Механизм вирусспецифического действия препарата Арбидол

Ленева, Ирина Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизм вирусспецифического действия препарата Арбидол
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Механизм вирусспецифического действия препарата Арбидол"

На правах рукописи

JIEHEBA Ирина Анатольевна

МЕХАНИЗМ ВИРУССПЕЦИФИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТА АРБИДОЛ

03.00.06- вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург -2005

Работа выполнена в Центре по химии лекарственных средств-Всероссийском научно-исследовательском химико-фармацевтическом институте (ФГУП ЦХЛС-ВНИХФИ)

Научный консультант

член-корреспондент РАМН, профессор, доктор медицинских наук Гуськова Татьяна Анатольевна

Официальные оппоненты

академик РАМН, профессор, доктор медицинских наук Ершов Феликс Иванович

академик РАМН, профессор, доктор медицинских наук Зверев Виталий Васильевич

доктор биологических наук Еропкин Михаил Юрьевич

Ведущая организация ГУ НИИ вирусологии

им. Д.И.Ивановского РАМН

Защита состоится <$>> 2005 года в часов на заседании

диссертационного совета Д001.043.01 при ГУ НИИ гриппа РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург,ул. Попова, 15/17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ гриппа РАМН Автореферат разославя^^££^2005 г. Ученый секретарь

диссертационного совета Д 001.043.01

кандидат медицинских наук р( Лобова Тамара Геннадьевна

ITëZr

сМвУ-УЗ y

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Грипп является острым респираторным заболеванием, наносящим значительный ущерб здоровью людей и приводящим к огромным экономическим потерям. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, каждый год во время эпидемий болеет от 5 до 15% населения, и по приблизительным оценкам, в целом в мире смертность от гриппа достигает 250 ООО - 300 ООО случаев в год, преимущественно среди людей пожилого возраста или страдающих хроническими заболеваниями. По оценкам Центра Контроля и Профилактики Заболеваний в Атланте, каждый год в США от гриппа и осложнений после него умирает в среднем 36000 человек и госпитализируется около 90 000 человек, а ежегодный экономический ущерб от эпидемий гриппа оценивается в пределах от 71 до 167 миллиардов долларов США. В России на протяжении последних 10-15 лет ежегодно регистрируется от 27,3 до 47, 2 млн. случаев заболеваний ОРВИ, причем удельный вес гриппа в структуре ОРВИ колеблется от 25 до 60% в зависимости от интенсивности эпидемий и пандемий гриппа. Поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин и нейраминидаза подвергаются постоянным изменениям (антигенный дрейф), приводящим к последовательному вытеснению из популяции людей ранее циркулировавших штаммов вируса гриппа А. В случае реассортадии между штаммами вируса гриппа А человека, млекопитающих и птиц (шифтовые изменения) могут возникать новые пандемические вирусы гриппа типа А. Вспышка заболевания гриппом среди людей в Гонконге в 1997 г., вызванная вирусом гриппа птиц подтипа H5N1, беспрецедентные эпизоотии, вызванные в последнее время вирусами гриппа птиц, в частности в России, а также участившиеся случаи заражения этими вирусами людей в странах Южной и Юго-Восточной Азии, сопровождавшиеся необычайно высокой смертностью, вызывают оправданные опасения, что эти события могут стать началом новой пандемии гриппа. Чрезвычайная изменчивость поверхностных белков вируса гриппа А является причиной, из-за которой может снижаться эффективность вакцинации, рекомендованной в настоящее время Всемирной Организацией Здравоохранения в качестве основного средства борьбы против гриппа. При появлении новых штаммов, содержащих измененные поверхностные антигены, предшествующий гуморальный иммунитет оказывается недостаточным. Как показывает опыт, для создания, тестирования на безопасность и распространения в достаточном количестве эффективной вакцины к такому вновь возникшему штамму вируса гриппа требуется около 6 месяцев. Этот промежуток времени является чересчур длительным в условиях приближающейся эпидемии гриппа. Кроме того, вакцинация не всегда эффективна у людей пожилого возраста, у пациентов, страдающих хроническими заболеваниями и нарушениями функций иммунной системы. В связи с

вышеизложенным особую важность и актуальность приобретает проблема разработки и применения препаратов для лечения и профилактики гриппа. Арсенал средств, используемых для этих целей, охватывает практически все возможные способы влияния на инфекционный процесс и включает в себя средства иммунокоррегирующей, патогенетической и симптоматической терапии, вирулицидные препараты, однако ведущее место принадлежит препаратам этиотропного действия, оказывающим непосредственное воздействие на вирусную репродукцию. К настоящему времени в мире и в России для лечения и профилактики гриппа широкое применение получили несколько групп таких препаратов. К первому поколению относятся препараты адамантанового ряда: амантадин и ремантадин. Однако их использование ограничено отсутствием активности в отношении вирусов гриппа В, наличием серьезных побочных эффектов и возможностью возникновения резистентных к ним штаммов вируса гриппа. К препаратам второго поколения относятся ингибиторы нейраминидазы: применяемый в виде ингаляций или аэрозольного спрея занамивир и используемый в виде капсул или таблеток озельтамивир. Наряду с высокой стоимостью этих препаратов к их недостаткам относятся побочные эффекты в виде раздражения носоглотки при приеме занамивира и в виде тошноты и рвоты при приеме озельтамивира. Из вышесказанного следует, что существующие препараты не являются идеальными, в связи с чем сохраняется необходимость создания новых с отличным от них механизмом действия. Совместными усилиями ученых Центра по химии лекарственных соединений - Всероссийского научно-исследовательского химико-фармацевтического института, Научно-исследовательского института медицинской радиологии РАМН (г.Обнинск) и Ленинградского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Пастера был разработан оригинальный препарат арбидол, рекомендованный

Фармакологическим Комитетом Минздрава России для лечения и профилактики гриппа А и В у взрослых и детей. Клинические испытания, проведенные более чем на 10000 пациентах, а также опыт почти 15-летнего использования в медицинской практике свидетельствуют об эффективности и безвредности арбидола и отсутствии у него побочных эффектов. Высокая терапевтическая эффективность этого представителя из класса индола является результатом разнообразия его биологической активности и обусловлена иммуномо дулирукяцим, интерферониндуцирующим, антиоксидантным и вирусспецифическим действием. Если иммуномодулирующие,

интерферониндуцирующие и антиоксидантные свойства арбидола изучены довольно подробно, наличие вирусспецифического действия у арбидола до сих пор вызывало сомнение у ряда специалистов. Изучение вирусспецифического действия арбидола, его механизмов целенаправленно не проводилось, а

касавшиеся этого вопроса данные имели поверхностный характер и были недостаточно аргументированы. Доказательство наличия у арбидола вирусспецифического действия и выявление вирусспецифической мишени, на которую направлено это действие, являлось принципиально важным для того, чтобы поставить арбидол в один ряд с препаратами адамантанового ряда и ингибиторами нейраминидазы. Это определяло актуальность данной проблемы, решение которой позволило получить новую необходимую информацию о противовирусных свойствах арбидола для оптимизации его применения в клинической практике. Доказательство и установление механизма вирусспецифического действия арбидола также может способствовать его более широкому применению и завоеванию достойного места в ряду фармацевтических препаратов.

Целью исследования являлось изучение механизма вирусспецифического действия арбидола в отношении вируса гриппа, определение вирусспецифической мишени, на которую направлено это действие, а также углубленное изучение особенностей вирусспецифической активности, отличающей арбидол от других противогриппозных препаратов. Задачи исследования:

2.0пределение спектра противовирусного действия арбидола в культуре клеток в отношении других вирусов, вызывающих респираторные инфекции.

3.Определение стадии вирусной репродукции, на которую направлено действие арбидола, и выявление точки приложения его действия (вирус-специфической мишени).

4,Выяснение возможности формирования у вирусов гриппа мутантов, резистентных к арбидолу, подтверждение их резистентности, изучение их свойств, а также определение генетической основы резистентности к арбидолу.

5.Изучение действия арбидола на репродукцию вируса гриппа А в культуре клеток в комбинации с противогриппозными препаратами, имеющими отличный от арбидола механизм действия, а также совместно с симптоматическими средствами.

Научная новизна исследования. 1. Впервые показано отсутствие у арбидола штаммовой специфичности в отношении трех антигенных серотипов вирусов гриппа А человека: НШ1, Н2Ы2, Н3№, наличие активности в отношении вирусов гриппа птиц подтипа

H5N1 и H9N2, вшвавших гриппозную инфекцию у людей, и в отношении ремантадинрезистентных штаммов вирусов гриппа.

2. При изучении широты спектра противовирусного действия арбидола впервые установлена способность арбидола ингибировать в различных клеточных культурах репродукцию вируса гриппа С, аденовируса, респираторно-синцитиального вируса (PCB).

4. Впервые идентифицирована стадия вирусной репродукции, ингибируемая арбидолом. Установлено, что арбидол ингибирует слияние липидной оболочки вируса с мембранами эндосом, происходящее внутри клеток. Показано, что арбидол не оказывает воздействия на адсорбцию, транскрипцию и трансляцию, а также нейраминидазную активность вируса гриппа.

5. Среди 47 изученных производных арбидола из ряда 5-оксииндолов выявлено 17 соединений, обладающих противовирусной активностью в отношении вируса гриппа А. Впервые в химическом ряду 5-оксииндолов выявлены соединения, подобно арбидолу ингибирующие эндоцитоз вируса гриппа А. Впервые в химическом ряду 5-оксииндолов выявлены соединения с противовирусной активностью в отношении PCB. Из 7 соединений, изученных в отношении их способности ингибировать репродукцию PCB в культуре клеток, было выявлено 4 соединения с активностью на уровне арбидола.

6. Впервые путем многократных пассажей в клеточных культурах получены и охарактеризованы вирусные мутанты, резистентные к арбидолу, и изучены молекулярно-биологические основы резистентности к нему. Впервые показано, что вирусным белком, на который направлено действие арбидола и который определяет чувствительность к нему, является гемагглютинин (НА) вируса гриппа. Все мутанты, резистентные к арбидолу, имели аминокислотные замены только в субъединице НА2 НА мутантаых вирусов гриппа и индуцировали слияние липидной оболочки вируса с клеточными мембранами при более высоком pH, чем вирус дикого типа. Арбидол не вызывал конформационных изменений у НА резистентных мутантов, в то время как его добавление к НА вируса дикого типа вызывало сдвиг конформационного перехода НА.

ингибирующий эффект при комбинированном действии арбидола с каждым из изученных препаратов был получен при использовании их низких концентраций, а при комбинированном действии с ингибиторами нейраминидазы также и при более позднем добавлении арбидола к клеткам. 8. Впервые изучено совместное действие на репродукцию вируса гриппа А арбидола с применяемыми в качестве симптоматических средств анальгином и ацетилсалициловой кислотой и показано, что добавление этих препаратов не снижало ингибирующего действия арбидола на вирусную репродукцию в культуре клеток.

Научно-практическая значимость исследования:

1. Данные о наличии у арбидола активности в отношении различных антигенных серотипов и ремантадинрезистентных штаммов вирусов гриппа А человека, а также в отношении вирусов гриппа птиц подтипа H5N1 и H9N2, вызвавших заболевания людей, являются экспериментальным основанием для его назначения во время вспышек и эпидемий гриппа, вызванных такими вирусами.

2. Данные об ингибировании арбидолом в клеточных культурах репродукции вируса гриппа С, аденовируса, PCB могут служить обоснованием для использования арбидола как этиотропного препарата в отношении инфекций, вызванных этими возбудителями.

3. Выявление стадии репродукции вируса гриппа, ингибируемой арбидолом, получение резистентных к нему мутантов и установление молекулярно-биологических основ резистентности к арбидолу являются доказательством наличия у него вирусспецифического действия, по механизму отличающегося от действия известных противогриппозных химиопрепаратов, и дают полное основание отнести арбидол к этиотропным препаратам так называемой первой линии защиты против гриппозной инфекции.

4. Данные об увеличении эффективности действия в культуре клеток противогриппозных препаратов при сочетанном использовании их с арбидолом открывают перспективу для их клинического изучения при комбинированной терапии гриппозной инфекции и их следует учитывать при разработке доз и схем лечения при комбинированной терапии гриппа в целях более рационального и в то же время эффективного использования этих препаратов в клинической практике.

обнаружение среди них соединений, способных так же, как и арбидол, ингибировать эндоцитоз вируса гриппа, открывает новое направление в химиотерапии вирусных инфекций и делает перспективным дальнейший поиск новых противовирусных препаратов в этом ряду. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Арбидол обладает широким спектром противовирусной активности, ингибируя репродукцию трех основных антигенных серотипов ШШ, Н2Ш, НЗЫ2 и ремантадинрезистентных вирусов гриппа А человека, вирусов гриппа птиц подтипов НА Н5, Н9 и Н6, вызвавших заболевания людей или имеющих общие или близкородственные с ними гены, вирусов гриппа В и С, а также респираторно-синцитиального вируса и аденовируса в культуре клеток.

2. Арбидол ингибирует стадию слияния липидной оболочки вируса с мембранами эндосом и не влияет на адсорбцию вируса гриппа и его нейраминидазную активность, а также на вирусную транскрипцию и трансляцию.

3. Впервые получены мутанты, резистентные к арбидолу, все из которых, имели аминокислотные замены в различных положениях субъединицы НА2 НА вируса гриппа. Арбидолрезистентные мутанты индуцируют слияние липидной оболочки вируса с клеточными мембранами при более высоком рН, чем вирус дикого типа, и при добавлении к ним арбидола у них не происходит сдвига информационного перехода, наблюдаемого у вируса дикого типа.

4. Арбидол - этиотропный препарат, вирусспецифической мишенью которого в цикле вирусной репродукции является НА вируса гриппа. Арбидол, взаимодействуя с НА, увеличивает его стабильность к конформационным изменениям, индуцируемым низким рН и необходимым для осуществления слияния липидной оболочки вируса с мембранами эндосом.

5. Комбинированное использование арбидола с каждым из противовирусных препаратов - амантадином, ремантадином, карбоксилатом озельтамивира, рибавирином и рибамидилом усиливает их эффект на репродукцию вируса гриппа А в культуре клеток по сравнению с эффектом, оказываемым каждым из этих препаратов в отдельности.

6. Химический ряд производных 5-оксииндолов является перспективным для поиска новых препаратов, обладающих противовирусной активностью.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены соискателем в виде докладов и стендовых сообщений на X, XII и Х1П Международных конгрессах по вирусологии в 1996, 2002 и 2005 г.г., на VI, VII, VIII и XVIII Международных конференциях по антивирусным исследованиям в 1993, 1994, 1995, 2005 г.г., на XVIII Конференции Американского общества

вирусологов в 1999 г., на международной конференции "Актуальные вирусные инфекции-теоретические и практические аспекты" в Санкт-Петербурге в 2004 г., на коллоквиумах и заседаниях Ученых советов ФГУП ЦХЛС-ВНИХФИ, а также в отчетах НИР ФГУП ЦХЛС-ВНИХФИ.

Публикации. По результатам исследований опубликовано 27 работ, из них - 12 статей в ведущих и реферируемых российских научных журналах, 5 статей в международных журналах и 10 тезисов докладов на международных конференциях.

Структура диссертационной работы. Работа изложена на ^Зстраницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, состоящий из трех глав, материалы и методы, результаты, состоящие из 8 глав, обсуждение, общее заключение, выводы и список литературы. В диссертационной работе представлено JL$ рисунков и JZJ? таблиц. Список цитируемой литературы включает 234 публикации отечественных и зарубежных авторов. Основные результаты, представленные в работе, получены самой И.А.Леневой и сотрудником лаборатории экспериментальной химиотерапии бактериальных и вирусных инфекций И.Т.Федякиной под руководством соискателя, а также в совместных исследованиях с сотрудниками ЦХЛС-ВНИХФИ проф., д.б.н. Н.И.Фадеевой и членом-корреспондентом РАМН, проф., д.м.н. Т.А.Гуськовой, сотрудниками отдела вирусологии Института медицинских исследований (Лондон, Великобритания)

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусы и клетки. В работе использовали однослойные перевиваемые культуры клеток почки эмбриона собаки MDCK, клетки человека линий Нер-2, HeLa, Vero, суспензионные культуры лимфобластоидных клеток Raj i и Namalwa, а также первичную трипсинизированную культуру фибробластов куриных эмбрионов (ФЭК). В опытах использовали лабораторные штаммы вирусов гриппа А, В и С человека, депонированные в музее ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН. Вирусы А/Сингапур/1/57 (H3N2), чумы птиц А/ВЧП/Вейбридж (H7N7) и реассортанты между ними, а также амантадинрезистентные и норакинрезистентные штаммы, полученные из вируса А/ВЧП/Вейбридж, были взяты из хранилища вирусов Всемирной Лаборатории по гриппу ВОЗ в Национальном Институте Медицинских Исследований (Великобритания, Лондон, Mill Hill). Вирусы гриппа А/Гонконг/156/97 (H5N1) и А/Гонконг/1074/99 (H9N2), изолированные от людей, а также вирусы А/Цесарка/Гонконг/С1/97 (H9N2) и A/yTKa/T0HK0Hr/W312/97, изолированные от птиц в Гонконге, являются собственностью отдела вирусологии детской клиники Сент-Джуд ( Мемфис,

США), и все эксперименты с ними проводились в специальных помещениях этого отдела, относящихся к 3 уровню безопасности. Вирусы гриппа А/У тка/Приморье/2633/01 (H5N3), А/Утка/Приморье/2621/01 (H5N2) и А/Утка/Алтай/1285/91 (H5N3), изолированные от диких птиц на территории России, и вирусы гриппа А/Ярославль/8/04 (H3N2), А/Гомск/27/04 (H3N2), В/Москва/1/02, изолированные в периоды эпидемических подъемов заболеваемости сезона 2002-2004 г., являются собственностью ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. В работе использовали вирусологические методы культивирования, накопления и характеристики вирусных препаратов.

Препараты и химические соединения. В работе изучались арбидол и 47 оригинальных химических соединений (производные индола), синтезированные в ЦХЛС-ВНИХФИ, а также препараты амантадин, ремантадин, рибавирин (фирма ICN, США), его отечественный аналог рибамидил, занамивир (фирма Glaxo Wellcome), карбоксилат озельтамивира (фирма Hofiman La Roche), ацетилсалициловая кислота, анальгин.

Изучение противовирусной активности препаратов и соединений. Изучение противовирусной активности препаратов и соединений проводили с использованием методов ингибирования цитопатического действия вирусов (ЦПД), бляшкообразующей активности (БОА) и метода иммуноферментного анализа (ИФА), модифицированного для определения противовирусной активности соединений в культуре клеток. MDCK клетки выращивали в 96-луночных планшетах до полного монослоя, после чего инфицировали вирусами с множественностью заражения от 10 до 100 БОЕ на клетку или от 0,1 до 1 БОЕ на клетку соответственно в одноцикловых и многоцикловых опытах в присутствии изучаемых препаратов или соединений. Кроме особо оговоренных случаев, препараты к клеткам добавлялись за 30-60 минут до их инфицирования. После 17 часов инкубации при температуре 37° С в атмосфере 5% С02 в многоцикловых или 6 часов в одноцикловых опытах клетки фиксировались и определялся уровень экспрессии вирусных антигенов, как описано Grambas et al.(1992). Для тестирования противовирусной активности соединений использовались моноклональные антитела (к внутренним белкам вируса гриппа АиВв разведении 1:1000, к белку F PCB и внутренним белкам аденовируса в разведении 1:500), политональная сыворотка (к вирусу гриппа С в разведении 1:100), а также IgG кролика против IgG мыши, меченные пероксидазой хрена в разведении 1:1000. Оптическую плотность (ОП) измеряли на автоматическом спектрофотометре при длине волны 492 им при использовании ортофенилендиамина (ОФД) или при длине волны 450 нм с использованием 33у55 тетраметилбензидина (ТМБ). В качестве контроля использовали лунки, не зараженные вирусом. Процент ингибирования вирусной репродукции

изучаемым соединением определяли по формуле: процент ингибирования = 100— (ОП опыта - ОП клеточного контроля / ОП вирусного контроля в отсутствии соединения - ОП клеточного контроля) хЮО. Концентрация препарата, уменьшающая значение величины ОП на 50%, принималась за минимальную ингибирующую концентрацию 50 (МИК50). Данный метод использовался также и для изучения комбинированного действия арбидола с различными препаратами в культуре клеток, однако в этих опытах каждый планшет, помимо лунок с клеточным контролем (клетки, неинфицированные вирусом) и лунок с вирусным контролем (клетки, инфицированные вирусом), включал в себя лунки, инфицированные вирусом в присутствии двух изучаемых препаратов, и контрольные лунки (клетки, инфицированные вирусом в присутствии каждого из изучаемых препаратов в отдельности).

Изучение действия арбядола на различные стадии вирусной репродукции

проводили с использованием молекулярно-биологических методов. Определение действия арбидола на нейраминидазную активность вируса гриппа проводили по методу Gubareva L. et al. (1996). Изучение влияния арбидола на транскрип-тазную активность РНП вируса гриппа in vitro проводили по методу Bishop D. et al. (1971), изучение меченых 3Н-уридином продуктов транскрипции вирусов гриппа А и В в культуре клеток в присутствии арбидола проводили с помощью метода электрофореза в 3% ПААГе. Изучение вирусных белков, синтезированных в присутствии арбидола в культуре клеток, проводили методом электрофореза в 7,5-15% ПААГе. Изучение действия арбидола и его аналогов на ранние стадии вирусной репродукции проводили методом рассвечивания флуоресценции (РФ) с использованием меченого флуоресцентного зонда, встроенного в мембрану вирусов гриппа А и В, и методом гемолиза эритроцитов (Wharton S. et al., 1986). Конформационные изменения НА вируса дикого типа и арбидолрезистентных мутантов изучали по методу, описанному Daniels R. et al. (1985) с использованием конформационных антител к нативному НА (НС58) и к активному НА (Н9), способному индуцировать слияние мембран. Определение нуклеотидной последовательности генов НА и М вируса дикого типа и арбидолрезистентных мутантов проводили на автоматическом секвенаторе ABI Model 377 DNA Sequencer (Perkin-Elmer, Applied Biosystems ( США) с использованием набора " ABI Prism dye terminator cycle sequencing kit?' по предварительной процедуре и с использованием праймеров, описанных Grambas S. et al. (1992).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Сравнительное изучение влияния арбидола и других противовирусных препаратов на репродукцию вирусов грнппа человека в культуре клеток MDCK. Известно, что у людей заболевания гриппом вызывают антигенные

типы вируса А, В и С. До 1997 в человеческой популяции периодически циркулировали три антигенных серотипа вируса гриппа А НШ1, Н2Ш и Н3№, которые в свою очередь подвергались изменениям при постоянно происходящем антигенном дрейфе. Поэтому важнейшей характеристикой противогриппозного препарата является отсутствие штаммовой специфичности. Изучение действия арбидола на репродукцию различных штаммов вирусов гриппа А, В и С в культуре клеток было проведено в сравнении с другими противогриппозными препаратами. В опытах с вирусами гриппа А использовали примерно эквимолярные концентрации препаратов (около 20 мкМ): арбидол, занамивир, карбоксилат озельтамивира -10 мкг/мл, рибавирин, рибамидил, амантадин, ремантадин-5 мкг/мл, в опытах с вирусами гриппа В и С, чтобы убедиться в отсутствии эффекта, амантадин и ремантадин были добавлены к клеткам в концентрации 20 мкг/мл. По данным фармакокинетических исследований, изученная концентрация каждого из исследованных препаратов может быть достигнута в носоглоточных секретах при их терапевтическом применении. Проведенные нами эксперименты показали (табл. 1), что арбидол ингибировал репродукцию всех изученных нами штаммов вируса гриппа А человека примерно в одинаковой степени на уровне 80%, причем ингибирующий эффект арбидола не отличался, а иногда и превосходил ингибирующий эффект других противогриппозных препаратов. В отличие от амантадина и ремантадина, которые практически не влияли на репродукцию вируса гриппа В, арбидол, так же как рибавирин и ингибиторы нейраминидазы, подавлял ее на 60%. Ингибирование арбидолом репродукции вирусов гриппа С было слабее, чем репродукции вирусов гриппа А и В, и составляло 20%. Одним из недостатков препаратов адамантанового ряда, в частности ремантадина, является быстрое формирование резистентности к ним. Изучение действия арбидола на репродукцию ремантадинрезистентных штаммов вируса гриппа, один из которых был получен путем пассирования вируса в культуре клеток в присутствии ремантадина, и двух эпидемических штаммов, выделенных от людей во время эпидемического сезона 2003-2004 года, показало, что арбидол, в отличие от ремантадина, подавляющего репродукцию только ремантадинчувствительного штамма вируса гриппа А, подавляет репродукцию как ремантадинчувствительного, так и ремантадинрезистентных штаммов вирусов гриппа (табл. 1).

Таблица 1. Влияние противовирусных препаратов на репродукцию различных штаммов вирусов гриппа А, В и С человека в

культуре клеток МРСК*

Вирусы Процент уменьшения значения ОП492**

арбидол амантадин ремантадин рибавирин рибамидил занамивир озельтамивнр

НШ1

А/Р1№34 80+3 50+8 40+3 59+4 59+3 75+3 73+2

АтИ 85+5 .*** - - - - -

Н2№

А/Сингапур/1/57 80+4 79+1 81+7 60+2 60+5 81+1 79+9

А/Япония/305/57 87+5 84+4 80+4 - - - -

№N2

А/Тайваяь/79 79+1 85+4 80+10 - - 85+2 77+3

А/Миссисипн/85 83+5 82+3 87+9 66+4 66+1 84+3 80±5

А/ВЧП/Вейбридж (Н7К7)

ремантадин чувствительный

(дикий тип) 60+3 - 56+4 - - - -

А/ВЧП/Вейбридж (НЖ7)

ремантадинрезистентный 80+4 - 15+5 - - - -

А/Ярославль/8/04 (НЗШ)

ремантадинрезистентный 68+2 - 9+2 - - - -

А/Томск/27/04 (Н3№)

ремантадинрезистентный 55+5 - 6±1 - - - -

Вирусы гриппа В

В/Ли/40 60+6 6+3 8+2 71+2 - 65+5 68±7

В/Москва/1/02 67+7 - 2+1 68+5 - - -

Вирусы гриппа С

С/СССР/77 20+5 н.а 10+1 - - - -

С/Ленинград 22+3 10+1 15+1 - - - -

♦Для сравнения использовали примерно эквимолярные концентрации препаратов: арбидол, занамивир, карбоксилат озельтамивира -10 мкг/мл, рибавирин. рибамидил, амантадин, ремантадин-5 шаг/мл. В опытах с вирусами гриппа В и С, чтобы убедиться в отсутствии эффекта, амантадин и ремантадин использовали в концентрации 20 мкг/мл . **В каждом опыте на одну точку использовали 4 лунки, результат представляет среднее арифметическое трех независимых опытов+среднее квадратичное отклонение. *** - не изучалось

Влияние арбидола на репродукцию вирусов гриппа птиц подтипов НА Н5, Н9 и Н6 в культуре клеток МОСК. В 1997 году в Гонконге вирус гриппа птиц А/Гонконг/157/97 (Н51М1) вызвал заболевания гриппом у 18 человек, 6 из которых умерли. Через год другой птичий вирус гриппа А №>N2 также вызвал несколько случаев заболевания у людей. С 2000 г. в странах Южной и Юго-Восточной Азии наблюдались эпизоотии среди кур, сопровождавшиеся заболеванием людей, подчас с высокой смертностью. Всего к началу 2005 г. зарегистрировано 45 случаев заболеваний «птичьим гриппом», закончившихся смертельными исходами. Летом 2005 г. в России также наблюдалось распространение гриппа среди птиц, вызванного патогенным вирусом Н5И1. Два вируса, вызвавшие заболевания у людей, А/Гонконг/157/97 (Н5№) и А/ Цесарка /Гонконг/О 1/97 (ГОШ), а также птичий вирус штамм

А/Утка/ГонконгЛМЗ 12/97(Н6№) имеют шесть общих генов, кодирующих внутренние белки. Еще один птичий вирус А/Курица/Гонконг/<39/97 (Н9Ы2) обладает двумя генами (РВ1 и РВ2), общими с перечисленными выше тремя вирусами. Сотрудниками отдела экологии вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского на территории России были изолированы вирусы гриппа А/Утка/Алтай/1285/91 (Н5Ю), А/Утка/Приморье/ 2621/01 (Н5№) и А/Утка/Приморье/2633/01(Н5№) от диких птиц. Антигенная и первичная структура НА этих трех вирусов сходна с таковой у вирусов, обусловивших вспышки заболевания среди людей и кур в странах Юго- Восточной Азии. В настоящее время все перечисленные вирусы продолжают циркулировать в птичьей популяции и нельзя исключить вероятность перехода ими межвидового барьера и внедрения в человеческую популяцию. В связи с этим данные вирусы рассматриваются как кандидаты, потенциально способные вызвать будущие эпидемии вируса гриппа, и получение данных об активности противогриппозных препаратов в отношении этих вирусов крайне важно. Из результатов, представленных в табл.2, видно, что арбидол подавляет репродукцию всех изученных вирусов гриппа птиц, однако чувствительность их к препарату отличается. МИК50 арбидола для обоих Н9№ вирусов составляла 15 мкг/мл , в то время как для А/Гонконг/157/97 (Н5Ы1) и А/Утка/ГонконгЛУЗ 12/97 (Н6Ы1) составляла соответственно 30 и 25 мкг/мл. МИК50 для вирусов гриппа А/Утка/Алтай/1285/91 (Н5Ю), А/Утаатриморье/2621/01(НЖ2) и А/Утка/Приморье/2633/01(Н51^3) были ниже и составляли соответственно 4,5 мкг/мл, 4,0 мкг/мл и 7,5 мкг/мл. МИК50 для вируса гриппа человека А/Сингапур/1/57, взятого в качестве контроля, составляла 7,5 мкг/мл.

Таким образом, арбидол подавляет репродукцию вирусов гриппа птиц, вызвавших заболевания у людей или имеющих общие со штаммом А/Гонконг/157/97(Н5№) гены, кодирующие внутренние белки. Однако, арбидол менее активен в отношении этих вирусов, чем в отношении НШ1, Н2№, Н3№

антигенных серотипов вируса гриппа А, циркулирующих в человеческой популяции. Активность арбидола в отношении вирусов гриппа птиц Н5КГ2 и Н5№, выделенных на территории России, сходна с его активностью в отношении антигенных серотипов вируса гриппа А человека.

Таблица 2. Противовирусная активность арбидола в отношении вирусов гриппа птиц подтипов Н5 и Н9 в культуре клеток МОСК

Вирусы МИКзо (мкг/мл) *

А/Гонконг/157/97 (H5N1) 30+5

А/ Цесарка /Tohkoht/GI/97 (H9N2) 15+3

А/ Утка /t0hk0hr/W31297 (H6N1) 25+3

А/ Курица /ToHKOHr/G9/97 (H9N2) 15+5

А/Утка/Приморье/2633/01 (Н5 N3) 4,5+2,5

А/Утка/Приморье/2621/01 (H5N2) 4,0+1

А/Утка/Алтай/1285/91 (H5N3) 7,5+2,5

А/Сингапур/1/57 (H2N2) 7,5+4

♦Для одной точки опыта использовали четыре лунки планшета, а каждое значение МИК50 представляет среднее арифметическое + среднеквадратичное отклонение, вычисленное из четырех таких независимых опытов.

Изучение влияния арбндола на репродукцию PCB и аденовируса в культурах клеток. Одним из преимуществ любого противовирусного препарата является широта его спектра действия. Арбидол рекомендован Фармакологическим Комитетом Минздрава России не только в качестве профилактического и лечебного средства при гриппе А и В, но также при острых респираторных вирусных инфекциях (ОРВИ) негриппозной этиологии, однако данные, подтверждающие вирусспецифическое действие арбидола в отношении других возбудителей ОРВИ, отсутствовали. С использованием ИФА была разработана система оценки активности препаратов против PCB и аденовируса в культуре клеток, в которой было изучено действие арбидола на репродукцию этих вирусов в сравнении с рибавирином и рибамидилом. Из данных, представленных в табл. 3, видно, что арбидол подавляет репродукцию PCB и аденовируса на уровне рибамидила и рибавирина, активных в отношении

возбудителей этих инфекции и используемых нами в качестве контроля, с МИК50 соответственно 10 мкг/мл и 20 мкг/мл.

Таблица 3. Противовирусная активность арбидола в культурах клеток

МИК50 препаратов •

Препараты PCB, штамм Long, клетки МК-2 Аденовирус тип 5, клетки HeLa

Арбидол 10+2 мкг/мл 20+3 мкг/мл

Рибавирин 5+1 мкг/мл 20+2 мкг/мл

Ремантадин >100 мкг/мл > 100 мкг/мл

*Для одной точки опыта использовали четыре лунки планшета, а каждое значение МИК50 представляет среднее арифметическое + среднеквадратичное отклонение, вычисленное из четырех таких независимых опытов.

Таким образом, полученные нами данные показывают, что арбидол обладает широким спектром противовирусной активности, ингибируя репродукцию различных антигенных серологов и ремантадинрезистентных штаммов вирусов гриппа А человека, вирусов гриппа птиц подтипа Н5 и Н9, вызвавших заболевания у людей, или обладающих общими или близкородственными с ними генами, а также вирусов гриппа В и С. Данные о широком спектре действия арбидола в отношении респираторных вирусов позволяют сделать вывод о его перспективности для лечения и профилактики ОРВИ и дают основание для рекомендации начала лечения им без проведения предварительной диагностики заболевания.

Изучение противовирусной активности соединений в ряду индолов. В связи с высокой и широкой по спектру противовирусной активностью арбидола в культуре клеток представлялось перспективным изучение его аналогов. С использованием метода ИФА, модифицированного для оценки противовирусной активности соединений в культуре клеток, из 47 соединений, изученных нами в отношении их способности ингибировать репродукцию вируса гриппа А, было выявлено 17 соединений с высокой противовирусной активностью на уровне арбидола, 15 соединений с менее выраженной активностью и 15 неактивных соединений. Из 7 соединений, изученных в отношении их способности ингибировать репродукцию PCB в культуре клеток, было выявлено 4 соединения с активностью на уровне арбидола или превосходящей ее, 1 слабоактивное и 2

неактивных соединения. Обнаружение нами большого процента соединений с выраженной ингибирующей активностью в отношении вируса гриппа и РСВ позволяет сделать вывод о перспективности поиска соединений, причем с широким спектром противовирусной активности, в этом химическом ряду. Изучение действия арбидола на различные стадии репродукции вируса гриппа. Первым шагом в изучении селективного действия препарата и доказательства наличия у него вирусспецифического эффекта является установление стадии вирусной репродукции, ингибируемой этим препаратом. Изучение действия арбидола на поздние стадии репродукции, проведенное нами, показало, что арбидол не влияет на вирусную транскрипцию и трансляцию, нейраминидазную активность. В одноцикловом опыте было показано, что добавление арбидола к клеткам MDCK через 1 час после их инфицирования не оказывало влияния на репродукцию вирусов гриппа А/Япония/305/57 и В/Ли/40, в то время как добавление арбидола к клеткам за 1 час до инфицирования вызывало ингибирование репродукции этих вирусов соответственно на 80% и 70% (рис.1). Эти данные позволили предположить, что действие арбидола связано с его влиянием на ранние стадии вирусной репродукции. Методом рассвечивания флуоресценции (РФ) с использованием флуоресцентного зонда, встроенного в вирусную мембрану, было изучено действие арбидола на ранние стадии вирусной репродукции. Добавление арбидола в различных концентрациях не оказывало влияния на связывание (адсорбцию) вируса с клетками MDCK. Далее было изучено действие арбидола на эндоцитоз вирусов гриппа А/Пуэрто-Рико/8/34 и и В/Ли/40 в клетках Raji. В предварительных экспериментах с ингибиторами эндоцитоза и тушителями флуоресценции было показано, что значение величины РФ при рН =5,0 в реакционной среде отражает процесс слияния липидной оболочки вируса с плазматическими мембранами, а при рН=7,4 в реакционной среде - процесс слияния липидной оболочки вируса с мембранами эндосом. Из данных, представленных на рис.2, видно, что добавление арбидола к клеткам при рН =5,0 и при рН=7,4 приводило к уменьшению значения величины РФ соответственно на 50% и 60% и подавляло, таким образом, как слияние липидной оболочки вируса с плазматической мембраной, так и с мембранами эндосом. Поскольку у вируса гриппа в естественных условиях наблюдается только слияние липидной оболочки вируса с мембранами эндосом, логично было предположить, что вирусспецифическое действие арбидола обусловлено его влиянием именно на эту стадию вирусной репродукции. Для подтверждения нашего предположения в следующей серии экспериментов мы изучили действие структурных аналогов арбидола, обладающих разной противовирусной активностью, как на слияние липидной оболочки вируса с плазматическими мембранами, так и на ее слияние с эндосомами ( табл. 4).

Рис.1. Влияние арбидола на репродукцию вируса гриппа А/Япония/305/57 (А) и вируса гриппа В/Ли/40 (Б) в клетках М13СК в зависимости от времени добавления препарата в условиях одноциклового опыта

1-60 минут до инфицирования; 2 - через 60 минут после инфицирования

Для одной точки опыта использовали четыре лунки планшета, а каждое значение представляет среднее арифметическое + среднеквадратичное отклонение, вычисленное из трех таких независимых опытов.

90 -80 -70 ■ 60 50 ■ 40 30 20 • 10 -0

I I

I вирус +клетки

□ вирус + клетки +арбидол (50 мкг/мл)

I вирус +клетки

□ вирус + клетки +арбидол (50 мкг/мл)

Рис.2. Влияние арбидола на величину РФ при взаимодействии вируса гриппа А/Пуэрто-Рико/8/34 (А) и вируса гриппа В/Ли/40 (Б) с лимфобластоидными клетками Кар при рН=5,0 (1) и при рН= 7,4 (2)

Для одной точки опыта использовали три повторности, а каждое значение представляет среднее арифметическое + среднеквадратичное отклонение, вычисленное из четырех таких независимых опытов.

Таблица 4. Противовирусная активность аналогов арбидола в культуре клеток МЕ>СК и их влияние на эндоцитоз вируса гриппа А/Краснодар/101/59 в

Соединения % подавления % подавления РФ**

вирусной рН=5,0 РН=7,4

репродукции*

Арбидол 60+10 52+2,7 50+2,0

А-902 65+10 42+2,1 44+2,2

Гр-3213 52+7 23+1,2 35+1,8

Гр-1834 50+10 76+2,5 66+2,4

Ш-1447 50+7 40+1,9 48+2,1

Ш-1603 40+5 45+2,2 40+2,1

Кардиофан н/а 5+0,1 5+0,2

ГЯЛ-78 6+3 39+2,1 15+1,2

Гр-3110 12+4 43+2,2 н/а

А-502 8+3 43+2,4 10+0,9

Гр-3078 7+4 70+3,4 10+0,5

Ш-1488 н/а 35+1,9 5+0,2

*В опытах по определению противовирусной активности соединений для одной точки опыта использовали четыре лунки планшета, а каждое значение представляет среднее арифметическое + среднеквадратичное отклонение, вычисленное из трех таких независимых опытов.

** В опытах по изучению влияния соединений на эндоцитоз вируса гриппа для одной точки опыта использовали три повторности, а каждое значение представляет среднее арифметическое + среднеквадратичное отклонение, вычисленное из трех таких независимых опытов.

№ данных по изучению их влияния на эндоцитоз вируса гриппа А/Пуэрто-Рико/8/34 в клетках Лар при рН=5,0 и рН=7,4 видно, что аналоги арбидола, проявляющие сходную с ним противовирусную активность в культуре клеток, ингибируют величину РФ при рН=5,0 и рН=7,4 приблизительно на том же уровне, как и сам арбидол. Ни одно из соединений, не обладающих противовирусной активностью, не ингибировало значение величины РФ при рН=7,4, отражающей процесс слияния липидной оболочки вируса с мембранами эндосом (табл.4). Эти данные подтверждают наше предположение о том, что подавление вирусной репродукции арбидолом обусловлено ингибированием препаратом одной из ее стадий, а именно - слияния липидной оболочки вируса с мембранами эндосом, происходящего внутри клеток.

Изучение влияния арбидола на репродукцию реассортаитов, имеющих различный набор генов. Для установления мишени, на которую направлено действие арбидола, мы изучили эффект арбидола на репродукцию реассортантов между вирусами гриппа А/ВЧП/Вейбридж и А/Сингапур/1/57, каждый из которых имел различный состав генов (рис.3). Видно, что одна группа реассортантов обладала высокой чувствительностью к действию арбидола (рис. 4). Все реассортанты этой группы имели НА от А/ВЧП/Вейбридж. Вторая группа реассортантов, которые имели НА от А/Сингапур/1/57, была менее чувствительна к арбидолу. Не было обнаружено никакой корреляции между каким-либо другим геном и чувствительностью к арбидолу. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что поверхностный белок НА является основным белком, определяющим чувствительность к арбидолу.

Реассортанты Гены

1 2 3 4 5 6 7 8

19Ь ЧУ* А А W А W ЧУ А

7а ЧУ ЧУ W ЧУ W ЧУ А ЧУ

21Ь ЧУ ЧУ А ЧУ ЧУ А А ЧУ

9а А** А А w А А А ЧУ

43а ЧУ ЧУ ЧУ А ЧУ ЧУ ЧУ ЧУ

58а А А А А А А А ЧУ

Рис.3, Состав генома реассортантов, полученных при совместном заражении клеточной культуры вирусами гриппа А/Сингапур/1/57 (НЗШ) и А/ВЧП/Вейбридж (Н7Ш) (*ЧУ-ген от А/ВЧП/Вейбридж; **А-ген от А/Сингапур/1/57)

О 2 4 6 8 10 концентрация арбидола (мкг/мл)

Рис.4. Влияние различных концентраций арбидола на репродукцию реассортантов между вирусами гриппа А/Сингапур/1/57 и А/ВЧП/Вейбридж в культуре клеток МОСК.

Получение мутантов, резистентных к арбидолу, и изучение их свойств. До

настоящего исследования попытки получения мутантов, резистентных к арбидолу, не увенчались успехом. Арбидолрезистентные мутанты были получены нами после 15 пассажей вируса в присутствии увеличивающихся (от 5 мкг/мл до 20 мкг/мл) концентраций арбидола в культуре клеток МОСК. Резистентность к арбидолу этих мутантов была подтверждена в опытах по ингибированию бляшкообразующей активности (БОА) и гемолизу эритроцитов, а также с использованием ИФА. Определение нуклеотидной последовательности НА полученных нами арбидолрезистентных мутантов показало, что все они имеют мутации в гене, кодирующем НА2, но в различных позициях (табл. 5).

Изучение влияния арбидола на конформационные изменения НА вируса гриппа. Известно, что ведущую роль в осуществлении слияния липидной оболочки вируса с мембранами эндосом играет поверхностный гликопротеин вируса гриппа НА, конформационные изменения которого при низком рН

индуцируют этот процесс, что приводит к освобождению вирусного генома и началу транскрипции. С использованием двух типов конформационных антител (КАТ), различающих НА в нативном состоянии (НС58) и индуцируемом низким рН активном состоянии (Н9), мы изучили конформационные изменения НА арбидолрезистентных мутантов в сравнении с НА вируса дикого типа, из которого эти мутанты были получены. Для дикого типа вируса переход НА из нативного состояния в активное состояние имел место при рН=5,0, однако для арбидолрезистентного штамма этого же вируса такой переход имел место при рН=5,2, то есть при рН выше, чем для вируса дикого типа (рис.5). Такие же результаты были получены и для остальных мутантов, резистентных к арбидолу. Гемолиз эритроцитов, индуцируемый этими же мутантами, также имел место при более высоком рН, чем для дикого типа вируса (табл.5).

Таблица 5. Изменение первичной последовательности арбидолрезистентных мутантов и увеличение рН, при котором происходит индуцируемое ими слияние вирусной липидной оболочки с клеточными мембранами.

Арбидол- Аминокис- Положения Увеличение рН слияния***

резистентные лотные аминокислот-

мутанты замены ных замен АрН* АрН **

М1 НА2 27 0.2 0.4

202 НА2 42 0.2 0.2

201 НА251 0.2 0.2

203 НА251 0.2 0.2

206 НА251 0.2 0.2

НА2 51 0.2 0.2

1ПЛ к->и

НА2 87

Р1 НА2 117 0.2 0.2

*Д рН- изменение рН перехода НА из нативного состояния в активное состояние при низком

значении рН, определенное методом ИФА с использованием конформационных антител

** ДрН -изменение рН гемолиза эритроцитов, индуцируемое вирусами, определенное при

измерении их гемолитической активности при различных значения рН

*** различия между ДрН для вируса дикого типа и арбидолрезистентных мутантов были

статистически достоверны ( р<0,05)

рн

Рис.5. рН конформационных изменений НА арбидолрезистентного мутанта 202 (- ■ Ль ■ - ■, ▼ ) и вируса дикого типа 7а (—■—,—~ ), взаимодействие НА с КАТНС58 (—■—,—▲•••) и Н9 (—▼—,—•").

При построении кривых для определения рН конформационного перехода НА для каждой точки опыта использовали шесть лунок планшета, а полученное значение рН представляет среднее арифметическое, вычисленное из трех таких независимых опытов.

Для подтверждения прямого взаимодействия НА вируса гриппа с арбидолом далее был изучен эффект последнего на конформационные изменения НА вируса дикого типа и арбидолрезистентных мутантов (табл.6). Добавление арбидола к НА дикого типа вызывало сдвиг конформационного перехода НА на 0,2 единицы. Увеличение концентрации арбидола до 50 мкг/мл не вызывало дальнейшего увеличения разницы значения рН перехода для НА. Добавление от 10 до 50 мкг/мл арбидола к НА резистентных вирусов не оказывало влияния на значение рН, при котором конформационные изменения НА имели место в отсутствии арбидола. Таким образом, НА арбидолрезистентных штаммов не был чувствителен к действию арбидола.

Таблица 6. Влияние арбидола на конформационные изменения НА вируса дикого типа 7а и арбидолрезистентных мутантов 201и 202.

Концентрации арбидола (мкг/мл) рН перехода НА из нативного состояния в состояние, индуцированное низким рН*

7а 201 202

0 5.0 5.2 5.2

10 4.8 5.2 5.2

20 4.8 5.2 5.2

50 4.8 5.2 5.2

♦При определения рН конформационного перехода НА для каждой точки опыта использовали шесть лунок планшета, а полученное значение рН представляет среднее арифметическое, вычисленное из трех таких независимых опытов. ♦* различия между рН слияния для вируса дикого типа 7а в отсутствии и присутствии арбидола были статистически достоверны (р<0,05)

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что вирусспецифической мишенью действия арбидола в цикле вирусной репродукции является НА вируса гриппа. Арбидол взаимодействует с НА вируса гриппа, увеличивая его стабильность к конформационным изменениям, индуцированным низким рН, и, как следствие, ингибирует процесс слияния липидной оболочки вируса с мембранами эндосом, приводящий к освобождению вирусного нуклеокапсида и началу транскрипции вирусного генома. Таким образом, полученные нами данные доказывают, что арбидол обладает вирусспецифическим действием и по механизму этого действия отличается от применяемых противогриппозных препаратов: амантадина и ремантадина, являющихся блокаторами ионных каналов, образованных М2 белком вируса гриппа, и ингибиторов нейраминидазы -занамивира и озельтамивира.

Изучение влияния арбидола на репродукцию вируса гриппа при сочетании с другими препаратами в культуре клеток МОСК. Одним из подходов для увеличения эффективности химиопрепарата против вирусной инфекции является его использование в комбинации с другим препаратом. При этом наилучшие результаты дает использование препаратов, имеющих различный механизм действия и направленных на разные мишени в цикле вирусной репродукции. Наши исследования показали, что механизм действия арбидола отличается от других применяемых в настоящее время противогриппозных препаратов.

Изучение эффекта арбидола в сочетании с амантадином и ремантадином

Использование препаратов адамантанового ряда лимитировано возникновением резистентных к ним штаммов и побочными эффектами, отмеченными при применении высоких доз препаратов. Для того, чтобы уменьшить вероятность возникновения резистентных штаммов или повысить эффективность действия их низких доз, представляло интерес изучить комбинированное действие этих препаратов с арбидолом.

Из данных, представленных в табл.7, видно, что ни одна из изученных концентраций амантадина и ремантадина не уменьшали эффект арбидола на вирусную репродукцию. Добавление к арбидолу в концентрации 1 мкг/мл всех изученных концентраций амантадина не влияло значительным образом на величину ингибирования вирусной репродукции, оказываемыми этими же концентрациями препаратов в отдельности. Комбинации арбидола с амантадином (арбидол 1 мкг/мл+амантадин 10 мкг/мл, арбидол 5 мкг/мл + все изученные концентрации амантадина; арбидол 10 мкг/мл+ все изученные концентрации амантадина) увеличивали эффект арбидола на вирусную репродукцию по сравнению с эффектом, оказываемым арбидолом и амантадином в этих же концентрациях в отдельности, однако наибольшее усиление эффекта ингибирования наблюдалось при комбинации 5 мкг/мл арбидола с амантадином в концентрации 0,3 мкг/мл и 1 мкг/мл. Сходные данные были получены при изучении эффекта арбидола на вирусную репродукцию в комбинации с ремантадином (табл.7).

Таблица 7. Действие арбвдола в комбинации с амантадином и ремантадином на репродукцию вируса гриппа А/Сингапур/1/57в культуре клеток МЕ)СК

Арбидол (мкг/мл) Процент ингибирования вирусной репродукции *

Амантадин (мкг/мл) Ремантадин(мкг/мл)

0 0,3 1 5 10 0 0,3 1 5 10

0 - 22+2 28+3 50+2 56+5 - 25+5 31+5 56+4 59+7

1 30+5 30+1 30+2 52+2 59+3 30±6 31+6 33+6 50+6 59+9

5 38+4 60+5 68±5 74+5 81+4 38+3 63+3 71+7 74+4 82+2

10 67+8 77+4 81+9 82+8 85+3 67+6 78+8 80+5 82+5 86+6

*Для одной точки опыта использовали четыре лунки планшета, а каждое значение представляет среднее арифметическое + среднеквадратичное отклонение, вычисленное из трех таких независимых опытов.

Изучение эффекта арбидола в сочетании с карбоксилатом озельтамивира.

Другим противогриппозным препаратом, разработанным сравнительно недавно и доступным на отечественном рынке, является ингибитор нейраминидазы -озельтамивир. В экспериментах на животных и в клинических испытаниях показано, что этот препарат эффективен при небольшой задержке лечения. Действие арбидола тем более эффективно, чем раньше начато лечение. Наши эксперименты также показали, что наибольший ингибиругощий эффект активного метаболита озельтамивира -карбоксилата озельтамивира наблюдается при добавлении его к клеткам через 2 часа после их инфицирования и остается примерно на этом же уровне при добавлении препарата к клеткам в течение 5 часов после их инфицирования. Наибольший ингибиругощий эффект арбидола наблюдается при добавлении к клеткам препарата за 3-4 часа до их инфицирования вирусом, в то время как добавление арбидола к клеткам после их инфицирования практически не оказывает влияния на вирусную репродукцию. Данные факты явились предпосылкой для изучения действия арбидола в сочетании с карбоксилатом озельтамивира на вирусную репродукцию при использовании трех схем внесения препаратов: оба препарата одновременно за 3 часа до инфицирования клеток, арбидол за 3 часа до инфицирования, а карбо-ксилат озельтамивира через 2 часа после инфицирования, оба препарата одновременно через 2 часа после инфицирования клеточной культуры (табл.8).

Полученные нами результаты показали, что во всех случаях наблюдалось увеличение эффекта препаратов, однако наибольшее усиление ингибирующего эффекта арбидола было получено при использовании третьей схемы внесения препаратов. Добавление арбидола через 2 часа после инфицирования клеток практически не вызывает ингибирования вирусной репродукции при всех концентрациях препарата, за исключением 10 мкг/мл.. Добавление карбоксилата озельтамивира к клеткам через 2 часа после их инфицирования вызывает ингибирование вирусной репродукции, причем уровень ингибирования увеличивается с 36% для концентраций 0,3 мкг/мл до 52% для концентраций 40 мкг/мл.

Одновременное с карбоксилатом озельтамивира добавление арбидола в концентрации 0,3 мкг/мл к клеткам через 2 часа после их инфицирования также не увеличивает уровень ингибирования вирусной репродукции, вызываемый ими, однако, начиная с концентрации арбидола от 1 мкг/мл и выше позволяет значительно усилить эффект обоих препаратов, а при комбинациях арбидол (3 мкг/мл и выше + карбоксилат озельтамивира 3 мкг/мл) практически полностью подавить вирусную репродукцию (табл.8).

Таблица 8.Действие арбидола в комбинации с карбоксилатом озельтамивира на репродукцию вируса гриппа А/Сингапур/1/57 в культуре клеток МЕХЖ

Арби -дол Процент ингибирования вирусной репродукции*

(мкг/ мл) Время добавления (арбидол и карбоксилат озельтамивира за 3 часа до инфицирования) Время добавления (арбидол за 3 часа до, карбоксилат озельтамивира через 2 часа после инфицирования)

Карбоксилат озельтамивира (мкг/мл) Карбоксилат озельтамивира (мкг/мл)

0 0,3 1 3 10 40 0 0,3 1 3 10 40

0 - 24+5 25+4 30+5 35+4 38+5 - 36+4 39+8 37+6 48+5 52+5

0,3 н.и»* 60+7 60+3 79+8 80+5 87+5 н.и 80+8 79+6 87+5 88+8 94+5

1 15+3 71+4 76+8 79+6 80+7 85+4 15+4 100 100 100 100 100

3 62+2 75+4 77+7 89+8 90+3 90+6 62+3 100 100 100 100 100

5 66+4 75+3 79+3 79+5 84+4 86+7 66+7 100 100 100 100 100

10 97+1 100 100 97+3 98+2 100 97+2 100 100 100 100 100

Арбидол (мкг/мл) Время добавления (арбидол и карбоксилат озельтамивира одновременно, через 2 часа после инфицирования)

Карбоксилат озельтамивира (мкг/мл)

0 0,3 1 3 10 40

0 - 36+6 39+9 37+5 48+7 52+5

0,3 н.и. 35±5 40+6 37+7 47+5 55+6

1 н.и. 48+5 59+8 56+5 100 100

3 н.и. 62+7 58+7 90+8 100 100

5 н.и. 79+8 84+8 100 98+2 100

10 20+4 70+10 85+12 100 100 100

Изучение эффекта арбидола в сочетании с рибавирином и рнбамидилом. Нередко также при лечении тяжелых форм ОРВИ применяются рибавирин и его отечественный аналог рибамидил. Из-за высокой токсичности эти препараты применяются в условиях стационара у лиц с ослабленным иммунитетом. Арбидол, помимо вирусспецифического действия в отношении вируса гриппа, обладает иммуномодулирующим эффектом и способностью индуцировать интерферон, в связи с чем он также рекомендован для применения у больных с ослабленным иммунным статусом.

Таблица 9. Действие арбидола в комбинации с рибавирином ирибамидилом на репродукцию вируса гриппа А/Сингапур/1/57 в культуре клеток МЕ)СК

Арбидол (мкг/мл) Процент ингибирования вирусной репродукции*

Рибавирин (мкг/мл) Рибамидил (мкг/мл)

0 1 3 10 15 0 1 3 10 15

0 - 5+1 25+5 30+4 38+5 - 4+2 28+6 32+5 40+5

3 н.и** 19+3 30+4 52+2 54+4 н.и 17+3 52+5 50+5 59+6

10 23+4 26+5 35+6 85+10 82+5 24+4 25+5 68+5 79+6 80+3

15 40+7 43+4 41+4 82+3 80+6 38+4 41+6 42+4 72+3 84+8

20 55+6 65+5 68+5 80+5 82+7 54+6 71+7 72+6 80+5 86+7

*Для одной точки опыта использовали четыре лунки плапшета, а каждое значение представляет среднее арифметическое + среднеквадратичное отклонение, вычисленное из трех таких независимых опытов. н.и.*-нет ингибирования

Изучение действия арбидола в комбинации с рибавирином показало, что добавление рибавирина к арбидолу во всех случаях увеличивало его ингибирующий эффект, однако степень увеличения была различна в зависимости от концентраций препаратов. Наибольшее усиление ингибирующего эффекта обоих препаратов наблюдалось при следующих их комбинациях: арбидол 3 мкг/мл+ рибавирин 1 мкг/мл; арбидол 10мкг/мл + рибавирин 10 мкг/мл; арбидол 15мкг/мл + рибавирин 10 мкг/мл. Добавление к различным концентрациям арбидола рибамидила также во всех случаях увеличивало ингибирующее действие арбидола на вирусную репродукцию, однако наибольшее усиление ингибирующего эффекта арбидола и рибамидила

наблюдалось при следующих их комбинациях : арбидол 3 мкг/мл+ рибамидил 1 мкг/мл; арбидол 3 мкг/мл+ рибамидил 3 мкг/мл; арбидол 10мкг/мл + рибамидил 3 мкг/мл; арбидол 10мкг/мл + рибамидил 10 мкг/мл (табл. 9).

Изучение эффекта арбндола в сочетании с анальгином и ацетилсалициловой кислотой Для облегчения течения гриппозной инфекции наряду со средствами этиотропной терапии используются симптоматические препараты. В качестве таких препаратов при ОРВИ для ослабления головной и мышечной боли, ломоты, понижения лихорадки используются анальгин и аспирин. Изучение эффекта арбидола на репродукцию вируса А/Япония/305/57 (Н2№) в культуре клеток МОСК в сочетании с анальгином и ацетилсалициловой кислотой показало, что добавление анальгина или ацетилсалициловой кислоты в концентрациях 0,3 мкг/мл, 1 мкг/мл, 5 мкг/мл и 10 мкг/мл практически не оказывало влияния на эффект арбидола по сравнению с его эффектом на вирусную репродукцию в отсутствие этих препаратов и не снижало его ингибирующего действия на вирусную репродукцию в культуре клеток.

Таким образом, изучение действия арбидола в сочетании с различными противогриппозными препаратами, обладающими отличным от арбидола механизмом действия, показало, что комбинация каждого их этих препаратов с арбидолом увеличивает их эффект на вирусную репродукцию в культуре клеток. Это позволяет для достижения того же самого эффекта при комбинации арбидола с ремантадином, амантадином, рибавирином и рибамидилом использовать более низкие концентрации последних, а при комбинации с озельтамивиром также начинать лечение арбидолом на более позднем этапе. Добавление к культуре клеток совместно с арбидолом симптоматических препаратов анальгина и ацетилсалициловой кислоты не снижало его ингибирующего действия на вирусную репродукцию.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наши исследования показали, что арбидол является противовирусным препаратом, с отсутствием штаммовой специфичности в отношении вирусов гриппа типов А и В, не уступающим по степени активности другим противогриппозным препаратам и обладающим широким спектром действия относительно возбудителей ОРВИ. Полученные данные о широком спектре активности арбидола в отношении ряда ОРВИ, для профилактики и лечения которых в настоящее время не существует вакцин и эффективных препаратов, позволяют рассматривать арбидол как препарат, не требующий проведения предварительной лабораторной диагностики перед началом лечения им. Проведенные нами исследования доказывают наличие у арбидола вирусспецифического механизма действия, заключающегося в том, что он

ингибирует процесс слияния липидной оболочки вируса с мембранами эндосом, взаимодействуя с НА вируса гриппа и увеличивая его стабильность к конформационным изменениям, необходимым для осуществления этого слияния. Комбинированное использование арбидола с другими противогриппозными препаратами, обладающими отличным от него механизмом действия, увеличивает их ингибирующий эффект на вирусную репродукцию. Полученные данные с полным основанием позволяют отнести арбидол к этиотропным препаратам первой линии защиты от гриппа. Наши результаты также являются обоснованием для существенного расширения возможностей моно- и комбинированной химиотерапии ОРВИ арбидолом, а также оптимизации его применения для более рационального и в то же время эффективного использования в клинической практике.

ВЫВОДЫ:

1. Арбидол в клеточных культурах в одинаковой степени ингибирует репродукцию антигенных серотипов вирусов гриппа А человека H1N1,H2N2, H3N2, а также ремантадинчувствительных и ремантадинрезистентных штаммов вирусов гриппа А.

2. Арбидол ингибирует репродукцию вирусов гриппа птиц А : H5N1h H9N2, вызвавших заболевания у людей, H6N1 и H9N2, имеющих общие с H5N1 и H9N2 внутренние гены, а также H5N2 и H5N3, изолированных от диких птиц на территории России.

3. Арбидол ингибирует в различных клеточных культурах репродукцию вирусов гриппа В и С, аденовируса и респираторно-синцитиального вируса.

4. Максимальный противовирусный эффект арбидола в клеточных культурах наблюдается при его добавлении за 3-4 часа до инфицирования клеточной культуры и коррелирует с моментом достижения его наивысшей концентрации в клетках, что подтверждает особую эффективность использования арбидола на ранних стадиях заболевания, а также в профилактических целях.

5. Арбидол ингибирует одну из ранних стадий вирусной репродукции, подавляя слияние липидной оболочки вируса с мембранами эндосом, происходящее внутри клеток. Арбидол не влияет на адсорбцию вируса гриппа и его нейраминидазную активность, а также на вирусную транскрипцию и трансляцию.

6. Исследования с реассортантами между А/ВЧП/Вейбридж/ (H7N7) и А/Сингапур/1/57 (H2N2), имеющими различный набор генов, показали, что

чувствительность реассортантов к арбидолу определяется геном, кодирующим НА.

7. Впервые в культуре клеток получены и охарактеризованы мутанты, резистентные к арбидолу. Определение нуклеотидной последовательности мутантов, резистентных к арбидолу, показало, что все они имеют аминокислотные замены в различных положениях субъединицы НА2 НА вируса гриппа.

8. Слияние липидной оболочки вируса с клеточными мембранами у арбидол-резистентных мутантов происходит при более высоком рН, чем у вируса дикого типа. Арбидол не вызывает конформационных изменений НА у резистентных к нему мутантов, в то время как его добавление к НА вируса дикого типа вызывает сдвиг конформационного перехода НА.

9. Комбинированное использование арбидола с каждым из изученных противогриппозных препаратов ( амантадин, ремантадин, рибавирин, рибами-дил, карбоксилат озельтамивира) увеличивало их эффект подавления вирусной репродукции в культуре клеток по сравнению с эффектом, оказываемым этими же концентрациями препаратов в отдельности. Во всех случаях наибольшее усиление ингибирующего эффекта было получено при использовании низких доз препаратов, а при комбинированном использовании арбидола с карбоксилатом озельтамивира также и при более позднем добавлении арбидола к клеткам.

10.Добавление симптоматических препаратов анальгина и ацетилсалициловой кислоты совместно с арбидолом не снижало его ингибирующего действия на вирусную репродукцию в культуре клеток.

11. Показано, что химический ряд производных 5-оксииндолов, к которым относится арбидол, является перспективным для поиска соединений, обладающих противовирусной активностью. Из 47 соединений, изученных в отношении их способности ингибировать репродукцию вируса гриппа А, и из 7 соединений, изученных в отношении их способности ингибировать репродукцию РСВ, в культуре клеток, было выявлено соответственно 17 и 4 соединения, сопоставимых по активности с арбидолом.

12. Полученные данные доказывают наличие у арбидола вирусспецифического действия, позволяющего отнести его к этиотропным препаратам первой линии защиты против гриппозной инфекции. Доказательства вирусспецифического действия арбидола являются основанием для включения арбидола в перечень этиотропных средств для химиотерапии ОРВИ и продолжения клинических исследований по оптимизации его применения при моно- и комбинированной терапии ОРВИ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1 .Melnikov S Ja., Mikhejeva A.V., Leneva I.A., Ghendon Yu. Z. Interaction of Ml protein and RNP of fowl plague virus in vitro // Virus Research, 1985, № 3. P. 353-365.

2. Ленева И.А., Гулак П.В., Дубров Ю.Н., Соболев А.С. Действие ремантадина на слияние липидной оболочки вируса гриппа А с плазматическими и внутренними мембранами в лимфобластоидных клетках // Бюллетень экспериментальной биологии, 1990, № 4. С. 483-485.

3. Глушков Р.Г., Фадеева Н.И., Ленева И.А., Герасина С.Ф., Буданова Л.И., Соколова Н.Д., Стебаева Л. Ф., Федякина И.Т. Молекулярно-биологические особенности действия арбидола-нового противовирусного препарата // Хим.-фарм. журнал, 1992, № 2. С. 8-15.

4. Фадеева Н.И., Ленева И.А., Панишева Е.К., Буссе Т.Л., Христова М.Л., Гранте В.Г., Харитоненков И.Г. Ингибиторы ранних стадий вирус-клеточного взаимодействия среди производных 3-этоксикарбонил-5-окси-6-броминдола // Хим.-фарм. журнал, 1992, № 9. С. 9-11.

5.Fadeeva N.I., Leneva LA., Khristova M.L., Fedyakina I.T., Kharitonenkov I.G. Monoclonal antibodies influenza virus ELISA-kits in determination of antiviral activity // 6th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Seville, Spain, 28-31 March.-1993.

6. Романова О.Б., Иванюк T.B., Кадушкин A.B., Фадеева Н.И., Ленева И.А., Николаева И. С., Петере В.В., Крылова Л. Ю., Граник В.Г., Гуськова Т.А. Синтез и исследование противовирусной активности енаминодикетонов, замещенных при атоме азота гидроксилсодержащими группам // Хим.-фарм. Журнал, 1993, № 10. С. 23-26.

7. Fadeeva N.I., Leneva I.A., Glushkov R.G., Fedyakina I.T. The effect of new antiviral drug Arbidol on influenza virus reproduction // 18th International Congress of Chemotherapy, Stockholm, Sweden, June 27-July 2,1993, Abstr.1463. P.366.

8. Рябова С.Ю., Трофимкин Ю., Кадушкин А.В., Николаева И. С., Гуськова Т.А. Фадеева Н.И., Ленева И.А., Граник В.Г. Синтез и исследование противовирусной активности ряда азагетероциклов, имеющих в качестве заместителей гидроксилсодержащие агенты // Хим.-фарм. журнал, 1993, № 9. С.32- 34.

9.Leneva LA., Fadeeva N.I., Fedyakina I.T., Khristova M.L., Kharitonenkov I.G. The study of a new antiviral drug arbidol using ELISA kits // Antiviral Research, 1993,-V.20, S(l). P. 173

10. Ленева И.А., Фадеева Н.И., Федякина И.Т., Гуськова Т.А., Христова М.Л., Соколова М.В., Харитоненков И.Г. Применение иммуноферментной индикации вирусспецифических антигенов в изучении нового противовирусного препарата // Хим.-фарм. журнал, 1994, № 9. С. 4-15.

11. Leneva I.A., Fadeeva N.I., Fedyakina I.T. The study of effect of a new antiviral drug arbidol on different stages of viral reproduction // Antiviral Research, 1994,

V.23, S(l). P. 187.

12. Leneva I.A., Fedyakina I.T., Fadeeva N.I., Guskova T.A. The effect of a new antiviral drug arbidol on influenza virus replication // Xth International Congress of Virology, Jerusalem, Israel, 11-16 August, 1996. Abs. PW30-11.

13. Leneva I., Hay A. The mechanism of action of arbidol against influenza A virus. Selection and characterization of arbidol-resistant mutants // 18th Meeting of American Society of Virology, Amherst, Massachusetts, USA, 10-14 July, 1999. Abs. W27-6.

14. Гуськова T.A., Ленева И.А., Федякииа И.Т., Чистяков В.В., Глушков Р.Г. Изучение кинетики арбидола и его влияния на репродукцию вируса гриппа А в культуре клеток MDCK // Хим.-фарм. журнал, 1999, № 6. С. 14-17.

15. Leneva I., Roberts N., Govorkova E., Goloubeva O., and Webster R.G. The neuraminidase inhibitor GS4104 (oseltamivir phosphate) is efficacious against A/Hong Kong/156/97 (H5N1) and A/Hong Kong/1074/99 (H9N2) influenza virus // Antiviral Research, 2000,V. 48. P. 101-115.

16. Glushkov R., Guskova Т., Leneva I., Krylova L. The new data of Arbidol activity // XVI International Symposium on Medical Chemistry, Bologna, Italy, 2000. P.561.

17. Hoffmann E., Stech J., Leneva I., Krauss S., Scholtissek C., Chin P., Peiris M., Schortridge K., Webster R. Characterization of the influenza A virus gene pool in avian species in Southern China: was H6N1 a derivate or a precursor of H5N1? // Journal of Virology.-2000,V.74. P.6309-6315.

18. Leneva I., Goloubeva O., Fenton R., Tisdale M., and Webster R.G. Efficacy of zanamivir against avian influenza A viruses that possess genes encoding H5N1 internal proteins and are pathogenic in mammals // Antimicrob.Agents Chemotherapy, 2001,V.45.P. 1216-1224.

19. Govorkova E.A., Leneva I.A, Goloubeva O.G., Bush K., Webster R.G. Comparison of the efficacy of RWJ-270201, zanamivir, and oseltamivir against H5N1, H9N2, and other avian influenza viruses // Antimicrob. Agents and Chemotherapy,

2001.V.45. P. 2723-2732.

20. Leneva I., Hay A. The mechanism of action of arbidol against influenza virus-selection and characterization of arbidol-resistant mutants // 12th International Congress of Virology, Paris, 2002. Abs. 1077.

21. Ленева И.А., Федякина И.Т., Соколова M.B., Гуськова Т.А. Использование иммуноферментного анализа для изучения действия противовирусного препарата на репродукцию респираторно-синцитиального вируса // Вопросы вирусологии,

2002, №2. С. 42-45.

22. Ленева И.А., Гуськова Т.А., Глушков Р.Г. Лекарственные средства для химиотерапии и химиопрофилактики гриппа: особенности механизма действия, эффективность и безопасность (обзор) // Хим.-фарм. журнал, 2004, №11. С.8-14.

23. Ленева И.А., Федякина И.Т., Фадеева Н.И., Гуськова Т.А., Глушков Р.Г. Изучение противовирусной активности препарата арбидол в культурах клеток //

РОС НАЦИОНАЛЬНА." [ БИБЛИОТЕКА | С. Петербург ОЭ КМ шаг

Новые лекарственные препараты, 2004, №. 11. С. 16-21.

24. Ленева И.А. Арбидол-эффективный препарат для лечения и профилактики гриппа и ОРВИ у детей // Русский медицинский журнал, 2005, № 13. С.72-75.

25. Leneva I., Shuster A., Hay A., Glushkov R. The Features of Antiviral Action of Arbidol. Selection and Characterization of Arbidol-Resistant Mutants. Antiviral Research, 2005/V. 11. Abs. 122.

26. Ленева И.А., Федякина И.Т., Гуськова T.A., Глушков Р.Г. Чувствительность различных штаммов вируса гриппа к арбидолу. Изучение эффекта арбидола на репродукцию вируса гриппа А в комбинации с различными противовирусными препаратами // Терапевтический архив, 2005, № 8. С. 84-88.

27. Leneva I., Shuster A., Fedyakina I., Glushkov R. Sensitivity of Different Strains of Influenza Viruses to Arbidol. Combination Study of Arbidol in Cell Culture with Other Antivirals // ХШ International Congress of Virology, San Francisco, California, USA, July 23-28,2005, Abs. V-33. P.7.

Типография ООО «Телер» 127299 Москва, ул. Космонавта Волкова, 12 тел.: 937-86-64,156-40-84

Подписано в печать 21.09.2005 г. Формат 60x90 1/16. Тираж 120 Бумага «Снегурочка» 1,5 печл. Заказ № П 666

IM 7 О 72

РНБ Русский фонд

2006-4 11615

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Ленева, Ирина Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА I. Структура и репродукция вируса гриппа.

ГЛАВА II. Противогриппозные химиопрепараты этиотропного действия II. 1 .Амантадин и ремантадин

Н.2.3анамивир и озельтамивир.

ГЛАВА Ш.Арбидол.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА IV. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

IV. 1 .Клетки.

IV.2. Вирусы.

IV.3. Химиотерапевтические препараты и химические соединения.

IV.4. Определение цитотоксического действия соединений.

IV.5.Изучение противовирусной активности препаратов с использованием метода ингибирования цитопатического действия вирусов.

ГУ^б.Изучение противовирусной активности препаратов с использованием метода ингибирования бляшкоообразующей активности (БОА) вируса гриппа.

ГУ^7.Изучение противовирусной активности соединений методом иммуноферментного анализа ( ИФА) в культуре клеток MDCK в отношении вирусов гриппа А, В и С.

IV.Б.Изучение противовирусной активности препаратов методом

ИФА в культуре клеток Нер-2 в отношении РСВ.

IV.9. Изучение противовирусной активности препаратов методом ИФА в культуре клеток HeLa в отношении аденовируса человека.типа 5.

IV.10. Изучение противовирусной активности арбидола методом

ИФА в зависимости от времени добавления препарата.

IV.11. Определение содержания арбидола в клетках, клеточных мембранах и внеклеточной среде.

IV. 12. Концентрирование и очистка вирионов вируса гриппа.

IV. 13. Изучение транскриптазной активности рибонуклеопротеида ( РНП) вируса гриппа.

IV. 14. Анализ геномных РНК ( вРНК) вируса гриппа в полиакриламидном геле (ПААГ).

IV. 15. Анализ вирусспецифических белков вируса гриппа в полиакриламидном геле (ПААГ).

IV. 16. Определение действия препаратов на нейраминидазную активность вируса гриппа.

IV. 17. Определение действия арбидола на гемолиз эритроцитов, индуцируемый вирусом гриппа при рН=5,5.

IV. 18. Определение действия арбидола на ранние стадии вирусной репродукции вируса гриппа с использованием метода. рассвечивания флуоресценции (РФ).

A) Синтез флуоресцентного зонда.

Б)Мечение вируса.

B) Измерение связывания вируса с клетками.

Г) Измерение слияния вирусной липидной мембраны с мембранами клеток.

IV.19. Изучение гемолиза эритроцитов, индуцируемого вирусом дикого типа и арбидолрезистентными мутантами.

IV.20. Определение конформационного перехода НА из нативного состояния в состояние при низком рН с использованием конформационных антител (КАТ).

IV.21. Определение конформационных изменений НА с использованием конформационных антител (КАТ).

IV.22.Определение конформационных изменений НА в зависимости от времени инкубации клеток с препаратом.87 IV.23.Определение первичной последовательности генов, кодирующих НА и М белки.

IV.24. Изучение комбинированного действия противогриппозных препаратов методом ИФА.

IV.25. Статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

ГЛАВА V. Изучение противовирусной активности арбидола с использованием метода ИФА.

V.I. Изучение цитотоксического действия арбидола в культурах клеток различного происхождения.

V.2. Отработка условий детекции репродукции вируса гриппа А и В в культуре клеток MDCK.

V.3. Определение возможности вирулицидного действия арбидола.

V.4. Влияние арбидола на репродукцию вируса гриппа А, В и С в культуре клеток MDCK.

V.5. Влияние различных концентраций арбидола на репродукцию вирусов гриппа А/Пуэрто-Рико/8/34 , А/Япония/305/57 и В/Ли

40 в культуре клеток MDCK.

V.6. Влияние арбидола на репродукцию различных антигенных серотипов вируса гриппа А человека в культуре клеток

MDCK.

V.7. Влияние арбидола на репродукцию в культуре клеток MDCK вирусов гриппа птиц А подтипов НА Н5,Н6,Н9.

V.8. Влияние арбидола на репродукцию ремантадин-чувствительного и ремантадинрезистентных вирусов гриппа А в культуре клеток MDCK.

V. 9. Сравнение действия арбидола на репродукцию вируса гриппа А/Аичи/2/68 в клетках MDCK иУего.

V. 10. Влияние арбидола на различные стадии репродукции вирусов гриппа А и В в культуре клеток MDCK.ИЗ

V. 11 .Сравнительное изучение влияния арбидола и других противовирусных препаратов на репродукцию вирусов гриппа А в культуре клеток MDCK.

V.12. Отработка детекции экспрессии РСВ и аденовируса типа 5 в культурах клеток.

V.13. Изучение влияния арбидола, рибавирина и рибамидила на репродукцию РСВ и аденовируса в культурах клеток.

V.14.3аключение

ГЛАВА VI. Изучение противовирусной активности соединений в ряду индолов

VI. 1. Влияние аналогов арбидола на репродукцию вируса гриппа

А/Япония /305/57 в культуре клеток MDCK.

VI.2. Влияние аналогов арбидола на репродукцию РСВ в

Культуре клеток Нер-2.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизм вирусспецифического действия препарата Арбидол"

Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Грипп является острым респираторным заболеванием, наносящим значительный ущерб здоровью людей и приводящим к огромным экономическим потерям. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, каждый год во время эпидемий болеет от 5 до 15% населения, и по приблизительным оценкам, в целом в мире смертность от гриппа достигает 250 ООО - 300 ООО случаев в год, преимущественно среди людей пожилого возраста или страдающих хроническими заболеваниями [8,122,221]. По оценкам Центра Контроля и Профилактики Заболеваний в Атланте, каждый год в США от гриппа и осложнений после него умирает в среднем 36000 человек и госпитализируется около 90 000 человек, а ежегодный экономический ущерб от эпидемий гриппа оценивается в пределах от 71 до 167 миллиардов долларов США. В России на протяжении последних 10-15 лет ежегодно регистрируется от 27,3 до 47, 2 млн. случаев заболеваний ОРВИ, причем удельный вес гриппа в структуре ОРВИ колеблется от 25 до 60% в зависимости от интенсивности эпидемий и пандемий гриппа [34,122,179,221]. Поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин и нейраминидаза подвергаются постоянным изменениям (антигенный дрейф), приводящим к последовательному вытеснению из популяции людей ранее циркулировавших штаммов вируса гриппа А. В случае реассортации между штаммами вируса гриппа А человека, млекопитающих и птиц (шифтовые изменения) могут возникать новые пандемические вирусы гриппа типа А [8, 25, 34, 52,122, 140]. Вспышка заболевания гриппом среди людей в Гонконге в 1997 г., вызванная вирусом гриппа птиц подтипа H5N1, беспрецедентные эпизоотии, вызванные в последнее время вирусами гриппа птиц, в частности в России, а также участившиеся случаи заражения этими вирусами людей в странах Южной и Юго-Восточной Азии, сопровождавшиеся необычайно высокой смертностью, вызывают оправданные опасения, что эти события могут стать началом новой пандемии гриппа. Чрезвычайная изменчивость поверхностных белков вируса гриппа А является причиной, из-за которой может снижаться эффективность вакцинации, рекомендованной в настоящее время Всемирной Организацией Здравоохранения в качестве основного средства борьбы против гриппа [34,122,179, 221]. При появлении новых штаммов, содержащих измененные поверхностные антигены, предшествующий гуморальный иммунитет оказывается недостаточным. Как показывает опыт, для создания, тестирования на безопасность и распространения в достаточном количестве эффективной вакцины к такому вновь возникшему штамму вируса гриппа требуется около 6 месяцев. Этот промежуток времени является чересчур длительным в условиях приближающейся эпидемии гриппа. Кроме того, вакцинация не всегда эффективна у людей пожилого возраста, у пациентов, страдающих хроническими заболеваниями и нарушениями функций иммунной системы [120,169, 178, 186]. В связи с вышеизложенным особую важность и актуальность приобретает проблема разработки и применения препаратов для лечения и профилактики гриппа. Арсенал средств, используемых для этих целей, охватывает практически все возможные способы влияния на инфекционный процесс и включает в себя средства иммунокоррегирующей, патогенетической и симптоматической терапии, вирулицидные препараты, однако ведущее место принадлежит препаратам этиотропного действия, оказывающим непосредственное воздействие на вирусную репродукцию. К настоящему времени в мире и в России для лечения и профилактики гриппа широкое применение получили несколько групп таких препаратов. К первому поколению относятся препараты адамантанового ряда: амантадин и ремантадин. Однако их использование ограничено отсутствием активности в отношении вирусов гриппа В, наличием серьезных побочных эффектов и возможностью возникновения резистентных к ним штаммов вируса гриппа [60,61,107,111]. К препаратам второго поколения относятся ингибиторы нейраминидазы: применяемый в виде ингаляций или аэрозольного спрея занамивир и используемый в виде капсул или таблеток озельтамивир. Наряду с высокой стоимостью этих препаратов к их недостаткам относятся побочные эффекты в виде раздражения носоглотки при приеме занамивира и в виде тошноты и рвоты при приеме озельтамивира[111,136]. Из вышесказанного следует, что существующие препараты не являются идеальными, в связи с чем сохраняется необходимость создания новых с отличным от них механизмом действия. Совместными усилиями ученых Центра по химии лекарственных соединений - Всероссийского научно-исследовательского химико-фармацевтического института, Научно-исследовательского института медицинской радиологии РАМН (г.Обнинск) и Ленинградского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Пастера был разработан оригинальный препарат арбидол, рекомендованный Фармакологическим Комитетом Минздрава России для лечения и профилактики гриппа А и В у взрослых и детей [15, 39, 97]. Клинические испытания, проведенные более чем на 10000 пациентах, а также опыт почти 15-летнего использования в медицинской практике свидетельствуют об эффективности и безвредности арбидола и отсутствии у него побочных эффектов. Высокая терапевтическая эффективность этого представителя из класса индола является результатом разнообразия его биологической активности и обусловлена иммуномодулирующим, интерферониндуцирующим, антиоксидантным и вирусспецифическим действием[ 11, 12,15, 97, 165]. Если иммуномодулирующие, интерферониндуцирующие и антиоксидантные свойства арбидола изучены довольно подробно, наличие вирусспецифического действия у арбидола до сих пор вызывало сомнение у ряда специалистов. Изучение вирусспецифического действия арбидола, его механизмов целенаправленно не проводилось, а касавшиеся этого вопроса данные имели поверхностный характер и были недостаточно аргументированы. Доказательство наличия у арбидола вирусспецифического действия и выявление вирусспецифической мишени, на которую направлено это действие, являлось принципиально важным для того, чтобы поставить арбидол в один ряд с препаратами адамантанового ряда и ингибиторами нейраминидазы. Это определяло актуальность данной проблемы, решение которой позволило получить новую необходимую информацию о противовирусных свойствах арбидола для оптимизации его применения в клинической практике. Доказательство и установление механизма вирусспецифического действия арбидола также может способствовать его более широкому применению и завоеванию достойного места в ряду фармацевтических препаратов.

1 .Изучение особенностей вирусспецифической активности арбидола в отношении вирусов гриппа в культуре клеток, включая штаммовую специфичность, широту спектра действия и временные интервалы проявления наибольшей активности. 2.0пределение спектра противовирусного действия арбидола в культуре клеток в отношении других вирусов, вызывающих респираторные инфекции.

4.Выяснение возможности формирования у вирусов гриппа мутантов, резистентных к арбидолу, подтверждение их резистентности, изучение их свойств, а также определение генетической основы резистентности к арбидолу.

Научная новизна исследования. 1. Впервые показано отсутствие у арбидола штаммовой специфичности в отношении трех антигенных серотипов вирусов гриппа А человека: H1N1, H2N2, H3N2, наличие активности в отношении вирусов гриппа птиц подтипа H5N1 и H9N2, вызвавших гриппозную инфекцию у людей, и в отношении ремантадинрезистентных штаммов вирусов гриппа.

3. Впервые выявлена корреляция между наиболее высоким антивирусным эффектом арбидола и его концентрацией в клетках и клеточных мембранах через 3-4 часа после добавления препарата к клеточной культуре. t 4. Впервые идентифицирована стадия вирусной репродукции, ингибируемая арбидолом. Установлено, что арбидол ингибирует слияние липидной оболочки вируса с мембранами эндосом, происходящее внутри клеток. Показано, что арбидол не оказывает воздействия на адсорбцию, транскрипцию и трансляцию, а также нейраминидазную активность вируса гриппа.

5. Среди 47 изученных производных арбидола из ряда 5-оксииндолов выявлено 17 соединений, обладающих противовирусной активностью в отношении вируса гриппа А. Впервые в химическом ряду 5-оксииндолов выявлены соединения, подобно арбидолу ингибирующие эндоцитоз вируса гриппа А. Впервые в химическом ряду 5-оксииндолов выявлены соединения с противовирусной активностью в отношении РСВ. Из 7 соединений, изученных в отношении их способности ингибировать репродукцию РСВ в культуре клеток, было выявлено 4 соединения с активностью на уровне арбидола.

6. Впервые путем многократных пассажей в клеточных культурах получены и охарактеризованы вирусные мутанты, резистентные к арбидолу, и изучены молекулярно-биологические основы резистентности к нему. Впервые показано, что вирусным белком, на который направлено действие арбидола и который определяет чувствительность к нему, является гемагглютинин (НА) вируса гриппа. Все мутанты, резистентные к арбидолу, имели аминокислотные замены только в субъединице НА2 НА мутантных вирусов гриппа и индуцировали слияние липидной оболочки вируса с клеточными мембранами при более высоком рН, чем вирус дикого типа. Арбидол не вызывал конформационных изменений у НА резистентных мутантов, в то время как его добавление к НА вируса дикого типа вызывало сдвиг конформационного перехода НА.

7. Изучено комбинированное действие арбидола в культуре клеток с каждым из противогриппозных препаратов: амантадином, ремантадином, карбоксилатом озельтамивира, рибавирином и рибамидилом. Показано, что это действие увеличивало эффект препаратов на вирусную репродукцию по сравнению с эффектом, оказываемым каждым их этих препаратов в отдельности. Наибольший ингибирующий эффект при комбинированном действии арбидола с каждым из изученных препаратов был получен при использовании их низких концентраций, а при комбинированном действии с ингибиторами нейраминидазы также и при более позднем добавлении арбидола к клеткам.

8. Впервые изучено совместное действие на репродукцию вируса гриппа А арбидола с применяемыми в качестве симптоматических средств анальгином и ацетилсалициловой кислотой и показано, что добавление этих препаратов не снижало ингибирующего действия арбидола на вирусную репродукцию в культуре клеток. Научно-практическая значимость исследования:

2. Данные об ингибировании арбидолом в клеточных культурах репродукции вируса гриппа С, аденовируса, РСВ могут служить обоснованием для использования арбидола как этиотропного препарата в отношении инфекций, вызванных этими возбудителями.

4. Данные об увеличении эффективности действия в культуре клеток противо-гриппозных препаратов при сочетанном использовании их с арбидолом открывают перспективу для их клинического изучения при комбинированной терапии гриппозной инфекции и их следует учитывать при разработке доз и схем лечения при комбинированной терапии гриппа в целях более рационального и в то же время эффективного использования этих препаратов в клинической практике.

5. С использованием ИФА разработан, апробирован и внедрен для практического применения в научных лабораториях метод для быстрого и количественного определения противовирусной активности соединений в отношении респираторных вирусов в культуре клеток. Обнаружение в ряду производных 5-оксииндолов значительного количества соединений с высокой противовирусной активностью в отношении вируса гриппа и РСВ, а также обнаружение среди них соединений, способных так же, как и арбидол, ингибировать эндоцитоз вируса гриппа, открывает новое направление в химиотерапии вирусных инфекций и делает перспективным дальнейший поиск новых противовирусных препаратов в этом ряду.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Арбидол обладает широким спектром противовирусной активности, ингибируя репродукцию трех основных антигенных серотипов H1N1, H2N2, H3N2 и ремантадинрезистентных вирусов гриппа А человека, вирусов гриппа птиц подтипов НА Н5, Н9 и Н6, вызвавших заболевания людей или имеющих общие или близкородственные с ними гены, вирусов гриппа В и С, а также респираторно-синцитиального вируса и аденовируса в культуре клеток.

3. Впервые получены мутанты, резистентные к арбидолу, все из которых, имели аминокислотные замены в различных положениях субъединицы НА2 НА вируса гриппа. Арбидолрезистентные мутанты индуцируют слияние липидной оболочки вируса с клеточными мембранами при более высоком рН, чем вирус дикого типа, и при добавлении к ним арбидола у них не происходит сдвига конформационного перехода, наблюдаемого у вируса дикого типа.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Грипп является острым респираторным заболеванием, наносящим вред здоровью людей, приводящим к огромным экономическим потерям и до настоящего времени плохо поддающимся контролю. По оценкам Центра Контроля и Профилактики Заболеваний в Атланте, ежегодно в США от гриппа и осложнений после него умирает от 20000 до 40000 людей и госпитализируются около 110 000 [122,180,223]. В России на протяжении последних 15-20 лет ежегодно регистрируется от 27,3 до 47, 2 млн. случаев заболеваний ОРВИ, причем удельный вес гриппа в структуре ОРВИ колеблется в зависимости от интенсивности эпидемий гриппа от 10 до 60% [44,46]. Экономический ущерб, причиняемый гриппом и ОРВИ, ежегодно составляет около 86% от всего ущерба, наносимого инфекционными болезнями. Заболевание продолжается от 34 дней до двух недель и сопровождается высокой температурой, лихорадкой, головной болью, миалгией и другими симптомами, характерными для острой респираторной инфекции. Часто грипп приводит к осложнениям и развитию вторичных инфекций [164]. У детей, несмотря на то, что в большинстве случаев исход болезни благоприятен, опасность заболевания гриппом заключается в осложнениях, наблюдаемых в виде поражений центральной нервной системы: от легких неврологических расстройств до поражений головного мозга [30]. Такие осложнения, как бронхит, пневмония, острый средний отит, регистрируются у каждого третьего ребенка, больного гриппом и ОРВИ [46]. Большинство смертельных исходов после заболевания гриппом у людей 65 лет и старше вызвано развитием пневмонии или обострением уже существующих сердечно-легочных и других заболеваний [8,9, 111,179, 180,223].

Всемирной Организацией здравоохранения в качестве основного средства борьбы против гриппа в настоящее время рекомендована вакцинация, однако эффективность ее применения ограничена в связи со способностью поверхностных белков вируса гриппа гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) подвергаться быстрым и непредсказуемым изменениям [8, 9, 83,122]. Состав вакцины меняется в зависимости от изменения антигенной структуры циркулирующих вирусов гриппа, предсказать которую заранее практически невозможно. Изменения поверхностных антигенов вируса гриппа, определяющих гуморальный иммунитет к этой инфекции, происходят двумя путями [9, 34, 163, 221,222]. Один из них - антигенный сдвиг, являющийся результатом реассортации сегментов вирусного генома двух различных штаммов вируса гриппа, приводящий к внезапному появлению новых антигенных подтипов вируса гриппа, иммунитет к которым в человеческой популяции отсутствует. Полагают, что именно такие вирусы явились возбудителями трех пандемий, имевших место в XX веке. Наиболее тяжелой была пандемия "испанского гриппа " в 1917-1918 г.г., по разным данным унесшая жизни 20-50 миллионов человек и вызванная вирусом гриппа А антигенного подтипа H1N1. Следующие пандемии гриппа, имевшие место в 1957 году ("азиатский грипп") и в 1968 году ("гонконгский грипп"), были вызваны вирусами гриппа H2N2 и H3N2 соответственно. До недавнего времени считали, что только эти три антигенных подтипа вируса гриппа А человека H1N1 , H2N2 и H3N2 , явившиеся результатом такого антигенного сдвига, могут вызвать развитие инфекции у людей [9,34, 120,219,220, 221] . Однако в 1997 году было установлено 18 случаев заболевания гриппом в Гонконге, вызванных птичьим вирусом H5N1, 6 из которых закончились смертельным исходом

75,88,210]. Через год другой птичий вирус H9N2 был выделен от двух детей с респираторными симптомами [176]. В конце 2003 - начале 2004 года в ряде азиатских стран у людей вновь были зафиксированы вспышки гриппа, вызванного птичьими вирусами H5N1, приведшие к тяжелым заболевания, в том числе и со смертельным исходом [216, 223]. Имеющиеся данные дают возможность предположить, что эти новые штаммы вирусов гриппа возникли путем реассортации между птичьим вирусом гриппа и вирусом гриппа человека или путем непосредственной трансмиссии птичьего вируса в человеческую популяцию [25,34,52,223]. Другой особенностью вируса гриппа является постоянно продолжающийся антигенный дрейф, происходящий в пределах одного подтипа и заключающийся, главным образом, в точечных мутациях в генах поверхностных белков гемагглютинина и нейраминидазы [28, 34, 221]. Этот процесс приводит к возникновению штаммов, мало отличающихся от вируса-предшественника, которые последовательно вытесняют из популяции людей ранее циркулировавшие штаммы. Таким образом, штаммы, вызывающие заболевания, постоянно меняются и поэтому способны вызывать заболевания у людей, не имеющих к ним иммунитета. Как показывает опыт, для создания, проверки на безопасность и распространения в достаточном количестве эффективной вакцины к такому вновь возникшему штамму вируса гриппа требуется около 6 месяцев. Этот промежуток времени является довольно длительным, что создает определенные трудности для своевременной вакцинации населения в условиях приближающейся эпидемии гриппа. Кроме того, вакцинация не всегда эффективна и безопасна для лиц пожилого возраста и пациентов с нарушениями функций иммунной системы [122,170,179,187].

В связи с вышеизложенным особую важность и актуальность приобретает проблема разработки и применения препаратов для лечения и профилактики гриппа. Арсенал средств, используемых для облегчения течения гриппозной инфекции, охватывает практически все возможные способы влияния на инфекционный процесс и включает в себя химиопрепараты этиотропного действия, вирулицидные препараты, средства иммунокоррегирующей, патогенетической и симптоматической терапии. К средствам патогенетической и симптоматической терапии, применяемым при комплексном лечении гриппа, относятся препараты, оказывающие жаропонижающее и противовоспалительное действия, улучшающие функции легких и бронхов, а также десенсилибилизирующие препараты (аспирин, эффералган, панадол, колдрекс, бутадион, метиндол, бронхолитин, солутан, тавегил, диазолин и др.). В основе действия вирулицидных препаратов лежит инактивация внеклеточного вируса. К известным вирулицидным препаратам, применяемым для лечения и профилактики гриппозной инфекции, относятся теброфен, флореналь, оксолиновая мазь и другие [18,19,35]. Особенно широкое распространение получила оксолиновая мазь, обладающая вирулицидной активностью в отношении миксо- и риновирусов, а также вируса герпеса. Для профилактики гриппа используют 0,25% мазь оксолина. Широкое распространение в России для лечения гриппа и ОРВИ получили средства повышения неспецифической резистентности организма, к которым относятся препараты интерферона (ИФН) и иммуномодуляторы [18,20,21,22]. Существующие медицинские препараты ИФН делятся по типу активного компонента на 01-, ft-, у - ИФН, а по времени создания и применения - на природные человеческие лейкоцитарные ИФН ( первое поколение), занимающие в настоящее время лидирующее положение, полученные с помощью современных биотехнологий рекомбинантные ИФН ( второе поколение) и гибридные , синтетические или мутантные ИФН ( третье поколение) [20]. Механизм действия ИФН заключается в индукции синтеза протеинкиназы, фосфорилирующей один из инициирующих факторов трансляции, после чего этот фактор не может обеспечить образование инициирующего комплекса. Избирательное подавление трансляции вирусных матриц обусловлено либо большей чувствительностью вирусной системы трансляции к фосфорилированию инициирующего фактора, либо специфическим выключением трансляции в зараженных клетках. В обработанных интерфероном клетках индуцируется синтез фермента, синтезирующего 2-5-олигоадениловую кислоту 2-5-А-синтетазы, которая вызывает активизацию латентных нуклеаз, разрушающих свободные вирусные и-РНК. В результате те вирусные РНК, которые не смогли связаться с рибосомами, подвергаются разрушению нуклеазами. Подавление ИФН стадии инициации трансляции и разрушение и-РНК вируса обуславливают его универсальный механизм действия при инфекциях, вызванных различными вирусами [20,21,22]. Клинический эффект получен при применении как моновалентных препаратов интерферона (бетаинтерферон, реаферон, реальдирон, роферон А, интрон А, человеческий лейкоцитарный интерферон), так и комбинированных с полимерами или витаминами препаратов (гриппферон, виферон). Параллельно с исследованиями препаратов экзогенного ИФН проводились работы по созданию и испытанию индукторов интерферона, способных индуцировать в организме человека продукцию эндогенного интерферона. Первые из открытых индукторов интерферона обладали высокой токсичностью, однако в результате целенаправленного скрининга было выявлено несколько перспективных индукторов интерферона, имеющих высокий химиотерапевтический индекс и пригодных для профилактики и лечения вирусных инфекций. Для профилактики и лечения гриппа используются синтетические низкомолекулярные соединения: флуорены (амиксин), азотистые основания (камедон и циклоферон), а также природные и синтетические высокомолекулярные полимеры (кагоцел, ридостин, полудан). Все они обладают широким диапозоном противовирусной активности и иммуномодулирующими свойствами. При введении в организм индукторы интерферона вызывают ряд неспецифических и специфических эффектов. Неспецифические эффекты связаны с ингибированием роста клеток, модуляцией их дифференцировки и синтезом мембранных рецепторов, специфические - с действием на различные звенья системы иммунитета, что выражается в активации макрофогов, цитотоксических Т-клеток, антителообразующих В-клеток, естественных киллеров и др. [18,20,22]. Одним из свойств индукторов интерферона является формирование в организме неспецифической резистентности на длительный период времени. Несмотря на общность свойств, каждый из индукторов интерферона имеет свои особенности. Так, например, амиксин вызывает медленную продукцию ИФН Т-лимфоцитами, в то время как циклоферон быструю продукцию ИФН В-лимфоцитами. Циклоферон вызывает образование ряда противовоспалительных цитокинов, что позволяет рассматривать его как регулятор цитокиновой сети [18, 20,21,22]. Особое место среди перечисленных препаратов занимает комплексный препарат цитовир-3. В основе действия входящих в него веществ лежит активация синтеза эндогенного интерферона и предотвращение формирования вторичного иммунодефицитного состояния. Цитовир-3 включает в себя : дибазол-индуктор интерферона, тимоген -иммуномодулятор, усиливающий интерфероногенный эффект дибазола и оказывающий иммунокорригирующий эффект на реакции клеточного, гуморального иммунитета и неспецифическую резистентность организма; а также аскорбиновую кислоту [18]. Однако, несмотря на многообразие препаратов, применяемых для лечения и профилактики гриппа, основное и ведущее место среди них принадлежит химиопрепаратам этиотропного действия. Данные препараты оказывают непосредственное воздействие на репродукцию вируса и направлены на определенную вирусспецифическую мишень в цикле вирусной репродукции. В первой части обзора будут представлены современные данные, касающиеся структуры вируса гриппа и цикла его репродукции.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Ленева, Ирина Анатольевна

ВЫВОДЫ:

1. Арбидол в клеточных культурах в одинаковой степени ингибирует репродукцию антигенных серотипов вирусов гриппа А человека H1N1, H2N2, H3N2, а также ремантадинчувствительных и ремантадин-резистентных штаммов вирусов гриппа А.

2. Арбидол ингибирует репродукцию вирусов гриппа птиц А : H5N1 и H9N2, вызвавших заболевания у людей, H6N1 и H9N2, имеющих общие с H5N1 и H9N2 внутренние гены, а также H5N2 и H5N3, изолированных от диких птиц на территории России.

6. Исследования с реассортантами между А/ВЧП/Вейбридж/ (H7N7) и А/Сингапур/1/57 (H2N2), имеющими различный набор генов, показали, что чувствительность реассортантов к арбидолу определяется геном, кодирующим НА.

8. Слияние липидной оболочки вируса с клеточными мембранами у арбидолрезистентных мутантов происходит при более высоком рН, чем у вируса дикого типа. Арбидол не вызывает конформационных изменений НА у резистентных к нему мутантов, в то время как его добавление к НА вируса дикого типа вызывает сдвиг конформационного перехода НА.

9. Комбинированное использование арбидола с каждым из изученных противогриппозных препаратов (амантадин, ремантадин, рибавирин, рибамидил, карбоксилат озельтамивира) увеличивало их эффект подавления вирусной репродукции в культуре клеток по сравнению с эффектом, оказываемым этими же концентрациями препаратов в отдельности. Во всех случаях наибольшее усиление ингибирующего эффекта было получено при использовании низких доз препаратов, а при комбинированном использовании арбидола с карбоксилатом озельтамивира также и при более позднем добавлении арбидола к клеткам.

10. Добавление симптоматических препаратов анальгина и ацетилсалициловой кислоты совместно с арбидолом не снижало его ингибирующего действия на вирусную репродукцию в культуре клеток.

XIV. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на то, что прошло уже больше, чем 70 лет, с открытия вируса гриппа, начала его тщательного изучения и разработки первой вакцины против него, грипп все еще остается серьезным заболеванием, приводящим к огромным экономическим потерям и высокой смертности, особенно среди людей пожилого возраста и людей, относящимся к так называемым группам повышенного риска Изучение огромного количества химических соединений увенчалось разработкой нескольких этиотропных химиопрепаратов, которые в настоящее время используются для лечения и профилактики гриппа. К наиболее изученным и широко применяемым относятся препараты адамантанового ряда , среди которых основными являются амантадин и ремантадин, ингибиторы нейраминидазы занамивир и озельтамивир.

Наши исследования показали, что арбидол обладает широким спектром противовирусной активности, ингибируя репродукцию различных антигенных серотипов и ремантадинрезистентных вирусов гриппа А человека, вирусов гриппа птиц подтипов НА Н5 и Н9, вирусов гриппа В и С, также репродукцию РСВ и аденовируса. Проведенные нами исследования по идентификации стадии вирусной репродукции, игибируемой арбидолом, и получение и изучение свойств мутантов, резистентных к нему, доказывают наличие у арбидола вирусспецифического механизма действия. Арбидол ингибирует процесс слияния липидной оболочки вируса с мембранами эндосом, взаимодействуя с НА вируса гриппа и увеличивая его стабильность к конформационным изменениям, необходимым для осуществления этого слияния. Полученные данные с полным основанием позволяют отнести г арбидол к этиотропным препаратам первой линии защиты от гриппа. Проведенное нами изучение действия арбидола в сочетании с различными противогриппозными препаратами, обладающими отличным от арбидола механизмом действия, показало, что комбинация этих препаратов с арбидолом увеличивает их эффект на вирусную репродукцию в культуре клеток, что позволяет для достижения того же самого эффекта при комбинации арбидола с ремантадином, рибавирином и рибамидилом использовать более низкие концентрации последних или при комбинации с ингибиторами нейраминидазы начинать лечение арбидолом на более позднем этапе.

Разнообразие биологической активности арбидола, выражающееся наряду с его вирусспецифическим действием интерферонидуцирующем, иммуномодулирующем и антиоксидантном действиях, а также обширные данные клинических испытаний свидетельствующие об эффективности и безвредности арбидола делают этот препарат весьма эффективным для лечения и профилактики гриппозной инфекции. Несмотря на опыт 15-летнего применения арбидола в медицинской практике, терапевтические и профилактические возможности арбидола еще не исчерпаны. Арбидол обладает широким спектром активности в отношении ряда ОРВИ, для профилактики и лечения которых в настоящее время не существует вакцин и эффективных препаратов. Дальнейшее изучение эффективности арбидола в отношении этих ОРВИ в клинических испытаниях может привести к позиционированию арбидола как препарата, не требующего проведения предварительной лабораторной диагностики перед началом лечения. Перспективными представляются дальнейшие исследования по изучению комбинированного использования арбидола с другими противовирусными препаратами, обладающими отличным от него механизмом действия, а также изучение возможности комбинации с этими препаратами в одной лекарственной форме. Кроме того, в случае возникновении пандемии, вызванной новым штаммом вируса гриппа, вакцины к которому еще не существует, или при угрозе биотеррористической атаки с использованием высокопатогенных штаммов вируса гриппа необходимо иметь достаточный запас арбидола, что требует изучения его стабильности в условиях длительного хранения.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Ленева, Ирина Анатольевна, Москва

1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях.//Ленинград: Медгиз.- 1962.- 180с.

2. Беляев А.Л., Бурцева Е.И., Слепушкин А.Н. Арбидол-новое средство для профилактики гриппа и острых респираторных вирусных инфекций у детей.// Вестник РАМН.- 1996.- №3.-С. 34-37.

3. Борисова A.M., Артемова О.П., Забаютникова О.Д. Клинико-иммунологическая оценка эффективности применения арбидола у больных вторичными дефицитами. // Иммунология .-1996.- №2.- С. 58-61.

4. Гагаринова В.М., Игнатьева Г.С., Синицкая Л.В., Иванова A.M., Родина М.А., Гурьева А.В. Новый химиопрепарат арбидол: профилактическая эффективность во время эпидемий гриппа. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -1993.- №5.-С.40-43.

5. Галегов Г.А., Львов Н.Д., Петрова И.Р., Флорентьев В.Л. Рибавирин как антивирусный химиопрепарат: химия, молекулярный механизм действия,возможности клинического применения. // Вопросы медицинской химии.-1986.-№32.-С. 10-19.

6. Гендон Ю.З. Пандемия гриппа: можно ли с ней бороться? //Вопросы вирусологии.-1995.-№2.- С.8-12.

7. Гендон Ю.З. Стратегия борьбы с гриппом с помощью гриппозных вакцин. // Вакцинация.-2001.-№5 (11).-С.З.

8. Герасина С.Ф., Фарашанян В.П., Фадеева Н.И., Першин Г.Н., Жданов В.М. Синтез вирусспецифических РНК в инфицированных клетках в присутствии бонафтона. // Фармакология и токсикология.-1985.-№4.-С.92

9. Глушков Р.Г., Гуськова Т.А., Крылова Л.Ю., Николаева И.С. Механизмы иммуномодулирующего действия арбидола. // Вестник Р АМН.-1999.-№3.-С.36-40.

10. Гмурман В.Е. Теория вероятностей и математическая статистика. // Москва: Высшая школа.-2002.-479с.

11. Гуськова Т.А. Токсикология лекарственных средств. // Москва, 2003.-103с.

12. Гуськова Т.А.и Глушков Р.Г. Арбидол-иммуномодулятор, индуктор интерферона, антиоксидант.// Москва, 1999.- 93с.

13. Дриневский В.П. Осидак Л.В. Нацина В.К. и др. Химиопрепараты в терапии гриппа и других респираторных вирусных инфекций. // Антибиотики и химиотерапия . 1998.- №9.- С.29-34.

14. Еропкин М.Ю., Еропкина Е.М. Культуры клеток как модельная система исследования токсичности и скрининга цитопротекторных препаратов. // С.-Петербург: Морсар АВ, 2003.-239 с.

15. Ершов Ф.И., Касьянова Н.В. Современные принципы профилактики и лечения гриппа и ОРВИ. Антигриппин. Интернет версия на сайте http://www.antigrippin.ru.

16. Ершов Ф.И. Противовирусные средства. // Клиническая фармакология и терапия. -1995.-№4.-С.72-75.

17. Ершов Ф.И. Интерфероны. // Вопросы вирусологии.-1998.-№6.-С. 247I252.

18. Ершов Ф.И. Этиотропная терапия наиболее распространенных вирусных инфекций. // Вестник РАМН.-2001.-№11.-С.34-39.

19. Ершов Ф.И. Медицинская значимость интерферонов и их индукторов. // Вестник РАМН.-2004.-№2.-С.9-13.

20. Зверев В.В., Киселев О.И., Стукова М.А. Лекарственные препараты против герпесных инфекций. // СПб.- 2002.

21. Иммунологические методы исследований. Под ред. И Лефковитса и Б. Перниса.- Москва: Мир, 1988,- 528с.

22. Каверин Н.В., Смирнов Ю.А. Межвидовая передача вируса гриппа А и пандемии гриппа. //Вопросы вирусологии.-2003.-№3 -С. 4-10.

23. Киселев О.И., Блинов В.М., Козелецкая К.Н., Ильенко В.И., Платонов В.Г., Чупахин О.Н., Стукова М.А., Каршнов В.А. Молекулярный механизм действия антивирусных препаратов адамантанового ряда. //Вестник РАМН.-1994.-№9.-С. 10-15.

24. Киселев О.И., Деева Э.Г., Слита А.В., Платонов В.Г. Антивирусные препараты для лечения гриппа и ОРЗ. // Спб.- 2000.и

25. Киселев О.И., Соминина А.А., Гринбаум Е.Б. Грипп: современное состояние и эпидемиологическая ситуация.// Вестник АМН.-1994.-№8.-С.3-7.

26. Козелецкая К.Н., Каршнов В.А., Киселев О.И., Мишин В.П., Гринбаум Е.Б., Бурмистрова В.В. Происхождение резистентности к химиопрепаратам у природных изолятов вирусов гриппа. // Вестник РАМН.-1995.-№9.-С.З 6-41.

27. Крамарев С.А., Палатная Л.А., Литус В.И. Опыт применения арбидола при лечении и профилактики гриппа и ОРВИ у детей на Украине. //

28. Русский медицинский журнал.-2003.-№21.-С. 1050-1051.

29. Крылова Л. Ю. Эффективность и переносимость арбидола и его аналогов у мышей с гриппозной пневмонией. Диссертация кандидата биол. наук.-Москва, 1998.-131с.

30. Кубарь О.И., Степанова Л.А. , Сафонова Л.С., Розаева Н. Р. Клиническая аппликация иммуномодулирующих свойств арбидола при ОРВИ.-IV Российский Национальный Конгресс 'Человек и Лекарство", 1997.-С. 269.

31. Лозицкий В.П. Экспериментальное обоснование применения ингибиторов протеолиза для лечения и профилактики гриппа и в производстве иммунопрепаратов. // Химиотерапия и химиопрофилактика гриппа и ОРЗ: Ленинград.- 1990.-С.58-65.

32. Львов Д.К., Ямникова С.С., Забережный А.Д., Гребенникова Т.В. Межпопуляционные взаимодействия в системе вирусы гриппа А-животные-человек.// Вопросы вирусологии. -2005.-№4.-С.4-11.

33. Машковский М.Д. Лекарственные средства: В 2т.- Харьков: Торсинг.-1997.

34. Остерман JI. А. Исследования биологических макромолекул электро фокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. //Москва: Наука, 1983.-304с.

35. Панишева Е.К., Кричевский Э.С., Николаева И.С., Фомина А.Н., Черкасова А.А., Голованова Е.А., Крылова Л.Ю. Аминоалкильные производные 5 и 6 -оксииндола и их противовирусная активность. // Химико-фармацевтический журнал.- 1989.-№2.-С. 189-191.

36. Панишева Е.К., Микерова Н. И., Николаева И.С., Фомина А.Н., Черкасова А.А., Голованова Е.А., Крылова Л.Ю. Синтез ипротивовирусная активность производных 5-оксииндола. // Химико-фармацевтический журнал.- 1988.-№ 12.-С. 1455-1458.

37. Патенты Российской Федерации № 2008004 , № 2033156, № 2033157.

38. Ратникова Л.И., Миронов И.П. Иммунологические факторы патогенеза как основа рефрактерности к лечению часто болеющих ОРВИ. III Российский Национальный конгресс "Человек и лекарство", Москва, 1996.- С. 192-193

39. Селькова Е.П., Грачева И.Ю., Готвянская Т.П., Данилина Г.А., Амарян М.П., Семененко Т.А. Изучение иммуномодулирующей активности арбидола. //Русский Медицинский Журнал.-2001.-Т.9.-С.16-17.

40. Учайкин В.Ф., Новокшонов А.А., Тихонова О.Н. Противовирусный препарат арбидол как перспектива этиотропной терапии ротавирусной инфекции у детей. // Детские инфекции.- 2004.-№ 8.-С. 34-39.

41. Учайкин В.Ф., Харламова С.Г., Чешик С.Г. Применение арбидола и амиксина в качестве этиотропной терапии гриппа и ОРВИ у детей. // Педиатрия .:2004.-№5.-С. 73-77.

42. Чешик С.Г. Вартанян Р.В. Эффективность терапии арбидолом при острых респираторных вирусных инфекциях у детей раннего возраста. // Новые лекарственные препараты.-2004.- №11.-С.37-44.

43. Чистяков В.В., Ермаченков И.А., Голованова И.В. Фармакокинетика арбидола у крыс. // Химико-фармацевтический журнал.-1993.-№9.-С.11-14.

44. Шумилов В.И., Шустер A.M., Лобастов, С.П., Шевцов В. А., Медников Б.Л., Пиявский С. А., Литус В.И. Эффективность арбидола при профилактике и лечении острых респираторных инфекций. //Военно-медицинский журнал.- 2002. -Т.9.-С. 51-53.

45. Хамитов Р.А., Шустер A.M., Логинова С.Я. Экспериментальные данные по эффективности арбидола в отношении возбудителя атипичнойпневмонии ( SARS) in vitro и in vivo. В сборнике: Арбидол-новые данные.- Москва.- 2004.-С. 43-46.

46. Ядровская В.А., Савина Е.П., Цышкова Н.Г., Трофимов Ф.А., Анисимова О.С., Скворцова В.Г., Деденков А.Н. Изучение метаболизма 14С-арбидола. // Химико-фармацевтический журнал.- 1993.- №5 (27)- С.23-24.

47. Ямникова С.С., Ковтун Т.О., Дмитриев Г.А., Аристова В.А., Русанов Г.М., Конечный А.Г. Львов Д.К. Циркуляция вируса гриппа А серотипа Н13 среди чайковых птиц Северного Каспия (1979-1985 г.г.). // Вопросы вирусологии.- 1989.-Т.4.-С.426-430.

48. Anderson L.J., Hierholzer J.C., Bingham P.G., Stone Y.O. Microneurtralization test for respiratory syncytial virus based on an enzyme immunoassay. //Journ. Clinic.Microbiol.-1985.-V.22 (6).-P. 1050-1052.

49. Aoki F.Y., Macleod M.D., Paggiaro P., Carewicz O., Savvy E.L., Wat A. Early administration of oral oseltamivir maximizes the benefits of influenza treatment. //J. Antimicrob. Chemother. -2003.-V 51(1).-123-129.

50. Atkinson P.H., Summers D.F. Purification and properties of HeLa cells plasma membranes.// J.Biol.Chem.- 1971.-V.246.-P.5162-5175.

51. Barnett J.M., Gadman A., Gor D., Dempsey M., Walters M., Candlin A., Tisdale M., Morley P.J., Owens I.J., Fenton R.J., Lewis A.P., Claas E.C., Rimmelzwaan G.F., De Groot R., Osterhaus D.M. Zanamivir susceptibility.

52. Monitoring and characterization of influenza virus clinical isolates obtained during phase II clinical efficacy studies. // Antimicrbial.Agents and Chemotherapy.-2000.-V.44.-P.78-87.

53. Bean W.J., Thelkeld S.C., Webster R.G. Biological potential of amantadine-resistant influenza A virus in an avian model. // J.Infect. Dis.-1989.-V. 159-P. 1050-1056.

54. Beaton A.R., Krug R.M. Transcription antiterminatiom during influenza viral template RNA synthesis requires the nucleocapsid protein and the absence of a 5/capped end. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA.-1986.-V.83.-P.6282-4286.i

55. Belshe R.B., Burk В., Newman F.B. Drug resistance and mechanism of action amantadine on influenza A viruses. // J. Inf. Dis.- 1989.-V. 159.-P. 430435.

56. Belshe R.B., Burk В., Newman F., Ceruti R.L., Sim I.S. Resistance of influenza A viruses to amantadine and rimantadine . Results of one decade of surveillance. // J. Infect. Dis.-. 1989. V.159.-P.430-435.

57. Bishop D.H.L., Obijeski I.F., Simpson R.W. Transcription of the influenza ribonucleic acid genome by a virion polymerase. I. Optimal conditions for in vitro activity of the RNA-dependent polymerase. // J.Virology.-1971.-V.8.-P.66

58. Bryson Y.J., Monahan C., Pollack M., Shields W.D. A prospective double blind study of side effects associated with the administration of amantadine for influenza A prophylaxis // Journal of Infectious Diseases.- 1980. V. 141.-P. 543-547.

59. Bodian, D.L., Yamasaki, R.B., Buswell, R.L., Stearns, J.F. , White, J.M., Kuntz, I.D. Inhibition of the fusion-inducing conformational change of influenza hemagglutinin by benzoquinones and hydroquinones. // Biochemistry.-1993.-V. 32- P. 2967-2978.

60. Bouloy M., Plotch S.J., Krug R.M. Globin mRNAs are primers for the transcription of influenza viral RNA in vitro. // Proc.Natl.Acad.Sci. USA.-1978.-V.75.-P.4886-4890.

61. Boya P., Roques В., Kroemer G. New EMBO member's review: viral and bacterial proteins regulating apoptosis at the mitochondrial level. // EMBO J.

62. W 2001 .-V.20.-P.4325-4331.

63. Brooks M. Studies with the antiviral drug Arbidol. Диссертация. Australia, Melburn, 2003.- 140p.

64. Carr, C.M., Kim P.S. Flu virus invasion; halfway there. // Science.- 1994.-V. 266-P.234-236.i

65. Castrucci M.R., Kawaoka Y. Reverse genetics system for generation of an influenza A virus mutants containing a deletion of the carboxyl-terminal residue of M2 protein. // J.Virol.-1995.-V.69.-P.2725-2728.

66. Chou J. Quantitation of synergism and antagonism of two or more drugs by computerized analysis // Synergism and antagonism in chemotherapy: Academic Press, Inc, 1981 .-P.223-241.

67. Claas E.C., Osterhaus A.D., van Beek R., De Jong J.C., Rimmelzwaan G.F., Senne D.A., Krauss S., Shortridge K.F., Webster R.G. Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus. // Lancet.-1998.-V. 351-P. 472-477.

68. Clover R.D., Crawford S.A., Abell T.D., Ramsey C.N., Glezen W.P., Couch R.B. Effectiveness of rimantadine prophylaxis of children with families. // American Journal of Diseases of Children.- 1986 .-V. 140-P. 706-709.

69. Colacino J.M., Stashke K.A. , Laver W.G. Approaches and strategies for the treatment of influenza virus infections. // Antiviral Chemistry and Chemotherapy.- 1999 .-V. 10.-P.155-185.

70. Collins P., Murphy B. Respiratory syncytial virus: Reverse genetics and vaccine strategies.// Virology.-2002.-V.296.-P.204-211.

71. Colman P.M. Influenza virus neuraminidase: enzyme and antigen. //The Influenza Viruses.-1989.-P. 175-218.

72. Colman P.M. Structure and Function of the Neuraminidase. // Textbook of Influenza, K.G.Nicholson, R.G.Webster, A.J.Hay: Blackwell Science UK .-1998.-P. 65-73.

73. Compans R.W., Content J., Duesberg P.H. Structure of the ribonucleoprotein in influenza virus. // J.Virol.-1972.-V. 10.-P.795-800.

74. Daniels R.S., Downie J.C., Hay A.J., Knossow M., Skehel J.J., Wang M.L., Wiley D.C. Fusion mutants of the influenza virus HA glycoprotein. // Cell.-1985.-V. 40-P. 431-439.

75. Davies W.L., Grunert R.R., Haff R.F. et al. Antiviral activity of 1-adamantamine.//Science.- 1964.-V. 144-P.862-863.

76. Dawkins A.T., Gallagher L.R., Togo Y., Hornich R.B., Harris B.A. Studies on induced influenza in man. // Journal of the American Medical Association.-1968.-V. 203-P. 1095-1099.

77. Desselberger U., Racaniello V.R., Zazra J.J., Palese P. The 3;and 5' terminal sequences of influenza A, B, and С virus RNA segments are highly conserved and show partial inverted complementarity. //Gene.- 1980.-V.8.-P.315-328.

78. De Jong J.C., Claas E.C., Osterhaus A.D.M.E., Webster R.G., and Lim W.L. A pandemic warning? //Nature.- 1997.-V. 389-P. 554.

79. Diaz M., Zieman S., Le Beau M., Pitha P., Chilcote R., Rowley J. Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA.-1988.-V.85.-P.5259-5263.

80. Dolin R., Reichman R.C., Madore H.P., Maynard R., Linton P.M., Webber-Jones J. A controlled trial of amantadine and rimantadine in prophylaxis ofinfluenza A infection. // New England Journal of Medicine.- 1982.- V. 307.-P. 580-584.

81. Egorov A., Brandt S., Sereinig S., Romanova J., ferko В., Katinger D., Muster T. Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells. // Journal of Virology.-1998.-V.72.-P.6437-6441.

82. FDA. Antiviral Drug Advisory Committee. Gaithersburg: Centre for Drug Evaluation and Research.-2002.-P. 1-266.

83. Garcia-Sastre A. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems.//Virology.-1998.-V.252.-P.324-330.

84. Glushkov R.G. Arbidol. Antiviral, Immunostimulant, Interferon inducer. //Drug of the Future.- 1992.-№. 17-P. 1079-1081.

85. Gomez-Puertas P., Albo C., Peres-Pastrana E., Vivo A., Portela A. Influenza virus matrix protein in the major driving force in virus budding. // J.Virol.-2000.-V.74.-P. 1153 8-11547.

86. Goto H., Kawaoka Y. A novel mechanism for the acquisition of virulence by a human influenza A virus. // Proc.Natl.Acad.Sci. USA.- 1998.-V.95.-P. 1022410228.

87. Goto H., Wells K., Takada A., Kawaoka Y. Plasminogenbinding activity of neuraminidase determines the pathogenicity of influenza A virus. // J.Virol. -2001 .-V.75 .-P.9297-9301.

88. Grambas S., Benett, M.S. , Hay, A.J. Influence of amantadine resistance mutations on the pH regulatory function of the M2 protein of influenza virus. // Virology.- 1992.-V. 191-P.541-549.

89. Gregoriades A. The membrane protein of influenza virus: extraction from virus and infected cell with acidic chloroform-methanol. // Virology.-1973.-V.54.-P.369-383.

90. Gubareva L.V., Bethell R.C., Hart G.J., Murti K.G., Penn C.R., Webster R.G. Characterization of mutants of influenza A virus selected with the NA inhibitor 4-guanidino-Neu5Ac2en.//J. Virology.- 1996.-V.70.-P. 1818-1827.

91. Gubareva L.V., Robinson M.J., Bethell r.c. et al. Catalyc and framework mutations in the neuraminidase active site of influenza viruses that are resistant to 4-guanidino-Neu5Ac2en. //J.Virology.- 1997- V. 71.-P. 3385-3390.

92. Gubareva L.V., Matrasovich M.N., Brenner M.K., et al. Evidence for zanamivir resistance in an immunocompromised child infected with influenza В virus.// J Infect.Diseases.- 1998.-V.178.-P. 1257-1262.

93. Guskova T.A., Nikolaeva I.S., Zacharova N.G. Experimental and clinical study of arbidol, an antiviral drug. 9-th Mediterranean Congress of Chemotherapy, 1994.- Abs.82.

94. Hay A. Amantadine and Rimantadine-Mechanisms. In book: Antiviral Drug Resistance, D.Richman (ed), John Willey and Sons Ltd, UK.-1996.-P. 4458.

95. Hay A. Virus Genome and its Replication. In book Textbook of Influenza, K.G.Nicholson, R.G.Webster, A.J.Hay , Blackwell Science UK.- 1998.- P. 4353.

96. Hay A. J., Lomniszi В., Bellamy A.R. Transcription of the influenza virus genome. // J.Virology.- 1977.- V. 83.- P. 337-355.

97. Hay A.J., Wolstenholme A.J., Skehel J.J., Smith M.H. The molecular basis of the specific anti-influenza action of amantadine. // EMBO Journal.- 1985.-V. 4.- P. 3021-3024.

98. Hayden F. WHO Guidelines on the Use of Vaccines and Antivirals during Influenza. Annex 5-Considerations for the Use of Antivirals during an Influenza pandemic, Geneva, 2-4 October, 2002.

99. Hayden F.G., Belshe R.B., Clover R.D., Hay A.J., Oakes M.G., Soo W. Emergence and apparent transmission of rimantadine -resistant influenza A in families. //New England Journal of Medicine.- 1989.-V. 281.-P. 579-584.

100. Hayden F.G., Rollins B.S., Hay A.J. Anti-influenza virus activity of the compound LY253963.// Antiviral Res.-1990. -V. 14.-P. 25-38.

101. Hebert M., Gugliemo B. What is the clinical role of aerosolized ribavirin? // Drug Intelligence and Clinical Pharmacy.-1990.-V.24.-P.735-738.

102. Herlocher M.L., Truscon R., Fenton R., Klimov A., Elias S., Ohmit S.E., Monto A.S. Assessment of development of resistance to antivirals in the ferret model of influenza virus infection. // J. Infect.Diseases.- 2003.- V. 188(9).-P.l 355-1361.

103. Hoffman L.R., Kuntz I.D., White Ju.M. Structure-based identification of an inducer of the low-pH conformational change in the influenza virus hemagglutinin: irreversible inhibiton of infectivity. // J.Virol.- 1997.-V.71(11).-P.8808-8820.

104. Horadam V.M., Sharp J.G., Smilack J.D. Pharmacokinetics of amantadinei'hydrochloride in subjects with normal and impaired renal function. // Annals of Internal Medicine 94.- 1981.- 454-458.

105. Kaiser L., Couch R., Galasso G. First International Symposium on influenza and other respiratory viruses: summary and overview. Kapalua, Maui, Hawaii, December 4-6, 1998 // Antiviral Research.- 1999.- 42.- 149-176.

106. Kell W., Niemann H„ Schwars R.T., Klenk H.D. Carbohydrates of influenza virus. Oligosaccharides attached to individual glycosylation sites of the hemagglutinin of fowl plague virus. // Virology.-1984.-V.133.-P.77-91.

107. Kendal A, Klenk H. Amantadine inhibits an early , M2 protein-dependent event in the replication cycle of avian influenza (H7) viruses. // Arch.Virology.-1991.-119.-P.265-273.

108. Kimberlin D.W., Spector S.A., Hill E.A. Assays for antiviral drug resistance. // Antiviral Research.-1995.-V.26.-P.403-413.

109. Kinchington D., Kangro H., Jeffries D. Design and testing of antiviral compounds. In Medical Virology: Oxford University Press, 1997.-P.147-160.

110. Kiso M., Mitamura K., Sakai-Tagawa Y.et al. Resistant influenza A viruses in children treated with oseltamivir: descriptive study. // Lancet .-2004.- V.364.-P. 759-765.

111. Klein T.W., Newton C., Larsen K., Perkins I., Nong L., Friedman H. The cannabinoid system and immune modulation.// J.Leukoc.Biol.-2003.-V.74.-P.486-489.

112. Klein T.W., Newton C., Larsen K., Chou J., Perkins I., Lu L., Nong L., Friedman H. Cannabinoid receptors and T helper cells. // J.Neuroimmunol.-2004.-V. 147.-P.91 -94.

113. Klenk H.D., Rott R., Orlich M., Blodorn J.Activation of influenza A viruses by trypsin treatment. // Virology.-1975.-V.68.-P.426-439.

114. Kolakofsky D., Ortin J. Negative strand RNA viruses come of age. // New Biol.-1991.-V.3.-P.754-758.

115. Krug R.M. Priming of influenza viral RNA transcription by capped heterologous RNAs. // Curr.Top.Microbiol.Immunol.-1981.-V.93.-P.125-149.

116. Lamb R.A. The influenza virus RNA segments and their encoded proteins. // Genetic of Influenza Viruses.Ed.P.Palese, D.W.Kigsbury, Springer-Verlag: Vienna.-1983.-P.21-69.

117. Lamb R.A., Lai C.J., Choppin P.W. Sequences of mRNAs derived from genome RNA segment 7 of influenza virus : collinear and interrupted mRNAs code for overlapping proteins. // Proc.Natl.Acad.Sci USA.- 1981.- V.78.-P.4170-4174.

118. Laver W.G. Crystallization and peptide maps of neuraminidase "heads" from H2N2 and H3N2 influenza virus strains // Virology.- 1978.-V.86.-P.78-87.

119. Laver W.G, Bischofberger N., Webster R.G. Disarming Flu Viruses. // Scientific American.- 1999.- V.280.- P. 78-87.

120. Lawetz C., Liuzzi M. The antiviral activity of the ribonucleotide reductase inhibitor BILD1351 SE in combination with acyclovir against HSV type-1 in cell culture. // Antiviral Research.-1998.-V.39.-P.35-46.

121. Lazarowitz S.G., Choppin P.W. Enhancement of the infectivity of influenza A and В viruses by proteolytic cleavage of the hemagglutininpolypeptide. // Virology.-1975.-V.68.-P.440-454.

122. Lazelari J., Campion К., Keene O., Silagy C. Zanamivir for the treatment of influenza A and В infection in high risk patients. // Arch. Intern. Med.-2001.- V. 161-P.212-217.

123. Leneva I., Roberts N., Govorkova E., Goloubeva O., and Webster R.G.I

124. The neuraminidase inhibitor GS4104 (oseltamivir phosphate) is efficacious against A/Hong Kong/156/97 (H5N1) and A/Hong Kong/1074/99 (H9N2) influenza virus. // Antiviral Research.- 2000.-V. 48. -P. 101-115.

125. Li S., Schulman J., Itamura S., Palese P. Glycosylation of neuraminidase determines the neurovirulence of influenza A/WSN/33 virus. // J.Virol.-1993.-V.67.-P.6667-6673.

126. Littler E. The past, present and future of antiviral drug discovery. // IDrugs.-2004.-V.7.-P.l 104-1112.D

127. Lowry O.H., Resenbrough H.J., Farr A.L. Protein measurement with the Folin phenol reagent. // J.Biological Chemistry.-1951.-V.193.-P.265-268.

128. LuY., Qian X.Y., Krug R.M. The influenza virus NS1 protein: a novel inhibitor of pre-mRNA splicing. // Genes Dev.-1994.-V.8.-P.1817-1828.

129. LuY., Wambash M., Katze M.G., Krug R.M. Binding of the influenza virus NS1 protein to double-stranded RNA inhibits the activation of the protein kibase that phosphorylates the eIF-2 translation initiation factor. // Virology.-1995.-V.214.-P.222-228.

130. Luo G., Colonno R., Krystal M. Characterization of a hemagglutinin -specific inhibitor of influenza virus. // Virology.- 1996. V. 226.- P. 66-76.

131. Marra F., Marra C.A., Stiver H.G. A case for rimantadine to be marketed in Canada for prophylaxis of influenza A virus infection. // Can.Resp.J.-2003.-V.10.-P.381-388.

132. Martin J., Wharton S.A., Lin Y.P., Takemoto D.K., Skehel J.J., Wiley D.C., Steihauer D.A. Studies of the binding properties of influenza hemagglutinin receptor-site mutants. // Virology.-1998.-V.241.-P. 101-111.

133. Martin J., Helenius A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: the viral matrix protein (Ml) promotes export and inhibits import. // Cell.-1991 .-V.67.-P. 117-130.

134. Meanwell N.A., Krystal M. Taking aim at a moving target: inhibitors of influenza virus. I. Virus adsorption, entry and uncoating. // Drug Discov.Today.-1996.- V.1.-P.316-324.

135. Mendel D.B., Sidwell R.W. Influenza virus resistance to neuraminidase inhibitors. // Drug Resist. Updates.- 1998.- V.l.-P. 184-189.

136. Mills J. Management of respiratory syncytial virus infection. In Antiviral Chemotherapy. Edited by Mills J., Volberding P. &Coreyet L. New York: Plenum Press.-1996. P. 163-174.

137. The MIST Study Group. Randomized trial of effecacy and safety of inhaled zanamivir in treatment of influenza A and В virus infection. // Lancet.- 1998.-V.352.-P. 1877-1881.

138. Monto A.S. Guidelines for the Clinical Use of Antivirals. In book Textbook of Influenza, K.G.Nicholson, R.G.Webster, A.J.Hay , Blackwell Science UK 1998 .-P. 506-517.

139. Monto A.S., Fleming D.M., Henry D Efficacy and safety of neuraminidase inhibitor zanamivir in the treatment of influenza A and В infections. //J.Infect Diseases.- 1999 .- V.180.-P. 254-261.

140. Morris J. Human Immunodefiency virus (HIV) use lipid molecules for many of its processes including: lateral assemblies necessary for entry, avoidance of immune eradication, and budding from membrane rafts. // J.of Mol.Medicine.- 2004.-V.5.-P.11-14.

141. Mosse A.G., Rueckert R.R. Capsid-binding agents. In book Antiviral drug resistance. Edited by Douglas D.Richman. John Wiley & Sons Ltd.- 1996.-P.13-39.

142. Murphy K.R., Eivindson A., Paukens K., Stein W.J., Pellier G., Watts R. Efficacy and safety inhaled zanamivir for treatment of influenza in patients withasthma or chronic obstructive pulmonary disease. // Clin. Drug Invest.- 2000.-V. 20.- P. 337-349.

143. Nakanawa Y., Oda K., Nakada S. The PB1 subunit alone can catalyze cRNA synthesis, and the PA subunit in addition to the PB1 subunit in required for viral RNA synthesis is replication of the influenza virus genome. // J.Virol.-1996.-V.70.-P.6390-6394.

144. Nguyen Van-Tam J. Epidemiology of Influenza. Textbook of Influenza:, K.Nicholson, R.Webster, A.Hay , Blackwell Science UK.- 1998.-P. 181-206.

145. Nicholson K.G. Human Influenza. Textbook of Influenza, K.G.Nicholson, * R.G.Webster, A.J.Hay , Blackwell Science UK.- 1998 .-P. 219-266.

146. Nikolaeva I.S., Guskova T.A. Arbidol-a new antiviral drug . 1993 18 International Congress of Chemotherapy , Stockholm, Sweden.- Abs.190.

147. Nikolaeva I.S., Guskova T.A., Peters V.V., Padeyskaya E.N. Interferon-inducing activity of arbidol, a new antiviral drug. 4-BICON, Prague,i

148. Chechoslovakia, 1992.-Abs.155.

149. Nikolaeva I.S., Peters V.V., Padeyskaya E.N. Arbidol, a new antiviral drug possessing an immunostimulating activity 8-th Mediterranean Congress of Chemotherapy , Athens, Greece, 1992.- Abs.336.

150. Neumann G., Hughes M.T. Kawaoka Y. Influenza A virus NS2 protein mediates vRNA nuclear export through NES-independent interaction with hCRMl. // EMBO J.-2000.-V.19.-P.6751-6758.

151. Ohmit S.E., Arden N.H., Monto A.S. Effectiveness of inactivated influenza vaccine among nursing home residents during an influenza type A (H3N2) epidemic. //J. Am.Geratr.Soc.- 1999.- V.47.-P. 165-171.

152. Oker-Blom N., Hovi Т., Cerinikki P., Palosone Т., Petterson R., Suni J. Protection in man from natural infection with influenza A2 Hong Kong virus by amantadine- a controlled field trial. // British Medical Journal.- 1970. V. 3.-P. 676-678.

153. O'Neill R.F., Talon J., Palese P. The influenza virus NEP (NS2 protein) mediates the nuclear export of viral ribonucleoproteins. // EMBO J.-1998.-V. 17.-P.2888-2296.

154. Ott S., Wunderli-Allenspach H. Effect of the virostatic norakin (triperidin) on influenza virus activities. // Antiviral Research. -1994.- V. 24.-P.37-42.

155. Palese P., Shulman J.L. Inhibitors of viral neuraminidase as potential antiviral drugs . In : Chemoprophylaxis and virus infections of the respiratory tract. Edited by J.S.Oxford Cleveland:CRC Press.- 1977.-V. l.-P. 189-205.

156. Peiris J., Lai S„ Poon L., Guan Y., Yam I., Lim W., Nicholls J:, Yee W. Yan W., Cheung M., Cheng v., Chan K., Tsang D., Yung,R., Yuen K. Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome.//Lancet.-2003 .-V.3 61 .-P. 1767-1772.

157. Peiris M., Yuen K.Y., Leung C.W., Chan K.H., Ip P.L.S., Lai R.W.M., Orr W.K., Shortridge K.F. Human infection with influenza H9N2. // Lancet.-1999.-V.354.-P. 916-917.

158. Pinto, L.H., Holsinger, L.J., Lamb, R.A. Influenza virus M2 protein has ion channel activity. // Cell.- 1992.- V.69.- P.517-528.

159. Powers D.C., Belshe R. Effect of age on cytotoxic T lymphocyte memory as well as serum and local antibody responses elicited by inactivated influenza virus vaccine. // J. Infect. Dis.- 1993,- V. 167.-P. 584-592.

160. Prevention and control of influenza : recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). // MMRW Morb Mortal Wkly Rep.- 1999- V. 48 (RR-4)-P. 1-28.

161. Prosch S.H., Heider H., Schroder C., Kruger D.H. Mutations in the hemagglutinin gene associated with influenza virus resistance to norakin. // Arch.Virol. -1988.- V. 102.-P. 125-129.

162. Qian X.Y. Alonso C.F., Krug R.M. Two functional domains of the influenza virus NS1 protein are required for regulation of nuclear export of mRNA. // J.Virol. -1994.-V.68.-P.2433-2441.

163. Qiu Y., Krug R.M. The influenza virus NS1 protein is a poly(A)-binding protein that inhibits nuclear export of mRNAs containing poly A. // J.Virol.-1994.-V.68.-P.2425-2432.

164. Raznikov V., Gazumyan A., Nikitenko A., Ellestad G., Krishnamurty G. RFI-641 inhibits entry of respiratory syncytial virus via interactions with fusion protein. // Chem.Biol.-2001.- V.8.-P.645-659.

165. Robertson J.S., Schubert M., Lazzarini R.A // Polyadenylation sites for influenza virus mRNA. //J.Virol.-1981.-V.38.-P.157-163.

166. Rosen HR, Gretch DR. Hepatitis С virus: current understanding and prospects for future therapies. // Mol. Med. Today.- 1999.-V.5.- No.9.-P.393-399.

167. Ruben F.L. Now and future influenza vaccines. // Inf .Dis.Clin. North Am.-1990.-V.4.-P. 1-10.

168. Schulze I.T. The structure of influenza virus. II.A model based on the morphology and composition of sub viral particles. // Virology.-1972.-V.47.-P.181-196.

169. Shapiro G.I., Krug R.M. Influenza virus RNA replication in vitro: synthesis 1 of viral template RNAs and virion RNAs in the absence of an added primer. //

170. J.Virol.-1988.-V.62.-P.2285-2290.

171. Shigeta S. Recent progress in anti-influenza chemotherapy. // Drugs R&D.-1998.-V.2.-153-164.

172. Sieczkarski S., Whittaker G. Viral Entry. // CTMI.Springer-Verlag.-2004.-* V.285.-P.1-23.

173. Skehel J.J., Hay A.J. Nucleotide sequences at 5/termini of influenza virus RNAs and their transcripts.//Nucl.Acids Res. -1978.-V.5.- P.1207-1219.

174. Skehel J.J., Waterfields M.D. Studies on primary structure of the influenza virus hemagglutinin.// Proc.Natl.Acad.Sci. USA.- 1975.-V.72.-P.93-97.

175. Smee D.F., Sidwell R.W. Peramivir 9 BCX-1812, RWJ-270201): potential new therapy for influenza. // Expert Opinion on Investigational Drugs.- 2002.-V.l 1.-P.859-869.

176. Smith A.E., Helenius A. How viruses enter animal cells. // Science.-2004.-V.3.-P. 237-241.

177. Smith G.L., Hay A.J. Replication of the influenza virus genome. // Virology.-1982.-V. 118.-P.96-108.

178. Smith D.W., Frankel L.R., Mathers L.H. A controlled trial of aerosolized ribavirin in infants receiving mechanical ventilation for severe respiratory syncytial virus infection. //N.Engl.J.Med.- 1991.-V. 325.-P.24-29.

179. Smorodintsev A.A., Zlydnikov D.M., Kiseleva A.M., Romanov J.A., Kazantzev A.P., Rumovsky V.I. Evaluation of amantadine in artificially induced A2 and В influenza. // Journal of the American Medical Association .-1970.-V.213.-P. 1448-1454.

180. Staschke K.A., Hatch S.D., Tang J.C., Hornback W.J., Munroe J.E., Colacino J.M., Muesing M.A. Inhibition of influenza virus hemagglutinin mediated fusion by a compound related to a podocarpic acid. // Virology.-1998.-V.248.-P.264-274.

181. Stebaeva, L.F., Padeyskaya, E.N., Golovanova, E.A. Effect of arbidol on the development of the influenzal virus the cellular immunity factor. 18th International Congress of Chemotherapy , Stockholm, Sweden.- 1993.-Abs.235.г

182. Stebaeva L.F., Guskova t.A., Nikolaeva I.S., Golovanova E.A. A new antiviral chemiotherapeutic arbidol. Electron microscopy data. 6-th Congress for Infectious Diseases, Prague, Chech.Republic.-1994.- Abs.81034.

183. Stegmann Т., Morselt W. , Scholma J., Wilschut J. Fusion of influenza virus in an intracellular acidic compartment measured by fluorescence dequenching. // Biochim.Biophys.Acta.- 1987.- V. 904.- P. 165-170.

184. Steinhauer D.A., Sauter N.K., Skehel J.J., Wiley D.C. Receptor binding and cell entry by influenza viruses. // Semin.Virol.- 1992.-V.3.-P.91-100.

185. Stein, D.S., Creticos, C.M., Jackson G.G., et al. Oral ribavirin treatment ofinfluenza A and B. // Antimicrob.Agents Chemother.- 1987.- V.31.-1285-1287.

186. Stieneke-Grober A., Vey M., Angliker H., Shaw E., Thomas G., Roberts C., Klenk H.D., Garten W. Influenza virus hemagglutinin with multibasic cleavage site is activated by furin, subtilisin-like endoprotease. // EMBO J.-1992.-V.11.-P.2407-2414.

187. Surgue R.J., Hay A.J. Structural characteristics of the M2 protein of influenza A viruses: evidence that it forms a tetrameric channel. // Virology.-1991 .-V. 180.-P.617-624.

188. Treanor J.J., Hayden F.G., Vrooman P.S., Barbarash R., Bettis R., Riff D. Efficacy and safety of the oral neuraminidase inhibitor oseltamivir in treating acute influenza. //JAMA.- 2000.- V.283.-P. 1016-1024.

189. Treanor J., Falsey A. Respiratory viral infections in the elderly. // Antiviral Research.-1999.-V.44.-P.79-102.t>

190. Tominack R.L., Willis R.J., Gustavson L.E., Hayden F.G. Multiple-dose pharmacokinetics of rimantadine in elderly adults. // Antimicrobial Agents and Chemotherapy.- 1988.-V. 32.-P.1813-1819.

191. Togo Y., Hornich R.B., Dawkins A.T Double blind studies designed to assess prophylactic efficacy of amantadine hydrochloride against A2/Rockville/l/65 strain. // Journal of the American Medical Association.-1968.-V.203 .-P. 1089-1094.

192. Van Voris L.P., Betts R.F., Hayden F.G., Christmas W.A., Douglas R.G. Successful treatment of naturally occurring influenza A/USSR/77 H1N1.// Journal of the American Medical Association.- 1981.-V. 245.-P. 1128-1131.

193. Watowich S.J., Skehel J.J., Wiley D.C. Crystal structures of influenza virus hemagglutinin in complex with high-affinity receptor analogs. // Structure.-1994.-V.2.-P. 337-340.

194. Webster R.G., Bean W.J. Evolution and Ecology of Influenza Viruses: Interspecies Transmission. In book Textbook of Influenza, K.G.Nicholson, R.G.Webster, A.J.Hay , Blackwell Science UK.- 1998.-P. 109-119.

195. Webby R.J., Webster R.G. Emergence of influenza A viruses. // Phil.Trans.Roy.Soc.Lond.-2001 .-V.2.-P. 1818-1828.

196. Weekly epidemical record. March, 2003.- 78th.-P. 73-80.h

197. Wharton S.A., Skehel J.J. , Wiley D.C. Studies of influenza haemagglutinin-mediated membrane fusion. // Virology.- 1986.- V. 149.- P.22-35.

198. Weis W., Brown J.H., Gusack S„ Paulson J.C., Skehel J.J., Wiley D.C. Structure of the influenza virus hemaggultinin complexed with its receptors sialic acid. //Nature.-1988.-V.333.-P.426-431.

199. Whittaker G., Skehel J.J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glucoprotein of influenza virus. // Annu.rev.Biochem.-1987.-V.56.-365-394.t.

200. Wilson I.A , Skehel J.J., Wiley D.C. Structure of the hemaggultinin membrane glycoprotein of influenza virus at ЗА resolution. // Nature.-1981.-V.289.-P.366-373.

201. Wingfield W.L., Pollak D., Grunert R.R. Therapeutic efficacy of amantadine HCI and rimantadine HCI in naturally occurring influenza A 2 respiratory illness in man. //New England Journal of Medicine.- 1969.-V. 281.-P. 579-584.

202. Yasuda J., Nakada S., Kato A., Toyoda Т., Ishihama A. Molecular assembly of influenza virus: association of the NS2 protein with virion matrix. // Virology.-1993 .-V. 196.-P.249-255,

203. Zambon M., Hayden F. Position statement: global neuraminidase inhibitor susceptibility network. // Antiviral Research.- 2001.-V. 49.- №. 3.-P. 147-156.

204. Zlydnikov D.M., Kubar O.I., Kovaleva T.P., Kamforin L.E. Study of rimantadine in the USSR: a review of the literature. (Review). //Rev. Infect. Dis.- 1981.-V. 3.- P.408-421.

205. Zvonaryov A., Ghendon Yu. Influence of membrane protein on influenza A virus virion transcriptase activity in vitro and its susceptibility to rimantadine. // J. Virology.-1980.-V.33.-P.583-586.

Информация о работе

Ленева, Ирина Анатольевна
доктора биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.06

Диссертация

Механизм вирусспецифического действия препарата Арбидол - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы