Особенности экспрессии вирусных антигенов и сборки вирусных частиц в фибробластах и эндотелиальных клетках, инфицированных цитомегаловирусом человека

Ряскина, Светлана Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности экспрессии вирусных антигенов и сборки вирусных частиц в фибробластах и эндотелиальных клетках, инфицированных цитомегаловирусом человека
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Особенности экспрессии вирусных антигенов и сборки вирусных частиц в фибробластах и эндотелиальных клетках, инфицированных цитомегаловирусом человека"

На правах рукописи

РЯСКИНА Светлана Сергеевна

ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ВИРУСНЫХ АНТИГЕНОВ

И СБОРКИ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ В ФИБРОБЛАСТАХ И ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ, ИНФИЦИРОВАННЫХ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСОМ ЧЕЛОВЕКА

03.00.25 - Гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в лаборатории молекулярной и клеточной кардиологии Института экспериментальной кардиологии ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росздрава».

Научный руководитель:

доктор биологических наук Ю. А. Романов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор Г.Е. Онищенко

кандидат биологических наук Р.В. Лацис

Ведущая организация:

ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, г. Москва

Защита состоится «21» декабря 2006 года в 11 часов на заседании диссертационного совета К 208.073.02 в ФГУ РКНПК Росздрава по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская улица, д. 15 А.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУ РКНПК Росздрава.

Автореферат разослан « 18 » ноября 2006 года.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.И.Венгерова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Цитомегаловирусная инфекция широко распространена в человеческой популяции, и лишь малой части людей удается избежать инфицирования. По данным эпидемиологических исследований подавляющее большинство взрослых людей инфицировано цитомегаловирусом (ЦМВ): до 80% в развитых и практически 100% в развивающихся странах [Griffiths, 1985]. В последнее время ЦМВ привлекает внимание исследователей не только как источник тяжелых осложнений у пациентов с ослабленным иммунитетом [De Bolle, 2005; Taylor, 2003; Badami, 2001]. Все больше данных свидетельствует о том, что цитомегаловирусная инфекция может являться наиболее вероятным участником патогенеза атеросклероза [Dockrell, 2003; Fong, 2002; Grahame-Clarke, 2005]. Имеются сведения, предполагающие взаимосвязь между ускоренным развитием атеросклероза при пересадке сердца и обострением цитомегаловирусной инфекции. Признаки обострения цитомегаловирусной инфекции были обнаружены у подавляющего большинства пациентов с вновь развившимся атеросклерозом коронарных артерий пересаженного сердца [Grattan, 1989, Loebe, 1990]. Кроме этого, повышение титра ЦМВ специфических антител, как правило, сопровождает развитие атеросклероза у человека: в эпидемиологических исследованиях была выявлена корреляция между степенью утолщения интимы, определенной с помощью ультразвукового исследования, и титром антител к ЦМВ у людей без клинических признаков атеросклероза [Sorlie, 1994]. Повторный стеноз коронарных артерий также чаще развивается у пациентов, имеющих в крови повышенный титр антител к ЦМВ [Blum, 1998]. Учитывая, что геном ЦМВ был найден в аорте, коронарных, бедренных и сонных артериях человека [Yamashiroya, 1988, Hendrix, 1989, Pampou, 2000], было предположено, что источник реактивации ЦМВ может находиться в стенке артерий [Grahame-Clarke, 2005; Speir, 1994].

Сосудистый эндотелий рассматривагтся как наиболее вероятный резервуар латентной цитомегаловирусной инфекции в организме человека [De Bolle, 2005; Pampou, 2000; Taylor, 2003]. Принято считать, что взаимодействие ЦМВ с эндотелиальными клетками (ЭК) играет важную роль в процессе генерализации инфекции, поскольку только для этого типа клеток твердо установлена способность, продуцировать вирусе организме [Percivalle, 1993].

Тем не менее, сведения о функционировании ЦМВ в ЭК ограничены. Сегодняшние представления о биологии ЦМВ базируются на исследованиях лабораторных штаммов, пассируемых на фибробластах. В то же время, известно, что пассирование вируса в фибробластах изменяет его свойства, в частности, такие штаммы теряют характерную для клинических изолятов способность инфицировать ЭК [Waldman, 1991]. Это может быть связано с изменениями в кодирующих областях генома ЦМВ [Sinzger, 1999] и в характере функционирования вирусных белков [Gerna, 2000, Revello, 2001]. Имеющиеся в литературе

данные позволяют усомниться в том, что литический цикл ЦМВ регулируется совершенно одинаково в инфекционных системах, базирующихся на использовании различных клеточных типов.

Чтобы прояснить этот вопрос, было проведено сравнительное изучение закономерностей экспрессии вирусных антигенов в ЭК и фибробластах, инфицированных эндотелиотропным (VHL/E) или фибробластотроптным (AD169) штаммами цитомегаловируса человека.

Цель н задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение процесса развития литической ЦМВ инфекции в эндотелиальных клетках и фибробластах человека с использованием эндотелиотропного штамма (VHL/E), сохраняющего клеточный тропизм клинического изолята.

Для достижения этой цели были поставлгны следующие задачи:

1. Отработать методы оценки развития литической инфекции различных типов клеток человека, основанные на выявлении сверхранних, ранних и поздних антигенов ЦМВ.

2. Исследовать закономерности развертывания цитомегаловирусной инфекции в культуре эндотелия и фибробластов человека, инфицированных эндотелиотропным вирусом (штамм VHL/E) и выявить возможные отличия от фибробластотропных вариантов цитомегаловируса

3. Провести сравнительное изучение закономерностей сборки вирусных частиц в эндотелиальных клетках и фибробластах, инфицированных эндотелиотропным (VHL/E) или фибробластотропным (AD169) штамшми цитомегаловируса человека.

Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе работы были разработаны методические приемы, позволяющие охарактеризовать локализацию вирусной ДНК в инфицированных клетках, в частности, метод проведения ДНК гибридизации in situ на электронно-микроскопическом уровне. Предложенный методический прием позволил одновременно исследовать ультраструкгуру клетки, оценивать стадии развития вирусной инфекции и процесс формирования и упаковки вирусных частиц. Впервые описан феномен нарушения созревания вирусных частиц эндотелиотропного варианта ЦМВ в цитоплазме инфицированных клеток. Впервые охарактеризованы особенности экспрессии сверхранних, ранних и поздних вирусных антигенов в ЭК и фибробластах, инфицированных эндотелиотропным вирусным штаммом. Показано, что последовательность экспрессии сверхранних и ранних белков ЦМВ в ходе литической инфекции эндотелиальных клеток и фибробластов, инфицированных штаммом VHL/E, отличается от литической инфекции

фибробластов, инфицированных штаммом AD169. Получены доказательства различий в молекулярных основах функционирования эндотелиотропного (VHL/E) и фибробластотропного (AD169) вариантов цитомегаловируса человека в различных типах клеток. Полученные данные впервые подтверждают изменение активности цитомегаловируса в результате длительного поддержания в лабораторных условиях на определенном типе клеток.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на межлабораторном семинаре Института экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК Росздрава (2006); 72-м конгрессе Европейской ассоциации по изучению атеросклероза (Глазго, май, 2001), 42-й ежегодной конференции Американского общества ш клеточной биологии (Сан-Франциско, ноябрь, 2002).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 2 тезисных сообщения.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 109 страницах и включает 12 рисунков и список литературы, содержащий 165 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Культура эндотелиальных клеток и фибробластов человека. В исследованиях были использованы культуры эндотелиальных клеток (ЭК) пупочной вены и фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ). Выделение ЭК пупочной вены человека осуществляли по методу Gimbrone в модификации А.С.Антонова и соавт. [Gimbrone, 1974; Antonov, 1986]. Клетки ресуспендировали в среде 199, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 50 мкг/мл фактора роста эндотелиальных клеток, 12 Ед/мл гепарина и антибиотики (50 Ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина) и высаживали в культуральные флаконы, покрытые 0.2% раствором желатина. Культуры помещали в С02-инкубатор (37°С, 5% С02, влажная атмосфера), через 24 часа отмывали фосфатным буфером Дульбекко (ФБД) и заменяли среду культивирования на свежую. По мере достижения монослоя, культуры пассировали в соотношении 1:2. Рост и морфологию клеток контролировали с помощью фазово-контрастной микроскопии (Olympus, Япония). Для исследования использовали клетки 3-6 пассажа.

Культура ФЛЭЧ, полученная в соответствии со стандартной методикой (Farber, 1979), была любезно предоставлена отделом клеточной биологии РКНПК. Полученную культуру вели в среде ДМЕМ, содержащей 10% ЭТС и антибиотики (50 Ед/мл пенициллин, 50 мкг/мл стрептомицин), и пассировали в соотношении 1:2. В работе использовали клетки 15-20

пассажей. Для проведения иммунофлуоресцентного окрашивания клетки высаживали в 24-луночные культуральные планшеты (около 10s клеток на лунку) на покрытые 0.2% раствором желатина покровные стекла.

Вирусологические исследования. Штаммы ЦМВ VHL/E и AD169 были любезно предоставлены доктором W.J.Waldman и доктором E.S.Mocarski, США. Инфекционный титр вируса определяли с помощью анализа бляшкообразования. Для этого, в 6-луночные планшеты засевали ФЛЭЧ и помещали в ССЬ-инкубатор. По достижении конфлюэнтгого монослоя, ростовую среду удаляли, клетки отмывали от сыворотки ФБД, после чего вносили по 1 мл среды без сыворотки, содержащей последовательные десятикратные разведения вируса в трех повторах. После инкубации в течение 1 часа при 37° С и 5% СОг из лунок удаляли инокулят, клетки дважды промывали ФБД и добавляли теплой пипеткой среду роста с агарозой (для этого смешивали двукратную среду роста с 1% раствором агарозы (Sea Kern LE, FMC Corp.) 1:1, предварительно нагретыми до 40-45° С). Затем, после образования геля, плашку помещали в СОг-инкубатор. Через 7 дней клетки фиксировали 10% нейтральным забуференным формалином в течение 1 часа и осторожно, не повреждая монослоя, удаляли агаровую пробку. Культуру высушивали на воздухе и окрашивали 0.1% водным раствором кристалл виолета в течение 30-60 секунд. После удаления красителя культуры отмывали водой и высушивали на воздухе. Далее производили подсчет бляшек в каждой лунке и рассчитывали титр вируса.

Эндотелиальные клетки и фибробласты инфицировали в суспензии. Клетки, растущие в конфлуэнтном монослое, снимали смесью трипсина-ЭДТА и отмывали от сыворотки ФБД. Вирус (штамм АД 169 и VHL/E) добавляли к суспензии клеток и инкубировали в течение 1 часа при 37°С на шейкере. Затем клетки высаживали на покрытые желатиной покровные стекла в 24-луночные культуральные планшеты. На следующий день производили замену культуральной среды и оставляли клетки в инкубаторе на 1-40 дней. Цитопатогенные изменения оценивали в ходе прижизненного наблюдения и на препаратах, окрашенных карболовым фуксином. Неинфицированные ЭК и фибробласты были использованы в качестве контроля

Иммуноцитохимическое окрашивание. Для обнаружения вирусных антигенов клетки, растущие на покровных стеклах, фиксировали 10 мин в холодном метаноле или в смеси 3.7% формальдегида и 1% Тритона Х-100, приготовленной на стабилизирующем микротрубочки буфере (100 mM PIPES, 1 шМ MgCl2, 5 mM ЭГТА, 33% глицерин, pH 6.8). Неспецифическое связывание антител блокировали инкубацией в течение 30 мин в 0.4% растворе казеина на ФБД при 37°С. Затем препараты инкубировали с одним из моноклональных антител против белков ЦМВ: к главному сверхраннему белку р72 (разведение 1:100), к белку матрикса вирусных частиц рр65 (разведшие 1:50), к гликопротеину вирусной

оболочки gB (разведение 1:50) в течение 30 мин при 37°С. Моноклональные антитела визуализировали с помощью козьих антител к иммуноглобулинам мыши (разведете 1:400), конъюгированных с флуорохромом (ФИТЦ). Для визуализации клеточных ядер препараты докрашивали флуоресцентным красителем ДНК DAPI в концентрации 1 мг/мл на ФБД в течение 5 мин при комнатной температуре. Препараты заключали в мовиол, содержащий 0.1% фенилендиамин и анализировали при помощи флуоресцентной микроскопии (Оптон III). Для оценки уровня неспецифического связывания моноклональных антител, инфицированные клетки обрабатывали в качестве первых антител иммуноглобулинами мыши, полученными от неиммунизированных животных. В качестве второго негативного контроля использовали неинфицированные клетки, обработанные моноклональными антителами к вирусным белкам.

Трансмиссионная электронная микроскопия. Клетки, растущие на покровных стеклах, фиксировали 2.5% глютаровым альдегидом в 0.1 М фосфатном буфере рН 7.2-7.4 в течение 40 минут при комнатной температуре, затем трижды отмывали ФБД (по 10 минут) при комнатной температуре. Культуры фиксировали 1% четырехокисью осмия в 0.1 М фосфатном буфере рН 7.2-7.4 в течение 1 часа при 4°С, после промывали фосфатным буфером. Затем препараты обезвоживали при проводке через этанол в возрастающей концентрации, контрастировали 1% уранилацетатом и заливали в Эпон-812. С помощью фазово-контрастного микроскопа выбирали клетки с внутриядерными включениями и готовили ультратонкие срезы. Все исследованные клетки были изучены на серийных ультратонких срезах, приготовленных на ультратоме LKB-5 с помощью алмазного ножа. После докрашивания уранилацетатом и цитратом свинца, срезы последовательно анализировали с помощью электронного микроскопа JEM-100 СХ.

ДНК гибридизация in situ. Гибридизация in situ проводилась с использованием коммерческого биотинилированного ДНК-зонда к последовательностям генома ЦМВ (Enzo Diagnostics). Клетки, растущие на покрытых полилизином покровных стеклах, фиксировали 0,25% глютаровым альдегидом, приготовленном на буфере PIPES (80 шМ PIPES-КОН, 1 mM MgCl2, 5 тМ ЭГТА, рН 6.8), в течение 10 мин при 37°С, затем обрабатывали 10 мин при 37°С 1% тритоном Х-100 в буфере PIPES, обезвоживали при проводке через этанол в возрастающей концентрации и высушивали на воздухе. После обработки РНК-азой А препараты вновь обезвоживали и высушивали на воздухе. Гибридизацию проводили по методу Бригати и соавт. [Brigati, 1983]. Для визуализации связавшегося зонда использовали авидин-биотин-пероксидазную технику и субстрат на основе 3,3'-диаминобензидина.

Совмещение гибридизации in situ с электронной микроскопией. После проведения гибридизации in situ, как было описано выше, образцы вновь фиксировали

последовательно в 1% глютаровом альдегиде на ФБД и 1% 0э04 на ФБД, обезвоживали при проводке через этанол в возрастающей концентрации, контрастировали уранилацетатом и заливали в Эпон 812. Клетки с внутриядерными включениями выбирали с помощью фазово-контрастного микроскопа, и готовили серийные ультратонкие срезы с помощью алмазного ножа на ультратоме ЬКВ-5. Срезы анализировали в электронном микроскопе 1ЕМ-100 СХ. В качестве негативного контроля служили образцы, обработанные с исключением зонда ЦМВ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор источника ЭК человека. Учитывая высокую распространенность ЦМВ и его способность латентно инфицировать ЭК, на первом этапе работы было необходимо выбрать источник клеток, изначально не содержащий признаков ЦМВ-инфекции. Для этого, с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) на присутствие в клетках генома ЦМВ были проверены первичные культуры ЭК аорты и пупочной вены человека. Для проведения ПЦР были использованы олигонуклеотидные праймеры, комплементарные экзонам 3 и 4 главного сверхраннего региона генома ЦМВ. В качестве положительного контроля ПЦР использовались праймеры, амплифицирующие ген стероидной сульфатазы человека, а также ФЛЭЧ, инфицированные ЦМВ (штамм АО 1 ©).

В результате проведенного анализа нуклеотидные последовательности ЦМВ были обнаружены во всех культурах ЭК аорты человека, независимо от того, из каких сосудов (визуально нормальных или атеросклеротических) они были получены (Рис. 1). В случае использования культур ЭК пупочной вены присутствия вирусного генома обнаружено не было, поэтому именно эта культура была выбрана в качестве объекта для проведения последующих

экспериментов.

12 3 4 5 6 7 8

Рисунок 1.

Результаты выявления ДНК ЦМВ в эндотелиальных клетках и фибробластах человека (ПЦР).

1 — позитивный контроль (ФЛЭЧ, инфицированные ЦМВ); 2 — негативный контроль (неинфщгрованные ФЛЭЧ); 3 и 4 — ЭК, выделенные из визуально "нормальных" аорт; 5 — то же, из атеросклеротической аорты; б и 7 - ЭК пупочной вены человека (ЭКПВ); 8 - набор фрагментов ДНК с известным молекулярным весом.

1425 Ьр 517 Ьр 396 Ьр 214 Ьр

Изменения в культуре ЭК при ЦМВ инфекции. Развитие цитопатогенного действия (ЦПД) оценивалось в клетках, инфицированных штаммом УН17Е, при множественности инфицирования 0,01 БОЕ/клетку. В течение месяца после инфицирования оценивалась морфология клеток, митотический индекс, число клеток поздней стадии инфекции (клетки с внутриядерными включениями). Появление одиночных (около 0,1% от всей популяции) клеток поздних стадий развития ЦП Д было отмечено уже на 3 день после инфицирования (Рис. 2).

Рисунок 2. Проявления цитопатогенного действия ЦМВ в культуре ЭК пупочной вены человека, инфицированных штаммом УН17Е.

А — конфлуэнтный моноспой ЭК, 2 суток после инфицированш; Б — формирование клеточных тяжей через 1 неделю после инфицирования; В и Г — появление многоядерных клеток (стрелка); Г — то же, при большем увеличении; Д — скопление клеток с внутриядерными включениями (стрелки), через две недели после инфицирования.

Окрашивание карболовым фуксином. Увеличение: А-В —Х600; Г—Х2500; Д-Х3500.

К концу 1 недели после инфицирования доля клеток, содержащих внутриядерные включения, характерные для поздних стадий инфекции, составляла не более 1%. По данным литературы, в таких клетках и в аналогичные сроки в клеточном ядре начинается продукция вирусных частиц [Оагпей, 1979]. В течение 5 дней культивирования клетки с внутриядерными включениями располагались чаще по одной, затем появлялись скопления из 4-5 измененных ЭК, а через 2 недели скопления таких клеток формировали большие разветвленные тяжи (Рис. 2Б). Однако даже в этот период число ЭК поздних стадий не превышало 30% от общего числа клеток. В дальнейшем, число клеток с внутриядерными включениями прогрессивно нарастало, но даже на 30 день после инфицирования обычно не превышало 75%. Тем не менее, через 40 дней после инфицирования наблюдался лизис практически всех клеток, в то время как неинфицированные клетки оставались интактными. Многоядерные ЭК, содержащие 2 или 3 ядра без видимых включений, обнаруживались в культуре ЭКПВ уже на следующий день после инфицирования. Клетки, содержащие 5 и более ядер, из которых хотя бы одно содержало внутриядерные включения, выявлялись только на 3 день после инфицирования культур (Рис. 2В и Г). Их число сохранялось практически постоянным (не более 0.5% от общего числа клеток) на протяжении всего периода наблюдения.

Описанные проявления ЦПД, накопление клеток поздних стадий (Рис. 2Д) и формирование многоядерных клеток соответствовали описанным ранее [\Valdman, 1991]. Однако, в отличие от данных других исследователей ДОПтег, МосагеИ, 1997], задержки деления ЭК, связанной с инфекцией ЦМВ, выявлено не было. В повторяющихся экспериментах нам не удалось выявить каких бы то ни было различий в митотическом индексе между инфицированными и неинфицированными ЭК на протяжении месяца наблюдения (Рис. 3).

1,6 • а* 1.4 И: 1 0,8 р 0,6. i 0,41 0,2 • J I 1 il lili

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15 20 25 30 ДНИ ■ контроль □ эксперимент

Рисунок 3. Сравнение митотического индекса в контрольной (неинфицированной) и инфицированной культуре ЭК в течение месяца после инфицирования штаммом УНЬ/Е. Число митотических клеток, определяли при подсчете 2000 клеток на каждый срок фиксации.

Закономерности экспрессии вирусных антигенов в инфицированных ЭК. Экспрессия р72 в ЭК, инфицированных штаммом УН17Е, была изучена в динамике (в течение месяца), при множественности инфицирования 0,01 БОЕ/клетку. Первые единичные р72-позитивные клетки выявлялись уже через 24 часа после инфицирования. В дальнейшем, число клеток, содержащих р72, постепенно увеличивалось, но обычно не превышало 2 % в течение первой недели и 25 % в течение двух недель после инфицирования клеток (Рис. 4А).

ЭКПВ, УИиЕ

Рисунок 4.

Изменение числа клеток, содержащих антигены цитомегаловируса (р72, рр65, gB), в культурах ЭК (А) и фибробластов (Б), инфицированных штаммом УНЬ/Е, в течение месяца после инфицирования.

Внизу - схематическое изменение характера окрашивания (ядро/цитоплазма) антителами к р72 и рр65 клеток с внутриядерными включениями.

Клетки, положительно окрашенные на р72, располагались группами, формируя скопления (Рис. 5А и 5А1). Максимальное количество клеток, содержащих р72 (до 70 %), было выявлено на 30 день культивирования (Рис. 4А).

Характер окрашивания антителами к р72 клеток с внутриядерными включениями изменялся с течением времени после инфицирования (Рис 4, схема). В течение первой недели в этих клетках было окрашено только ядро; позднее появились клетки, в которых были окрашены цитоплазматичгские гранулы (Рис. 5Б и 5Б'). Через 15 дней после инфицирования антиген р72 выявлялся и в ядрах и в цитоплазме (Рис. 5В и 5В'). Клетки с цитоплазматическим накоплением антигена и неокрашенными ядрами появлялись в популяции р72-позитивных клеток через 20 дней после инфицирования.

Рисунок 5.

Иммунофлуоресцентное окрашивание ЭК и фибробластов антителами к вирусному антигену р72 (А-Д) и ядерным красителем ЭАР1 (А'-Д') в разные сроки после инфицирования штаммом УНЬ/Е или АБ 169.

A, А' — 5 суток после инфицированга (р72-позитивные ЭК, инфицированные УНЬ/Е, формирующге скопления).

Б, Б' — 9 суток после инфицирования ЭК (окрашены и ядро, и цитоплазматические гранулы).

B, В' — 20 суток после инфицирования ЭК (формалиновая фиксация, клетки с внутриядерными включениями с неокрашенными ядрами и окрашенными цитоплазматические гранулами).

Г, Г' — 20 суток после инфицирования ЭК, фиксация клеток метанолом. Слабое окрашивание ядер в клетках с внутриядерными включениями.

Д, Д' — 20 суток после инфицирования ФЛЭЧ штаммом АИ169

(окрашивание только клеточных ядер, независимо от способа фиксации)

Факт обнаружения клеток (одноядерных и многоядерных) поздних стадий с внутриядерными включениями, у которых была окрашена цитоплазма, но не ядро (Рис. 5В, 5В') показался интересным, поскольку не укладывался в существующую концепцию. Известно, что продукты гена ie-1 являются ДНК-связывающими белками и накапливаются в ядрах инфицированных клеток [Stenberg, 1996]. В отношении некоторых сверхранних белков, в том числе р72, известно, что они функционируют как факторы транскрипции, регулируя экспрессию более поздних вирусных генов. Продукты гена iel могут быть связаны с мембранными структурами в цитоплазме [Otto, 1988], однако на сегодняшний день отсутствуют сведения, подразумевающие возможность их отсутствия в клеточном ядре. В связи с этим, было решено повторить все эксперименты, используя альтернативный способ фиксации. Формалиювая фиксация была заменена на спиртовую (метанол). При использова-

нии спиртовой фиксации были получены аналогичные результаты, за исключением выявления слабого окрашивания ядер в клетках через 20 суток после инфицирования (Рис. 5Г, Р).

Клетки, содержащие рр65, выявлялись в культурах ЭК через 3 дня после инфицирования. Примечательно, что в течение первых 15 дней после инфицирования число рр65-позитивных клеток существенно превышало число р72-позитивных клеток (Рис. 4 и Рис. 6А, А').

• í й

1 ф ' 1 ф

ф ф

Б , • Б'

Рисунок 6.

Иммунофлуоресцентное окрашивание ЭК и фибробластов антителами к вирусному антигену рр65 (А-Е) и ядерным красителем DAPI (А'-Е') в разные сроки после инфицирования штаммом VHL/E или AD 169.

A, А' — 5 сутки после инфицирования ЭК штаммом УНЬ/Е.

Б, Б' — то же, при большем увеличении. Окрашены ядра, а в митотических клетках — хромосомы.

B, В' - 9 суток после инфицирования. Скопления рр65-позитивных ЭК (видна ярко окрашенная центральная и слабо окрашенная периферическая зона).

Г, Г' и Д Д' - ЭК и ФЛЭЧ, соответственно, (окрашивание ядер и цитоплазматических гранул).

Е, Е' — многоядерная клетка с окрашеными цитоплазматическими гранулами.

В отличие от числа клеток, содержащих р72, которое непрерывно возрастало на протяжении всего периода наблюдения, число рр65-позитивных ЭК подвергалось резким подъемам и спадам (Рис. 4А). В серии повторяющихся экспериментов на протяжении 30-дневного наблюдения максимальное количество рр65-позитивных клеток обычно выявлялось между 4 и 15 днем после инфицирования. Число рр65-позитивных клеток достигало 80% от общего числа клеток, по крайней мере, дважды на протяжении двухнедельного периода. В эти дни рр65 накапливался в ядре клеток, лишенных внутриядерных включений (Рис. 6 А,А'), а в клетках с внутриядерными включениями, как в ядре, так и в цитоплазме (Рис. 6 Г,Г'). При этом, не только интерфазные, но и митотические клетки оказывались положительно окрашенными на рр65; во всех из них вирусный антиген был ассоциирован с хромосомами (Рис. 6 Б,Б'). Ррб5-позитивные клетки располагались обычно в виде скоплений, которые морфологически отличались от скоплений р72-позитивных клеток. Число клеток, составляющих рр65-позитивный кластер, как и число таких кластеров, варьировало в очень широких пределах в процессе роста культур. Клетки, составляющие рр65-позитивный кластер, различались по интенсивности окрашивания: в каждом скоплении была видна ярко окрашенная центральная зона и слабо окрашенная периферическая зона (Рис. 6В,В'). В центре каждого рр65-позитивного кластера располагались клетки с внутриядерными включениями (одноядерная или многоядерная), в которых кроме ядер были окрашены также цитоплазматические гранулы (Рис. 6В,В' и 6Г,Г'). Как и в отношении р72, многоядерные клетки, найденные до 15 дня культивирования, чаще всего имели окрашенные ядра и цитоплазму, тогда как клетки, исследованные после 20 дня показывали обычно только окрашенную цитоплазму (Рис. 6, Е,Е').

Динамика накопления клеток, содержащих §В, была сходной с описанной для р72-позитивных клеток. Число §В-позитивных клеток постепенно увеличивалось в течение месяца после инфицирования (Рис. 4А). При этом характер внутриклеточной локализации §В не менялся: антиген всегда выявлялся только в цитоплазме инфицированных ЭК. Митотические клетки, положительно окрашенные на gB найдены не были.

Особенности экспрессии вирусных антигенов в фибробластах, инфицированных эндотелиотропным вирусным штаммом. Описанные различия в развитии литической инфекции в ЭК не позволяют ответить на вопрос: связаны ли они с особенностями функционирования вируса в разных клетках или вызваны особенностями разных штаммов ЦМВ, которые проявляются независимо от типа инфицированных клеток? Для ответа на этот вопрос, было проведено сравнение закономерностей экспрессии вирусных антигенов в фибробластах, инфицированных эндотелиотропным вирусным штаммом. В исследованиях,

проводимых до сих пор, использовались разные концентрации вируса и антитела к разным вирусным антигенам, что не позволяло провести такое сравнение. В этой связи, были изучены закономерности экспрессии антигенов ЦМВ (р72, рр65 и gB) в культуре ФЛЭЧ, инфицированных эндотелиотропным штаммом VHL/E. Как и ЭК, фибробласты, инфицированные штаммом VHL/E, погибали между 40 и 45 днем после инфицирования.

Первые р72-позитивные клетки были обнаружены на следующей день после инфицирования. Как в культуре ЭК, так и в культуре ФЛЭЧ, доля р72-позитивных клеток не превышала 2 % в течение недели поле инфицирования (Рис. 4Б). В течение первой недели после инфицирования единичные р72-позитивные клетки были случайно разбросанные в монослое; время от времени обнаруживались кластеры из 2 или 3 позитивных клеток. Позднее, большинство р72-позитивных клеток формировало кластеры, каждый из которых включал от единиц до нескольких десятков клеток. Характер окрашивания антителами к р72 клеток с внутриядерными включениями изменялся с течением времени после инфицирования (Рис. 4, схема). В течение первой недели в этих клетках (независимо от способа фиксации) было окрашено только ядро, позднее появлялись клетки, в которых были окрашены также цитоплазматические гранулы (Рис. 6 Д,Д')- Различия в характере окрашивания антителами к р72 в культуре фибробластов и в культуре ЭК, инфицированных штаммом VHL/E обнаружено не было, за исключением того, что в культуре ФЛЕЧ, р72 был ассоциирован с хромосомами. Ранний антиген ЦМВ рр65 был обнаружен в культуре фибробластов только на 4 день после инфицирования (Рис. 4Б). Так же как и в культуре ЭК, инфицированных штаммом ЦМВ VHL/E, число клеток, содержащих рр65, изменялось скачкообразно. Локализация рр65 в разные сроки после инфицирования не отличалась от локализации, показанной в культуре ЭК (Рис. 4, схема). Поздний вирусный антиген ЦМВ gB накапливался в клетках находящихся на поздней стадии инфекционного цикла. Первые клетки, содержащие антиген gB, были обнаружены на 4 день после инфицирования, и, как правило, содержали внутриядерные включения (Рис. 4, схема). Как и в инфицированных ЭК, gB присутствовал в цитоплазме инфицированных ФЛЕЧ. Митотические клетки, показывающие позитивность для gB, найдены не были.

Закономерности экспрессии вирусных антигенов в фибробластах, инфицированных фибробластотропным вирусным штаммом. Приведенные выше результаты показывают, что в клеточных культурах, инфицированных VHL/E в низком титре, много больше клеток окрашивается антителами к рр65, чем антителами к р72. Чтобы выяснить, не является ли это результатом низкой множественности инфицирования, мы изучили характер экспрессии вирусных белков в фибробластах, инфицированных фибробластотропным штаммом AD169 в

концентрации 0,001 БОЕ/кл. При таком низком титре вируса АЭ169-инфицированные фибробласты выживали в течение периода времени (22-25 дней), сопоставимого со временем выживания УНЬ/Е-инфицированных клеток.

В культуре АЕ)169-инфицированных фибробластов частота встречаемости р72-позитивных клеток примерно соответствовала частоте встречаемости рр65-позитивных клеток (Рис. 7).

s « 3

л w

зс

о *

tz £

î .

ФЛЭЧ, AD 169

■ «»2 09a

jhJL

« • ( t • I M « я

ДНИ ПОСЛЕ МН*ИЦИРОВЛЧИЯ

îfCD-O«

Рисунок 7.

Изменение числа клеток, содержащих белки цитомегаловируса (р72, рр65, gB), в культуре клеток фибробластов эмбриона легкого человека, инфицированных фибробластотршным штаммом AD 169.

Внизу — схематическое изменение характера окрашивания (ядро/цитоплазма)

___антителами к р72 и рр65 клеток с

внутриядерными включшиями.

Клетки, окрашенные антителами к р72 и антителами к рр65, формировали морфологически сходные скопления. Что касается характера окрашивания клеток с внутриядерными включениями, то в подавляющем большинстве из них антитела к р72 окрашивали только клеточные ядра независимо от способа фиксации (Рис. 7, схема; Рис. 5 Д,Д'), лишь в единичных клетках были окрашены также цитоплазматические гранулы. В течение двух недель после инфицирования окрашивание клеток с внутриядерными включениями антителами к рр65 было таким же, как и окрашивание антителами к р72. Однако на 15 день появились клетки, в которых антитела к рр65 окрашивали только гранулы в цитоплазме. На 20 день после инфицирования во всех клетках с внутриядерными включениями ядро не было окрашено (Рис. 7, схема). Картина окрашивания клеток антителами к рр65 и р72 была одинаковой при фиксации формалином и метанолом. Поздний вирусный антиген ЦМВ gB накапливался в клетках находящихся на поздней стадии инфекционного цикла. Как и в клетках инфицированных эндотелиотропным штаммом ЦМВ, поздний антиген накапливался в цитоплазме.

Особенности сборки вирусных частиц в клетках, инфицированных эндотелиотропным или фибробластотрошым штаммами цитомегаловируса человека. В предыдущих разделах были описаны различия в динамике экспрессии вирусных антигенов в ходе инфекции эндотелиотропного (УН1УЕ) и фибробластотропного (АО 169) штаммов ЦМВ. В последующих

экспериментах, используя метод электронной микроскопии, был проведен сравнительный анализ сборки вирусных частиц в инфицированных ЭК и фибробластах. Эндотелиальные клетки и фибробласты были инфицированы штаммом УН17Е при множественности инфекции 0,01 БОЕ/клетку. Как уже отмечалось, в этих условиях клетки подвергались лизису между 40 и 45 днем после инфицирования. Для электронно-микроскопического исследования клетки фиксировали на 5 и 25 дни после инфицирования. Эти сроки были взяты в связи с тем, что были обнаружены две популяции клеток поздних стадий инфекции в культурах, инфицированных эндотелиотропным штаммом ЦМВ. В каждом из двух типов клеточных культур было изучено по 8 случайно выбранных клеток с внутриядерными включениями на 5 день после инфицирования и по 8 клеток поздних стадий на 25 день после инфицирования. Клетки для электронно-микроскопического исследования выбирали с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Рисунок 8. Основные стадии сборки вирусных частиц в культурах клеток, инфицированных эндотелиотропным штаммом УНЬ/Е.

(A) - организация вирусных капсидов в ядре, где А -> капсиды без внутренних белков и без ДНК ЦМВ; В -> капсиды с внутренними белками, но без ДНК ЦМВ; С-> капсиды с ДНК ЦМВ ; Ф -> капсиды, контактирующие с электронноплотными филаментами (встраивание ДНК в капсиды).

(Б) — организация вирусных капсидов в цитоплазме (выявляются зрелые покрытые оболочкой инфекционные и неинфекционные вирусные частицы и темные тельца).

(B) — (М) - многочисленные капсиды, контактирующие с электронно-плотным филаментом в цитоплазме клеток на 25 день после инфицирования.

Увеличение: А, Б, х67000; В-М, хЮОООО.

В исследованных клетках были найдены все основные стадии сборки вирусных частиц. В ядре присутствовали капсиды, содержащие или не содержащие электронно-плотную сердцевину (ДНК ЦМВ), и капсиды, контактирующш с электронно-плотным филаментом (Рис. 8А), который, как предполагают, представляет собой конкатамерную вирусную ДНК в процессе встраивания в капсид [Gilloteaux and Nassiri, 2000; Mocarski ES, 1996]. В цитоплазме клеток определялись зрелые покрытые оболочкой инфекционные и неинфекционные вирусные частицы (Рис. 8Б) и темные тельца.

Анализ серийных срезов выявил существенные различия между клетками поздних стадий инфекции на 5 и на 25 день после инфицирования. Так, на 25 день после инфицирования, мы обнаружили, что не только в ядре (Рис. 8А), но и в цитоплазме VHL/E-инфицированных клеток находятся многочисленные капсиды, контактирующш с электронно-плотным филаментом (Рис. 8В-М). Как видно на рисунке 8, некоторое различие есть и в морфологии филаментов, ассоциированных с ядерными и цитоплазматическими капсидами: в отличие от филаментов в ядре, филаменты, контактируюыце с капсидами в цитоплазме, имеют примерно одинаковую толщину по всей длине (Рис. 8А, 8В-М). Интересно, что часть цитоплазматических капсид, контактирующих с филаментами, были окружены уплощенными мембранны\и везикулами (Рис. 8 3-М). Относительное содержание капсид, окруженных мембранной везикулой, среди капсид контактирующих с филаментами, варьировало в разных клетках в широких пределах. В некоторых клетках все контактирующие с филаментами капсиды располагались вплотную к аморфным скоплениям электронно-плотного материала (Рис. 9А,Б). В этом случае лишь редкие капсиды контактировали с мембранной везикулой (Рис. 8 3). В других клетках капсиды, контактирующие с филаментом, были многочисленны в перицентриолярном районе. Подавляющее большинство из них контактировало с мембранной везикулой (Рис. 8И-М, 9В), при этом лишь единичные лишенные контакта с мембранами капсиды были найдены вокруг аморфных агрегатов электронно-плотного материала. Следует отметить, что как в ЭК, так и в фибробластах в цитоплазме также содержались стандартные зрелые покрытые мембраной инфекционные частицы (Рис. 8Б).

Чтобы выяснить, формируются ли цитоплазматические, связанные с филаментами, капсиды при низкой множественности инфицирования клеток фибробластотропным штаммом ЦМВ, была исследована ультраструктура 12 фибробластов с внутриядерными включениями через 20 дней после инфицирования штаммом AD169 (0.001 БОЕ/клетку). В отличие от VHL/E-инфицированных клеток, содержащих множество контактирующих с филаментами капсидов, в AD 169-инфицированных клетках мы нашли лишь единичные подобные образования (Рис. 9Г). В цитоплазме AD169-инфицированных клеток зрелые покрытые оболочкой инфекционные частицы встречались очень часто, причем не только

внутри клеток, но и во внеклеточном пространстве. Чтобы выяснить, зависит ли образование капсидов, связанных с филаментом, от множественности инфицирования клеток, было проведено сравнение ультраструктуры фибробластов, инфицированных УНЬ/Е или АБ169 в концентрации 0,1 и 1 БОЕ/клетку, соответственно. Многочисленные капсиды, контактирующие с филаментом, были обнаружены в цитоплазме каждой клетки, исследованной в культуре фибробластов через 7 дней после инфицирования штаммом УНЬ/Е (изучено 8 клеток). Однако контактирующие с филаментом капсиды не были найдены в цитоплазме фибробластов, продуцирующих вирус, через 7 дней после инфицирования штаммом АО 169 (изучено 8 клеток).

Рисунок 9. Распределение капсидов, контактирующих с электронно-плотным филаментом, в цитоплазме УНЬ/Е-инфицированных эндотелиальных клеток (А-В) или АО 169-инфицированных фибробластов (Г).

Область, ограниченная серой линией на иллюстрации А, представлена на иллюстрации Б при большем увеличении; на рисунке В представлены срезы другой клетки.

Ц— центриоль. Стрелки обозначают капсиды, контактирующие с филаментами.

Увеличение: А, х!3300; Б-Г, хЗЗООО.

Рисунок 10. Выявление последовательностей генома цитомегаловируса с помощью ДНК гибридизации in situ на электронно-микроскопическом уровне в эндотелиальных клетках через 25 дней после инфицирования штаммом VHL7E.

Сигнал гибридизации виден в ядре (А, Б) и в цитоплазме (Д-И) клеток с внутриядерными включениями. На рисунках В и Г представлены, соответственно, ядро и цитоплазма клеток, обработанных с исключением ДНК-зонда (негативный контроль). Стрелки указывают вирусные частицы.

Увеличение: А, В, х13000; Б, Г-Е, х40000; Ж-И, х80000.

Для ответа на вопрос, является ли филамент, с которым контактируют цитоплазматические капсиды, вирусной ДНК, было проведено дополнительное исследование: гибридизация in situ на электронно-микроскопическом уровне с использованием коммерческого ДНК-зонда к последовательностям генома ЦМВ. Работа была выполнена на ЭК через 25 дней после инфицирования штаммом VHL/E (0,01 БОЕ/клетку). Специфическое окрашивание было выявлено как в ядре, так и в цитоплазме клеток с внутриядерными включениями (Рис. 10А,Б,Д-И). В ядре были окрашены вирусные капсиды и филаменты разнообразной конфигурации (Рис. 10А,Б). В большинстве инфекционных частиц, расположенных в цитоплазме, была окрашена сердцевина (Рис. 10Д,Е,И), причем окрашивались также филаменты, контактирующие с цитоплазматическими капсидами (Рис. 10Ж-И). Только слабое фоновое контрастирование уранилацетатом было заметно в клетках, обработанных с исключением ДНК-зонда (Рис. 10В,Г). Таким образом, выше описанным методом было показано, что филаменты, с которыми контактируют капсиды, являются вирусной ДНК.

выводы

1. Цитомегаловирусная инфекция не оказывает существенного влияния на митотический индекс эндотелиальных клеток. Единичные, характерные для цитомегаловирусной инфекции патологические митозы, встречаются только в участках скопления клеток, содержащих сверхранний антиген цитомегаловируса р72.

2. В эндотелиальных клетках, инфицированных эндотелиотропным штаммом VHL/E, ранний антиген цитомегаловируса рр65 способен к ассоциации с хромосомами митотических клеток.

3. На поздних стадиях развития инфекции эндотелиальные клетки и фибробласты, инфицированные эндотелиотропным штаммом VHL/E, различаются по локализации вирусных антигенов: до 15 дня сверхранний антиген р72 и ранний антиген рр65 локализованы в ядре, после 20 дня антигены накапливаются и вядре, и в цитоплазме.

4. В культурах клеток, инфицированных эндотелиотропным (VHL/E) и фибробластотропньм (AD169) штаммами цитомегаловируса, характер экспрессии сверхранних и ранних вирусных антигенов различается.

5. В ходе литической инфекции, вызванной эндотелиотропным штаммом, в культурах эндотелиальных клеток и фибробластов выявляются две популяции клеток, различающиеся по характеру сборки вирусных частиц и сменяющиеся на протяжении развития инфекции.

6. При исследовании методом in situ ДНК гибридизации и электронной микроскопии установлено, что процесс упаковки вирусной ДНК в капсид нарушается спустя две недели после инфицирования клеток эндотелиотропным штаммом цитомегаловируса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Быстревская В.Б., Ряскина С.С.. Смирнов В.Н. Цитомегаловирусная инфекция и атеросклероз. «Фундаментальные исследования и прогресс кардиологии», Москва, 2002, стр. 133-140.

2. Ряскина С. С.. Бояркин А. В., Быстревская В. Б. Экспрессия вирусных антигенов в клетках, инфицированных эндотелиотропным или фибробластотропным штаммами цитомегаловируса человека. Вопросы вирусологии, 2006, т. 1, стр. 15-19.

3. Ряскина С. С.. Бояркин А. В., Быстревская В. Б. Особенности сборки вирусных частиц в клетках, инфицированных эндотелиотропным или фибробластотропным штаммами цитомегаловируса человека. Вопросы вирусологии, 2006, т. 2, стр. 39-44.

4. V.N. Smirnov, S.Yu. Pampou, S.S. Ryaskina, V.B. Bystrevskaya. Cytomegalovirus infection and atherosclerosis. 72nd Congress of the European Atherosclerosis Society, May 20-23, Glasgow. Aterosclerosis, 2001. Vol 2, № 2 (suppl), p. 37.

5. V. B. Bystrevskaya, S. S. Ryaskina. V. N. Smirnov. Lytic infection of endothelial cells by human cytomegalovirus: the pattern of viral reproduction depends on the time of postinfection. 42nd Annual Meeting of the American Society for Cell Biology, November 2002, San Francisco, USA, Supplement to Molecular Biology of the cell, Vol. 13, p. 405a.

Принято к исполнению 16/11/2006 Исполнено 16/11/2006

Заказ № 941 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495)975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ряскина, Светлана Сергеевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Современные представления о патогенезе атеросклероза.

1.2. Вирусная теория атеросклероза.

1.3. Цитомегаловирус человека.

1.4. Особенности развития цитомегаловирусной инфекции в клеточных культурах.

1.5. Латентная цитомегаловирусная инфекция.

1.6. Особенности иммунного ответа на цитомегаловирусную инфекцию.

ГЛАВА II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Расходные материалы и реактивы.

2.2. Культура эндотелиальных клеток и фибробластов человека.

2.3. Вирусологические исследования.

2.4. Иммуноцитохимическое окрашивание.

2.5. Стандартная трансмиссионная электронная микроскопия.

2.6. ДНК гибридизация in situ.

2.7. Совмещение гибридизации in situ с электронной микроскопией.

2.8. Полимеразная цепная реакция и электрофорез

ГЛАВА III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Идентификация инфицированных ЦМВ эндотелиальных клеток. Выбор источника ЭК человека.

3.2. Цитопатологические изменения в эндотелиальных клетках при ЦМВ инфекции.

3.3. Закономерности экспрессии сверхраннего антигена ЦМВ р72 в инфицированных эндотелиальных клетках.

3.4. Закономерности экспрессии раннего антигена ЦМВ рр65 в инфицированных эндотелиальных клетках.

3.5. Закономерности экспрессии позднего антигена ЦМВ gB в инфицированных эндотелиальных клетках.

3.6. Особенности экспрессии вирусных антигенов в фибробластах, инфицированных эндотелиотропным вирусным штаммом.

3.7. Цитопатологические изменения в культуре фибробластов при ЦМВ инфекции.

3.8. Закономерности экспрессии сверхраннего антигена ЦМВ р72 в фибробластах, инфицированных эндотелиотропным штаммом

3.9. Закономерности экспрессии рр65 и gB в фибробластах, инфицированных эндотелиотропным штаммом.

3.10. Закономерности экспрессии вирусных антигенов в фибробластах, инфицированных фибробластотропным вирусным штаммом.

3.11. Оценка уровня неспецифического связывания моноклональных антител.

3.12. Особенности сборки вирусных частиц в клетках, инфицированных эндотелиотропным или фибробластотропным штаммами цитомегаловируса человека.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности экспрессии вирусных антигенов и сборки вирусных частиц в фибробластах и эндотелиальных клетках, инфицированных цитомегаловирусом человека"

Цитомегаловирусная инфекция широко распространена в человеческой популяции, и лишь малой части людей удается избежать инфицирования. По данным эпидемиологических исследований подавляющее большинство взрослых людей инфицировано цитомегаловирусом (ЦМВ): до 80% в развитых и практически 100% в развивающихся странах [Griffiths et al., 1985; Grahame-Clarke, 2005]. В последнее время ЦМВ привлекает внимание исследователей не только как источник тяжелых осложнений у пациентов с ослабленным иммунитетом [De Bolle et al., 2005; Taylor, 2003; Badami et al, 2001]. Bee больше данных свидетельствует о том, что цитомегаловирусная инфекция может являться наиболее вероятным участником патогенеза атеросклероза [Dockrell et al., 2003; Fong et al., 2002; Grahame-Clarke, 2005]. Еще в 80-х годах, в исследованиях на экспериментальных животных было убедительно доказано, что инфекция вирусами группы герпеса индуцирует в артериях развитие поражений, близко напоминающих атеросклероз у человека [Minick et al., 1979; Fabricant et al., 1981; Span et al, 1992]. В последующие годы накопилось множество данных, подтверждающих взаимосвязь между развитием атеросклероза и ЦМВ. Так, признаки обострения цитомегаловирусной инфекции были обнаружены у подавляющего большинства пациентов с вновь развившимся атеросклерозом коронарных артерий пересаженного сердца [Grattan et al, 1989, Loebe et al, 1990]. Ускоренное развитие атеросклероза на фоне цитомегаловирусной инфекции было отмечено у больных после операций аортокоронарного шунтирования [Bulkley, Hutchins, 1977; Speir et al, 1994]. В эпидемиологических исследованиях была выявлена корреляция между степенью утолщения интимы, определенной с помощью ультразвукового исследования, и титром антител к ЦМВ у людей без клинических признаков атеросклероза [Sorlie et al., 1994].

Исследования больных с клиническими проявлениями атеросклероза также показали, что подавляющее большинство больных имеют повышенный титр антител к ЦМВ [Adam et al., 1987]. Имеются также сведения, что повторный стеноз коронарных артерий чаще развивается у пациентов, имеющих в сыворотке крови антитела к ЦМВ, причем большинство таких пациентов имеют повышенный титр антител [Blum et al., 1998]. Учитывая, что геном ЦМВ был найден в аорте, коронарных, бедренных и сонных артериях человека [Yamashiroya et al., 1988, Hendrix et al1989, Pampou et al., 2000], было высказано предположение, что сайт реактивации ЦМВ может находиться в стенке артерий [Speir et al, 1994].

Способность эндотелиальных клеток (ЭК) быть инфицированными и продуцировать вирус в организме на сегодняшний день не вызывает сомнения. Сосудистый эндотелий является резервуаром латентной цитомегаловирусной инфекции в организме человека [Pampou et al., 2000], в связи с чем взаимодействие ЦМВ с ЭК может играть важную роль в генерализации инфекции. Помимо эндотелия, ЦМВ способен продуктивно инфицировать различные типы человеческих клеток: фибробласты, гладкомышечные и эпителиальные клетки, а также клетки крови [Taylor, 2003]. Закономерности протекания цитомегаловирусной инфекции в фибробластах хорошо изучены, однако в организме человека эти клетки инфицируются только в случае развития острого процесса, например, при подавлении иммунной системы при трансплантациях. Несмотря на это, сегодняшние представления о биологии ЦМВ базируются на исследованиях не клинических изолятов ЦМВ, а лабораторных штаммов, пассируемых на фибробластах. Известно, что пассирование вируса в фибробластах изменяет его свойства: штаммы теряют характерную способность инфицировать ЭК [Waldman et al., 1991]. Эти данные позволяют усомниться в том, что литический цикл ЦМВ регулируется совершенно одинаково в инфекционных системах, базирующихся на использовании различных клеточных типов.

Чтобы прояснить этот вопрос, было проведено сравнительное изучение закономерностей экспрессии вирусных антигенов в ЭК и фибробластах, инфицированных эндотелиотропным (УНЬ/Е) или фибробластотроптным (АБ169) штаммами цитомегаловируса человека.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение процесса развития литической ЦМВ инфекции в эндотелиальных клетках и фибробластах человека с использованием эндотелиотропного штамма (УНЬ/Е), сохраняющего клеточный тропизм клинического изолята.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

2. Исследовать закономерности развертывания цитомегаловирусной инфекции в культуре эндотелия и фибробластов человека, инфицированных эндотелиотропным вирусом (штамм УНЬ/Е) и выявить возможные отличия от фибробластотропных вариантов цитомегаловируса.

3. Провести сравнительное изучение закономерностей сборки вирусных частиц в эндотелиальных клетках и фибробластах, инфицированных эндотелиотропным (УНЬ/Е) или фибробластотропным (АО 169) штаммами цитомегаловируса человека.

Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе работы были разработаны методические приемы, позволяющие охарактеризовать локализацию вирусной ДНК в инфицированных клетках, в частности, метод проведения ДНК гибридизации in situ на электронно-микроскопическом уровне. Предложенный методический прием позволил одновременно исследовать ультраструктуру клетки, оценивать стадии развития вирусной инфекции и процесс формирования и упаковки вирусных частиц. Впервые описан феномен нарушения созревания вирусных частиц эндотелиотропного варианта ЦМВ (VHL/E) в цитоплазме инфицированных клеток. Впервые охарактеризованы особенности экспрессии сверхранних, ранних и поздних вирусных антигенов в ЭК и фибробластах, инфицированных эндотелиотропным вирусным штаммом. Показано, что последовательность экспрессии сверхранних и ранних белков ЦМВ в ходе литической инфекции ЭК и фибробластов, инфицированных штаммом VHL/E, отличается от литической инфекции фибробластов, инфицированных фибробластотропным штаммом AD169. Получены доказательства различий в молекулярных основах функционирования эндотелиотропного (VHL/E) и фибробластотропного (AD169) вариантов цитомегаловируса человека в различных типах клеток. Полученные данные впервые подтверждают изменение активности ЦМВ в результате длительного поддержания в лабораторных условиях на определенном типе клеток.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Ряскина, Светлана Сергеевна

ВЫВОДЫ

4. В культурах клеток, инфицированных эндотелиотропным (VHL/E) и фибробластотропным (AD169) штаммами цитомегаловируса, характер экспрессии сверхранних и ранних вирусных антигенов различается.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ряскина, Светлана Сергеевна, Москва

1. Антонов A.C., Крушинский A.B., Николаева М.А. и др. Первичная культура эндотелиальных клеток из пупочной вены человека: идентификация и характеристика растущей и конфлуэнтной культуры // Цитология, 1981,23: 1154-1159.

2. Иванова В.Ф. (1984): Многоядерные клетки (образование, строение, биологическое значение) //Арх. Анат. Гистол. Эмбриол., т.23, стр. 1154-1159.

3. Караганов Я.Л., Алимов Г.А., Миронов A.A. (1986а): Общая морфология сосудистого эндотелия // В кн.: «Сосудистый эндотелий» Киев, «Здоров'ья», стр. 78-121.

4. Караганов Я.Л., Миронов В.А., Миронов A.A. (19866): Сосудистый эндотелий при старении // В кн.: «Сосудистый эндотелий» Киев, «Здоров'ья», стр. 200-208.

5. Романов Ю.А., Антонов A.C. Морфологические и функциональные особенности эндотелия аорты человека. Два варианта организации эндотелиального монослоя при атеросклерозе // Цитология, 1991,33 (3): 7-15.

6. Смирнов В.Н., Романов Ю.А., Антонов A.C., Корнхилл Дж.Ф., Хердерик Е.Е. (1991): Морфологические особенности эндотелия аорты человека при атерогенезе // В кн.: «Проблемы атерогенеза» под ред. Е.И. Чазова, М.: Внешторгиздат., стр. 4-16.

7. Adam Е, Melnick JL, Probtsfield JL, Petrie BL, Burek J, Bailey KR, McCollum CH, DeBakey ME (1987): High levels of cytomegalovirus antibody in patients requiring vascular surgery for atherosclerosis // Lancet, ii, p. 291-293.

8. Albrecht T, Cavallo T, Cole NL, Graves K (1980): Cytomegalovirus: development and progression of cytopathic effects in human cell culture // Lab Invest, v. 42, p. 1-7.

9. Augsburger JJ, Henry RY (1978): Retinal aneurysms in adult cytomegalovirus retinitis // Am J Ophthalmol, v. 86, p. 794-797.

10. Badami KG. (2001): The immunocompromised patient and transfusion // Postgrad Med J, v.77(906), p.230-234.

11. Bancroft GJ, Shellam GR, Chalmer JE (1981): Genetic influences on the augmentation of natural killer (NK) cells during murine cytomegalovirus infection: correlation with patterns of resistance // J Immunol, v. 126, p. 988994.

12. Barnes PD, Grundy JE (1992): Down-regulation of the class I HLA heterodimer and beta 2-microglobulin on the surface of cells infected with cytomegalovirus // J Gen Virol, v. 73, p. 2395-2403.

13. Beck S; Barrell BG (1988): Human cytomegalovirus encodes a glycoprotein homologous to MHC class-I antigens // Nature, v. 331, p. 269272.

14. Beninga J, Kropff B, Mach M. (1995): Comparative analysis of fourteen individual human cytomegalovirus proteins for helper T cell response // J Gen Virol., v.76 (1), p. 153-160.

15. Benditt EP (1974): Evidence for a monoclonal origin of human atherosclerotic plaques and some implications // Circulation, v. 50, p. 650652.

16. Berencsi K, Endresz V, Klurfeld D, Kari L, Kritchevsky D, Gonczol E (1998): Early atherosclerotic plaques in the aorta following cytomegalovirus infection of mice // Cell Adhes Commun, v. 5, p. 39-47.

17. Beschorner WE, Hutchins GM, Burns WH, Saral R, Tutschka PJ, Santos GW (1980): Cytomegalovirus pneumonia in bone marrow transplant recipients: miliary and diffuse patterns // Am Rev Respir Dis, v. 122, p. 107114.

18. Borysiewicz LK, Morris S, Page JD, Sissons JG (1983): Human cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes: requirements for in vitro generation and specificity // Eur J Immunol, v. 13, p. 804-809.

19. Bresnahan WA, Shenk TE. (2000): UL82 virion protein activates expression of immediate early viral genes in human cytomegalovirus-infected cells// Proc Natl Acad Sci U S A., v. 97(26), p.14506-14511.

20. Brigati DJ, Myerson D, Leary J J, Spalholz B, Travis SZ, Fong CKY, Hsiung GD, Ward DC (1983): Detection of viral genomes in cultured cells and paraffin embedded tissue sections using biotin labelled hybridization probes // Virology, v. 126, p. 32-50.

21. Browne EP, Shenk T. (2003): Human cytomegalovirus UL83-coded pp65 virion protein inhibits antiviral gene expression in infected cells// Proc Natl Acad Sci U S A., v. 100(20), p.l 1439-11444.

22. Browne H, Smith G, Beck S, Minson T (1990): A complex between the MHC class I homologue encoded by human cytomegalovirus and beta 2 microglobulin // Nature, v. 347, p. 770-772.

23. Bukowski JF, Woda BA, Welsh RM (1984): Pathogenesis of murine cytomegalovirus infection in natural killer cell-depleted mice // J Virol, v. 52, p. 119-128.

24. Bulkley BH, Hutchins GM (1977): Accelerated "atherosclerosis". A morphologic study of 97 saphenous vein coronaiy artery bypass grafts // Circulation, v. 55, p.163-169.

25. Burch GE, Harb JM, Hiramoto Y, Shewey L (1973): Viral infection of the aorta of man associated with early atherosclerotic changes // Am Heart J, v. 86, p. 523-534.

26. Burch GE (1974): Viruses and atherosclerosis // Am Heart J, v. 87, p. 407-412.

27. Bystrevskaya VB, Lichkun W, Krushinsky AV, Smirnov VN. (1992): Centriole modification in human aortic endothelial cells// J Struct Biol., v. 109(1), p.1-12.

28. Bystrevskaya VB, Lobova TV, Smirnov VN, Makarova NE, Kushch AA. (1997): Centrosome injury in cells infected with human cytomegalovirus // J Struct Biol., v. 120(1), p.52-60.

29. Cha TA, Tom E, Kemble GW, Duke GM, Mocarski ES, Spaete RR. (1996): Human cytomegalovirus clinical isolates carry at least 19 genes not found in laboratory strains // J Virol., v.70(l), p.78-83.

30. Chang, C.P., Malone, C.I., Stinski M.F. (1989). A human cytomegalovirus early gene has three inducible promoters that are regulated differentially at various times after infection. Journal of Virology 63, 281290.

31. Chee M (1991): The HCMV genome project: what has been learned and what can be expected in the future // Transplant Proc, v. 23 (Suppl 3), p. 174-180.

32. Cunningham K.S., Gotlieb A.I. (2005): The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis // Lab Invest, v. 85(1), p. 9-23.

33. Daugherty A., Webb N.R., Rateri D.L., King V.L. (2005): Thematic review series: The immune system and atherogenesis. Cytokine regulation of macrophage functions in atherogenesis // J Lipid Res., v.46(9), p. 1812-1822

34. De Bolle L, Naesens L, De Clercq E (2005): Update on human herpesvirus 6 biology, clinical features, and therapy // Clin Microbiol Rev., v.18(1), p. 217-245.

35. Dittmer D, Mocarski ES. (1997): Human cytomegalovirus infection inhibits Gl/S transition // J Virol., v.71(2), p.1629-1634.

36. DeMarchi J.M. (1983): Correlation betwin stimulation of host cell DNA syntesis by Human cytomegalovirus and lack of expression of a subset of early virus genes // J. Virol, v. 129, p. 274-286.

37. Dockrell DH (2003): Human herpesvirus 6: molecular biology and clinical features // J Med Microbiol., v.52(Pt 1), p.5-18.

38. Einhorn L, Ost A (1984): Cytomegalovirus infection of human blood cells // J Infect Dis, v. 149, p. 207-214.

39. Fabricant CG, Hajjar DP, Minick CR, Fabricant J (1981): Herpesvirus infection enhances cholesterol and cholesteryl ester accumulation in cultured arterial smooth muscle cells // Am J Pathol, v. 105, p. 176-184.

40. Faggiotto A, Ross R (1984): Studies of hypercholesterolemia in the nonhuman primate. II. Fatty streak conversion to fibrous plaque // Arteriosclerosis, v. 4, p. 341-356.

41. Farber I, Wutzler P, Sprossig M, Schweizer H. (1979): Determination of antibodies against cytomegalovirus-induced early antigens by using rabbit lung fibroblasts. Brief report. // Arch Virol,v.62(3),p.273-276.

42. Feldman DL, Hoff HF, Gerrity RG (1984): Immunohistochemical localization of apoprotein B in aortas from hyperlipemic swine. Preferential accumulation in lesion-prone areas // Arch Pathol Lab Med, v. 108, p. 817822.

43. Fish KN, Britt W, Nelson JA (1996): A novel mechanism for persistence of human cytomegalovirus in macrophages // J Virol, v. 70, p. 1855-1862.

44. Fish KN, Depto AS, Moses AV, Britt W, Nelson JA (1995): Growth kinetics of human cytomegalovirus are altered in monocyte-derived macrophages // J Virol, v. 69, p. 3737-3743.

45. Fong IW. (2002): Infections and their role in atherosclerotic vascular disease // J Am Dent Assoc., Suppl. p. 7S-13S.

46. Foucar E, Mukai K, Foucar K, Sutherland DE, Van Buren CT (1981): Colon ulceration in lethal cytomegalovirus infection // Am J Clin Pathol, v. 76, p. 788-801.

47. Frostegard J. (2005): Atherosclerosis in patients with autoimmune disorders // Arterioscler Thromb Vase Biol., v.25(9), p. 1776-1785

48. Garnett HM. (1979): Fusion of cytomegalovirus infected fibroblasts to form multinucleate giant cells// J Med Virol., v.3(4), p.271-274.

49. Gerna, G.G., Percivalle, E., Baldanti, F., et al. (2000). Human cytomegalovirus replicates abortively in polymorphonuclear leucocytes after transfer from infected endothelial cells via transient microfusion events. Journal of Virology 74, 5629-5638.

50. Gerna G, Percivalle E, Sarasini A, Baldanti F, Campanini G, Revello MG. (2003): Rescue of human cytomegalovirus strain AD 169 tropism for both leukocytes and human endothelial cells // J Gen Virol., v.84(6), p. 14311436.

51. Gilloteaux J, Nassiri MR. (2000): Human bone marrow fibroblasts infected by cytomegalovirus: ultrastructural observations // J Submicrosc Cytol Pathol., v.32(l), p. 17-45.

52. Gimbrone MA Jr, Cotran RS, Folkman J. (1974): Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis // J Cell Biol., v. 60(3), p.673-684.

53. Goldstein JL, Brown MS (1984): Progress in understanding the LDL receptor and HMG-CoA reductase, two membrane proteins that regulate the plasma cholesterol // J Lipid Res, v. 25, p. 1450-1461.

54. Grahame-Clarlce C. (2005): Human cytomegalovirus, endothelial function and atherosclerosis // Herpes., v. 12(2), p.42-45.

55. Grattan MT, Moreno-Cabral CE, Starnes VA, Oyer PE, Stinson EB, Shumway NE (1989): Cytomegalovirus infection is associated with cardiac allograft rejection and atherosclerosis // J Am Med Assoc, v. 261, p. 35613566.

56. Greaves, R.F., Mocarski, E.S. (1998). Defective growth correlates with reduced accumulation of a viral DNA replication protein after low-multiplicity infection by human cytomegalovirus iel mutant. Journal of Virology 72, 366-379.

57. Grefte A, van der Giessen M, van Son W, The TH (1993): Circulating cytomegalovirus (CMV)-infected endothelial cells in patients with an active CMV infection // J Infect Dis, v. 167, p. 270-277.

58. Griffiths P, Baboonian C, Ashby D (1985): The demographic characteristics of pregnant women infected with cytomegalovirus // Int J Epidemiol, v. 14, p. 447-452.

59. Grundy JE, McKeating JA, Griffiths PD (1987a): Cytomegalovirus strain AD 169 binds beta 2 microglobulin in vitro after release from cells // J Gen Virol, v. 68, p. 777-784.

60. Hagemeier C, Walker SM, Sissons PJ, Sinclair JH. (1992): The 72K IE1 and 80K IE2 proteins of human cytomegalovirus independently trans-activate the c-fos, c-myc and hsp70 promoters via basal promoter elements// J Gen Virol.,v. 73 (9), p.2385-2393.

61. Hajjar D.P. Viral pathogenesis of atherosclerosis. Impact of molecular mimicry and viral genes // Amer. J. Pathol., 1991, 139: 1195-1211.

62. Hansson GK, Holm J, Jonasson L (1989): Detection of activated T lymphocytes in the human atherosclerotic plaque // Am J Pathol, v. 135, p. 169-175.

63. Hendrix MG, Dormans PH, Kitslaar P, Bosman F, Bruggeman CA (1989): The presence of cytomegalovirus nucleic acids in arterial walls of atherosclerotic and nonatherosclerotic patients // Am J Pathol, v. 134, p. 1151-1157.

64. Houle S, Roach MR (1981): Flow studies in a rigid model of an aorto-renal junction. A case for high shear as a cause of the localization of sudanophilic lesions in rabbits // Atherosclerosis., v.40(3-4), p.231-244.

65. Jonjic S, del Val M, Keil GM, Reddehase MJ, Koszinowski UH (1988): A nonstructural viral protein expressed by a recombinant vaccinia virus protects against lethal cytomegalovirus infection // J Virol, v. 62, p. 16531658.

66. Kalejta RF, Shenk T. (2003): The human cytomegalovirus UL82 gene product (pp71) accelerates progression through the G1 phase of the cell cycle// J Virol., V.77(6), P.3451-3459.

67. Kapasi K, Rice GP (1988): Cytomegalovirus infection of peripheral blood mononuclear cells: effects on interleukin-1 and -2 production and responsiveness // J Virol, v. 62, p. 3603-3607.

68. Koszinowski UH, Reddehase MJ, Del Val M (1992): Principles of cytomegalovirus antigen presentation in vitro and in vivo // Semin Immunol, v. 4, p. 71-79.

69. Koszinowski UH, Reddehase MJ, Keil GM, Volkmer H, Jonjic S, Messerle M, del Val M, Mutter W, Munch K, Buhler B (1987): Molecular analysis of herpesviral gene products recognized by protective cytolytic T lymphocytes // Immunol Lett, v. 16, p. 185-192.

70. Maciag T, Hoover GA, Stemerman MB, Weinstein R. (1981): Serial propagation of human endothelial cells in vitro// J Cell Biol., v.91(l), p.420-426.

71. Majno G, Joris I, Zand T. (1985): Atherosclerosis: new horizons. // Hum Pathol., v. 16(1), p. 3-5.

72. Malone CL, Vesole DH, Stinski MF (1990): Transactivation of a human cytomegalovirus early promoter by gene products from the immediate-early gene IE2 and augmentation by IE1: mutational analysis of the viral proteins // J Virol, v. 64, p. 1498-1506.

73. Marutsuka K., Hatakeyama K., Yamashita A., Asada Y. (2005): Role of thrombogenic factors in the development of atherosclerosis // J Atheroscler Thromb., v. 12(1), p. 1-8.

74. McKeating JA, Griffiths PD, Grundy JE (1987): Cytomegalovirus in urine specimens has host beta 2 microglobulin bound to the viral envelope: a mechanism of evading the host immune response? // J Gen Virol, v. 68, p. 785-792.

75. Melnick JL, Adam E, DeBakey ME (1993): Cytomegalovirus and atherosclerosis // Eur Heart J, v. 14 (Suppl K), p. 30-38.

76. Michelson-Fiske S, Horodniceanu F, Guillon JC (1977): Immediate early antigens in human cytomegalovirus infected cells // Nature, v. 270, p. 615-617.

77. Minick CR, Fabricant CG, Fabricant J, Litrenta MM (1979): Atheroarteriosclerosis induced by infection with a herpesvirus // Am J Pathol, v. 96, p. 673-706.

78. Mocarski ES, Stinski MF (1979): Persistence of the cytomegalovirus genome in human cells // J Virol, v. 31, p. 761-775.

79. Mocarski ES (1996): Cytomegaloviruses and their replication. In Fields of virology, 3rd edn., p. 2447-2492.

80. Mossman K.L. Activation and inhibition of virus and interferon: the herpesvirus story// Viral Immunology, 2002,15(1): 3-15.

81. Mueller SN, Rosen EM, Levine EM. (1980): Cellular senescence in a cloned strain of bovine fetal aortic endothelial cells // Science, v.207(4433), p.889-891.

82. Newby AC, Zaltsman AB (1999): Fibrous cap formation or destruction-the critical importance of vascular smooth muscle cell proliferation, migration and matrix formation // Cardiovasc Res, 1999, v. 41, p. 345-360.

83. Otto SM, Sullivan-Tailyour G, Malone CL, Stinski MF (1988): Subcellular localization of the major immediate early protein (IE1) of human cytomegalovirus at early times after infection // Virology., v. 162(2), p.478-482.

84. Palinski W, Rosenfeld ME, Yla-Herttuala S, Gurtner GC, Socher SS, Butler SW, Parthasarathy S, Carew TE, Steinberg D, Witztum JL (1989): Low density lipoprotein undergoes oxidative modification in vivo // Proc Natl Acad Sci U S A, v. 86, p. 1372-1376.

85. Pampou, S.Yu., Gnedoy, S.N., Bystrevskaya, V.B., Smirnov, V.N., Chazov, E.I., Melniclc, J.L., DeBakey M.E. (2000). Cytomegalovirus genome and the immediate-early antigen in cells of different layers of human aorta. Virchows Archiv 436, 539-552.

86. Paya CV, Hermans PE, Wiesner RH, Ludwig J, Smith TF, Rakela J, Krom RA (1989): Cytomegalovirus hepatitis in liver transplantation: prospective analysis of 93 consecutive orthotopic liver transplantations // J Infect Dis, v. 160, p. 752-758.

87. Percivalle E, Revello MG, Yago L, Morini F, Gerna G (1993): Circulating endothelial giant cells permissive for human cytomegalovirus (HCMV) are detected in disseminated HCMV infections with organ involvement // J Clin Invest, v. 92, p. 663-670.

88. Peterslund NA (1991): Herpesvirus infection: an overview of the clinical manifestation // Scand J Infect, v. 78, Suppl., p. 15-20.

89. Quehenberger O. (2005): Thematic review series: the immune system and atherogenesis. Molecular mechanisms regulating monocyte recruitment in atherosclerosis // J Lipid Res., v. 46(8), p. 1582-1590.

90. Quinn MT, Parthasarathy S, Fong LG, Steinberg D (1987): Oxidatively modified low density lipoproteins: a potential role in recruitment andretention of monocyte/macrophages during atherogenesis // Proc Natl Acad Sci U S A, v. 84, p. 2995-2998.

91. Quinnan GY, Manischewitz JE, Ennis FA (1978): Cytotoxic T lymphocyte response to murine cytomegalovirus infection // Nature, v. 273, p. 541-543.

92. Quinnan GV, Manischewitz JE.(1979): The role of natural killer cells and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity during murine cytomegalovirus infection // J Exp Med, v. 150(6), p. 1549-1554.

93. Rasmussen L (1990): Immune response to human cytomegalovirus infection // Curr Top Microbiol Immunol, v. 154, p. 221-254.

94. Reddehase MJ, Koszinowski UH (1984): Significance of herpesvirus immediate early gene expression in cellular immunity to cytomegalovirus infection//Nature, v. 312, p. 369-371.

95. Reddehase MJ, Mutter W, Munch K, Buhring HJ, Koszinowski UH (1987): CD8-positive T lymphocytes specific for murine cytomegalovirus immediate-early antigens mediate protective immunity // J Virol, v. 61, p. 3102-3108.

96. Reddehase MJ, Rothbard JB, Koszinowski UH (1989): A pentapeptide as minimal antigenic determinant for MHC class I-restricted T lymphocytes // Nature, v. 337, p. 651-653.

97. Revello MG, Zavattoni M, Sarasini A, Percivalle E, Simoncini L, Gerna G (1998): Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy // J Infect Dis, v. 177, p. 1170-1175.

98. Reyburn HT, Mandelboim O, Vales-Gomez M, Davis DM, Pazmany L, Strominger JL (1997): The class I MHC homologue of human cytomegalovirus inhibits attack by natural killer cells // Nature, v. 386, p. 514-517.

99. Rice GP, Schrier RD, Oldstone MB (1984): Cytomegalovirus infects human lymphocytes and monocytes: virus expression is restricted to immediate-early gene products // Proc Natl Acad Sci U S A, v. 81, p. 61346138.

100. Roby C, Gibson W. (1986): Characterization of phosphoproteins and protein kinase activity of virions, noninfectious enveloped particles, and dense bodies of human cytomegalovirus// J Virol., v. 59(3)., p.714-727.

101. Ross R. (1986): The pathogenesis of atherosclerosis an update. Engl J Med // v.314(8), p. 488-500.

102. Ross R (1993): Rous-Whipple Award Lecture. Atherosclerosis: a defense mechanism gone awry // Am J Pathol, v. 143, p. 987-1002.

103. Ruger B, Klages S, Walla B, Albrecht J, Fleckenstein B, Tomlinson P, Barrell B. (1987): Primary structure and transcription of the genes coding for the two virion phosphoproteins pp65 and pp71 of human cytomegalovirus// J Virol,v. 61(2), p. 446-453.

104. Schwartz CJ, Valente AJ, Sprague EA, Kelley JL, Nerem RM. (1991) :The pathogenesis of atherosclerosis: an overview // Clin Cardiol., v. 14 (2 Suppl 1), p.11-16.

105. Sedmak DD, Guglielmo AM, Knight DA, Birmingham DJ, Huang EH, Waldman WJ (1994a): Cytomegalovirus inhibits major histocompatibility class II expression on infected endothelial cells // Am J Pathol, v. 144, p. 683692.

106. Sedmak DD, Roberts WH, Stephens RE, Buesching WJ, Morgan LA, Davis DH, Waldman WJ (1990): Inability of cytomegalovirus infection of cultured endothelial cells to induce HLA class II antigen expression // Transplantation, v. 49, p. 458-462.

107. Sinzger C, Plachter B, Stenglein S, Jahn G (1993): Immunohistochemical detection of viral antigens in smooth muscle, stromal, and epithelial cells from acute human cytomegalovirus gastritis // J Infect Dis, v. 167, p. 1427-1432.

108. Sima A, Bulla A, Simionescu N. (1990): Experimental obstructive coronary atherosclerosis in the hyperlipidemic hamster // J Submicrosc Cytol Pathol, v.22(l), p.1-16.

109. Smirnov VN, Repin VS, Tkachuk VA, Chazov EI. (1988): Vascular endothelium and atherosclerosis a multidisciplinary approach // Endothelial cells. CRC Press, Boston, v.3, p. 139-215.

110. Soderberg C, Larsson S, Bergstedt-Lindqvist S, Moller E (1993): Definition of a subset of human peripheral blood mononuclear cells that arepermissive to human cytomegalovirus infection // J Virol, v. 67, p. 31663175.

111. Sorlie PD, Adam E, Melnick SL, Folsom A, Skelton T, Chambless LE, Barnes R, Melnick JL (1994): Cytomegalovirus/herpesvirus and carotid atherosclerosis: the ARIC Study // J Med Virol, v. 42, p. 33-37.

112. Span AH, Frederik PM, Grauls G, Van Boven GP, Bruggeman CA (1993): CMV induced vascular injury: an electron-microscopic study in the rat // In Vivo, v. 7, p. 567-573.

113. Span AH, Grauls G, Bosman F, van Boven CP, Bruggeman CA (1992): Cytomegalovirus infection induces vascular injury in the rat // Atherosclerosis, v. 93, p. 41-52.

114. Speir E, Modali R, Huang E-S, Leon MB, Shawl F, Finkel T, Epstein SE (1994): Potential role of human cytomegalovirus and p53 interaction in coronary restenosis // Science, v. 256, p. 391-394.

115. Spencer GD, Shulman HM, Myerson D, Thomas ED, McDonald GB (1986): Diffuse intestinal ulceration after marrow transplantation: a clinicopathologic study of 13 patients // Hum Pathol, v. 17,p. 621-633.

116. Stagno S, Reynolds DW, Pass RF, Alford CA (1980): Breast milk and the risk of cytomegalovirus infection // N Engl J Med, v. 302, p. 1073-1076.

117. Stamminger T, Fleckenstein B (1990): Immediate-early transcription regulation of human cytomegalovirus // Curr Top Microbiol Immunol, v. 154, p. 3-19.

118. Starr SE, Allison AC (1977): Role of T lymphocytes in recovery from murine cytomegalovirus infection // Infect Immun., v. 17(2), p.458-462.

119. Steinberg D, Witztum JL (1990): Lipoproteins and atherogenesis. Current concepts // JAMA, v. 264, p. 3047-3052.

120. Stenberg RM, Depto AS, Fortney J, Nelson JA (1989): Regulated expression of early and late RNAs and proteins from the human cytomegalovirus immediate-early region // J Virol, v. 63, p. 2699-2708.

121. Stenberg RM (1996): The human cytomegalovirus major immediate-early gene // Intervirology, v. 39, p. 343-349.

122. Stinski MF, Thomsen DR, Stenberg RM, Goldstein LC (1983): Organization and expression of the immediate early genes of human cytomegalovirus // J Virol, v. 46, p. 1-14.

123. Swenson PD, Kaplan MH (1987): Comparison of two rapid culture methods for detection of cytomegalovirus in clinical specimens J Clin Microbiol, v. 25, p. 2445-2446.

124. Tamura T, Chiba S, Abo W, Chiba Y, Nalcao T. (1980): Cytomegalovirus-specific lymphocyte transformations in subjects of different ages with primary immunodeficiency // Infect Immun., v.28(l), p.49-53.

125. Taylor GH. (2003): Cytomegalovirus // Am Fam Physician. v.67(3), p.519-524.

126. Thyberg J, Nilsson J, Palmberg L, Sjolund M (1985): Adult human arterial smooth muscle cells in primary culture. Modulation from contractile to synthetic phenotype // Cell Tissue Res, v. 239, p. 69-74.

127. Tokunaga 0, Fan JL, Watanabe T (1989): Atherosclerosis- and age-related multinucleated variant endothelial cells in primary culture from human aorta // Am J Pathol, v. 135, p. 967-976.

128. Toorkey CB, Carrigan DR (1989): Immunohistochemical detection of an immediate early antigen of human cytomegalovirus in normal tissues // J Infect Dis, v. 160, p.741-751.

129. Vyalov S, Langille BL, Gotlieb AI (1996): Decreased blood flow rate disrupts endothelial repair in vivo // Am J Pathol, v. 149, p. 2107-2118.

130. Waldman WJ, Sneddon JM, Stephens RE, Roberts WH (1989): Enhanced endothelial cytopathogenicity induced by a cytomegalovirus strain propagated in endothelial cells // J Med Virol, v. 28, p.223-230.

131. Waldman WJ, Roberts WH, Davis DH, Williams MV, Sedmak DD, Stephens RE (1991): Preservation of natural endothelial cytopathogenicity of cytomegalovirus by propagation in endothelial cells // Arch Virol, v. 117, p. 143-164.

132. Waldman WJ, Adams PW, Orosz CG, Sedmak DD (1992): T lymphocyte activation by cytomegalovirus-infected, allogeneic cultured human endothelial cells // Transplantation, v. 54, p. 887-896.

133. Wathen MW, Stinski MF (1982): Temporal patterns of human cytomegalovirus transcription: mapping the viral RNAs synthesized at immediate early, early, and late times after infection // J Virol, v. 41, p. 462477.

134. Weber B, Hamann A, Ritt B, Rabenau H, Braun W, Doerr HW (1992): Comparison of shell viral culture and serology for the diagnosis of human cytomegalovirus infection in neonates and immunocompromised subjects // Clin Investig, v. 70, p. 503-507.

135. Wick G, Schett G, Amberger A, Kleindienst R, Xu Q (1995): Is atherosclerosis an immunologically mediated disease? // Immunology Today, v. 16, p. 27-33.

136. Winston DJ, Pollard RB, Ho WG, Gallagher JG, Rasmussen LE, Huang SN, Lin CH, Gossett TG, Merigan TC, Gale RP (1982): Cytomegalovirus immune plasma in bone marrow transplant recipients // Ann Intern Med, v. 97,p. 11-18.

137. Wright HP (1972): Mitosis patterns in aortic endothelium // Atherosclerosis, v. 15, p. 93-100.

138. Wolf DG, Courcelle CT, Prichard MN, Mocarski ES. (2001): Distinct and separate roles for herpesvirus-conserved UL97 kinase in cytomegalovirus DNA synthesis and encapsidation // Proc Natl Acad Sei U S A., v.98(4), p.1895-1900.

139. Yamada T, Fan J, Shimokama T, Tokunaga O, Watanabe T (1992): Induction of fatty streak-like lesions in vitro using a culture model system simulating arterial intima // Am J Pathol, v. 141, p. 1435-1444.

140. Yamashiroya HM, Ghosh L, Yang R, Robertson AL (1988): Herpesviridae in the coronary arteries and aorta of young trauma victims // Am J Pathol, v. 130, p. 71-79.

141. Yamashita Y, Shimokata K, Mizuno S, Yamaguchi H, Nishiyama Y (1993): Down-regulation of the surface expression of class I MHC antigens by human cytomegalovirus // Virology, v. 193, p. 727-736.

142. Yang Z., Ming XF. (2006): Recent advances in understanding endothelial dysfunction in atherosclerosis // Clin Med Res., v.4(l), p.53-65

Информация о работе

Ряскина, Светлана Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.25

Диссертация

Особенности экспрессии вирусных антигенов и сборки вирусных частиц в фибробластах и эндотелиальных клетках, инфицированных цитомегаловирусом человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы