра психического здоровья РАМН под руководством кан. биол. наук Ю.С. Массино гибридомы, продуцирующие антитела к пероксидазе хрена (клон 36Р9), человека (клон 7505) и миоглобину (клоны 13С6, 1406 и 18Н2), а также тетрадомы продуценты БИАТ анти-^/ПХ (клон 75С5х36Р9) и БИАТ анти-Мб/ПХ (клон 14Р6х36Р9). Все антитела относились к изотипу ^в!.

Ш.2. Анализ характера связывания антител с антигенами, иммобилизованными на твердой фазе В нашей работе было проведено количественное сравнение связывания бивалентных МКА и БИАТ с антигенами, адсорбированными на твердой фазе Анализируемая панель включала следующие антитела: антимиоглобино-вые АТ и БИАТ, которые несли тождественный сайт связывания с Мб; анти-пероксидазные МКА и БИАТ (несли тождественный сайт связывания с ПХ); МКА к и БИАТ анти-Ы§0/ПХ (включали тождественный

связывающий сайт). Анализ проводили радиоиммунологическим методом. Для определения параметров связывания БИАТ и МКА метили 1И1. Данные по связыванию представляли в координатах Скэтчарда. Полученные зависимости показывают, что имеет место существенная разница в связывании с ПХ моноклональных антипероксидазных АТ и БИАТ, несущих тождественный сайт связывания с ПХ (Рис 3 а) Значительно менее выражена разница в свя-

Связанные антитела, нМ Связанные антитела, нМ

а б

Рис. 3. Связывание родительских моноклональных и биспецифических мо-ноклональных антител с иммобилизованными антигенами, адсорбированными на твердой фазе, в координатах Скэтчарда

а - связывание акгипероксидазных антител и бифункциональных антител со специфичностью антипероксидаза/антимиоглобин и антипероксидаза/анти-1дС с иммобилизованной пероксидазой; сайты связывания с пероксидазой у тестируемых антител идентичны;

б - связывание антител к 1дС человека и бифункциональных антител со специфичностью анти-1дС/антипероксидаза с иммобилизованным 1дС1 человека; сайты связывания с 1дС1 у тестируемых антител идентичны.

зывании между МКА к Ы§0 и БИАТ анти-ЫдСг/ПХ (Рис 3, б) В таблице 1 приведены значения наблюдаемых равновесных констант ассоциации (К0ь5), определенных по тангенсу угла наклона кривой связывания Как можно видеть. К^ родительских антипероксидазных АТ (2,0хЮ8М"1) в 38 раз превышает КоЫ антипероксндазного сайта БИАТ анти- ПХ/Ьда (5,3x106 М"') и в 21 раз превышает Ко!» антипероксндазного сайта БИАТ анти-ПХ/Мб (9,6x106 М"!) В то же время К0ь, антипероксндазного сайта БИАТ, специфичных к ПХ и Мб, всею лишь в 1,8 раз превышает К0ь$ антипероксндазного сайта БИАТ со специфичностью к ПХ и ЫдО, что лежит в пределах погрешности определения Коь твердофазным радиоиммунологическим методом.

В случае Ы§01, адсорбированного на твердой фазе, разница в связывании между МКА к И^О и И^О-связывающим сайтом БИАТ значительно ме-

Таблица 1. Наблюдаемые равновесные константы ассоциации (КоМ) родительских моноклональных и биспецифических моиоклональных антител с антигеном, адсорбированным на твердой фазе

Клеточная линия Тестируемые антитела Иммобилизованный антиген К„Ьз, М"1 КоЬа±А

Гибридома 7505 Анти-Ь^С (5,9±0,6)х108

Тетрадома 75С5х36Р9 Бифункциональные Анти-ЫйО/Анги-ПХ Ыё01 (2,6+0,2)Х108

Гибридома 36Р9 Антипероксидазные ПХ (2,0±0,1)х108

Тетрадома 75С5х36Р9 Бифункциональные Анти-Ь^О/Анти-ПХ ПХ (5,3±0,5>106

Тетрадома 1406х36Р9 Бифункциональные Анти-Мб/Анти-ПХ ПХ (9,6±0,8)х10б

1 Доверительный интервал

нее выражена (Рис 3, б) Коь8 родительских МКА (5,9x108 М"1) в 2,3 раза выше, чем Ком (2,6x108 М"1) анти-Ы^ф сайта БИАТ (Табл. 1).

Зная соотношение констант, из уравнений 6 и 7 (см. "Приложение") для родительских антипероксидазных АТ можно рассчитать соотношение бивалентно и моновалентно связанных антител [АЬА£2у[А1х^]5 Это соотношение составляет 9 и 18, в зависимости от того, значение К0ь8 каких БИАТ (ан-ти-ПХ/Мб или анти-ПХ/Ъ^О) считать истинной аффинностью антиперокси-дазного сайта АТ. Следовательно, при данной плотности антигена и в данном диапазоне начальных концентраций антител около 90-95% от общего числа связавшихся родительских МКА ассоциировано бивалентно и только около 510% моновалентно.

Если на твердой фазе адсорбирован Ы§С1, КоЬз родительских МКА в 2,3 раза выше, чем Кы» связывающего Ы^ сайта БИАТ анти-И^О/ПХ (Табл. 1). Теоретически, при отсутствии бивалентного связывания К0ь$ родительских МКА должна быть в 2 раза больше, чем КоЬз БИАТ (см "Приложение", раздел IV.2) Это различие лежит в пределах погрешности метода. Следует заключить, что МКА к Ь^в при данной плотности антигена и в данном диапазоне начальных концентраций антител связываются с иммобилизованным Ы^!

2 0.5 -

Л 0.4

Ёо.з

2 ft 9

d у»О3187Х

Рис. 4 Связывание родительских моноклональных антител к миоглобину и биспецифических моноклональных антител антимиоглобин/гтероксидаза с миоглобином, иммобилизованным на твердой фазе.

х 0.2

ш и

о—о связывание антимиоглобиновых антител;

•—• связывание бифункциональных антител анти-Мб/ПХ.

2 4

Антитела, нМ

преимущественно моновалентно

Связывание антимиоглобиновых AT и БИАТ анти-Мб/ПХ, включающих тождественный Мб-связывающий сайт, анализировалась путем представления кривых связывания в координатах' концентрация связанных AT от общей концентрации AT (Рис 4) Как видно из графиков, имеет место существенная разница между родительскими антимиоглобиновыми AT и БИАТ, которые несут сайт связывания с Мб По тангенсам углов наклонов (приведены на Рис 4) можно рассчитать, что с иммобилизованным Мб связывается в 5,3 раза больше антимиоглобиновых МКА, чем БИАТ анти-Мб/ПХ. Соотношение тангенсов для линейных приближений кривых связывания родительских МКА и БИАТ достоверно больше двух, что позволяет сделать вывод о наличии бивалентного связывания антимиоглобиновых AT с иммобилизованным Мб (см. разделы IV.3 и IV 4 "Приложения") К сожалению, анализ кривых связывания AT с АГ в координатах4 связанные АТ/общая концентрация AT позволяет констатировать наличие бивалентного связывания, но не дает возможности рассчитать доли антимиоглобиновых антител, связанных с миоглобином моновалентно и бивалентно

Ранее [Kaufman and Jain, 1992] путем сравнения связывания нативных AT и их Fab-фрагментов продемонстрировали, что способность молекулы IgG связываться с иммобилизованным антигеном моновалентно или бивалентно

зависит от концентрации антител в растворе, поверхностной концентрации антигена и стерических факторов. Однако эта модель не является достаточно полноценной. Недостаток подобного сравнения заключается в том, что структура РаЬ-фрагментов отлична от структуры нативных молекул антител - это лишь часть молекулы иммуноглобулина, лишенная Рс-фрагмента. В то же время, имеются данные о том, что Рс-участок может влиять на АГ-связывающую способность АТ (например, изменяя гибкость молекулы) [МсОовкеу е1 а1, 1997]. На наш взгляд, использование БИАТ для изучения характера связывания АТ с иммобилизованным АГ является более корректным Структура молекулы БИАТ тождественна структуре молекулы нативно-го иммуноглобулина (по крайней мере, в том случае, когда обе "полумолекулы" БИАТ относятся к одному субклассу 1§Сг). Тождественность структур молекул родительских МКА и БИАТ и тождественность соответствующих АГ-связывающих сайтов позволяет корректно определить наличие (или отсутствие) бивалентного связывания родительских МКА Следует отметить, что мы изучали связывание в условиях, при которых на поверхность иммунных планшетов адсорбировалось максимальное количество антигена В работе использовались высокосорбирующие планшеты фирмы "ТкеЛек" и концентрация сорбируемого антигена подбиралась таким образом, что ее дальнейшее увеличение не приводило к увеличению связывания 1251-АТ. В этих условиях АТ к Мб и ПХ связываются с иммобилизованным АГ бивалентно, а АТ к Ы{>0 - преимущественно моновалентно. Наличие бивалентного связывания можно объяснить относительно небольшими размерами АГ (для Мб и ПХ мол. массы равны 18,6 и 40 кДа) и высокой плотностью антигенов на поверхности планшетов Таким образом, среднее расстояние между эпитопами АГ (Мб и ПХ), с которыми связываются АТ, не превышает максимального расстояния между АГ-связывающими сайтами АТ (учитывая, что последняя величина может значительно варьировать). Отсутствие бивалентного связывания с Ы^ можно объяснить относительно большими размерами молекулы Ы^ (она по мол массе в четыре раза больше ПХ и почти в девять раз боль-

ше Мб) Кроме того, молекулы ПХ и Мб имеют глобулярную структуру, а молекула hlgG имеет "палковую" структуру, что также может сказываться на характере связывания.

Полученные результаты соответствуют, в частности, данным Доувера и соавт Power et al., 1984], показавшим, что различные МКА, специфичные к одному антигену, могут проявлять и бивалентный, и моновалентный характер связывания. Наблюдаемые нами различия изучаемых иммунохимических пар свидетельствуют о том, что возможность и относительный вклад бивалентного связывания антител с иммобилизованным антигеном отличаются как для разных антигенов, так и для клонов МКА к данному антигену

Таким образом, полученные результаты доказывают, что сравнительный анализ связывания МКА и БИАТ с иммобилизованным АГ являются методически удобной и информативной моделью для изучения характера взаимодействия МКА с иммобилизованными антигенами

III.3. Изучение бифункциональных антител как детектирующих антител в твердофазном ИФА Большой массив публикаций свидетельствует о высокой результативности БИАТ как меченых AT в иммуногистохимии, иммуноблоттинге, в сэндвич-методе [см обзор Cao and Sures, 1998] Во всех упомянутых тестах с мечеными AT имеет место взаимодействие БИАТ с антигенами, локализованными на твердой фазе Вместе с тем, теоретически, утверждения о высокой результативности БИАТ в сравнении с обычными МКА представляются весьма спорными Во-первых, при равной концентрации МКА и БИАТ с иммобилизованным антигеном связывается вдвое больше МКА чем БИАТ даже в отсутствие бивалентного связывания (см. теорию в разделе "Приложение") Во-вторых, в отличие от БИАТ обычные МКА могут связываться с иммобилизованным АГ бивалентно - одновременно двумя АГ-связывающими сайтами (т е гораздо более прочно), что в реальных твердофазных тестах может обеспечивать более высокую чувствительность детектирования. В третьих, в твердофазном анализе используются БИАТ, несущие сайт связывания с фер-

ментом и тестируемым АГ Следовательно, даже при большом избытке фермента, молекула БИАТ может быть помечена не более чем одной молекулой фермента Вместе с тем, существующие методы конъюгации фермента с антителами (например, периодатный метод сшивки пероксидазы с АТ [Ыакапе апё Калуао1, 1974]) предполагают метку молекулы АТ более чем одним молем ПХ (в цитируемой работе двумя молями) Таким образом, в твердофазном ИФА, в расчете на моль антител, меченные БИАТ должны давать меньший сигнал, чем обычные меченые антитела, что должно приводить к уменьшению чувствительности определения. Несомненно, БИАТ, несущие сайт связывания с ферментом, могут выполнять роль меченых АТ при идентификации антигена на твердой фазе Весь вопрос в том, насколько БИАТ более (или менее) результативны как меченые молекулы Таким образом, вопрос сравнения БИАТ и МКА как детектирующих молекул оставался открытым и рассматривался как одна из задач нашего исследования.

Для анализа этой проблемы мы сравнили связывание антимиоглобиновых АТ и БИАТ анти-Мб/ПХ (несущих тождественные сайты связывания с Мб) с миоглобином, адсорбированным на поверхность иммунных планшетов Ан-тимиоглобиновые АТ и БИАТ были одинаково мечены ПХ Эта система подобна тестированию антигена в иммуноблотгинге и иммуногистохимии. Кроме того, сравнивали калибровочные кривые сэндвич-метода определения Мб, полученные с использованием в качестве детектирующих АТ родительских МКА к Мб и БИАТ анти-Мб/ПХ (также одинаково меченых). Отметим, что обе выбранные системы позволяют уравнять концентрации препаратов как по АТ, так и по ПХ1 Конъюгаты антител с ферментом готовили таким образом, чтобы моль активной пероксидазы приходился на моль активных АТ, либо (второй - "классический" - вариант конъюгата, который использовался только в сэндвич-методе), два моля активной пероксидазы приходились на моль активных АТ К БИАТ пероксидаза добавлялась в десятикратном мо

1 Контролируемыми параметрами были концентрации активной пероксидазы и АТ, сохранивших иммунологическую активность после синтеза конъюгата

= 0,0203х + 0,0449

у = 0,0052х 1,5-

80 160 240

Антитела нг/мл а

0 ВО 160 240 320

Миоглобин нг/мл б

Рис. 5 Сравнительный анализ результативности антител к миоглобину

(конъюгированных с пероксидазой) и бифункциональных антител антимиогло-

бин/антипероксидаза (в присутствие пероксидазы) как детектирующих антител в

твердофазном ИФА.

Сайты связывания с миоглобином тождественны у монофункциональных и бифункциональных антител

а - связывание антител с миоглобином, иммобилизованным на твердой фазе; б - калибровочные кривые в сэндвич методе определения миоглобина (детектирующие антитела и БИАТ присутствуют в инкубационной смеси в равных концентрациях) Меченые АТ (1) - антитела конъюгированы с пероксидазой хрена из расчета моль активной пероксидазы на моль антител; меченые АТ (2) - антитела конъюгированы с пероксидазой хрена из расчета два моля активной пероксидазы на моль антител, молекулы БИАТ мечены пероксидазой более чем на 90%.

лярном избытке с таким расчетом, чтобы исходя из значения Ка для антипе-роксидазных АТ (см. Табл.1) не менее 90% молекул БИАТ были мечены ПХ

В экспериментах по связыванию с иммобилизованным Мб использовался конъюгат с молярным отношением ПХ/АТ » 0,92. Следовательно, БИАТ и антимиоглобиновые АТ были мечены пероксидазой в одинаковой степени Кривые связывания меченных ПХ антимиоглобиновых АТ и БИАТ анти-Мб/ПХ (в присутствии избытка ПХ) с иммобилизованным миоглобином представлены на Рис 5 а № соотношения тангенсов угла наклона кривь^ связывания (приведены на рисунке) следует, что с миоглобином связывается в 5,4 раза больше антимиоглобиновых АТ, чем БИАТ анти-Мб/ПХ. Посколь-

ку данное соотношение больше двух, то может иметь место бивалентное связывание антимиоглобиновых АТ с иммобилизованным Мб (см. "Приложение") Напомним, что даже в отсутствии бивалентного связывания при равной концентрации антимиоглобиновых АТ и БИАТ, несущих тождественный сайт связывания с Мб, с иммобилизованным миоглобином может связаться вдвое больше родительских МКА, чем БИАТ (раздел "Приложение") Следовательно, при выявлении антигенов на твердой фазе меченые МКА позволяют обеспечить более высокую чувствительность детектирования, чем БИАТ.

Проверку БИАТ как меченого препарата АТ в сэндвич-методе ИФА проводили на примере одностадийного метода определения миоглобина, в котором антитела клонов 1306 и 18Н2 адсорбировались на поверхности иммунных- планшетов (улавливающие антитела), а антитела клона 1406, конъюги-рованные с пероксидазой хрена, использовались в качестве детектирующих Все три использованных антитела (АТ продуцировались различными клонами) специфичны к разным эпитопам Мб, что позволяло регистрировать комплекс [сорбированные АТ — миоглобин — меченые АТ] Для корректного сравнения калибровочных кривых, получаемых при добавлении конъюгата АТ клона 14Б6 с ПХ или с помощью БИАТ анти-Мб/ПХ, меченые АТ добавлялись в инкубационную смесь в равных концентрациях' до конечной концентрации 2,5 мкг/мл активных АТ конъюгата или БИАТ Равенство концентраций обеспечивали теми же способами, что и в предыдущей серии экспериментов Связанными с ПХ были около 90% молекул БИАТ. Для двух конъюгатов антимиоглобиновых АТ с ПХ мольное отношение ПХ/АТ равнялось 0,92 и 2,1 Оба конъюгата были получены по классической методике [Иакапе апё Ка\уаоь 1974], широко используемой в практике ИФА

Калибровочные кривые для обоих вариантов сэндвич-метода представлены на Рис 5 б Наибольший наклон калибровочной кривой достигается с традиционным конъюгатом, в котором мольное отношение ПХ/АТ«2,1 • для него тангенс угла наклона ГО,0203) в 5,2 раза больше, чем для меченых БИАТ

Адсорбированное Антиген антитело

Конъюгат

77/7

Бифункциональное антитело

/ / / / в

Рис. в. Комплексы, которые образуются в сэндвич-методе тестирования антигена при использовании детектирующих антител, конъюгированных с перокси-дазой (конъюгатов) [а, б], и бифункциональных антител, несущих сайт связывания с пероксидазой (в).

(0,0039). Вместе с тем, конъюгат с мольным отношением ПХ/АТ * 0,92 дает калибровочную кривую с тангенсом угла наклона 0,0031, что лишь в 1,3 раза превосходит тангенс для меченных БИАТ и лежит в пределах погрешности метода Чувствительность метода1 в случае меченых АТ к Мб в 2 раза выше, чем при использовании БИАТ (5 нг/мл для обоих химических конъюгатов и 10 нг/мл для анти-Мб/ПХ).

Таким образом, использование БИАТ в качестве детектирующих АТ в сэндвич-методе не приводит к увеличению чувствительности анализа, тангенс угла наклона калибровочных кривых при этом также не увеличивается.

В сэндвич-методе МКА и АГ могут образовываться комплексы двух основных типов, в которых реализуется либо бивалентное связывание между адсорбированными и мечеными антителами (одий из вариантов таких комплексов представлен на Рис. 6, б), либо моновалентное связывание меченых

1 Минимальная концентрация миоглобина в анализируемой пробе, для которой поглощение с достоверностью не ниже 95% (для п=4) отличатся от поглощения, Даваемого нулевым стандартом миоглобина

АТ с АГ (Рис. 6, а). В последнем случае может образовываться комплекс, [адсорбированное антитело - антиген - меченое антитело - антиген], в котором одна из молекул антигена связывается только с мечеными АТ и не связывается с адсорбированными. В этом случае связывание АГ со вторым антигенсвя-зывающим сайтом меченых АТ не приводит к увеличению количества меченых АТ в сэндвиче и, следовательно, интенсивность регистрируемого сигнала не меняется. БИАТ несут только один сайт связывания с АГ, и, таким образом, концентрация миоглобина, "работающая" на образование сэндвича, увеличивается вдвое (Рис 6, в). Вероятно, в нашем сэндвич-методе тестирования Мб меченые АТ связываются с Мб только моновалентно, тогда, (см. раздел "Приложение") при одинаковой концентрации детектирующих антимиогло-биновых АТ и БИАТ анти-Мб/ПХ с миоглобином свяжется больше антител к миоглобину, чем БИАТ Однако, поскольку инкубация одностадийная, то в случае БИАТ эффективная концентрация миоглобина, "работающая" на образование сэндвича, вдвое выше, чем при использовании меченых антимиогло-биновых АТ Таким образом, выигрыш, связанный с наличием у БИАТ только одного сайта связывания с Мб, полностью нивелируется способностью меченых МКА связываться с Мб вдвое результативнее

При использовании конъюгата, содержащего два моля пероксидазы на один моль АТ, детектируемое окрашивание существенно возрастает

В целом полученные результаты позволяют заключить, что монокло-нальные БИАТ являются наиболее корректной моделью для анализа характера взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном Однако, на наш взгляд, нецелесообразно использовать БИАТ как меченые антитела в неконкурентных твердофазных системах тестирования антигенов - в сэндвич-методе, иммуногистохимии и иммуноблоттинге. Получение и очистка БИАТ весьма трудоемки, тогда как улучшение параметров аналитической системы вряд ли будет достигнуто.

IV. ПРИЛОЖЕНИЕ

В настоящем разделе мы опишем теорию взаимодействия антител с антигеном, которая использовалась в нашем исследовании для оценки эффективности связывания При анализе взаимодействия мы руководствовались работами Скэтчарда [Scatchard, 1949] и Кауфмана и Джейна (Kaufman and Jain, 1992).

IV. 1. Анализ равновесного связывания антител с антигеном в растворе

В растворе наблюдаемая равновесная константа ассоциации (К^) взаимодействия антитело-антиген (когда употребляют термин аффинность при описании взаимодействия антитела и антигена в растворе подразумевают именно этот параметр) описывается следующим образом:

K°bs = ([Ab]0-[B]X[Ag]0-[B])' (М 1} (1)'

где [АЬ]о - общая концентрация антител, (М); [В] - концентрация связанных антител, (М); [Ag]0 - общая концентрация антигена, (М).

При этом обычно не учитывается то обстоятельство, что молекула антитела (изотопов IgG) несет два антигенсвязывающих сайта Истинной аффинностью связывания является равновесная константа ассоциации одного анти-генсвязывающего сайта антитела и антигена.

Согласно Скэтчарду, уравнение (1) может быть преобразовано следующим образом:

где [F] - концентрация свободных антител, иногда обозначаемая [Ab], (М), [F]=[Ab]=[Ab]0-[B]

Альтернативным представлением является кривая связывания - зависимость [В] от [АЬ]0 При низких значениях [В] [Ag]0»[B] и из уравнения 1 имеем'

К к [Agin

IV.2. Анализ равновесного связывания антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе

Молекула ^О бивалентна и при определенных условиях способна связываться одновременно с двумя антигенами, иммобилизованными на твердой фазе Однако для количественной характеристики взаимодействия МКА с иммобилизованным антигеном используется упрощенная модель, в которой это взаимодействие рассматривается как гомогенный, равновесный, одноступенчатый процесс с однородной степенью связывания, что позволяет применять уравнение 1. Зависимость [В] от [АЬ]о (уравнение 3) часто используют в твердофазном ИФА, причем концентрацию связанных антител ([В]) представляют не в концентрационных, а в пропорциональных им оптических единицах При этом величина тангенса угла наклона кривой связывания пропорциональна коэффициенту К0ьДАд]о/(1+КоЬ8[Ад]о).

1У.З. Модель бивалентного связывания антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе На поверхности твердой фазы может существовать смесь бивалентно и моновалентно связанных молекул МКА. В этом случае твердофазные методы оценивают авидность (кажущуюся аффинность) МКА при данных условиях эксперимента, а не истинную аффинность антигенсвязывающего сайта антитела к данному эпитопу антигена. Схематически взаимодействие антитела с антигеном изображено на Рис 7 Процесс моновалентного связывания характеризуется равновесной константой (К]):

к-1 2[АЪ][АёУ

где к] - кинетическая константа ассоциации между антигенсвязывающим сайтом антитела и антигеном (М^с1); к_1 - кинетическая константа диссоциации моновалентного комплекса (с*1).

Процесс превращения бивалентного комплекса в моновалентный характеризуется равновесной константой К2:

Антитело Антиген

-Л

/Твердая фаза

Рис.7 Схема моновалентного и бивалентного связывания молекул антител с иммобилизованным антигеном.

К2=Ь_= 2[АЬАё2]5 (см^/моль) (5),

к-2 [А8]8[АЬА8]5

где кг - кинетическая константа превращения моновалентного комплекса в бивалентный (см2моль"1с"1); к_2 - кинетическая константа диссоциации между бивалентным и моновалентным состоянием антител (с"1).

Статистический фактор два возникает из-за того, что на первой стадии Тцв может связываться с антигеном любым АГ-связывающим центром, » диссоциировать только одним; на второй стадии верно обратное утверждение. Для БИАТ вторая стадия реакции, представленной на Рис 7, невозможна, и статистический фактор равен единице, так как у них есть только один сайт связывания с данным антигеном.

Теперь совместим модель бивалентного связывания (уравнения 4 и 5) с уравнением 1. Тогда для наблюдаемой равновесной Константы ассоциации (К„ы) имеем-

КоЬ$= Ь* =[АЬ^АЬА1]£= (М-') (6),

каш [АЬ][Ад]в

где кш8 - наблюдаемая кинетическая константа ассоциации (М^с*1); ка188 - наблюдаемая кинетическая константа диссоциации (с"1).

Значение истинной равновесной константы ассоциаций (КО в твердофазных методах можно измерить с помощью моновалентных БИАТ.

IV.4. Использование модели бивалентного связывания для предсказания изменений К„ы в координатах Скэтчарда

Коь, может быть определена по тангенсу угла наклона кривой при представлении данных в координатах Скэтчарда (см уравнение 2). Если бивалентное связывание МКА по каким-либо причинам невозможно и AT связываются только моновалентно, т е в уравнении (6) К2=0, то КоЬз для родительских МКА равна 2Кь Для БИАТ, у которых к данному антигену только один АГ-связывающий сайт, Kobs в координатах Скэтчарда равна Ki Таким образом, если бивалентное связывание невозможно, К0ьз родительских антител (2Ki) будет в два раза больше, чем K^s биспецифических (Ki) Если бивалентное связывание МКА возможно, то К„ь8 больше 2Kj

IV.5. Определение доли антител, связанных с иммобилизованным антигеном бивалентно и моновалентно При наличии бивалентного связывания родительских МКА с иммобилизованным антигеном можно, исходя из уравнения 5, вычислить соотношение бивалентно и моновалентно связанных антител:

[AbAg2y[AbAg]s=K2[Agy2 (7)

Величину K2[Ag]s в литературе принято называть усиливающим фактором (enhancement factor) Как можно видеть из уравнения 7, эта величина равна удвоенному соотношению бивалентно и моновалентно связанных антител. Это соотношение можно вычислить из уравнения (6), зная значение K0bs БИАТ, равное Кь и значение Kobs родительских МКА

V. выводы

1 Для определения типа взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентное или бивалентное) предложен сравнительный анализ параметров связывания родительских антител и тождественного антиген-связывающего сайта бифункциональных антител

2 Получены доказательства того, что в выбранных условиях тестирования антимиоглобиновые и антипероксидазные антитела связываются с антигеном, иммобилизованным на поверхности иммунных планшетов, преимущественно двумя антигенсвязывающими сайтами (бивалентно). Вместе с тем, антитела к человека связываются с иммобилизованным антигеном, в основном. одним антигенсвязывающим сайтом (моновалентно).

3 Получены доказательства того, что степень связывания бифункциональных антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе, существенно ниже, чем родительских монофункциональных.

4 Показано, что использование бифункциональных антител, несущих сайты связывания с миоглобином и пероксидазой хрена, в качестве детектирующих молекул при анализе миоглобина не дает выигрыша в чувствительности анализа в сравнении с традиционными конъюгатами (антителами, ко-валентно связанными с пероксидазой хрена) - как при определении иммобилизованного миоглобина, так и в двухсайтаом сэндвич-методе ИФА.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Массино ЮС., Суханова Л.Л., Кизим Е.А., Сегал О.Л., Смирнова МБ., Монахов В.В., Коляскина Г.И., Дмитриев А.Д. (1994). Получение бифункциональных антител к IgG человека и пероксидазе хрена и их использование для тестирования антител к ВИЧ. Бюлл эксп. биол. мед., т. CXV, № 3, стр. 291-293.

2. Дмитриев А.Д., Массино Ю С., Дергунова H.H., Кизим Е.А, Сегал О.Л, Смирнова М Б , В остряков В.М, Коляскина Г И (1996). Моноклональные биспецифические антитела- получение и изучение антигенсвязывающих свойств Вестник РАМН, т. 4, стр. 46-51.

3 Смирнова М Б, Дергунова Н.Н, Кизим Е А, Массино Ю С, Никулина В.А, Сегал О Л., Терешкина Е.Б., Коляскина Г И, Дмитриев А Д. (1997) Изучение антигенсвязывающих свойств биспецифических моноклональ-ных антител Биохимия, т. 62, № 1, стр. 51-59.

4 Смирнова М Б , Никулина В.А., Сегал О.Л , Кизим Е А, Массино Ю.С., Рязанская Н.Н, Коляскина Г.И., Дмитриев АД (1999). Одностадийный твердофазный иммуноферментный сэндвич-метод определения миоглоби-на с использованием бифункциональных моноклональных антител. Биохимия, т. 64, № 6, стр. 767-776.

5 Никулина В А., Кизим Е А., Массино Ю.С., Сегал О.Л., Смирнова МБ., Авилов В.В., Сапрыгин Д.Б., Смотров С.П., Коляскина Г.И., Дмитриев А.Д. (1999). Одностадийный твердофазный иммуноферментный сэндвич-метод определения миоглобина в сыворотке крови с использованием трех моноклональных антител к различным эпитопам. Бюлл. эксп биол мед., т. CXXVII, № 5, стр. 597-600.

6. Никулина В.А., Кизим Е.А., Массино Ю С., Сегал О.Л., Смирнова М.Б., Авилов В.В, Сапрыгин Д.Б, Смотров С П., Коляскина Г.И., Дмитриев АД (1999) Трехсайтный сэндвич-метод определения миоглобина может быть более эффективным, чем двухсайтный. Биохимия, т. 64, № 10, стр.

52-60

7. Nikulina V.A., Kizim E.A., Massino Y S , Segal О L., Smirnova M.B , Avilov V.V, Saprigjn D.B., Smotrov S.P., Tichtchenko VA, Kolyaskina G.I., Dmitriev A.D. (2000). The synergistic effects in antigen capture ELISA using three monoclonal antibodies directed at different epitopes of the same antigen. Clin. Chim. Acta, vol. 299, N 1, p. 25-44.

8. Дмитриев Д А., Массино Ю.С., Смирнова М.Б., Сегал O.JL, Павлова Е.В., Коляскина Г.И., Осипов А.П., Егоров A.M., Дмитриев А.Д. (2001). Связывание биспецифических моноклональных антител с антигенами, адсорбированными на твердой фазе. Биоорганическая химия, т. 27, N 4, стр. 265274.

9. Dmitriev D.A., Massino Y.S., Segal OL., Smirnova M.B., Kolyaskina G.I., Pavlova E.V., Osipov A.P., Egorov A.M., Dmitriev A.D (2001). The comparison of the ability of monoclonal antibodies directed to different proteins (human IgG, human myoglobin and HRP) and bispecific antibodies derived thereof to bind antigens immobilized on a surface of a solid phase. Clin. Chim. Acta, vol. 309, N1, p. 57-71.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АГ - антиген;

Анти-Мб - моноклональные антитела к миоглобину человека;

Анти-ПХ - моноклональные антитела к пероксидазе хрена;

Анти-Мб/ПХ - бифункциональные моноклональные антитела, несущие сайты

связывания с миоглобином и пероксидазой хрена;

Анти-Ь^О - моноклональные антитела к человека;

Анти-Ы^/ПХ - бифункциональные моноклональные антитела, несущие сайты связывания с человека и пероксидазой хрена; АТ - антитела,

БИАТ - бифункциональные (биспецифические) моноклональные антитела; ИФА - иммуноферментный анализ; Мб - миоглобин;

МКА - моноклональные антитела; ПХ - пероксидаза хрена; РИА - радиоиммунологический анализ; Ы§Ст - иммуноглобулин в человека.

к исполнению 17/02/2006 Исполнено 17/02/2006

Заказ № 92 Тираж 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www autoreferat ru

ZOQG (V

»-T995

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Смирнова, Мария Борисовна

Список использованных сокращений

I ВВЕДЕНИЕ

II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 История создания бифункциональных антител и области их применения

2 Тестирование бифункциональных антител

3 Взаимодействие антител с антигенами в растворе и на 17 твердой фазе

4 Антигенсвязывающие свойства бифункциональных моноклональных антител

5 Применение бифункциональных антител в иммуногистохимии, иммуноблоттинге и твердофазном иммуноферментном методе

Введение Диссертация по биологии, на тему "Антигенсвязывающие свойства бифункциональных моноклональных антител"

Актуальность проблемы. Наряду с обычными моноклональными антителами (МКА) гибридомная технология позволяет получать биспецифические (бифункциональные) антитела1 (БИАТ), несущие сайты связывания двух различных антигенов (АГ) [Milstein and Cuello, 1983]. БИАТ синтезируются гибридными гибридомами (тетрадомами), которые образуются при слиянии двух родительских гибридом (Рис. 1). Молекулы бифункциональных антител образуются в тетрадомах при рекомбинации двух АГ-связывающих сайтов ("полумолекул"). Родительские МКА и соответствующий АГ-связывающий сайт БИАТ имеют одинаковую структуру АГ-связывающих центров (см. Рис. 1) и, как следствие, проявляют одинаковые АГ-связывающие свойства. В работе Алларда с соавторами [Allard et al., 1992], показано, что при связывании с антигеном в растворе аффинность родительских моноклональных антител равна аффинности соответствующего АГ-связывающего сайта БИАТ.

В практическом плане БИАТ, несущие сайты связывания с тестируемым антигеном и ферментом, (например пероксидазой хрена [ПХ]) могут выполнять роль меченых2 молекул и заменять традиционные конъюгаты (антитела, ковалентно связанные с ферментом). Такие БИАТ могут успешно использоваться в иммуногистохимии, иммуноблоттинге и иммуноферментном анализе (ИФА), и их называют биоконъюгатами нового поколения - см. обзор: [Cao and Sures (1998)]. Другим важным приложением БИАТ,

БИАТ могут быть также получены химически: путем ковалентного связывания АГ-связывающих сайтов (Fab-фрагментов) к двум неидентичным антигенам. Однако такие антитела в настоящем исследовании не рассматриваются. ,2 Здесь и ниже термин меченые антитела употребляется нами в широком смысле и может предполагать любой характер маркирования (метка изотопом, ферментом, коллоидом и т.п.)

• •

Антитела к антигену 1 (Гибридома 1)

Антитела к антигену 2 (Гибридома 2)

Антиген 1 Y

Антиген 2

Бифункциональные антитела (Тетрадома)

Рис. 1. Родительские и бифункциональные антитела, образуемые гибридными гибридомами (тетрадомами).

Антитело

Антиген

Бифункциональное антитело \

Fab-фрагмент ч:

Твердая фаза о с/о О в

Рис. 2. Связывание моноклональных (монофункциональных) и бифункциональных антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе. а - моновалентное связывание антител с иммобилизованным антигеном; б - бивалентное связывание антител с иммобилизованным антигеном; в - связывание бифункциональных антител с иммобилизованным антигеном (может быть только моновалентным); г - связывание Fab-фрагмента антител с иммобилизованным антигеном (может быть только моновалентным) включающих сайты связывания с антигеном злокачественной клетки и биологически активным веществом, может быть направленный транспорт лекарств к опухолевым клеткам (направленная химиотерапия) [Webb at al., 1985].

Весьма важной как с практической, так и с теоретической точки зрения, является проблема взаимодействия антител (AT) с поверхностными АГ клеток и вирусов, а также с АГ, адсорбированными на твердой фазе. Молекула иммуноглобулина класса IgG несет два АГ-связывающих сайта и может связываться с поверхностными и иммобилизованными АГ как одним антигенсвязывающим сайтом (моновалентно, см. Рис. 2, а), так и двумя антигенсвязывающими сайтами одновременно (бивалентно, см. Рис 2, б). БИАТ несут два сайта, специфичных к различным антигенам, и, таким образом, могут связываться с адсорбированным АГ только моновалентно (см. Рис. 2, в). При этом следует принять во внимание, что структура молекулы БИАТ, исключая один АГ-связывающий сайт (как первичная, так и третичная), тождественна структуре родительских AT. Таким образом, сравнительный анализ связывания монофункциональных AT и БИАТ с иммобилизованным АГ позволяет корректно оценить характер взаимодействия МКА (моновалентное или бивалентное). Отметим, что до сих пор характер взаимодействия AT с иммобилизованным АГ оценивали путем сравнения параметров связывания нативной молекулы AT и ее Fab-фрагментов [Greenwood et al., 1963]. Эти фрагменты включают антигенсвязывающий сайт и образуются из молекулы IgG после обработки папаином (Рис. 2, г). Очевидно, что для оценки характера взаимодействия AT с АГ Fab-фрагмент AT является гораздо менее полноценной молекулой, чем БИАТ.

Бесспорно, что бивалентное связывание AT с антигенами существенно прочнее, чем моновалентное. Следовательно (по крайней мере, теоретически), обычные МКА должны обеспечивать более чувствительную детекцию иммобилизованного антигена по сравнению с БИАТ. Вместе с тем, большой массив публикаций свидетельствует об успешном применении БИАТ как меченых молекул в иммуногистохимии, иммуноблоттинге и твердофазном ИФА (эти данные суммированы в обзоре [Cao and Sures, 1998]). Однако постулируемые преимущества БИАТ как меченых молекул по сравнению с обычными конъюгатами представляются весьма спорными. На сегодняшний день, на наш взгляд, отсутствуют работы, в которых бы корректно сравнивались свойства БИАТ и обычных МКА, конъюгированных с ферментом, как меченых молекул.

Цели и задачи исследования. Цель исследования - изучение типа взаимодействия AT с иммобилизованными АГ (моновалентное или бивалентное) путем сравнительного анализа связывания МКА и БИАТ, содержащих тождественные сайты связывания с АГ, а также сопоставление двух типов меченых молекул: традиционных коныогатов МКА с ферментом и БИАТ, несущих сайт связывания с ферментом.

В задачи работы входило:

1) для определения типа взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентное или бивалентное) соотнести равновесные константы связывания родительских антител и тождественного антигенсвязывающего сайта бифункциональных антител;

2) для анализа характера взаимодействия сравнить антитела к антигенам различной молекулярной массы и структуры: миоглобину (мол. масса» 18,б кДа), пероксидазе хрена (мол. масса«40 кДа) и IgG человека (мол. масса«160 кДа).

3) сравнить два типа меченых молекул: конъюгаты антимиоглобиновых антител с пероксидазой хрена и бифункциональных антител, несущих тождественный сайт связывания с миоглобином и пероксидазой хрена в твердофазном ИФА и сделать вывод о чувствительности анализа.

Проведен сравнительный анализ двух типов меченых молекул антител: антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (традиционного конъюгата) и БИАТ, несущих тождественный сайт связывания с тестируемым антигеном и пероксидазой хрена. Показано, что бифункциональные антитела в качестве меченых молекул не дают выигрыша в чувствительности иммуноферментного анализа в сравнении с традиционными конъюгатами.

Полученные результаты могут представлять интерес для возможного использования этого нового класса биомолекул.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В настоящем обзоре мы кратко опишем историю создания БИАТ и области их применения, отсылая, в основном, к обзорным статьям, опубликованным за последние 10 лет. Относительно полно будут освещены только проблемы, которые составляют предмет наших исследований. Мы опишем методы получения клонов-продуцентов БИАТ, механизмы взаимодействия антител с антигенами (включая антигены, иммобилизованные на твердой фазе) и применение БИАТ в качестве меченых антител в твердофазном ИФА.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Смирнова, Мария Борисовна

VII. выводы

1. Для определения типа взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентное или бивалентное) предложен сравнительный анализ параметров связывания родительских антител и тождественного антигенсвязывающего сайта бифункциональных антител.

2. Получены доказательства того, что в выбранных условиях тестирования антимиоглобиновые и антипероксидазные антитела связываются с антигеном, иммобилизованным на поверхности иммунных планшетов, преимущественно двумя антигенсвязывающими сайтами (бивалентно). Вместе с тем, антитела к IgG человека связываются с иммобилизованным антигеном, в основном, одним антигенсвязывающим сайтом (моновалентно).

3. Получены доказательства того, что степень связывания бифункциональных антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе, существенно ниже, чем родительских монофункциональных.

4. Показано, что использование бифункциональных антител, несущих сайты связывания с миоглобином и пероксидазой хрена, в качестве детектирующих молекул при анализе миоглобина, не дает выигрыша в чувствительности анализа в сравнении с традиционными конъюгатами (антителами, ковалентно связанными с пероксидазой хрена) - как при определении иммобилизованного миоглобина, так и в двухсайтном сэндвич-методе ИФА.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смирнова, Мария Борисовна, Москва

1. Брондз Б.Д., Рохлин О.В. (1978) Молекулярные и клеточные основы иммунологического распознавания, Наука, Москва.

2. Варфаломеев С.Д., Зайцев С.В., Мевх А.Т. (1985) Физико-химические исследования молекулярных механизмов действия физиологически активных соединений. Рецепция. "Биоорганическая химия" (Итоги науки и техники) ВИНИТИ, Москва, "Мир", т. 3, стр. 51-55.

3. Дмитриев А.Д., Массино Ю.С., Дергунова Н.Н., Кизим Е.А., Сегал О.Л., Смирнова М.Б., Востриков В.М., Коляскина Г.И. (1996). Моноклональные биспецифические антитела: получение и изучение антигенсвязывающих свойств. Вестник РАМН, т. 4, стр. 46-51.

4. Дергунова Н.Н., Массино Ю.С., Кизим Е.А., Дмитриев А.Д. (1993). Изучение взаимодействия бифункциональных моноклональных антител с антигенами радиоиммунологическим методом. Бюл. Эксп. Биол. Мед., т. CIV, № 9, стр. 299-301.

5. Зозуля А.А., Пшеничкин С.Ф., Щурин М.Р. (1988) Опиоиды в регуляции иммунитета, в сб. "Новое в иммунологии и терапии психических заболеваний", Москва, стр. 7-20.

6. Иммунология, под ред. У. Пола (1989) Москва, "Мир", т. 3, стр. 15.

7. Ленинджер А. (1985) "Основы биохимии", Москва, "Мир", т.2.

8. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. (2000) Иммунология. М., Мир.

9. Тернер М. (1993) "Структура и функции иммуноглобулинов" в сб. "Структура и функции антител" под ред. Глинна Л., Стыоарда М., Москва, "Мир", стр. 31.

10. Чехонин В.П., Рябухин И.А., Морозов Г.В., (1989) Иммуноферментная детекция специфических антигенов мозга как критерий проницаемости гематоэнцефалического барьера крыс после острого у-облучения. Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 107, № 4, 464466.

11. Чехонин В.П., Жирков Ю.А., Дмитриева Т.Б. (1995) Направленный транспорт психотропных средств через гематоэнцефалический барьер. Моноклональные антитела в нейробиологии: Под ред. М.Б. Штарка, М.В. Старостиной.- Новосибирск: АО "Офсет", стр. 171182.

12. Allard W. J., Moran С. A., Nagel Е., Collins G., Largen M. Т. (1992) Antigen binding properties of highly purified bispecific antibodies. Mol. Immunol., 29, № 10, 1219-1227.

13. Auriol J., Guesdon J.L., Masc J.C., Nato F. (1994) Development of a bispecific monoclonal antibody for use in molecular hybridisation. J. Immunol. Methods, 169, № 1, 123-133.

14. Azimzadeh, A., Pellequer, J.L., and Van Regenmortel, M.H.V. (1992) Operational aspects of antibody affinity constants measured by liquid-phase and solid-phase assays. J Mol Recogn, 5, 9-18.

15. Azuma Т., Takada J., Motoyama N., Okada H. (1992) Mol. Immunol., 29, 37-44.

16. Bassiri R.M., Utiger R.D. (1972) The preparation and specificity of antibody to thyrotropin releasing hormone. Endocrinology, 90, 722727.

17. Bohlen H., Manzke O., Patel В., Moldenhauer G., Dorken В., Von Fliedner V., Diehl V., Tesch H. (1993) Cytolysis of leukemic B-cells by T-cells activated via two bispecific antibodies. Cancer Res., 55, № 18, 4310-4314.

18. Bosslet K., Stainstraesser A., Hermentin P., Kuhlmann L., Bruynck A., Magerstaedt M., Seemann G., Schwarz A., Sedlacek H. H. (1991) Generation of bispecific monoclonal antibodies for two phase radioimmunotherapy. Br. J. Cancer, 63, № 5, 681-686.

19. Bugari G., Polesi C., Beretta A., Ghelmi S., Albertini A. (1990) Quantitative immunoenzymatic assay of human lutropin, with use of a bispecific monoclonal antibody. Clin. Chem., 36, № 1, 47-52.

20. Burchiel S.W. and Rhodes B.A. (eds) (1983) Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy Elsevier, New York, 1983.

21. Cao Y., Suresh M.R. (1998). Bispecific antibodies as novel bioconjugates. Bioconjug. Chem., 9, № 6, 635-44.

22. Cao Y., Christian S., Suresh M.R. (1998) Development of a bispecific monoclonal antibody as a universal immunoprobe for detecting biotinylated macromolecules. J. Immunol. Methods. 220, № 1, 85-91.

23. Chervonsky A. V., Faerman A. J., Evdonina L. V., Jazova A. K., Kazarov A. R. and Gussev A. I. (1988) A simple metabolic system for selection of hybrid hybridomas (tetradomas) producing bispecific monoclonal antibodies. Mol. Immunol., 25, 913-915.

24. Cifone M.A. and Fidler I J. (1981) Increasing metastatic potential is associated with increasing genetic instability of clones isolated from murine neoplasms. Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 6949-6952.

25. Coloma M.J., Morrison S.L. (1997) Design and production of novel tetravalent bispecific antibodies. Nat. Biotechnol., 15, № 2, 159-63.

26. Cotton R. G. H., Milstein C. (1973) Fusion of two immunoglobulin-producing myeloma cells. Nature, 244, 42-43.

27. Crothers, D.M. and Metzger, H. (1972) The influence of polyvalency on binding properties of antibodies. Immunochemistry, 9, 341-346.

28. De Lau W. В. M., Van Loon A. E., Heije K., Valerio D. and Bast B. J. E. G. (1989) Production of hybrid hybridoma based on HATS -neomycinr double mutants. J. Immunol. Methods, 117, 1-8.

29. De Lau W. В. M., Heije K., Neeijes J. J., Oosterwegel M., Rosemuller E. and Bast B. J. C. G. (1991) Absence of preferential homologous H/L chain association in hybrid hybridomas. J. Immunology, 146, № 3, 906914.

30. Demanet C., Brissink J., Moser M., Leo O., Thielemans K. (1992) Bispecific antibody therapy of two murine B-cell lymphomas. Int. J. Cancer, Suppl., 7, 67-68.

31. Dower, S.K., Ozato, K., and Segal, D.M (1984) The interaction of monoclonal antibodies with MHC class I antigens on mouse spleen cells. I. Analasys of the mechanism of binding. J. Immunol., 132, 751758.

32. De Preval C. and Fougereau M. (1976) Specific interaction between VH and Vl regions of human monoclonal immunoglobulins. J. Mol. Biol., 102, 657-678.

33. Eipper B.A. and Mains R.E. (1980) Structure and biosynthesis of pro-adrenocorticitropin/endorphin and related peptides. Endocrinol. Rev., 1, № 1, 1-27.

34. O'Farrel P.H. (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem., 250,4007-4021.

35. French R.R., Penney C.A., Browning A.C., Stripe F. Goerge A.J., Glennie M.J. (1995) Delivery of the ribosome-inactivating protein, gelonin, to lymphoma cells via CD22 and CD38 using bicpecific antibodies. Br. J. Cancer, 71, № 5, 986-994.

36. Friguet, В., A.F. Chafotte, L. Djavadt-Ohaniance and M.E. Goldberg (1985) Measurments of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay. J.of Immunol. Meth., 77, № 2, 305-319.

37. Gaut J.R., Hendershot L.M. (1993) Mutations within the nucleotide binding site of immunoglobulin binding protein inhibit ATPase activity and interfere with release of immunoglobulin heavy chain. J. Biol. Chem., 268, № 10, 7248-7255.

38. Gorog G., Gandolfi A., Paradisi G., Rolleri E., Klasen E., Dressi V., Strom R., Celada F. (1989) Use of bispecific hybrid antibodies for the development of a homogeneous enzyme immunoassay. J. Immunol. Methods, 123, № 1, 131-140.

39. Graciano, R.F., Somasundaram, С., and Goldstein, J. (1995) The production of bispecific antibodies, in 'Bispecific antibodies' (Finger, M.W., ed.), Spring Verlag, New York, Berlin, pp. 1-20.

40. Greenwood F.G., Hunter W.M., Glover J.S. (1963) The preparation of1 3 t1.labeled human growth hormone of hihg specific activity. Biochem. J., 89, 114-123.

41. Gridley D. S., Stickney D. R., Slater J. M. (1988) Effects of murine bifunctional antibody infusion on leukocyte populations of patients with colon cancer. FASEB J., 2, A695

42. Gruber M., Schodin B.A., Wilson E.R. and Kranz D.M. (1994) Efficient tumor cell lysis mediated by a bispecific single chain antibody expressed in Esherichia coli. J. Immunology, 152, № 11, 5368-5374.

43. Hamel P. A., Klein M. H. and Dorrington K. J. (1986) The role of the VL and Vh segments in the preferential reassociation of immunoglobulin subunits. Mol. Immunol., 23, № 5, 503-510.

44. Hamel P. A., Klein M. H., Smith-Gill S. J., Dorrington K. J. (1987) Relative noncovalent association constant between immunoglobulin H and L chains is unrelated to their expression or antigen-binding activity. J. Immunol., 139, 3012-3020.

45. Hammerling U., Aoki Т., DeHarven E., Boyse E. A., Old L. J. (1986) Use of hybrid antibody with anti-G and anti-ferritin specificities in locating cell surface antigens by electron microscopy. J. Exp. Med., 128,1461-1473.

46. Handbook of biochemistry and molecular biology. Ed. G.O. Faseuau. (1976). V. II. P. 383. 3rd ed. CRC Press.

47. Hendershot L. M., Bole D. G., Kearney J. F. (1987a) The role of immunoglobulin heavy chain binding protein. Immunol. Today, 8, 111115.

48. Hendershot L., Bole D., Koller G., Kearney J.F. (1987b) Assembly and secretion of heavy chains that do not associate posttranslationally with immunoglobulin heavy chain binding protein. J. Cell. Biol., 104, № 3, 761-767.

49. Hendershot L.M. (1990) Immunoglobulin heavy chain and binding protein complexes are dissociate in vivo by light chain addition. J. Cell. Biol., Ill, № 3, 829-837.

50. Hendershot L.M., Wie J.Y., Gaut J.R., Lawson В., Freiden P.J., Murti K.G. (1995) In vivo expression of the endoplasmic reticulum. Mol. Biol. Cell., 6, № 3, 283-296.

51. Holliger P., Prospero T. and Winter G. (1993) "Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragments. Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 90, 6444-6448.

52. Hudson N. W., Mudgett M., Panka D. J., Margolies M. N. (1987) Immunoglobulin chain recombination among antidigoxin antibodies by hybridoma-hybridoma fusion. J. Immunol., 139, 2715-2723.

53. Ishikawa E., Imagava M., Hashida S., Yoshitake S., Hamaguchi Y., Ueno T.(1983) J Immunoassay, 4, 209-314.

54. Karawajew L., Behrsing O., Kaiser G., Micheel B. (1988) Production and ELISA application of bispecific monoclonal antibodies against fluorescein isothiocyanate (FITC) and horseradish peroxidase (HRP). J. Immunol. Methods, 111, № 1, 95-99.

55. Kaufman, E. N., Jain, R. K. (1992) Effect of bivalent interaction upon apperant antibody affinity: experimantal confirmation of theory using fluoresence photobleaching and implications for antibody binding assays. Cancer res., 52, 4157-4169.

56. King K. L., Gridley D. S., Stickney D. R. (1988) Autoradiographic biodistribution of bifunctional antibody 111 In BLEDTAIV in nude mice bearing human colon tumour. FASEB J., 2, A694

57. Knarr G., Gething M.J., Modrow S. and Bucher J. (1995) BIP binding sequences in antibodies. J. Biol. Chem., 270, № 46, 27589-27594.

58. Koelemij R., Kuppen P.J., Van de Velde C.J., Fleuren G.J., Hagenaars M., Eggermont A.M. (1999) Bispecific antibodies in cancer therapy, from the laboratory to the clinic. J Immunother., 22, № 6, 514-524.

59. Kohler G., Milstein C. (1975) Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 256, 495-497.

60. Koolwijk P., Rosemuller E., Kees Stad R., De Lau W. В. M. and Bast B. J. E. G. (1988) Enrichment and selection of hybrid hybridomas by percoll density gradient centrifugation and fluorescent-activated cell sorting. Hybridoma, 7, 217-225.

61. Kranz D.M., Herron J.N. and Voss E.W. (1982) Mechanisms of ligand binding by monoclonal anti-fluorecyl antibodies. J. Biol. Chem., 257, № 12, 6987-6995.

62. Kreutz F.T., Suresh M.R. (1997) Novel bispecific immunoprobe for rapid and sensitive detection of prostate-specific antigen. Clin. Chem. 43, № 4, 649-656.

63. Krika L.J. (1994) Selected strategies for improving sensitivity and reliability of immunoassays. Clin. Chem., 40, № 3, 347-357.

64. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 277, 680-685.

65. Langer Т., Lu C., Echols H., Flanagan J., Hayer M.K. and Hartl F.U. (1992) Successive action of DNAK , DNAj and Gro EL along thepatheway of chaperone-mediated protein folding. Nature, 356, № 6371, 683-689.

66. Littlefield W. (1964) Selectiion of hybrids from matings of fibroblasts in vitro and their presumed recombinations. Science, 145, 709-710.

67. Mallender W.D. and Voss E.VJ. (1994) Construction, expression and activity of a bivalent bispecific single-chain antibody. J. Biol. Chem., 269 № 1, 199-206.

68. Massino Y.S., Kizim E.A., Dergunova N.N., Vostrikov V.M. and Dmitriev A.D. (1992) Immunology Lett., 33, № 3, 217-222.

69. Margulies D.H., Cieplinski W., Dharmgrongartama В., Gefter M.L., Morrison S.L., Kelly Т., Scharff M.D. (1977) Regulation of immunoglobulin expression in mouse myeloma cells. Cold Spring Harbor Sympos. Quant. Biol., 41 (pt.2): 781-791.

70. Mariani M., Bonelli F., Tarditi L., Calogero R., Camagna M., Spranzi E., Seccamani E., Deleide G. and Scassellati G.A. (1989) BioChromatography, 4,149-157.

71. Milstein C., Cuello A.C. (1983) Hybrid hybridomas and their use in immunohistochemistry. Nature, 305, № 5934, 537-40.

72. Milstein C., Cuello A. C. (1984) Hybrid hybridomas and the production of bispecific monoclonal antibody. Immunol. Today, 5, 299-304.

73. Morelli L., Plotkin L., Leoni J., Fossati C.A., Margni R.A. (1993) Mol. Immunol., 3, 695-700.

74. Nakane, P.K., Kawaoi, A. (1974) Peroxidase-labelled antibody. A new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem. 22, 1084.

75. Neri D.M., Momo M., Prospero T. and Winter G. (1995) High-affinity antigen binding by chelating recombinant antibodies (CRAbs). J. Mol. Biol., 246, 367-373.

76. Nissonoff A., Rivers M. M. (1961) Recombination of a mixture of univalent antibody fragments of different specificity. Arch. Biochem. Biophys., 93, № 2, 460-462.

77. Nolan, O., and Kennedy, O.R. (1990) Biochim. Biophys. Acta, 1040, 111.

78. Nowel A. (1976) The clonal evolution of tumor cell populations. Science, 194, 23-28.

79. Pack P. and Plutckthun A. (1992) Miniantibodies: Use of amphipathic helices to produce functional, flexibly linked dimeric Fv fragments with high avidity in Escherichia coli. Biochemistry, 31, 1579-1584.

80. Paya С. V., McKean D. J., Segal D. M., Schoon R. A., Showalter S. D., Leibson P. J. (1989) Heteroconjugate antibodies enhance cell-mediated anti-herpes simplex virus immunity. J. Immunol., 142, № 2, 666-671.

81. Perry G., Friedman R., Kang D.R., Maneto V., Antilio-Gambetti L., Gambetti P. (1987) Antibodies to the neuronal cytoskeleton are elicited by Alzheimer paired helical filament fractions. Brain Res., 420, № 2, 233-242.

82. Pluckthun A., Pack P. (1997) New protein engineering approaches to multivalent and bispecific antibody fragments. Immunotechnology, 3, №2, 83-105.

83. Reading C. L. and Bator J. M. (1988) Proceedings for the 5th Annual Industry Conference and Exhibition, San Francisco, CA.

84. Reardan D.T., Meares C.F., Goodwin D.A., Mc. Tigne T.N., David G.S., Stone M.R., Leung J.P., Bartholomew R.M. and Frincke J.M. (1985) Antibodoes against metal chelates. Nature, 316, № 6025, 265268

85. Scatchard G. (1949) The attractions of protiens for small molecules and ions. Ann. N. Y. Acad. Sci., 51, 660-672.

86. Segal D.M., Weiner G.J., Weiner L.M. (1999) Bispecific antibodies in cancer therapy. Curr. Opin. Immunol. 11, № 5, 558-562.

87. Smith-Gill S.J., Hamel P.A., Klein M.H., Rudikoff S. and Dorrington K.J. (1986) Contribution of the Vk4 light chain to antibody specificity for lysozyme and b(l,6) D-galactan. Mol. Immunol., 23, 919-926.

88. Staerz U. D., Bevan M. J. (1986) Hybrid hybridoma producing a bispecific monoclonal antibody that can focus effector T-cell activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1453-1457.

89. Stickney D.R., Frincke J.M., Slater J.B., Ahlem C.N., Merchant В., Slater J.M. (1988) Effects of perfluorochemical and carbogen on tumor metastases and phagocytic cell populations. FASEB J., 2, A 694.

90. Strateeva-Taneeva P.A., Khaidukov S.V., Kovalenko V.A., Nazimov I.V., Samokhvalova L.V., Nesmeyanov V.A. (1993) Bispecific monoclonal antibodoes to human Interleukin 2 and horseradish peroxidase. Hybridoma, 12, № 3, 271-284.

91. Suresh M. R., Cuello A. C., Milstein C. (1986) Advantages of bispecific hybridomas in one-step immunocytochemistry and in immunoassays. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 7989-7993.

92. Tada H., Toyoda Y., Iwasa S. (1989) Bispecific antibody-producing hybrid hybridoma and its use in one-step immunoassays for human lymphotoxin. Hybridoma, 8, 73-83.

93. Takahashi M., Fuller S. A. (1988) Production of murine hybrid hybridomas secreting bispecific monoclonal antibodies for use in urease-based immunoassays. Clin. Chem., 34, 1693-1696.

94. Tarditi L., Camagna M., Parisi A., Vassarotto C., De Monte L. В., Letarte M., Malavasi F., Mariani M. (1992) Selective high-performance liquid chromatographic purification of bispecific monoclonal antibodies. J. Chromatogr., 599, № 1-2, 13-20.

95. Thompson, R.J. and Jackson, A.P. (1984) Cyclic complexes and high avidity antibodies. Trends Biochem. Sci., 9, 1-9.

96. M.Tiebout R. F., Van Boxtel-Oosterhof F., Strieker E. A. M. and Zeijlemaker W. P. (1987) A human hybrid hybridoma. J. Immunol., 139, 3402-3405.

97. Towbin H., Staelin Т., Gordon J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrilamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76, № 9, 43504354.

98. Ward E.S., Gussow D., Griffits A.D., Jones P.T. and Winter G. (1989) Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherihia coli. Nature, 341, № 2, 544 546.

99. Weiner G. J. (1992) Bispecific IgG and IL-2 therapy of a syngeneic B-cell lymphoma in immunocompetent mice. Int. J. Cancer, Suppl., 7, 6366.

100. Weiner G.J., De Gast G.C. (1995) Byspecific monoclonal antibody therapy of B-cell malignancy. Leuk.-Lymphoma, 16, № 3-4, 199-207.

101. Wong J. Т., Colvin R. B. (1987) Bi-specific monoclonal antibodies: selective binding and complement fixation to cells that express two different surface antigens. J. Immunol., 139, 1369-1374.1. БЛАГОДАРНОСТИ

Информация о работе

Смирнова, Мария Борисовна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Антигенсвязывающие свойства бифункциональных моноклональных антител - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы