Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование молекулярно-генетических основ устойчивости вируса гриппа типа А к химиопрепаратам адамантанового ряда

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование молекулярно-генетических основ устойчивости вируса гриппа типа А к химиопрепаратам адамантанового ряда"

Р Г б-од------------------------------------------------------------------------------------------

Российская Академия наук 2 ^ ДЬг Сибирское отделение

НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГЛНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

на правах рукописи

УДК 577.112: 577.212.3: 578.52-53

МИШИН ВАСИЛИЙ ПЕТРОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСНОВ УСТОЙЧИВОСТИ ВИРУСА ГРИППА ТИПА А К ХИМИОПРЕПАРАТАМ АДАМАНТАНОВОГО РЯДА

Новосибирск, 1995 г.

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН.

Научные руководители: чл.-корр. РАЕН,

доктор биологических наук проф. Мертвецов Николай Павлович кандидат биологических наук Каргинов Владимир Андреевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Дымшиц Г.М.

кандидат биологических наук Беклемишев А.Б.

Ведущая организация: НИИ молекулярной биологии НПО "Вектор"

Защита состоится _ 1995 г. _ часов на

заседании диссертационного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, проспект акад. Лаврентьева 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан

сь^уг^ЬПЛ 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук О.С.Федорова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность__проблемы. Грипп - одна из массовых вирусных

инфекций, возбудитель которой существенно отличается от остальных вирусов особенностями строения и репродукции. Геном вируса гриппа,состоящий из 7-ми (вирусы типа С) или 8-ми 'вирусы А и В) фрагментов, представлен одноцепочечной (-)-РНК.

Для лечения гриппозной инфекции как в нашей стране, так и за рубежом широко применяются химиопрепараты адамантанового ряда. Однако, эффективность использования этого класса соединений существенно снижается из-за появления в вирусной популяции штаммов, устойчивых к их действию. Для синтеза новых и модификации существующих препаратов, способных преодолевать лекарственную резистентность и, возможно, снизить вероятность возникновения устойчивых вариантов вируса, необходимо знание молекулярных основ их действия.

При изучении механизма действия химиопрепаратов адамантанового ряда первоначально было установлено, какие сегменты вирусного генома связаны с признаком устойчивости. Для этого использовали явление генетической реассортации, когда в результате одновременного заражения клеток двумя или несколькими штаммами вирусов с сегментированным геномом вновь синтезированные вирусные частицы имеют геномы, содержащие различные комбинации сегментов исходных штаммов. Исследованием генетической реассортации геномов устойчивых и чувствительных к химиопрепаратам вирусов гриппа типа А было установлено, что признак устойчивости определяется либо 4-ым сегментом генома, который кодирует гемаг-глютинин, либо 7-ым сегментом, кодирующим белки М1 и М2 . По мнению ряда авторов именно 7-ой сегмент вРНК играет основную роль в устойчивости гриппа типа А к химиопрепаратам, а исходя из функциональных особенностей белков, кодируемых этим сегментом, наибольшее внимание уделяется белку М2.

Цель настоящей работы заключалась в определении и сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей генов М2 и аминокислотных последовательностей кодируемых ими белков, ответственных за проявление устойчивости штаммов вируса гриппа

типа А к действию химиопрепаратов адамантанового ряда. На основании обобщения вновь полученных результатов и уже имеющихся данных предполагалось исследовать молекулярно-генетические основы действия химиопрепаратов адамантанового ряда.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи: 1} определить нуклеотидные последовательности генов М2 штаммов вируса гриппа типа А, устойчивых и чувствительных к действию химиопрепаратов адамантанового ряда, выделенных из природных популяций и полученных в лабораторных условиях; 2) провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей и соответствующих им аминокислотных последовательностей белка М2 в устойчивых и чувствительных штаммах вируса гриппа типа А; 3) исследовать влияние аминокислотных замен в белке М2 на проявление устойчивости к химиопрепаратам; 4) исследовать роль вторичной структуры 7-го сегмента генома вируса гриппа типа А в появлении замен в участке, кодирующем транс-мембранный домен белка М2.

ЫЭД1®95_Э2ВЙ§н§_И_Щ>§ктотеская_цетость_раб^ В результате анализа полученных данных показано, что устойчивость вирусов гриппа типа А к химиопрепаратам определяется заменами аминокислот в транс-мембранном домене белка М2. Также установлено, что на устойчивость влияют замены и во внемембранном ын2-домене белка М2, Показано, что для изменения фенотипа вируса с чувствительного на устойчивый, достаточно даже единичной нуклеотидной замены в участке 7-го сегмента РНК, которая приводит к амино-. кислотной замене в транс-мембранном домене белка М2. Предложена •модель взаимодействия белка М2 вируса гриппа с химиопрепаратами адамантанового ряда, согласно которой такие химиогхрепараты подвижно ориентированы в полости канала, сформированного тетра-мером бежа М2. При этом происходит гидрофобное взаимодействие лиганда с белком без жесткой фиксации адамантана. У устойчивых вариантов вируса нарушается внедрение химиопрепаратов в канал, что является результатом изменения структуры участка вз аимодействия.

Предложена вторичная структура 7-го сегмента РНК вируса гриппа. В ней обнаружены консервативные (шпилечные, петлевые) и вариабельные участки. Основные зарегистрированные различия

структур сосредоточены вне шпилечных (петлевых) районов; следовательно, большинство нуклеотидных замен происходит вне консервативных участков РНК. Для некоторых эпидемических штаммов вируса гриппа установлено, что ген М2 полностью соответствует гену лабораторного вируса А/?н/8/ЗД» который использовался для получения вакцинных штаммов. Можно предположить, что вирусы, использованные для вакцинации населения, явились донорами 7-го сегмента у природных устойчивых штаммов. Также не исключается возможность восстановления вирулентности реассортантных вакцин, полученных с использованием этого штамма, или сохранения ими жизнеспособности в следствии несовершенства технологий инактивации.

На основании полученных результатов в настоящее время Институтом гриппа (С.-Петербург) проводятся работы по конструированию противогриппозных химиопрепаратов с заданными свойствами.

Публикации и апробация работы.

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи (1 статья в печати). Результаты работы представлены на 17-ом Международном Конгрессе по Химиотерапии < Берлин, 1991г. ).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 125_ страницах, включающих 20 рисунков, з таблицы и список литературы (164 ссылки). Диссертационная работа состоит из введения, трех глав и выводов. Глава 1 - "Вирус гриппа типа А. Проблема устойчивости вируса гриппа типа А к химиопрепаратам." (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫ). Глава 2 - Экспериментальная часть. Глава 3 содержит изложение и обсуждение результатов, полученных в работе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ч£вствитедашх^_К1^огтре^ типа_Ал

Нами были определены и проанализированы нуклеотидные последовательности 7-го сегмента РНК (ген М2) разных штаммов ВГ типа А и соответствующих им вирусных белков. Среди исследованных штаммов были как природные изоляты, так и варианты, полученные в

Таблица 1. Исследованные штаммы вируса гриппа типа А.

No. НАЗВАНИЕ ШТАММА ПОДТИП КОММЕНТАРИЯ

1 А/Виктория/35/72 H3N2 природный штамм, поддерживаемый в лабораторных условиях

2 А/Виктория/35/72/RR H3N2 лабораторный штамм, устойчивый к ремантадину

3 А/Виктория/35/72/ER H3N2 лабораторный штамм, устойчивый к дейтифорину

4 А/Биктория/35/72/RDR H3N2 лабораторный штамм, устойчивый к ремантадину и дейтифорину

5 А/СССР/90/77 H1N1 природный штамм, поддерживаемый в лабораторных условиях

6 A/CCCP/90/77/RR H1N1 лабораторный штамм, устойчивый к ремантадину

7 А/СССР/90/77/DR H1N1 лабораторный штамм, устойчивый к ремантадину

8 A/CCCP/90/77/RDR H1N1 лабораторный штамм, устойчивый к дейтифорину

9 А/СССР/90/77/AR H1N1 лабораторный штамм, устойчивый к ремантадину и дейтифорину

10 А/Свердлов ск/7862/82 H3N2 природный штамм, чувствительный к химиопрепаратам

11 A/PR8/34 H0N1 лабораторный штамм, музей НИИ гриппа, устойчивый к химиопрепаратам

12 А/Москва/711/88 H1N1 природный штамм, от взрослого, в период смешанной эпидемии А и В,

устойчивый к химиопрепаратам

13 А/МОНГОЛИЯ/128/86 HIN1 природный штамм, межэпидемический изолят от ребенка, устойчивый к

А/Монголия/113/89 химиопрепаратам

14 H0N1 природный штамм, межэпидемический изолят от ребенка, устойчивый к химиопрепаратам

15 А/МОНГОЛИЯ/148/88 H0N1 природный штамм, межэпидемический изолят от ребенка, устойчивый к

А/Монголия/153/88 химиопрепаратам

16 H1N1 природный штамм, от ребенка в зимний период, устойчивый к

А/Ленинград/153/83 химиопрепаратам

17 НЗЫ2 природный штамм, от ребенка в эпидемию ЮТ2, устойчивый к

А/Свердловск/8347/82 химиопреп арат ам

18 H3N2 природный штамм, от ребенка в ' межэпидемический период,

А/Ленинград/203/85 устойчивый к химиопрепаратам

19 НЗК2 природный штамм, от ребенка при эпидемической вспышке в закрытом коллективе, устойчивый к

А/'Ленингр ад/3711 /49 хими опре п ар ат ам

20 H1N1 природный штамм, эпидемический изолят от Езрослого, музей НИИ гриппа, устойчивый к химиопрепарата

21 А/Ленинград/156/83 H3N2 природный штамм, от взрослого в эпидемию НЗН2, слабоустойчиьый к хими опре п ар ат ам

Рис. 3. Нуклеотидные последовательности гена М2 исследованных штаммов вируса гриппа типа А.

** - участок гена М2, кодирующий транс-мембранный домен белка Мг. Нумерация нуклеотидов по мРНК белка М2.

По НАЗВАНИЕ ШТАММА ПОДТИП

41 51

1 А/Виктория/35/72 H3N2 GAAACGAATGGGGGTGCAGATGCAAC

2 А/Виктория/35/72/ЯК H3N2 GAAACGAATGGGGGTGCAGATGCAAC

3 А/Виктория/3*/72ЛЖ КЗЫ2 GAAACGGATGGGGGTGCAGATGCAAC

4 А/Виктория/35/72/RDR H3N2 GAAACGAATGGGGGTGCAGATGCAAC

5 A/CCCP/90/77 H1N1 GAAACGAATGGGGGTGCAGATGCAAC

6 A/CCCP/90/77/RR H1N1 GAAACGAATGGGGGTGCAGATGCAAC

7 A/CCCP/90/77/DR H1N1 GAAACGAATGGGGGTGCAGATGCAAC

8 A/CCCP/90/77/RDR Н1Н1 GAAACGAATGGGGGTGCAGATGCAAC

9 A/CCCP/90/77/AR H1N1 GAAACGAATGGGGGTGCAGATGCAAC

10 а/Свердлов ск/7862/82 НЗЫ2 GGTGCAGATGCAAC

11 A/PR8/34 H1N1 ACGAATGGGGGTGCAGATGCAAC

12 А/Москва/711/88 H1N1 AACGAATGGGGGTGCAGATGCAAC

13 А/Монголия/128/86 H1N1 CAGAAACGAATGGGGGTGCAGATGCAAC

14 А/Монголия/113/89 H0N1 ATGCAAC

15 А/МонголиЯ/148/88 H0N1 GGGGTGCAGATGCAAC

16 А/МоНГОЛИЯ/153/88 Н1Ы1 GGGGGTGCAGATGCAAC

17 А/Ленинград/153/83 НЗЫ2 GCAGATGCAAC

18 А/Свердловск/8347/82 НЗЫ2 GGTGCAGATGCAAC

19 А/Ленинград/203/85 НЗЫ2 CAGAAACGAATGGGGGTGCAGATGCAAC

20 А/Ленинград/3711 /49 H1N1 AAACGAATGGGGGTGCAGATGCAAC

21 А/Ленинград/156/83 H3N2 TGGGGGTGCAGATGCAAC ++++++++ ++++^+++++++++++++

Ыо 61 71 81 91 101 111

1 GATTCAAGTGACCCTCITGTTGTTGCTGCGAGTATCATTGGGATCTTGCACITGATATTG

2 GATTCAAGIGACCCTCTTGTTGTTGCTGCGAATATCATTGGGATCTTGCACTTGATATIG

3 GATTCAAGTGACCCTCTTGTTGTTGCTGTGAGTATCATTGGGATCTTGCACTTGATATTG л GATTCAAGTGACCCTCXIG1IGITGCTGCGATTATCATTGGGATCTTGCACTTGATATTG

5 GATTCAAGTGATCCTCTTGTTGTTGCCGCAAGTATCATTGGGATTTTGCACTTGATATTG

6 GATTCAAGTGATCCTCTTGCTGTTGCCGCAAGTATCATTGGGATTTTGCACTTGATATTG

7 GATTCAAGTGATCCTCTTGCTGTTGCCGCAAGTATCATTGGGATTTTGCACTTGATATTG

8 GATTCAAGTGATCCTCTTGTTGTTGCCGCAAATATCATTGGGATTTTGCACTTGATATTG

9 GATTCAAGTGAICCTCTrGTTGTTGCCGCAAATATCATTGGGATTITGCACTIGATATIG

10 GATTCAAGTGACCCICTTGTTGTTGCTGCGAGTATCATTGGGATCTTGCACTTGATATTG

11 GGITCAAGTGATCCTCTCACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTG

12 GGTTCAAGTGATCCTCTCACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCITGCACTTGACATTG

13 GGTTCAAGTGATCCTCTCACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTG

14 GGITCAAGTGATCCTCTCACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTG

15 GGITCAAGTGATCCTCTCACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTG

16 GGTTCAAGTGATCCTCTCGCTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTG

17 GGTTCAAGTGATCCTCTCACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTG

18 GGTTCAAGTGATCCTCTCACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTG

19 GATTCAAGTGACCCTCTTGTTGTTGCTGCGAATATCATTGGATCTTGCACTTGATATTGG

20 GATTCAAGTGATCCTCTTGTTGTTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTG

21 GATTCAAGTGACTCTCTTGTTGTTGCTGCGAGTATCATCGGAATCTTGCACTTGATATTG + +++++++++ ++++ + ++++ + + ++++++ ++ ++ ++++++++++ ++++

No 121 131 141 151 161 171

*********

1 IGGATICÏTGAICGICXTXTIIICAAAIGCAXCTATCGAXXCXITGAACACGGTAIGAAA

2 TGGATTCTXGAXCGXCTÎXTTTXCAAATGCAÎCTATCGATTCTTTGAACACGGTCÎGAAA

3 IGGATXCTIGAICGICTITTXXXCAAAIGCATCTATCGATTCIIIGAACACGGTCIGAAA

4 IGGAIICTIGATCGTCITTTIXICAAAXGCAICTAXCGAIXCIIIGAACACGGTCIGAAA

5 IGGATTCTTGAICGÎCTTTTXTTCAAAIGCAITTAICGICICTTTAAACACGGTCIGAAA

6 ÎGGATTCTIGATCGICITTXIIXCAAAXGCAÎTTAICGICTCITTAAACACGGÏCTGAAA ? TGGATTCTTGATCGTCTTTXTTTCAAATGCAITTATCGTCTCTTTAAACACGGTCTGAAA 8 TGGAIICIIGATCGTCITTXIITCAAAXGCATTTAXCGXCTCTTTAAACACGGTCXGAAA

19 TGGATICTIGATCGTCTTTTTTTCAAAXGCAXIXAICGICICIIÏAAACACGGTCIGAAA

10 TGGATXCTIGAXCGTCTXTITIICAAAIGCAICIAICGAITCTTTGAACACGGTCTGAAA

11 TGGATTCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCATTTACCGTCGCTTTAAATACGGACTGAAA

12 ÏGGATÏCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCATTTACCGTCGCTTTAAATACGGACTGAAA

13 TGGATTCTIGATCGTCTTTTTTTCAAATGCATTTACCGÏCGCTTTAAATACGGACTGAAA

14 TGGATTCTTGAÏCGTCTTTTTTTCAAATGCATTTACCGTCGCTTTAAAÏACGGACTGAAA

15 TGGATTCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCATTTACCGÎCGCTTTAAATACGGACTGAAA

16 TGGATTCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCATTTACCGTCGCTTXAAATACGGACTGAAA

17 TGGATÏCTTGATCGTCXTTTTTTCAAATGC ATTTACCGTCGCTTTAAATACGGACTGAAA

18 TGGATICITGATCGTCXTTTTTÏCAAATGCAIXIACCGTCGCIITAAAIACGGACIGAJLA

19 TGGATICTTGATCGICTTXITITCAAAIGCAICIAICGACTCTTCAAACACGGCCTGAAA

20 TGGAIXCTIGATCGICIXTITTICAAATGCAXIXACCGTCTCXITAAACACGGICTGAAA

21 TGGAITCTTGATCGICTTTTTTTCAAATGCATCTATCGATTCTTCAAACATGGCCTGAAA ++++++++++++++++++++++++++++++++ ++ ++ +++ ++ + ++ +++++■ •

No 181 191 201 211 221 231

1 ÂgagggccitciacggaaggÀgiaccigagtciatgagggÀagaaiatcgÀaaggaacag

2 agagggccitctacggaaggagxaccxgagtctaigagggaagaatatcgaaaggaacag

3 agagggccttctacggaaggagtacctgagtctatgagggaagaatatcgaaaggaacag

4 agagggccitciacggaaggagxacctgagtctatgagggaagaaiaicgaaaggaacag

5 agagggccttctacggaaggagtaccagagtctatgagggaagaatatcgaaaggaacag

6 agagggccttciacggaaggagiaccagagtctatgagggaagaatatcgaaaggaacag

7 agagggccxicxacggaaggagtaccagagtciatgagggaagaatatcgaaaggaacag

8 agagggcctxctacggaaggagtaccagagtctatgagggaagaataicgaaaggaacag 19 agagggcctîctacggaaggagtaccagagîctaigagggaagaatatcgaaaggaacag

10 agagggccttctacggaaggagtacctgagîctaîgagggaagaatatcgaaaggaac ag

11 ggagggccttcxacggaaggagtgccaaagtctatgagggaagaatatcgaaaggaacag

12 ggagggccttctacggaaggagtgccaaagtctatgagggaagaatatcgaaaggaacag

13 ggagggccttctacggaaggagtgccaaagtctaigagggaagaaiatcgaaaggaacag

14 ggagggccttctacggaaggagtgccaaagtciatgagggaagaaiaicgaaaggaacag

15 ggaggggcttctacggaaggagtgccaaagtctatgagggaagaatatcgaaaggaacag

16 ggagggccïxctacggaaggagigccaaagxctaigagggaagaatatcgaaaggaacag

17 ggagggccttctacggaaggagtgccaaagtci atgagggaagaataicgaaaggaacag

18 ■ ggagggccttctacggaaggagtgccaaagtctaxgagggaagaaiatcgaaaggaacag

19 agagggccttctacggaaggagxgcctgagtcxaxgagggaagaatatcgaaaggaacag

20 agagggccttctacggaaggagtaccagagtctatgagggaagaatatcgaaaggaacag

21 agaggaccitciacggaaggagtacctgagtctatgagggaagaataxcgaaaggaacag

++++ +++++++++++++++++ ++ ++++++++++++++++++++++++++++++++

Но 241 251 261 271 281 291

1 САСАСТССТСТССАТССТСАССАСАСТСАТТ1ТСТСАССАТАСАССТССАСТА_А.

2 САСАСХССХСХССАХССТСАССАСАСХСАТХТХСТСАССАТАСАССХССАСХАА

3 САСАСТССТСТССАТаСТСАСаАСАСТСАТТТТСТСАССАТАСАССТССАОТАА

4 САСАСТССТСТСОАТОСТСАССАСАСТСАТТТТСТСАССАТАСАОСТССАСТАА

5 САСААТССХС'ГСЮАХССХСАСОАХАСХСАТТХЮТСААСАТАСАОСХАСАСТАА

6 САОААХССХСТСОАХССХОАСОАХАСХСАИХХОХСААСАТАСАССХАСАОХАА

7 САОЛАТССТСТОСАТОСТСАСОАТАСТСАТТТТСТСЛЛСАТАСАССТАОАСТАА 3 САСААХССТОТССАТССТСАССАТАСТСАТТТТСТСААСАТАСАССТАСАСТАА

19 САСААТССТСТССАТССТСАССАТАСТСАТТТТСТСААСАТАСАССТАСАСТАА

10 САСАетССТСХСЮАТССХСАССАСАСХСАТХХХСТСАССАХАОАССХСОАОХАА

11 САОАСХС^ХСТССАХССХСАССАХООХСАХХХХОХСАОСАХАСАОСХССАСХАА

12 САСАСХССХСТССАТССХСАССАХССХСАХХХЮТСАССАТАСАССХССАСХАА

13 САСАСХОСХСТСЮАТССХСАССАХССТСАТХХХСТСАССАХАСАССХСЮАСХАА

14 САСАСТССТСТССАТССТОАСОАТОСТСАТМТСТСАССАТАОАССТССАИАА

15 САСАСХОСЮТСОАХССХОАССАЮСТСАТХХХСТСАОСАТАСАОСХССАОХАА

16 САСАС1СС1С1СК5А1СС1САССА1(КТСА1111С1САССАТАСАСС1(Х}АСТАА

17 САСАСХССХСТССАХССЮАССАТССХСАТИТСТСАССАГАОАаСХССАСТАА

18 САОАСХССХСТССАХССТСАСОАХтеХСАТТХТОТСАССАТАСАССХСЮАСТАА.

19 С АСААТССТСШСАХССХСАССАСАС,ХСАТТТХСТСАСС АТАСАССХССАСТАА

20 САСАСТССХСТССАХССХСАССАТССТСАТТТХСТСААСАТАСАОСХССАОХАА

21 САСААХССЮТС-ОАЮСХСАССАХАОХСАТХХХСТСАССАТАОАССТССАСТАА ++++ ++++++++++++++++++ ++++++++++++ +++++++++ ++++++

результате пассирования чувствительных штаммов вируса гриппа типа А в присутствии лекарственных препаратов в лабораторных условиях.

При определении первичной структуры мы использовали метод прямого праймерного секвенирования. Для синтеза специфичной кДНК, соответствующей участку 7-го сегмента РНК, который кодирует белок М2, нами был выбран олигонуклеотид-праймер, соответствующий участку с 716 по 730 нуклеотид в структуре полноразмерной кДНК 7-го сегмента генома вируса А/даеуЪгхсЗ^е/ЗЗ (Н7И7).

После проведения синтеза кДНК исследуемых штаммов с

[рЭ2]-меченного праймера и определения первичной структуры фрагмента гена, кодирующего белок М2, нами был проведен сравнительный анализ участка 7-ого сегмента РНК, кодирующий белок М2 (рис.1), а также аминокислотных последовательностей этого белка. Список исследованных штаммов вируса" гриппа приведен в табл.1.

вщусов_гриппа_А_с_прщодаой_резистонтно

В нашей работе количественные показатели чувствительности или резистентности были отработаны на эталонных вирусах различной антигенной структуры. Вирусы, снижение репродукции которых при выращивании на хориоаллантоисной оболочке в присутствии 25 мкг/мл ремантадина составляло 2,0 1еИД50 и более, считали чувствительными (вирусы НЗЫ2), от 1,0 до 2,0 1вВД50 - слабочувствительными (А/шзп/ЗЗ), менее 1,0 1яИД50 - резистентными (А/РК/8/34 и В1фусы гриппа В).

Козелецкой К.Н. (НИИ гриппа РАМН С.-Петербург) показано, что в период с 1982 по 1988 годы регулярно выделялись резистентные штаммы, но общая тенденция свидетельствует о том, что устойчивые штаммы в силу каких-то обстоятельств не получают ожидаемого широкого распространения в природе. За последние годы не выделено ни одного резистентного изолята, хотя ремантадин широко использовали в медицинской практике. Т.е. резистентные штаммы появляются, по-видимому, независимо от применения химиопрепара-тов. Доказательством этому могут служить данные по выявлению устойчивых к химиопрепаратам штаммов в музейной коллекции вирусов гриппа Н1Ы1 (Институт гриппа, С.-Петербург) и среди изолятов, полученных из Монголии, где препараты адамантанового ряда не использовались даже при лабораторных исследованиях.

Для выяснения механизмов возникновения резистентности к химиопрепаратам были отобраны индивидуальные представители каждого подтипа ВГ. Большинство резистентных штаммов по антигенной структуре отличались от вирусов, доминирующих на момент их выделения, но были схожи с вирусами, уже вышедшими из циркуляции. В этиологии гриппа такие изоляты относятся к "антигенным анахронизмам".

Нами были определены куклеотидные последовательности гена М2 и аминокислотные последовательности белка М2 резистентных изолятов ВГ НЗЫ2, НОШ и Н1Ы1 и проведен сравнительный анализ с исходно чувствительным к ремантадину вирусом А/Виктория/35/72 (НЗЫ2) и резистентным' лабораторным штаммом А/РЕ/8/34 (НОН1 )•

Как видно из рис.2 природные резистентные штаммы всех

__ЛЗИ2;____

А/Виктория/35/72 А/Свердловск/7862/82 А/Свердлов ск/8347/82 А/Ленинград/153/83 А/Ленинград/156/83 -А/Ленинград/203/85

_Н1Ы1_

20

30

40

МЗЬЬТЕтР1ЕЫШССКСЫБ38СРЬ7УАА311С11НЬ1Ьда1ЬСКИ?ГК

А/МОНГОЛИЯ/128/86

А/Москва/711/88 А/Монголия/153/88 А/Ленинград/3711/49

_НОШ_

А/РК8/34

А/Монголия/113/89 А/Монголия/148/88

С

С

Т1 N

Т1 N

N1 К Ь

0 Т1 ы Т

в тх N т

в А1 11 т

N

в N т

Т1 N т

II N

Б

_НЗЫ2_

А/Виктория/35/72 А/Свердловск/7862/82 А/Свердловск/8347/82 А/Ленинград/15 3/83 А/Ленинград/156/83 А/Ленинград/203/85

50 60 70 80 90

СХтарРШСМтаСРЗТЕОУРЮМЕЕЕУРКЕООЗАТОАСОЗОТУЗХЕЬЕ Ь

К

тьс К КУ ъ с

к ь ь к ъ

к

к

с

ЛИИ

А/Монголия/128/86 А/Москва/711/88 А/Монголия/153/88 А/Ленинград/3711 /49

_НОМ_

А/РН8/34

А/Монголия/113/89 А/Монголия/148/88

К И ЬС

К КУ ъ о

8КУ1С

ь К ь

В КУ ь с К КУ Ь О К Н Ь С

к к

к к к

в

с

с с

с

с с

Рис. 2 Аминокислотная последовательность белка М2 у вирусов с различной чувствительностью к химиопрепаратам

подтипов, выделенные в географически удаленных регионах, имеют в 31-ом положении белка М2 аминокислотный остаток Асн, который является одним из "маркеров1* резистентности. Такой замены не обнаружено у штамма А/Ленинград/156/83, который по степени

ингибирования репродукции в присутствии химиопрепаратов отнесен нами к слабочувствительным штаммам. У штамма А/Ленинград/3711/49 из коллекции НИИ гриппа, который определен как резистентный, в 31-см положении белка М2 также обнаружен "маркер" резистентности - а.к.о. Асн. Этот факт никак не может быть связан с применением химиопрепаратов, а является результатом спонтанного мутагенеза, имеющего место в вирусной популяции. Тем не менее, вероятность селективного давления на вирусную популяцию ремантадина в результате его использования в медицинской практике сохраняется. Подтверждением этому служит тот факт, что среди резистентных вирусов был обнаружен штамм А/Ленинград/203/85, являющийся по своим антигенным свойствам представителем доминирующих в этот период чувствительных вирусов H3N2, подобных эталону А/Филигаош/2/85.

Интересным представляется тот факт, что многие современные изоляты H3N2, Н1Ы1 и H0N1 по структуре белка М2 соответствовали вирусу A/PR/8/34 (рис.2).

Ito т. с соавторами (1991) был проведен сравнительный анализ 7-ого сегмента РНК, кодирующего белки М1 и. М2, 42-х штаммов вируса гриппа типа А различного происхождения. Было отмечено, что не нашлось ни одной пары вирусов, у которых бы совпадали структуры белка М2.

В связи с этим, выявленное нами абсолютное сходство аминокислотных последовательностей белка М2 у вирусов А/Монголия/128/86 И А/Москва/771/88 (Н1Н1), А/Свердловск/8347/82 и А/Ленинград/153/83 (H3N2), А/Монголия/113/89 и А/Монголия/148/88 (HON1) с белком М2 А/РЕ/8/34 позволяет говорить о том, что эти вирусы имеют одно и то же происхождение или общий ген-предшественник М2.

Известно, что высокорепродуктивный вирус A/PR/8/34 без учета его устойчивости к адамантановым препаратам широко использовался в нашей стране как "донор аттенуации" при создании убитых реассортантных гриппозных вакцин. Это может служить одним из объяснений, почему штаммы А/Монголия/128/86, А/Москва/771/88 антигенно родственны вышедшему из циркуляции штамму А/СССР/90/77 и имеют сходную первичную структуру гена М2 с лабораторным штаммом A/PR/8/34.

Исследоваоте_2стойчивых^

гриппа__типа__AL__полученных__при__пассировании__чувствительных

штшшов^в_присутствш_эта

В результате пассирования чувствительных штаммов А/Виктория/35/72 (K3N2) и А/СССР/90/77 (H1N1) в присутствии химиопрепаратов были получены устойчивые к mm варианты вируса. £ экспериментах тлн использовали: ремантадин, дейтифорин, адопромин, а так же комбинацию ремантадина и дейтифорина.

Для всех этих препаратов были получены устойчивые варианты вирусов с заменами (как правило с единственной заменой) в структуре гена М2, которые приводили к аминокислотным заменам в мембран-связанном домене белка М2 (рис.3).

При сравнении аминокислотных последовательностей белка М2 исходного штамма А/Виктория/35/72 (H3N2) и устойчивого к дсйти-форину варианта ЕГ оыли обнаружены три аминокислотные зам&ны: Гли->Глу, Ала->Вал, Мет-хйей в положениях 14, 30, 59 соответственно (рис.3).

В случае ремантадин-резистентного варианта также был выявлен ряд характерных замен. Изменения в структуре белка М2 ВГ были обнаружены в положениях 31 и 59. Они либо совпадет с заменами в дейтифорин-резистентном штамме вируса (положение 59 - идентичная по характеру замена Мет -> Лей), либо находятся в непосредственной близости от положения 30 (в 31 положении Сер -> Асн), где наблюдаются замены при формировании резистентности к дейтифорину.

При пассировании вируса гриппа А/Виктория/35/72 (H3N2) в присутствии ремантадина и дейтифорина одновременно был получен устойчивый вариант вируса, у которого в результате мутаций в гене М? произошли замены в структуре белка №2. Они обнаружены в 31 положении (Сер->Иле) и в 59 положении (Ме?->Лей).

В качестве другой модельной системы для изучения мутационных замен в гене и белке М2 ВГ мы взяли хорошо изученный и используемый в лабораторных исследованиях чувствительный к действию химиопрепаратов штамм а/СССР/90/77 (H1N1).

10 , 20 30 40

Виктория мбььтеуетр иадЕ»0СЕСЫГ©ЗБРЪ7УАА31 гспяъшгсыжш'к

Виктория/Б N

Виктория/В в V

Виктория/ВР I

СССР МБШГЕУЕТР 1МШ»ООЕСШ)ЗЗБРЬУУААЗ I К1ЬНЫЬ»1ЬСЕЬРРК

СССР/Я А

СССР/Б А

ссср/т N

СССР/А N

50 60 70 80 90

Виктория С1У1^РШаМКВСРЗТЕСУРЕЗМРЕЕУРКЕ005АУБАБШНРУ31ЕЪЕ

Виктория/1? Ъ

Виктория/О Ъ

Виктория/ЕС Ъ

СССР СI УЫЛУНОХККСРБТЕСУРЕБМНЕЕУЫСЕОСааУСАБСЗНРУТЯЕЬЕ

СССР/К

СССР/Б

СССР/И)

СССР/А

Рис. 3. Аминокислотные последовательности белка М2 чувствительных к химиопрепаратам штаммов вируса гриппа А/Виктория/35/72 НЗЫ2 и А/СССР/90/77 Н1Ы1 и лабораторных устойчивых вариантов, полученных при выращивании исходных штаммов в присутствии химиопрепаратов. Е-штаммы пассированы в присутствии ремантадина, в-штаммы пассированы в присутствии дейтифорина, РБ-штаммы пассированы в присутствии обоих препаратов, А-штаммы пассированы в присутствии адопромина.

При пассировании его в присутствии адопромина, дейтифорина, ремантадина и двух последних препаратов вместе были получены устойчивые варианты вируса. В результате сравнительного анализа аминокислотных последовательностей чувствительного и устойчивых штаммов (рис.3) обнаружены следувдие замены: в 27 положении у

ремантадин- и дейтифорин- устойчивых вариантов вируса валин заменен на аланин (Вал->Ала), а у варианта, полученного в присутствии обоих препаратов, в 31 положении вместо серина находится аспарагин (Сер->Асн). Эта же замена обнаружена у штамма, выделенного при использовании адопромина.

Таким образом, у всех устойчивых лабораторных вариантов ВГ обнаружены замены в транс-мембранной области белка М2.

Следовательно, использование химиопрепаратов с различной химической структурой для получения в лабораторных условиях устойчивых к ним штаммов приводит к появлению вариантов с аминокислотными заменами в транс-мембранном домене белка . М2, которые характерны и для природных устойчивых штаммов вируса.

!Ж!&_4_^Р§§истентности_к_рем^

На основании сравнительного анализа аминокислотных последовательностей белков М2 природных чувствительных к химкопрепаратам штаммов ВГ нами предложена обобщенная последовательность этого белка, в которой можно выделить функционально вачные участки (рис.4).

внеклеточная транс-мембранный внутриклеточная

часть белка | домен | часть белка

лейцин-зиппер * мотив

1 -МБЬЬТЕУЕТ-----те-С----ЭБОРЬ—ААЗНОНЛ-НШЬ—ыткс-шг-

* (-) ~ -сайт начального взаимодействия химиопрепарата

—О-К-СРЗТЕО-О-Р-БМгЕЕУ

Рис.4 Обобщенная аминокислотная последовательность белка иг природных чувствительных к химиопрепаратам штаммов вируса гриппа типа А.

Результатом обобщения полученных данных явилась модель возможного взаимодействия амантадина и транс-мембранного участка белка М2 {рис.5). В соответствии с этой моделью связь молекулы амантадина (и дру:их препаратов) с белком М2 осуществляется за счет гидрофобных взаимодействий неполярной части молекулы, которая погружена в мембрану, а также водородных и электростатических связей ез полярной части.

Для дальнейшей разработки модели взаимодействия белка М2 и химиопрепаратов мы исследовали вторичную структуру белка М2 вируса гриппа типа А и ее роль в резистентности к химиопрепаратам адамантанового ряда и дейтифорину.

В результате анализа первичной структуры белка М2 вируса гриппа А/Ленинград/156/83 (НЗЫ2), отличающегося естественной резистентностью к химиопрепаратам, установлено, что он содержит только ДЕе аминокислотные замены Про-25->Сер и Мет-59->Лей по сравнению с последовательностью М2 высокочувствительного к ремантадину штамма А/Виктория/35/72 (ИЗЮ (рис.6).

Замена Про-25->Сер локализуется в непосредственной близости к предполагаемому сайту связывания с адамантаном (26)-Лей-Вал-Вал-Ала-Ала-Сер-(31 )• Вторая замена встречается у многих других штаммов ВГ и, скорее всего, не изменяет функциональных и физико-химических свойств белка М2 и не влияет на чувствительность к химиопрепаратам. Поэтому в данном случае мы

22 Сер-он

23 Сео-ОН------Н^Н

Рис. 5 Область взаимодействия молекулы ремантадина с примем-бранной и внутримем-бранной областью белка М2 вируса гриппа А/Виктория/35/72 (НЗИ2).

а) А/Виктория/35/72

10 20 30 40

МЗЫ/ГЕУЕТР ТШЕУОСБСЫРЗБРРЬУУААЗ11С IIH.IiIbWiLDP.LFFK

АААААААА Т ТТТТТТ1ТТТТВВВВВЕВВВВВВАААААААААВТТ

50 60 70 80 90

СI УКРРЕНСМКРОРбТЕИГтУРЕбМРЕЕУРКЕООВАУРАЬЮНРУв I гХБ ТТАААААА ТТ Т ТААААААААААААААТТ АААААААА

ъ) А/Ленинград/156/83

10 20 * 30 40

МБЫ/ТЕУЕТРIRNEWGCRCNDSSDSLWAASI IGILHLILWILDRLI'FK ;!1ААААААА х ТТТТТТТТТТТАААААААААААААААААААААВТТ

50 60 70 80 90

С1УВГЕЕНСЬКРОРЗТЕа^ЕБ»ЖЕЕУЕКЕООЗАУМБЬЗНЕУ81Е1Е ТТАААААА Т1 Т ТААААААААААААААТТ АААААААА.

Рис. 6 Вторичная структура бежа М2 штаммов вирусов гриппа А/Виктория/35/72 (а) и А/Ленинград/156/83 (Ъ). Первичная структура в однобуквенном коде. Обозначение типов вторичной структуры: А -а-спираль, Е- р-структуры, Т-поворот или релаксирсванная структура.

имеем идеальный вариант для анализа роли замены Про-?5->Сер, определяющей изменения, прежде всего, вторичной структуры околомембранной части бежа М2. Установлено, что в чувствительном штамме ВГ именно в этой части формируется угол перехода случайной спирали, не имеющей признаков а-спирали или /з-структуры, в жесткую р-структуру, характерную для вирусных белков в районах, контролирующих самосборку вирусных частиц.

Вторичные структуры белка М2 штаммов А/Виктсрия/35/72, чувствительного к химиопрепаратам, и резистентного А/Ленинград/156/83 показаны на рис.б.

Как видно из представленных денных, после остатка Про-25 у штамма А/Виктория/35/72 наблюдается протяженная область Р-структуры, охватывающая фактически половину гидрофобного домена, пронизывающего мембрану (рис.6). Короткий «-спиральный

участок начинается с Гис-37 и продолжается до очередного поворота спирали на аминокислотных остатках Асп-44 и Арг-45, расположенных на границе трансмембранного и цитоплазматического доменов белка М2. Эта область представляет значительный интерес. Как показали расчеты, большинство аминокислотных замен, встречающихся у устойчивых к химиопрепаратам штаммов, не изменяют вторичную структуру (а-спираль) в этом участке.

На основании данных по устойчивости к химиопрепаратам штамма А/Ленинград/156/83 можно сделать вывод о том, что ОН-группа Серина-25 белка М2, даже казалось бы в столь идеальном положении, как начало гидрофобного домена и сайта связывания адамантана, не играет существенного значения. во взаимодействии с препаратами адамантанового ряда.

Второе обстоятельство, а именно, отсутствие жесткой р-структуры в этом районе у штамма А/Ленинграя/156/83 (рис.6), кажется более важным в формировании резистентности к химиопрепаратам, чем ранее описанные мутационные замены, меняющие гидро-фобность или вносящие в боковые цепи аминокислотных остатков аминогруппы вместо гидроксила серина в 31-ом положении.

По данным анализа вторичной структуры можно предположить следующее значение функциональных участков в формировании димера: область поворота и случайной спирали, в которой находятся остатки Цис-17 и Цис-19, закручивается в гомодимере, так как эти остатки расположены по разные стороны спирали. Формирование двух сульф-гидрильных связей требует закручивания релаксированных областей друг на друга с образованием в этом районе двух Б-Б-ковалентных шпилек и жестких углов у основания обеих спиралей. Это делает область М2 бежа, начиная с Асн-20 и по Про-25, мало доступной для стереохимических взаимодействий. Резкий поворот с формированием жесткого угла в начале транс-мембранного фрагмента предполагает существование в ¡этой р-структурной части белка ( от Про-25 до Иле-33 или Иле-35) небольшой полости. Район гидрофобного мембранного фрагмента, который начинается с этих аминокислотных остатков (Иле-33), отличается своеобразной структурой перехода в а-спираль. Такая структурная организация данного участка сохраняется для всех штаммов Еируса гриппа типа А. Отмечена высокая консервативность данного участка.

А.

1 г

Б.

г

22 S

23 S

24 D -25 Р 26

27

28 29

# 30

# 31

-(Р)-

КЛЕТОЧНАЯ ПОВЕРХНОСТЬ

«Leu*

•Val*

(А)

32

33

34

35

36

37 Н

38 Ъ

39 I

40 L

41 W

42 I

43 L -44 D-

45 Е

46 L

47 F

48 F

49 К

Val*

♦ S •Не»

(А)

Не* * . *

* * .* G « * »Не» Leu*.* *

* *.* * н

» *.* »Leu*

* *IIe* * * * Leu* *. * * ♦

» * * »Trp*

* *.*Ile*

Leu* *

-----* * *------о-----

R

* *Leu*

Phe* *

*Phe«

«Val МЕМБРАНА

(А) .* КЛЕТКИ . *

-. *—i

*Ile Не* *. * *. ■ * *.

Leu* ♦ »

* «

* *Ile

«Leu* * * *

* » *

«Leu*

-« , *—

« . ♦

* »Leu •Phe*.*

* *. *

К

Рис.7 Топологическое распределение аминокислотных остатков в транс-мембранном домене белка М2 вируса гриппа А/Виктория/35/72. Аминокислоты, составляющие сайт связывания с адамантановым кольцом, отмечены-*.

A. Аминокислотная последовательность транс-мембранного домена белка UZ

Б. Распределение аминокислотных остатков в транс-мембранном домене белка М2. ** - связи между аминокислотными остатками, обеспечивающими формирование а-спирали

B. Остатки Leu и Ile-, составляющие лейцин-зиппер мотив.

По-видимому, остатки лейцина и изолейцина, в составе лейцин-зиппер мотива, взаимодействуют в тетрамере белка м2 и формируют прочную надмолекулярную структуру (Рис.7), так как эти "ребра" обращены ближе к наруяйой стороне полости канала.

Таким образом, для малой молекулы ремантадина, имеющей около 6,5 А в диаметре, мы находим только одну область интеркаляции в структуре транс-мембранного образования, сформированного белком

В

s

S

*

М2 - это полость, ограниченная последовательностями: 25-Про-Лей-Вал-Вал-Ала-Ала-Сер-31. Она напоминает ворота ионного канала, а ремантадин, амантадин и дейтифорин, по-видимому, являются антагонистами этого ионного канала, они блокируют его прямо у входа в мембрану (рис. 8).

Рис.8 Модельное представление интеркаляции аман-тадина в канал тетра-мера белка М2 вируса гриппа А.

На модели видно 4 жестких Р-структурных домена и молекулу амантадина. Молекула лигавда не имеет какой-либо прочной

стабилизации в канале .

Замена Про-2Ь->Сер в белке М2 у штамма А/Ленинград/156/83 приводит к образованию устойчивой а-спирали и делает канал фактически бесполостным, в результате чего объемный лиганд не проникает в ионный канал и не достигает участка связывания. По-видимому, простейшие производные адамантана можно отнести к антагонистам типа лигандов с подвижной ориентацией в узкой полости транс-мембранного канала без стабильного связывания с отдельными функциональными группами боковых цепей аминокислотных остатков. Таким образом, компактные молекулы антивирусных препаратов (ремантадин, амантадин и дейтифорин), являясь слабыми диполями, свободно вращаются в полости канала в непосредственной близости от мембранной поверхности и , таким образом, нарушают функционирование данного ионного канала.

МодежроЕаше ^торитаой_структ^

генома_вир^са_гриппа^

Нами была исследована точная локализация нуклеотидных замен в участке гена М2 с 786 по 842 нуклеотид (нумерация по "+" цепи

7-ого сегмента), который кодирует транс-мембранный домен белка М2. На основании обобщения имеющихся данных и вновь полученных результатов предложена возможная вторичная структура РЖ этого сегмента.

Наше внимание привлекли, во-первых, повышенная изменчивость предполагаемого функционально важного участка между 790-820 и 870-890 нунлеотидачи, во-вторых, наличие высоко консервативных районов 740-790, 820-860, 920-950 и 970-1010 (по структуре комплементарной РНК) (рис.9), нукл. отличия

Рис. 9 Сравнительный анализ нуклеотидных отличий в участке 7-го сегмента вируса гриппа типа А, кодирующего белок М2, между устойчивыми и чувствительными к химиопрепаратам штаммами. В — чувствительные штаммы 1 - устойчивые штаммы

Для 7-го сегмента РНК вируса гриппа типа А наиболее консервативные в эволюционном плане структурные элементы обнаружены в участке, кодирующем белок М2. В некоторых случаях соответствующие участки РНК формировали стабильные структуры как на "+", так и на "-" цепях, что подтверждалось также существованием компенсаторных ковариантов этих структур у различных штаммов вирусов (рис.Ю). Для вирионной РНК человеческих штаммов стабильные структуры были обнаружены между нуклеотидами 164-208 (соответствующими нуклеотидам 820-864 по комплементарной РНК), что приходится на одну из наиболее консервативных частей молекулы РНК. Рядом с этим участком располагается высоковариабельная последовательность (рис.11).

Обнаруженные консервативные структуры (рис.Ю) дают возмож-

ю-9 -

О —

700

800

900

, , нуклеотиды 1000 ' по кРНК

А. "+" chain

967-976 985-994

av, sw wsn U

u

♦ Cp

967-AUGCUGACGA IIIIIIII»I

994-UACGACUGUUTT

♦ U

A

wsn av-sw

*H1

G" U-»g sw

С

"-" chain

34-4i__54=6l

H1 av, sw wsn U

34-AUGCUGAC IIIIIIII 61-UACGACUG^

A

wsn av>sw

А А А

U G *

а

U

G

А-»с sw

С»

a av

U

В.

"+" chain

169=776__792г799 av

sw PR G G

769-GCAACGAU-776

XIIII»I* 799-CGUUGUUG-792

+

С

sw

¿1

PR *

С A

Л

PR, wsn av, sw

769-GCAA-772

IIII 799-CGW-796

773-CGGU-776

IIII 801-GCCG-798

WSN-like

PR-like

Рис.10. Рассчитанные консервативные структуры на участке 7-го сегмента РНК, кодирующего белок М2, на примере вируса гриппа А/Виктория/35/72. Нумерация нуклеотидов дана по полноразмерному сегменту от 5'-конца.

A. Консервативные структуры, предсказанные для комплементарной (+)— , и вирионной (-)-цепей 7-ого сегмента РНК. Нуклеотидные замены, обнаруженные у штаммов ВГ человека, птиц и свиньи показаны буквами: А,и,С,С - компенсаторные коварианты; а,и,с^, -изменения, нарушающие комплементарность оснований.

B. Возможные структуры, предсказанные для комплементарной (+)-цепи 7-ого сегмента РНК человеческих штаммов вируса гриппа, устойчивых к химиопрепаратам.

и

132

в и

С А

С-С Ав =

и-А и-А С-С

С-С-128

II СССисиОТиСАиАСССТ!СииСАААСААиСОАиАСА

АССАЦСААСААЦС С С

А А

А С

А А

А А

А и.

А А ** 172-А-и-200 С С-С и-А и-А

и*с

А-и С-С С-С 1б4-и-А-208

1 1

ттГА

А О

А

с«~»и

—>А«-К3 А*-*С С«-»и

А А С в

АОАиСССААШАиАСиСОСА

I 1 II I

ва Ц и ил в

в Аи

с I п 1 II I ш *

А с ВМ, А О Свв в аи

и«—»С ли а

О С

а<->и >А

и

С

а-100

Рис. 11. Вторичная структура 5'-области (-)-цепи 7-го сегмента РНК штаммов вируса гриппа типа А человека (на примере нуклеотид-ной последовательности штамма А/Виктория/35/72), кодирующая

СООН-часть белка М2.

Строчными буквами обозначены нуклеотидные заметь встречающиеся у человеческих штаммов.

К, и. б. С - буквы, соответствующие нуклеотидным заменам у устойчивых штаммов вируса гриппа.

—» - местоположение уникальных замен, существенных для штаммов, устойчивых к химиопрепаратам; |—> «—| - нуклеотины, кодирующие мембран-связанный домен

^елка М2.

ность установить Функциональную роль соответствующих последовательностей РНК. Показано, что большинство нуклеотидных замен происходит на границах перехода эволюционно консервативных двух-цепочечшх структур в одноцепочечные. Определенная взаимосвязь между гипервариабельностью и вторичной структурой РНК показана и для Н1У-1: наиболее консервативные участки вирусного генома формируют закрытые (шпилечные) структуры. Консервативные,

высокоэнергетические спиральные структуры, предсказанные для цепи (вРНК) 7-го сегмента ВГ (рис.ю), расположены между двумя наиболее вариабельными участками, включая последовательность 790-820 н. (по кРНК), изменения в которой приводят к приобретению признака устойчивости к химиопрепаратам.

Можно предположить, что функциональная важность трансмембранного домена белка М2 накладывает некоторые ограничения на замены в нуклеотидкой последовательности гена М2, которые могут происходить в соответствии с тенденцией полимеразного комплекса совершать ошибки в данном участке.

Как было сказано выше, замена Cep-31-Асн в белке М2 является достаточной для появления вируса гриппа с фенотипом, устойчивым к аминоадамантановым химиопрепаратам. Отсутствие взаимодействия с химиопрепаратами у этих штаммов тесно коррелирует с низким значением ионного тока для сформированных белком М2(31Асн) каналов (Pinto L.H. et al. 1992). Можно полагать, что такие замены приводят к изменению структуры тетрамера М2, а это, в свою очередь, определяет изменение функциональной активности этого канала и, как следствие, химиопрепараты перестают оказывать свое действие. Последствия этой мутации на созревание вирусного гемагглютинина и на другие процессы в период развития вируса в клетке пока остаются неясными.

Нами било проведено моделирование тетрамерного канала М2 в мембране клетки. В настоящее время на основании этой модели проводятся работы по конструированию высокоспецифических препаратов, которые содержат различные реакционноспособные группы для взаимодействия с различными аминокислотными остатками в участке взаимодействия с химиопрепаратами.

В соответствии с нашей гипотезой замена Cep-31-Асн определяет появление вирусных штаммов с низким потенциалом репликации и в дальнейшем, возможно, приводит к исключению этих вариантов из пула активно циркулирующих вирусов гриппа типа А. Таким образом, можно полагать, что широкое использование химиопрепаратов для лечения и профилактики гриппа не приводит к генерированию устойчивых вариантов вирусов, способных вызывать эпидемии, как считалось ранее.

Выводы

1. Определена первичная структура гена М2 двадцати одного штамма Еируса гриппа типа А, как устойчивых, так и чувствительных к химиопрепаратам адамантанового ряда.

2. Показано, что в лабораторных условиях возникновение устойчивых к химиопрепаратам вариантов вируса гриппа - типа А связанно с мутациями в гене М2, происходящими в области, кодирующей начало транс-мембранного участка белка М2.

3. Среди эпидемических вирусов гриппа типа А, выделенных в бывшем СССР и Монголии, обнаружены штаммы подтипов Н1Ы1 и НЗК2 устойчивые к ремантадину, ацопромину и дейтифорину. Исследованные штаммы содержали аминокислотные замены в белке М2, характерные и для вариантов вируса гриппа, полученных в лабораторных условиях пассированием в присутствии этих препаратов.

4. Установлено, что нуклеотидная последовательность гена М2 некоторых природных устойчивых изолятов вируса гриппа полностью соответствует первичной структуре гена М2 лабораторного штамма А/РК/8/34. Происхождение этих изолятов может быть связано с использованием для вакцинации населения штаммов, производных от А/РК/8/34.

5. Предложена модель взаимодействия химиопрепаратов адаманта-нового ряда с вирусным белком М2, согласно которой такие химиопрепараты подвижно ориентированы в полости канала, сформированного тетрамером белка М2. При этом происходит гидрофобное взаимодействие лиганда с белком без жесткой фиксации адамэнтана. У устойчивых вариантов вируса нарушается внедрение химиопрепаратов в канал, что является результатом изменения структуры участка взаимодействия.

6. На основании анализа нуклеотидных последовательностей 7-го сегмента РНК, кодирующего белки М1 и М2 вирусов гриппа типа А, предложена вторичная структура этого сегмента. В ней обнаружены консервативные (шпилечные, петлевые) и вариабельные участки. Основные зарегистрированные различия структур сосредоточены вне шпилечных (петлевых) районов; следовательно, большинство нуклеотидных замен происходит вне консервативных участков РНК.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. В.М.Блинов, С.М.Ресенчук, В.А.Каргинов, В.П.Мишин, К.Н.Козелецкая, чл.-корр. АН СССР Л.С.Сандахчиев, О.И.Киселев Исследование молекулярных механизмов селекции штаммов вируса гриппа по признаку лекарственной устойчивости // Доклады Академии наук СССР, 1991, 319, 1480-1484.

2.О.И.Киселев, В.П.Мишин, В.И.Ерошкин, В.И.Руденко, В. А.Каргинов, К.Н.Козелецкая, Е.В.Усова, О.Н.Чупахин Вторичная структура белка М2 вируса гриппа типа А и его роль в резистентности к ремантадину и дейтифорину // Молекулярная биология, 1994, Т.28, N5, С. 1009-1013

3. K.N.Kozeletskaya, V.A.Karginov, O.I.Kiselev, V.P.Mishin, E.B. Greenbaum, V.V. Burmistrova. Antiviral drug resistance of natural isolates of influenza A viruses. 17-th International Congress of Chemotherapy, Berlin, June 23-28, 1991, Abstracts 1511.

Подписано к печати 20.03.95

Формат бумаги 60x84-1/16 печ.л. Объем I печ.л.

Заказ 21 Тираж 100 экз.