Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структурно-функциональных закономерностей в парамагнитных металлобелках методом ЯМР

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, доктора химических наук, Дикий, Александр Игоревич

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность проблемы

Одной из важнейших научно-технических задач современной биохимии является определение структуры и структурно-функциональных зависимостей для белков различных классов и разработка на этой основе научно обоснованных методов синтеза новых веществ с прогнозируемыми свойствами. Эффективным инструментом решения поставленной задачи является спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Спектроскопия ЯМР - мощный и во многом уникальный инструмент структурной биологии, позволяющий определять структуры биологических молекул на уровне атомного разрешения в условиях, близких к физиологическим. Наличие данных о структуре макромолекул, полученных для твердого состояния (рентгеноструктурный анализ) и для растворов (ЯМР спектроскопия), позволяет сравнить конформации макромолекулы в обоих состояниях, дает полное и достоверное отражение реальной структуры макромолекул и выявляет структурные особенности, определяющие их функциональные свойства. Кроме того, ЯМР дает информацию о динамике макромолекул в растворе, описывает свойства частично или полностью неупорядоченных белков. Способность данного метода проводить мониторинг слабых взаимодействий между макромолекулами и лигандами позволяет использовать этот метод при разработке новых типов лекарств. Роль ЯМР становится еще более важной в постгеномную эру, так как данная спектроскопия является основным методом проверки компьютерно предсказанных структур белков. Указанные возможности метода представляют собой далеко неполный перечень достоинств ЯМР.

Список используемых обозначений:

ЯМР - ядерный магнитный резонанс; ПМР - гюотонный i

КНИГА ИМЕЕТ

В перепл. елак. сосдин. ,V"X': ВЫП. онные доли; шляющей в химический Г, - время ;сации; Chr. станционная - штрафная >Y - общая ия ядерного ероядерной релаксации; структурная

Первые упоминания о применение метода ЯМР для получения структур белка появились в литературе в восьмидесятых годах. Именно тогда началось интенсивное использование ЯМР для получения трехмерных структур белков и нуклеиновых кислот в растворе. Усовершенствование методов ЯМР и сегодня является одной из актуальнейших методологических задач, получившее дальнейшее развитие после появления коммерчески доступных магнитов с мощным магнитным полем. Наличие ЯМР спектрометров, оперирующих при 800 - 900 МГц Ларморовой частоты для протонов, значительно упростило проблему спектрального разрешения сигналов в ЯМР спектре макромолекул. Объединение современных ЯМР спектрометров с мощной вычислительной техникой и компьютерами, позволившими быстро производить Фурье преобразование, значительно сократило длительность эксперимента и повысило качество решения стоящей задачи. Немаловажную роль в дальнейшем развитии ЯМР играет разработка и усовершенствование последовательностей ЯМР импульсов, применяемых для записи спектров. Так, например, недавно разработанная последовательность импульсов, называемая ТЛОБУ, позволяет уменьшить ширину 'ЯМР сигналов, таким образом, решая проблему спектрального перекрывания сигналов.

Непрерывное развитие молекулярной биологии и биотехнологии позволяет значительно ускорить процесс получения трехмерных структур белков в растворе. Наличие усовершенствованных экспрессионных систем дает возможность получить Достаточное количество как нативного белка для протонных гомоядерных экспериментов, так и 13С, 2Н, обогащенных белков для гетероядерных спектров. Работа с обогащенными белками позволяет помимо обычных двухмерных спектров получить трех- и четырехмерные спектры, в которых 3-я и 4-я координаты соответствуют гетероядру (13С-15"Ы). Наличие многомерных спектров существенно облегчает анализ и интерпретацию спектральных данных. Изотопное обогащение наряду с использованием современных последовательностей ЯМР импульсов позволило увеличить пределы молекулярного веса белков, для которых возможно определение трехмерной структуры высокого разрешения в растворе с помощью ЯМР с 10 кДа до 40 кДа. Кроме того, наличие обогащенных белков позволяет получить дополнительную информацию о конформации и мобильности аминокислот, составляющих данный белок.

Приведенные выше основные положения позволяют отнести ЯМР спектроскопию к важнейшим инструментам современной структурной биохимии.

1.2 Особенности ЯМР парамагнитных металлосодержащих белков

Как упоминалось выше, методы ЯМР предоставляют уникальную возможность получения структур макромолекул в условиях близких к физиологическим. Большое количество белков содержит в своем активном центре ион(ы) металла. Во многих случаях парамагнитное состояние данного иона является биологически важным. В то время как процедура получения трехмерных структур для диамагнитных белков хорошо разработана и находит широкое применение, методы получения трехмерных структур парамагнитных металлобелков, содержащих в активном центре ионы металлов с неспаренными электронами, находятся в стадии интенсивного развития. На сегодняшний день подавляющее большинство структур, полученных с помощью ЯМР, и зарегистрированных в РБВ банке, представляют собой структуры диамагнитных белков. Причиной этому являются сложности в детектировании как самих ЯМР сигналов, соответствующих ядрам, расположенным в непосредственной близости к ионам металла, так и их скалярных и диполярных взаимодействий с другими ядрами. Данные сложности обусловлены наличием в молекуле неспаренных электронов. Взаимодействие последних с ядерными спинами приводит как к значительному изменению химического сдвига данного ядра, так и к увеличению скоростей релаксации ядра (как спин-матричного, Ть так и спин-спинового, Тг). Увеличение спин-матричной скорости релаксации усложняет обнаружение диполярных взаимодействий между ядрами, что затрудняет получение структурных данных. Увеличение спин-спиновой скорости релаксации приводит к уширению ЯМР сигналов, таким образом препятствуя их детектированию, что в свою очередь, также ведет к потере структурной информации.

Приведем пример изменения характеристик сигналов ЯМР ионом парамагнитного металла. В парамагнитной молекуле цитохрома с, содержащего в своем активном центре низкоспиновый ион Ре3т (8=1/2), время релаксации Т[ протонов порфиринового кольца и близлежащих аминокислот варьируются от 10 мс до 100 мс. Ширина сигналов, V, обратно пропорциональная Т2, - от 50 до 300 Гц. Химический сдвиг, 5, от +30 до -30 м.д. Аналогичные параметры для протонов в диамагнитной молекуле имеют значения: Т] - несколько сотен миллисекунд; V - от 2 до 10 Гц; 5 - от 10 до 0 м.д. Следовательно, наличие неспаренных электронов значительно затрудняет получение структурной информации об активном центре парамагнитных белков методами ЯМР. С другой стороны, присутствие в молекуле парамагнитной метки приводит к тому, что ядра, находящиеся в непосредственной близости от парамагнитного центра и взаимодействующие с ним, имеют ЯМР свойства (5, Т] и Тг), значительно отличающиеся от соответствующих характеристик ядер, не чувствующих влияние парамагнетизма. Это позволяет из всего ПМР спектра, содержащего несколько сотен - тысяч сигналов, выделить лишь несколько десятков сигналов и селективно проводить изучение активных центров парамагнитных белков, извлекая важную информацию относительно структуры, электронных, магнитных и функциональных свойств данного центра.

Вышесказанное подтверждает, что разработка методологии, приемлемой для структурного и функционального изучения парамагнитных белков с помощью ЯМР спектроскопии, является чрезвычайно актуальной задачей.

2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 2.1 Цель и задачи исследования

Целью работы является разработка, усовершенствование и оптимизация методологических аспектов применения ядерного магнитного резонанса для изучения структурных, электронных и функциональных характеристик парамагнитных металлобелков и ферментов, вовлеченных в различные биологические процессы.

Работа условно может быть разделена на два взаимосвязанных направления. Первое - структурные исследования, направленные на получение полных трехмерных структур изучаемых белков в растворе. Второе направление - исследование структурно-функциональных зависимостей в исследуемых классах белков, изучение с помощью ЯМР активных центров белков. Часть исследования, касающаяся изучения структурных, электронных и функциональных характеристик железосерных белков и их активных центров, представляет собой развитие кандидатской диссертации автора [1-7].

В ходе выполнения представляемой работы решались следующие задачи:

1 Номера, указанные в квадратных скобках, соответствуют номерам публикаций.

1. Выделение и очистка парамагнитных металлобелков. Среди них: железосерные (HiPIP и ферредоксин), железосодержащие (диоксигеназа), гемсодержащие (цитохром с, цитохром с', цитохром с пероксидаза), медьсодержащие (пластоцианин) белки и ферменты из различных источников, а также их производные и мутанты.

2. Запись ЯМР спектров, являющихся экспериментальной основой для определения трехмерных структур упомянутых парамагнитных металлобелков (одномерные NOE, двухмерные COSY, TOCSY, NOESY, EXSY, 'H-15N (I3C) HMQC, трехмерные 'H-1SN HMQC-TOCSY, 'H-1sN HMQC-NOESY, HN-HA спектры).

3. Расчет структуры белков на основании полученных ЯМР данных. Усовершенствование полученных структур с помощью энергетической минимизации и молекулярной динамики. Разработка и оптимизация протоколов, применяемых для расчета структу р парамагнитных металлобелков.

4. Сравнение полученных структур белков в растворе с имеющимися кристаллографическими структурами белков. Сравнительный анализ полученных структур белков в окисленной и восстановленной формах. Выявление структурных различий между сравниваемыми структурами.

5. Дизайн и применение новых последовательностей ЯМР импульсов для структурного изучения парамагнитных металлобелков.

6. Корреляция полученных структурных и электронных характеристик активных центров изученных металлобелков с их функциональными свойствами (изучение структурно-функциональных закономерностей).

2.2 Научная новизна и практическая значимость работы

1. Выделены и очищены до гомогенного состояния следующие белки и их мутанты: высокопотенциальные железосерные белки (HiPIP) из Chromatium vinosum и Ectothiorhodospira halophila, селеновые производные этих белков, Cys77Ser-MyraHT HiPIP из Chr. vinosum, 7Fe-8S ферредоксин из Rhodopseudomonas palustris, 2,2',3-тригидроксибифенилдиоксигеназа из дибензофуран-деградирующей бактерии Sphingomonas sp. штамм R.W1, цитохромы с из Rhodocyclus gelatinosus, Bacillus pasieurii, метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha, цитохром Cf, из сине-зеленых водорослей Cladophora glomerata, цитохром с' из Rhodopseudomonas palustris, пластоцианины из Synechocystis sp. PCC 6803 и листьев шпината, Arg48Glu цитохром с пероксидаза из дрожжей. Для получения трехмерных структур в растворе HiPIP из Chr. vinosum и пластоцианина из Synechocystis sp. PCC 6803 были обогащены 15N изотопом.

Следует отметить, что в рамках данной работы впервые была разработана методика выделения и очистки цитохрома с из метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha. Этот белок является первым представителем класса цитохромов с, выделенным из нетрадиционных индустриальных дрожжей. Вышеупомянутые микроорганизмы при росте используют метанол как единственный источник энергии. В процессе работы данный белок был охарактеризован биохимически и . биофизически.

2. Впервые разработана методология получения с помощью ЯМР полной трехмерной структуры парамагнитных белков в растворе на примере HiPIP, выделенного из Chr. vinosum, в обеих окислительно-восстановительных формах. Впервые определена структура белка, содержащего ион Cu(II), в растворе на примере окисленного пластоцианина из Synechocystis sp. PCC 6803. Сравнительный анализ полученных ЯМР структур с данными рентгеноструктурного анализа показал, что общая конформация молекул не изменяется при изменении фазового или окислительно-восстановительного состояния белка. Однако, при общем принципиальном сходстве конформаций, они демонстрируют реальные, значимые различия. Проведенные исследования позволили вьивить эти различия. Мониторинг подобных изменений в окислительно-восстановительных белках играет важную роль для определения механизма и пути переноса электронов.

3. Применение методов ЯМР для изучения парамагнитных металлобелков позволило получить информацию о распределении неподеленной электронной плотности по активному центру упомянутых в п. 1 белков. Это впервые позволило определить электронные структуры изученных белков. Из полученных данных были определены механизмы взаимодействия между ядрами и неспаренными электронами. Используя соответствующий формализм, был рассчитан относительный вклад различных механизмов (диполярного и контактного). На основании собранных данных было получено детальное описание активных центров белков на молекулярном уровне. Установлена корреляция между наблюдаемыми

ЯМР параметрами (химический сдвиг, время ядерной релаксации, pH и температурная зависимость данных характеристик) и биологическими свойствами изученных белков (потенциал, структура, наличие водородных связей, координационные характеристики активного центра, скорость переноса электрона). 4. Разработаны две новые методики изучения парамагнитных белков с помощью ЯМР. Первая методика (NOE-NOESY), заключающаяся в применении новой последовательности импульсов, позволяет существенно облегчить детектирование и интерпретацию диполярных взаимодействий в ПМР спектрах парамагнитных систем. Разработка методики производилась для цианидного комплекса миоглобина и в дальнейшем использовалась для ЯМР изучения различных парамагнитных систем. Второй метод, основанный на наблюдении обменных ЯМР взаимодействий между сильно парамагнитной и диамагнитной формами белка, позволяет определить положение и ширину линий сильно сдвинутых и уширенных сигналов (ширина линий сигналов, детектирующихся с помощью данного метода, может достигать 500-800 КГц). Метод был разработан и продемонстрирован для пластоцианинов, белков, содержащий в активном центре ион меди. Данный метод может быть успешно применен для любой другой системы, где существует быстрый процесс переноса электрона между парамагнитной и диамагнитной формами молекулы.

Изложенные в работе результаты имеют как фундаментальное, так и прикладное значения и представляют собой значительное развитие метода ЯМР для структурного изучения парамагнитных металлобелков.

2.3 Основные положения, выносимые на защиту

-Получение трехмерных структур парамагнитных металлобелков, используя ЯМР спектроскопию, на примере HiPIP, выделенного из Chr. vtnosum, в восстановленной и окисленной формах;

-Изучение электронных и структурных характеристик активных центров парамагнитных металлобелков, с помощью ЯМР спектроскопии, на примере пластоцианина из Synechocystis sp. РСС6803.

2.4 Апробация работы

Результаты работы были представлены на конференции молодых ученых химического факультета МГУ, Москва (1989), Втором симпозиуме по кинетике переноса зарядоБ в гомогенных и гетерогенных системах (Батуми, 1989); конференции молодых ученых Химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова (Москва, 1989) конференции "Экология и проблемы окружающей среды" (Ташкент, 1990); 7ой международной конференции по органической и биологической химии (София, Болгария, 1990); Зей Международной Евразия конференции по химическим наукам (Бангкок, Тайланд,1992); международной конференции "Бионеорганические и биотехнологические аспекты химии дш окружающей среды" (Флоренция, Италия, 1992); 5ой, 6ой, 7ой, 8ой Кьянти конференциях по магнитному резонансу "Ядерная и электронная релаксация" (Сан-Миньято, Италия, 1993, 1995, 1997, 1999); международной конференции "EUROBIC II" (Флоренция, Италия, 1994); международном симпозиуме по железосерным белкам "Новые структуры и неожиданные функции" (Констанц, Германия, 1994); конференции НАТО "Молекулярное моделирование и динамика биологических молекул, содержащих ионы металла" (Сан-Миньято, Италия, 1997); 1ом Балканском ботаническом конгрессе (Тессалоники, Греция, 1997); XXXIII Международной конференции по координационной химии (Флоренция, Италия, 1998); 1ой и 2ой SAPIO конференциях по ЯМР спектроскопии (Болонья, Италия, 1999, Флоренция, Италия, 2000); Зей международной конференции по молекулярной структурной биологии (Вена, Австрия, 1999); XX конгрессе итальянского химического общества (Римини, Италия, 2000); XIX международной конференции по магнитному резонансу в биологических системах (Флоренция, Италия, 2000); NATO школе «Химические перспективы кристаллографии и молекулярной биологии» (Эриче, Италия, 2000). Материалы данной работы были представлены автором на лекциях, проведенных в следующих университетах: Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова (1995); Университет Нью-Йорка в Баффало, США (1999); Университет Небраски в Линкольне, США (1999); Университет Лунда, Швеция (2000).

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Все химические реагенты, использовавшиеся в работе, являлись коммерческими продуктами высшего качества. Исследованные белки, ферменты, мутанты, белковые производные были получены согласно существующим методикам. 15N обогащенные белки были изолированы из бактерий, выращенных на среде, содержащей 1SN- сульфат аммония. Их очистка была идентична очистке нативных белков.

Образцы для ЯМР спектроскопии содержали 1-3 мМ растворы исследуемых систем в водном или дейтерированом растворителях. Приготовление образцов и обмен буфера (с НгО на D2O, и наоборот) производился пятикратным повторением ультрафильтрования с необходимым раствором, используя амикон с YM1 мембраной. Белки, их производные и другие соединения, неустойчивые к кислороду воздуха, готовились в анаэробных условиях в атмосфере азота или аргона.

ЯМР спектры были получены, с использованием Bruker ЯМР спектрометров, работающих при 200, 300, 500, 600, 700 и 800 МГц Ларморовской частоты по протону. ПМР спектры калибровались приписыванием сигналу воды химического сдвига 4.79 м.д. при 300 К по отношению к ДСС (2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфоновая кислота). 15N ЯМР спектры калибровались приписыванием химического сдвига 21.4 м.д. сигналу (15NH4)2S04 при 300К по отношению к жидкому аммиаку.

Необходимые для работы ЯМР данные были получены, применяя следующие гомо- и гетероядерные последовательности ЯМР импульсов: одномерные NOE, двухмерные COSY, TOCSY, NOESY, EXSY, 'H-15N (,3С) HMQC, трехмерные 'H-1sN HMQC-TOCSY, 'н-1^ HMQC-NOESY, HN-HA. Указанные последовательности представляют собой стандартные программы, содержащие требуемый набор ЯМР импульсов. Для преодоления проблемы перекрывания сигналов, и для подтверждения полученных результатов, ЯМР спектры были записаны, по крайней мере, при двух различных температурах. Обработка спектров производилась программой Bruker XWINNMR. 25 - и 3х - мерные спектры анализировались на IBM RS6000 и SGI компьютерах, используя программу XEASY.

Ниже изложены основные шаги, предпринимаемые для получения трехмерных структур белков с помощью ЯМР: а) специфическое приписывание сигналов в ЯМР спектре с помощью скалярных и диполярных экспериментов. Скалярные эксперименты, к которым относятся TOCSY (tottal correlation spectroscopy), COSY (correlation spectroscopy). HMQC (heteronuclear multiple coherfense correlation) и их модификации, основаны на регистрации переноса магнетизации между двумя взаимодействующими ядрами, соединенными химической связью или несколькими связями, Диполярные эксперименты, к которым относятся МОЕвУ и его различные модификации - на регистрации переноса магнетизации между двумя ядрами через пространство. Другими словами, задачей этой части работы являлось определение химических сдвигов всех или большинства протоновых сигналов в ЯМР спектре белка, б) отнесение диполярных взаимодействий (кросспиков) между протонами, находящимися на расстоянии менее 5А один от другого. Каждый кросспик помимо своего химического сдвига характеризуется интенсивностью. Интенсивность диполярного кросспика, I, обратно пропорциональна расстоянию, К, между протонами, образующими данный кросспик, в шестой степени: 1=АЛ16, где А - константа пропорциональности. Приведенное соотношение является одним из главных источников структурной информации, получаемой с помощью ЯМР. Следовательно, чем больше диполярных кросспиков будет отнесено в спектре, тем больше структурной информации можно получить из ЖЖЭУ спектра, и тем более качественной будет результирующая структура; в) определение угловых ограничений для ф и у торсионных углов. Данные ограничения были получены из анализа трехмерных Н>?-НА спектров (ограничения для ф торсионных углов путем определения 31ынна констант спин-спинового взаимодействия) и из сравнительного анализа интенсивностей МН,-На( и МНгНам кросспиков в двухмерных ЫОЕ8У и трехмерных НМСЮ-МОЕЗУ спектрах (ограничения для ф и \|/ торсионных углов). г) расчет трехмерной структуры макромолекулы на основе экспериментально полученных ЯМР данных (дистанционные и угловые ограничений) с помощью выбранного алгоритма; д) увеличение резолюции полученной структуры с помощью расчетов молекулярной механики и динамики.

Геометрические ограничения (дистанционные и угловые) для атомов находящихся в непосредственной близости к парамагнитному центру были определены из ЯМР экспериментов, предназначенных для спектрального обнаружения быстро релаксирующих ядер. При расчете всех структур, приведенных в данной работе, дистанционные ограничения для таких атомов были определены из одномерных КОЕ спектров. Эти спектры были получены при насыщении парамагнитных сигналов, находящихся вне диамагнитной зоны. Кроме того, дополнительные дистанционные и угловые ограничения для парамагнитных ядер были использованы при расчете трехмерной структуры окисленного пластоцианина из Synechocystis sp. 6803. Данные ограничения были получены из анализа времен продольной релаксации амидных протонов белка (дистанционные ограничения между ионом меди и соответствующим амидным протоном) и значений химических сдвигов метиленовых протонов Cys83 (ограничение %2 торсионного утла для Cys83) и амидного протона Asn40 (дистанционное ограничение для водородной связи между HN Asn40 и Sy Cys83).

Для расчета структур белков объемы отнесенных NOESY кросспиков интегрировались при помощи программного пакета XEASY. Программа CALIBA применялась для трансформирования объемов диполярных кросспиков в расстояния. Полученные значения использовались как максимально допустимые значения расстояний. Набор максимальных предельно допустимых расстояний (дистанционных ограничений) между протонами, образующими кросспики, представлял собой входные экспериментальные данные для расчета структур белков программой DIANA и DYANA. Стереоспецифическое отнесение сигналов было определено используя программу GLOMSA. Полученное с помощью упомянутых программ семейство структур (ДГ семейство) подвергалось усовершенствованию энергетической минимизацией (ЭМ семейство) и, в дальнейшем, молекулярной динамикой (МД семейство) в вакууме, с использованием программы AMBER. В некоторых случаях, для учета специфических взаимодействий белок - вода, расчет молекулярной динамики производили в воде. Эта процедура аналогична проводимой в вакууме за исключением того, что белок был сольватирован в 10 Ä слое молекул воды. В этих расчетах использовалась фиксированная константа диэлектрической проницаемости. Полученные структуры депонировались в PDB банк данных. Процедура получения трехмерной структуры белков представлена на схеме 1.

Схема 1. Методика получения трехмерной структуры белков с помощью. ЯМР спектроскопии.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 4.1 Анализ спектральных ЯМР данных

Железосерные белки и ферменты вовлечены в различные важные биологические процессы (фотосинтез, дыхание, изомеризация и т.д.). Наиболее распространенной функцией железосерных белков является электронный перенос. В своем активном центре эти белки содержат железосерные кластеры, которые различаются по строению и числу ионов железа и серы, составляющих этот кластер. Основные типы железосерных кластеров представлены на рис.

Рисунок 1. Структуры и общие заряды железосерных кластеров, встречающихся в биологических системах.

Высокопотенциальные железосерные белки (HiPIP) в своем активном центре содержат тетрамерный 4Fe-4S кластер и характеризуются высокими значениями окислительно-восстановительного потенциала. Еш этих белков варьируется от +50 мВ до +350 мВ. В восстановленной форме, в активном центре белка присутствуют 2 иона железа в восстановленном состоянии (2+) и два в окисленном (3+). Общий спин тетрамерного кластера в восстановленном состоянии равен нулю. Таким образом, белок должен быть диамагнитным. В связи с близким расположением основного диамагнитного состояния и более высоко лежащих возбужденных парамагнитных энергетических уровней, последние, при комнатной температуре являются частично заселенными. То есть, восстановленный белок является парамагнитным несмотря на то. что его общий спин равен нулю. Действительно, ПМР спектр восстановленной формы является типичным спектром парамагнитного белка. В окисленном состоянии активный центр содержит 3Fe3+ иона и один 3Fe2+ ион. Суммарный спин белка, S, равен '/;. Таким образом, в случае окисленного белка, базовое спиновое состояние является парамагнитным.

В данной работе, используя методы ЯМР, была определена структура HiPIP. выделенного из Chr. vinosum в восстановленной [15,16,18] и окисленной формах [15,17,18]. Данный белок содержит 85 аминокислот. Его молекулярный вес равен 9,5 кДа и окислительно-восстановительный потенциал, Е^, равен +350 мВ по отношению к стандартному водородному электроду. Кристаллографическая структура окисленной формы данного белка была получена еще в 1974 году. Однако отсутствие надежного протокола для получения ЯМР структуры парамагнитного белка препятствовала получению структурных данных о белке в растворе. Эта проблема успешно решена в данной работе. Ниже приведены результаты определения структур HiPIP, выделенного из Chr. vinosum в восстановленной и окисленной формах.

На Рис.2 представлены 1Н ПМР спектры окисленного и восстановленного HiPIP, выделенного из Chr. vinosum. Как видно из рисунка, спектры обеих форм белка характеризуются сигналами, сдвинутыми вне диамагнитной зоны (10 - 0 м.д.), что говорит о парамагнетизме обеих форм. Сдвинутые парамагнитные сигналы в ПМР спектрах соответствуют протонам цистеинов, координирующих ионы железа, и таким образом являются наиболее чувствительными к парамагнетизму тетрамерного активного центра.

Рисунок 2. 600 МГц ПМР спектры окисленной (А) и восстановленной (В) форм высокопотенциального железосерного белка ШРГР, выделенного из СИготаНит \4n0sum. Спектры записаны при 298 К, рН 7.0, в 50 мМ фосфатном буфере.

Как отмечалось ранее, для получения ЯМР структуры высокого разрешения максимальное число сигналов должно быть отнесено в спектре изучаемого белка.

Анализ ЯМР спектров с целью специфического приписывания сигналов в спектрах окисленной и восстановленной форм, изучаемого белка, был проведен по стандартной методике. Сравнительный анализ ТОСБУ и МОЕБУ спектров позволил определить химические сдвиги для сигналов, соответствующих 69 аминокислотам в спектрах обоих форм. Анализ трехмерных спектров позволил провести отнесение N11 сигналов с одинаковыми или близкими значениями химического сдвига. На рис.3 в качестве примера представлено несколько - \\'з (*Н - !Н) плоскостей, экстрагированных из трехмерного ЬТОЕЗУ - НМС)С спектра, при различных значениях химического сдвига 15М.

118.2 122.7 122.9 119.3 117.8 122.

Т-----Г------1---5-'---Г------~Т

6.60 8.28 7.52 8.18 7.47 10.

1Н8 (м.д.)

Рисунок 3. Р1-РЗ плоскости, экстрагированные из трехмерного 'Н-'Н МОЕБУ - 1Н -15М HMQC спектра восстановленной формы Н!Р1Р, вьщеленного из СкготаНит У1позит. Спектр записан при 300 К, рН 5.1, в 50 мМ фосфатном буфере. Специфическое отнесение сигналов для аминокислот 28-33 обозначено стрелочками. Вверху рисунка указан химический сдвиг 15Ы каждой приведенной плоскости.

На Рис.4 приведена схема, суммирующая специфическое отнесение протонов, полученное традиционными ЯМР методами, используемыми для изучения диамагнитных систем, для восстановленной и окисленной форм. Отнесение спектра данного белка в обеих формах было получено, анализируя как упомянутые выше

ЗАРАЫАХ/ААОйАТА I А Ц К V N о о а т к в е v а а а я р й рре е

Сан-мн С'Н-МН мн-гчн онсамсор моаоааоат dew

СН-МН —лт С'Н-ИН

КОССЬ-РРеК!. ¡NVNGWCASW

NN В ■ ■ ■ ■ Н ■ Ш Ш Я

С'и-ин м шм-миимын-мн '--■ —

Т I- К А О

6араыа\/ааооата i а к v n

ЫН « М ■ » Ш ш

С*И-МН ЯВЯ — ■!!—II —

О О А Т К Э Е ЙЧ/АААРЗРОЦ РРЕ Е

ОНСАЫСОР М О А О А А Э А Т О Е \Л/ сн^н " " ** " ш "" ™

INVNGWCASW с*н-ын с'н^н мн-мн

Т ц К А а

С'Н-М с'н-и NH-N

Рисунок 4. Схематическое изображение последовательностных взаимодействий, вовлекающих протоны КН, На и Нр, полученных из стандартных двумерных ПМР экспериментов, для восстановленного (А) и окисленного (Б) №РГР из СкготаНит у1по$ит. Диполярные КН- На взаимодействия поделены на сильные (толстая линия) и слабые (тонкая линия). Темные квадраты обозначают медленно обменивающиеся с водой протоны. трехмерные спектры, так и двухмерные 'н - l5N HMQC спектры.

На Рис.5 представлен 'Н - ,5N спектр восстановленной формы HiPIP, выделенного из Chr. vino sum.

110.0 J

120.0 j 15NS' шд.);

130.0,

23 té ■

4V o 22 Ж £.

4. н ^

• U • *

63 51 54' ф

10.5 10.

9.0 8.

1Н 5 (м.д.)

Рисунок 5. 300 К 'Н-ЬК спектр восстановленного Н1Р1Р из СИготайит \inosum в водном растворе 0,05 М фосфатного буфера. М'Н-15К кросспики обозначены в соответствии с их отнесением.

Последовательностные ПМР взаимодействия между амидным протоном данной аминокислоты и На протоном предыдущей (1ОД - Наы) не были обнаружены для всех аминокислот по нескольким причинам (спектральное перекрывание сигналов, отсутствие последовательностных ЯМР взаимодействий у пролинов). Однако наиболее важной из них является близость некоторых аминокислот к парамагнитному кластеру, приводящая к уширению соответствующих протоновых сигналов, и не позволяющая их обнаружение традиционными ЯМР методами. Отнесение последних производилось на основе экспериментов, предназначенных для детектирования взаимодействий между быстро релаксирукяцими протонами. В число этих экспериментов входили специально модифицированные ТОСЗУ и КОЕБУ спектры и одномерные КОЕ эксперименты, являющиеся одномерными аналогами двухмерных ЖЗЕЭУ спектров и отличающиеся повышенной чувствительностью. Отметим, что данные одномерные ИОЕ спектры являются важнейшим источником структурной информации при изучении парамагнитных систем, поскольку они позволяют провести отнесение сигналов соответствующим протонам, находящимся в непосредственной близости к парамагнитному центру, и которые из-за парамагнитного уширения нельзя детектировать обычными методами, а также наблюдать диполярные взаимодействия, в которые вовлечены парамагнитные ядра.

На рис.6 приведены ХОЕ спектры, полученные для парамагнитных протоновых сигналов, соответствующих протонам р-СНг групп цистеинов, координирующих кластер, в восстановленной форме белка. Наблюдаемые МОЕ-сигналы в диамагнитной зоне спектра соответствуют сигналам аминокислот, находящихся в непосредственной близости к кластеру. Эти сигналы не были детектированы в стандартных двухмерных спектрах.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Дикий, Александр Игоревич

5.ВЫВОДЫ

1. Разработан протокол для получения структур парамагнитных металлобелков в растворе с помощью ЯМР и с его использованием определены трехмерные структуры высокого разрешения следующих белков: высокопотенциальный железосерный белок (HiPIP) из Chr. vinosum в восстановленной [15,16,18] и окисленной [15,17,18] формах, С778-мутант данного белка в восстановленной форме [21], окисленный цитохром сцз из Bacillus pastewii [30,35], окисленный пластоцианин из Synechocystis sp. РСС 6803 [37,38]. Проведен сравнительный анализ между полученными структурами белков в различных окислительно-восстановительных состояниях и между структурами в растворе и в твердом состоянии. Найдено, что конформации белков не претерпевают значительных изменений при изменении редокс и фазового состояний. Однако, сравниваемые структуры, при общем принципиальном сходстве конформации, демонстрируют реальные значимые различия. Проведенный анализ позволил выявить данные структурные различия.

2. Разработана новая последовательность ЯМР импульсов, названная NOE-NOESY, для детектирования диполярных взаимодействий между быстро релаксирующими протонами в парамагнитных белках [9,10]. Данная последовательность существенно облегчает интерпретацию ЯМР спектров парамагнитных систем, поскольку позволяет селективно изучать диполярные взаимодействия между протонами, находящимися в непосредственной близости (<5А) от протона, сигнал которого сдвинут вне диамагнитной зоны ПМР спектра. Детектирование таких взаимодействий имеет первостепенное значение для определения структур высокого разрешения парамагнитных белков.

3. Изучено распределение неподеленной электронной плотности в [4Fe-4S] кластере высокопотенциальных белков, выделенных из фотосинтетических бактерий. Информация по распределению электронной плотности была получена путем ЯМР исследований 4Fe-4Se производных HiPIP из Chr. vinosum и Ectothiorhodospira halophila [8,11,14], а также Cys77Ser-MyraHia HiPIP из Chr. vinosum [20,24]. ЯМР спектроскопия позволила наблюдать изменения магнитного взаимодействия в [4Fe-4Х] кластере, обусловленные заменой S/Se, определить константы такого взаимодействия и сравнить такие характеристики в нативном (S) и модифицированном (Se) белках. Я.МР исследования Cys77Ser варианта HiPIP из Chr. vinosum позволили расширить существующую ранее модель распределения электронной плотности в [4Fe-4S] кластере и позволяют оценить значения окислительно-восстановительного микропотенциала каждого иона железа внутри [4Fe-4S] кластера в высокопотенциальных железосерных белках.

4. ЯМР исследования 7Fe-8S ферредоксина, выделенного из Rhodopseudomonas palustris, привели к определению новой модели магнитного взаимодействия в этом классе белков [23,26]. Анализ распределения ПМР сигналов, соответствующих цистеиновым остаткам, координирующих [3Fe-4S] кластер как в 3Fe-4S, так и в 7Fe-8S ферредоксинах, позволил найти корреляцию между упомянутым распределением сигналов и первичной структурой данных белков.

5. Низкоспиновые цитохромы с (цитохром С551 из Rhodocyclus gelatinosus [12], цитохром cm из Bacilluspasteurii [28,30], цитохром С( из Cladophora glomerata [29], цитохром с из метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha [39]), а также Arg48Glu-MyTaHT рекомбинантной дрожжевой пероксидазы с [13,25] были охарактеризованы методом ЯМР спектроскопии. Изучение pH- и температурной зависимостей ПМР спектров позволило: определить рКа значения белков, обнаружить различные формы белков при разных значениях pH, предположить структурные и конформационные изменения происходящие с данными белками при изменении pH и температуры. Из полученных данных были определены кинетические [13,25] и термодинамические [28,30] характеристики систем.

6. Результаты ЯМР исследования восстановленного высокоспинового цитохрома с (S=2) из Rhodopseudomonas palustris позволили объяснить закономерносп распределения электронной плотности по активному центру белка [27,31]. Был< показано, что ориентация аксиального гистидина по отношению к порфириновом) кольцу определяет специфическое распределение электронной плотности t активном центре и обуславливает характеристическое распределение ПМР сигналоЕ в данной системе.

7. Окисленные пластоцианины, выделенные из листьев шпината [32,33,34] и Synechocystis sp. РСС 6803 [37,38], были охарактеризованы с помощью парамагнитного ЯМР высокого разрешения (800 МГц). Изучение обменных ПМР взаимодействий между окисленной и восстановленной формами белков позволило определить константы скорости внутримолекулярного переноса электрона. Все протоновые сигналы, относящиеся к лигандам иона меди (цистеин, метионин и два гистидина) были впервые обнаружены ПМР методами. Сигналы протонов ß-СИг цистеина, имеющие ширину сигналов 330-520 КГц и недетектирующихся в обычном ПМР спектре, были обнаружены с помощью специально разработанного метода. Полученные данные позволили впервые полностью определить электронную структуру данного класса белков в условиях близких к физиологическим.

8. 2,2',3-тригидроксибифенил диоксигеназа из Sphingomonas sp. RW1, содержащая в своем активном центре высокоспиновый ион Fe(II) (S=2), была исследована с помощью парамагнитной спектроскопии ЯМР [19]. Данным методом было изучено взаимодействие белка с субстратом (2,3-дигидроксибифенил). Проведенные эксперименты позволили получить информацию о структуре активного центра молекулы, о кинетике и динамике взаимодействия фермента с субстратом. Данное исследование представляет собой первый пример использования ЯМР для изучения этого класса белков.

9. ПМР спектроскопия использовалась для изучения парамагнитных сэндвичевых комплексов с ионами Yb, Dy и Lu [22, 36]. Определены динамические, термодинамические и магнитные свойства исследованных систем. Полученные результаты позволили установить различия структурных и динамических характеристик данных комплексов в растворе и в твердом состоянии.

Приведенные результаты исследований опубликованы в работах, перечисленных ниже.

6. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. А. Дикий, А. Яцимирский, "Механизм восстановления гемина под действием железосерных кластеров", Тезисы докладов конференции молодых ученых химического факультета МГУ, Москва (1989), 125-128.

2. А. Дикий, А. Яцимирский, "Изучение взаимодействия железосерного кластера с гемином", Тезисы докладов II симпозиума "Кинетика переноса заряда в гомогенных и гетерогенных системах", Батуми (1989), 37-38.

3. A. Dikiy, A. Yatsimirsky, "Cleavage of activated esters in the presence of iron-sulfur cluster", The proceedings of Vllth International conference of young scientists on organic and biological chemistry, Sofia, Bulgaria (1990), 195-197.

4. А. Дикий, А. Яцимирский, "Расщепление активированных сложных эфиров железосерным кластером", Тезисы докладов научно-теоретической конференции "Экология окружающей среды", Ташкент (1990), 63-64. —

5. A. Yatsimirsky, A. Dikiy, "Catalytic hydrolysis of aryl esters by an iron-sulfur cluster", Inorg. Chim. Acta, 186 (1991), 161-163. ~

6. А. Дикий, А. Яцимирский, "Кинетика каталитического гидролиза сложных эфиров в присутствии железо-серных кластеров", Кинетика и Катализ, 33 (1992), N 56, 1080-1086.

7. A. Dikiy, A. Yatsimirsky, "New aspects of iron-sulfur cluster chemistry", The proceedings of Illrd Eurasia conference on chemical sciences (EuAsCS), Bangkok, Thailand (1992), 274.

8. I. Bertini, S. Ciurli, A. Dikiy, C. Luchinat "Isolation and physico-chemical characterization of the Se-derivatives of high potential iron-sulfur proteins", The proceedings of international conference "Bioinorganic and biotechnological aspects of the environmental chemistry", Florence, Italy (1992), 36.

9. I. Bertini, A. Dikiy, C. Luchinat, M. Piccioli, D. Tarchi, "NOE-NOESY: a further! tool in NMR of paramagnetic metalloproteins", J. Magn. Resonance, Ser. B, 103 (1993), 278- j 283. ~~

10. L. Banci, I. Bertini, A. Dikiy, C. Luchinat, M. Piccioli, R. Pierattelli, D. Tarchi "New NMR pulse sequence for investigation of paramagnetic biological systems", 77k proceedings of Vth Chianti Workshop on Magnetic Resonance "Nuclear and Electron Relaxation", San-Miniato, Italy (1993), 3.

11. I. Bertini, S. Ciurli, A. Dikiy, C. Luchinat, "The electronic structure of the [4Fe-4Se]-'+ clusters in Chromatium vinosum HiPIP and Ectothiorhodospira halophila HiPIP II through NMR and EPR studies", J. Am. Chem. Soc., 115(1993), 12020-12028.

12. L. Banci, I. Bertini, M. T. Cambria, F. Capozzi, A. Dikiy, "1h ID and 2D studies of cytochrome c from Rhodocyclus gelatinosus", Eur. J. Biochem., 219 (1994), 663-669.

13. L. Banci, I. Bertini, A. Dikiy, P. Turano, J. C. Ferrer, A. G. Mauk "Proximal and distal site mutants of cytochrome c peroxidase", The proceedings of international conference EUROBICII "Metal Ions in Biological Systems ", Florence, Italy (1994), 20.

14. L. Banci, A, Battistuzzi, I. Bertini, M. Borsari, F. Capozzi, S. Ciurli, A. Dikiy, S. Ferretti, C. Luchinat, M. Piccioli, R. Pierattelli, M. Sola "The electronic structure of Fe4S4 clusters", The proceedings of International workshop on iron-sulfur proteins "New Structures and Unexpected Functions", Konstanz, Germany (1994), 33.

15. I. Bertini, A. Dikiy, C. Luchinat, P. Sompornpisut, "Complete 'H and 15N resonance assignments in the NMR spectra of reduced and oxidized HiPIP from Chr. vinosum", The proceedings of International workshop on iron-sulfur proteins "New Structures and Unexpected Functions", Konstanz, Germany (1994), 35.

16. L. Banci, I. Bertini, A. Dikiy, D. Kastrau, C. Luchinat, P. Sompornpisut, "The three-dimensional solution structure of the reduced high potential iron-sulfur protein from Chromatium vinosum through NMR", Biochemistry. 34 (1995), 206-219. f 17. I. Bertini, A. Dikiy, D. Kastrau, C. Luchinat, P. Sompornpisut, "The three-dimensional solution structure of the oxidized high potential iron-sulfur protein from Chromatium vinosum through NMR. Comparatvie analysis with the structure of the reduced species", Biochemistry, 34 (1995), 9851-9858.

18. L. Banci, I. Bertini, A. Dikiy, I. Felli, D. Kastrau, C. Luchinat, M. Piccioli, P. Sompornpisut, "Determination of the solution structures of highly paramagnetic metalloproteins: high potential iron-sulfur proteins (HiPIP) in reduced and oxidized form", The proceedings of Vlth Chianti Workshop on Magnetic Resonance "Nuclear and Electron Relaxation", San-Miniato, Italy (1995), 42.

19. I. Bertini, F. Capozzi, A. Dikiy, B. Happe, C. Luchinat, K.N. Timmis, "Evidence of histidine coordination to the catalytic ferrous ion in the ring-cleaving 2,2'3- | 2 trihydroxybiphenyl dioxygenase from the dibenzofuran-degrading bacterium Sphingomonas \ sp strain RW\", Biochem. Biophys. Res. Commun. 215(1995), 855-860.

20. E. Babini, I. Bertini, M. Borsari, F, Capozzi, A. Dikiy, L.D. Eltis, C. Luchinat, "A J 3 Serine-^Cysteine ligand mutation in the high potential iron-sulfur protein from Chromatium \ vinosum provides insight into the electronic structure of the [4Fe-4S] cluster", J. Am. Chem. J Soc., 118 (1996), 75-80.

21. D. Bentrop, I. Bertini, F. Capozzi, A. Dikiy, L.D. Eltis, C. Luchinat, "The three ] dimensional structure of the reduced C77S mutant of the Chromatium vinosum high potential I ^ Q iron-sulfur protein through NMR. Comparison with the solution structure of the wild-type \ protein", Biochemistry. 35 (1996), 5928-5936. —''

22. I. Bertini, A. Coutsolelos, A. Dikiy, C. Luchinat, G. Spyroulias, A. Troganis, T "Structural and dynamic information on double-decker Yb^+ and Dy3+ porphyrin complexes \ A ■'"■ in solution through !h NMR", Inorg. Chem., 35 (1996), 6308-6315. —

23. I. Bertini, A. Dikiy, C. Luchinat, R. Macinai, M. S. Viezzoli, "NMR characterization of ferredoxin from Rhodopseudomonas palustris: new model of exchange coupling in [7Fe-8S] clusters", The proceedings of Vllth Chianti Workshop on Magnetic Resonance "Nuclear and Electron Relaxation", San-Miniato, Italy (1997), 123.

24. I. Bertini, M. Borsari, F. Capozzi, A. Dikiy, C. Luchinat, "Investigation of the electronic structure of high potential iron-sulfur proteins: equilibrium between two species in oxidized [4Fe-4S] cluster", The proceedings of Vllth Chianti Workshop on Magnetic Resonance "Nuclear and Electron Relaxation". San-Miniato, Italy (1997), 139.

25. J. Bujons, A. Dikiy, J.C. Ferrer, L. Banci, A.G. Mauk, "Charge reversal of a 1 { critical active site residue of cytochrome-c peroxidase. Characterization of the Arg48->Glu variant", Eur. J. Biochem., 243 (1997), 72-84. —1

26.1. Bertini, A. Dikiy, C. Luchinat, R. Macinai, M. S. Viezzoli, M. Vincenzini, "An \ NMR study of the [7Fe-8S] ferredoxin from Rhodopseudomonas palustris and reinterpretation of data on similar systems", Biochemistry, 36 (1997), 3570-3579.

27.1. Bertini, A. Dikiy, C. Luchinat, R. Macinai, M. S. Viezzoli, "An extensive NMR study of the reduced cytochrome c' from Rhodopseudomonas palustris", Inorg. Chem., 37 J (1998), 4814-4821. A

28. S. Benini, M. Borsari, S. Ciurli, A. Dikiy, M. Lamborghini, "Modulation oi ^ \Bacillus pasteurii cytochrome c-553 reduction potential by structural and solution )arameters", J. Biol Inorg. Chem., 3 (1998), 371-382. T~~ 29. N. Safarov, R. Agalarov, M. Isaev, A. Dikiy, R. Gasanov, "Isolation and spectroscopic characterization of cytochrome c« from Cladophora glomerata", in "Progress in Botanical Research", 1998, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, p.235-238.

30. S. Benini, M. Borsari, S. Ciurli, A, Dikiy, M. Lamborghini, W.R. Rypniewski, K.S. Wilson, "Structure and function of Bacillus pasteurii cytochtome c553", The proceedings of XXXI11 International Conference on Coordination Chemistry (ICCC), Florence, Italy (1998), 227.

31. M.S. Viezzoli, I. Bertini, A. Dikiy, C. Luchinat,"A 'H NMR study of the reduced cytochrome c' from Rhodopseudomonas palustris containing a high spin iron (II) heme moiety", The proceedings of XXXI11 International Conference on Coordination Chemistry (ICCC), Florence, Italy (1998), 325.

32. I. Bertini, S. Ciurli, A. Dikiy, R. Gasanov, C. Luchinat, G. Martini, N. Safarov, /1 C "High-field NMR studies of oxidized blue copper proteins: the case of spinach plastocyanin", T ¡k C > J Am. Chem. Soc., 121 (1999), 2037-2046.

33. R. Agalarov, I. Bertini, S. Ciurli, A. Dikiy. R. Gasanov, C. Luchinat, G. Martini, N. Safarov, "High-field NMR studies of spinach plastocyanin", The proceedings of Illrd International conference on molecular structural biology, Vienna, Austria (1999), 49.

34. I. Bertini, S. Ciurli, A. Dikiy, C. Luchinat, "New NMR technique for detection of extremely broad hyperfine shifted signals", The proceedings of VHIth Chianti Workshop on Magnetic Resonance "Nuclear and Electron Relaxation", San-Miniato, Italy (1999), 108.

35. S. Benini, S, Ciurli, A. Dikiy, "Structural and functional studies of low-spin cytochrome c553 from Bacillus pasteurii", The proceedings of 1st SAPIO NMR conference, Bologna, Italy (1999). f~ 36. S. Babailov, A. Coutsolelos, A, Dikiy, G. Spyroulias, "Intramolecular dynamics of >. j asymmetric lanthanide (III) porphyrin sandwich-comlexes in solution", Eur. J. Inorg. Chem.,

J 2000, 3101-3105.

37. I. Bertini, S. Ciurli, A. Dikiy, C. Fernandez, C. Luchinat, N. Safarov, S. Shumilin, '"Studio di proteine blue con la risonanza magnetica nucleare", The proceedings of XXth congress of Italian Chemical Society, Rimini, Italy (2000), 298.

38. I. Bertini, S. Ciurli, A. Dikiy, C. Fernandez, C. Luchinat, N. Safarov, S. Shumilin, A. Vila, "Breakthrough in NMR characterisation of blue-copper proteins: chemical and electronic structure of plastocyanins", The proceedings of XlXth International conference on Magnetic Resonance in Biological Systems, Florence, Italy (2000), 410.

39. M. Borsari, E. Dikaya, A. Dikiy, M. Gonchar, R. Pierattelli, A. Sibirny, "Isolation j

1 A \ and physico-chemical characterization of the cytochrome c from methylotrophic yeast | "-1°

Hansenulapolymorpha", Biochem. Biophys. Acta, 2000 1543(1), 174-188. s

Отпечатано на ризографе вОНТИГЕОХИРАН Заказ № 24 Тираж /зо экз.