Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Реконструкция цепи переноса электронов мембран хромаффинных гранул

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Реконструкция цепи переноса электронов мембран хромаффинных гранул"

I 7 ОКТ 1995

ашнональная акадшия наук республики армения институт виохшии гшш г. бэтшяна

На нравах рукошгса УДК 531.3/541.128/547.915/577.17/.23

БОЯДДШ АННА СУРЕКОБНЛ

шсокстршдш цепи переноса электронов шз£еран хромаффшйл гранул

оо.оз - иоиькуллраая ояологал и генетика

автореферат

доссортяцкн на сонскашз ученой степени дептора бкапоютесках ыау»

Креван - 1996

шиилш» ¿тгашие-шъ <»мг.ш>ылр1» ишам ами^ьиьи

I, Р(»ЪМ5РвиЪЬ аыиь 1>Ъ93г$(к5

ИЗ1» 531.3/541.128/547.915/577.17/. 23

шшиъ иш1 илгвъь

«пшьшм» ггишл-арь ¡ншии» иьирпшгь «т»и1г(гил1 едим аьпмшодг

00.03 - [Ыр1«;||Ь <1

МЫ|иириЬа1|аЪ ^нЦшар

^¡шЦиЬ иия^иЪ Ни^Цп ш1Ь\из|«я«1ар ¿аЪ

у ь 11г а » ► р

¡7 РИМ - 1996

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии Национальной Академии Наук Республики Армения.

Официальные оппоненты:

академик HAH РА, доктор биологических наук, профессор I.J.A. ДАВТЯН

доктор биологических наук, профессор Р.Г. КАШЛЯЙ

доктор биологических наук С.С. ШРДАКЯН

Ведущая организация - кафедра общей и биоорганической химии Ереванского государственного медицинского университета им. М. Гераци.

Защита состоится " !& " сентября 1996г. в /fr 82 часов на заседании специализированного совета 042 при Институте биохимии им.академика Г.Х.Бунятяна HAH РА(375044, Ереван,ул.П.Севака,5/1).

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке Института биохимии им. академика Г.Х. Бунятяна HAH РА

Автореферат разослан августа 1996г.

Ученый секретарь

специализированного совета,

доктор биологических наук,

профессор ß> „ A.A. СШОНЯИ

OU yuß^

- 3 -ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ряд ключевых окислительно-восстановительных реакций кивой клетки протекает на ее мембранных структурах при участии влектронтранспортных цепей. Реакции вти имеют большой диапазон действия: с одной стороны, они принимают участие в биосинтезе макрозргичеоких и биоактивных соединений, с другой - в детоксификации ксенобиотиков, способствуя, таким образом, реализации многих кизненно вашшх функций организма.

Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о ваыиой структурно-функциональной и регуляторной роли липидов , в частности фосфолипидов (ФЛ), в функционировании биологических цепей переноса электронов путем воздействия на входящие в состав этих цепей электронные переносчики и ферглентц (French, Guenge-rích, 1980; Robinson, 1982; Ахрзм к др., 1988, Baivers et al., 1993; Powell et al., 1990; Pinheiro, 1994; Chang et al., 1994; Ovad! et al., 1994; Rutomaa and Klnnunen, 1995; Córtese et al., 1995). Возможность осуществления подобных функций обусловлена тем, что липидное ыикроокружение является активным фактором, определяющим структурные, каталитические, динамические и соответственно функциональные особенности мембранных белков, как интегральных, так и периферических. Оно достаточно мобильно и дшгамнчно, чувствительно :: исуспепия. скруга»г;ей среды, что в определенной степени достигается благодаря процессам флкл-флоп, латеральной диффузии, а самое главное - возмоазюстям метаболических взаимопревращений компонентов лсшдного шпфоокруаения белка, переходом одних форм липидов в другие и, соответственно, изменением конформации втого шпсроокруаения. Модификация структурных и динамических свойств липидов способствует модификации структурных, динамических и каталитических свойств находящихся в их окружении белков (Бурлакова, 1977; Jost et al., 1977; Carru-ters, Melchior, 1986; Кшпшеп, 1991} Saltiel et al., 1991; Newton, 1993; Mouriteen, 1993; Uarsh, 1995).

Предметом настоящего исследования являлась цепь переноса электронов мембран хромаффинных гранул (ХГ), природа, молекулярная организация и последовательность взаимодействия ев компонентов и роль липидного окружения в функционировании данной цепи.

ХГ представляют собой специализированные оубклеточные орга-нел"ы, локализованные в мозговом слое надпочечников и осущест-

влязсщке процессы накопления, хранения и секреции гормонов кате-ходачиновой природы (Winkler et al., 1986). В ХГ протекает такие одна из стадий биосинтеза хатехоламинов - реакция гидроксилиро-вания дофамина с образованием норядреналина, катализируемая медьсодержащим ферментом' - дофамин-р-монооксигеназой (ДБМ: КО 1.14.17.1) (Gkotlanü, Ljones, 1979! Stweart, Klinman, 1988).

Достаточное количество експериментвльных данных (Fiatmark et al., 1971; lerland, Platmark, 1973: Zaremba, Hogue-Angaletti, 1932; Strivastava et al., 19Э4; Yiinkler et al., 1986; Wakeiield et al., 1986; Stweart, Kliman, 1988; Perin et al., 1938: Евров-ti at al, 1989), позволяет предположить наличие на мембранах ХГ цепи переноса электронов, поставляющей необходимые для синтеза норадреналина восстановительные ьхсзиваленты неубранной фор Je ДБМ (иДБЫ) и вклвчащей следующую последовательность кошонентов:

KADH -> ЙШ1:(акцептор)редуктаза -> ?-> цит.Ь5б1-> ?->иДШ -> 02

_2

дофашн + Gig -> норадреналин + HgO

Как следует из представленной схемы, состав кошонентов влектронтранспортной цепи идентифицирован не полностью. В частности, не установлены влектронные переносчнкк, фунвдаонирущиа на участках цепи мевду NADHs(акцептор) ¡редуктазой н цитохроыом ь5б1 0 ода°й стороны, и мевду шт.Ь^., и концевой

оксидазой данной цепи - мДБМ. с другой.

В отношении последнего втапа -следует отметить, что еще в 1978г. в составе мембран ХГ был обнаружен кислый медьсодержащий белок (КМБ) (Helle et al., 1978), фенологическая роль которого до настоящего времени оставалась невыясненной. Белок этот был назван подобным образом исходя из низкого значения его изоэлектрической точки (3,5) и наличия в его составе меди (одного атома на молекулярную массу 1(ВДа (Григорян, 1983)). По своим физико- химическим свойствам атот белок может быть сравним с, так называемыми, "синими" ыёдьсодеровдщош белками, функциони-рущиыи в составе цепей переноса електронов растений и бактерий и часто выступающими в рож акцепторов електронов цитохромов и доноров электронов концевых оксидаз (Сох, Boxer, 1978; Aikazyan, Nalbandyan, 1981; Adman, 1988; Nakamura, 1988; Trost et ul., 1988; Chen et al., 1994: Ikeda, Sakura, 1994; Haikazyan, 1996).

Основные принципы структурно-функциональной организации ХГ "

сходни с таковими секреторных гранул, расположенных в других тканях, включая цозг. XT значительно крупнев аналогичных структур по размерам, и, кроме того, их несравненно легче получать методически, йто позволяет рассматривать ХГ как идеальпуп модель для изучения общих принципов молекулярной организации и механизмов функционирования секреторных гранул в целом (Russe! et al., 1985; Winkler et al., 1986; Sohwarzenbrunner et al., 1990).

В этой связи интересно, что некоторые из электронных переносчиков, характерные для электронтранспортной цепи мембран ХГ, были такие обнаружет! в нейроеекреторных гранулах окончаний ад-ренергических нейронов и нейрогапо^за (Rüssel et al., 19S5; Kent, Fleming, 1987; Sclwarzenbrunner et al., 1990). Тагам образом, но исключено, что сходные по структура п молекулярной организации электронных переносчиков, но отличащиеся природой концевой оксвдазы ьлектровтранспортные цегш могут функционировать и в составе других секреторных гранул, обеспечивая синтез тех или иных биоактивных ооединешй!.

Учитывая вшиеизлоавнное, очевидно,что исследования, направленные на изучение молекулярной организации цепи переноса влект-ронов мембран ХГ, последовательности взаимодействия составляющих ее компонентов, а такке той роли, которую играет липидное окру-кение этих компонентов в функционировании отмеченной электронтранспортной цепи, играют сущестзенную роль в penemsE ряда фундаментальных проблем молекулярной биологии..

Цель и задачи исоледовмшя. Первая задача настоящего исследования соотояла в идентификации недостающих звеньев в цепи переноса влектронов мембран ХГ и предполагала выяснение следующих вопросов:

1. Идентификация природного донора электронов цит.Ъ^^^;

2. Изучение возмокностн функционирования КМБ в цеш перекоса электронов меибран ХГ в качества промеауточного звена на этапе переноса влектронов от цит. Ъ^ к ыДБМ.

Вторая задача настоящего исследования состояла в изучении воздействия 4Д на реакции переноса электронов меаду компонентам электронтранспортной цеш мембран ХГ. Прагра1л.1 исследований э пределах данной задачи включала:

1. Изучение воздействия ФЛ на отдельные этапы переноса электронов;

2. Изучение молекулярных механизмов^ взаимодействия <ЬЛ с

- 6 -

концевой оковдазой цепи - ыДЕМ.

Основные результаты и новизна полученных данных. В процесса поиска природного донора электронов цкт.Ь^ среда компонентов ХГ, в мембранах этих органелл нами С5ыл обнаружен и выделен из них ранее неизвестный Олектроншй переносчик флавопротеидной природа. Разработан метод очистки, позволяющий получать флово-протевд (5>П) в олектрофоретически гомогенном состоянии, исследованы оснозные физико-химические свойства этого белка и сравнены со свойствами соответствущих иитохондриальных к микр<~сомальных аналогов. Показано» что этот белок представляет собой гликопро-теид с молекулярной массой 140кДа, состоящий из двух нековалент-но связанных субъеданвд (53 л Й7кДа) и содерзшщий две молекулы нековаленгно связанного ФАД на одну молекулу белка.

Изучены окислительно-восстановительные свойства И, его до--норно-акцепторше отношения с рядом неприродных и природных окислителей и восстановителей„ в том числе и способность к взаимодействию с цит.Ь5бг Показана возможность переноса электронов от восстановленной фор« к окисленной форме цит.Ь^. Установлено, что процесс взаимодействия Ж с октамерной молекулой 1ШТ.Ь561 специфичен, имеет положительно кооперативный характер со стехиометрией связывания 2:1. Показано, что в отличие от большинства электронных переносчиков флавопротеидной природы, обнарукенный нами белок не обладает ни NADH-, ни 1UDPH:(акцептор) ре дуктазной активностью.

Способность ФП выступать в роли донора электронов цит.Ь^.,. с одной стороны, и отсутствие у него способности к взаимодействии с NADH- или NADPH, с другой, позволяют сделать вывод о том, что in vivo этот белок функционирует в составе цепи переноса влектронов мембран ХГ на учаотке мевду NAJDH: (акцептор)редуктазой и цит.Ь5б1. ~

Изучение донорно-акцепторних отношений цит.Ъ^.,, КМБ и мДБМ показало способность КМБ сопрьхеши функционировать в роли акцептора электронов цитохрома и донора электронов в реакциях, катализируемых ферментом. Показано, что окислительно-воссганови-тельные реакции между КМБ, цит-Ь^ и цЦБМ специфичны, и что процесс взаимодействия мевду КМБ и октамерной молчкулоЯ цитохрома имеет положительно кооперативный - характер со стехиометрией связывания 6:1. Установлено, что окислительно-восстановительные свойства ЮДВ обусловлены наличием в его составе меди.

Результаты этой части экспериментов позволяют сделать вывод о том, что in vivo КЫБ функционирует в составе влектрснтранс-портной цепи мембран ХГ мон.цу цит.Ь^ н мДЕМ.

Следует отметить, что решению поставленной перед нами исследовательской задачи в значительной степени способствовала разработка мягкого метода очистка цит.Ь^^ г позволяющего получать этот белок в его Исходном лшщдном микроокрунешш в виде октамерного липопротеидного комплекса - в состоянии ыекснмально приближенном к его структурной организации in vivo (Apps at al., 1984). Впервые был идентифицирован лншдный состав цитохроыа.

Результаты вкспериментов по изучению влияния &Л на отдельные этапы переноса электронов мекду компонентами електронтранс-портной цепи мембран ХГ позволили установить специфическое моду-лируюцее воздействие ряда Ш на реакции переноса олектронов от цит.Ь^., к КМБ, с одной стороны, и от КМБ к мДЕМ, о другой. Установлено, что одни ©Л действуюг как активаторы, а другие - как ингибиторы по отношению к этим реакциям, что проявляется на уровне повышения или понижения эффективности и изменения кинетических параметров отмеченных реакций.

С учетом того, что in vivo больпшютво из идентифицированных наш ©Л - модуляторов входит в состав лшзэдного шкроокруке-ния ujiT.ti^6l и мДБМ (Saxena, Fleming, 1981; Stweart, Klimrni, 1988). полученные двннне ппляютса свидетельством рогуляторной роди фосфолшхидных компонентов мембран ХГ в функционировании входящей в состав втих мембран цепи переноса электронов.

Изучен процесс комплексообразованця мДШ с индивидуальными биполярными ФЛ, идентифицированными нами как активаторы феодсн-та, а такгге с суммарной фракцией ©Л мембран ХГ. Исследовано влияние ряда факторов, в тои числе рН, ионной силы, степени ассоциации-диссоциации субъединиц фермента, наличия или отсутствия в его составе атомов мода (фермент содержит 4 атома меди на тетра-мер с молекулярной массой 280кДа) на отмеченный процесс. Результаты вкспериментов показали, что процесс ассоциации мДБМ с ФЛ обрати, специфичен и зависит or третичной и четвертичной структуры фермента. Показано, что наиболее эффективно процесс комп-лексообразованил меаду ферментом и ©Л происходит при рН, характерных для физиологических значений рН внугр! ХГ. У' -•аяовлено, что в стабилизации комплекса фермент - фоофолипидная везикулр пр,лимают участие как электростатические, так и гидрофобные

взаимодействия. Проведен такие сравнительный анализ эффективности кошишксообразования мембранной: и растворимой форы да (рДШ), что позволило сделать вывод об участии гидрофобного пептида, входящего в состав мДШ и отсутствующего у рДШ (MoMahon et ai., 1990; Bon et al., 1991; Gibson et al., 1993), в стабилизации комплекса фермент - ФЛ на мембране XT'.

Научно-практическое значение работы. Работа относится к числу фундамзнтальннх последований. В результате этих исследований на ыеыбран ХГ впервые выделен ранее неизвестный влектрон-ный переносчик флавопротвидаой природы; установлены структурная организация втого бэлка и его физиологическая роль,; как компонента цепи переноса елэктроков мембран ХГ, функционирующего на втапе переноса электронов or MDH: (акцептор)редуктазы к цит.Ь^.

Впервые показано, что, ранее обнаруженный в составе мембран ХГ КМБ способен функционировать в составе электроятракспортной цепи втпх органелл в качестве промежуточного звена на втапе переноса електронов от цит.Ь^ к мДБМ.

С другой стороны, выяснение функциональной роли ФП и КМБ позволило идентифицировать недостающие звенья в цепи переноса электронов мембран ХГ.

Результаты настоящего исследования в значительной степени расширяют наш познания о составе и молекулярной организации цепи переноса электронов мембран ХГ, при участил которой осуществляется один из ключевых этапов биосинтеза гормонов катехо-ламиновой природы. Впервые представлены данные, свидетельствукь щие о возможной регуляторной рола фосфолкпидного микроокрукения компонентов влектронтранспортной цепи в отношении как промежуточных реакций переноса електронов, тек и завершающего атапа -. гидроксилирования дофамина. Это открывают возможность целенаправленного поиска путей контролируемых воздействий на процесс биосинтеза гормонов и нейроыедиаторов категоламиновой природы.

Представленные в работе данные способствуют такяе развитию современных представлений о структурно-функциональной организации биологических цепей переноса электронов и секреторных гранул, в целом, а кроме того, являются существенным вкладом в область исследований молекулярных механизмов и основных принципов липид - белковых взаимодействий.

Помимо этого, полученные в настоящей работе данные могут, служить хоросга» ориентире;-! и быть использовакх; при выяснении

структурно-функциональной взаимосвязи и идентификации компонентов электроптрпнспортной цепи нейросекреторшх гранул гипофлэа (полный состав которой до настоящего времени но идентифицирован), где при участии цит.Ь,^ и а-амидазы - фермента, сходного с ДЭЛ по типу катализируемой реакции, протекает конечный этап образования активных форм циклических пептидных гормонов (Russel et al., 1985; Kent, Fleming, 1997).

Данные о молекулярных механизмах воздействия ФЛ па реакции переноса электронов и каталитические свойства ДЕМ, а такзхе комп-лексообразования фермента с фосфолипидными везикулами могут быть использованы в исследованиях по изучению основных принципов, лежащих в основе липид-белковых взаимодействий, а также роли лнпидного микроокружения в функционировании цепей переноса электронов биологических мембран.

По ходу проведения настоящего исследования разработаны эффективные процедуры очистки ряда мембраносвязанных электронных переносчиков и ферментов ХГ; найдены новые методические подходы к постановке экспериментов в модельных системах белок - фосфоли-пидная везикула. Отмеченные разработки могут быть применены в ряде областей экспериментальной биологии.

Полученные данные могут бить включены в соответствуйте разделы преподавания курсов молекулярной биологии, нейрохимии, биохимии, биофизики и эндокринологии.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы и вошедшие в нее материалы были доложены и обсувдены на заседаниях Ученого Совета Института Молекулярной Биологии НАН'РА (Ереван, 1996) и Отделения Биологических Наук НАН РА (1991, Ереван), на ряде Республиканских и Всесоюзных конференций, на Международном съезде,посвященном нейрохимическим аспектам метаболизма фос-фолипидов (Перуджиа, 1988), на XIX съезде. ФЕБС (Рим. '1989), на II Международном конгрессе по Теоретической Органической Химии (Торонто, 1990), на VIII съезде Европейского Нейрохимического Общества (Лейпциг, 1990), на II съезде Азиатского Нейрохимического Общества (Хайдрабад, 1994), на VIII Международной симпозиуме по Биологии Хромаффанных Клеток (Эдинбург, 1995).

Публикации. Основные результаты исследований отрааены в 21 печатных работах.

Обьеы и структура диссертации. Работа излокена на °10 страницах машинописного текста, иллюстрирована- 14 таблицами и 37

рисунками. Построена по монографическому плану и состоят из введения, обзора .литературы, описания методов исследования, двух: глав, содержащих изложение результатов собственных исследований и их обсувдешя, заключения к первой из них, общих выводов и указателя литературы, содержащего 211 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Все вксперяменты проводили In vitro, используя влектрофоре-тическк гомогенные препаратов белков к везикулы, сформированных из индивидуальных и суммарных ФЛ мембран ХГ-.

Выделение ХГ из мозгового слоя свежих надпочечников крупного рогатого скоте проводили методом Hoffman et al. (1976). Чистоту ХГ контролировали електронношкроскопически и определением активности цитохромоксидазы - маркерного фермента мембран митохондрий (Cooperstein et al., 1951). Получение водорастворимой к мембранной фракций проводили суспендированном ХР в 1,5 «М К, Na-фосфэтном буфере, pH 6,0-6,5. содержащем каталазу (2000 ед/мл), в соотношении 1:10 (вес на объем). Суспензию XT подвергали лизису трехкратным заморакиванием-размораживаяием (в хидком F30TQ). Лиза? центрифугировали при 15000g, 60 мин. Надосадочный раствор - водорастворимую фракцию ХГ, использовала для получения рДБМ. Промытый осадок - мембраны ХГ, либо использовали для получения суммарного екстракта М, либо подвергали фракционированию последовательной екотракцией 1 % Nací, затем - 0,1% тритоном Х-100 ("Ferak", Германия), получая фракции, используемые для очистки, соответственно, Ш. циг.Ъ^., и мДБМ, КМБ.

Процедуры очистки рЦБМ. цДШ и КМБ основаны на ранее описанных методах (Бояджян и др., 1981; Poldes et al., 1972; Григорян, 1983). Удельная активность полученных препаратов ДБЫ составляла 17-25рмоль>мин~1*мг~1. Процедуры очистки всех белков, начиная оо стадии получения ХГ проводили при +5°С.

Гомогенность белковых препаратов оцениивали по наличию одной белковой полосы при электрофорезе (ЭФ) в 7,5% полиакрила-мидаом геле (ПААГ). pH 8,9, по методу Davis (1964), используя реактивы и прибор для ЭФ в ПААГ фирмы "Reaml" (Венгрия).

Окисление и воестановление белковых препаратов, получение апоОелков и реконструкция. КМБ и цит-Ь^. восстанавливали 10-кратным молярным избытком аскорбата ("FluKa", Швейцария) и ди-тионкта, соответственно. Окисляли - Ю-кратным молярным избытке«

феррицианида. Sil восстанавливали и окисляли 10-кратннм малярним избытком дитионитя и иетиленового синего ("Sigma", США), соответственно. Шт. t>5 и с ("Flulca", Швейцария) окисляли и восстанавливали инкубацией с Ю-крапшм молярным избытком фэррг- и фэрроцианцдз, соответственно. Инкубацию всех вышеотмечешшх белков с соответствующий окислителями или восстановителями проводили в течении 10 «пл.

Медь из состава И.® ыокно било удадать инкубацией с ехвн-. молярным количеством ЭДГА ("Perak", Германия), 30 ишз. В присутствии 2-кратного молярного избытки CuClg в точении 10 мил происходила полная реконструкция бежа. Апобелок ДЕМ получали диализом против ЭДГА, по ранее описанной процедуре (Scotland -ml LJonen, 1979). Реконструкция фермента происходила в точошга 10 шш-го гагоубирсвшпя с 10-кратнш молярный избытком СиС10.

Во всех случаях избыток окислителя, восстановителя, ЭДТА н/илп СиС12 удаляли гель-фшьтрацкей на сефадексе G-25 ("Pharmacia", Швеция). Зое процедуры проводили при 23°0.

Эффективность окислитолыго-восстоновитольной роакции в случае КОВ оценивалась определением степени окислешюстп мада: в случае тшт.Ь^, ФП, щга.Ь^ и с - по полосе поглощения а впдаыой области оптического спектра, характерней для восстановленной ц окисленной формы соответствующего белка. Контролем оффокгпвност:? процедур получения алайзруы и реконструкции голофорш для ДШ и ЮПЗ являлось огтрддолонг'е ссдер^'^пгп иод::,

Молекулярную массу белков определял:! методами гелъ-фильтращш (Andrews, 1964) и ЭФ в ПААГ, содержащем 0,1,1 Na-DS (Weber and Oßborn, 1969). Препараты балка предварительно шшуби-ровали в присутствии 2% Na-DS ("Fornk", ФРГ) с/без Ъ% /J-моркан-тоэтонолом ("Flulca", Швейцария). 2 часа, при 38°С. Для построо-нпя стандартны! кривых использовали набор.маркеров для калибровки колонок при гель - фильтрации фирмы "Phamaoia" (Швеция) и набор маркеров для калибровка гелей фирмы ."Sigma" (США). Гели денситометраровали на спектрофотометра "Speoord Н-40", снабженной денептометрической приставкой, фгрмы "Zeiss" (Германия).

Определение наличия углеводов в белковых образцах проводили посла препаратов в 7,5$ ПААГ, окрашивая голевые отолби-г ки по методу Zaohariua and Zell (1969).

Содержание меди в препаратах белков к липосом о! юделпет методом üatsuba and Takahaahi (1970), позволяющим определение

концентрацию как одно-, так и двухвалентной меди, и методом PolIon and Dawson (1963). позволяющим определение концентрации одновалентной меди, используя как стандарт раствор CuClj.

Определение концентрации белков и липидов. Общее содорка-ние белка определяли по методу Lowry et al. (1951), используя бычий сывороточный альбумин ("Sigma",США) в качестве стандарта.

Концентрацию ХСБЫ определяли спектрофотомегрнчески, исход* из значения коеф&пцтента поглощения фермента при 280нм (Agg0=12,4) (Scotland and Ljones, 1979).

Расчет молярных концентраций ДSí, КМБ, цит.Ь^, ФП, цит.Ъ- и с проводили с учетом их молекулярных масс, 280, 10, 400, 120 100 и 15 кДа, соответственно.

Концентрации липидов определяли исходя иэ веса сухого ли-пида. При расчете молярных концентраций индивидуальных природных Ш за среднюю молекулярную waocy принимали 0,7кДа.

Качественную и количественную идентификацию проотетической группы ФП и способа ее связывания с белком проводили тремя независимыми методами: спектрофотометричвским в флуоресцентным анализом, тонкослойной хроматографией (ТСХ) (Hiwatashi et al..1976: Paeder and Siegal, 1973; Gorass et al., 1981;). В качестве стандартов использовали раствори ФАД я АМН фирмы "Sigma" (США).

Содержание гама определяли методом BaeXord et al. (1957).

Анализ аминокислотного сотава ФП и цит.Ь^-). При поготовке к общему аминокислотному анализу препараты белков повергали гидролизу 6М HCl в течение 24, 48 и 7£ часов при 110°С в запаянных в потоке азота вакуумных гидролизных ампулах. После лиофилизации гидролизаты растворяли в 0,2М Ка-цитратном буфера, pH 2,2 и проводили оминокислояшЛ анализ на автоматическом анализаторе с одпоколоночной системой "Т-339" фирмы "Microtechna" (Чехословакия) , используя в качестве стандартов дансилированные производима аминокислот фирмы "Serva" (Германия). Содержание остатков триптофана определяли методом Edelhooh (1967), цистеина - количественным определения SH-груш по методу Habeeb (1973).

Определение наличия и качественного соотова липидов в препаратах ФП и цкг,1)^1 проводили ТСХ вкстрактов, полученных после обработки болкоз согласно методу Bllgh и üyer (1959): к 0,5мл белка (1,0 мг/мл) добавляли 2 мл смеси хлороформа с метано, jm в соотношении 1:2, встряхивали 5-Ю мин, а затем добавляли по 1мл хлороформа к О, IM KCl и центрифугировали: в гажшй органической-

Фазе после повторной екстракцки определяли M и нейтральные ли-гшди, ъ суммарной верхней водной фазе - ганглнозидо.

ТСХ проводили на пластинах о силшсагелем типа H (10-40/j) (Signa, CülA), используя для разделения следующие системы растворителей: хлороформ-метанол-уксусная кислота-вода (25s 1514s2) -для ФЛ, петролойный офир -диэтиловмй вфнр -муравышная кислота (60:40:2) - для нейтральных липидов и хлороформ-метанол-2.5М ыл.так (60:5:0) - для ганглиозядов. Пластины окрашивали в парах Йода. В качестве маркеров использовали стандартные смеси соответствующих липидов фирмы "Serva" (Германия).

Экстракцию суммарных ФЛ из мембран ХГ проводили по ранее отмеченному методу BligH and Eyer (1959).

Определение удельной активности ДЕИ, регистрация юшетлк катализируемой ферментом реакции. Активность ДШ определяли методом Kuzuya and Hagatbu (1969), при использовании тирампаа ("Signa", США) в качестве субстрата. Инкубационная смесь в 10 На-ацетатном буфере, pli 6,0 содержала 20 tóí субстрат, 10 мМ донор электронов,, 20 мМ фумарат ( "Pituca". Швейцария), 3500 едшшц каталази ("Serva", Германия) и 2-100 мкг фермента на 1мл инкуба-ционпой смеси. В контуюлышх пробах субстрат добавляли после остановки реакции. Смесь инкубировали при 37°С, ЗОмин, реакцию останавливали добавлением 4н НН^ОН. Смесь центрифугировали и к на-досалочзюП яи.тгкооти добавляли 2 % псрйсдат Ma ("rluia", Шввйца-рия), для окисления образующегося в ходе реакции окситирашша до оксибензвльдегида. Через 5 шш добавляли 10% мета-бисульфит На ("Flnka", Швейцария) для нейтрализации избытка перйодата и регистрировали поглощение оксибензальдегада при 330 нм. Удельную активность виракали в дмолях продукта, образувдегося за 1 млн на 1 иг белкг?. В качестве стандарта использовали раствор окоитирамина ("Piuka", Швейцария).

■ При изучении кинетики образования продуктов реакции пщ-роксилирования, катализируемой ДШ, использовали ишеубационнуи сиесь, содержащую субстрат, донор электронов и фермент в !0 ыМ Na-ацетатном или 20мМ К-фосфатной буфера, pli 6,0. Далее повторяли те же процедуры, что и в случае определения удельной активности, отбирая пробы через каждые 5мин,

Кинетику "окисления аскорбата в процессе реакций гидрокси-лирования тирамина или дофамина ("Sigma", США), регистрировали по уменьшению характерного для аскорбата поглощения при 300 нм

(сЗОСГ420 Ы сы ' по мет°ДУ Sootland and Idónea (1980). Реак-щющшя смесь содержала ДЕМ, субстрат и аскорбат в 20MÍJ К-фосфатном буфере, рН 7,0., Реакции проводили при 23°С.

Кинетику поглощения Og в процессе реакций, катализируемых ДШ, регистрировали при 37° С. Реакционная смесь содержала ДШ, субстрат и донор электронов в 10uM Ка-ацвгатном буфере, рН 6,0. Полярографические измерения проводили с помощью кислородного анализатора "Вdotean" (США), снабженного електродсм Кларка в герметичных термостатируемых монетах.

При регистрации вшеотмечешшх юшетик в качестве контроля использовали шпгубащюннув емось, содар^^дуи (topjcHT, предварительно наактавировашшЯ ногрсвызгем прн 100°С, 10мин.

Прк проведения реакций в присутствии <ЭД ДШ предварительно инкублровалк с нмш 1С:лш при 23°С.

Кинетику окисления шш восстановления цит.Ь^ регистрировали при 23°С по, соответственно,, уменьшению шп! возрастанию интенсивности полоса оптического поглощения с максимумом при 561 нм. Прз! проведении реакций е присутствии лшадоз цитохром прзд-варительно инкубировали о шш 10 ¡да: при 23°С.

WAP(Р)К• (акцептор)редуктавную активность (Ш определяли спектрофотометрически (Tesrlcr.d аий Platmarír» í971) s кепольгуя в качестве акцепторов электровоз ферршдаанвд, мэтиленовий синай, КМБ (окислешагй) и цнт.Ъ^ (окисленный). Метод основан на различии в интенсивности оптического поглощения при 340вы мезду восстановленной и окисленной формами UÁD(P)H {"Signa"0 США).

Липооомы и мицеллы кз индивидуальных и суммарных Ш мембран ХГ получали двумя следущинв методами: 1. Липкд суспендировали в 20 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,0 в соотношении 20 иг ла-пида на 1 мл буф-эра, подвергали ультразвуковой обработке в трубчатом концентратора под током азота в течение 20 мин при частоте 22 кГц и 10°С на приборе "УЗДН-2Т". В отих условиях моно- и ди-фосфатщцшшозитида, а такае siso- формы ©Л образуют мицеллаt в то время как остальные М - мльолвысяляраде липссомы со стоксо-вым радиусом от 80 до 115 А° (Левчук и Воловик, 1983). Для удаления более высокомолекулярных агрегатов смесь центрифугировали 2 часа при 15000g. После центрифугирования надооадочный раствор подвергали гель-фильтрации на колонке с СефарозоЙ 6В ("Pharmacia", Швеция), уравновешенной 20ыМ К-фоофатным буфером и елшровали фосфолипвдные везикулы (ФЛВ) тем s;e буфером. Послед-.

няя процедура позволяет более тонкое фракционирование <МВ по размеру. В дальнейших экспериментах были использованы фракции со стоксовым радиусом 115Л0: 2. Раствор М в хлороформе высушивали под током азота в круглодонной колбе до получения тонкой пленки, после чего суспендировали в 20мМ K-фосфатном буфере встряхиванием 20 мин при 25°С. В этих условиях большинство ФЛ образуют большие мультиламеллярные везикулы (Марголио и Бергельсон, 1986). высокомолекулярные агрегаты отделяли центрифугированием суспензии ЗОмин при 15000g. Индекс Клейна (А^^/А^^) полученных <МВ находился в пределах допустимых значений (Klein, 1970).

Эксперименты по изучению комплекоообразования ДБМ с ЬЛВ методом поляризации флуоресценции. Получение меченных флуоресце-ин изотиоцианатом Целит (ФИТЦ) препаратов ДЕМ проводили в 20 ыМ Н-фосфагном буфера, рН 7»5, по ранее описанной процедуре (Гокра et al., 1906). Избыток ФИТЦ ("Sigma", США) удаляли гель-фильтрацией на сефадексе G-50 ("Pharmacia", Швеция), Концентрация включившейся в соотав ДШ метки, рассчитанная из значения коэффициента молярной экстинкции характерной для ФИТЦ полосы при 490 нм (е490= 66м)Г1см~1), составляла 0,35±0,05 молей на тетра-мер ДБМ. Титрование меченной ФИТЦ ДБМ ®ЛЗ проводили при постоянной концентрации фермента добавлением различных концентраций MB до достижения их существенного избытка. При каздой данной концентрации ФЛ по достижению равновесия измеряли относительную интенсивность флуоресценции (ОИФ), а такке интенсивность флуоресценции (ИФ) вертикально и горизонтально поляризованных компонент излучения при горизонтально и вертикально поляризованном возбукдении. На основании последних рассчитывали анизотропию флуоресценции (АФ), как ранее описано (Лакович, 1986). Измерения проводили при характерных для ФИТЦ длинах волн возбуждения и испускания 470 и 520ны, соответственно. Собственную ОИФ'немечен-ной ДБМ измеряли при длинах волн возбуждения и испускания 280 и ЗЗОнм, соответствешю.

Спектрофотометрические и флуориметрические измерения проводили на спектрофотометрах "Speoord И-40" фирмы "Zeiss" (Германия) и "OJM6"; спектрофлуоримэтрах ,,МРУ-44А" фирмы «Perltin-Elmer" (США) и "Applied Photophysioe SP3" (США), снабженном поляризационной приставкой, в термостатируемых кварцевых и стеклянных кюветах с длиной оптического пути 0,5 и 1см.

Обработку экспериментальных данных проводили с помощью

компьютерной программы "Enzritter", разработанной в Королевском Колледже Науки и Технологии (Лондон, Англия) и "Plot-40" фирмы "Sigma" (США): статистическую обработку - с помощью программы "t-EASE" (Институт Научной Информации, Румыния).

Аминокислотный анализ белков проводили совместно с зав. сектором аналитики НИТИ аминокислот Министерства микробиологической и сельскохозяйственной промышленности СССР Абрамовым Р.Е. Электронноыикроскопичеокий анализ был выполнен совместно со старшим научным сотрудником лабораторш электронной к.лкроскопии Института цитологии РАН Романовым В.И. Измерения поляризации флуоресценции проводились на базе Института Знзимолопш НАН Венгрии, любезно предоставленной в наше распоряжение доктором Йозефом Батке. Использованные в работе электрофоретически гомогенные препараты цит.Ьс были очищены (из мшсросом печени быка) и любезно предоставлены нам старшим научным сотрудником Института Биохимии им. академика Бунятяна НАН РА Симоняном М.А.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ (часть I)

Очистка цит.Ьг;g^ и характеристика полученного препарата. Имеющиеся в литературе метода очистки цит.Ь^ основаны на применении достаточно жестких процедур (Sisland and Platmark, 1974;), в результате чего получают денатурированные препараты цитохрома, лишенные гема. Таким образом, результаты, полученные при изучении структурных особенностей цитохрома Ь^^ in vitro, не могут считаться достаточно надекными. С другой стороны, данные вкспериментов in vivo довольно трудно однозначно интерпретировать без соответствующего подкрепления их результатами, подученными in vitro. Вот почему в литературе нет достаточно ясного представления об истинной четвертичной структуре цитохрома и о числе молекул гема на одну структурную единицу втого белка. Отсутствует информация относительно наличия в-' составе молекулы цитохрома липидов, их качестве^ ого к количественного состава. Кроме того, применение детергентрв на всех этапах очистки приводит к тому, что препарат цитохрома включает в свой состав значительное количество прочно связанных с ним молекул детергента, от которого невозможно избавиться без необратимого нарушения структурной целоотноти цитохрома (Platmark and Cronberg, 1981: Duong and Fleming, 1934). Таким образом, данные, полученные при изуче-.

шш физико-хишгческих свойств этого балка, фактически отражают свойства комплекса детергента с цитогромом. Поскольку и окислительно-восстановительный потенциал влектронного переносчика, и его сродство к тем или иным окислителям и восстановителям в значительной степени зависят от микроокруаения, изучение in vitro каталитических свойств цит.Ь^, его донорно-акцепторних характеристик, а, следовательно, и правильный выбор физиологических доноров и акцепторов электронов при использовании препаратов, полученных в комплексе о детергентшяг, крайне затруднены.

Учитывая вышеизложенное, нами была разработана процедура очистки, даодая возможность получать влектрофоретически гомогенные препараты цитохрома без применения детергентов и других кестких агентов, используемых обычно при очистке этого белка.

Раствор, полученный при вкстрзкции мембран XT 1& NaOl, диализовали и наносили на колошу с ДЭАЭ-целлилозой (2,5 х 26 см), уравновешенной 10мМ К,На-фосфатным буфером (буфер А). Через колонку пропускали по 600 мл вкстракта, промывали ее порцигаш по 200 мл уравновешивающего буфера, содержащего 10, 20, 30, 40, 50, 60 и 100 Ш NaCl. Коричневую фракцию, содержащую цит.Ь^, влш-ровали тем же буфером, содержащим 200 мМ NaCl. Элиат диализовали до конечной концентрации NaOl 10 M?i. Отдиализованшй элюат трех таких колонок объединяли, наносили на небольшую колонку о ДЭАЭ-целлилозой ("Sigma", США), уравновешенной буфером А, и резко плюнрсвелп ypsnnoBSEHbax^iJi буфером, содержащим бООмМ NaCl. Концентрированный елюат далее подвергали гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-75 ("Pharmaoia". Швеция) уравновешенным буфере?.! А, содержащим 200 м>! МаС1. Фракцию, выходящую в свободном объеме, вновь диализовали до конечной концентрации NaCl в среде 10 Ш и концентрировали на небольшой колонке с ДЭАЭ-цоллюлозой. Концентрированный елюат подвергали гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-200 ("Pharmaoia", Швеция), уравновешенным 200 мМ NaCl в буфере А. При повторной гель-фильтрации на колош<е о сефадексом G-200 фракция цит.Ь^1 элшровалась в виде одиночного пика; препарат обнаруживает также одну белковую полосу при ЭФ- в ПААГ. Выход цитохрома составляет 43 мг из 150 г пасты ХГ.

Выход цит.Ь^^ на всех стадиях очистки контролировали как визульно, по специфической коричневой окраска, так и спектрофо-тометрически, по характерному для втого белка спектру поглощения в видимой области при 427, 530 и 5б1ны (восстановленная форма).

- 18 -

Параметры спектров оптического поглощения полученных нами препаратов miT.b^g^, его аминокислотный состав, а также значение минимальной молекулярной массы (ЗОкДа) соответствуют представленным в литературе (Sicland and Platinarle, 1974; Duong and Fleming, 1982; Ferln et al., 1988].

Молекулярная масса белка по данным гель-фильтрации составляла приблизительно 400 кДа. Количественный анализ липидов в препаратах цит.Ь^б1 показал, что'на молекулярную массу 400 кДа приходится 200 молекул липидов. Учитывая вти данные, а также значение минимальной молекулярной массы цитохрома, мы рассчитали, что в состав полученного нами лкпопротеидного комплекса входит 8 белковых субъединиц. Поскольку анализ на содержание гема показал, что на молекулярчую массу 400 кДа приходится около 6 молокул гема, мы пришли к выводу, что часть субъедшшц в комплексе лишена гема. Это может быть либо следствием потери его в процессе очистки, либо отражает исходное состояние цитохрома in vivo. Последнее предположение находится в соответствии с данными Аррз et al. (1984), согласно которым в составе мембран ХГ часть молекул цит.Ь^ мокет находиться в виде апобелка.

Нами впервые идентифицирован липидный состав цнт-Ь^. Согласно анализу липидов, в состав вдт.Ъ^^ входят ФЛ - фоофати-дилхолин (ФХ), фосфатидилвтаноламин (ФЭ) и нейтральные липиды -1,2-, 1,3-диацилглицерида, триацилглицериды.

Разработанный метод очистки цит.Ь^ позволяет получать этот белок в водно-солевых растворах в нативном липидном микро-окрукении в виде липопротеидного агрегата. Очевидно, что структурные и каталитические свойства таких препаратов цитохрома, должны более соответствовать его свойствам in situ, чем препаратов, полученных в комплексе с детергентами.

Очистка ФП. В процессе направленного поиска природного донора электронов цит.в мембранах ХГ нами был обнаружен ранее неизвестный белок флавопротеидной природы. Разработан метод очистки, позволяющий полу 'С-ше с тектрофоретичеокл гомогенных препаратов этого белка.

Начальные стадии очистки ФП идентичны используемым в случае цит.Ь^^1 до стадии лоннообменной хроматографии. После промывки колонки ДЭАЭ-целлюлозы с адсорбированным экстрактом мембран ХГ 60 мМ NaCl в буфере А, желтую фракч-ш, содержащую £Л, олкагровали 1С0 Ш Nací в том же буфере и диа.икюьали ее до дос-.

Т1ШС1ШЯ конечной концентрации NaCl 10мМ. Объединенный елюат трех колонок концентрировали на небольпой колото с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной буфером А, елшруя 600 tdi NaCl В буфера и подвергали гель-Фильтрации па колонке с сефадексом G-50. уравновешенным 200 мМ NaCl в буфере А. Фракции, выходящую в свободном объеме, вновь давлизовали до конечной концентрации NaCl 10мМ, концентрировали на небольшой колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной буфером А, элюировали 600м!! NaCl в буфере А и подвергали гель-фильтрации на колонке о сефадексом G-100, уравновешенным 200мМ NaCl в буфере А. Повторная гель-фильтрация полученной фракции, содержащей ФП, на колонке с сефадексом G-100 приводила к элюции ®1 в виде одиночного пика: полученпая фракция обнаруживала одну белковую полосу при ЭФ в 7,53 ПААГ. Описанная процедура очистки позволяет получить 23 иг <Щ из 150 г пасты ХГ.

Выход на всех стадиях очистки контролировали как визуально, по специфической аалтой окраске, так и спектрофотометрн-чески, регистрируя характерный для итого белка спектр поглощения в видимой области при 360, 410 и 445нм (окисленная форма).

Изучение физико-химических свойств ФП. В таблице 1 основные физико-химичемше свойства 01 сравнены со свойствами ряда электронных переносчиков флавопротеидной природы.

Согласно получешшм данный, обнаруженный нами Sil представляет собой гликопротеид. Качественна яналнэ липцев в окОтрак-тах ФП показал отсутствие в молекула белка ФЛ, нейтральных липидов и ганглиозидов. Молекулярная масса ФП по данным гель-фильтрации составляет 123 кДа. При ЭФ в ПААГ в присутствии 0.1S Na-DS препараты ФП, обработанные 2% Na-DS, мигрируют в виде двух полос, подвижность которых соответствует молекулярным массам 53 и 87 кДа. Таким образом, в состав молекулы белка входят две нековалентно связанные оубьедшшцы. Ыолекулярная масса <Ш, определенная при суммировании молекулярных маос оубьедипиц, составляет 140 кДа. При ЭФ препаратов <Ш, обработанных 2% tJa-DS и Ъ% 0-меркаптовтанолом, подвижность более высокомолекулярной оубъединицы возрастает, соответствуя молекулярной массе 76 кДа. Мы предполохадш, что либо данная субъединица включает в свой состав небольшой полипептидный фрагмент, который невозможно идентифицировать при окраске гелей, связанный о остальной частью молекулы дисульфидам мостиком, либо вследствие расщепления внутрицепочечных дисульфидных связей происходит уменьшена сток-

Таблица i

ФПХГ NADH- NADH- NADPH: NADH:

редухтаза дегидрогеназа цитохром цитохром b5

мембран ХГ митохондрий P-4S0 редуктаза шкросом рэдуктаза микросом

Молекулярная масса, кДа 115-140 105 70 78 43

Число субъединиц 2 1 1 1 1

Молекулярная масса су&ьединиц.

кДа 87; 53 55 70 78 43

Простетичесхая группа 2 ФАД не установлена 1 ФМН 1ФАД- 1ФМН 1ФАД

Наличие угл^чодов + не установлено не установлено + —

Основные максимумы поглощения в 360 .не иденти- 370 340 3S0

видимой области оптического спектра 445 фицированы 450 450 461

■окисленной формы), им 410 476 476 4S0

Природный донор электронов не установлен NADH NADH NADPH NADPH

1 ;,;ирпдньш акцептор электронов цитохром ЬЖ1 не установлен Fe-S белок цитохром Р-450 цитохром b5

Связь с мембраной периферический интегральный интегральный интегральный интегральный

Литература настоящая Zaremba, Singer et al., Kre¡.;->is et al., Василии и

работа Hoque- Angeletíi, 1982 1971 1981 др., 1988

Сравнение основных физико-химических параметров ряда электронных переносчиков флавопротеидной природы

совокого радиуса а тс л субъедишщы. Значение молекулярной массы ФП, рассчитанное на основании дагашх аминокислотного анализа, с учетом наличия двух молекул ФАЯ на молекулу белка (см. далоо), составляет 115 кДа. Taiani образом, данные по определенна молекулярной массы Sil тремя независимыми методами находятся в хорошем соответствии. Более низкое зпачепие молекулярной массы, рассчитанное исходя из аминокислотного анализа, по сравнению с данными двух других методов, мокно объяснить наличием в молекуле белка углеводов. Согласно данным аминокислотного анализа 27% молекулы ФП составляют кислые аминокислоты, 35$ - гидрофобные.

Гель-фильтрация препаратов ОТ, обработанных 3 мМ ЗДТД при 100°С в течение 3 мин, приводила к отделению характерной для флавшха аолтой фракции от белковой части молекулы. ТСХ показала, что отмеченная фракция представляет собой ФАД. Эти дащшо подтвердились при сравнении спектров оптического поглощении полученной фракции в УФ и видимой области со спектрами стандартных растворов ФАД и ®Ш. Таким образом, простатической группой ФП является нековалентно связанный с ним ФАД. Содержание ФАД в препаратах MI, рассчитанное с учетом исходной концентрации белка и ФАД *с450 = (Г1см~1), составляло 2 молекулы на одну молекулу

ФП. Аналогичные данные получены при использовании метода флуоресцентного анализа, позволяющего осуществить как качественную, так и количественную идентификацию нековалентно связанного г белкой флавила.

Основные максимумы поглощения окисленной форищ ífl в видимой области оптического спектра приходятся на 360 и 445 им, имеется плечо при 410 hmj препараты имеют гшлтую окраску. Восстановленный ФП бесцветен. При восстановлении, как ото характерно для всех ФП, интенсивность поглощения в видимой области оптического спектра белка попихается, характерные максимумы исчезают. На рис.1 представлены спектр« поглощения окисленной и восстановленной форм ФП в УФ и видимой областях оптического спектра.

Из представленных в таблице 1 данных следует, что обнару-аенный нами в ХГ ФП по своим физико-химическим свойствам не •соответствует ш NADH:(акцептор)редуктазе ХГ, ни переносчикам электронов флавопротеидной природы мнкросом и митохондрий.

Изучение окислительно-восстановительных свойств <Ы1. В таблице 2 представлены результаты экспериментов по изучению донор-но-акцепторных отношений ФП. Как следует из приведенных дшшых,

ам

0,35

0,30 0,25

0,20

0,15 0,10

0,05 -

0,00

ч 360 445 410

I

Г'ОО 350 400 500 600 Донна волны, нм

Рис.1. Спектри оптического поглочаная окнслвкпой (1,2) и восстановленной (3) форша СП (3,5 нг/нл) в шадшой в У© облаете.

А

1.0 Т 427нму

0,8 /

0,6 - /

0,4 Г 445нм

0,2 х-:-г 2 -^^Л I

0,0 Ь-1-*>

Бремя, ыин

Рис.2. Взаимодействие восстановленной форыи ФП с окисленной формой шрг.ь561. 1.3 - восстановление цит.Ь^; 2 - окисление ФП. Концентрация цит.Ъ^., составляла 1,3 мг/мл (1,3) и 6 мг/мл (2); ФП - 1,9 мг/мл (1,3) и 3.9 мг/мл (2). Кинетики регистрировали в ЮмМ К. N<1- фосфатном буфере, рН 7,5 при 23°С. Т - (*о): п - 15.

в числа ноприрошшх восстановителей и окислителей эффективными оказались да тиши г и метилегговыя синий, соответственно. ФП окислялся таюко молекулярным кислородом: инкубация восстановлешюго белка в течение 24 часов при комнатной температуре в аэробных условиях приводила к его полному окислению.

В числе природных окислителей ФП нами был идентифицирован цит.Ь^.,. На рис. 2 представлена кинетика окислительно-восстановительных процессов в смеси ФП и цит.Ъ^^^. Добавление окисленных препаратов цит.Ъ,^ к восстановленным препаратам ФП приводило к возрастанию интенсивности оптического поглощения при 561 и 427 им, свидетельствующее о восстановлении цитохрома. Синхронно возрастала интенсивность оптического поглощения при 445 пм, что свидетельствует об окислении ФП. Добавление окиолонных препаратов цитохрома с либо Ъ^ к восстановленным препаратам Cil но приводило к окислению последнего, что свидетельствует о специфичности процесса взаимодействия ФП с цит.ЪкС1.

Таблица 2.

"ШИТ

..........Феррицианид............

Цетиленовый сшшй

К?®,.......ощслещшй.

ДШ, окисленная

цит.Ц

561 '

окисленный

цнт. с, окиелетшЯ

цит. Ь^, окисленный

ШШ

ТЙССМНйЫИИЙ»

..................Ферроциапид

........................ДИОТОШМ........

......КЫБ,. восстановленный.....

ДИЛ, ..восстмовленная циг.^,восстановленный

цдт.с. восстановленный

, восстшк

Адренал1Ш

цит. Ь^, восстановленный

.................Корадренвлин

........................Дофашш............

..................НАШ,......NADPIf

Аскорбаг Глутатион

ЭФФЕКТ

Воздействие окислителей и восстановителей на ФП из ХГ.

На рис. 3. показаны теоретические кривые, описываицие зависимость У0 окисления ФП от концентрации цит.Ь^^ (а) и зависимость 70 восстановления цит.Ъ^ от концентрации <И1 (б).

Зависимость У0 окисления ФП от концентрации цит.Ь^^ апи-сывалась обычной кинетикой Ыихавлиса-Нвнтен. При отсч V, 39 (±4,0) дМ/мин, к4 = 4,6 (¿0,5) уИ (И±л\ п=2).

шах

цм7.ь5б1 (а) и Уо восстановления цит.Ь561 (3(¡и) о? концентрации «п (О) в координатах Михаэлвса-Ментен и Холла, соответственно.

Условия эксперимента указаны в подписи к рис.2.

- 25 -

Экспериментальные точки, полученные при изучении зависимости V0 вооотановления цитохрома от концентрации <ffl, хорошо описывались уравнением Хилла. При атом УЮ1 «= 3,5 (±0,4) p'4/тн, kd = 13 (±1,5) ДО, Н = 2 (±0,2) п=2).

Попытки описания втих точек уравнением ' Михаелиса-Ментен, предполагающего наличие одного центра связывания лиганда, или уравнением, используемым в том случае, когда два центра связывания лиганда действуют независимо, оказались безуспешными Иными словами, в составе одной октаыерой молекулы цит.Ь^ имеется два, находящихся в положительно кооперативном взаимодействии, центра связывания ФП.

Поиск природного восстановителя СП среди компонентов XT, а такзе ряда других природных соединений, обладающих высокой восстановительной активностью, не увенчался успехом. В отличие от большинства электронных переносчиков флавопротендной природы, обнаруженный нами 5Í1 не обладал ни NADH- ни HADPH:(акцептор) редуктазной активностью: окисления 1Ш(Р)Н препаратами СП не происходило ни в отсутствии, ни в присутствии его (ФП) акцепторов электронов (метиленового синего, окисленной формы цит.Ь^).

Наличие у обнаруженного нами ФП способности окисляться 4HT.b^g1 и при этом отсутствие у него способности к восстановлению при взаимодействие с NADH, свидетельствует о тем, что этот белок может in vivo функционировать в составе цепи переноса электронов мембран ХГ на участке между NADH:(окцептор)редуктазой и цит.Ь^. Однако, результаты наши экспериментов не позволяют дать прямого ответа на вопрос, является ли МВД:(акцептор)ре-дуктаза непосредственным донором электронов <И1, или этот перенос опосредован еще одним электронным переносчиком.

• Изучение взаимодействия КМВ о цит.Ь^ и цДБМ. Эксперименты ряда исследователей, с одной стороны, свидетельствовали о возможности переноса электронов от цит.Ь^ к цДЕЫ, а о другой, исключали прямой перенос электронов ыеаду ними (Wakefield et al., 1986; Winkler et al., 1986). На основании втих данных был оделан вывод о наличии промежуточных переносчиков электронов, функционирующих в составе цепи переноса электронов мембран ХГ между цит.Ь^ и мДШ. В представленных ниже експериментах по изучению донорно-акцепторных отношений цит.Ь^, КЫБ и мДШ мы исследовали возможность функционировашм КМБ как промежуточного зврна на стадии переноса электронов от цит.Ь(^^1 к цЦШ.

Концентрация НМВ, мМ

Рис.4. Взаимодействие восстановленной форш с окислен-

ной формой КМЕ. а - кинетика окисления цит.Ь^ (4ДМ) в присутствии КМБ (0,24мМ); б - зависимость У0окисления цит.Ъ^., (40114) от концентрации КМВ в координатах Хилла. Регистрацию проводили в 10мМ К.На-фосфатном буфере, рН 7,5 при 23°С.

- 27 -

ИМБ. как акцептор влектронов unr.bgg1. Инкубация восстановленных препаратов цит.Ь^ о окисленными препаратами КМБ приводила к окислению первого и восстановлению последнего. На рис.4 показана кинетика этого процесоа (а) и зависимость V0 окисления цитохрома от концентрации КМБ (б). Экспериментальные точки на рнс.4.6 хорошо описывались уравнением Хилла о k^ = 1,85 (±0,20)мМ, 7ШХ = 5,7(±0,6)/Ш/иин, Н = б,00±0,55 (*Ы!п=2).

Таким образом, процесс взаимодействия КМБ - цат.Ь^1 имеет положительно кооперативный характер, при втом одна октамерная молекулы цитохрома содержит б центров способных к взаимодействию с КМБ. Последнее находится в хорошем соответствии о соотношением влектрондонорных групп НЫВ и цитохрома - 1:6 и свидетельствует о том , что каждый из шести гемов, входящих в состав октамерной молекулы цит.Ъ5£1, способен к взаимодействию 4 медью активного центра КМБ.

Окисление цит.Ь,^ не наблюдалось в присутствии ни восстановленных препаратов КМБ, ни его апо-форыы. Добавление восстановленных препаратов циг.с или Ь^ к окисленным препаратам КМБ не приводило к восстановлении последнего. Соответственно не наблюдалось окисление отмеченных цитохромов, что свидетельствует о специфичности окислительно-восстановительных процессов между КМБ и цит.Ь561.

Представлении« денные свидетельствуют, что КмБ способен выполнять роль непосредственного акцептора электронов цит-Ь^.

КМБ как донор электронов ИДЕМ. Инкубация ыДБЫ с тирамином в присутствии восстановленных препаратов КМБ приводила к образованию соответствующего продукта гидроксилирования - окоитирами-на. В присутствии окисленных препаратов КМБ или его апо-формы образование окситирамина не наблюдалось. Поскольку реакции, катализируемые ДШ, протекают лишь при наличии в среде внешнего донора влектронов (фермент является гидроксилазой со смешанными функциями) (Skotland and LjJones, 1979), результаты вышеотмечен-ных экспериментов однозначно свидетельствуют о способности КМБ функционировать в роли донора влектронов мДШ в процессе катализируемой ферментом реакции.

В целях оценки еффективносги и специфичности КМБ, как донора влектронов мДБМ, для сравнения, были использованы наиболее еффективные доноры влектронов фермента in vitro - ферроцианид и аскорбат (Skotland and Ljones, 1979} Stewart and Kliman, 19S8).

- 28 -

На рис.5 кинетика образования оксигирадана (а) и поглощения 02 (б) сравниваются в реакциях, катализируемых ДБМ, в присутствии трех доноров влектронов - КЫБ, аскорбата и ферроциани-да. Из представленных данных очевидно, что как образование продукта так и поглощение 0^ 'наиболее аффективно протекает в присутствии КМВ. В таблице 3 сравнены кинетические параметры реакции гидроксилирования тираюша, катализируемой мДБМ, определенный о помощью преобразований Дайнуивера-Берка, при исследовании зависимостей У0 поглощения 02 в етой реакции от концентрации трех использованных доноров влектронов и субстрата. Аналогичные данные были получены при использовании в качестве субстрата дофамина. Согласно полученным данным, V поглощения 0,, в ходе

шал с.

реакции гидроксилирования тирамина или дофамина в присутствии КМБ приблизительно в 1,5 и 2,0 раза выие, чем в присутствии аскорбата и форроцианида, соответственно. Кроме того, КМБ обладает большим сродством к ферменту, чем два других донора влектронов. При втом для реакции, катализируемой в присутствии КМБ, К^ меньше, чем для реакции в присутствии ферроцианида или аскорбата. Все ето говорит о том, что КЫБ является более аффективным донором влектронов в реакции гидроксилирования, катализируемой цДБМ, чем аокорбат или ферроцианвд и свидетельствует о специфичности окислительно-востановительной реакции мевду КМБ и ферментом.

Таблица 3.

Донор влектронов ^ донора влектронов, мМ (И t Л) щах поглощения ДМ/мин с (* ± л) кд, тирамина, Ш (М ± л)

КЫБ 0,41 ± 0,04 0,51±0,05 0,1? ± 0,01

аскорбат 0,50 + 0,05 0,33±0,04 0,21 ± 0,02

ферроцианвд 0,63 ± 0.06 0,23±0.02 0.37 ± 0.04

п=2

Кинетические параметры реакции гидроксилирования тирамина в присутствии КМБ аакорба'.а и ферроцианида.

Реконструкция частиалектронтранопортной цепи. включающей шгг.Ь^ 1Л ШБ и цДШ. В следующей серии екслерииентов изучение донорно-акцепторных отношений цит.Ь^, КМБ и мДЕМ проводила при использовании систем, включающей одаовромошо вое три белка.

Результаты экспериментов показали, что в ;гр-,!сутствии воо-

Вют

Рио.5. Ктагзха обрагсзгпкя оксзтпргншга <а) я погяозапшз 02 (б) з рэсыда гпдроксшагрсзааая терпдяа, каталгакруеиоа мдш, в пргсутстает КМБ (1>, аскорбата (2) я ©эррсцяггзда (3). Реакционная смесь в 10мМ Ла-ацетагном буфере, рН 6,0 оодеряала: (я) -2к?«1 мДБМ, 0,2рМ тирамии и соответствущиЯ донор влектроноа; (б) - 2ДМ иДБМ, 0,2мМ тирамин и оответегауюгай донор электронов. Т - 15! и » 9.

отановлешюй формы цит.Ъ^., и окисленной формы КМБ, мДБМ эффективно катализирует реакцию пидоокснлирования. В отоутотвии КМБ или при замене цитохроме» окисленной формой реакция гидроксилиро-вания не катализировалась.

Рио.6. Образование окситнрамина в реакции гвдроксилирования

тирашша. катализируемой мДШ. а - в присутствии восстановленной формы цнт.Ь^ и окисленной формы КМВ; б - в присутствии восстановленной формы КМБ. Реакционная смесь в 10мЫ Ыа-ацетатном буфере» рН 6,0 содержала: ЗнМ иДЕМ, О.ЗМУ тирамин и следукщив концентрации цитохрома и КМВ: (■-■) - 0,1дЫ цит.Ь^, о.бДМ КМБ; (•-•) - 0.1ДМ цит.Ъ5б1, 12нМ КЫБ; (о-о) - 2нМ цит.Ь5б1, 12нМ КМБ; (х-х) - 2нМ цит.Ь66г О.бдМ КМБ', (о-о) - 0,6ЦМ КМБ; -

12нМ КЫБ. Т - ы; п = 15.

На рис.6.а показана кинетика образования окситнрамина в реакции гадроксилировакия тирамина, катализируемой мДЕМ. Сравниваются реакции, проводимые в присутствии различных соотношений восстановленной формы цит.Ь^ и окисленной формы КМБ, при насыщающей конц&нтрашш субстрата. В этих условиях эффективность реакции зависит только от концентрации цитохрома и не зависит от

концентрации КМБ. Так, если цитохром взят в молярном избытке (по числу влектрондонорных групп) по отношению к мДШ, независимо от того, находятся4ли мДБМ и КМБ в вквимолярных соотношениях (о-в), или последний взят в избытке по отношению к ферменту (в-я), еф-фективность реакций практически одинакова. При вквимолярных соотношениях цитохрома и мДБМ, независимо от того, находятся ли иЩЭЛ и КМБ в вквимолярных соотношениях (а-а), или последний взят в избытке по отношению к ферменту (х-х), гидроксилирование тира-мина на наблюдалось. ■

Для сравнения на рис.6.б показаны такае кинетические кривые образования оксктирашша в реакции гидроксшпгровшшя тирамина, катализируемой мДШ, полученные в отутствии шт.Ь^.,, при использовании восстановленных препаратов ГО1Б (двухкомпонентная система). Концентрации субстрата и мДШ те ке, что и на рис.6.а. Как видно из представленных данных, когда КМБ взят в избытке по отношению к ыДШ (о-о), эффективность реакции практически та ке, что и в случае использования трехкомпонентных систем с избытком цитохрома (о- а; п-а). При вквимолярных соотношениях KííB и мДБМ гидроксилирование тирамина не наблюдалось.

На рис 7.а показана зависимость VQ поглощения Og в реакшш гидроксилирования тирамина от концентрации дат.Ь^ (восстановленная форма), при оквимолярных соотношениях мекду КЕМ (окисленная фсриа) ;í нДЕм, в координатах михаэлиса-Ыентен (А) и Лайнуи-вера-Берка (Б). Для сравнения на рис.7-О показана зависимость VQ поглощения 02 от концентрации КМБ в двухкошонентной система (восстановленный КМБ - мДБМ), выраженная в тех аэ координатах, что н на рис.7.а. Отношение величин кд, полученных при варьировании концентраций КМВ и цит.Ь^, и определенных из соответст-вуицих графиков, составляет 6:1 (0,409 (±0,022)мМ, (MtA', п=2), для КМБ и 0,073 (±0,005)мМ (М±л; п=2) для цит.Ь5б1). Этот факт, с одной отороны, является хорошим подтверждением ранее установленной нами стехиометрии взаимодействия КМБ - цит.Ь^, а с другой стороны, свидетельствует об идентичности насыщающих концентраций втих доноров электронов для реакций, катализируемых мЛЕМ.

На рис.8.а сравнены кинетики окисления восстановленной формы цит.Ьс£1 в реакции гидроксилирования тирамина или дофамина, катализируемой мДБМ, в присутствии окисленной формы КМБ. На рис.8.б - кинетика окисления цитохрома, полученная при использовании двухкомпоненглой системы (восстановленный uhtoipom - окис-

ю «

1.00

2.00

3.04

4.00

[цит.Ь6б11, Ы

10-

[кмб], м

Рио.7. Зависимость Уо поглоцешгя Оа в реакции гадроксшшрования тнрашшя, каталиамрувжй ыДВ4. от концентрации цит.Ьеб1 (а) в КЫБ (0) в трех- а даухкоипонентной система, соответственно, в координатах Михазлнса-Ывктвн (А) н Лабнушера-Бврка (В). Реакционная смесь в 10»А1 Ла-ацегатнсы буфере, рН 6,0 содержала: а -2{М цДБЫ, 8иЫ КМБ, 0,2мМ тирамин и указанные на графике концентрации цит.об61; б - 2(Ш мДБМ, 0,2иМ тирамин и указанные на графике концентрации КМВ.

ленный КМБ). В обоих случаях концентрации КМБ и цит.Ь^ одинаковы, и последний взят в избытка по отношению к первому. Сопоставление данных, представленных на рис. 8.а о данными рис.8.б наиболее наглядно демонстрирует функциональную взаимосвязь компонентов реконструированной системы и последовательность переноса электронов от цит.Ь^ к КМБ и к мДЕМ, сопряженного е гадрок-силированием тирашша или дофамина: в первом случае за процессом восстановления КМБ под действием цитохроиа следует окисление первого под действием ыДБМ, окисленный КМБ вновь ыоавт взаимодействовать с взятым в избытке цитохромом; во втором - перенос электронов ограпзгчьи лить стехиомбтрическиы восстановлением КМВ. Повтому, к тому Еремвни, когда процесс окисления цитохроиа для цвухкошонентноЯ системы достигает насыдения (рис.Э.б), в случяо грехкошонентной системы (рис.8.а) он еща продолжает нарастать. •

^561

0,14

0,09

0,04

10

15

0,14

0,04

Время, шн

10 15

Рис.8. Окисланнз восстановленной форцц цнт.ь561. а - в реакции гидроксилировяния тирамина (1) и дофамина (2), катализируемой мДБМ, в присутствии окисленной формы КМБ; б - в двухкомпоноит-иой системе: восстановленный цит.Ъ^^ - окисленный КМБ. Реакционная смесь в 10мМ К.Иа-фосфатном буфере, рН 7.0 содержала: (а) - 4ДМ ЦИТ.Ь561. 0.48ДМ КМБ. 0,12ДМ цДШ, 12ДМ тирамин или Чофамин; (б) - 4¡Л! цит.Ь5б1. 0.49ДМ КМБ.

- 34 -

Таким образом, результаты по изучению донорно-акцепторных отношений цит.Ь^, КМБ и мДШ как в двух-, так и в трехкомпо-пентноЯ системах, полученные рядом независимых методов, позволяют сделать вывод о возможности функционирования КЫБ в цепи переноса влектронов мембран ХГ в качестве промежуточного звеяа на стадии переноса электронов от цит.Ь^ к мДБЫ.

Поскольку апофориа КМБ не оказалась способной ни пригашать олектроны от цит-Ь^, ни передавать их мДШ, мы пришли к выводу, что окислительно-восстановительные свойства КМБ обусловлены наличием в его молекуле меди.

Как было отмечено ранее, низкомолекулярные медьсодержащие переносчики электронов широко распостраневд в составе цепей переноса влектронов растений и микроорганизмов. Однако, КМБ является первым из отмеченного типа белков, обнаруженным у кивотных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ К ЧАСТИ I

Результаты первой части настоящего исследования в значительной степени расширяют современные представления о составе и молекулярной организации цепи переноса електронов мембран ХГ, структуре и последовательности функционирования ее компонентов.

На основании полученных нами д&шшх, с учетом предыдущих исследований в данной области, структурно-функциональная взаимосвязь компонентов цепи переноса електронов мембран ХГ мокег быть представлена следующим образом:

NADH ->Ш)Н:(акцептор)редуктаза -><Ш ->цит.Ь5б1 ->КИБ ->мДБМ

Как было отмечено ранее, некоторые из характерных для одэктронтранспортвой цепи мембран ХГ электронных переносчиков, были также обнаружены и" в других сокреторных гранулах. Так, цпт.Ь^1 и NADH:(акцептор)редуктаза входят в состав мембран ней-росекреторных гранул передней доли гипофиза и, как предполагают, участвуют в функционировании влектронтранспортной цепи, постав-лямдой восстановительные эквиваленты ферменту а-амидазе, камали-зируицей последний втал биосннгеэа циклических пептидных гормонов - амидирование концевой карбоксильной группы пептида (Russe! et al., 1985i Kent and. Fleming, 1987). шт.Ь^, и NADH: (акцеп-тор)радуктаза обнаружены такие и в нейросекреторных гранулах окончаний адренергнческих нейронов центральной и симпатической

нервных систем, где, как п в ХГ, при участие ДБМ протекает конечный втап биосинтеза норадреналина - нейромедиатора здренергл-ческих нейронов (И1пк1ег et а1., 1986; ЗйнгаггепЬгиппег а1., 1990). Остальные ксыпснонгы влактронтранспортяых цепей нейросек-роторных гранул до настоящего времени не идентифицированы.

Результаты, представленные в настоящем исследовании, дают полное основание предполагать, что структурно-функциональная организация электронтранспортных цепей нейросекреторных гранул может быть аналогична электронтранспортной цепи ХГ. В этом аспекте интересно, «то белок, сходный по своим физико-химическим свойствам с КМБ, был обнаружен такие и в тканях мозга (БЬагоуад ег а1., 1977: Саерагот еЪ а1., 1979). Хотя до настоящего времени не удалось установить в каких структурах и органеллах мозговой ткани содержится этот белок, результаты настоящего исследования позволяют рассматривать ого как возионный компонент электронтранспортных цепей нейросекреторных гранул.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛВДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ (часть II)

Влияние М на перенос электронов меаду компонентами электронтранспортной цепи мембран ХГ. Как было ранее отмечено, ®Л игран? существенную структурно-функциональную и регуляторную роль в функционировании цепей переноса электронов, входяизи в состав биологических мембран. Учитывая вышеизложенное, наш была проведена серия экспериментов по изучению возможного участия фосфоли-ггадаых компонентов мембран ХГ, таких как СО, лФЭ, фосфатидалхо-лш(ФХ), лизофосфатидалхолин (лФХ), фосфатиднлсерин (ФС), фосфа-тидная кислота (ЗК), ыоно- и дифосфатидилинозитиды, в реакциях переноса электронов. В результате этих экспериментов было установлено, что некоторые ФЛ оказывают или активирующее, или/и ин-гибируюцее влияние на отмеченные реакции на ствдиях переноса электронов от цит.Ь^ к КМБ и от КМБ к цДБМ. Какого либо существенного воздействия ФЛ на реакцию переноса электронов от ФП к ццт.Ь^ нами не обнаружено.

В качестве источника ФЛ в этих экспериментах использовали ФЛВ со стоксовым радиусом 115А°, (мицеллы и ионоламелллрные ли-посомы), сформированные из отмеченных индивидуальных ФЛ.

Воздействие на реакцию переноса влвкт^»ноа.от„.щге.^Ьдб1 к„КМВ. Как показали проведенные эксперименты, ФЗ и лТО активиро-

вали, а ФК и СС ингиАировали перанос электронов от цит.Ь^^ к 1МЗ. Остальные ФЛ но оказывали существенного воздействия на эту реакцию. На рис. 9 показано влияние ФЭ, л 10, ФК и ФС на реакции переносы олектродов от цит.Ь^£1 к КМБ.

В таблица 4 приведет константы ингибировашя для ФС и ИС, рооочитадные на основе преобразований Диксона, а такае сравнены кинетические параметры реакции переноса электронов от цитохроыа к КМБ а присутствии всех <ЪЛ, обладавдих модулирующим воздействием на эту реакцию. Как видно из представленных данных, в присутствии ФС и ФК происходит понижение, а в присутствии ФЭ и лФЭ

- повышение V„„„ окисления цитохроыа.

UkiJ»

Таблица 4.

Липид Эффект kd, ми H

_ 1,85 6 ................5,7.........

......ею... активация...... .......1,8.5...... .............11,6.......

лФО .....активация...... ..... 6 ............3.7.1.5________

ФС ингибировакие 1,85 6 0,16

¡^ = О.ЗЗиМ

ФК ингибирование 1,85 6 0,08

^ = 1,77иЫ

п = 4; кооффициент вариабельности не превышает 1515 Кинетические параметры реакции окисления ыит-bggj КМБ в присутствии ФЛ.

ВоздеАстеие <ЬЛ на реакццю переноса электронов......от КМБ.....к

мДШ. На рис. 10 показано влияние ОМ на реакцию гидроксилирова-ш1я тирамша, катализируемую мДШ, при использовашш в качества донора электронов восстановленной формы КМБ. Как следует из представленных данных, ФХ и лФХ повышают, а 30, ФС'и ФК поникают оффектшшосгь реакции. Остальные из исследуемых ФЛ не оказывали существенного влияния на отмеченную реакцию. Аналогичные результаты были получены при регистрации в тех se условиях кштатик поглощения 02 для двух субстратов мДШ - гирашша и дофамина.

Таким ооразоц, полученные данные свидетельствую!' о том, что некоторые! ФЛ, входящие в состав мембран ХГ, способны модулировать реакции переноса електронов иекду цит-Ь^, КМБ и мДЕЫ. В целой, за исключением ФЭ, нейтральные ФЛ (ФХ, лФХ, лФЭ) проявля-

'4561

Рис.9. Окнслониа восстановленной форм цлт.Ь™ 1 окисленной формой го,в и присутствии <ЯС(1), ФС (2), оэз лшпда (3), ФЭ (4) п

лЗЭ (5). Реакционная смесь в 10мМ К^а-фасфатном буфере, рН 7,0 содержала: 1,5ДМ цитохром, 20рМ КМБ и 1мМ соответствушнй лгатад.

Рис.10. Образование окситирашша в реакции гпдроксшшровашя тираиина, катализируемой идем. в присутствия л®Е (1), ОХ (2), без липвда (3), ФС (4), ФЭ (5) и ФК (6). Реакционная смесь в 10мМ Иа-ацетатном буфере, рН 6,0 содержала: 50кМ цЕБМ, 1дМ КМП, 20ЦЫ тирамин и 50ДМ соответствующий лилид. Т - ¿о; п = 15.

- за -

ли активирующее воздействие на отмеченные реакции; ФЭ действовал как активатор на этапе переноса электронов от цит.Ь,^ к КМБ и ингибировал перенос электронов от КМБ к мДБМ. {Сислые (М(ФС и ФК) ингибировали перенос олектронов на обоих этапах, что, как показали контрольные эксперименты, связано с удалением под их воздействием меди из состава КМБ и мДШ.

На первый взгляд, может показаться, что воздействие кислых ФЛ на КМБ и мДОЛ, сходное с воздействием многих хелаторов меда, не является специфичным и, с физиологической точки зрения, не стоит обсуздения. Однако, следует обратить внимание на тот факт, что, как показали эксперименты Saxem ana Fleming (1981), часть молекул мДБМ в своем исходном липидном микроокружении предотав-лона в виде алобелха. Медь при этом находится в комплексе с отрицательно заряженными головками ФС - основного липида в микроокружении фермента In vivo. Таким образом, не исключено, что результаты, полученные нами при исследовании воздействия кислых ФЛ на мДБМ in vitro, отражают процесс, имеющий место in vivo.

С другой стороны, специфичность воздействия нейтральных ФЛ очевидна и проявляется как на уровне воспроизводимого эффекта, так и на уровне самих реакций.

Отметим, что некоторые из вышеуказанных ФЛ - модуляторов теоно связаны с изучаемыми нами белками и составляют их непосредственное лшшдное окружение in situ. Так, ФЭ является составным компонентом лшшдного микроокруаения цит.Ь^ (настоящая работа), а Ш и ОС - мДВН {Saxena, Fleming. 1981). Таким образом, сопоставив известные из научной литературы факты с полученными нами данными, uosao допустить участие лкпщщого микроокру-кения цит.Ь^^1 и мДШ в переносе электронов, осуществляемым этими белками с КМБ в качестве промежуточного эвена. Выполняют ли ФЛ регуляторную роль, возможную как в случае их взаимопревращения '(ФС -> ФО > ФХ), так и взаимозамещешя (латеральная

диффузия или механизм флип-флоп), или не лшшдное окружение консервативно и создает в комплексе микросреду, способствующую наиболее эффективному функционированию белков - эти вопросы требуют своего дальнейшего исследования.

Изучение молекулярных механизмов взаимодействия ФЛ о мДШ. В этой части исследований были подробно изучены молекулярные механизмы, лежащие в основе взаимодействия м,КЕМ с индивидуальными ФЛ - модуляторами активности фермента, а также с суммарной

фракцией ФЛ мембран ХГ. В процессе Bcei экспериментов параллельно с мЦБМ исследовалось также взаимодействие с <М растворимой формы фермента, отличающейся от мембранной, отсутствием в ее молекуле гидрофобного пептида (Stewart and Klinman, 1988). Сравнительный анализ полученных результатов в значительной степени облегчил интерпретацию экспериментальных данных и способствовал выявлению специфических для взаимодействия мДЕМ с ФЛ особенностей. Это позволило также придти к определенному заключению относительно механизмов, лежащих в основе взаимодействия мДБМ с мембраной ХГ In situ и возможного участия в них гидрофобного пептида, входящего в состэв молекулы этой формы фермента.

Воздействие М на кшгетотестае параметры, реакции,катализируемой цДБМ. В данной серии экспериментов использовали везикулы, сформированные из индивидуальных ФЛ, со стоксовым радиусом 115А0. В исследованиях использовали два субстрата ДЕ?Д - тирамин и дофамин и три донора электронов - КМБ, аскорбат и ферроцаатвд.

В таблице 5 представлены кинетические параметр« реакции гидроксилирования тирамина, катализируемой мДЕМ, при использовании в качестве донора электронов КМБ, определенные, из двояных обратных зависимостей VQ поглощения от концентрации КМБ и тирамина в присутствии ФЛ - активаторов (лФХ, ФХ) и - ингибиторов (ФС, ФК, ФЭ). Аналогичные данные были получены с ферроцианидом или аскорбатом.В опытах о КМБ или ферроцианидом кинетические параметры определяли, из двойных обратных зависимостей VQ поглощения 02 от концентрации соответствующего донора электронов и субстрата. В случае аскорбата - из зависимости VQ окисления ас-корбата от концентрации аскорбата и субстрата.

Согласно полученным данным, в присутствии ФХ и лФХ возрастало сродство мДБМ к субстрату и к донору электронов, V не изменялась. В присутствии ФК и ФС наблюдалось понижение V , что является следствием удаления под действием этих липидов медй из активного центра фермента; к^ реакции не менялась. В присутствии ФЭ сродство мДБМ к субстрату и к донору электронов

повышалось, однако, V„„„ при этом понижалась. По-видимому, под

шах

под действием iO фермент приобретает такую конфорыацию, при которой его связывание с субстратом (или образующимся из последнего продуктом! носит частично необратимый характер. Аналогичное данные был;! получены и с дофамином.

Таблица 5

лшвд Цд КМБ, мЫ (Шл) V шах' мМхмшГ1(¥±.*) ^ тирамина, мМ (М±л)

---- 0,41±0,04 0,051 ± 0,005 0,13±0,01

лФХ ФХ 0,1б±0,02 0,24±0,03 0,051 ± 0,005 0,051 ± 0,005 0,05±0,01 0,076±0,010

ФС 0,41±0,04 0,036 * 0.004 0,13*0,02

ФК 0,41±0,04 0,028 ± 0,001 0, Ш0.01

ФО 0,27±0,03 0,031 ± 0,005 0,086±0,020

п » 2

Кинетические параметры реакции гидроксилироЕвния тирамшю под действием мДШ в присутствии лФХ, ФХ, ФС, Ж, ФЭ и без липида, с КМВ в качестве донора електронов.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что моду врущее воздействие индивидуальны! ФЛ на реакции, катализируемые мДВМ, отракается в иг воздействии на кинетические параметры реакции. Различие в молекулярных механизмах влияния нейтральных ФД на фермент является еще одним хорошим доказательством специфичности взаимодействия иДШ - нейтральный ФЛ. Отмечешше различия могут быть объяснены различием в конформации нейтральных ФЛВ, образуемых ФХ и лФХ, с одной стороны и ФЭ - . с другой: области полярных головок втих цвиттерионных липидов в структурном отношении отягчаются весьма, сильно.

Как было ранее отмечено, параллельно с изучением влияния &Л на цЦЕМ, мы исследовали также их воздействие на реакции, котонизируемые рДЕМ. Оказалось, что и характер воздействия ФК и степень активации или ингибирования ими рДЕМ полностью соответствовали наблюдаемым в случае мДЕЫ. На основании втих результатов был сделан вывод, что во взаимодействие иДБМ с &Л, приводящее к модуляции ее каталитических свойств, не вовлечен входящий в состав молекулы етой формы фермента гидрофобный пептид.

Изучение ..процессов кошлексообразованиямежду мДШ и ФЛ. Следующий этап исследований молекулярных механизмов взаимодействия мДШ с ФЛ состоял в изучении процессов ее комплексообразова-ная с ФЛВ, сформированными из нейтральных ФЛ - активаторов фер-«онта(лФХ.ФХ: мицеллы и мультилаыеллярные липосомы соответствен-

но) и из суммарной фракции ФЛ мпмбрян ХГ (мультиламеллярные ли-посомы). Исследования были проведет при использовании техники измерения АФ и высокоскоростного центрифугарова.чия.

Ассоциаиия_мда^_с_неЙтральш^_Фта. На рис.11 показана зависимость АФ меченных ФИТЦ м- и рДБМ от концентрации лФХ. По мере повышения концентрации лФХ АФ возрастает, что является свидетельством образования комплекса между ферментом и ФЛВ (Лакович, 1986). Поскольку ОИФ меченных ФИТЦ м- и рДБМ не изменялась, мы исключили возможность воздействия ФИТЦ на процесс комплексооб-разования. Аналогичные данные были получены и в случае ФХ.

Экспериментальные точки, полученные при регистрации АФ меченных ФИТЦ м- и рДБМ в зависимости от концентрации лФХ или ФХ, описывались теоретическими кривыми титрования со стехиометрией связывания 1:1 (везикула - фермент) (Тотра е1; а1., 1936).

Значения к^, рассчитанные на основании соответствующих кривых, составляли: для рДЕМ - 3,9(±0,3)ЦМ и 4,3(±0,4)рМ в случае лФХ и ФХ, соответственно; для цДБМ - 0,58( ±0,4)^4 и 0,60(±0,5)ДМ в случае лФХ и ФХ, соответственно (М±л, п-2). Таким образом, сродство мЛБМ к ФЛВ на порядок выше чем сродство рДБМ.

В соответствии с этим заключением находятся результаты экспериментов, представленные на рис.12, демострирувдие возможность вытеснения рДБМ из комплекса с везикулами ФХ (аналопгпше данные были получены и в случае лФХ) добавлением цДБЫ. В атш экспериментах меченную ФИТЦ рЦШ титровали ФЛВ и при насшдамцей концентрации липида добавляли немеченную мДБМ. С увеличением концентрации мЛБМ наблюдалось понижение АФ рДБМ. Вытеснить «ДБМ из комплекса с ТЛВ добавлением рЦБМ оказалось невозможным.

О возрастанием в среде концентрации ФЛ, в процессе титрования ими мДЕМ, происходит возрастание собственной ОИФ фермента, сопровождаемое коротковолновым сдвигом максимума спектра флуоресценции. Для рЦБМ такие изменения параметров не наблюдаются. Эти результаты могут быть объяснены либо непосредственным взаимодействием флуорофора мДЕМ с гидрофобной, частью ФЛВ, либо/и конформационными изменениями в структуре фермента, приводящими г. уменьшению доступности флуорофора к воде.

На рис. 13 показано влияние рН на АФ ыечокной ФИТЦ чДО.1 в присутствии (А) и в отсутствии (Б) везикул лФХ. Представлена такие дифференциальная кривая (В), демонстрирующая зависимость процесса комллексообразования ФЛВ - фермент от рН. Аналопгпше

! ю-'

К*

2.« з.го

2.ос 1.8« 1.(0

1.40 1-

0.00

мДШ

,8

л-

рдш

».40

0.80

1.29

1.(0

10

Концентрация лй, ДМ

Рис. п. Равновесное титрование ывченнш <МПЦ и- и рДБЫ (0,3|ДО) везнкулаыи лФХ. Регистрации проводили в 20мМ К-фосфатноы буфере, РН 5,7. СУ 5 8Ж; п = 3.

10"1 (

АФ

2.00

1.»

1.(0 ! 1.40

к

/

.В"'

""■8--Ч

I

1.20

1.00

-1- I

0,01 0,03 0,05!

[идт), т I

о.оо

0.40

о.ю

1.»

1.(0

10

Концентрация ФХ, ДМ

Рис. 12. вытеснение меченной аитц рДШ (0,ЗДО) нз комплекса с везикулаин ФХ добавлением намеченной цДШ. регистрацию проводили в 20ыМ К-фосфатном буфере, рН 5,7. СУ £ 258; п = 3.

Рис. 13. Заввмзхоста АО гтзвпой <Г!ИЦ !?ДБУ (0,з,ед о? pH а прз-оутсташ (Л) а отсутствии (Б) ввзз»7Я .öS (lOfifJ) и дп£$ервш(в-

эльяая крстая <35 - (А - Б). Регистрацию проводили в 20нМ К-фос-фатпом буфере. 07 s 2%\ п - 3-

РИС. 14. Зозкспиость АО ггэчэшой С.ТЩ цДЕМ (О.зр*!) а прасутетшп вазяаул гЭХ (10д!1) от концептрарцв КаС1, Регистрацию проводили з 20мМ K-фосфатном буфереfpH 5,7; СУ з BfA n = 3-

результаты получони и в случае везикул ФХ. Согласно полученным дашшы, наиболее оф$ектиьно процесс коыплексообразовакия протекает при кислых рН: максимальная степень комплексообразоьания наблюдается при рН 5,7; дальнейшее повышение рП приводит к понижению степени коиплексообразования до минимальной при рН 7,2. Сравнение К^ комплексов мДШ - ФЛВ при различных рН подтверждает дашше, представленные на рис.13 (таблица 6).

Таблица 6.

kd, M (М±д; п=2)

Фосфолипид РН 5,7 РН 7.2

лФХ ..................ФХ............... 0,5в±0,04 Ó,6Ó±0,05 го,з±1,70 22,8±2,0С)

kri комплексов мДШ - ФЛВ при рН 5,7 И 7,2

На pic 14 показано влияние ионной силы (концентрация fiaCl) ни процесс коиплексообразования меаду мДКМ и везикулами лФХ. {Сак следует из представленных данных, с возрастанием ионной силы (ог О до 100мМ NaCl) наблюдаетоя пошшенио АФ моченной ФИТЦ мДШ в условиях насыщения ФЛ. Аналогичные данные были получены и в случае ФХ. Таким образом, повышение ионной силы приводит к дестабилизации коиплекса фермент - 4ЛВ. Нами была исключена возможность того, что наблюдаемый аффект может быть следствием диссоциации тетрамерыой молекулы witEîJ на дшдерц, поскольку t контрольные эксперименты показали, что повышение ионной силы приводит к стабилизации тетрамерюй молекулы фермента. Так.к^ мДБМ при высокой ионной силе приблизительно на два порядка ниже, чем при низкой (1,5 (±0,1)|Д1 и 9 (±0,1)нЫ (Uíxí п=2), соответственно, в отсутствии ЫаС1 и в присутствии 100мМ UaCl).

Асеоццацмя_уДЙЛ_е_(№_:уз_с__ХГ.

В сл едущих экспериментах ферыент инкубировали с ФЛВ при комнатной температуре, бОшш, центрифугировали -бОмип при 100000g ("Spinco 1-2","Beotoran",США) .затем определяли содержание tfsjiKa в осадке, исходя из разницы меаду исходной концентрацией оелка в инку с анионной смеси и концентрацией его в надо^адочной £аш<остп.

Как следует из результатов экспериментов, представленных на рис. 15, по мере повышения концентрации ФЛ в инкубационной смеси доля мДБМ в осадке возрастает. При насыщающей концентрации липида везикулы адсорбируют около 40% от обцего содержания белка. Поскольку контрольные эксперименты показали, что в отсутствии в среде M фермент не.осаждается, полученные дашше факта-

т

1ФЛЗ, иг/ил

Рис. 15- Ззвйспиость ассоциации ИДЕМ с «ЛВ суммарной фрякцнп ФЛ

йЕНбрпа хг ст концектрацгя! ЙЛ. Концентрация мДЕМ в 7мл ¿СмМ К~ фосфатного буф?ра, рН 5.5 составляла 0,01мг/мл. СУ £ 20%\ п-15.

Рис. 16. Зависимость ассоциации ИДЕМ с ФЛВ суммарной фракции ФЛ иеибран ХГ от рй. Концентрации мДБМ и ФЛ в 7мл 20мМ К-фосфатного буфера составляли 0,01 и 0,18мг/мл,соответственно. СУ«20Я; п=15.

чески свидетельствуют, что мДШ способна образовывать комплекс с ФЛВ, сформированным; из суммарной фракции ©Л мембран ХГ. Эффективность комплексообразования рДШ с ФЛВ ниже: при насыщающей концентращш лишща везикулы адсорбировали всего 10» рДШ.

Как и в случае нейтральных МВ, процесс комплексообразования мДШ с везикулами из суммарной фракции ФЛ мембран ХГ зависит от рН и ионной силы среды. Как следует из данных, представленных на рис. 16, ассоциация фермента с ФЛВ наиболее вффективно протекает в узком интервале рН (5,0-6,0) с максимумом адсорбции при рН 5,5. При рН 7,0 ассоциация фермента о ФЛВ практически не происходит. С повышением ионной силы эффективность комплексооб-разования меаду мДШ и ФЛВ понижается. В присутствии 100мМ ЫаС1 ассоциация фермента о ФЛВ практически не наблюдается.

Таким образом, результаты экспериментов по изучении процессов комплексообразования меаду цДЕЫ и ФЛВ свидетельствуют о способности фермента к образованию обратимых комплексов с везикулами нейтральных ФЛ - активаторов мДШ, а такие с везикулами, сформированными из суммарной фракции ФЛ мембран ХГ.

Как известно, электростатические взаимодействия играй? немаловахиую роль в процессах ассоциации мембранных белков, особенно периферических, с лшшдаыми везикулами -и биологичеоиши мембранами. Набладаемое наш: поникание эффективности коаплексо-образования uДЭi с МВ при повышении ионной силы такке свидетельствуют, что за процесс ассоциации фераента с ФЛВ ответственны взаимодействия ионного типа.

С другой стороны, наличие максимума рН для процесса комплексообразования меаду мДЕМ и ФЛВ позволяет сделать вывод, что, ломимо заряда, другие факторы такае играют определенную роль в формировании комплекса меаду ФЛ и ферментом. В противной случае, следовало бы оамдать монотонную зависимость эффективности комплексообразования от рН.

Известно, что тетрамерыая молекула ДБМ способна к обратимой диссоциации на дамери, и втот процесс зависит от рН среды. При этом, в интервала рН 5,0-5,7 основной формой является дашер; дальнейшее повышение рН приводит к возрастанию соотноие-ния тетрамергдимар (Бгшагг апс! КИпшап, 1988). Аналогичная зависимость степени ассоциации-диссоциации субъедшшц иДШ от рН среды наблюдалась и нами (рис.13.Б). Поскольку оба процесса - и

диссоциация субъедшощ мДБМ, и ассоциация фермента с ФЛВ анзло-пгчтам образом зависят от рН, мы пришли к выводу, что ФЛВ ио влияют на степень диссоциации субъединиц, к что эффективность комплексообразовашя мДБМ с ФЛВ зависит от четвертичной структуры фермента: тетрамер образует комплекс эффективнее чем димср. Результаты наших экспериментов такке свидетельствует, что условия рН внутри ХГ - 5.5- 5.7 (WinKler et al., 1986) крайне благоприятны для ассоциации цЦЕМ с входящими в состав мембран втих органелл ФЛ.

Кроме того, полученные наш данные свидетельствуют, что помимо наряда и четвертичной структуры, общие конформационные изменения молекулы мДШ на уровне третичной структуры такие могут воздействовать на процесс ассоциации фермента с ФЛВ. Этот вывод основан на той, что апобелок мДЕМ, отличающийся своей третичной структурой о? голофермента (Stweart and Klinman, 1988), не способен к ассоциации с ФЛВ.

С другой стороны, как следует из представленных данных, для мДБУ характерна более'высокая степень комплексообразованич с ФЛВ, чем для рЦБМ. Основываясь на этом выводе, иогаю прядполо-saTb, что in vivo гидрофобный пептид мДБМ может принимать участие в процессе комплексообразования фермента с мембранными ФЛ, стабилизируя комплекс и, тем самым, способствуя более прочной ассоциации мДБМ с мембраной ХГ.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. В составе мембран ХГ обнаруяен новый белок флавопротеидной природы. Разработан метод очистки, позволяющий получать этот белок в электрсфоретически гомогенном состоянии, изучены основные физико-химические свойства ФП и его донорно-акцепторные отношения о рядом как природных, так и неприродных окислителей и восстановителей.

2..Разработан метод очистки локализованного в составе мембран ХГ ЦИТ.Ь56Г Метод позволяет получать влектрофоретически гомогенные препараты белка в его исходном липидном микроокружении в виде олигомерного комплекса. Изучены основные физико-химические свойства полученного препарата цитохрома, его донорно-акцепторные отношения с рядом как природных, так и неприродных окислителей и восстановителей;- впервые идентифицирован липидньД состав цит.Ь,^.

3. Исследовано взаимодействие цит.Ь^ с ФП. Установлено, что ФЛ способен выполнять роль донора влектронов цитохрома, и что процесс переноса электронов мекду этими белками специфичен и имеет положительно кооперативный характер со стехиометрией связывания 1:2.

4. Установлено, что локализованный в составе мембран ХГ КМВ способен функционировать в роли акцептора алектронов цит.Ь^1 и донора электронов ыДШ, сопрягая при атом процесс окисления цитохрома с восстановлением фермента И, соответственно, гидрокси-лироьанием его субстратов. Показано, что окислительно-восстановительные реакции между КМБ, цит.Ъ^б1 и мДВМ специфичны, и что взаимодействие КМБ с имеет положительно кооперативный характер со стехиометрией связывания 6:1. Установлено, что окис-лительно-восстановителыше свойства КМБ обусловлены входящей в состав его молекулы медью.

5. На основании полученных данных сделан вывод, что и ФП, и КМБ входят в состав цепи переноса влектронов мембран ХГ; сделано заключение относительно структурно-функциональной взаимосвязи компонентов отмеченной електронтранспортной цепи.

6. выявлено специфическое модулирующее воздействие индивидуальных ФЛ на перенос влектронов мекду цит.Ь^, КМБ и мДБЫ:

а. установлено, что одни ФЛ способны активировать, а' другие -ингнбировать перенос электронов мекду втами белками; 0. изучены молекулярные механизмы модулирующего воздействия ФЛ на реакцию переноса электронов от цит.Ь,^ к КМБ;

в. изучены молекулярные механизмы модулирующего воздействия ФЛ т каталитическую активность ДЕМ;

г. на основании полученных данных, с учетом того, что некоторые из 4Я - модуляторов входят в состав микроокружения и мДШ in si tu, выдвинуто предположение о возможной регуляторной роли ФЛ в отношении реакций переноса электронов и, соответственно, олекТронтранспортной цепи мембран ХГ in vivo.

7. Исследован процесс комплексообразования ыДБМ с везикулами, сформированными как из индивидуальных биполярных ФЛ - активаторов фермента, так и из суммарной фракции ФЛ мембран ХГ; изучено влияние ряда факторов (рй, ионной силы, степени ассоциации-диссоциации суоъодиниц фзрыэнта, наличия или отсутствия в его составе меда) на отмеченный процесс:

а. установлено, что процесс ассоциации фермента с ФЛВ обратим,'

специфичен и зависит от его третичной и четвертичной структуры;

б. П0КЯ39Н0, что при рН, соответствующих физиологическим значениям рН внутри ХГ. процесс комплексообразовшшя меаду ферментом и ФЛВ протекает наиболее вффекишно;

в. показано, что в стабшпзацш: ксмплекса фермент - MB принимают участие как электростатические, так и гидрофобные взаимодействия;

г. сравнительный анализ эффективности кс?тлексообразовадая м-н рДЕИ с ФЛВ позволяет оделать вывод об участии гидрофобного пептида мембранной формы фермента в стабилизации котглексп фермент - липид in vivo.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТБНЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Боядаян А.С. Очистка дофашн-й-моноокснгэназы п крайне гаюлого медьсодержащего белка из мозгового слоя надпочечников. Крайне кислый медьсодержащий белок кек донор электронов для до-фашш-р-моноокенгеназы // Биохгмия.- 1985.- Т.50, N.1.- С.84-90.

2. Боядаян А.С., Карагезян К.Г. Очистка дофашн-р-моноок-сигенязы X! изучение эффектов липилов ч регуляции ее каталитических свойств // Всесоюзная хонф. "Выделение, отастка и анализ биологически активных соединений": Тезисы,- Сухуми, 198?.- С.28.

3- Boyaj'ian A.S., Karageuzyan K.G. xinatios of dopamlne-Д-moncoxygenase activation by lipids // Giuseppe I'orcellati Foundation International Meeting on Neurochemical Aspeote of phospholipid Metabolism: Abstracts,- Perugia, Italy, 1988.- p.50.

4. Petroeian S.A., Boyajian A.S., Karageuzyan K.G. Purification of Membrane-bound cytochrome b-561 from chromaffin granules in water-soluble form and investigation of its phyaioo-ohemioal parameters /J XIX Meeting of ?3BS: Abstracts.- Rome, Italy, 1989.- TH 113.

5. Karageuzyan K.G., Hakopyan Zh.I., Ktzoyan J.A., Boyad-Jyan A.S., Mkrtohyan Z.S., MartIkyan H.R., Sarkissyan N.N., Me-liksetyan G.D., Ananev A.V., Pepoyan A.Z. The regulatory effect of aoidic and neutral phospholipids on the activity of gome enzyme systems // XIX Meeting o* PEBS: Abstracts.- Roma, Italy, 1989.- TU 136.

6. Петросян С.А., Оганесян Л.Л., Арутюнян М.Г., Бсядкян А.С. Мембранные переносчики электронов хромаффинных гранул // III Республиканская конференция "Достижения физико-химической

биологии и биотехнологии и пути их внедрения": Тезисы.- Ереван,

1989.- С.69.

7. Karageuzyan K.G., Boyajian A.S., Petrosian S.A., Haru-tiunyan Ы.Ы., Ohanesyan L.l. Reconstruction of the electron transfer ohain of chromaffin granule membrane // II World Congress or theoretioal organic chemists: Abstracts.- Toronto, Canada, 1990.- EP-07-

8. Boyajlan A.S., Karageuzyan K.G., Pogosyan A.G., Mtort-ohyan Ц.У., Aivazyan Y.A. Possible mechanism of modulation the catalytio properties of dopamine-fl-monooxy^enaee during the interaction with phospholipid vesiolea // II World Congress of theoretical organic ohemiats: Abstracts.- ïoronto, Canada,

1990.- DP-Q4.

9. Boyadzhyan A.S., Karagezyan K.G. Interaction of dopami-ne-0-monooxygenase with lipids: 1.lipids ав modulators of the catalytio aotlvity of tha епгутпе // Biomedical Soienoe.- 1990, V.1, N. 1.- P.379-383.

10. Petrosyan S.A., Hovanesyan L.I., Boyajian A.S., Karageuzyan K.G.. The electron carriers of protein nature from neurosecretory vesicle membranes // VIII General Meeting of European Society for Neurochemiotry:Abstraots.-GDR,Ie^pzig,t990.-P.98.

11. Петросян С.А., Боядаян А.С., Карагезян К.Г. Получение и очистка белковых переносчиков электронов мембран хромаффшшых гранул // VI научно-техническая конференция молодых ученых ' и специалистов района 26 Комиссаров: Тезисы.- Ереван, 1990.- С.83.

12. Оганесян Л.Л., Боядаян А.С., Погооян А.Г. Кислый медь-оодеркащий белок - промежуточное звено на стадии переноса олект-ронов от цитохроыа в-561 к дофаиин-р-монооксигеназе // VI научно-техническая конференция молодых ученых и специалистов района 26 Комиссаров: Тезисы.- Ереван, 1990.- С.79.

13. Петросян С.А., Бояджян А.С., Карагезян К.Г. Очистка цитохрома В-561 из мембран хромаффишшх гранул и его физико-химические свойства // Украинский биохимический курнал.- 1931.-Т.763, N.2.- С.39-45.

14. Оганесян Л.Л., Боядасян А.С., Петросян С.А., Карагезян К.Г. Кислый медьсодерхащий белок - промежуточное звено на стадии переноса электронов от цитохрома Ь-561 к дофамин-р-монооксигена-ье // Молекулярная биология.- 1991.- Г.25, N.1.- С. 99-104.

15. Оганесян Л.л., Боядаян А.С., Петросян с.А., Мкртчян

М.Е., Карагезян К.Г. Кислый медьсодержащий белок как промежуточное звено на стадии переноса электронов от нитохрома Ь-561 к дофамин-/? - монооксиген аз е//ДАН СССР,- 1991 --Т.317.N.3.- С.742- 745.

16. Pogosyan A.G., Boyajian A.S., Mkrtchyan M.Y.-, Karage-zyan K.G. Interaction of dopamine-p-monooxygenaae with chromaffin granule membrane lipids // Biochemical and Biophysical Research Communications.- 1992.- V.188, H.2.- P.678-683.

17. Петросян С.A., БоядаянА.С., Карагезян К.Г., Авакян С.А., Абрамов Р.Е. Очистка и исследование свойств нового белка флавопротеиновой природа из хромаффинных гранул // Нейрохимия.-1992.- Т.11, И.1.- С.28-34.

18. Петросян С.Ам., -Еоядяян Д.С., Карагезян К.Г. Участие белковых и липидных компонентов мембран хрома$фшшых гранул в реакциях, катализируемых дофашш-р-монооксигеназой // Нейрохи-мия.- 1992.- Т.11, N.3-4.- С.70-78.

19. Petrosyan S.H., Boyajyan А.S., Karageuzyan K.G. The participation of protein and lipid components or the chromaffin granule membrane in the reactions catalyzing by the dopamine-0-monooxygenase // II Asian Paoifio Society for Neuroohemistry fleeting: Ab3tract3.- Hyderabad. India, 1994.- P0-80.

20. Боядаяк А.С., Петросян С.Ам., Петросян С.А., Харагезян К.Г. Реконструкция участка цепи переноса электронов мембран хро-

гд¿j^j^aHSui,^ ГрСIIу,i7f оКЛхиЧслЮЩGjuO IXilTCIpC*« -j г IwICJIl££i 5»0,ДГ>ССДСр*!С(~

кщй белок и дофамин-р-монооксигеназу // Доклады Академии Наук (Российская Академия Наук).- 1995.- Т.344, N.6.- С. 1025-1028.

21. Boyajian A.S., Petroeyan S.H., Pogosyan A.G., Aivazy-an V.A., Karageuzyan K.G. Association of dopamine-0-monooxygena-se with ohromaffin granule membrane phospolipids // VIII International Symposium on Chromaffin Cell Biology: Abstracts.-Edinburg, Sootland, 1995, P.86.

- ьг -UUOBOUIhr

puutp' tjo^vtii/^-ß-i nbaep i , t ( Цшр« VVib|>|i £ifsar| p ifu\i

JUpu, ри^вЬр, ppa эц|)1ва1|га), j|<aappatf >

fpnilia$|iVuj|>\i ^piabn(bbp, 3»[ш$вцрпо1|]|], ( fiEj^ij 1

l/|i japp Ijiapbftp i|«|ii)u-i{bpa^aV^b/uV akul(j|iuibbp gli^ulsií b\i l(kbi)ubji Ftl'tí pe^Bbpuj(ib biatfa({i>p^atf ' Ц kljapebtibpji ¡^puVbputfi Ид akatjgjtabtipf tfuu^ulj juif kb p ■ t p^ fi Ц к tjt>\iiiual]ia|i 4 Vi jia.pЬp|> «|)ЬрЩ|\>, l{abbap¡iBm^l) V japbpji цк«« f • {iЦш| JiaVp, isuphai^b j ai| о pi)t¡iV¡>iiií |i hufap l| kbnal|uV jnV вЬку>ц флЬ|{ j|giabbp|i |i puigmf 1

¿utfisAuj\i 4iaiiulml{ul||i 9 tabanp juV [ ^^t11^1 ^ PС > 'иикЦпрецЬи Ç.B i ¡u^qVbpft, l|uphapta^ajV Цвр^щЦо]>f ¿ ^ j ^nVe) I^P tj^umpiaií j^pabkpai!, i^nfs^^qt (■ ^ Vpab| i/bj dubatj t ( b!¡upa\ibb p|>

<ji a |uii| p ¿ Ъ Ь p ^ к фЬ piIbbinVbp|i к hua a t |

l>bpl(ajB|4a* ujJsBuajVfnuf виа/Ьиа^р^Ц t b«puqptilü(|>li[i ujibpk -H|ib du»bui|jen рра ifu^ba jfiti tbpji jt-rjubpji ЦлраЪЪЬр|| ф|фи-

qpiíuV дриЬ' bpa ljus{í|i tfb¡ ^цЬпц Цn|ЦпЬЫшЪЬр(| pVrjjpji, J« [Ь1)й|и-j fiV Ijuan j^utyg h к |apjuV hejnpijuiljutop jnbg, Visb la j Ъ Ц к p p ,

» pb нЪ|> i ¡^¡щи^Ь jpj«u¡au|i a^ ju[ }qрш j qi p irablop jub L 1

¿Ьиицвьд^аЬПр|| ¡jfepagfcJ f pnt/u^buj |i b 4patu|bbp|i pjqobparf u\itpil bojaVupbp^bi t *fVa¿ и u\>be ja tibljupaVVibp^ фа|..!-ЧРП Vlai!l*1l>*u^t"ll* jt*^1 p Va j p |i, u«m/luu |i pi(b[ t Vp» du[kl(a[uj|i\i Iju-• i fin;f t api{b(, sp ^{Ui(»>(pnvib|ii)p at qopib( ppntÍB^{i-

\¡a¡ ¡il <, b b pf, p-u^iabpji t [ Ь1|ира bb bp ¡1 фа^з^ p4a\i JHP"-*jai1 1ШДО:

(al¡<¡büpn p )аЬ||й1)!аац|| a j|iunpp«si t^gj if|i ¡ü 11

tisujjib иЬ^в/ jra jj t upi(ai, a p pp a tfu^jibu j qpuVu[bbp|> pu^ubpaïf ^ubi|aq v^jpis.balji»n pp» lipa <)a pini ( bpubg

Ц13tf ^ tfk j tfabaq t ( ЦарпМЬр |i ijin^aq piíub }Цри jraiT ]|>uaf pnií ^gg^'t1 a ^a^utí^b-£-iíab»tpa¡iqkbui(( èujpaj|ib t p«|iijBn)^bpiíb\¡a|i tfji{b :

Uj» t¡a\»!¡>j, b U)>l|>t& i^apnVsval)«^ ppn uu)|>Bial|nj[i

^bp|i ^epi^iapuibHifg fut j ( ui(b | Vub pu jubu jut> ( be -

J |>Va q puVa{ Vbp|i pu^uVp)i 11 b 1|иря Vb к p |i фв(ча1| piíui\i jr^pu j |i i^aljiiaa^ »i(ul|Vbp :

Fb| ^ bj^ , igu|^al ui(j»(tbp^ butfniujb, uniajjib ubijuif jaj) t up^u) I p a ^puVa[ Vkp^ pu^uVpfi Ц bl|\apabVbp|i p tfub

JUpujJi l|a/^abkVubkp|i ^a ut/я ^ |>чНа JI1 ^ ^^ t«a4>a> J F t1 ^n^utjVni^ u^q b jia -PJ^b; tl bi|npkbVbp|i ijia^ui|piiab иврркр pn.if 1