Структурно-функциональный анализ мембранных белков вирусов в генетически трансформированныхклетках

Тугизов, Шароф Мавлонович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональный анализ мембранных белков вирусов в генетически трансформированныхклетках
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональный анализ мембранных белков вирусов в генетически трансформированныхклетках"

На правах рукописи УДК 578.833.26:578.531.08

Тугизоп Шароф Мавлонопич

Структурно-функциональный анализ мембранных белков вирусов в генетически трансформированных

клетках

03.00.06. - Вирусология

Автореферат ' диссертации «а соискаиие ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА 1995

Работа выполнена в лаборатории клеточной инженерии Института вирусологии им. Л-И.Ивановского Российской Академии Медицинских Наук и в лаборатории вирусологии Калифорнийского Университета (США, Сан франциско).

Научный консультант: доктор биологических наук,

профессор А.А.Кущ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор медицинских наук, профессор Я.Я.Цилинский доктор биологических наук, профессор А.В.Зеленин доктор медицинских наук, профессор В.Г.Нестеренко

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Научно-исследовательский институт

вирусных препаратов РАМН

Защита диссертации состоится " "_ 1996 г. в--часов

на заседании специализированного Совета Д 001.20.01. при Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМП, Москва, ул. Гамалеи, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

Автореферат разослан " * _ 1996 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор медицинских наук

Н.П.Косякова

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Изучение структурных и функциональных свойств вирусных белков позволяет выяснить механизмы развития вирусной инфекции на молекулярном и клеточном уровнях, открывает новые перспективы профилактики и лечения вирусных инфекций. В процессе вирусной инфекции в клетках хозяина синтезируется множество вирусных антигенов, обладающих различающимися функциональными свойствами. Их можно условно разделить на две группы: существенные - белки, которые необходимы для размножения вируса, и несущественные ■ белки, непосредственно не участвующие в репродукции вируса, но играющие важную роль в развитии инфекционного' процесса. Определение функции индвидуального вирусного белка, обнаруживаемого в зараженной клетке, не всегда возможно, т.к. нельзя исключить роль других белков вируса. Использование мутантных вирусов, в которых исследуемый ген инактивирован, также лшеет ряд недостатков: невозможно исследовать фуикции несущественных генов, поскольку вирусы, несущие мутации по этим генам, хорошо размножаются в клеточных культурах. При получении мутантных вирусов по изучаемым генам нельзя избежать нелегальных мутаций других генов вируса, т.к. мутагенное воздействие может индуцировать большое число различных мутаций в вирусном геноме; множественные мутации в исследуемом гене не позволяют идентифицировать функциональные домены генного продукта.

Создание генетически трансформированных клеток, экспрессирующих индвидуальные вирусные гены под контролем природных и искусственных промоторов, дает в руки исследователей новый инструмент, позволяющий изучать функции и свойства генных продуктов, открывает перспективы создания' клеток-продуцентов для биотехнологии. Клеточные линии, экспрессирующие мутантные варианты исследуемого гена, позволяют идентифицировать функциональные домены вирусных белков. Использование клеточных линий, экспрессирующих существенные гены вирусов, и вирусов, несущих мутации по этим же генам, для комплементарного анализа является уникальным методом для анализа вирусных антигенов, ответственных за ключевые стадии размножения вируса: адсорбция, проникновение, сборка, отпочковывание. Клеточные линии, экспрессирующие гены трудно культивируемых вирусов, таких как гепаднавирусы, являются почти безальтернативной моделью для изучения генных продуктов.

Используя генетически трансформированные клеточные линии, экспрессирующие вирусные гены, можно создать путем селекции их в присутствие гормонов, лекарственных веществ, лектинов и т.д. различные модельные системы, проявляющие признаки дифференцировки, дефектности по рецепторам и пострансляционной модификации (гликозилирование, олигомеризация). для изучения регуляции экспрессии вирусных генов, внутриклеточного транспорта, созревания и компартментализации генных продуктов.

Генетически трансформированные клетки различного происхождения (нервные клетки, лимфоциты, гепатоциты), экспрессирующие вирусные гены

, позволяют определить роль этих генов в тропизме вируса и выяснить механизмы клеточного и тканевого тропизма вирусной инфекции.

Генетически трансформированные клеточные линии, экспрессирующие вирусные белки, являются, таким образом, не только удобной клеточной системой для решения важных фундаментальных проблем вирусологии, но представляют также большую ценность для биотехнологических исследований и решения прикладных вопросов вирусологии и медицины.

Цель и задачи исследований. Целью исследований являл ось изучение закономерностей экспрессии и структурно-функциональных свойств оболочечных белков вируса гепатита В и цитомегаловируса человека в генетически трансформированных клеточных линиях человека и млекопитающих.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Получение мутантных клеток человека и млекопитающих, дефектных по генам Tlv и ГФРТ, пригодных для селекции генетически трансформированных клеток, экспрессируюших вирусные гены. Развитие и оптимизации методов трансфекнии и селекции трансформантов.

2. Создание генетически трансформированных клеточных линий различного происхождения, зкслрессирущих ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg). Сравнительный анализ экспрессии HBsAg в различных клетках.

3. Селекция высокодифференцированных и низкодифференцированных клонов гепатокарциномы человека., экспрессируюших HBsAg и НВсАд. Роль диффереицировки гепатоцитов в регуляции экспрессии генов вируса гепатита. В.

4. Получение клеточных линий, конститутивно экспрессируюших мембранные гликопротеины (gB,us9) цитомегаловируса человека.! Анализ процессинга, внутриклеточного транспорта и функциональных свойств этих белков. .

Научная новизна работы:

-Изучение эффективности промоторов мсталлотионина-1 мыши и длинных концевых повторов (ltr) вируса саркомы Рауса показал, что эти промоторы обеспечивают индуцибельную и конститутивную экспрессию HBsAg в генетически трансформированных клетках почки эмбриона свиньи (СД1ЭВ) и трахеи эмбриона коровы (ТР), а также в первичных клетках печени и ночки сурка Marmoto шопах. Сравнительный анализ различных клеток, экспрессируюших HBsAg, показал, что высокая и стабильная продукция HBsAg обнаруживается в клетках СПЭВ и достигает 1,28 мкг/Ю^кл. в сутки.

-Изучена роль диффереицировки гепатоцитов в регуляции экспрессии HBsAg и НВсАд в высокодифференцированных и

низкодифференцированных клонах гепатокарциномы человека PLC/PRF/5. Впервые показано усиление экспрессии HBsAg и активация

репрессированного( гена HBcAg d внеокодифференцированных клонах гепатокарциномы plc/prf/5.

-Впервые показана в генетически трансформированных клетках глиобластомы фузогенная активность оболочечного гликопротеина В (дв) цитомегаловируса человека, обеспечивающая проникновение вируса п клетки путем слияния вирусной и клеточной мембран. Установлено, что трансмембранный и цитоплазматический участки дв играют важную роль в сливающей функции белка. Доказано, что функциональная активность дв зависит от гликознлирования, фосфорилирования и транспорта белка к плазматической мембране клеток.

-Впервые показано, что ЦМВ инфицирует полярные эпителиальные клетки сетчатки глаза человека (ЛРПЕ-19) с апикальной поверхности, и зрелые вирусные частицы после репродукции отпочковываются также с апикальной поверхности. Установлено, что инфекция ВПГ-1 не связана с феноменом полярности клеток. ВПГ-1 инфицирует полярные АРПЕ-19 клетки как с апикальной, гак и с базолатеральной поверхности в одинаковой степени.

-Созданы полярные эпителиальные клеточные линии, стабильно экспрессируюшие дв и US9 ЦМВ. Показано, что дВ транспортируется к апикальной поверхности, тогда как us9 аккумулируется на латеральной мембране полярных клеток. С использованием делеционных мутантов ЦМВ по us9 и ВПГ-1 по дЕ в полярных клетках показано, что эти белки участвуют в переходе вируса от инфицированных к неинфицированным клеткам через латеральную мембрану.

Практическая ценность работы.

-Получены и охарактеризованы новые TIC' и ГФРТ" мутантные клеточные линии человека (plc/prf/5, u373mg, сем), свиньи (СПЭВ), коровы (TP) и обезьяны (cvi). пригодные для генетической трансформации клеток. Установлены оптимальные параметры трансфекшш мутантмых клеток и селекции трансформантов.

-Получены серии генетически трансформированных клеточных линий, экспрессирующих поверхностные белки ВГВ (HBsAg) и ЦМВ (дв, US9), которые могут быть полезными для решения практических задач медицины и биотехнологии.

-Разработаны методы селекции высокодифференцированных и низкодифференцированных клонов гепатокарциномы человека plc/prf/5 с использованием токсических лекарственных веществ: цитостатиков, антиметаболитов, аналогов пуриновых и пиримидиновых оснований нуклеиновых кислот.

-Получены клеточные клоны гепатокарциномы человека plc/prf/5. проявляющие различную степень дифференцировки и экспрессируюшие HBsAg И HBcAg.

-Создана модельная клеточная система пигментных эпителиальных клеток сетчатки глаза человека, проявляющих полярность in vitro, для вирусологических и молекулпрно-биологических исследований.

-Полученные результаты используются в учебном процессе при проведении лекционных и практических занятий по вирусологии и клеточной биологии в Калифорнийском университете Сан Франциско.

-По материалам диссертационной работы получены авторские свидетельства на изобретения:

1. Авторское свидетельство. N 1294-ОЮ, от 08.08.1986, Штамм ГФРТ" мутантных клеток трахеи эмбриона коровы для гибридизации клеток животных in vitro. Дьяконов J1.II., Куш A.A., Тугизов Ш.М.,

Майджи E.G.. Жданов D.M.

2. Авторское свидетельство. N 1275905, от 09.11.1986, Штамм ТК' клеточного клона почки эмбриона свиньи для гибридизации клеток животных in vitro. Тугизов Ш.М., Кущ A.A., Дьяконов Jl.ll., Расульев

О.Ш.. Жданов U.M..

.'5. Авторское свидетельство. N 1503301. от 22.04.1989, Штамм культивируемых клеток печени человека, дефектных по ГФРТ для гибридизации. Тугизов Ш.М.. Куш A.A.

4. Авторское свидетельство. N 1495375. от 22.03.1989, Штамм культивируемых клеток гепатокарциномы человека, дефектных по ТК для гибридизации и траисфекции. Тугизов Ш.М., Кущ A.A.

-Подготовлены и опубликованы методические рекомендации по получению мутантных клеточных линий, дефектных по генам ТК и ГФРТ. Утверждены секцией ВАСХНИЛ 'Биотехнология", прот. N23 от 20 мая 1986 года. Дьяконов Л.П.. Куш A.A., Тугизов ILI.M. Методические рекомендации по получению мутантных штаммов перевиваемых линий клеток сельскохозяйственных животных, пригодных для гибридизации и трансакции. Москва, ВАСХНИЛ, 1986, 16 с.

Основные положения, выносимые на защиту.

-Экспрессия оболочечного (HBsAg) и сердцевинного (нвсАд) белков ВГБ зависит от степени дифференцировки клеток гепатокарциномы PLC/PRF/5. R начальной стадии дифференцировки клеток экспрессия HBsAg усиливается, в предтерминальной и терминальной стадии цитодифференинровки происходит активация репрессированного гена НВсАд. В период активации нвсАд отмечалось снижение экспрессии HBsAg, что свидетельствует о существовании различных механизмов регуляции экспрессии этих генов в гепатоцитах.

-Генетически трансформированные клетки почки эмбриона свиньи (СПЭВ), транс<1)ицированные геном HBsAg, находящимся под контролем промоторов LTR ВСР и МТ-1 мыши, обеспечивают как конститутивную, так и индуцибельную экспрессию оболочечного белка ВГВ.

-Оболочечный гликопротеин В (дв) цитомегаловируса человека является фузогенным белком, обеспечивающим проникновение вируса в клетки путем слияния вирусной и клеточной мембран. Трансмембранный и

цнтонлазматический домены (73 аминокислоты) дв ответственны за фузогенную функцию белка, для осушествления сливающей активности необходимо сохранение конформации внеклеточных доменов в1(411-447 аминикислоты), с2а(447-476 аминокислоты), б2ь(476-618 аминокислоты).

-Цптомегалопирус человека инфицирует полярные эпителиальные клетки сетчатки глаз только через апикальную мембрану и после завершения репродукции вируса, зрелые вирионы отпочковываются также с апикальной поверхности клеток, куда транспортируется мембранный гликопротеин В вируса (дв). В присутствие пируснейтрализуюших антител цитомегаловирус может переходить от инфицированных клеток к унифицированным через латеральную мембрану полярных .'эпителиальных клеток. Оболочечный гликопротеин иээ аккумулируется на латеральной мембране клеток и участвует к переходе вируса через эту мембрану. '

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены на Всесоюзной конференции "Биология клетки в культуре", "Ленинград, 1987; Всесоюзной конференции "Новые направления в биотехнологии", Пушино 1988, 1990: Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток в культуре," Звенигород, 1986. 1989. Всесоюзной школе-семинаре "Молекулярная биология и медицина". Москва 1990: Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", Самарканд, 1991; Международном симпозиуме'Вирусные гепатиты", Ростов Великий, 1990; Иберо-Амереканском Конгрессе по биотехнологии и интерферону, Гавана, Куба, 1989: 17 Международной конференции по герпесвирусам, Лондон, Англия. 1992: Международной конференции "Болезни глаз" Ныо Орланд, США, 1992: 2-м международном симпозиуме "Персистентные вирусные инфекции" Саванна, США, 1992; 1-м международном симпозиуме по нитомегаловирусам, Окасака. Япония, 1992; 4-м международном симпозиуме по цитомегаловирусам, Париж, Франция,,,,, 1993; Международной конференции по клеточной биологии и , биохимии, Кейстон, США, 1993: 18-й Международной конференции по герпесвирусам, Питсбург. США, 1993: 19-й международной конференции по герпесвирусам, Ванкувер. Канада, 1994; 20-й международный конференции по герпесвирусам. Амстердам, Нидерланды, 1995: 6-м международном симпозиуме по нитомегаловирусам, Голландия: 1995: Международной конференции по клеточной и молекулярной биологии, Кейстон, США, 1996:

Публикации. По теме диссертации опубликовано 45 печатных работ, из них - 15 статей, 27 тезисов докладов на Всесоюзных и международных конференциях, 4 авторских свидетельства на изобретения и 1 методические рекомендации.

Собственные исследования Материалы и методы.

Клетки, вирусы и плазмиды. Для селекции мутантных клеток но генам тимидинкиназа (ТК) и гипоксантингуанин-фосфорибозилтрансфераза (ГФРТ) были использованы следующие клеточные линии: гепатокарцинома человека plc/prf/5, глиобластома человека u373mg, линия Т-лимфобластоидных клеток человека сем, клетки почки эмбриона свиньи СПЭВ, клетки трахеи эмбриона коровы TP, клетки почки зеленой мартышки cv-l.

Эксперименты были проведены с использованием следующих вирусов: цитомегаловирус человека (штамм АД-169) и его лелеционные мутанты по гену us 9 - RV- 61, rv-3 5, rv-8 0 (любезно предоставленные Dr. т. Jones): вирус простого гсрпеса-1 (штамм f) и его делеционные мутанты но генам дЕ и gEgl - R-7032 и R-7048 (любезно предоставленные Dr. В. Roizman).

Рекомбинантные ДНК-плазмилы, несущие гены нвзАд и ТК ВПГ-1, были любезно предоставлены ст.н.с. Института Молекулярной Биологии РАИ Еникалоповым Г.П. (pUC19,pAGo) и ст.н.с. Института Вирусологии РАМН Филатовым Ф.П. (pRPAS,pFF). В этих рекомбинантных конструкциях ген HBsAg находился под контролем промотора металлотионина-1 (МТ-1) мыши (рис19) или промотора ltr вируса саркомы Рауса (pRPAs). Ген ТК ВПГ-1 в обеих плазмидах находился под собственным промотором (pFF,pAGo). СПЭВ-ТК" клетки котрансфицировали ДНК-плазмидамн, несущими ген HBsAg и ген ТК ВПГ-1. ТР-ГФРТ" клетки котрансфицировали илазмидами, несущими ген HBsAg и маркерный ген бактериальной КГФРТ pSV-2gpt (Mulligan, et. al . , 1980).

ДНК-плазмида pRc/CMV (invitrogen), несущая ген дв цитомегаловируса, и маркерный ген неомицин-фосфотрансферазы была сконструирована Dr. Qadri И Dr. Bazgoz (Qadri et al., 1992; Basgoz et al.,1992;). Нуклеотидные последовательности, кодирующие gB, были вырезаны из вирусного генома (AD16 9) как 4,5 kb xbal фрагмент и клонированы в xbal сайт pRc/CMV в правильной ориентации. Также были использованы ДНК плазмиды, экспрессирующие мутантные формы gB. Мутанты, имеющие делении между аминокислотами Д170-447, Д411-447, Д5 48-618 были получены вырезанием соответствующих нуклеотидных последовательностей без нарушения рамки считывания (в вырезанные участки были вставлены линкеры, не соответствующие сиквенсу дв). с-концевые мутанты были сконструированы вставкой стоп-кодонов в позициях 760 и 833 аминокислот. Эти конструкции экспрессировали мутантные формы дв с отсутствием 146 (Д76 0-906) и 73 (Д833-906) аминокислот в цитоплазматическом домене соответственно (Qadri et al . , 1992).

Мутагены и селективные агенты. Для повышения частоты возникновения мутации по генам ТК и ГФРТ и для индукции дифференцировки в клетках plc/prf/5 были использованы мутагены:

■тилметацсульфонат (ЭМС), ы-мстпл-ы-питрозомочспикп. лфлогокат В. N-кпил-ы-питро-имтрозогуа и илип. 20-мстнлхолаптрпн. 12-о-тетра-лека нон л-)орбол-18-ане,тат (sigma). IÎ ка честно селективных агентов лля отбора :леток. дефектных но гену ГФР'Г, били использованы токсические аналоги I у pi ni о» 1,т х оснований нуклеиновых кислот - 8-азагуаппн (8-ЛГ). 6-ногуанин (6-'1'Г). 6-меркаптопурнн (6-MII) (Fluka): для отбора ТК-юфектпых клеток - Г)-Пром-2-дсзокснурилни (ПДУ) (sigma).

Для отбора клеточных клопов гепатокарнппомы plc/prf/5 с фнзиаками лиффсрсиниропки были использованы: метотрсксат (М'Г) Sigma), колхишш (КХ). ппнблаг.тин (ВБ). пипкристин {13К). пуромицпн (Ш'К •lerk). а также пымюпгречпг.ленпые аналоги пурнповых и пирнмилиповых )снованиП нуклеиновых кислот.

Методы трансфекнии клеток и селекции трансформантоп. Грапсфекнню клеток осуществляли с помощью кальций-фосфатного (chen and Okayama, 1987) и ДКАН-лекстра НОВОГО (Van Pel et. al.,1985) «столов, a также с помощью электрического пробоя мембран (Neumann at . al ., 1 9 82).

Солекшно трансформантоп но ТК+ фенотипу осуществляли в Г/\Т -реле (Littlef ield. , 1966). а трапсформантон но ГФРТ+ фенотипу - в ПЛТ среде,. содержа той микофсполопую кислоту и ксаптин (Mulligan and Berg. , 198о). При трансфскнпи клеток ДНК. содержащей маркерный ген пеошшип-трансферазм. трансформлпты выделили в среде, содержащей аналог' пеомишша- гепепшпи (g-418).

Клонирование клеток проводили в чашках Пстрн с использованием металлических цилиндров или метолом лимитирующих разведений в 96-луночных или 24-лупочпых панелях.

Анализ экспрессии вирусных белков. Экспрессию HBsAg определили в реакции пассивной гемагглютнпапии (диагностику« Горьковского ПИИ ЭМ) и в реакции пммунофлуорсснсшшп с попользованном моноклинальных антител к HBsAg (Куш Л.Л.. 1986. 1987). И Вс Ад и клеточном экстракте выявляли с помошмо твердофазного пммупоферментного анализа с использованием аитп-нве-сыпоротки человека, любезно предоставленной М.И.Михайловым. Анализ экспрессии H в с A g проведен совместно с Т.И.Калининой. Экспрессию нвсАд » клетках определили в реакции пммупофлуоресцснипи с использованием кроличьей аптн-HBcAg сыворотки (Accurat).

Диализ .экспрессии белков иитомегаловируса и вируса простого гернесн-1 н инфицированных н генетически трансформированных клетках осуществляли в реакции пммунофлуореснспнми с использованием панели моноклинальных антител (Pereira., 1 9 8 5,1988 , 1994,19 9 5).

Радиоиммунопрецинитация и иммуноблотт. Для

ра л моим м у и on pciii шита ним к легки, .жспре.ссируюшие исследуемые, белки. Пыли мечены 35s-mc.thohiiiiom (КЮмкКю/мл) (Amersham) в течение 16ч в с.редс. не. содержащей мешонип. Дли анализа фосфорплпромапни Полков клетки чтит 3 2 Р-аргафосфп/ам (лшегяЬлт) н ктшентри mill 100 мК'ю/мл п среде, не содержащей фосфаты. Солюбилизапню белков клеток

осуществляли в растворе, содержащем 1% np-40, 1% дезоксихолат натрия. 0.1% sds и ингибитор протеаз. в течение 30-40мин. Затем клеточный экстракт центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. и супернатант использовали как радиоактивный антиген.

Параллельно нротеин-А-сефарозу-ФВ (sigma) обрабатывали кроличьей аптимышиной сывороткой (igG) в течение 1ч., затем мышиными моноклональными антителами к исследуемым белкам. Комплекс антител с нротеин-А-сефарозой инкубировали с радиоактивным антигеном на шейкере при +4°С в течение часа. После этого иммунопреципитат промывали 5-6 раз эктрагируюшим буфером. Денатурацию белка осуществляли при кипячении в растворе, содержащем 5% меркаптоэтанола и 2% SDS (Змии). Полипептиды белков анализировали в SDS-полиакриламидном геле. В качестве маркеров молекулярных масс использовали: 200КД - миозин, 97,4КД - фосфорилаза, 69КД - бычий альбумин. 46КД - овальбумин, ЗОкД - ангидраза (Amersham). Визуализацию белков проводили с использованием рентгеновской пленки (Kodak).

При постановке вестерн-блотта белки после электрофореза в полиакриламидном геле переносили па нитроцеллюлозный фильтр и выявляли специфическими антителами с использованием набора ECL (Amersham).

Анализ транспорта белков к плазматической мембране.

Клетки снимали с поверхности флакона диспергирующим раствором (Difco), не содержащим ферментов. Последующие процедуры проводили на льду. Клетки инкубировали со специфическими антителами к исследуемым белкам в разведении 1:200 в течение 1ч„ затем трижды промывали в pbs, содержащем 0,1% бычьего сывороточного альбумина, после чего инкубировали со вторичными антителами, конъюгированными ФИТЦ. и течение 40 мин. После двукратной отмывки в pbs, клетки анализировали в проточном цитофлуориметре (facs scan, usa).

Получение полярных эпителиальных клеток. Для получения полярных клеток были использованы диплоидные эпителиальные клетки сетчатки глаза человека АРПЕ-19 (Dunn., 1 9 9 5) и перевиваемые эпителиальные клетки почки собаки (МДСК). Их выращивали на микропористых мембранах, покрытых ламинииом и вмонтированных в конструкции, состоящие из верхней и нижней ячейки (costar). АРПЕ-19 клетки культивировали в течение 2 месяцев в присутствие дексаметазона (4 мкг/мл) и клеточного экстракта сетчатки коров (10 мкг/мл), Клетки МДСК культивировали 4-8 дней.

В качестве критериев для оценки полярности клеток использовали три параметра. 1) Трапсэпителиальный потенциал полярных клеток измеряли с помощью вольтометра, (Millipor) поместив электроды в верхнюю и нижнюю ячейку конструкции с растущими клетками. 2) Межклеточную проницаемость полярных клеток определяли с помощью радиоактивного ^н-инулина (Amersham). Радиоактивную метку вносили в среду верхней ячейки. Через определённый интервал времени определяли уровень радиоактивности среды из нижней ячейки. Низкий уровень

радиоактивности полярных клеток по сравнению с контролем неполярными клетками (фибробластами) свидетельствовал о наличии развитых плотных и адгезивных контактов между клетками, задерживающих прохождение радиоактивного инулина из перхпей ячейки через межклеточное пространство в нижнюю. 3) Экспрессию белков, характерных для апикальной мембраны (ыа+/к+-зависимая АТФаза), для плотною (zo-l) и адгезивного контакта Ф-кадхерин), анализировали в реакции непрямой иммунофлуоресценции с помощью конфокального микроскопа (mrc- 6 о о).

Анализ вирусной инфекции в полярных эпителиальных клетках. Для анализа вирусной инфекции в полярных эпителиальных клетках их инфицировали питом era лопирусом и вирусом простого i.epneca-1 с апикальной поверхности (верхняя ячейка) или с базолатералыюй поверхности (нижняя ячейка). Экспрессию вирусных белков в полярных эпителиальных клетках изучали с помощью реакции ичмунофлуоресценции с использованием моноклональных антител к ним. Для определения титра вируса инфицированные полярные клетки снимали с поверхности фильтра, разрушали с помошыо ультразвука. ЦМВ титровали на первичной культуре клеток фибробластов человека. ВПГ-1 - на клетках vero.

Распространение вирусной инфекции через латеральные мембраны полярных эпителиальных клеток оценивали по размеру бляшек. Для этого клетки инфицировали с множественностью инфекции 0,1 (UMI3), 0.001 (В11Г-1). После инфекции пируснейтра лизуюшие антитела были добавлены в верхнюю и нижнюю ячейки через 2 дня для ЦМВ и через 2ч для ВПГ-1. Это позволило изучить переход вируса ог инфицированной клетки к соседним неинфицированным, поскольку вирус, почкующийся с апикальной или базолатералыюй поверхности, нейтрализовался антителами. Через определенный интервал времени клетки фиксировали, бляшки анализировали в реакции иммунофлуоресценции с использованием специфических антител к поздним антигенам вирусов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение и характеристика мутантных клонов клеток человека и млекопитающих для генетической трансформации клеток в культуре Мутантные клеточные линии, дефектные по генам тимидинкиназа (ТЮ и гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза. широко используются для исследований по генетической трансформации клеток in vitro. Котрансфекция этих клеток маркерными генами (ТК вируса простого герпеса-1 и ГФРТ человека, мыши, китайского хомячка) и изучаемым геном с последующей селекцией трансформантов в селективной среде позволяет отобрать клеточные клоны, конститутивно экспрессируюшие внедренный ген.

1.1 Селекция мутантных клонов человека и млекопитающих, дефектных по генам ТК и ГФРТ.

Использование маркированных клеточных линий по ТК или ГФРТ для генетической трансформация имеет существенные преимущества перед

немаркированными. Частота и эффективность трансформации маркированных клеточных линий во многих случаях в 10-100 раз выше, чем немаркированных клеток. Уровень и длительность экспрессии исследуемого гена в маркированных клетках также, как правило, относительно высоки и стабильны. Поэтому, одной из наших задач являлось получение мутантных клеток, имеющих маркерные свойства. Основным критерием для выбора клеточных линий для исследований была широкая распространенность этих клеток в вирусологических работах в нашей стране. Первые шаги для реализации этого подхода были начаты нами в начале 80-х годов. Были получены ТК'клеткн почки эмбриона свиньи (СПЭВ) и ГФРТ" клетки трахеи эмбриона коровы (TP), которые с успехом были использованы для трансформации и гибридизации клеток в культуре. Развивая этот подход, мы получили серии мутантных клеток гепатокарциномы человека (plc/prf/s), почки зеленой мартышки (evi), лимфобластомы (СЕМ) и глиобластомы (U3 7 3MG) человека, имеющих дефект по генам TIC и ГФРТ.

Псе эксперименты по селекции мутантов были проведены многошаговым методом. Предварительно была определена частота возникновения спонтанных и индуцированных мутантов, оптимальная посевная концентрация клеток, препятствующая метаболической кооперации и обеспечивающая размножение истинных мутантных клеток. В связи с низкой частотой спонтанных мутаций, а также сильно выраженной метаболической кооперацией клетки plc/prf/5, u373mg и TP обрабатывали мутагенами (Табл. 1). Селекцию мутантов проводили при низкой посевной концентрации клеток (2-3-103/см2) для избежания метаболической кооперации. Частота возникновения спонтанных мутантов в клетках СПЭВ и evi была достаточно высока (Ю'^-Ю"^), что позволило отобрать мутантные клетки без использования мутагенов (Табл. 1).

Для селекции ТК"- клеток был использован 5-БДУ. Отбор ГФРТ"-клеток осуществлялся с использованием 8-азагуанина, 6-меркаптопурина и 6-тиогуанина (Табл. 1). Начальная концентрация селективных агентов была 3-5мкг/мл. Постепенным повышением концентрации селективных агентов были отобраны клональные сублинии клеток, устойчивых к высоким концентрациям токсических аналогов иуриновых и ииримидиновых оснований нуклеиновых кислот. Длительность селекции была 3-6 месяцев. Когда клетки приобретали устойчивость к высоким концентрациям препаратов, их проверяли на стабильность проявления фенотипического признака. Для этого клетки культивировали в течение 1,5-2 месяцев без препаратов и затем вновь подвергали воздействию токсических аналогов. Результаты этих экспериментов показали, что при многошаговой селекции возникают как стабильные, так и нестабильные варианты мутантных клеток, устойчивых к токсическим аналогам. Природа возникновения нестабильных вариантов мутантных клеток неизвестна. Для некоторых клеток было показано, что это может быть связано с приобретением новых эпигенетических признаков во время селекции: изменение проницаемости мембран, снижение активности соответствующих киназ и фосфорилаз (shay., 1 9 85). Для дальнейших исследований были отобраны

клопы, проявляющие стабильную устойчивость к токсическим препаратам (Табл. 1).

О выражении мутантного фенотипа клеток сулили по проявлению функциональной активности ферментов ТК п ГФРТ при культивировании в среде ГАТ. Клетки культивировали в среде ГАТ при низкой коцситрашш в течение 2-3 недель. Массовая гибель и

дегенерация клеток в ГАТ-среде наблюдалась через 5-8 дней, и к третьей неделе культивирования все клетки погибали. Мутантный фенотип также проверяли но включению радиоактивного «'Н-тимидина и ЗЦ-]-Ш1оксантина авторадиографическим методом. Включение радиоактивных: изотопов в мутантные клетки не было обнаружено. Эти результаты свидетельствуют об отсутствии активности ферментов TIC и ГФРТ в мугантных клетках.

Реверсионпнй анализ мутантных клеток проводили через каждые 2030 пассажей (40-60 генерацией). Для этого клетки предварительно обрабатывали мутагеном (ЭМС) и через 2-3 пассажа культивировали в ГАТ среде. Количество клеток для ревсрсионного анализа было не меньше 10?. Ревертантн были обнаружены d клетках TP, plc/prf/5 и cvl (1-3-10"7) (Табл. 1) В остальных мутантах при анализе 10? клеток ревертанты не были обнаружены, что свидетельствует о частоте реверсии меньшей, чем 10"^ (Табл. 1). Для предотвращения появления репертантов через каждые 20-30 пассажей клетки культивировали в течение 2-3 пассажей в среде, содержащей соответствующие аналоги. Таким образом, были получены серим мутантных клонов клеток человека и млекопитающих, дефектных по генам ТК и ГФРТ (Табл. 1).

1.2.Оптимизация условий трапсфекции и анализ эффективности и частоты трансформации мутантных клонов маркерными генами

Известно, что степень поглощения клетками трансфицируемых ДНК-плазчид. а также эффективность и частота трансформации эукариотичсских клеток сильно различаются. Для оптимизации этих чараметров в качестве маркерных генов были использованы ТК ВПГ-1 и шштингуанинфосфорибозилтрансфсраза (КГФРТ), клонированные в эукариотическнх векторах, pFF и pSV-2gpt соответственно. Трансфекцию слеток осуществляли кальций-фосфатным, ДЕАЕ-дскстра новым метода Mit, а гакже электрическим пробоем клеточных мембран. В качестве ДНК-юсителя использовали очищенную ДНК лосося. Селекцию ТК+-грансформантоп осуществляли в среде ГАТ, а КГФРТ+-трансформаптов - в :рсде ГАТ, содержащей микофеноловую кислоту и ксантин. Эффективность и частоту трансформации определяли по числу клонов, шросших в селективной среде через 14-21 день после трансфекции.

Эксперименты показали, что оптимальным методом трансфекции для слеток СПЭВ-ТК', cv-TK" и U373MG-TK" был кальций-фосфатный метод. Эффективность трансформации на 1 мкг ДНК-плазмид - 1-4-10-5. частота трансформации - l-8.5-10"J (Табл. 2). Для ТК" и ГФРТ'-клеток клонов plc/prf/5 и ТК"-клеток клоноп СЕМ наиболее высокий выход

Таблица 1. Мутантные клетки человека и млекопитающих, дефектные по генам ТК и ГФРГ.

Наимеиовен Мутагены Селективные Частоты Фенотипичес Частота не агенты возникнове- - реверсии

клеток ния кий признак

мутации

РЬС/РЙР/5 -А7-4-ТК" Не испол. 5-БДУ 1-3 -10 -6 Дефект по ТК 1-2-10-7

РЬС/Р1«3/5 -А7-14- ТК" Не испол .. _ .. .. _ И Ч _ 11 1-2-10-7

РЬС/РКР/5 -А7-1-3- ГФРТ- ЭМС 8-АГ 5-6-10' -5 Дефект по ГФРТ 2-3-10"7

РЬС/РНР/5 -А7-13-2- ГФРТ НМНГ » _ « . _ « 1-2• 10~7

и373МС-6- тк~ ЭМС 5-БДУ 7-8-10" -5 Дефект по ТК 0,9-1,5" 10-7

СЕМ-4-ТК~ Не испол. " _ " не иссл. » _ " не иссл.

СПЭВ-Д5-тк- » _ . и _ и 5-6-10" -4 1-2-10"8

СПЭВ-А4- тк- « _ » » _ » 5-6-10" -4 3-5-10-8

СМ1-17-ТК~ » _ .. . - « 1-2-10' -5 . _ « 3-4-10-"7

тр-аг-9-гфгт БДУ 8-АГ 5-6-10' -6 Дефект по ГФРТ 4-6-10-7

тр-аг-13- гфрт- ЭДУ .. - И 5-6-10- -6 » _ .. 1-3-10-7

Указанные в таблице мутантные клоны депонировании (за исключением мутантах клеток глиобластомы) в коллекциях клето'шых культур Российский АН (Институт Цитологии РАН), РАСХНИЛ (ПИИ Ветеринарии) и Института вирусологии ДИИвановскога РАМН.

трансформантон обеспечивал ДЕАЕ-декстрпновый метод (Табл. 2). Ьыло установлено, что электрический пробой мембран клеток гепатокарниномы человека PLC/PRF/5 и клеток почки эмбриона свиньи СПЭВ позволяет увеличить частоту трансформации в 100 раз (Табл. 2).

2.Анализ экспрессии нваАд в генетически

трансформированных клетках млекопитающих.

Продукт гена s вируса гепатита в - HBsAg является поверхностным мембранным белком вируса. участвующим в адсорбции вируса на клеточной мембране и проникновении нуклеокапсида в цитоплазму (Gerlich et al, 199 3). HBsAg является также диагностическим маркером, присутствующим в кропи как составная часть вируса или как вирусный антиген, имеющий сферическую или филаментозиуго форму. Несмотря на интенсивные исследования HBsAg, еще многие вопросы, связанные со структурой и функцией этого антигена остаются невыясненными. Это. в первую очередь, связано с трудностью культивирования вируса гепатита В. т.к. культуры клеток, поддерживающие размножение вируса, пока отсутствуют. Поэтому, генетически трансформированные клеточные линии, эксиресспрующие HBsAg, могут быть удобной модельной системой для изучения этого белка.

2.1.Селекция трансформированных клеток, экспрессирующих поверхностный антиген вируса гепатита В.

Для получения генетически трансформированых клеток, экснрессирущих HBsAg, были использованы мутантные клеточные линии СПЭВ-ТК- и ТР-ГФРТ. СПЭВ-ТК" клетки котрансфицировали ДНК-плазмидой, несушей ген HBsAg и ген TIC ППГ-1. ТР-ГФРТ" клетки котрансфицировали ДНК, несущей ген HBsAg и маркерный ген бактериальной КТФРТ (psv-2gpt). Селекцию трансформантов по ТК+ фенотипу осуществляли в ГАТ среде, а трансформантов по ГФРТ+ фенотипу - и ГАТ среде, содержащей микофеноловую кислоту и ксантин. Экспрессию HBsAg определяли в реакции пассивной гемагглютинации и реакции иммуиофлуоресценции с использованием моноклональных антител к HBsAg (Куш A.A., 1986, 1987).

Через 2-3 недели после грансфекции в соответствующей селективной среде были обнаружены клеточные клоны с ТК+ и ГФРТ+ фенотипами. Они были изолированы и проверены на экспрессию HBsAg. Продукция HBsAg клетками различных клонов варьировала от 0.4 нг до 1.28 мкг/Ю^кл. в сутки (титр в РИГА 1:4-1:528). С помошыо реакции непрямой иммукофлуоресценции была показана цитоплазматическая локализация HBsAg.

2.2. Сравнительный анализ экспрессии HBsAg в различных клетках. Влияние промоторов ltr ВСР и МТ-1 мыши на

ЭКСПреССИЮ HBsAg.

Был проведен анализ экспрессии HBsAg в клетках СПЭВ-ТК' и ТР-ГФРТ", полученных путем генетической трансформации.

Таблица 2. Эффективность и частота трансформации мутантных клеток по генам ТК и ГФРТ.

Наименование Методы Эффективность Частота клеток трансфекции трансформации трансформации _(на 1 мкг ДНК) ' (на 10 6' клеток)

рьс/ркг/5-а7- Кальций- 5-6 • ю 0,5-0,6-ю-б

4 -тк_ фосфатный

ДЕЛЕ-

декстрановый

4-5 • 10"®

0,4-0,5-Ю"6

Электрический пробой

3-4■10"

3-4-10"6

РЬС/РИР/5-А7- Кальный-

1-3-ГФРГ

фосфатный ДЕЛЕ-

декстрашвый

4-5-10-6 4,5-5-10-6

35-40-10"6 35-40-10-6

Электрический 70-80-Ю-6 70-85-10-6 пробой

СЛЭВ-ДЗ-ТК"

Кальцый-фосфатный

ДЕАЕ-

дексграиовый

Электрический пробой

10-40-10'6 5-6-10-6

70-85-10-6

10-20-10"6

20-30-10"6 200-300-10"6

ТК- и ГФРТ- дефектные клетки трансфицировали генами ТК ВПГ-1 (ркг) и КГФРТ Е.соИ соответственно. Эффективность трансформации - число трансформантов на 1 мкг/мл плазмидной ДНК. Частота трансформации - число образовавшихся трансформантов на тесло использованных в опыте клеток.

Трансформированные, клопы СНЭК с ТК+ фенотипом размножались быстро. и некоторые! im них имели тенденцию расти в суспензии. Били проанализированы 88 клопов, полученных и результате трансфекшш клеток СИЗП-ТК" ДНК. содержа шеи ген нвяАд. находящийся.' иол промотором j^jTTj мыши. По результатам РИГА 24, ,'.'клона экспрссеировллн нвяЛд. .')тп данные были подтверждены результатами лот-шбрилшаини ДНК клеток-трансформантоп с радипактмппмм'и ДПК-зоплами (Рис. I). Тигры HBsAg в клонах на уровне 4-0' пассажа распределялись следующим образом: м l.'i клонах тигр был 1:8. » 8. -N28. в Ü - \-b\2. Три наиболее сильных продуцента были использованы дли дальнейшего анализа экспрессии HBsAg. Анализ экспрессии HBsAg в этих клопах и селективных условиях в течение .4.5-4 месянеп показал, что продукции белка постепенно снижалась к 6-14 пассажу до l:6<i. к 1Г>-27 пассажу до 1:1!2. к 27-41 пассажу до 1:8 (Рис. 2). IIa .поздних пассажах (40-45). когда гитры HBsAg были низкими (Ü4., 1;8),.'.клетки обрабатывали глюкокоргикоилпым гормоном дексамегазоном- (5 м к г/мл). Гормональна я обработка клеток в 2-.'i раза усиливала экспрессию HBsAg в течение нескольких пассажей. Можно предположить, что этот эффект бил обусловлен действием гормона на промотор LTR HCl'. т.к. изведтио. что промоторы ltr многих рогропирусоп являются индуиибсльными и пол воздействием различных гормонов усиливают транскрипцию гена (Engel L,W.,et al, 1983).

Рис I. Анализ ДНК к.четк-трппсформппгов. .1кс11|га;иру1оших нвзАд. Клеточную ДНК (10^ клегок) экстрагировали из т готически тр;н!сформи|юшшных клеток СПЭ15. трапефшшровапнмх геном нв-чАд (рИРАЭ) и использовали для дот-гибрилизанип с ДНК зондом рИРАг меченным32р. I! качестве положительного контроля использовали клетки генагомы рьс/рке/5. эксн])ессиру10-пше нвзАд СМ) , отрицательным кошролсм служили петрансфишфован-»1,10 клетки ООН (41). Дот N 42 -

к0н1|к)ль дли зонда рЯРАБ

1!о второй серии экспериментов были получены 150 клонов трппсформпнтоп с помощью кот-pa исфскиии клеток СПЭВ-ТК-рекомбимаппнш ДНК. содержащей ген HBsAg, находящийся иод промотором МТ-1 мыши, и ДПК-плазмидой. несущей маркерный ген ТК

1 1

1 Vi н II 1У

ц о

И W

5 6 • •

41 41

pRPAS

11 «

PLC/PRF/5

слэв

♦

ВПГ-1. Результаты РИГА показали, что 34 клона из 150 экснрессировали HBsAg.Тигр антигена и разных клонах варьировал от 1:8 до 1:512, 4 клона оказались высокопродуктивными (титр 1:256. 1:512). Изучение экспрессии HBsAg в течение 2,5 месяцев непрерывного культивирования показало, что стабильную экспрессию сохранили 11 из 34 клонов. Была изучена возможность усиления экспрессии HBsAg в клетках-трансформантах путем обработки их солями тяжелых металлов. Клетки были обработаны ионами ниика (10 мМ) и кадмия (1 мМ) в течение 6 и 10 часов соответственно, через 24 ч анализировали продукцию HBsAg. Результаты экспериментов показали, что ионы тяжелых металлов усиливают продукцию HBsAg в 3-4 раза.

Была изучена экспрессия HBsAg в генетически трансформированных клетках трахеи эмбриона коровы. ТР-ГФРТ" клетки котрансфицировали рекомбинангной ДНК, содержащей ген HBsAg, находящийся под промотором ltr ВСР, МТ-1 мыши, и ДНК-плазмидой, несущей маркерный ген бактериальной КГФРТ. Получены 2 серии клонов трансформантов, экспрессирующих HBsAg: 43 клона, экспрессирующих HBsAg под промотором ltr RCP. и 36 клонов, экспрессирующих HBsAg под промотором МТ-1. Все трансформанты независимо от промоторов оказались слабопродуцирующими (титр 1:4, 1:8) и медленнорастущими, однако, обработка клеток глюкокортикоидными гормонами (для промотора ltr ВСР) и солями тяжелых металлов (для промотора МТ-1 мыши) усиливала экспрессию HBsAg в 2-3 раза (титр 1:32, 1:64).

Рис. 2 Анализ эксщйссии нвзАд в наиболее стабильных генетически трансформированных клетках СПЭВ, экспрессирующих нвэАд при непрерывном культивиропании. Тигр нвэАд определяли в культдалыгой жидкости с помощью РПГА.

- ген нвэАд под контролем промотора ьтя ВСР

- ген нвэАд под контролем промотора МТ-1 мыши.

Таким образом, были получены генетически трансформированные клеточные лишит, окг.прессирушне поверхностный антиген пмруса гепатита 1]. Результаты экспериментов показали, что клетки почки эмбриона свиньи обеспечивают высокую и стабильную продукцию HBsAg. Эти трансформированные клеточные линии могут служить модельной системой дли изучении HBsAg и быть полезными п бнотехпологичеекпх исследованиях.

Известно что. вирус гепатита li сурка эффективно размножается н сурках marmoto топах, высокий титр поверхностного антигена вируса обнаруживается н кропи инфицированных животных, что свидетельствует о возможности создания модельных клеточных систем сурка ллп изучения экспрессии белков ВГВ человека. С этой нелыо были приготовлены первичные клетки печени и мочки сурка. Первичные печеночные клетки культивировали до 1.5 мое. Попытки получения диплоидных или пммортальпых линий гепатоцитоп с помощью различных канцерогенов (метилхолаптреп. афлотокс.пп I!) и онкогенов (c-myc, c-ras,El-A и Е1 - В аденовируса) не увенчались успехом. Пыли получены иммортальные клетки почки сурка путем трансформации онкогенами аденовируса Е1-А п Е1-В. Эти клетки были использованы для изучении экспрессии HBsAg. находящегося нод контролем промоторов LTR lid' и МТ-1 мыши. Клетки трансфинировалн ДНК плазмиламп. содержащими ген HBsAg. Через 48 ч. клеточный экстракт и культуральная жидкость были исследованы на экспрессию HBsAg. Результаты РИГА показали. что HBsAg обнаруживается в культура льной жидкости и в клеточном экстракте первичных гепатоцитоп п одинаковом тигре - 1:16. Анализ экспрессии HBsAg н клетках почки сурка показал, что антиген обнаруживается только и клеточном экстракте в низком титре - 1:4, 1:8. Эти результаты свидетельствуют о том, что значительное количество HBsAg секрелируется только в гепатоцитах сурка. Возможно, это объясняется различной степенью проиессинга белка в гепатоцитах и клетках почки. Иммупофлуорсснсптпый анализ клеток, окснрсссируюшнх HBsAg, показал локализацию белка в цитоплазме гепатоцитоп и клеток почки, что характерно для оболочечиых белков вирусов. Вышеизложенное

свидетельствует о пригодности клеток печени и почки сурка для изучения экспрессии оболочечного белка вируса гепатита В человека.

З.Роль клеточной дифференциропки в экспрессии генов вируса гепатита В.

Вирус гепатита В является гепатотропннм вирусом. Однако, несмотря па то, что ДИК ВГВ была найдена в пепечепочных клетках пациентов и трансгспных животных, репликация, созревание вируса и патологический процесс, вызываемый им. осуществляются п клетках печени (shaul. , 1 994 ) . I) результате трансфскшш ДНК 13ГВ п клетки гепатокарниномы установлено, что репликация вирусной ДНК происходит только и пнеоколифференпировапных гепатоцитах (sells et. al., 19 88 ). Анализ вирусных антигенов п опухолевой ткани, полученной от HBsАд-позитивпого ипипепта, показал, что высокая экспрессия HBsAg и нвсАд обнаруживается только в нормальной части ткани, которая окружает опухолевую ткань (Raimondo et,al., 19 87 ,). Результаты

этих исследований свидетельствуют о том, что дифференцировка гепатоцитов играет ключевую роль в развитии инфекции. В связи с этим одной из наших задач являлось создание модельной клеточной системы гепатоцитов, проявляющих признаки цитодифференцировки и пригодной для изучения экспрессии генов ВГВ человека.

3.1. Селекция клеточных клонов гепатокарциномы человека, проявляющих различную степень дифференцировки.

Большинство клеточных линий. как опухолевых, так и экспериментально трансформированных in vitro, сохраняют способность к дифференцировке. Процесс дифференцировки клегок может быть индуцирован самыми различными факторами и воздействиями. Индукторами являются противоопухолевые препараты, антиметаболиты, цитостатики, опухолевые промоторы, ДМСО, ретиновая кислота, простогландины. интерферон, гормоны, условия культивирования, антиметаболиты (Ставровская А.А., 1990; Schwariz . , 1992 , )

В наших исследованиях была использована опухолевая клеточная линия гепатокарциномы человека plc/prf/5 (Alexander et al., 1976) .Эта клеточная линия содержит несколько копий интегрированных ДНК ВГВ и экспрессирует HBsAg. Были изучены свойства клеток plc/prf/5, находящихся в нашем распоряжении. Было установлено, что клеточная популяция состоит из гепатоцитов. 60-80% которых экспрессируют альфа-фета протеин (каннероэмбриональный антиген). Экспрессию человеческого альбумина обнаружить не удалось. При введении бестимусным мышам 5-Ю^кл. опухоль образуется через 1421 день. Вышеуказанные характеристики свидетельствуют о низком уровне дифференцировки клеток.

HBsAg в культуральной жидкости plc/prf/5 обнаружить не удалось, лишь при гормональной индукции или 8-10 кратном концентрировании культуральной жидкости удавалось обнаружить антиген в низкой концентрации (титр 1:2, 1:4). Путем клонирования и реклонирования клеток не удалось выделить клоны, проявляющие признаки дифференцировки или экспрессирующие HBsAg в высоких концентрациях.

Для селекции клонов гепатомы с признаками дифференцировки был использован методологический подход, основанный на имевшихся данных о том, что возникновение клонов, устойчивых к противоопухолевым препаратам. часто сопровождается приобретением признаков дифференцировки ( Игнатова Т.Н., 1986, Ставровская А,А., 1990, Kane,et al.,1990 ; Schwar t z . , et. al. 1992). С этой целью мы применяли ряд цитостатиков и антиметаболитов (колхицин, винбластин, винкристин, пуроиицип, 6-тиогуанин, 8-азагуанин, 6-меркаптопурин). Для индукции возникиовения клеток, устойчивых к токсическим препаратам, использовали мутагены и опухолевые промоторы N-метил-ы-нитрозомечевина. ы-метил-ы-нитрозо-гуанидин, 20-метилхолантрин, афлотоксин В, 12-0-тетрадеканоил-форбол-13-ацетат. Эксперименты проводили с клетками одного из клонов линии plc/prf/5, который был назван plc/prf/5-a7. Селекцию устойчивых вариантов клеток

осуществляли многошаговым методом, постепенно повышая концентрацию селективных агентов. После каждого шага селекции устойчивые клоны исследовали на экспрессию маркерных белкоп - альфа-фета протеина (ЛФП) и человеческого альбумина для определения степени дифферепциронки клеток. Интервалы времени между последовательными шагами отбора были от трех недель до 1,5-2 месяцев. Эти периоды мы условно обозначили как этапы селекции.

В процессе селекции было обнаружено, что, начиная со второго этапа, некоторые устойчивые клоны снижают или теряют экспрессию ЛФП и начинают синтезировать человеческий альбумин, т.е. приобретают признак» дифференцировки. Такие клоны очень медленно размножались, и в некоторых из них на 6 этапе селекции наблюдалась остановка роста и дегенерация клеток (фенотип терминальной дифференцировки). Клетки таких культур в течение 1-1,5 месяцев не размножались, но сохраняли жизнеспособность. Возникновение этого периода (период покоя) не было связано с токсическим действием селективных агентов, т.к. этот период наступал также при культивировании клеток (с 5 этапа) без селективных агентов. На 7 этапе селекции на фоне перазмножаютихся клеток появлялись активно растущие клоны. Эти клоны экспрессировали АФП и прекращали синтез человеческого альбумина, что свидетельствовало о дедифференшфовке клеток. Частота возникновения клонов с фенотипом дедифференнировки была 1-5-10"6.

Таким образом, селекция высокодифферешшрованных клеток гепатомы состояла из 6 этапов; 1-3 этапы - селекция клонов, потенциально имеющих признаки дифференцировки (снижение экспрессии АФП): 4 этап -селекция клеток, имеющих признаки дифференцировки (остановка экспрессии АФП, начало синтеза альбумина); 5 этан предтермипальная дифференциропка (замедление размножения клеток, усиление экспрессии альбумина): 6 этап - терминальная дифференцировка (остановка размножения клеток, увеличение размера клеток): 7 этап -дедифферернцпровка (появление активно растущих клонов, возобновление экспрессии АФП, исчезновение синтеза альбумина).

Известно, что возникновение клеток, устойчивых к противоопухолевым (лекарственным) препаратам, сопровождается амплификацией генов mdr (multi drug resistance), которые кодируют белок с молекулярной массой 170 КД (капе, et .al. , 1990). Р170 выполняет роль мембранного насоса, осуществляющего откачивание токсических веществ из клеток (Endicott, and Ling ., 1989). Результаты анализа экспрессии Р-170 в высокодифференцированных клонах, устойчивых к пуромицину (клопы 92 и 95). и в исходном клоне (А7) показали высокий уровень продукции белка н клетках, тогда как в исходном клоне продукция не была установлена (Рис. 3). Начало экспрессии Р-170 коррелировало с прекращением синтеза АФП и возобновлением синтеза альбумина, т.е. с приобретением клетками признаков дифференцировки. Установлено, что экспрессия Р-170 является физиологическом процессом в многих тканях организма, включая печень, почки, поджелудочную железу надпочечники, прямую кишку (sigawara et al., 1988;) Высокий уровень экспрессии Р-170 отмечен' в зрелых

(высокодифференцированных) гспатоцитах d организме, которые участвуют в процессе детоксикации организма от вредных веществ (Arias et al ., 19 9 0).

Из 200 клонов, устойчивых к токсическим препаратам, в 60 были обнаружены признаки дифференцировки. Не была установлена корреляция между возникновением клонов, имеющих фенотип дифференнировки, и селективным агентом, однако, большинство клонов с признаками дифференцировки были получены при селекции клеток н присутствие цитостатиков. Анализ клеток на туморагенность на бестмусных мышах показал отсутствие способности к образованию опухолей у клеток с признаками дифференцировки (эксперименты проведены совместно с проф. Ревазовой Ё.С). Клетки, проявляющие дифференцированный фенотип, также не образовывали колонии в полужидком агаре.

Таким образом, полученные нами данные об экспрессии Р-170 в клетках ряда клонов, подтверждают заключение о проявлении ими ■свойств нысокодифференцированных гепатоцитов. Клоны, не проявлявшие признаки дифференцировки. особо не отличались от plc/prf/5 или исходного клона А7 - хорошо размножались, при введении бсстимусиыи мышам образовывали опухоли, экспрессиропали АФП, не синтезировали альбумин и Р-170.

3.2. Особенности ЭКСПреССИИ НВвАд И НВсАд в высокодифференцированных и низкодифференцированных клонах гепатокарциномы.

Анализ экспрессии HBsAg в высокодифференцированных и в низкодифференцированных клетках клонов plc/prf/5 показал, что практически во всех клонах с признаками дифференцировки было отмечено усиление продукции этого белка (Табл. 3). На уровне 2-3 этана селекции в большинстве исследованных клонов экспрессия этого антигена увеличивалась в 100-200 раз в сравнении с исходным клоном А7 и в 400-500 раз - в сравнении с исходной культурой plc/prf/5. Количество клеток, экспрессируюших HBsAg, составляло 50-80%. Локализация HBsAg наблюдалась в цитоплазме и на клеточной мембране (Рис. 3). Усиление экспрессии HBsAg строго коррелировало с уменьшением экспрессии АФГ1 и появлением синтеза альбумина. На 5 этапе селекции (предтерминальный этап) отмечался самый высокий уровень экспрессии HBsAg (титр 1:512. 1:2048). Однако, на 6 этапе селекции, когда клетки приобретали признаки терминальной дифференцировки (остановка роста), экспрессия HBsAg уменьшалась (титр 1:8, 1:16) (Рис. 4). Экспрессия HBsAg в дедифференцированных клонах не была обнаружена.

Известно, что ген нуклеокансидного антигена ВГВ в клетках plc/prf/5 находится в репрессированном состояния (Miller and Robinson., 1986; Yoakim et al., 1 98 8). Анализ экспрессии HBcAg в клетках, устойчивых к противоопухолевым препаратам, показал, что происходит активация гена сердцевинного белка ВГВ в клетках, имеющих признаки дифференцировки. В 14 из 60 клонов с дифференцированным фенотипом и усиленной экспрессией HBsAg был обнаружен НВсАд (Табл. 3). Результаты иммунофлуоресцентного анализа показали, что

и г

Oí

а. «

J О.

К Г5

са о а. X

Ъа

M Ж

X S

3 Я

п &

< г»

О)

Я gj

ïs£

ЯГ «

Г Píi о

е-а » е-е

J-Í Sä Зх

MtC •< iaa Í»

гх л и

S 5. S " *

Sa«

Sä Зх

Bï-ïssâ

и я s S

Ч я « " йсэ ïli""— S " m »

tO!; !

» î 5 « s

1 • i 5

S g ; à?

1С 4 j

3 c

C.Ö

** Ü S1" Б s

.-s

I 1Л Cl to rt to Ю tn c»

lOOinQOOOOO -f-ifimn-

о о о о о о о

Т7Т7|ЛТ

ooomooi/joo «— Т т Cl с5 -г сэ

II I I CI С< Cl Cl С» Cl

♦•«(OPÎTC'I-.--

7? T, Т. i « 7¡ « ^ ^ ~ —

111 ci Ci I J> I I 4 4 CI

CI CI CI — CI CO — CO 00 n

tO CO CI О OOOOOCIOCOO lO ~• Ю * П CO lO CO К) Ю *T КЗ LO C7>

I I I I I ! Il II I II I I I

OO'fOOCQMOOQOl'lilh-Q — — íW¡3t^Tclc( — й

|[ll|| [ooooooooo in — rt ь- — o" o* —' n'

О О О n in n •— ю — rj — c>

I I I ■ -

11 •as

I О О О О О О О I I Cl О

CI —

SQQQqqoooauiiBnwnci сЗоосооооо — —CI — — — с» ---

JÀJ.UJ,

to <о t-- 1— ,

U-. O-t-jl— -í > „ _____.

g: • й'х^жг^а-а.

. ^ w п-'-у^хиишСС и ю-—r¡> i i ~

рН^З -г I г) — с» ci о ci >q с< m

Q,«<-tr — — —-reí—.ю — t^t»<oo>o

Q-

1'ис_ 3. ОкСЩХХСИП НВБАд И НВсАд I! IТ0Л1 )ффСрС1 иII1р01мш] 1 ых (исходным клоп-А7) и |)1.1соколмффс|)сши1ро1юшшх (пуромишш-усгойчивии клоп-92) клетках гешпшаршшомы. Клетки выращивали на покроппых стеклах, фиксировали 4% формалином с добавлением и 0,1% Тритона Х-ЮО. Экспрессию нвэАд (мышиные МАК). НВсАд (кроличьи 1ЖА), альфа-фета протеина (мышиные МКА) и с1,1во[х)точиого альбумина (к|Х>лпчы1 ПКА) определяли с помошыо реакции непрямой пммуиофлуортнешши. Для двойного иммунсх|)лу0рссис11Т110Г0 анализа клетки шцшшелпо инкубировали с антителами к альфа-фета протеину и смио|х)точиому ал1,бумш1.у пли - к НВгАд и НВсАд. Вторичные аишмышипые и ¡штпк|юл11ЧМ1 антитела былы копыогированы ФИ'П [ и Техас красным соотвотсгвсппо. Препараты анализировали с помошыо конфокального микроскопа с использованием криптонового и аргонового лазероп. ^недифференцированный исходный клоп А7. 2, 3 и 4 - клетки нысоколи(|х]юрсш(иропаиного клона 92 1а и 2а ■ альфа-фота нротепп: 16 и 26- сывороточный альбумин : За и 4а -НВэАд: .'36 И 4Г) - НВсАд.

НВсАд локализуется п ядре и на ядерной мембране клеток (1'ис. 3). Начало экспрессии НВсАд отмечалось нл '1-5 этапе селекции (5-10% клеток), но максимальный уропепь экспрессии был зарегпстрпропап на б этапе селекиип (остановка роста), когла клетки приобретали признаки терминал!,пой дифферсиниропки (1'ис. 4). До 40-60 % клеток п нонулпннн экспрессиронали нвсАд, титр антигена п клеточном экстракте (10^ клеток) достигал 1:100. 1:200. Интересно отмстить, что на 6 этапе селекции, когда клетки имели признаки терминальной днфферепннровкн. экспрессии нВэАд резко снижалась, а синтез НВсАд достигал максимального урони я (Рис. 4).

Рис. 4. Изменение экецх-шш HBsAg и НВсАд н процессе селекции клеток с. признаками лиффе|1епппропк11. Лбсниссп - эгани селекции: Ордината-количество клеток, .жщх'ссиругоишх белки вируса miaima It HBsAg ( О ) и HBcAg ( О ), %.

_колхинин-усгоГгп шый клон N17

---колхппнн-устоНчпвый клоп N19

. . . .шшкрнсгин-усгончппыП КЛОП N70

I! литературе имеется много свидетельств того, что экспрессии генов ВГВ связана с лифферешшровкон генатопитоп. Установлено. что в пысоколнфферснпиропапных гепатонигах имеется ряд белков, участвующих в регуляции экспрессии вирусных генов. 13 высокодиффсрснпированных линиях гепатомы илептпфиниропап белок (белок Л), связывающийся со вторым эпхапсером ПГП и активирующий транскрипцию генов ВГВ. Найден другой белок (белок f) в ннзкодиффереппироваиных клетках гепатомы и в клетках испечепочпого происхождеипн. который тоже взаимодействует со иторым эпхапсером ВГВ и блокирует работу вирусных генов (Yun and Ting ., 1991, 1992 ) .Другими исследователями из ядер высокодифферениироиаиных клеток гепатомы выделены факторы (hnfI, HNF3). которые связываются с промоторами HBsAg и нвсАд и обеспечивают экспрессию этих генов. (Raneu et al.,1991, 1995).

Результаты наших исследований демонстрируют, что усиление экспрессии HBSAg и активация НВсАд зависит от лнффсрспнпровкп

клеток гематомы. Степепь дифферешшровки также играет важную роль в регуляции экспрессии этих геноп. Эта регуляция, возможно, связана с различными клеточными факторами, взаимодействующими с регуляторньши элементами (промоторы, энханссры) генов поверхностного и пуклеокапсидного антигенов ВГ'Б. Вероятно, синтез клеточных факторов, необходимых для регуляции экспрессии генов ВГВ, зависит от стадии дифференцировки гепатоцитов.

Результаты цитоморфологического анализа показали, что п клетках с признаками дифферешшровки наблюдается заметное повышение доли многоядерных клеток, т.е. симпластов. Отмечена прямая зависимость появления симпластов и усиления экспрессии нвэАд. Симпластообразование является одним из показателей фузогенной активности мембранных гликопротеинов вирусов. Считают, что НВэАд обладает фузогенной активностью, которая обеспечивает проникновение вируса в клетку. (вегИсЬ еь а1.,1993). Возможно, симпластообразование в клетках с признаками дифференцировки и высоким уровенем экспрессии нвэАд связано с фузогеной активностью этого белка.

4.Структурно-функциональный анализ мембранных белков цитомегаловируса в генетически трансформированных клетках

Цитомегаловирус человека принадлежит к семейству герпес-вирусов (Негрезу1г1с1ае), в организме может находиться в латентной форме. Активация вируса часто происходит при трансплантации органов и при иммуиодефицитах различной природы, включая ВИЧ-инфекцию.

Мембранные белки ЦМВ являются обязательным компонентом вируса и играют важнейшую роль в жизненном цикле вируса: распознают клеточные рецепторы и, связываясь с ними, обеспечивают адсорбцию вируса: вызывают слияние оболочки вируса с клеточной мембраной, инициируя инфекцию; участвуют в высвобождении (почкование) зрелых вирусов из инфицированных клеток. В инфекционном процессе оболочечные гликопротеины являются главной мишенью для реакции иммунной системы, так как они расположены на наружной поверхности вирусной частицы. Поэтому именно они являются потенциальными белками для создания противовирусных вакиин. В связи с этим нами были изучены некоторые структурно-функциональные свойства одного из оболочечных белкой ЦМВ, гликопротеина В (дв) в генетически трансформированных клетках.

4.1 Роль гликопротеина В цитомегаловируса человека в адсорбции и проникновении вируса в клетки хозяина.

Гликопротеин В ЦМВ находится на оболочке вириона и взаимодействует с плазматической мембраной клеток хозяина в начальной стадии инфекции ( сгетег., 1985; вгЛьь. , 1 990). Гликопротеин В (906 аминокислот) принадлежит к гамма-белкам (генам) вируса и синтезируется на поздней стадии жизненного цикла вируса.

С использованием вируснейтрализующих (комплемент-связывающих и коплемеит-несвязывающих) моноклональных антител к дБ было

идентифицировано 5 антигенных доменов. На N-конне белка аминокислоты от 27 ло 84 образуют конформационно-незаписимнй домен (ds1v). Три конфорчационно-записимых домена расположены между аминокислотами: 411-447 (di). 447-476 (D2a), 476-618 (D2b). с-концевые знитопы, расположенные между 719-906 аминокислотами, образуют линейный внутриклеточный домен (DC2). (Pereira., 1991; Meyer.,1992; Bazgoz., 1992).

Для определения функции дв, обеспечивающей адсорбцию вируса на поверхности клеток, смесь моноклоналных антител к различным доменам была добавлена к радиоактивно-меченному (3 ^э-метионин) вирусу. Вирус с антителами инкубировали в течение 2 ч. при З7'с. Затем смесь радиоактивно-меченого вируса с антителами была добавлена к клеткам глиобласточы для инкубации при 4°с в течение 2 ч. Инкубация при 4°с обеспечивает адсорбцию вируса, но блокирует его проникновение в клетки, т.к. слияние вирусной и клеточной мембран температурозависимый процесс. После инкубации клетки промывали трижды средой без сыворотки, лизировали фосфатно-солевым буфером (рН7,2). содержащим 1% sds и 1% np-40, и измеряли радиоактивность с помощью сцинтилляиионного счетчика. Результаты этих экспериментов показали, что моноклональные антитела к дв не блокируют адсорбцию вируса па клетках, т.е. дв не участвует в процессе адсорбции. Возможно, адсорбция обеспечивается с помощью других оболочечных гликопротеинов вируса.

Аналогичный эксперимент был проведен для изучения роли дв в проникновении вируса в клетку. Для этого использовали не радиоактивный вирус. Также смесь вируса с антителами инкубировали при 4°с в течение 2 ч., и затем клетки инфицировали вирусом, связанным с антителами. Инкубацию проводили при 37°с в течение 1 ч., после чего клетки промывали и культивировали в течение следующих 24 ч. Затем их фиксировали и использовали для реакции непрямой пммунофлуоресценции. Инфицированные клетки анализировали с помощью моноклональных антител к продранному белку р 72 и подсчетом их определяли количество вирусных частиц, проникших в клетку. Сравнение количества вируса в экспериментальном и контрольном варианте показало, что моноклональные антитела к дв блокируют проникновение вируса в клетку, т.е. слияние вирусной и клеточной мембран.

О фузогенной активности оболочечных белков вирусов в инфицированных клетках можно судить ло образованию симпластов. Нами было установлено, что на 4-5 сутки после инфицирования ЦМВ в клетках глиобластомы появляются многоядерные клетки с обшей цитоплазмой (до 40-50 ядер). Такое симпластообразование свидетельствует о фузогенной активности вирусных гликопротеинов. Добавление моноклональных антител к дв после инфицирования снижает количество и уменьшает размер симпластов. Интересно отметить, что моноклональные антитела к дв также блокируют процесс бляшкообразования, т.е. распространения вируса от инфицированных клеток к соседним неинициированным. Цитоморфологический анализ бляшек, окрашенных

Гимза, показал, что более 80% клеток в бляшках - многоядерные, т.е. переход вируса от инфицированных к пеинфнпированным клеткам происходит в результате их слияния. Использование антител к внеклеточным (м-концевым) доменам дв показало, что домены а, 02а и 1)2Ь участвуют в сймндастообразовавни и в распространении вируса.

Таким образом, результаты исследований, проведенных на инфицированных клетках, показали, что гликопрогепн В цптомегаловируса не участвует в адсорбции вируса на мембране клеток, но играет важную роль в проникновении в клетку и распространении вновь синтезированных вирусов от инфицированных клеток к неинфицированным. Однако, эти результаты не позволяют сделать окончательные выводы, поскольку нельзя исключить роль других мембранных белков вируса в слиянии. В инфицированных клетках также трудно проанализировать роль функциональных доменов дв, играющих ключевую роль в слиянии. Поэтому следующая наша задача состояла в получении генетически трансформированных клеток с клонированным геном дв, анализ его фузо генной активности и функциональных доменов, участвующих в слиянии.

4.2;Получение генетически трансформированных клеток, экспрессирующих гликопротеин В цитомегаловируса человека.

Для получения генетически трансформированных клеток, экспрессирующих гликопротеин В ЦМВ, использовали перевиваемые клетки глиобластомы человека, пермиссивпые для этого вируса. Для трансфекции клеток использовали ДНК-плазмнду рНс/СМУ (1пу1!:годеп), несущую гены дв, и маркерный ген неомицин-фосфотрансферазы.

Трансфекцию клеток глиобластомы из7змс ДНК-плазмидами осуществляли кальций-фосфатным методом. Селекцию трансформантов проводили в среде. содержащей аналог неомицина - с-418. Пеомицин(с418)-устойчивые клоны были обнаружены через 10-14 дней после трансфекпии. Экспрессию дв в трансформантах определяли с помощью реакции непрямой иммунофлюоресцснции с использованием панели моноклональных антител. 5-7% пеомицин-устойчивых клопов экспрессировали дВ. Уровень экспрессии был очень высоким, до 60-80% клеток популяции продуцировали оболочечные гликонротеипы ЦМВ. Локализация белков была характерна для гликопротеинов, т.е. в цитоплазме и на плазматической мембране. Положительные клоны были отобраны для изучения свойстп белков.

Белки, продуцируемые трансформированными клетками, были также исследованы с помощью методов радиоиммупопреципитации. Сравнительный анализ полипептидов в трансформантах, экспрессирующих нормальный (иь) дв, и в ЦМВ-инфицированных клетках показал, что в генетически трансформированных клетках не происходит протеолитичсского расщепления гликопротеина, т.е. клетки продуцируют только 150-160 1СД предшественник (Рис. 5). В инфицированных клетках были обнаружены как предшественник, так и продукты нарезания дВ: 115 1СД ы-конси и 55 КД с- конец. Эти результаты позволяют предположить, что протеолитические ферменты, расщепляющие полипротеин между 460 и 461 аминокислотами, являются активными только во время инфекции, т.е.

-Й

U-

¡I

и.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 ю 11 12 13

G9-I- i

(i ** s * ■

I» I

pjtk ■ ■ tfí

«л. .м> '.'j Ы v.» м *>» M w .«а» л» w,

■ fl.-,-;."-

• • „.l-, • ' .,

Рис. 5. Элсктрофоретичсский анализ гликолротеина В в генетически трансформированных и инфицированных клетках. Трансформированные клетки глиобласгомы, экспрессируюшне нормальный и мутированные формы дв, инфицированные ЦМВ (АД169) клетки глиобласгомы были мечены 35s-метионином {100 мкКю/мл.) и 32Р-ортофосфатом (400мкКю/мл). Радиоактивный дв был иммунонреципитирован с помощью MICA (пул антител к различным доменам дв). Полипепгиды были анализированы в 9%. SDS ПААГ. Линии 1-7 -белки, меченные 35з-метионгаюм, линии 8-13 - белки, меченные 32Р-ортофэсфатом. Линии: 1 и 8 - wt gB;2 И 9 - Д411-447;3 и 10 - Д760-906;4 И 11 - Д833-90б;5 И 12 - Дб70-90б;6 И 13 - КЛеТКИ глиобласгомы, инфицированнные ЦМВ; 7 и 13 - неинфицированные вирусом клетки. Полипегггидьк 150-160 КД - предшественник; 116 Кд - N-конец; 55 КД -с-коиец. MW-иаркери молекулярных масс : 200 КД - миозин, 97,4 КД -фосфорилаза. 69 КД • бычий альбумин, 46 КД - овальбумин, 30 КД -ангидраза.

возможно. их активность регулируете« факторами. кодирующимися вирусным геномом.

Цптоморфологическни анализ трансформантов показал, что в клетках, гжспрессируюшнх нормальный (нсмутироваппый) дв, имеются многоядерпые клетки-спмпластн (1'пс. 6). Количество симпластов в дВ-продупируюших клетках колебалось от 180 до 250 па см^. Число ядер в симпластнх было 5-25. Спмпластообразовпппс зависело от наличии дВ па плазматической мембране. Анализ живых клеток в проточном нитофлуоромстре (facs) с использованием антител к дВ показал, что высокий уровень симпластообразопания отмечается только н клопах, имеющих интенсивный транспорт гликопротсипа к плазматической мембране.

1'пс. 6. Симиласгообразопание в клетках глиобластомы, зксирессируюших дв ИМИ. Мпогоядсрныс клетки на препаратах окрашенных Гимза (а,в) и в реакции непрямой иммунофлуорссисниии (c,d) с использованием МКА (пул) к дВ.А, В, С- клоп UB15-11, ЭКСПреССИруюШИЙ дВ: D- U373 -пео, контрольные клетки глиобластомы. трансформированные ДНК-векторной плазмилоп pRc/CMV.

Количество симпластон сильно уменьшалось при обработке клеток туникамицином и моненсином. блокирующими внутриклеточный транспорт гликопротенпов к плазматической мембране. Добавление моноклоналышх антител в культуральную среду также блокировало симпластообразование. Антитела к внеклеточным конформанионно-зависимым доменам Di, D2a и D2 Ь оказывали наибольший блокирующий эффект, вероятно, эти участки дв участвуют в слиянии клеточных мембран.

Для выяснения функционально активных доменов дв, участвующих в слиянии, были получены клеточные клоны глиобластомы U373MG, эксирессирующие мутантные формы белка, не имеющие внеклеточные и внутриклеточные участки; Д170-447,- Д411-447; Д548-618; Д760-9 0 6 ; Д833-90 6. FACS-анализ с использованием моноклональных антител к дв показал, что ни один из мутантов не потерял способность к транспорту белка к плазматической мембране. Результаты радиоиммунопреиинитации показали уменьшение молекулярных масс мутангных белков соответствующих кодирующих последовательностей (Рис. 5). Эпитопное картирование с помощью панели моноклональных антител методами непрямой иммунофлуоресцсншш также подтвердило отсутствие соответствующих эпитопов в мутированных доменах.

Анализ клеточных клонов, экспрессируюших мутантные формы дв, показал, что симпластообразование обнаруживается только в мутантах, имеющих делении во внеклеточных доменах белка. Мутант Д760-906 с недостающим нитоплазматическим доменом белка потерял полностью фузогенную активность. Другой мутант Д83 3 -906 с недостатком 63 аминокислот с С-конца сохранил только 50% сливающей активности ( 90110 сими ластов/см^.) (Рис. 7) •

При селекции клеток, экспрессируюших нормальный (wt) дв, нами был обнаружен клоп UB31-B3, клетки которого не формировали симпластн (Рис. 5). Эпитопное картирование с использованием панели моноклональных антител методом иммунофлуоресценции показало, что дВ, продуцируемый этими клетками, не имеет полного трансмембранного и нитоплазматического домена белка. С помощью FACS-анализа клеток, экспрессируюших мутантный дв,был установлен нормальный внутриклеточный транспорт белка к плазматической мембране клеток.

Анализ методом радиоиммуиопреципитации показал, что эти клетки продуцируют три полипептида с молекулярной массой: 125 КД, 90 КД и 35 КД (Рис. 5. линии 5). Все эти молекулы ассоциированы с клеточной мембраной, в культуральной жидкости не обнаруживаются, т.е. не секретируются. Для выяснения происхождения этих полипептидов нами был проведен пульс-чейз (pul s- cha se) анализ белка с использованием 3 5 s-метионина. Клетки метили радиоизотопом п течение 15 мин. (200 мкКю/мл). Инкубацию осуществляли в течение 0.5., 1ч. и 2ч. с добавлением избыточного количества нерадиоактивного метионина. Результаты показали, что 125 КД-полипептид является предшественником дв. 90 КД и 35 КД-полипептиды образуются в результате протеолитического расщепления предшественника.

Рис 7. Анализ симпластообразовання генетически трансформированными клетками глиобластомы, экспрессируюшими нормальный и мутированные формы гликопрогеина В ЦМВ.

Для выяснения природы этой мутации осуществлено секвенирование нуклеотидной последовательности белка (ciron corporation). Анализ секвенированин показал, что спонтанная мутация произошла в результате внедрения терминирующего кодона в положение 669 аминокислоты (лизин). Этот мутант был обозначен нами как Д670-90 6. Таким образом, было установлено, что спонтанно мутированный дв не экспрессирует полный трансмембранный (712-774 аминокислоты) и цитоплазматический (774-906 аминокислоты) домены белка. Возникает вопрос: "Каким образом этот трансмембранный белок заякоривается в плазматической мембране клеток?" Здесь может быть два отпета. Первый - во внеклеточном домене дв между аминокислотами 629 и 652 имеется гидрофобный участок, который может служить как трансмембранный домен. Второй - мутантный белок может связываться трансмембранным участком с интегральными белками клеточной мембраны и ассоциироваться с ней.

Были изучены гликозилированне и олигомеризация дв ЦМВ в генетически трансформированных клетках. Для анализа гликозилирования радиоиммунопреципитированные белки (нормальный - wt и мутированный) обрабатывали ферментами эпдогликозидазой H и эндогликозидазой F, отщепляюшимп олигосахарпдные пени белка. После обработки белки анализировали в 9% sds-ПААГ. Результаты показали, что молекулярные массы белков, обработанных ферментами, по сравнению с контрольными (не обработанными) уменьшались на 3-5 КД. что свидетельствовало о несущественном изменении степенн гликозилирования дв. Это, возможно, связано с множественностью сайтов гликозилирования белка, т.к. 15 N гликозилирующие сайты имеются в иемутированном белке, и лелетированные сайты не достаточны для снижения степени гликозилирования. Также не было обнаружено изменения олигомеризации мутантных форм дв при анализе их в 7% sds-ПААГ без обработки р-меркаптоэтанолом и кипячением. Все мутанты образовывали олигомерные формы (340-360 КД) не зависимо от размера делеции. что свидетельствует о достаточном количестве s - s связей в мутированных белках.

Известно, что фосфорилирование многих вирусных и клеточных белков является важнейшим свойством их функциональной активности. Поэтому нами было изучено фосфорилирование дВ, экспрессируемого генетически трансформированными клетками глиабластомы. Для анализа фосфорилирования дВ, клеточные линии, экспрессирующие нормальный (wt) и мутаитнне белки, мстили радиоактивным 32Р-ортофосфатом (400 мкКю/мл) в течение 16 ч. Белки анализировали в 9% SDS ПААГ. Полученные результаты показали, что фосфорилирование происходит в полноразмерном дв и его делеиионных мутантах по внеклеточным доменам (Рис.5). Мутанты с отсутствующим цитоплазматическим участком не фосфорилировались. что свидетельствует о локализации сайта фосфорилирования в этом участке и активном участии В: ; процессе слияния. Однако, эти результаты не позволяют сделать окончательные выводы о роли фосфорилирования в фузогенной активности- дв. Для этого необходимо произвести замену фосфорилирующих аминокислот (серии и тирозин) на нефосфорилирующие, сохраняя размер цитоллазматического домена.

Таким образом, полученные результаты показали, что гликопротеин 15 цитомегаловируса индуцирует симпластообразование в клетках глиобластомы. Моноклональные антитела к внеклеточным доменам и, 02а и 02 блокируют фузогенную активность белка как в процессе инфекции, так и в клетках, экспрессируюших клонированный ген дВ, (эффект антител к цитонлазматическому домену невозможно проверить, т.к. иммуноглобулины не проникают в живые клетки). Анализ симнласгообразонанип в клеточных линиях, экспрессируюших мутантные формы дВ; продемонстрировал прямое участие трансмембранного и цитоплазматического доменов в процессе слияния. Эти результаты свидетельствуют о существовании нескольких функциональных доменов дВ, ответственных за его фузогенную активность.

Известно, что цитомегаловирус проникает в клетки путем рН-независимого слияния вирусной оболочки с плазматической мембраной клеток. (сотр1:оп еь а1. , 1990). Наши результаты продемонстрировали, что для слияния необходим гликопротеин В. Анализ нуклеотидных последовательностей дВ ЦМВ показал отсутствие последовательностей, кодирующих пептид слияния, что свидетельствует о существовании других механизмов слияния вирусной оболочки с мембраной клеток, индуцированного гликопротеином В герпесвирусов.

5.Изучение инфекционносги цитомегаловируса и вируса простого герпеса в полярных эпителиальных клетках сетчатки глаза человека.

В последние годы вирусологи проявляют особый интерес к роли эпителиальных клеток в вирусной инфекции, т.к. эпителиальные клетки первыми имеют контакт с вирусами. Было показано, что проникновение вируса в клетки и выход дочернего потомства происходит с определенной поверхности эпителиальных клеток. Вирус гриппа, например, может инфицировать клетки с апикальной и базолатеральной мембраны, но выход (отпочковывание) вируса происходит только с апикальной мембраны (Rodriguez-Boulan et al., 1989). Вирус везикулярного стоматита инфицирует эпителиальные клетки с базолатеральной поверхности, и выход вируса происходит с этой же поверхности (Fuller et al., 1984). Для этих же целей вирус трансмиссиввого гастроэнтерита использует апикальную мембрану клеток (Rossen et al . , 19 94).

Роль базолатеральной и апикальной мембран эпителиальных клеток в инфекции герпесвирусамн оставалась неизученной. Удобным объектом для изучения этого вопроса оказались пигментные эпителиальные клетки сетчатки глаза человека, которые часто поражаются у больных питомегалией. Иммуноцитохимическое исследование инфицированных глаз показало, что антигены цитомегаловируса обнаруживаются в клетках сетчатки и пигментных эпителиальных клетках, но не в хороидо-капиллярном слое глаз. Эти сведения указывают на важнейшую роль пигментных эпителиальных клеток сетчатки в распространении вирусной инфекции в клетках глаза, т.к. они образуют монослойный барьер между

сетчаткой и хороидом. Поэтому одной из наших задач являлось изучение закономерностей гернесвирусной (ЦМВ и ППГ-1) инфекции в эпителиальных клетках, проявляющих полярность in vitro.

5.1. Особенности инфекции ЦМВ и ВПГ-1 в полярных эпителиальных клетках сетчатки глаза человека.

Для получения полярных клеток были использованы диплоидные эпителиальные клетки сетчатки глаза человека ЛРПЕ-19. Полярные клетки инфицировали ЦМВ (ЛД169) и ВПГ-1 (f) с апикальной и базолатеральной поверхности. Через 24 ч. клетки фиксировали, и с помощью реакции непрямой иммунофлуоресценции анализировали экспрессию вирусных белков. Для этого использовали моноклональные антитела к предраннему белку ЦМВ (р72) и поздним белкам ВПГ-1 (дБ, дс и gD). Результаты экспериментов показали, что полярные эпителиальные клетки сетчатки глаза человека инфицируются цитомегаловирусом с апикальной мембраны, а вирусом простого герпеса - с обоих сторон (Рис. 8).

Интересно отметить, что цитомегаловирусная инфекция в эпителиальных клетках сетчатки глаза протекает без пилимых цитопатичсских изменений в течение 3-4 недель. Цитопатогенное действие ВПГ-1 в этих клетках наступает через 10-12 ч. после инфекции, а еще через 24-48 ч. обнаруживается массовая дегенерация и гибель клеток. Поэтому эксперименты для изучения выхода вновь синтезированных ВПГ-1 из полярных клеток провести не удалось, т.к. вследствие чрезвычайно быстро наступающего ЦПД вируса нарушается полярность клеток.

В ЦМП инфицированных клетках полярность не нарушается н течение 5-7 дней, и в течение следующих 2-3 недель наблюдается лишь незначительное изменение. Это позволило нам исследовать выход вновь синтезированных вирусов в полярных клетках. Для этого клетки инфицировали ЦМВ с апикальной стороны. Затем определяли титр вируса в культуралыюй жидкости, полученной с апикальной и базолатеральной стороны инфицированных клеток через 5, 7 и 14 дней после инфекции. Результаты титрования показали, что выход вируса происходит с апикальной стороны полярных клеток.

Был проведен анализ полярных мембран для выявления дв в ЦМВ инфицированных клетках АРПЕ-19. Для этого через., 5-6 дней после инфекции, клетки фиксировали 3% параформальдегндом на льду и исследовали в реакции иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител (пул) к дв (все процедуры осуществляли на льду). Этот вариант иммунофлуоресценции позволяет обнаружить белок только на поверхности мембран. Затем клетки анализировали с помощью конфокального микроскопа, позволпющего регистрировать флуоресценцию в желаемом участке клеток. Результаты этих экспериментов показали, что дв транспортируется к апикальной поверхности полярных клеток сетчатки глаза, где происходит почкование цитомегаловируса человека.

Таким образом, наши результаты продемонстрировали, что цитомегаловирус инфицирует полярные эпителиальные клетки сетчатки глаза человека с апикальной поверхности, и после репродукции выход вновь синтезированных вирусных частиц также происходит с апикальной

Рис 8. Анализ инфекции ЦМВ и ВПГ-1 п полярных эпителиальных клетках сетчатки глаз. Полярные клетки АРПЕ-19 (а, в) и фибробласты человека ФЧ (с, ь) инфицировали ЦМВ (АД169) с апикальной (а, с) или базолатеральной (в,б) поверхности. АРПЕ-19 клетки инфицировали ВПГ-1 (е,р) с апикальной (е) и базолатеральной (р) мембран клеток. Через 24- ч. клетки фию!ровалп 70% метанолом и экспрессию вирусных белков определяли в реакции непрямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител к предраннему белку (р72) ЦМВ и поздным белкам (дв, дС, дБ) ВПГ-1. По оси абсцисс -множественность инфекции. БОЕ/кл. По оси ординат- количество инфицированных клеток. %.

мембраны клеток. Этим, возможно, объясняется локализованность ЦМВ инфекции в сетчатке. Вероятно, вирус перехолит из клеток сетчатки в эпителиальный слой, инфицирует клетки с апикалыюй мембраны, и после репродукции вновь синтезированные вирусные частицы выходят из клеток через эту же мембрану, т.е вирус возвращается назад и таким образом блокируется распространение инфекции в следующей слой - сосудистую оболочку хороида.

5.2. Роль оболочечных белков ЦМВ и ВПГ-1 в распространении инфекции через латеральные мембраны полярных клеток.

Развитие герпесвирусной инфекции в организме зависит от многих иммунобиологических факторов и состояния вируса: количества потенциально вирулентного вируса. местонахождения, способности перехода вируса от инфицированной клетки к соседним неинфицированныч в присутствие вируснейгрализующих антител (Roizman. , 1993). Показано, что делеционные мутанты ВПГ-1 по генам, кодирующим оболочечные белки дЕ и gEgl, не могут переходить от инфицированных нейронов к неинфицировапным ( Jonhson et al., 1990, 1995). Для изучения механизмов распространения инфекции нами были использованы мутантные вирусы ВПГ-1, любезно предоставленные Dr. Roizman, а также делеционные мутанты цитомегаловируса по гену US9, гомологичному гену дЕ ВПГ-1, любезно предоставленные Dr.T.Jhones. Эти гены находятся в уникальном коротком (us) сегменте вирусной ДНК и являются несущественными (jonhson et al., 1990, 1995; Jhones., 1993, 1994)).

Полярные эпителиальные клетки АРПЕ-19 инфицировали мутантными и "дикими" штаммами вирусов ВПГ-1 и ЦМВ. Для инфекции ВПГ-1 также использовали полярные клетки почки собаки (МДСК). ЦМВ-инфицированные клетки фиксировали через 7. 14 и 21 день, ВПГ-1-инфицированные клетки -через 3-5 дней.

Результаты этих экспериментов показали, что мутантные вирусы, как ВПГ-1, так и ЦМВ, образовывали маленькие бляшки (3-5 клеток) по сравнению с "дикими" штаммами вирусов (ВПГ-1 - 180-250 кл, ЦМВ - 2530 кл). Интересно отмстить, что вируснейтрализующие моноклональные антитела не блокировали бляшкообразование. Это, возможно, связано с трудностью доступа антител к определённым участкам латеральной мембраны полярных клеток. Вероятно, плотные и адгезивные контакты латеральной мембраны эпителиальных клеток образуют между клетками участки, препятствующие проникновению антител. Не искючено, что через эти участки пирус может переходить от инфицированной клетки к неинфицированной.

Анализ межклеточной проницаемости полярных клеток, инфицированных мутантными и "дикими" штаммами вирусов, с помощью Зц-инулнна продемонстрировал драматическое увеличение межклеточной проницаемости клеток, инфицированных "дикими" штаммами, тогда как межклеточная проницаемость клеток, инфицированных мутантными вирусами, изменялась незначительно (Рис. 9). Эти данные свидетельствуют

30.000

х 23,000

о <и 20.000

5 15,000

а">

о. 10.000

р о 5.000

10 15

Дни поело инфекции.

ё зо.ооо

± 25.000

с?

° 20.000 § 15.000

г ю.ооо

В 5,000 о

Часы поело инфекции

Часы после нпфекшш

Рис 9.Изучение межклеточной проницаемости полярных клеток, инфищцюванных "дикими" и мутантными штаммами ЦМВ и ВПГ-1. Полярные клетки АРПЕ-19 (А) инфици1ювали "диким" штаммом ЦМВ - АД-169 и делеиионными по гену из5 мутантами: ЛУЗ 5, , ЯУ8С с апикальной мембраны, 10 БОЕ/кл. АРПЕ-19 клетки инфицировали ВПГ-1 и его делеционными мутантами по генам дЕ, дЕд1 с апикальной мембраны (В), 1 БОЕ/кл.; МДСК - с базолатералыюй мембраны (С), 50 БОЕ/кл. Неинфинированные клегки были контролем. Через определённое время после инфекции в верхнюю ячейку (апикальная мембрана) добавляли Зн-инулин, 0,1 мкКю/мл. Через 9 мин. после добавления радиоактивного инулина 200 мкл среды было взято из нижней ячейки (базолатеральная мембрана) и радиоактивность была определена с помощью сиинтилляционпого счетчика. По оси абсцисс - часы (Б, С), дни (А). По оси ординат - радиоактивность среды внижней ячейке.

о том, что "дикие" штаммы ВПГ-1 и ЦМП разрушают межклеточные контакты и п результате этого увеличивается поток радиоактивного инулина от верхней ячейки к нижней. Дслеционные мутанты вирусов не увеличивают межклеточную проницаемость полярных клеток, т.к. они не разрушают межклеточные контакты и, следовательно, не переходят от инфицированных клеток к неинфицированным через латеральную мембрану. Эти результаты показывают, что оболочечные белки ВПГ-1 - дЕ и ЦМВ -US9 участвуют о переходе вируса от инфицированных к пеинфицировашшм полярным эпителиальным клеткам через латеральную мембрану.

Для изучения механизма перехода нитомегаловируса через латеральную мембрану полярных эпителиальных клеток были получены генетически трансформированные полярные эпителиальные клетки, экспрессируюшие иS9.

МДСК трансфицировали ДНК-плазмидой pRc/CMV, содержащей ген US9 (любезно предоставленной Dr. Jhones), находящийся под контролем промотора предраннего гена ЦМВ, и ген неомипин-трансферазы для селекции трансформантов. Селекцию трансформантов осуществляли в среде, содержащей аналог неомипииа - с-418. Экспрессию us9 определяли с использованием моноклональных антител к альфа-4 антигену ВПГ-1 {н 9 4 3). В N-конец этого гена была вставлена нуклеотидная последовательность ВПГ-1, кодирующая эпитоп альфа-4 (22

аминокислоты), который распознаётся антителами Н9 4 3 (American Cynamid Inc.)

Для получения полярных клеток траисформанты, экспрессируюшие US9, выращивали на микропористых мембранах. Через 4-8 дней клетки фиксировали и с помощью реакции непрямой имчунофлуоресцеиции анализировали локализацию US9, полярное распределение клеточных белков и колокализацию us 9 с белками латеральной мембраны клеток. Для этих исследований использовали одновременно два вида антител различного происхождения (напр. к US9 - мышиные, к актину - кроличьи) и копыогаты к ним, меченные различными флуорохромами (напр. антимышиный, меченый ФИТЦ, антикроличнй - техас-красным). Анализ препаратов осуществляли с помощью конфокального микроскопа.

Результаты конфокального анализа полярных клеток, экснрессирующих US9, показали, что белок локализуется и

аккумулируется на латеральной мембране полярных клеток. Установлено, что в us9-экснрессирующих клетках меняется полярное распределение актина. В-катенина и тенсина. Все эти белки в полярных нетрансформпрованных клетках аккумулируются на латеральной мембране (Рис. 10). В US9-экснрессирующих клетках актин и В-катенин распределялись диффузно, экспрессия тенсина сильно уменьшалась (Рис. 10). Актин является одним из важных белков цитоскелета, регулирующих и обеспечивающих морфогенез клеток. Тенсин и В-катенин являются актип-связываюшими белками, регулирующими полярность клеток. На 8 день культивирования полярных клеток, продуцирующих US9,

MDCK US9-MDCK US9-MDCK

I'nc. К) Изменение белков питоскелста и лате|шшюй мембраны генетически транорормирешшшх полярных клеток почки собак (МДСК). экспресс: ipyioi них U59 HMD. Клетки, лкспрсссиругащие US9, выращивали на мпк]юнормстых мембранах и течение 8 дней. Начиная с 4 по 8 день, клетки фиксировали и изучали изменение экспрессии клеточных белков с помощью |хяшш ||ммуи()флуо|1е<.не1иши с использованием специфических к ним антител. Пыли ;inajiii3ii|K)iiaiii.i следующие белки: К-клдхерин (мышиные МКЛ). Е-катешш (к|*»1пчы1 НКЛ). leiicini (крол. Г1КЛ). актин (крол. Г1КЛ). zo-l (крыс. МКЛ). Препараты ¡инициировали с помощью конфокального микроскопа. Правая часть рисунка - копт|Х)лы1ми вариант. МДСК клетки. Средняя и левая часть (н одном поле 3]ie.inni исследуются одни и тс же. клетки)- т|хшсформ<пггы. im:ii|X'<:cii|).viопте US9 (коиьки<п" .меченным ФИТЦом) и клеточные белки (кошлогат меченый Техас крас:иым). обх40. окхБ

наблюдалось изменение полярности клеток. Экспрессия белков плотного контакта (го—1) и адгезивного контакта (Е-кадхерин) уменьшалась, клетки теряли полярную морфологию, клеточная проницаемость увеличивалась и трансэпителиальный потенциал уменьшался (Рис. 10).

Вышеизложенные результаты демонстрируют, что оболочечный гликопротеин иээ меняет полярное распределение белков цигоскелета и латеральной мембраны эпителиальных клеток. В результате этих и, возможно, других изменений клетки теряют полярность, что. вероятно, обеспечивает переход вируса ("дикий" штамм, имеющий иээ) от инфицированных клеток к неинфицированным. Мутантный по этому гену вирус не может переходить, т.к. белок (иБЭ), обеспечивающий деполяризацию эпителиальных клеток, отсутствует. Механизм функционирования иээ не ясен, но, возможно, иээ ассоциируется с белками, обеспечивающими связь между нитоскелетом и адгезивными молекулами. При этом эти белки (или белок) не могут выполнять спои функции, в результате чего связь между цитоскелетом и адгезивными белками нарушается, клетки теряют полярность.

ВЫВОДЫ

1. Получены мутантные клетки человека на основе клеточных линий рьс/ рр1р/ 5 , сем, из7змв и мутантные клетки млекопитающих на основе клеточных линий СПЭВ, ТР, су-1, дефектные по генам ТК или ГФРТ. Показана пригодность мутантов для генетической трансформации в культуре.

2. Получены генетически трансформированные клеточные линии, экспрессируюшие поверхностный антиген вируса гепатита В (нвгАд). Изучена конститутивная и инлушгоельпан активность промоторов ЬТИ вируса саркомы Рауса и мегаллотионина-1 мыши. Показано, что генетически трансформированные клетки СПЭВ являются высоко эффективным продуцентом НВвАд.

3. Многошаговой селекцией с использованием токсических лекарственных препаратов получены мутантные клоны клеток гепатокараиномы человека рьс/рир/б. Показано, что в клонах с признаками цитодифференцировки активируется синтез альбумина и прекращается экспрессия канцеро-эмбриоиального антигена (альфа-фета протеина). В процессе селекции было отмечено, что проявление фенотипа дифференцировки осуществляется как многоступенчатый процесс и завершается терминальной дифференцировкой (стадия покоя) гепатоцитоп.

4. Показано, что в клетках гелатомы с признаками иитодифференцировки п 100-500 раз усиливается экспрессия нвэАд. В высокодифферениированных клетках рьс/рир/5 в предтерминальной и терминальной стадиях дифференцировки установлена индукция репрессированного гена нвсАд. В период активации нвсАд отмечалось снижение экпрессин НВэАд, что свидетельствует о существовании различных механизмов регуляции экспрессии этих генов в клетках печени.

5. С помощью генетически трансформированных клеток глиобластомы и373мо, экспрессируюших оболочечпый гликопротеин В (дв) цитомегаловируса человека, впервые показана фузогенная активность дв ЦМВ.

6. Впервые установлено, что:

а), пассивный транспорт или задержка дв в просветах эндоплазматического ретикулума и в аппарате Гольджи уменьшает или блокирует его фузогенную активность;

б) протеолитическое расшепление дв (между аминокислотами 460461) не влияет на сливающую активность белка;

в) моноклональные антитела к внеклеточным доменам дв - VI, П2а и Ь2Ъ блокируют сливающую активность белка;

г) мутантные формы дв с отсутствующим трансмембранным и цитоплазматическим доменами (Д670-906) и только цитоплазматическим доменом (Д760-906) не проявляют фузогенной активности. Мутант с частично отсутствующим цитоплазматическим доменом (Д833-906 ) наполовину восстанавливает сливающую активность белка.

Эти результаты демонстрируют, что трансмембранный и цитоплазматический домены (73 аминокислоты) дв участвуют в процессе слияния, и для осуществления фузогенной функции белка принципиально важен его активный транспорт к плазматическоой мембране клеток и сохранение конформации внеклеточных доменов дв - 2а и 2Ь.

7. Впервые показано, что ЦМВ может инфицировать полярные клетки только через апикальную мембрану, тогда как ВПГ-1 - как через апикальную, так и через базолатеральную поверхности эпителиальных клеток. Установлено, что дв ЦМВ транспортируется к апикальной мембране полярных клеток, где происходит почкование вируса.

8. Получены генетически трансформированные полярные эпителиальные клетки почки собаки (МДСК), экспрсссирующие оболочечпый гликопротеин ЦМВ - иээ. С помощью конфокального микроскопированин «оказано, что ий9 аккумулируется на латеральной мембране полярных клеток, меняет распределение клеточных белков (актин, кадхерин, тенсин, В-катенин). регулирующих полярность, в результате чего происходит деполяризация клеток.

9. Установлено, что в присутствие вируснейтрализующих моноклональных антител как ЦМВ, так и ВПГ-1 могут переходить от инфицированных клеток к неинфицированным через латеральную мембрану полярных клеток. Впервые показано, что гены иБ9 ЦМВ и дЕ ВПГ-1 ответственны за переход вируса через латеральную мембрану полярных эпителиальных клеток.

Список работ, опубликованых по теме диссертации.

1. Дьяконов Л.П.. Кущ A.A., Тугизов Ш.М., Гибридизация соматических клеток и перспективы использовании клеточных гибридов в решении проблем инфекционной патологии сельскохозяйственных животных. Сельскохозяйственная биология, 1986, N 1, с. 22-28.

2. Дьяконов Л.П., Кущ A.A., Тугизов Ш.М., Методические рекомендации по получению мугантных штаммов перевиваемых линий клеток сельскохозяйственных животных, пригодных для гибридизации. 1986, 16 с.

3. Тугизов Ш.М., Кущ A.A., Получение мутантных клонов клеток СПЭВ, устойчивых к 5-бромдезоксиуридину. Всесоюзная конференция по генетике соматических клеток в культуре. Тезисы докладов. 1986. с 11.

4. Дьяконов Л.П., Кущ A.A., Тугизов Ш.М., Майджи Е.В.. Жданов П.М.. Штамм мутантных клеток трахеи эмбриона коровы для гибридизации клеток животных in vitro. Авторское свидетельство, N 1294010. 1986.8.08. 5 с.

5. Тугизов Ш.М., Куш A.A., Дьяконов Л.П., Расульев О.Ш., Жданов В.М.. Штамм клеточного клона почки эмбриона свиньи для гибридизации клеток животных in vitro. Авторское свидетельство, N 1275905, 1986.11.09.5 с.

6. Тугизов Ш.М., Кущ A.A., Усиление продукции поверхностного антигена вируса гепатита В в метотрексат-устойчивых клетках гепатомы человека. Цитология, 1987, т 24, N 9, с. 1108.

7. Тугизов Ш.М.. Кущ A.A.. Ениколопов Г.Н., Экспрессия поверхностного антигена вируса гепатита В в клетках почки свиньи, трансформированных клонированной вирусной ДНК. Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Новые направление биотехнологии", Пушино-на Оке, октябрь, 1988. с 55.

8. Тугизов 111.М., Кущ A.A., Получение биохимически маркированных клеточных линий гепатомы человека и их использование для экспрессии чужеродных генов. Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Новые направление биотехнологии", Пушино-на Оке, октябрь, 1988, с 55-56.

9. Филатов Ф.П.. Тугизов Ш.М., Дорошенко Н.В.. Масолова О.В.. Русавская Е.А., Шилов A.A., Селиванов H.A., Пелецкая E.H., Урываев Л.В., Кущ A.A., Ананьев В.А., Царев С.А., Свердлов Е.Д.. Конструирование рекомбинантного белка с антигенными детерминантами вирусов гепатита А и В. Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Новые направленияа биотехнологии". Пушино-на Оке, октябрь, 1988, с 107-108.

10. Тугизов Ш.М., Кущ A.A., Штамм культивируемых клеток печени человека, дефектный по ГФРТ для гибридизации. Авторское свидетельство. N 1503301. 22.04.1989. 5 с.

11. Тугизов Ш.М.. Куш Л.А.. Штамм культивируемых клеток гепатокарциномы человека, дефектный по ТК для гибридизации и трансфекции. Авторское свидетельство. N 1495375. 03.22. 1989. 5 с.

12. Кущ A.A., Тугизов Ш.М., Клеточная инженерия в вирусологии. Вопросы вирусологии. N 2. 1989, с. .

13. Тугизоп Ш.М., Кущ A.A., Калинина Т.И., Активация гена НВсАд в клетках гепатокарциномы человека. В кп: Молекулярная биология и генетическая инженерия вирусов. Москва. 1989. с. 57-62.

14. Тугизов 11I.M.. Использование электрического пробоя мембран для гибридизации и трансфекции эукариотических клеток. В кн: Молекулярнаяа биология и генетическая инженерия вирусов. Москва. 1989. с. 93-98.

15. Тугизов Ш.М., Кущ A.A., Активация внутренного антигена вируса гепатита В в мутантных клеточных клонах гепатокарциномы человека. Тезисы докладов Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток в культуре. Звенигород, октябрь 1989. с. 75-76.

16.Filatov F.P., Tugizov Sh.M., Tzarev S. A., Sverdlov E.D., The expression of the recombinant gene constructed from the hepatitis A and В viral genomis seqiences. In Ibero-American Congress on Biotechnologu. Havana, Cuba, 1989, p. S 0 5-044

17.Tugizov Sh. M., Selection of human hepatocarcinoma cell lines for expression of transfected genes in vitro. In Ibero-American Congress on Biotechnologu. Havana, Cuba, 1989, p. S 0 6 - 014.

18. Тугизов Ш.М.. Сравнительный анализ экспрессии поверхностного антигена (hbsАд) вируса гепатита В. В кн: Молекулярная биология и медицина. Ленинград, май, 1990. с. 7.

19. Тугизов Ш. М., Рымалов И.В., Разработка способов получения липлоидных и и орта л mux сублиний клеток сурка для исследований гепадновирусов. Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии", октябрь 1990. с 69-70.

20. Тугизов Ш.М., Кущ A.A., Изучение экспрессии HBsAg и нвсАд в мутантных клонах гепатокарциномы человека. В кн: Итоги науки и техники. Серия : Вирусология, Вирусные гепатиты. Москва, Изд-во ВИНИТИ, 1990. т. 22. с 71.

21. Филатов Ф.П., Тугизов Ш.М., Кассетный вектор на базе HBsAg и его синтез в герпесвирусной системе экспрессии. В кн: Итоги науки и техники. Серия : Вирусология, Вирусные гепатиты. Москва, Изд-во ВИНИТИ. 1990, т. 22, с. 72.

22 Савченкова И.П.. Тугизов Ш.М., Анализ компетентности клеток млекопитающих к поглащению и экспрессии трансфицируемых генов. Тезисы докладов. Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии. Москва, 1991, с.169.

23. Тугизов Ш.М.. Савченкопа И.П., Грабопская И.Л., Куш ДА., Связь степени дифференцировки клеток гепатокарииномы человека с .экспрессией интегрированных генов вируса гепатита В. Тезисы докладов. Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии. Москва, 1991. с. 195.

24. Filatov, F.РTugizov,S.М.,Kunarev,V.P.Designing exposition vectors on the basis of HBsAg.Sov. Med. Rev. E: Virology Reviews. 5:27-42, 1992. Printed in the United Kingdom. London.

25. Тугизов Ш.М., Савченкова И.П., Грабовская И.Л., Куш А.А., Изменение экспрессии генов вируса гепатита В в клетках гепатокаршшомы человека PLC/PRF/5 в процессе приобретения ими лекарственной устойчивости. Вопросы вирусологии. 1992. ы 5/6, с. 238241.

26 Филатов Ф.Л., Тугизов Ш.М.. Савченкова И.П., Кумарев В.П., Беликов А.С.. Кадошников Ю.П., Кущ А.А., Урываев Л.П., Рекомбинантный поверхностный белок вируса гепатита В, экспонирующий иммунодоминанту мембранного белка вируса ВИЧ-1. Доклады Академии Паук, 1992. том 327, ы 1, с. 172-175

27. Tugizov, S,М., Savchenkova, I.P., Grabovskaya, I.L., Makarova, N.E., Eraizrer, T,L.,Revazova, E.P.,and Kushch, A.A., Changes.in expression of surface and core antigens of hepatitis В in different mutant'^clones of hepatoma PLC-PRF-5 cells. Virus Research. 30:189-203, 1993. (USA).

28. Grabovskaya, I.L., Tugizov, S.M., Glukhova, L.A., Kushch, A.A. Cytogenetic analysis of human hepatocarcinoma cell line PLC-PRF-5 and its mutant clones with different degrees of cell differentiation .Cancer Genetics and Cytogenetics 65:145-151, 1993. (USA)

29. Pereira, L., Lennette, E., Tugizov, S., Pas, P., Navarro, D., and Qadri, I. Humoral immunity to glycoprotein В in primary and recurrent human Cytomegalovirus infections. 4th .International CMV Conference. Paris, April 18-21, 1993. p. 29. (Presentation).

30. Pereira, L., Navarro, D., Paz, P., Tugizov, S., Topp, K., La Vail, J., Glycoproten B of Human Cytomegalovirus promotes virion into cells, spread of infection from cell to cell and cell fusion. J.of Cellular Biochemistry. Supplement 17D, March 13-31, 1993.

31. lugizov, S., Paz, P., Qadri, I., and Pereira, L., Cells producing a mutated form of HCMV gB lacking the intracellular carboxy terminus fail to form syncytia.lSth International Herpesvirus Workshop. Pittsburg, Pennsylvania, USA. July 25-30, 1993. C-182.

32. Paz, P., Tugizov, S., and Pereira, L., HCMV infection of polarized retinal pigment epithelial cells proceeds from the

apical membrane and its blocked by monoclonal antibodies to glycoprotein B.18th International Herpesvirus Workshop, Pittsburg, Pennsylvania. USA. July 25-30, 1993. C-183.

33.Navarro, D., Paz, P.,Tugizov, S., Topp, K., La Vail, J., and Pereira, L.,Glycoprotein B of human Cytomegalovirus promotes virion penetration into cells, transmission of infection from cell to cell, and fusion of infected cells. 18th International Herpesvirus Workshop, Pittsburg, Pennsylvania, USA. July 25-30, 1993. C-103.

34. Navarro, D., Paz, P., Tugizov, S., Topp, K., La Vail, J., Pereira, L., Glycoprotein B of human Cytomegalovirus promotes virion penetration into cells, transmission of infection from cell to cell, and'fusion of infected cells.Virology. 197:143158, 1993. (USA).

35. Tugizov, S., Navarro, D., Paz, P., Wang, Y., Qadri, I., and Pereira, L., Function of human Cytomegalovirus glycoprotein B: Syncytium formation in cells constitutively expressing gB is blocked by virus neutralizing antibodies. Virology.201, 263276, 1994. (USA).

36. Maidji, E. , Tugizov, S., Jones, T., and Pereira, L..HCMV mutants with deletions in US show decreased infectivity of polarized retinal pigment epithelial cells. 19th International Herpesvirus Workshop, Vancouver, Canada, July 30- Aug. 5, 1994. 4 0.(Presentation).

37. Tugizov, S., Qadri, I., Paz, P., Wang, Y., Maidji, E., and Pereira, L., Expression of mutant forms of Human Cytomegalovirus gB precludes syncytium formation of glioblastoma cells. 19th International Herpesvirus Workshop, Vancouver, Canada, July 30-Aug.5, 1994 . 30.

38. Tugizov, S., Maidji, E., and Pereira, L., Human Cytomegalovirus infection in polarized retinal pigment epithelial cells proceeds from the apical surface. 19th International Herpesvirus Workshop, Vancouver, Canada, July 30-Aug. 5.1994 . 335.

39.Wang, Y., Qadri,I., Paz.P., Tugizov, S., Guo,J., and Pereira, L., Human Cytomegalovirus UL14 encodes a protein that accumulates in infected cells at late times. 19th International Herpesvirus Workshop, Vancouver, Canada, July 30- Aug. 5. 1994. 512.

40. Tugizov,S.,Wang,Y.,Qadri, I., Navarro,D.,Maidji, E.,and Pereira,L., Mutated forms of Human Cytomegalovirus Glycoprotein B are impaired in inducing syncytium formation. Virology. 209, 580-591, 1995.

41. Rauiakrishnan, M. , Tugizov, S., Pereira,L., and Lee, S, A., Conformation-Defective Herpes Simplex Virus 1 Glycoprotein B Activates the promoter of the grp94 Gene That Codes for the 94 KD Stress Protein in the Endoplasmic Reticulum. DNA and Cell Biology.1995, vol. 14, N.5, p. 373-384.

42. Tugizov S., Maidji E., Pereira L., HCMV infection of polarized Retinal Pigment Epithelial Cells. 12 th Annual AIDS Investigator Meeting. Abstracts, 105, March 23, 1995. California, USA

43. Maidji E., Tugizov S., Jones T., CMV Glycoproteins: Role of infection of polarized RPE cells. 12 th Annual AIDS Investigator Meeting. Abstracts, 105, March 23, 1995. California, USA

44. Zheng Z.,Maidji E., Tugizov S., Jones T and Pereira

L.HCMV Infection of Polarized Retinal Pigment Epitelial Cells 12 th Annual AIDS Investigator Meeting. Abstracts, 78, March 23, 1995. California, USA

45. Pereira L., Maidji E., Tugizov S., and Jones T., Deletion Mutants in Human Cytomegalovirus Glycoprotein US9 are impaired in Cell-Cell Transmission and in Altering Tight Junctions of Polarized Numan Retinal Pigment Epithelial Cells.Scandinavian Journal of Infection Disease. 99, 82-87, 1995.

46. Tugizov,S., Maidji, E .,Pereira,L.,Role of apical and basolateral membranes in replication of human cytomegalovirus in polarized pigment epithelial cells.Journal of General Virology, 77,3421-3432, 1996..

47. Tugizov S., Maidji E., Jones T., Zheng Z., and Pereira L., Accessory Glycoproteins encoded by the Unique Short component of the Herpesvirus genome required for cell-to-cell spread of virus in polarized cells.Keystone Symposia on „ Molecular and Cellular Biology, Abstracts, p 28, Febrary 1-7, 1996, Lake Tahoe, USA.

nam wno 3.241 T.80 - 'J6 r.

Mocicsa, HoDO-BacwanHan, 6

Информация о работе

Тугизов, Шароф Мавлонович
доктора биологических наук
Москва, 1995
ВАК 03.00.06

Автореферат

Похожие работы