Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Медьсодержащие мембранные оксидоредуктазы: их свойства, функции и роль меди в восстановлении кислорода

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Медьсодержащие мембранные оксидоредуктазы: их свойства, функции и роль меди в восстановлении кислорода"



<т {б. бЦ. 90 ^^ АКАДЕМИЯ НАУК АРМЯНСЮЙ ССР

МВДЬС СУШАЩИЕ ЫШРШШ ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ: ИХ СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ И РОЛЬ ЖДИ В ВОССТАНОВЛЕНИИ КИСЛОРОДА

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи

МРКОСЯН КИРА АНДРЕЕВНА

УДК 577.152.1+(14.17.3+14.17.1+9.3.1)

Ереван - 1990

Работа выполнена в лаборатории физической химии белков Института биохимии АН АрмССР (директор - академик АН АрмО А.А.Галоян)

Официальные оппонента:

академик АМН СССР, профессор Ашмарин И.П. доктор химических наук, профессор Лихтенштейн Г.И. доктор биологических наук, профессор Акопян Ж.И.

Ведущая организация - кафедра биохимии Ленинградского

государственного университета

Защита диссертации состоится "_" _ 1990 г.

в " " час " " мин на заседании специализированного сое та Д 005.15.01 при Институте биохимии АН АрмССР по адресу: 375044, Ереван, ул.П.Севака 5/1.

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке институт Автореферат разослан "_" ___ 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук,

профессор 0 'А.А.Симонян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОШ

Актуальность проблемы. Подавляющая часть терминальных внутриклеточных окислительно-восстановительных превращений протекает на биологических мембранах, где локализованы оксвдоре-дуктазы, использующие в качестве акцептора электронов молекулярный кислород. Б тканях животных терминальные оксидоредук-тазы представлены главным образом медьсодержащими ферментами: в митохондриях таким ферментом является вдтохроы с оксидаза (К.$.1.9.3.1), в хромаффинных гранулах, везикулах норадренэр-гических и адренэргических нейронов роль терминальной системы выполняет дофамин ?>-монооксигеназа СК.Ф. X.14.17.I), в секреторных гранулах многих эндокринных и нейроэдцокринных тканей процессинг лелтидннх гормонов сопровождается редокс превращениями меди дептидилглицин о<-амидир,ущей монооксигеназы (К.Ф. 1.14,17.3). Терминальные реакции восстановления молекулярного кислорода, сопряженного с синтезом АТР, образования нейроме-диатора и горюна, норадреналина, и о(-амидированных пептидных гормонов, катализируемые соответственно цитохромоксидазой (ЦО), дофамит f-монооксигеназой 1ДБМ) и пептидилглицин о(.-ами-дирущей монооксигеназой (ПГАМ), представляют вачсне^ше биохимические процессы в организме.

Информация о функциональных особенностях, молекулярной структуре и строении активных центров ПГАМ, ДБМ и ЦО, а также механизмах реакций, катализируемых этими оксидоредуктазаш, не одинакова и отражает как сложность фермента и катализируемой та реакции, так и продолжительность времени, в течение которого фермент находится в центре внимания исследователей.

ПГАМ, обнаруженная в 1982 г. (Bradbury et al., 1982), в настоящее время выделена из секреторных гранул многих типов (Шароян, Налбандда, 1988; Emeson, 1984; Conway et al., 1985; Миг thy et al., 1986; bleng, Isou, 1988). Однако к началу наших исследований были очищены и частично охарактеризованы лишь препараты фермента из пефедней и промежуточной долей гипофиза крупного рогатого скота (Glembotski, 1985; Murthy et al., 1986), гипофиза свиньи (Kizer et al., 1986), а также кожи лягушки (k'izuno et al., 1986) и было сообщено о наличии активности ПГАМ в гомогенатах предсердной тка-

ни крысы (sakata et al., 1986), тогда как активность фермента в медулле надпочечников не была обнаружена. Кроме того, из данных, полученных для передней и промежуточной долей гипофиза, следовало, что практически вся ПГАМ в секреторных гранулах находится В р-форме (Glembotski et al., 1984; Murthy et al., 1986), существование М-формы фермента не было установлено.

Как показано для ДШ, фермент в хроыаффинных гранулах и нейрональных везикулах находится в двух формах - мембраносвя-занной и растворимой, однако соотношение этих форм,по данным разных авторов, варьирует ( Viveros et al., 1969; Hortnagl et al., 1972; Kuzuya, Nagatsu, 1972; Baerrum et al., 1979; Stewart, Klinman, 1988). He выяснена также функциональная и структурная взаимосвязь этих форм. Кроме того, сведения об' общем содержании атомов меда фермента и атомах, участвущих в каталитическом акте, довольно противоречивы (Blackburn et al., 1980; Ash, 1984; Klinman et al., 1984; Syversten et al., 1987).

В литературе сообщалось об эндогенных медьзависимых ингибиторах ДЕМ и ПГАМ (Gb.ubb et al., 1969; Belpaire, Laduron, 1970; Lander, Austin, 1976; Eipper et al., 1983; Glembotski et al., 1984), природа которых однако не была установлена. Несомненно идентификация этих ингибиторов является очень важной.

Как известно, реакция восстановления молекулярного кислорода оксидоредуктазами может протекать в несколько стадий с образованием промежуточных форм кислорода разной степени восстановленное ти. Так, для ЦО реакции установлено, что перенос 4-х электронов, необходимых для полного восстановления кислорода, сопровождается образованием "короткоживущих" промежуточных соединений, представляющих комплекс кислорода разной степени восстановленности с ферментом (Chance et al., 1975). Таким образом, проблема изучения механизма реакции восстановления кислорода ЦО заключается в обнаружении и идентификации промежуточных форм кислорода и выявлении изменений структуры участка фермента, с которым связан кислород. Сведений о способности ЦО утилизировать промежуточные формы восстановления кислорода до начала наших исследований не было.

В связи с высокой скоростью реакции восстановления кислорода ЦО в физиологических условиях изучение механизма реакции проводится в основном при помощи низкотемпературных кинетик с использованием быстрорегистрирующей аппаратура. Применение ингибиторов ЦО, взаимодействующих с кислородсвязывающим участком фермента и продлевающих "время жизни" промежуточных соединений, представляет подход, который также может способствовать изучению механизма реакции.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена выяснению вопросов, связанных с функциональными особенностями, строением и свойствами терминальных медьсодержащих оксидоре-дуктаз, ПГАМ, ДБМ и ЦО, а также роли атомов меди в активных центрах этих ферлентов в реакции восстановления кислорода. В частности в задачи исследования входило:

1. Поиск М- и Р-форм ПГАМ в секреторных гранулах предсердий и хромаффинннх гранулах надпочечников крупного рогатого скота.

2. Разработка методов выделения М- и Р-форм ПГАМ из секреторных гранул предсердий и одновременного выделения М- и Р~ форм ПГАМ и ДБМ из хромаффинных гранул. Определение количественного соотношения М- и Р-форм этих ферментов, выявление факторов, влияющих на это соотношение. .. '

3. Характеристика физико-химических и каталитических свойств препаратов ЯГАМ, ДБМ и ЦО (для ДБМ и ПГАМ сравнительная характеристика М- и Р-форм).

4. Реконструкция апоформ ПГАМ и ДБМ ионами металлов.

5. Выявление возможности переноса меди между монооксигена-зами (ПГАМ и ДБМ) и другими медьсодержащими белками. Идентификация эндогенных медьзависимых ингибиторов ПГАМ и ДБМ.

6. Изучение особенностей реакции восстановления кислорода ЦО. Выявление способности ЦО утилизировать помимо молекулярного кислорода промежуточные формы восстановления кислорода. Использование соединений азота разной степени восстановленно-сти для выявления промежуточных форм не полностью восстановленного кислорода. Изучение влияния азотсодержащих соединений на физико-химические свойства фермента.

Научная новизна работы. Обнаружены М- и Р-формы ПГАМ в сек-

реторных гранулах предсердий и хромаффинных гранулах надпочечников. Разработаны методы одновременного выделения из хромаффинных гранул препаратов М- и Р-форл двух монооксигеназ, ПГАМ и ДБМ, и медьсодержащего белка - нейрокупреина и из секреторных гранул предсердий - препаратов М- и Р-форм ПГАМ, а также нейрокупреина, впервые обнаруженного нами в этих гранулах. Установлено количественное соотношение М- и Р-форм этих ферментов, выявлены факторы, влияющие на переход М-форм в растворимое состояние. Впервые из секреторных гранул предсердий и хромаффинных гранул надпочечников получены препараты Р-формы ПГАМ в электрофоретически гомогенном состоянии. Показана близость каталитически свойств для препаратов М- и Р-форм ПГАМ и М- и Р-форм ДБМ. Впервые проведено исследование окружения меди в активном центре ПГАМ. Установлено, что медь в ПГА1Л так же, как и в ДБМ относится к типу 2. Выявлена аналогичность антигенных свойств ПГАМ и ДБМ. Обнаружено, что ферментативные активности ПГАМ и ДБМ ингибируются апофюрмой нейрокупреина, медьсодержащего белка, содержащегося в секреторных гранулах различных эндокринных тканей. Установлено, что инги-бирование апоформой нейрокупреина связано с хелатированием меди этих ферментов. Обнаружено, что единственным металлом, кроме меди, способным реактивировать апоформу ДБМ, является ванадий, находящийся в виде ионов ванадила. Впервые продемонстрирована возможность переноса меди между ДБМ и Си-тионеи-ном'. Выявлены факторы, влияющие на перенос меди от Си-тионе-ина к ДБМ и в обратном направлении, от ДБМ к тионеину.

Обнаружена СОД активность у препаратов ЦО. Установлено,что за СОД активность ЦО ответственны атомы меди фермента. Предполагается функциональное значение СОД активности ЦО.

Обнаружены нитритоксидазная и гидразиноксвдазная активности ЦО. Впервые показано, что нитрит и гидразин взаимодейст-' вуют с кйслородсвязывающим участком ЦО, выступая одновременно как доноры электронов и ингибиторы ЦО реакции. В присутствии нитрита и гидразина установлено образование довольно стабильных форм фермента, обычно наблюдающихся в ходе реакции восстановления молекулярного кислорода ЦО при низкотемпературных кинетиках. Обнаружено, что в окружении атома меди кислород-

связывающего участка ЦО находится кислород даже в условиях, рассматриваемых как строго анаэробные.

Научно-практическое значение работы. Проведенное исследование оксвдоредуктаз, ПГАМ, ДБМ и ЦО, представляет фундаментальный вклад в область изучения медьсодержащих ферментов.

Выявление роли нейрокупреина.содержащегося в гранулах,сек-ретируицих пептидные гормоны и КА, как ингибитора моноокси-геназ, ПГАМ и ДБМ, установление характера ингибирования имеет важное значение для понимания механизма регуляции процес-синга этих гормонов. Нейрокупреин как регулятор ферментативных активностей ПГАМ и ДБМ может иметь применение при терапии психических заболеваний, связанных с нарушениями обмена ыеди в организме. Изучение переноса меди между ДБМ и медной формой тиойеина важно для понимания физиологической роли Си -тионеина как ингибитора или активатора медьсодержащих ферментов. Обнаружение способности ионов ванадила реактивировать апоформу ДБМ полезно с точки зрения изучения возможной роли ванадия в живых организмах. Предложенный метод выделения и очистки ПГАМ из секреторных гранул предсердий и хромаффинных гранул надпочечников может быть использован для выделения этого фермента из секреторных гранул других эндокринных и нейрозндокрянных тканей. Обнаружение СОД активности у ЦО- ваяно с точки зрения выявления функциональных особенностей ЦО. Данные по влиянию некоторых азотсодержащих соединений на ЦО реакцию и свойства фермента могут способствовать изучению, механизма реакции восстановления молекулярного кислорода ЦО.

На основании результатов исследования влияния на ЦО азотсодержащих соединений, используешх в медицине и народном хозяйстве, можно судить о токсичности этих соединений для организма человека. Результаты исследования влияния нитропруссвда на ЦО, направленные на выявление токсического действия этого препарата на дыхание (реакцию восстановления молекулярного кислорода ЦО), позволяют обосновать дозировку этого препарата при внутривенном введении (внедрено в практику в отделе реанимации и интенсивной терапии Ереванского филиала ВНЦХ с 20.03.1984г.). На основании данных, полученных при исследовании влияния производных гидразина (регуляторов роста расте-

ний) на ферментативную активность ЦО, предложено рассматривать ЦО как экспериментальную модель для ускоренного прогнозирования токсичности соединений азота (внедрено в лаборатории общей токсикологии Ереванского филиала ВНШШШКС с 1987г.).

Основные положения, выносимне на защиту.

1. Существование в секреторных гранулах предсердий и хро-маффиннкх гранулах надпочечников М- и Р-форм ПГАМ. Зависимость соотношения М- и Р-форм ПГАМ и М- и Р-форм ДБМ от экспериментальных условий, роль прожекторов при ввделении и лизи-ровании гранул.

2. Аналогичность антигенных свойств и окружения атомов меди в активных центрах ПГАМ из предсердных гранул и хродаффин-ных гранул и ДБМ из хромаффинных гранул.

3. Роль атомов меди для ферментативных активностей ПГАМ и ДБМ. Возможность реактивации апсфэрды ДБМ ионами ванадила.

4. Ингибирование ферментативных активностей ПГАМ и ДБМ апоформой нейрокупреина. Нейрокупреин как возможный эндогенный белковый регулятор процессинга пептидных гормонов и нор-адреналина.

5. Обнаруженная СОД активность у препаратов ЦО связана с атомами меди фермента. СОД активность ЦО может иметь функциональное значение.

6. Использование нитрита и гидразина, взаимодействующих с кислородсвязыващим участком ЦО и являющихся одновременно восстановителями и ингибиторами ЦО, для изучения механизма реакции восстановления кислорода ферментом.

7. ЦО как экспериментальная модель для определения токсичности азотсодержащих соединений.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на Ш Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции активных центров ферментов" (Москва, 1976); Всесоюзном симпозиуме "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Черноголовка, 1977, 1989); 1У Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов (Шнек, 1977); ХП Конференции ФЕБО (Дрезден, 1978); I Всесоюзной конференции по кровоснабжению, метаболизму и функции органов при реконструктивных операциях (Ереван, 1979); П Закавказской конференции по применению радиоспектроскопии в химии, физике и

биологии (Ереван, 1979); X мевдународном конгрессе кардиологов (Москва, 1980); Ш Республиканской сессии по вопросам биофизики (Ереван, 1982); I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); Всесоюзной конференции по химии и биохимии порфи-ринов (Самарканд, 1982); Объединенном симпозиуме биохимических обществ 1ДР и СССР "Окислительный метаболизм, гликолиз и АТР" (Лейпциг, 1983); I Всесоюзной конференции по переносу электрона в белковых системах (Вильнюс, 1985); ХП Конференции международного общества нейрохимиков (.Алгарви, Португалия, 1989). Диссертационная работа апробирована на заседании Ученого совета Института биохимии АН АрлССР 22 июня 1989 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 32 работы в отечественных и международных изданиях. На основании результатов исследований получено два акта о внедрении.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 281 странице машинописного текста, включая 10 таблиц и 70 рисунков. Список цитированной литературы содержит 530 наименований.

Список сокращений, использованных в автореферате: BPJ -большая гранулярная фракция, ДДТК - дизтялдитиокарбамат, ДСН - додецнлсульфат натрия, ДЭАЭ - диатиламиноэтил, КА -катехоламинн, М - мембранный (ая), Ю - 2-ыеркаптозтанол, ПААГ - полиакриламвдный гель, Р - растворимый (ая), СШ -субмитоховдриальные частивд, ТЕС - и -трнс(гидроксилметил) метил-2-аминоэтансульфоновая кислота, ФМСФ - фенилметилсуль-фонилфторид, ЦПХ - цетилпирцдиний хлористый.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы сердце и надпочечники крупного рогатого скота, полученные непосредственно после убоя животных.

Секреторные гранулы из предсерпной ткани получали по методу de Bold (1982), модифицированному Маркосян и др. (1989) и хромаффинные гранулы - в основном по методу Helle et al. (1971). Для получения хромаффинных гранул (БГФ) был использован также метод Hoffman et al. (1976), обеспечивающий высо-

кий выход гранул. Митохондрии получади из сердечной мышцы по методу Low arid Vailtn (1963). Мембранные фракции секреторных гранул и СМЧ выделяли путем центрифугирования соответственно лизатов гранул и митохондрий. Лазирование гранул и митохондрий проводили путем гипоосмотического шока и последующих повторных процедур замораживания-оттаивания суспензий.

Выделение и очистку препаратов М- и Р-форм ДБМ проводили по методу saxena and Fleming (1983). М-форму фермента получали также, по методу Skotland 'and. Flatmart (1979).

Нейрокупреин из хромаффшных гранул и секреторных гранул предсердий получали из лизатов гранул после осаждения мембранных фракций. Очистку нейрокупреина проводили по методу Grigoryan et al. (1981), модифицированному Mikaelyan et al. (1988).

Cu-тионеин ввделяли из печени кроликов через 24 ч после одноразовой инъекции кроликам раствора CuS04 по методу Мел-конян и др. (1984).

Апоформы ПГАМ, ДБМ, нейрокупреина и тионеина получали путем инкубации этих белков в присутствии ДЦЖ. Образующийся осадок, представлящий собой комплекс ДЦТК с медью, удаляли центрифугированием, избыток хелатора удаляли ионообменной хроматографией, затем ультрафильтрацией и гель-хроматографией при высокой ионной силе. Полноту удаления меди из белков определяли методом атомной абсорбции и ДЦ1К-при помощи бумажной хроматографии.

ЦО получали из СМЧ по методу Yu et al. (1975). "Пульсиго-ванную" форму ЦО получали по методу Kumar et al. (1984). Медьсодержащую субъединицу ЦО получали по методу Tanaka et al. (1975).

Цитохром с получали из митохондрий сердца по методу Matsu-Ъага and Yasunobu (1961) в модификации Маркосян и Налбандя-на (1978).

Антисыворотку к Р-форме ДБМ получали иммунизацией кроликов по схеме, описанной Grzaria and Coyle (1976). Фракцию иммуноглобулинов ИЗ плазмы выделяли по методу Levy and Sober (I960).

Концентрации ПГАМ, нейрокупреина и Cu-тионеина определяли, анализируя белок по методу lowry et al. (1951). Концентрацию

ДБМ определяли на основании поглощения I/î-ного раствора фермента при 280 нм, принимая &28СГ 12,4 (Scotland and Ljones, 1977). Концентрации ДО и цитохрома с определяли, исходя из миллимолярных коэффициентов экстинквди соответственно (восст.-окисл.Г24'0 (van Gelder, 1966) и лб 550(восст.-ОКИСЛ )_2I'° GeIder aad Slater, 1962).

Гомогенность препаратов белков анализировали электрофоре-тически в 7,5%-тм ПААГ по методу Davis (1964) и при помощи гель-фильтрации. 0 чистоте препаратов ЦО судили по спектральным индексам чистоты (Xonetani, 1961; Yu et al., 1975) И на основании содержания гемового железа и меди. Субъединичный состав ферментов и молекулярные массы субъединиц определяли электрофоретически в 10^-ном ПААГ методами Weber and Osborn (1969) и baemmli (1970). Для лучшего разделения ЦО на субъединицы электрофорез проводили в 12,5^-ном ПААГ по методу Downer et al. (1976). Содержание меди определяли химически при помощи тетраэтилтиурамдисульфида (Matsuba and Takahaahi, 1970), а также методом двойного интегрирования спектров ЭПР, используя в качестве стандарта комплекс меди с ЭДТА. Содержание гема а в препаратах ЦО определяли по методу Greenwood (1963). Общее содержание фосфолипидов в препаратах ферментов оценивали после экстракции их из осадков ш'есью хлороформ-метанол (1:1) путем определения в них неорганического фосфата (Ames and Dubin, I960). Индивидуальные фосфолипида идентифицировали методом тонкослойной хроматографии ( Folch et al., 1957) на силикагелевых пластинках марки "Silufol". Анализ липидных гидроперекисей проводили путем определения малонового диальдегида (Asakawa and Matsushita, 1979).

ПГАМ активность определяли по методу Glembotski et al. (1987), используя в качестве субстрата синтетический трипеп-тид D-oUAla-Gly-Gly и в качестве кофактора - аскорбат. Образование амидированного пептида анализировали спектрофлуороме-трически, используя раствор о-фталевого диальдегида, по методу Eoth (1971) В модификации Benson and Hare (1975). В качестве субстрата ПГАМ использовали также дансил - D-«-Ala-Gly-Gly. Дансилированное производное тршептида D-oi-Aia-Gly-Gly получали согласно методу Bendig (1986).

- 10 -

ДБМ активность определяли по поглощению кислорода (Blackburn et al., 1980), используя в качестве субстрата тирамин и кофактора - аскорбат. Орто-дифенолоксидазную активность ДБМ определяли, используя в качестве субстратов пирокатехин или дофамин ( Boyajian and Halbandyan, 1982).

ЦО активность определяли спектрофотоыетрически, регистрируя уменьшение интенсивности полосы поглощения восстановленного цитохрома с. при 550 нм ( Smith et al., 1979) или по поглощению кислорода.

СОД активность 110 анализировали при помощи л-нитратетра-золиевого хлористого (Nishikimi et al., 1972), а также по методу Misra and Fridovich (1972).

Антигенные свойства анализировали методом двойной иммуно-диффузии ( Ouchterlony, 1967) в 1,5%-нож агарозе.

Поглощение кислорода определяли при помощи электрода Кларка на кислородном анализаторе фирмы "Beckman" модель 0260 (Австрия), снабженном самописцем "Omniscribe", В-5000 ( "Веск-шап" ), в термостатированной, изолированной от доступа атмосферного кислорода ячейке. Оптические спектры регистрировали на спектрофотометрах "Beckman" модель 26 (Австрия), "Acta М-4" ("Beckman", Австрия) и"Hitachi" 150-20 (Япония). Спектры флуоресценции регистрировали на спектрофлуориметре MPI'-44A ("Perkin-Elmer", США). Спектры ЭПР регистрировали на спектрометре Е-4 ( "Varian", США). Анализ чистоты гранулярных фракций проводили при помощи электронного микроскопа "Tesla" BS 4-1 ЗА. Обработку экспериментальных данных проводили при помощи ЭВМ "PDP-11" фирмы "Dec" (США).

При проведении экспериментов по реконструкции апоформы ДБМ все исходные растворы были обработаны смолой био-рекс 70, и каталаза обработана ЭДГА для удаления следов меди.

ЭКСШРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ 0БСУЗДЕЭДЕ

МОНООКСИГЕНАЗЫ ИЗ СЕКРЕТОРНЫХ ГРАНУЛ Пептидилглицин о<-амидирующая монооксигеназа

ПГАМ активность в М- и Р-фракциях секреторных гранул предсердий и хромаффинных гранул надпочечников. В секреторных гранулах предсердий и хромаффинннх гранулах надпочечников,

полученных и лизированных в присутствии протекторов: ингибиторов протеаз (пепстатина и ФМСФ), н-этилмалеимида и катала-зы, мы обнаружили ИГАМ активность.

•После осаждения и промывания мембран (как 50 мМ трис-HCi буфером, pH 7,0, так и при повышении ионной силы) ПГАМ активность в надосадочных растворах более не обнаруживалась. Однако добавление к суспензиям мембран детергентов позволило выявить в экстрактах дополнительную активность, обусловленную М-формой фермента, солгобилизированной в присутствии детергента. Для солюбилизацяи М-форкы ПГАМ были использованы неионные детергенты: тритон Х-100, окталглвхозид, твин 20, а также ионный детергент - холат. После инкубации суспензий мембран в присутствии одного из указанных детергентов в течение I ч при 4°С в экстрактах определяли ЯГАМ активность. Оценка активностей позволила заключить, что наиболее полная экстракция М-формы фермента имеет место в присутствии тритона Х-100 или октилглюкозйда.

После исчерпывающей экстракции М-формы ПГАМ было определено соотношение активностей фермента в Р-содержимоы лизата гранул и экстрактах из мембран (табл.1). Как еидно из таблицы, суммарная активность Р-франций составляет от общей актав-ности, определяемой в тритоновом экстракту из интактных гранул, около 40% - для предеердных и 50^ - для хромаффинных гранул, тогда как остальная часть активности связана с М-фракциями.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о наличии в секреторных гранулах предсердий и хромаффинных гранулах надпочечников быка ПГАМ, представленную М- и Р-формами.

Наши д иные получили подтверждение в последних работах других исследователей, также показавших наличие ПГАМ в секреторных г.панулах предсердий (Eipper et al., 1988; Kojima et al., 1989, и хромаффинных гранулах надпочечников (Katopodis, May, 1988; iastiaensen, De Potter, '989), а также существование М-формы фермента ( Eipper et al., 1988; Kojima et al., 1989). Количественное соотношение М- и Р-форм, по данным разных авторов, варьирует и может отражать как видоеую и -кане-вую специфичность ( May et al., 1988), так и различие эЛ1;пе-

Таблица I

Активность ПГАМ Р- и М-фракций из секреторных гранул предсердий и хромаффинных гранул надпочечников

^Активность относительно Фракция общей активности

преде ердные хромаффтиые

гранулы гранулы

Супернатант после осаждения М-фракций 25,0 32,0

Супернатант после первого промывания М-фракций 10,0 12,5

Супернатант после второго промывания М-фракций 4,0 4,5

Супернатант после третьего промывания М-фракций 0,0 1,0

Суммарная активность Р-фракций 39,0 50,5

М-фракции после солюбилизации тритоном Х-100 61,0 49,0

ж3а 100$ принята активность ПГАМ, солюбилизированной из ин-тактных гранул 1%-ным тритоном Х-100

риментальных условий.

Изучение каталитических свойств М- и Р-форм ПГАМ показало (табл.2), что обе формы фермента из секреторных гранул предсердий и хромаффинных гранул надпочечников активны в довольно широком диапазоне рН (6,5-9,0) с оптимумом активности в районе рН 7,2-8,0, проявляют максимальную активность при одних и тех же концентрациях аскорбата и активируются ионами меди. Близкие значения свидетельствуют об аналогичности каталитических свойств М- и Р-форм ПГАМ. Близость каталитических свойств М- и Р-форм фермента установлена также для этих форм из гипофиза быка (May et al., 1988). Кроме того, показано, что удельная активность высокомолекулярной М-ПГАМ из пред-сердной ткани практически не отличается от активности Р-фор-т с молекулярной массой 37 кДа, полученной из промежуточной 'до;«1 гипофиза 1" et al., 1988).

Таким r jm, можно включить, что М- и Р-формы ПГАМ для ферме"тг .ой активности одинаково проявляют потребность в

Таблица 2

Каталитические параметры ПГАМ М- и Р-фракций из секреторных гранул предсердий и хромаффинных гранул надпочечников

Предеердные Хромаффинные гранулы гранулы

М Р М Р

Оптимум рН 7,2-8,0

Оптимум аскорбата (мМ) 3,0-5,0

Оптимум сиБО^ (мкМ) 2,5 3,0-6,0 3,5 5,0-7,0

^макс (нмоль/4 на I мг белка) 6,2 5,5 5,9 4,7

*КИ (мкМ) 5,6 5,8 7,2 6,5

^Значения %акс и Кт получены при оптимальных значениях рН, концентрациях аскорбата и ионов меди (в качестве субстрата использован трипептид 1)-с<-л1а-а1у-01у).

ионах меди, аскорбате и кислороде и обладают близкими каталитическими свойствами.

Очистка препаратов Р-формы ПГАМ. Для очистки Р-формы ПГАМ из секреторных гранул предсердий и хромаффинных гранул были использованы надосадочные растворы, полученные после осаждения М-фракций. Разработанная нами методика очистки фермента включает процедуры фракционирования препаратов сульфатом аммония, ультрафильтрации, ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-фильтрации через сефадекс с;-100. В результате использованных процедур из гранул обоих типов были получены электрофоретически гомогенные препараты Р-формы фермента. Удельная активность очищенных препаратов ПГАМ возрастала в 3000-5000 раз по сравнению с удельной активностью неочищенных Р-фракций из гранул. Выход очищенного фермента составил 5-8%.

Характеристика препаратов Р-формы ПГАМ, Электрофорезом в 10^-ном ПААГ в присутствии 1^-ного ДСН и МЭ было показано,что Р-форма ПГАМ из гранул обоих типов состоит из одной полипеп-твдной субъединицы с молекулярной массой 68 кДа. Из хромаффинных гранул надпочечников быка получена также Р-форма с мо-

- 14 -

лекулярной массой 40 кЦа (Bastiaensen, De Potter, 1989). Носмотря на то, что формы ПГАМ с молекулярными массами, составляющими 60-75 кДа, наиболее характерны для различных тка-•дей (Шароян, Налбандян, 1988; Kizer et al., 1986; Hehta et al., I9ô8), существуют "множественные" формы фермента, отличающиеся молекулярными массами (Bradbury, Smith, 1988; Stoffers et al., 1989). Предполагается, что образование Р-форм ПГАМ, в основном имеющих более низкие молекулярные массы по сравнению с М-формами, происходит в результате прогеолити-ческого процессинга М-форм в секреторных гранулах ( sipper et al., 1988; May et al., 1988). Таким образом, можно предположить, что в хромаффинных гранулах имеются, по крайней мере, две формы ПГАМ с различными молекулярными массами. Однако не исключается также возможность превращения формы с молекулярной массой 68 кЦа в форму - 40 кДа вследствие ее частичной протеолитической деградации в ходе выделения.

Химический 'анализ содержания меди в препаратах ПГАМ пока-чл, что на молекулу фермента приходится один атом меди (0,87-0,91 и 0,78-0,84 моль Си на I моль ПГАМ соответственно из секреторных гранул предсердий и хромаффинных гранул надпочечников в расчете на молекулярную массу 68 кДа).

На рис Л представлены спектры ЭПР Р-формы ПГАМ, полученной из предсердных гранул. На основании спектров ЭПР можно заключить, что медь ПГАМ относится к типу 2. Обращает на себя внимание значительное сходство сигналов меди ПГАМ и ДБМ, для которой установлена связь атомов меди с несколькими гисти-диновыми лигандами ( Hasnain et al., 1984). Определение аминокислотной последовательности предшественника ПГАМ ги-пофйза, • выполненное путем определения последовательности нуклеотидов 'клонированной цЦНК, кодирующей ПГАЫ, также выявило наличие гиствдиновых кластеров (Eipper et al., 1987).

.Изучение каталитических свойств полученных в очищенном состоянии препаратов Р-формы ПГАМ из секреторных гранул предсердие и хромаффинных гранул показало, что оптимум рН для препаратов фермента из гранул обоих типов так же, как и до их 04i:t.тки, находится в районе 7,2-8,0. При рН ниже 6,0 фермент

Рис Л. Спектры clIP Р—шор— мы ПГАМ из секреторных

гранул предсерди1';. Условия регистрации спектров: СВЧ-мощность - "."О мВт,

поля - 500 Гс.'шн, температура - 77 К.

амплитуда модуляции - Ш Гс, скорость развертки

2600 2300

3000 3200

3400

Н Гс

был практически не активен. Аналогичные рН-завпсшяости ферментативной активности показаны для Р-фюрш ПГА:.! с молекулярной массой 40 кДа ИЗ хроыаффинных гранул (Bastiaensen, De Potter, 1989) и К-формы с молекулярной л.ассой 90. кДа из секреторных гранул предсердий ( Kojima et al., 1989). Для ферментативной активности очищенных препаратов ПГАы так:.ге было необходимо присутствие в реакционной смеси ионов меди и аскорбата, однако их более низких концентраций по сравнению с исходными неочищенными препаратами. Максимальные значения активности Р-ПГАМ из предеердных и хромаффинных гранул были получены при концентрациях аскорбата 2 мМ и ионной ¡леди ~ в пределах 0,5-1,0 мкМ. Более высокие концентрации ионов ;;еди или аскорбата ингибиро-вали ферлент. йнгибирование избытка.*.® ионов меди и аскорбата показано также для ПГАМ из других источников < iineson, 1984; Uurthy et al., 1986; i-iehta et al., 1988). Препараты,очистка которых проводилась в присутствии ионной меди и в конечном итоге содержащие один атом меди на молекулу, были полностью активны без добавления к ним экзогенной меди. Значения Кш и

- 16 -

V составляли соответственно 5,0 мкМ и 15 нмоль/ч на I

мг белка - для Р-формы из секреторных гранул предсердий и 5,7 мкМ и 10,7 нмоль/ч на I мг белка - для фермента из хроглаффин-ных гранул.

Ингибирование ПГАМ хелаторами металлов. Медь, связанная с белковой частью молекулы ПГАМ, может быть легко удалена при добавлении к ферменту хелаторов двухвалентных металлов, как ДДТК или ЭДТА. В результате инкубации препарата P-формы ПГАМ из секреторных гранул предсердий" в присутствии 0,1 М ЭДТА в течение 30 мин наблюдалось исчезновение сигнала в спектре ЭПР и полное ингибирование активности фермента. Однако при добавлении небольшого молярного избытка ионной меди по отношению к хелатору интенсивность сигнала ЭПР и Ферментативная активность ПГАМ восстанавливались до исходного ; -„.вня.

Ингибирование ПГАМ нейрокупреином. Как отмечалось выше, для максимального активирования ПГАМ в лизатах хромаффинных или предсердных гранул били необходимы более высокие концентрации ионной меди по сравнению с очищенными препаратами фермента. Этот факт свидетельствует о наличии в лизатах гранул соединений, конкурирующих за ионы меда с ферментом. Ингибирование ПГАМ, зависящее от меда, наблюдали также в экстрактах гипофиза ( Eipper et al., 1983). Наш было обнаружено, что нейроку-преин, выделенный из хромаффинных или предсердных гранул, в апоформе является сильным ингибитором ДБМ ( Markossian et al., 1986; Mikaelyan et al., 1988).

Эти факты побудили нас проверить также влияние апоформы нейрокупреина на ферментативную активность ПГАМ. Для проведения этой серии экспериментов были использованы препараты Р~ формы ПГАМ из секреторных гранул предсердий или хромаффинных гранул, содержащие один атом меди на молекулу, и в реакционную смесь ионы меда не добавлялись. В результате исследований было обнаружено ингибирование ПГАМ активности апоформой нейрокупреина, тогда как голоформа этого белка не оказывала ингибируодего действия. На рис:2 приведена зависимость инги-бирования активности препарата Р-форыы ПГАМ из секреторных гранул предсердий от концентрации нейрокупреина. Как видно из рисунка, 50^-ное Ингибирование достигается при 23-кратном мо

tu ВО

Рис.2. Зависимость ингибирования ПГАМ от концентрации

апоформы нейрокуп-реина. Концентрация ПГАЫ составляла 3,5 нМ. Фермент и ней-рокупреин получены из секреторных гранул предсердий.

Q4 Q8 1,2 1,6 2,0 18

I А ПОНЕЙРОКУПРЕИН] * \0* И

-I

лярном избытке апофорш нейрокупреина по отношению к ПГАМ.

Так как медь 1ГОШ легко удаляется хелатораш металлов и поскольку ингибирование ДБМ апоформой нейрокупреина происходит путем переноса меди от ДБМ на апонейрокупреин (МагкоБо1ап еЬ а!., 1986), можно предположить, что ингибирование ПГАМ апоформой нейрокупреина также -происходит в результате хелати-рования меди.

Соотношение М- и Р-фс..м ДБМ из хромавдмнных гранул надпочечников. Анализируя соотношение М- и Р-форм ДБМ, мы заметили, что выход этих форы зависит от таких факторов, как продолжительность времени получения гранул, длительность и условия их хранения, повторные процедуры замораживания-оттаивания, pH препаративной среды. Имеющиеся в литературе данные относительно соотношения М- и Р-форм ДБМ в хромаффинных гранулах довольно противоречивы (Hortnagl et al., 1972; Bjerrum et al., 1979; Stewart, Kliman, 1988). В связи с этими фактами мы^проводили процедуры выделения и лизирования гранул при добавлении в среду (pH 6,2) протекторов: ингибиторов протеаз (лепстатина и ®ЮФ), N-этилмалеишда и каталаэы, а таете в отсутствие этих протекторов и затем, оценивая ферментативную активность Р-содержимого гранул и М-фракции, судили о соотно-

Дофашн в-монооксигеназа

Таблица 3

Активность ДЕМ Р- и М-фракций из гранул, полученных и лизированных в присутствии и в отсутствие протекторов

Активность, %

Фракция

с протекторам! без протекторов

рН 6,2 рН '6,2 рН 5,0

Супернатант после осаждения М-фракций 30 51 70

Супернатант после первого промывания М-фракций 7 19 18

Супернатант после второго промывания М-фракций 0 12 II

Суммарная активность Р-фракций 37 82 99

ГЛ-оЬракция после солюбилиза-ций тритоном Х-ЮО 60-65 10 3

х3а 10С$ принята активность ДБМ, солюбиллзированнок из гранул 1#-ныы тритоном 1-100. Определение активности проводилось в присутствии 1,0 мкМ СиБО^.

шении М- и Р-форм.

Оказалось, что добавление в среду указанных протекторов приводит к значительному снижению вклада Р-формы в суммарную Ферментативную активность, причем величина суммарной активности не зависела от применения протекторов. Из данных таблицы 3 видно, что при использовании протекторов суммарная ДБ!,! активность Р-фракций составляет не более 40$ от общей активности, определяемой после экстракции фермента детергентами (тритоном Х-ЮО или октилглюкозвдоа). Лизис гранул и однократное промывание М-фракции приводили практически к полному выходу Р-формы ДБМ и последующие промывания мембран (50 ыМ ацетатные буфером, рН 6,2, и этим же буфером в присутствии 0,15 ГЛ иаС1 ) не вызывали дальнейшего выхода фермента в раствор. Б отсутствие протекторов при лизисе гранул при рН 6,2 суммарная активность Р-фракции составляла примерно 80% от общей активности и каздое очередное промывание М-фракции приводило к

выходу в Р-фракцию заметной доли фермента. Проведение процедуры лизиса при рН 5,0 способствовало более быстрому и полному выходу фермента в раствор по сравнению с лизисом при рН 6,2.

Солюбилизация М-формн ДБГЯ детергентами, влияние детергентов на ферментативную активность ДБМ. Для солюбилизэции ДБ/л из ¡.¡-фракций был использован ряд неионных (тритон Х-100, ок-тилглюкозид, твин 20) и ионии (холат, ЦПХ) детергентов,концентрация которых составляла 1-2%. Как оказалось, твин 20 (при концентрации до 2%) не солюбилизирует фермент, тогда как в присутствии 1,'о-ного тритона X-IOO или 2^-ного октиглюкозида практически вся Ivi—ДБ^Л переходит в Р-состояние. В случае ионных детергентов при солюбилкзации ДБЫ 1%-нш холатоы или ЦПХ наблюдалась последующая заметная инактивация фермента. Для более верной оценки действия, оказываемого детергентами на ДБМ, мы изучили такгхе Елияние этих детергентов на активность Р-формы.

В результате этих исследований было получено, что холат и ЦПХ инактирируют так:хе Р-йорму ДБ1/1, в то время как октилглю-козид к тритон л.— 100 (в указанных концентрациях) практически не влияют на ее активность. В связи с этими данными предпочтение для солюбилкзации и дальнейшей очистки Ъ'-формк фермента было отдано окгилглгакозццу и тритону Х-100.

Характеристика препаратов М- и Р-форм ДБМ. М-форма ДБМ,со-любилизированная октилглюкозидом и очищенная в присутствии этого детергента, при электрофорезе в Ю^-ном ПААГ в присутствии ДСН и МЭ обнару:кивала две близко-располоненные полосы, отвечающие молекулярным массам 75 и 72 кДа. У Р-форш обнаруживалась одна полоса, соответствующая молекулярной массе 72 кДа. В полученных препаратах Ы-формы установлено наличие фосфолипидов, представленных в основном фосфатидилсерином (до 605» от общего количества), а также небольшие количества фосфатидилхолина, фосфатидилэтанолашша, сфингомиелина и фос-фатидилинозитола. Эти данные согласуются с данными Saxena, Fleming (1983), такяе использовавшими для солюбшшзацш; 1Л-форш ДБМ октилглюкозид. В Р-форме фермента фосфолипиды ае были обнаружены. Таким образом, М-форма ДБМ моает рассматрк-

АГ170

2600

2800

3000

3200

3400

Рис.3. Спектры ЭПР М- (I) и Р-форм (2) ДБМ при рН 6,2. М-форма.солюбили-зирована 2%-иш • октилглюкозидом. Условия регистрации спектров: СВЧ-мощность - 10 мВт, амплитуда модуляции - 10 Гс, скорость развертки поля - 500 Гс/мин, температура - 77К.

Н, Гс

ваться как гетероолшгомер, тогда как Р-фюрма является гомо-олигомером. В то же время антитела, полученные к Р-форме ДБМ дают кросс-реакцию с М-фюрмой. Следовательно, антигенные свойства этих двух форм аналогичны.

Содераание меди, определенное путем химического анализа, в препаратах М-формы ДБМ составляло 5,6 моль Си на I моль тет-рамера и для Р-форм - 7,4 моль Си на I моль тетрамера. Однако, как видно из рис.3, параметры спектров ЭПР этих форм аналогичны.

Анализ ферментативной активности М- и Р-форм ДБМ при различных значениях рН (5,0; 6,0 и 7,0) показал, что оптимум рН активности М-формы, так же, как и Р-фюрмы, находится при рН 5,0.

Удельная активность, определенная при 25°С для М-ДБМ (в дезагрегированном состоянии) составляла 7-3 мкмоль/мин на I мг белка и для Р-формы - 16-20 мкмоль/мин на I мг белка. Таким образом, Р-форма фермента характеризуется значительно более высокой удельной активностью, чем М-форма. Добавление

ионной меди н М-ДБМ до уровня, соответствующего уровню меди в Р-форме, лишь незначительно увеличивало ее активность, а более высокие количества приводили к ингибированикз. Следовательно, более низкое содержание меди в М-форме фермента не способно объяснить ее более низкую активность. Различие в активности не может быть также объяснено различием в лиганд-ном окружении атомов меди в активных центрах Р- и М-форм ДВМ, поскольку параметры их спектров ЭПР аналогичны. Следует отметить, что солюбилизацид М-формн фермента октилглюкозидом или тритоном Х-100 не вызывала ее ингибированюг. Не исключено, что более низкая активность М-формы может быть следствием того, что субъединицы этой формы, отсутствующие в Р~форме, каталитически не активны.

Помимо различия в удельной ферментативной активности, М- и Р-формы ДБМ различались также по величине температурного коэффициента реакции. Так, при повышении температур! от 25° до 37°С активность Р-формы возрастала в 2 раза, тогда как для М-формы увеличение активности составляло 1,3 раза, что, скорее всего, можно объяснить присутствием в М-форме фермента фосфолипвдов. Из графиков зависимости скорости реакции гддро-ксилярования тирашна препаратами М- и Р-форм ДБМ от концентрации этого субстрата в координатах Лайнуивера-Верка при температурах 25 и 37°С, следует, что сродство М-формы к тира-мину возрастает при повышении температуры в указанном интервале, в то время как для Р-формы значительного изменения величины Кщ при повышении температуры не наблюдается. При 37°С значение Кт для М- и Р-форм были практически равны. По всей вероятности, в связи с тем, что липидная фаза М-формы ДБМ, физическое состояние которой в зависимости от температуры способно изменяться от жидкостно-кристаллического до желеобразного и при этом вызывать конформационные изменения фермента, влияющие на его кинетические свойства ( лига б et а!., 1977), низкое сродство М-формы к субстрату при 25°С может быть обусловлено состоянием липвдов в препаратах. Для Р-формы такая закономерность отсутствует и величина Кщ практически .не зависит от температуры.

Таким образом, М- и Р-формы ДБМ обнаруживают аналогичное

лигавдное окружение атомов меди в активных центрах и обладают близкими антигенными и каталитическими свойствами. В результате лимитированного протеолиза, приводящего к отщеплению гидрофобного пептида, при помощи которого М-форма связана с мембраной гранул ( Bjerrum et al., 1979; Slater et al., 1981), она переходит в Р-форму (Sabban et al., 1983; Helle et al.,1984).

В связи с этими данными мы проводили дальнейшие исследования на Р-форме ДБМ.

Реактивация апоформы ДБМ ионами металлов. Апоформа ДБМ, полученная путем удаления связанной с ферментом меди в присутствии ДЦ1К, была полностью лишена ферментативной активности и не обнаруживала сигнала ЭПР. Добавление ионной меди к апоформе ДБМ (после удаления избытка ионов меди гель-фильтрацией) приводило к полному восстановлению ее ферментативной активности, а также исходных формы и интенсивности сигнала в спектре ЭПР. Максимальная реактивация при добавлении ионной меди в реакционную смесь, содержащую апоформу ДБМ, достигалась при молярном отношении Си(П)/тетрамерный фермент, равном 8-10 (рис.4). Более высокие концентрации ионов меди вызывали ингибирование ДБМ.

Многочисленные данные, имеющиеся в литературе, свидетельствуют о незаменимой роли меди для ферментативной активности ДБМ (Blackburn et al., 1980; Colombo et al., 1987; Syvert-sen et al., 1987). Попытки реконструировать апофермент ионами других металлов, таких как:Ni (П), Со (П), Мп (П), Zn Ш), Ре (П), Fe (Ш) и Mo (VI ), были безуспешны (Blackburn et al., 1980; KLinman et al., 1984).

№ проверили способность ионов ванадила, VO (П), для реактивации апоформы ДБМ. Основанием для проведения этого исследования послужили литературные данные, согласно которым ванадий является микроэлементом, участвующим в регуляции многих ферментативных процессов, стимулируя или ингибируя их (Kechay, 1984; Erdemann et al.,' 1984; Benade et al., 1987).

Несмотря на способность ионов ванадила стимулировать автоокисление некоторых КА ( Martin et al., 1959), реакцию моно-оксигенации (гидрокбилирования) тирамина (субстрата ДБМ) они

Рис.4. Зависимости относительной активности ДБМ от концентраций ионов ванадила (А) и меди (Б). Реакционная смесь содержала: 0,2 I ацетатный буфер,рН 5,0, 15 мМ тирамин, 20 мМ аскорбат, 50 мкг/мл ка-талазы и 0,14 мкМ апо-формы ДБМ.

[СиБО^, мкМ

не активировали. При добавлении ионов ванадила к апоформе ДБМ имела место ее быстрая реактивация (рис.4), причем необходимости в преинкубации фермента в присутствии ионов ванадила не наблюдалось. Максимальная реактивация происходила при молярном отношении уо(П)/тетрамер фермента, равном. 350-400, тогда как более высокие концентрации ионов ванадила ингибировали ДБМ.

Несмотря на то, что ионы ванадила в качестве активатора ДБМ менее эффективны по сравнению с ионной медью, тем не менее величины удельных активностей препаратов, реконструированных ионами меди или ванадила, практически не отличались.

На рис.5 приведен спектр ЭПР препарата ДБМ, реконструированного ионами ванадила. Апоформу ДБМ преинкубировали в течение нескольких минут с 400-кратным молярным избытком ионов ванадила и затем несвязанные или слабосвязанные ионы исчерпывающе удаляли ультрафильтрацией. Б результате интегрирования спектра ЭПР было получено, что препарат фермента содержит 4 иона ванадила на тетрамер. Эти данные позволяют предположить, что ионы меди и ванадила могут связываться с одними и теми же каталитическими участками фермента.

Хранение (при 4°С) препарата ДБМ, реконструированного ионами ванадила, сопровождалось уменьшением интегральной интенсив-

_J_i_i_ i. .

2500 3000 3500 4000

H, Гс

Рис.5. Спектр ЭПР апоформы ДБМ, реконструированной ионами ванадала. Условия регистрации спектра: микроволновая частота - 9,11 ГГц, СВЧ-мощность - 10 мВт, амплитуда модуляции - 10 Гс, температура - 77 К.

ности сигнала ЭПР, свидетельствующим об аутоокислении ванадала в ванадат. Однако при добавлении аскорбата, являющегося кофактором ДБМ, интенсивность сигнала восстанавливалась до исходного уровня. Следовательно, способность ионов Еанадмла реактивировать ДБМ обусловлена их окислительно-восстановительными превращениями в связанном с ферментом состоянии при условиях восстанавливающей среды и слабо-кислых значений рН.

Таким образом, по крайней мере, в условиях in vitro ванадий является единственным металлом, кроме меди, способным реактивировать ДБМ.

Перенос меди мевду ДБМ и Cu-тионеином. Предполагается, что медьсодержащий белок, Cu-тионеин, локализованный в цитозоле и участвующий в накоплении, а также хранении меди, может участвовать в процессах переноса этого металла в условиях in vivo (Brady, 1982; Webb, Can, 1982; Palida et al., 1989). В экспериментах in vitro Cu-тионеин был успешно использован для реконструкции апоформ некоторых медьсодержащих ферментов И белков ( Beltramini, Lerch, 1982; Morpurgo et al., 1983,

3

1

Рис.6. Реактивация aro-' формы ДБМ Си-тионеином. Состав реакционной смеси приведен в подписи к рис.4. I, 2 и 3 - кинетические кривые, полученные в присутствий ü,3 мкЫ соответственно апо-фермента, голофермента и реконструированного фермента .

10 30 50

сек

70

1984; Schechinger et al., 1986; Brouwer, Brouwerhoexum, !989). В то же время показано, что при аккумуляции токсических соличеств меди в клетках, ее обезвреживание и удаление проис-содит путем связывания с вновь синтезированной апоформой тио-Jeiraa (Brady, 1982; Kage, Sohaffer, 1988).

В связи с вышесказанным нам представилось целесообразным 1ровести исследование переноса меди от Си -тионеина к апофор-ле ДБМ и в обратном направлении, от насыщенной медью ДБМ к гионеину, лишенному меди.

В первой серии экспериментов апоформу ДБМ, полностью ли-ленную меди и ферментативной активности, инкубировали в течение 12 ч при Ю°С с Си -тионеином, содержащим II,0 моль Си яа I моль белка, молярное отношение тетрамерный фермент/си-тионеин составляло 1/10. Затем смесь подвергали гель-фильтрации и во фракциях определяли содержание меди. В результате фермент содержал около 8,0 моль Си на I моль тетрамера, тогда как содержание меди в тионеине уменьшалось от 11,0 до 10,0 моль Си на I моль белка. Выход каталитической активности ДБМ при этом составлял более 70% (рис.6). Такой же выход активности наблвдался, когда 10-нратный молярный избыток си-тионеина добавляли в реакционную смесь, содержащую апоформу ДБМ, и непосредственно определяли активность. Преинкубация

Рис.7. Зависимость ингиби-рования ДБМ от концентрации апоформы тионеина. Состав реакционной смеси приведен в подписи к рис.4. Концентрация ДБМ составляла 0,3 мкМ

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1АЛ0ТИ0НЕИН }, мкМ

практически не являлась необходимой, следовательно перенос меди от Си-тионеина на апоферменг происходит очень быстро. Когда этот эксперимент проводили при молярном отношении Си-тионеин/апоферлент (тетрамер), равном 25, был достигнут 95,^-ный выход активности. Таким образом, полная реконструкция апофермента была получена лишь при высокой концентрации тионеина, полностью насыщенного медью.

При использовании тионеина с относительно низким содержанием меди (4 или 7 моль Си на I моль белка) перенос меди к апоформе ДБМ не наблюдался. Более того, когда тионеин, содержащий 4 моль Си на I моль белка добавляли к голоформе ДБМ, имело место ингибирование фермента. Это означает, что тионеин с относительно низким уровнем меди акцептирует медь у голофор-мы ДБМ и, следовательно, апофорыа тионеина является эффективным ингибитором ДБМ. Как видно из рис.7, 50^-ное ингибирование достигалось при стехиометрических количествах фермента и апоформы тионеина. Добавление к смеси ДБМ и апоформы тионеина относительно высокой'концентрации ионной меди приводило к полной реактивации ДБМ.

Таким образом, из приведенных результатов следует, что перенос меди между. ДБМ и тионеином направлен в сторону образования си-тионеина. Перенос в обратном направлении происходит лишь в случае полностью насыщенного медью тионеина.

Ингибирование ДВМ нейрокупреином. При выделении ДБМ из ли-зата хромаффинных гранул мы обнаружили в нем низкомолекулярную кислую фракцию, ингибирувдую активность фермента. Ингиби-рование не наблюдалось в присутствии ионной меди. О существовании эндогенного медьзависгамого ингибитора ДБМ в хромаффин-ных гранулах известно также из ранних работ (ßuch et al., 1968; Belpaire, laduron, 1970; Kuzuya, Nagatsu, 1972; Or-cuut, Molinoff, 1976). Природа ингибитора однако не была установлена. В связи с этими данными возник вопрос о возможности переноса меди между ДБМ и нейрокупреином, выделенным из ингибирущей фракции лизата хромаффинных гранул, а также из секреторных гранул предсердий.

В результате проведенных исследований было установлено, что голоформа нейрокупреина не влияет на поглощение кислорода реакционной смесью, содержащей тирашн, аскорбат и ДБМ. Однако при-добавлении апоформы нейрокупреина наблюдалось ингиби-рование монооксигеназной активности фермента, которое не зависело от источника нейрокупреина. На рис.8 приведена зависимость ингибирования ДБМ от концентрации апоформы нейрокупреина. 50%-ное ингибирование активности фермента достигалось при 100-кратном молярном избытке апоформы нейрокупреина по отношению к тетрамеру ДБМ. Следует отметить, что апонейрокупреин вызывал ингибирование как Р-, так и М-формы ДБМ.

Таким образом, нейрокупреин в апоформе в качестве ингибитора ДБМ так же эффективен, как ДЦТК или цианид, являющиеся наиболее сильными ингибиторами фермента (Green, 1964) и на два порядка более эффективен, чем ЭДТА.

Из полученных результатов следует, что ингибирование ДБМ апоформой нейрокупреина обусловлено взаимодействием апобелка с медью фермента. Доказательством служит исчезновение ингибирущей способности у апонейрокупреина после преинкубации его со стехиометрическими количествами меди, приводящей к реконструкции белка, а также уменьшение интегральной интенсивности сигнала меди в спектре ЭПР ДБМ и появление сигнала в спектре апоформы нейрокупреикз. Обратный перенос меди, от нейрокупреина к апофорые ДБМ, не наблюдался даже при 400-кратном молярном избытке нейрокупреина по отношению к ферменту.

48

[ АПОНЕЙРОКУПРЕИН] * 1о\ м'

Рис.8. Зависимость ингибирования ДБМ от концентрации апоформы нейрокупреина из хромаффинных гранул (е-е-в) и секреторных гранул предсердий Со-о-о), Состав реакционной смеси приведен в подписи к рис.4. Концентрация ДБМ составляла 4,5 нМ.

Поскольку ДЕМ, помимо основной, монооксигеназной, обладает также оксидазной активностью, которая проявляется при отсутствии в среде дополнительных доноров электронов (Хеу1п, Каийнап, 1961; Воуао1ап, Ыа1Ъапс1уап, 1982), мы проверили также влияние апоформы нейрокупреина на оксидазную (о-дифе-нолоксидазную) активность ферлента. Добавление апонейроку-преина в реакционную смесь не вызывало ингибирования при использовании в качестве субстрата пирокатехина и отмечалось лишь слабое ингибирование, когда субстратом являлся дофамин.

Следовательно, апоформа нейрокупреина практически не влияет на оксидазную активность ДБМ, тогда как монооксигеназная функция фермента, проявлявдаяся лишь в присутствии восстановителя, ингибируется апонейрокупреином. Эти данные показывают, что ингибирование ДБМ апонейрокупреином может зависеть от состояния меда фермента.

- 29 -

Сравнение свойств ПГАМ и ДБМ свидетельствует о сходстве этих монооксигеназ. Оба фермента локализованы в секреторных гранулах, где они находятся в виде М- и Р-форм, и для проявления ферментативных активностей одинаково нувдаются в ионах меди, аскорбате и молекулярном кислороде. Сравнение спектров ЭПР ПГАМ и ДБМ свидетельствует о сходстве окружений атомов меди в активных центрах этих ферментов. Кроме того, антитела к Р-форме ДБМ дают кросс-реакцию с Р-формой ПГАМ, полученной из предсердных гранул, и антитела к ПГАМ из передней доли гипофиза - с мономером ДБМ, тогда как у тетрамерной формы ДБМ кросс-реа-щия с антителами к ПГАМ не обнаруживается (неопу-бликован'ле результаты). Эти результаты позволяют предположить наличие у ПГАМ и ДБМ участков с близкой первичной структурой. И действительно, сравнение аминокислотных последовательностей ПГАМ быка и ДБМ крысы выявило примерно 28$ идентичной последовательности аминокислотных остатков на каталитических участках этих ферлентов (Southan, Kruse, 1989).Приведенные выше данные дают возможность рассматривать ПГАМ и ДБМ как "члены одного семейства" (Southan, Kruse, 1989) с медью, относящейся к типу 2. И, наконец, ингибирование ПГАМ и ДБМ апоформой нейрокупреина, обнаруженного в секреторных гранулах, где содержатся эти ферменты, может свидетельствовать в пользу общего механизма регуляции нейрокупреином про-цессинга пептидных гормонов и норадреналина.

ЦИТОХРОМ с ОКСНДАЗА ИЗ МИТОХОНДРИЙ СЕРДЦА

Характеристика препаратов ЦО. В результате использованной процедуры выделения, включающей солюбилизапшо ЦО из СМЧ хо-латом и очистку фракционированием сульфатом аммония в присутствии холата, были получены препараты фермента ("покоящейся" формы), удовлетворяющие известным критериям чистоты и нативности. Число оборотов фермента, не подвергавшегося многократному фракционированию сульфатом аммония (обогащенные фосфолипидами препараты) в 1$-ном холате составляло 100-140 Активность препаратов, очистку которых для достижения максимальных показателей чистоты проводили путем нескольких фракционирований сульфатом аммония (обедненные фосфолипвдами

'- 30 -

препараты), в 1%-пои холате составляло 1-3 Частичное восстановление активности таких препаратов достигалось растворением их в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 0,5-1%-ный гвин 20. При этом число оборотов фермента возрастало до 60-80 с-1.

СОД активность ЦО. Стехиометрия ЦО реакции трес. 'от переноса четырех электронов от молекул восстановленного ц.тохрома с к молекуле кислорода, йнгибирование ЦО реакции экзогенно добавленной СОД должно означать, что восстановление 0>2 в х°Де ЦО реакции происходит по одноэлектронному механизму, т.е сопровождается образованием в качестве промежуточного соединения

Мы установили, что СОД не влияет ни на реакцию окисления цитохрома с ЦО, ни на аутоокисление восстановленной ЦО. СОД активность была обнаружена у самих препаратов ЦО. СОД активность ЦО была показана как тетразолиевым, так и адреналиновым методами, причем активностью обладали и обогащенные, и обедненные фосфолипидами препараты фермента. На рис.9 приведена зависимость процента ингибирования реакции восстановления те-тразолия под действием от концентрации ЦО. Как видно из этих данных, 50^-ное ингибирование реакции достигается при концентрации ЦО 0,25 ыкМ.

СОД активность ЦО, подобно ее оксидазной активности, инги-бировалась цианидом, азидом и нитритом. Нагревание ЦО при 80°С в течение 3 мин, а также щелочная обработка фермента при рН 12,0 с последующей нейтрализацией раствора приводили к падению СОД активности. Так как удаление меди ЦО при инкубации препарата в присутствии хелатора металлов - батокупроина сопровождалось падением СОД активности, можно заключить, что за СОД активность ЦО ответственны атомы меда фермента. В пользу этого свидетельствует наличие СОД активности у выделенной медьсодержащей субъединицы ЦО.

Наиболее простым и естественным предположением о физиологической роли СОД активности ЦО является роль скэвенджера супер-оксвдных радикалов, которые, несмотря на термодинамическую невыгодность (Ма1п15^бт, 1979), возможно, образуются в ходе каталитического акта НО. Однако экзогенно добавленная СОД не

Зис.9. Зависимость процента ингибирования реакции образования (¡юр-казана из п-нитротетра-золия от концентрации ЦО.

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 [ЦО], мНМ

и'нгибирует ЦО. Следовательно, если супероксядные радикалы и образуются в ходе ЦО реакции, они не успевают мигрировать в свободный объем, а благодаря СОД активности ЦО, подвергаются дисмутации самим ферментом. Наше предположение о во3i.roхной функциональной рода СОД активности ЦО получило подтверждение в работе Ченса и сотр. (iiaqui, Chance, 1986), показавших наличие СОД активности у "пульсированной" формы ЦО, которая, как и оксидазная активность, оказалась выше по сравнению с препаратами "покоящееся" формы. Если'-'"пульсиро ванная" ЦО является более активной формой, вероятность образования "пульсированной" формой гораздо выше по сравнению с "покоящейся" формой. Следовательно, повышенная СОД активность у "пульсированной" формы ЦО также мотает иметь функциональное значение.

Следует тлеть в вину и другие предположения о возможной роли СОД активности ЦО. В связи с тем, что СОД из эритроцитов обладает антиоксидантной активностью, мы предположили наличие этой активности также у препаратов ЦО. В результате было получено, что в присутствии 0,1 мкМ ЦО имеет место 50$-ное ин~ гибирование перекисного окисления фосфатидилсерина. Поскольку внутренняя мембрана митохондрий не содержит СОД, можно предположить, что СОД активность ЦО может.быть существенна для внутренней мембраны. ■

- 32 -

Взаимодействие соединений азота разной степени восстанов-денности с ЦО. № изучили влияние азотсодержащих соединений, таких как:штрат, нитрит, окись азота, гидроксилашн и гидразин, на реакцию восстановления молекулярного кислорода ЦО и спектральные свойства фермента. Азот в этих соединениях, подобно молекулярному кислороду, способен к ступенчатому многоэлектронному восстановлению. Однако эти соединения, в отличие от промежуточных форы восстановления кислорода, большей частью довольно стабильны.

Влияние нитрата и нитрита на ЦО реакцию и свойства ЦО. Как оказалось, соединение с наибольшей степенью окисленности азота (нитрат) в концентрации до 0,1 М не влияет на кинетические и спектральные -свойства ЦО.

Нитрит вызывал ингибирование ЦО реакции и изменение спектральных свойств фермента. Окисление восстановленного цитохро-ма с ЦО при рН 7,0 в присутствии 0,5-5,0 мМ нитрита сопровождалось ингибированием поглощения кислорода на 30-80$. С увеличением концентрации кислорода степень йнгибирования уменьшалась. Из графиков в координатах Лайнуивера-Берка следует, что ингибирование ЦО нитритом по отношению к кислороду являются ингибированяем "смешанного" типа (рис.ЮА). Из графиков в координатах Диксона (рис.ЮБ) определено значение К г > равное 1,5 мМ.

Для выяснения мехак" via ингибирования ЦО нитритом было изучено также его е.. ie на субстрат - цитохром с. Выяснилось, что концентрация нитрита, ингибирующая ЦО реакцию на 90%, при нейтральных значениях рН практически не влияет на свойства окисленного или восстановленного цитохрома с.

Добавление нитрита к препаратам окисленной "покоящейся" формы ЦО приводило к изменениям в спектрах ЭПР и оптических спектрах ЦО. В результате 90 мин инкубации ЦО (0,5 мМ) в присутствии 0,5 М нитрита при рН 7,4 интегральная интенсивность сигнала меди в спектре ЭПР возрастала на 20-30$.

Изменения, вызываемые нитритом в оптических спектрах ЦО, были прослежены на препаратах фермента в холате и твине 20 ' (рис.II). Отличия в спектрах препаратов ЦО в холате или твине заключались лишь в сравнительно меньшей интенсивности полос

Рис.10. Влияние нитрита на кинетики поглощения кислорода при окислении восстановленного цитохрома с ЦО. А. График в координатах Лайнуивера-Берка при различных концентрациях нитрита: I - в отсутствие и 2, 3 и 4 - в присутствии соответственно 1,25; 2,5 и 10,0 мМ нитрита. Б. График в координатах Диксона при различных начальных концентрациях кислорода: 2,0; 3,0 и 5,0 глкМ соответственно для I, 2 и 3. Реакционная смесь содержала: 42 мкМ цитохром с, 0,2 мкМ ДО, 0,1 мМ ЭДТА, 50 мМ ' фосфатный буфер, рН 7,0 и 1%~шй холат.

поглощения в случае твиновых препаратов. Особого внимания заслуживает нестабильная полоса при 6С7 нм, увеличение интенсивности которой происходило одновременно с уменьшением интенсивности полосы при 655 нм, принадлежащей в спектре поглощения окисленной ЦО сопряженному кислородсвязывающему участку, гем а^-Сид (Ве1пег-{; ей а1., 197§). Полосу при 607 нм можно было наблюдать также при добавлекиЬ нитрита к "пульсзрован-ной" форме ЦО. "Время, жизни" полосы при 607 нм зависело от рН, возрастая при изменении рН от 7,4 до 8,5. Уменьшение концентрации кислорода в образце стабилизировало эту полосу. При одновременном добавлении во^становденного цитохрома с в образец, содержащий ЦО к нитрит^гдантроль с интактной ЦО, интенсивность полосы при 607 нм возрастала и полоса при 550 нм, характерная для восстановленного цитохрома с, не обнаружива-

Pkg.II. Оптические разностные спектры ЦО в присутствии нитрата при различных рН. А - ЦО в 1%-тп холате и

Б - е 0,5^-ном ТЕине 20. (.....) - нулевая линия:

ЦО-иитрат минус окисленная ЦО; (-) - ЦО-нитрит

минус окисленная ЦО. Концентрации ЦО и нитрита (или нитрата) составляли соответственно 80 мкЫ и 30 мМ. Числа на рисунке соответствуют временам в минутах после добавления нитрита.

лась. Следовательно, нитрит не влияет на перенос электронов от цитохрома с к ЦО. Как следует из литературных данных, "коротко живущая" полоса при 607 ни принадлежит "перокси" форда ЦО, образующейся при реакции восстановления молекулярного кислорода ЦО, для которой также характерно отсутствие в спектре поглощения полосы при 655 нм ( СЗалпсе et а1., 1975). Таким, образом, нитрит взаимодействует с кислородсвязнвающим центром ЦО, приводя к образованию формы фермента, аналогичной "перокси" форме. Изменения, вызываемые нитритом в оптическом и ЭПР спектрах ЦО, по всей вероятности, присущи одной и той же форме фермента, поскольку имеют одинаковый характер зависимости от концентрации кислорода.

Ш обнарушли, что окисленная "покоящаяся" форла ЦО в присутствии нитрита и в отсутствие каких-либо восстановителей

Рис.12. Зависимости вызываемого нитритом поглощения кислорода от концентраций ЦО (I), нитри-

та (2) и рН (3). Реакционная смесь содержала: 80 и 45 мкМ ЦО соответственно для 2 и 3, фосфатный буфер, рН 7,0 (для I и 2), 1%-тй холат и 0,1 мМ

1 -10 30 50 70 90

J_I_1__1_1_1-1-1-и

ЭДТА. Концентрация нитрита для I и 3 составляла I М.

ЩО), пкМ 0,5 1,0 1,5

Л_i_i.

[ N0'], М 6,5 7,5 8,5

1 1 рН

поглощает кислород (рис.12). Скорость поглощения кислороди линейно зависела от концентраций фермента и нитрита и имела такую же зависимость от рН в интервале 6,4-8,5, как и ЦО активность. Из этих данных следует, что ЦО обладает нитритокси-дазной активностью.

На основании полученных результатов можно заключить, что нитрит, являясь одновременно донором электронов и ингибитором ЦО, приводит к образованию "перокси" формы с полосой при 607 нм, стабилизирует ее, не внося непосредственного вклада в эту полосу.

Влияние гидразина на ЦО реакцию и свойства ЦО. На рис.13 показано влияние гидразина на окисление восстановленного ци-тохрома с ЦО (препарат фермента в 1%-пои холате с низким содержанием липидов) при различных значениях рН. Как видно из рисунка, при рН 6,0 гидразин оказывает выраженное ингибирующее

1Щ], мМ

Рис.13. Влияние гидразина на реакцию окисления восстановленного цитохрома с ЦО. А, Б и В - кинетические кривые изменения интенсивности полосы при 550 ш восстановленного цитохрома с (80 ыкй) в присутствии ЦО (2 мкМ) в 1%-ном холате и гидразина соответственно при рН 6,0; 7,4 и 8,5. Концентрации гидразина составляли: А. 1-0, • 2-30, 3-50, 4-100 и 5-200 ый; Б. 1-0, 2-100 и 3-200 мГЛ; В. 1-0, 2-10, 3-20, 4-100 и 5-200 мМ. Г. Зависимости скорости изменения интенсивности полосы при 550 нм от концентрации гидразина при рН 6,0 (о-о-о), 7,4 (а-4-1) и 8,5 (•-•-•). За 100$ принята скорость изменения интенсивности полосы при 550 нм при рН 6,0 в отсутствие гидразина.

действие на ЦО реакцию, 5С$-ное ингибирование наблюдалось при концентрации гидразина 40 мМ. На активность препаратов фермента с высоким содержанием фосфолипидов в 0~ном холате, а также препаратов в 1%-вои твине 20 гидразин практически не оказывал ингибирунцего действия. Когда реакция окисления цитохрома с проводилась при рН 7,4, ингибирование гидразином было слабее. При повышении рН до 8,5 в присутствии гидразина наблюдалось увеличение скорости окисления цитохрома с, т.е..активиро-

1И2Н4!гмМ 1Ц01,мкМ

Рис.14. Поглощение кислорода ЦО в присутствии гидразина.Фермент растворен в 1^-ном холате. А - Зависимости скорости поглощения кислорода от концентрации гидразина при рН 6,0 (I), 7,4 (2) и 8,5 (3). Концентрация ЦО -6,7 мкМ. Б - Зависимость скорости поглощения кислорода от концентрации ЦО при рН 7,4. Концентрация пиразина - 10 ми!.

вание реакции. Аналогичные результаты были получены также при регистрации ЦО реакции по поглощению кислорода. В контрольных экспериментах было установлено, что гидразин при концентрации до 200 мМ не влияет на спектральные свойства восстановленного или окисленного цнтохрома с.

Выяснилось, что сам гидразин в отсутствие восстановленного цитохрома с вызывает поглощение кислорода ЦО (рис.14). Скорость поглощения кислорода являлась линейной функцией от концентрации ЦО, а такие зависела от концентрации гидразина и рН. Число оборотов при условии насыщения гидразином (при рН 6,0; 7,4 и 8,5) составляло соответственно 0,09; 0,27 и 0,5 с-^. Эти результаты подтверждают данные Ми^Бегв ей а1. (1962) о наличии у ЦО некоторой гидразиноксидазной активности. Гидразине ксидазная актив;-^ть фермента не зависела от его удельной

Зис.15. Влияние гидразина на оптический и ЗПР (вставка) спектры ЦО в аэробных (I) и анаэробных (2) условиях. (-) - "покоящаяся" окисленная ЦО в 1%-пом холате.рН 7,4; (.....) - восстановленная дитионитом ЦО; (---) -

окисленную ЦО инкубировали в течение I ч в присутствии гидразина. Концентрации ЦО и гидразина составляли для оптических измерений соответственно 23 мкМ и 30 мМ, для ЭПР - 0,3 м!Д и С,3 М.

ЦО активности. Добавление окисленного цитохрома с также не влияло на скорость окисления гидразина. Этот факт указывает, что гидразин взаимодействует с центром, отличным от центра, с которым взаимодействует восстановленный или окисленный цито-хром с. •

Из спектральных исследований следует, что гидразин восстанавливает ЦО. Скорость восстановления гидразином гемовых и медных центров ЦО и конечная степень их восстановленности зависели от таких факторов, как рН, соотношение концентраций фермента, гидразина и кислорода, а также типа детергента, в котором солюбилизирована ЦО. В аэробных условиях при нейтральных рН гидразин восстанавливал только один гем фермента, тогда как в анаэробных условиях гидразин восстанавливал обе ге-ыовне группы, а и а^ иратоа меди, Сид (рис.15). Таким образом, кислород препятствует полному восстановлению гемов и Сид. Исхода из того, что с кислородом взаимодействует участок фермента, гем ауСх^, можно предположить, что в аэробных условиях именно гем щ не восстанавливается гидразином. Скорость восстановления и конечная степень восстановленности ге-

нов и Сид в аэробных условиях при увеличении рН (до 8,5) возрастали, что, вероятнее всего, является следствием уменьшения концентрации кислорода в образце с ферментом при таких условиях.

Под влиянием гидразина в оптических спектрах ЦО образуются полосы поглощения, расположенные при 530, 537 и 845 нм, не наблодающиеся в спектрах окисленной или восстановленной ЦО. Полосы при 530 и 537 нм достигали максимальной интенсивности на начальных этапах реакции восстановления кислорода ЦО при щелочных рН после аэрирования полностью восстановленного в анаэробных условиях в присутствии гидразина ферлента и без дальнейшего аэрирования были стабильны в течение продолжительного времени. По всей вероятности, гидразин, ингибируя окисление восстановленной ЦО кислородом (о чем судили по появлению -полосы при 605 ны в разностном спектре), стабилизирует полосы при 530 и 537 нм. Таким образом, полосы при 580 и 537 нм отражают изменения фериенга при взаимодействии его с кислородом при щелочных рН. Из этих данных следует, что предварительное восстановление ЦО обеспечивает переход ферлента в промежуточную форму с полосами при 580 и 537 нм. В результате последующего аэрирования эти полосы исчезали и появлялась новая, ранее не обнаруженная полоса при 845 нм (рис.16). Следовательно, полоса при 845 нм также- образуется при взаимодействии ЦО с кислородом. Образование этой полосы, наблюдаемой и после добавления гидразина к окисленной ЦО в аэробных и анаэробных условиях, не зависело от восстановленное™ или окислен-ности геыов, а в а^, меди, СиА, а также от рН. На этом основании мы предположили, что полоса при 845 нм скорее всего отражает изменения ЗПР-необнаруживаемой меди, Сид , а не гемов или ЭПР-обнаруетваемой меди, Сид. При взаимодействии "пульси-рованной" (или "онсигенированной") ЦО с гидразином интенсивность и скорость образования полосы при 845 нм были выше, чем в случае окисленной "покоящейся" формы фермента. Факт, что оксигенирование ЦО приводит к максимальному увеличению полосы при 845 нм.позволил предположить, что эта полоса образуется при условии, когда кислород входит в структуру участка гем а^-Си^. Обнаружение этой полосы в аэробных и анаэробных ус-

Рис.16. Изменения в разностных спектрах ЦО-дитионит-гидразин минус ЦО-дитионит при рН 7,4 (А) и 8,5 (Б). ЦО (25 мкМ) инкубировали 30 мин с дитионитом (10 ай) и гидразином (10

мШ. (.....) - ЦО-дитионит-гидразин минус ЦО-дитионит;

(-) - после 30 сек аэрирования образца и контроля.

А. 1,2,3 и 4 соответственно через 2, 8, 20 и 35 мин после

аэрирования; (-----) - через 50 мин после 2-го аэрировани

Б. I - непосредственно после 1-го аэрирования и далее в течение I ч инкубации; 2 и 3 соответственно после 2-го и 3-го аэрирований; (-----) - через 50 мин после 3-го аэрирования.

лоейях позволило предположить, что в окружении меди, с^, не ходится кислород даже при таких условиях, которые обычно рас сматриваются как строго анаэробные. Исходя из условий образе вания этих полос, их кинетического поведения, а также их раг

личной зависимости от некоторых ингибиторов реакции восстановления кислорода ЦО (окись углерода, цианид, аззд, нитрит)-был сделан вывод, что полосы при 580, 53? и 845 нм принадлежат двум разным центрам кислородсвязывагацего участка фермента.

Согласно литературным данным, трехэлектрошгое восстановление кислорода на участке гем a^-Gug приводит к образованию "феррил" формы фермента с полосой поглощения при 580 нм и симбатно с ней изменяющейся полосой при 537 нм (Blair et al-, 1985; Witt et al., 1986). Взаимодействие ДО с гидразином также сопровождается образованием и симбатным изменением кине-тик этих двух полос. Однако в этом случае они отчетливо наблюдались лишь при высоких значениях pH (как, например, pH 8,5), тогда как полоса при 845 нм наблюдалась при всех исследуемых значениях pH. Следует отметить, что взаимодействие восстановленной дитионитом ЦО с гидразином в отсутствие кислорода не приводит к появлению полос при 580, 537 и 845 нм. Однако их наблюдение становится возможным после аэрирования образца с ферментом, причем образование полос при 580 и 537 нм предшествует образованию полосы при 845 нм.

Совокупность полученных фактов позволяет считать, что полосы при 580 и 537 нм принадлежат гему ад, связанному с кислородом, претерпевшим двух- или трехзлектронное восстановление, тогда как полоса при 845 т принадлежит меди, Сив, связанной с одной из частично восстановленных форм кислорода и гидразином. Тем самым становится возможным значительно стабилизировать при комнатной температуре промежуточные формы частично восстановленного кислорода и наблюдать при этом формы фермента с полосами поглощения 580, 537 и 845 юл.

Таким образом, из результатов исследования взаимодействия ЦО с соединениями азота разной степени восстановленности следует, что нитрит и гидразин могут быть использованы для изучения механизма реакции восстановления кислорода ЦО.

Мы изучили также влияние на ЦО азотсодержащих лекарственных препаратов - нигропруссида натрия и нитроглицерина и некоторых органических производных гидразина - регуляторов роста растений.

Выяснилось, что нитропруссид оказывает ингибирущее дейст-

вие на ЦО. 50%-ное ингибирование ДО реакции наблюдалось при концентрации нитропруссида 8 мМ. В результате спектральных исследований было получено, что нитропруссид взаимодействует с кислородсвязывающим центром ЦО. Как оказалось, нитроглицерин взаимодействует с ЦО лишь в присутствии восстанавливающих агентов и не влияет на окисленную форму фермента.

Изучение влияния на ЦО реакцию органических производных гидразина, к числу которых относятся ид-диметилгидразид янтарной кислоты (ДЯК), гидразид малеиновой кислоты (ГМК натрия) ,гидразиниевые соли фосфоновой кислоть: - гидрел и диги-дрел, квартазин, показало, что из указанных соединений лишь ДЯК ингибирует ЦО. При концентрации ДЯК, составляющей 20 мМ, наблвдалось 50^-ное ингибирование ЦО реакции, тогда как ги- . дрел, дигидрел, ГМК натрия и квартазин не оказывали влияния на ЦО. Ингибирование ЦО под влиянием ДЯК наблвдалось также в экспериментах in vivo после введения крысам этого соединения и анализа активности выделенных препаратов ЦО (Маркссян и др., в печати). Следовательно, токсический эффект ДЯК монет быть обусловлен также его влиянием на ЦО.

Таким образом, из полученных данных следует, что ЦО может рассматриваться как экспериментальная модель для ускоренной оценки токсичности азотсодержащих соединений.

ВЫВОДЫ

1. Установлено наличие М- и Р-форм ПГАМ в секреторных гранулах предсердий и хромаффинных гранулах надпочечников. Разработаны методы одновременного выделения из гранул М- и Р~ форм ПГАМ, М- и Р-форм ДБМ и медьсодержащего белка нейроку-преина.

2. Определены выход М- и Р-форм ПГАМ и ДБМ и соотношение этих форм в зависимости от экспериментальных условий. Пока-

'зано, что при выделении и лизисе гранул в присутствии протекторов: ингибиторов протеаз (пепстатина и ШСФ),N-этилмале-имвда и каталазы, выход М-форм ПГАМ и ДБМ по отношению к общему содержанию этих ферментов составляет 50-60$, тогда как в отсутствие протекторов оба фермента могут быть получены практически полностью в Р-форме.

3. Изучены физико-химические свойства впервые полученных 1 электрофоретически гомогенном состоянии препаратов Б-формы ПГАМ из секреторных гранул предсердий и хромаффинных гранул. Показано, что ПГАМ из обоих типов гранул состоит из одной полипептидной цепи с молекулярной массой 60 кДя к содер!ит один атом леди на молекулу. Ка основании спектров СПР _;сд! ЛГАЛ отнесена к типу 2. Установлена аналогичность ::2т;^"-л:кгчсских свойств '¿- и Р-фора ПГА.7 из гранул обоих типов.

4. Срознены йязико-хнишеские, каталитические :: антигенные свойства препаратов ¡.I- и Р-чрорм ДБ;.!. В препаратах ¡..-формы в отличие от Р-формы обнаружены субъедикицы двух типов и наличие фосфолипидов. Лигандное окружение атомов меди в активных центрах этих форы, а также их каталитические и антигенные свойства аналогичны.

5. Изучена возможность реактивации апофорл ПГАМ и ДБМ ионами металлов. Показано» что при добавлении ионной меди к апофорд5ам этих ферментов достигается полное восстановление их активностей. Обнаружено, что единственным металлом, помимо меди, способным реактивировать адоформу ДБМ, является нападай, находящийся в виде ионов ванадила, УО (П).

6. ИсследоЕана возможность переноса меди между ДБМ и Си~ тионеином. Установлено, что способность Си-тионекнз отдавать медь ДБМ зависит от уровня насыщенности тионеина медью. Полная реактивация апоформы ДБМ наблюдается лишь при молярном избытке насыщенного медью тионеина по отношению к ферменту. Апоформа тионеина или тионеин с относительно низким уровнем меди акцептируют медь у голофорлы фермента, приводя к его ин-гибированию. Таким образо;.!, перенос меди мезду ДБМ и Си-тионеином направлен в сторону образования Си-тионеина.

7. Обнаружено, что апоформа нейрокупреина, выделенного из хромаффинных гранул надпочечников и секреторных гранул предсердий, является сильным ингибитором глонооксигеназных активностей ПГАМ и ДБМ, тогда как голоформа нейрокупреина не влияет на активности этих ферментов. Представлены доказательства, что ингибирование апоформой нейрокупреина связано с хелатиро-ванием меди ферментов. Обратный перенос ыеди от нейрокупреина к апоформам ПГАМ и ДБМ не наблюдается. Нейрокупреин может

рассматриваться как один из возможных эцдогенных белковых регуляторов процессинга пептидных гормонов и норадреналина. -

8. Выявлено значительное сходство свойств ПГАМ из гранул обоих типов и ДБМ. Обе монооксигеназы в секреторных гранулах существуют как М- и Р-формы, обнаруживают аналогичное окружение атомов меди в активных центрах, обладают близкими антиген ными свойствами, нуждаются для проявления ферментативных активностей в аскорбате и молекулярном кислороде и имеют общий белковый ингибитор.

9. У препаратов ДО обнаружена СОД активность. Показано,что СОД активность ЦО так же, как и ее оксидазная активность ин-гибируется цианидом, азидом и нитритом. Установлено, что за СОД активность ЦО ответственны атомы меди фермента. Предполагается, что СОД активность ЦО может иметь функциональное значение.

10. Изучено взаимодействие ЦО с соединениями азота разной степени восстановленное™ (нитрат, нитрит, окись азота, ги-дроксиламин, гидразин). Показано, что влияние этих соединений на ЦО зависит от степени восстановленности азота в них, а также от присутствия кислорода, рН среды и типа детергента,в котором растворен фермент. Установлено,что нитрит и гидразин, взаимодействуя с кислородсвязывагацим центром ЦО, ингибируют реакцию восстановления кислорода и не влияют на перенос электронов от восстановленного цитохрома с к ЦО. У ЦО обнаружены нитритоксидазная и гидразиноксидазная активности. Нитрит и гидразин, выступая одновременно как доноры электронов для ЦО и ее ингибиторы, приводят к образованию довольно стабильных промежуточных форм (соответственно "перокси" и "феррил"), наблюдающихся обычно при низкотемпературных килетиках реакции восстановления-молекулярного кислорода ЦО, и могут быть использованы для изучения механизма этой реакции. На основании исследований с гидразином установлено, что в окисленной ЦО в окружении атома меди, Сив, находится кислород даже в условиях, рассматриваемых как строго анаэробные.

11. Исследовано влияние азотсодержащих лекарственных препаратов (нитропруссид натрия, нитроглицерин) и производных гидразина - регуляторов роста растений (гидрел, да-

гпдрел, ДЕК, Гь'К натрия п квартазин) па ДО. Обнаружено, что витропруссид ингибирует ЦО реакцию к гизивает кзиенепия спектральных свойств окисленного фермента. Нитроглицерин взаимодействует с ЦО в присутствии восстанавливающих агентов и не влияет на окисленный ферьхнт. Исследование влияния регуляторов роста растений на ЦО реакцию выявило, что ингибирование имеет ;.;есто лишь в случае ДЯК.

12. Токсически!: зффект азотсодержащих соединений шзет быть обусловлен также их влиянием на ЦС. ДО может использоваться в качестве экспериментально;! поделя для ускоренной оценки токсичности соединений азота.

Список работ, опубликованных по тепе диссертации

I.. Айказян Е.Ц., |,!аркосяк К.А., 1'албандян P.m. Счистка и некоторые свойства двух медьсодержащих белков из огурца Cucu-raio oativus //Еиохшшя.- 1974.- Т.39, 6.- С.П84-П90.

2. Karkosoian К. A., Aikazyan V.I в. and Nalbandyan I:.I,I. Two copper-containing proteins from cucumber (Cucumis sativus)// 3iochin.Biophys.Acta.- 1974— У.35У, If 1— P.47-54.

3. Karkossian K.A. and ilalbandyari Е.Ы. Superoxide dicmuta-se does not inhibit the oxidation of cytochrome g and cytochrome oxidase//Biochem..Biophys.Res.Сошшп.- 1975.- V.67,

IT 3-- P.870-876.

4. Шркосян К.А., Ногосян A.A., ПаДтян И.A., Калбаадщи P...i. Суперокспддисмутззная активность Ц;1тохромокс:щ£зн//Тез.докл.

3 Всесоюзного симпозиума "Структура и функции активных центров ферментов". М,- 1976.- С.35.

5. Ыаркосян К.А., ¡.¡арданян С.С., Камалян i.i.P., Палбандян P.M. Спектры <,ПР ццтохрококсздаз анвотикх ткапей//Тез.дакл. Всесоюзного смшозиуш "¡лагнлтнын резонанс в биологии и ¡медицине". Ы.- 1977.- С.97.'

6. Маркосян К.А., Налбандян P.Li. Медьсодержащая субъединица цдтохромоксидазы: шделение, связь меди с аминокислотными лягэздаш, роль в цитохрошкеидазнол реакции//Тез.докл.4 Всесоюзного симпозиума по химии белков и пептидов, ¡лшек.- 1977.-C.I2I.

7. I.Iarko:-'sian К.A., Poghossiun А-А-, Paitian N.A. and

- 46 -

Halbandyan R.M. Superoxide dismutase activity of cytochrome oxidase//Biochem.Biophys.Kes.Commun.- 1978.- V.81, N 4.-P.1336-1343-

8. ¿larkossian К.Д. and Halbandyan R.M. Partial reconstruction of cytochrome oxidase from the heme and Cu subunits//Abstracts of the 12 FEBS Meeting. Dresden— 1978.- P.166.

9. Маркосян К.A., Балбандян P.M. О роли гледи в вдтохроы-оксвдазе//Биохимия.- 1978.- Т.43, JS 7.- С.П43-П49.

10. Маркосян К.А., Погосян Г.Г., Пайтян Н.А., Налбандян P.M. Взаимодействие неорганических анионов с атомами меди щ-тохромоксидазы/УВиохимия,- 1979.- Т.44, й 5.- С.844-850.

11. Маркосян К.А., Пайтян Н.А. Сигнал нового типа в спектре ЭПР цитохромоксидазы//Тез.докл.2 Закавказской конференции по 1трименению радиоспектроскопии в химии, физике и биологии. Ереван.- 1979.- С.72.

12. Пайтян Н.А., Погосян А.А., Демин Ю.М., Маркосян К.А., Налбандян P.M. Изучение физико-химических и функциональных свойств иысскоочнщенных цитохромов митохондрий миокарда//Тез. докл.1 Всесоюзной конференции по кровоснабжению, метаболизму и функции органов при реконструктивных операциях. Ереван.-1979.- С.31-32.

13. Paitian N.A., Markossian К.A., Demin Yu.M., Piloian. A<fi., Halbandyan R.M. A comparative study on the physico-chemical properties of cytochrome £ oxidase from cardiac mitochondria of different animals//J.Mol.Cell.Cardiology.- 1980.-V -12, Supplement 1-- Р-Ш-

14. Маркосян К.A., Пайтян Н.А., Налбандян P.M. Влияние нитрита на цитохроыоксидазу//Биохимия.- 1981.- Т.46, JS 9.- С. I6I5-I62I.

15. Маркосян К.А.,.Пайтян Н.А. О взаимодействии гемов и меди в цитохромоксидазе//Тез.докл.З Республиканской сессии по вопросам биофизике. Еревае.- 1982.- С.22.

16. Маркосян К.А., Пайтян Н.А., Налбандян P.M. Влияние нитрита и гидразина на оптические и ЭПР-спектры цитохромокси-дазы//Тез.докл.1 Всесоюзного биофизического съезда. М.- 1982,-С.128.

17._ Маркосян К.А., Пайтян Н.А., Налбандян P.M. О различии

гемов а и щ в цитохрошксидазе//Тез. докл.Всесоюзной конференции по химии и биохиши порфиринов. Самаркавд.- 1982.-С.29,

18. Markossian К.A., Paitian Н.А. and. Nalbandyan Е.М. Properties of cytochrome oxidase under effect of some compounds with different valency of nitrogen//Abstracts of the seventh joint symposium of the biochemical societies of the GDR and USSR "Oxidative metabolism, glycolysis and ATP'.' Leipzig —

19S3- P.

19. Markossian K.A., Paitian N.A. and Nalbandyan R.M. Changes induced by hydrazine in optical spectra of cytochrome oxidase// FEBS Xett.- 1983— 7-156, IT 2.- P.235-238.

20. Маркосян К.А., Пайтян Н.А. Изучение механизма реакции восстановления кислорода с использованием ингибиторов//Тез. докл.1 Всесоюзной конференции по переносу электрона в белковых системах. Вильнюс.- 1985.- С.57.

21. Paitian N.A., I.larkossian К.A. and Nalbandyan К.М. The effect of nitrite on cytochrome oxidase//Biochem.Biophys.Ees. Commun.- 1985— 7-133, N" 3— P-1104-1111.

22. Markossian K.A., Paitian N.A., ¡.likaelyan i.I-7. and Nalbandyan R.M. On the physiological role of neurocuprein. Apo-neurocuprein is an inhibitor of dopamine 3-monooxygebase// Biochem.Biophys.Вез-Солшшп.- 1986— V.138, N 1— P.1-8.

23. 1.!аркосян K.A., Пайтян Н.А., Налбандян P.i;I. Влияние гидразина на свойства цитохромоксидазы//Виохимия.- 1988.- Т. 53, 7.- C.II36-II43.

24. Markosuian К.A., Paitian 1Т.А-, l.ielkonyan 7.Z. and llal-bandyan R.M. On the copper transfer between dopamine <3-nono-oxygenase and Cu-thionein//Biocheia.Biophys-Res.Commun.- 1988.7 .153, N 2.- P.558-564.

25. Mikaelyan M.V., Markossian K.A., Paitian IT.A. Sharoyan S.G. and Nalbandyan R.M. Secretory granules from different glands contain neurocuprein-like protein//Biochem.Biophys. Res.Commun.- 1988— 7-155, II 3— P-1430-143C.

26. Markossian K-A-, Paitian N.A., Halbandyun Е.Г.1. The reactivation of apodopamine 3-monooxygenasQ by vanadyl ions FEBS Lett.- 1983.- 7.238, IT 2-- p.401-404.

- 48 -

27. Авакян А.Х., Маркосян К.А., "-.йтян Н.А., Надбандян P.M. Влияние регуляторов роста растений - производных гидразина на цитохромоксидазную реакцию//Известия All СССР, серия биол.- 1988.- № 2,- С.302-304.

28. ilarkossian К.a., Paitian Н.д., Nalbandyan R.M. An endogenous inhibitor of copper-containing nionooxygenases of chromaffin granuIeB//J.Neurochem.- 1939.- V.52, Suppl.-P.89.

29. Маркосян К.A,,' Пайтян Н.А., Налбандян P.M. Спектры ЭПР пептидилглицин Ы-амидирутацеГ монооксигеназы//Тез.докл.УЛ Всесоюзной конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине". М.- 1989.- С.37,

30. Маркосян К.А., Пайтян Н.А., Налбандян P.M. Влияние нитропруссида на реакцию восстановления кислорода цитохром-оксидазой/УЙурн.Эксп.Клин.Мед.- 1989.- Т.29, \1 4.- С.363-366<,

31. Маркосян К.А., Пайтян Н.А., Абрамян К.С., Налбандян P.M. Пептидилглицин а-аьшдируицая монооксигеназа из секреторных гранул предсердий и хромаффинных гранул надпочечников бы-ка//Биохимия.- 1989.- Т.54, Si 12,- С.2046-2053.

32. Маркосян К.А., Пайтян Н.А., Налбандян P.M. Взаимосвязь мембранной и растворимой форм дофамин в-монооксигеназы//Био-химия,- 1990.- Т.55, № I.- С.147-154.