Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение взаимодействия субстратов с цитохромом Р-450 методом оптической и 1 Н-ЯМР спектроскопии
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Изучение взаимодействия субстратов с цитохромом Р-450 методом оптической и 1 Н-ЯМР спектроскопии"
РГ8 С^
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ~ ' : ; : " ' СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ
На правах рукописи УДК 577.152.1'136.088.5
Вольдман Яков Юрьевич
ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ СУБСТРАТОВ С ЦИТОХРОМОМ Р-450 МЕТОДОМ ОПТИЧЕСКОЙ И ^-ЯМР СПЕКТРОСКОПИИ
03.00.04 — Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Новосибирск — 1993 г.
Работа выполнена в Институте химической кинетики и горения СО РАН и Институте молекулярной патологии и экологической биохимии СО РАМН.
Научные руководители: кандидат химических наук Л. М. Вайнер,
доктор биологических наук, чл.-корр. РАМН В. В. Ляхович Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор
Ведувая организация: Институт биомедицинской химии РАМН, г. Москва.
на заседании специализированного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8.
С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.
Автореферат разослан и февраля 1993 года.
Ученый секретарь специализированного совета,
0. И. Яаврик
кандидат биологических наук С. П. Коваленко
Завита состоится 1993 года в ^
кандидат химических наук
0. С. Федорова
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблема. Интерес к проблемам, связанным с цито-хромон Р-450 обусловлен, в частности, осознанием его роли в химическом канцерогенезе и метаболизме лекарственных вецеств, а в последние годи - е»е и тем, что к этому хе классу относятся простагландин - синтетаза и но- синтетаза - ферменты, исследование которых развернулось в самое последнее время. Кроме того, привлекает иехднсциплинарннЯ характер возникавших проблем, за-трагиващих области от бионеорганической химии до генетики. Поскольку одним из вахяых свойств цитохрома Р-450 является разнообразие окисляемых им органических молекул, естественен вопрос о механизме взаимодействия этого фермента с субстратами и структуре фермент-субстратного комплекса: именно она определяет скорость окисления конкретного соединения. В данном случав для изучения структуры удобно использовать метод ЯМР, так как в активном центре цитохрома Р-450 имеется естественная парамагнитная метка - ион Fe3+. Этим хе методом удается определить и некоторые кинетические характеристики фермент-субстратного взаимодействия и сравнить их с данными, полученными другими методами.
Целью работы являлось получение кинетической и структурной информации о комплексах различных изоформ цитохрома Р-450 с субстратами.
Научная новизна работы состоит в том, что впервые последовательно изучены комплексы нескольких изоформ Р-450 с субстратами методами оптической и ЯМР-спектроскопии, что позволило сделать внводы о структуре этих комплексов; рассмотрены ограничения
применявшегося ранее подхода для выделения парамагнитного ккиа-да в скорость релаксации и предложен новый подход, основанный иа зависимости скорости релаксации от концентрации субстрата в присутствии парамагнитного белка; кроме того, изучены комплексы с энзиматически неактивной формой цитохрома Р-450 Ст. наз. "ци-тохромом Р-420") и миоглобином.
Основными результатами работы является геометрическая информация о расположении субстратов относительно иона железа в активном центре Р-450 и кинетические данные для комплексов P-4S0-субстрат.
Публикации х апробация работа. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, получено два свидетельства на рацпредложения. Отдельные результаты работы были представлены на Всесоозных симпозиумах: "Цитохром Р-450: структура и функции" (Минск, 1982), "Цитохром Р-450 и охрана внутренней среды человека" (Москва, 1985), "Цитохром Р-450 и охрана окружавшей среды" (Новосибирск, 1987), "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул" (Ялта, 1989); на международных конференциях "Цитохром Р-450: биохимия и биофизика" в Куопио (Финляндия, 1982), Вене (Австрия, 1988), Москве (СССР, 1991); на 16-ом Конгрессе ФЕБО (Москва, 1984), 2-ом Симпозиуме по ферментным системам метаболизма лекарств (Варна, 1989), 9-ом международном симпозиуме "Микросомы и окисление лекарств" (Иерусалим, 1992). Обьеи И структура работы. Диссертация изложена на 135 страницах, содержит 24 таблицы, 29 рисунков, состоит из введения, трех глав, выводов, благодарностей, списка литературы из 159 наименований. Первая глава посвяцена обзору литературы, причем автор не ставил себе цель охватить все работы в данной области
и
Спо данным К. Рвкпауля, около 10000 статей только за 19791989г), а скорее выявить основные направления развития и "белые пятна" в физико-химическом аспекте проблемы цитохрома Р-450. Вторая глава содерхит описание экспериментальны* методов. В третьей главе изложены полученные автором результаты и их об-сухдение. Основная часть результатов опубликована в работах, приведенных в конце автореферата.
2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Для исследования были выбраны субстраты: аминопирин, 4-метоксипиридин и ацетанилид. Кроме того, некоторые эксперименты проводились с 3,5-лутидином (3,5-лиметилпиридин), метирапоном (2-метил,1,2-ди-3-пиридил-1-пропанон)', бензфетамином.
2.1. Вэаимодейстивие цитохрома Р-450 с аминопирином
Для изучения взаимодействия цитохрома Р-450 с аминопирином использовали фракцию цитохрома Р-450 из печени крыс, индуцированных фенобарбиталом, содерхацую в основном Р-450ь. Аминопирин 4 дает с этим препаратом Р-450 спектры связывания 1 типа со спектральной константой (К3) от 5 до 10 мМ. Протонный ЯМР-спектр аминопирина в растворе представляет собой три метильных синглета С 6=1.6, 2.0, 2.5 м.д.) и фенйлъный мультиплет С баб. 8 м.д.). Для выделения парамагнитного вклада в скорость релаксации обычно проводят измерения протонов субстрата в лрисутс-твии парамагнитной (Ре "О и диамагнитной (Ее - СО) формы белка. Разность соответствуввих скоростей полагает равной парамагнитному вкладу:
Т1р 1= Т1Р450ох 1 " Т1Р450гес1-СО 1 а:>
Здесь - парамагнитный вклад в скорость релаксации
соответствувмй группы протонов аминопирина, 1*1 Р450ох " в1)ем" релаксации в присутствии окисленного Р-450; Т1Р450гес1-С0 ~ врй" мя релаксации в присутствии комплекса восстановленного Р-450 с СО. Результаты измерений на всех линиях аминопирина приведены в таблице 1.
Таблица 1
Группа 1/Т,, с-1
р"450ох р"450ге<1-со 1/Т1р
ню 0,134*0,001 0,084915,5-10"4 0.049*0,0011
с-СН3 1,285*0,015 1,099±0,015 0,186±0,021
НССН3)2 1,445*0,010 1,248±0,0085 О,197±0,013
И-СН3 1,092*0,014 0,974±0,0079 0,118*0.016
РЬ 0,94210,036 0,738±0,034 0,204±0,050
[Р450] = 48 (Л, [аминопирин]= 0,06 М, К- фосфатный ¡>¿0 - буфер, рН 7,4, темп 21°С.
Таблица 2
Группа 1/Т}, с"1
Р420ох мгогвЧ-со 1/Т1о 1/Т1рприведенн.*
№<э 0 ,19710,0038 0,1691Й,0036 0.028*0,005 0,024*0,004
с-сн3 1,395*0,027 1,248*0,041 0,147*0,049 0.125*0,042
М(СН3)2 мссн3) РЬ 1 531*0,019 1,435*0,035 0,096*0,040 0,083*0,034
1 290*0,022 1,164*0,027 0,126*0,035 0.108*0,030
1 021*0,010 0.859*0,046 0,162±0,047 0.139*0.040
* Приведенные к [Р420]= 48 рМ
СР4 2 0 3=36 /Л , [аминопирин]=0,06М; 7М мочевина, К - фосфатный ю20 - буфер рН 7,4, температура 21 °С
Аналогичные эксперименты были проведены в присутствии мочевины С7М), которая полностью разрушает третичную структуру белка. Результаты приведены в таблице 2. Как видно из сравнения таблиц 1 и 2, парамагнитные вклады в присутствии мочевины остаются до-
б
статочно большими. Это означает, что не весь парамагнитный вклад связан с образованием специфического фермент-субстратного комплекса, т. е. этот вклад содержит суиестве.чнув неспецйфичес-кую часть, которая может объясняться, например, сорбцией на гидрофобной поверхности фермента и внешнесферной релаксацией. Таким образом, приведенный метод выделения парамагнитного вклада в этом случае не дает количественной структурной информации. Кроме того, для вычисления мольной доли субстрата в комплексе независимо должна быть определена константа конплексообразова-ния фермент- субстрат. Другой подход к выделение парамагнитного вклада в скорость релаксации состоит в следующем. Скорость продольной релаксации протонов свободного субстрата в растворе, содержащем фермент, с которым данный субстрат образует комплекс будет:
1/ТЮЬ3 = 1/Т1Ч + с/СТ1м+т> (2)
где Т - наблюдаемая скорость продольной релаксации прото-
нов субстрата; Т^1- скорость релаксации, обусловленная всеми взаимодействиями, за исключением комплексообразования фермент -субстрат; а - мольная доля комплекса в растворе; Т1М иг-время продольной релаксации и время жизни субстрата в комплексе. Б свое очередь
а = Р/СКц + Б) СЗ)
где Р - концентрация фермента в растворе; Кр- константа диссоциации комплекса и э - концентрация субстрата. Объединяя уравнения (2) и (3), получаем:
р 1
1/Тюьз = 1/Т1«1 + * ТГ+"ЁГ
1М 1)
Из уравнения (4) следует, что зависимость от э содержит
в качестве неизвестных параметров Т^ , Р/"(Т1М + с) и Кп; оцен-
ки этих параметров мохно получить, анализируя зависимость Т^ от 5 по методу наименьших квадратов.
Для обоснования вышеизлохенного подхода были проведены следующие контрольные эксперименты.
1. Измерение скорости продольной релаксации протонов аминопири-на в зависимости от его концентрации в отсутствие цитрохрома Р450 показало, что в широком диапазоне концентраций эта скорость меняется незначительно, кроме того, направление этого изменения противополохно тому, что ожидается из-за комплексообра-зования.
2. Т1оЬз ряда небольших органических молекул, не являицихся субстратами цитохрома Р450 либо не меняется, либо увеличивается ■ с. уменьшением их концентрации в присутствии цитохрома Р-450 (табл. 3). Это свидетельствует об отсутствии комплексообразова-ния с цитохромом Р450, а такхе каких-либо других факторов, которые могли бы имитировать эффект комплексообразования.
Таблица 3
Т1оЬз
^бутанол уксусная тетраметил трис-окси диоксан концентр кислота аммонний метиламино
бромид метан
0,1 М 1,59±0,11 4,30±0,20 0.01М 1.5310.07 4.25*0.11 0.001М 2,28±0,79 5,2±1,4
5,64±0,41 0,64±0,03 3,12±0,59 6,2610,44 0,8010,034 2,55±0,?.0
СР4503 = 60 (Я, темп = 21 °С. К - фосфатный 1>г0 - буфер, рНо1)8 7,5
3. Для моделирования неспецифической сорбции использовали вещество, близкое по гидрофобным свойствам к аминопирину, а именно - формилфенилаланин. Формилфенилаланин не образует комплексов с цитохромом Р450 С по данным оптической спектроскопии), при
этом отсутствует и концентрационная зависимость наблпдаемого
времени релаксации в присутствии цитрохрома Р450. Из зависимостей скорости релаксации протонов -аминопирина от
концентрации в присутствии цитрохрома Р450 оценивали параметры, приведенные в таблице 4.
Таблица 4
с-сн, ncch35 ncch,), ph
Темп, пара-_(К)___метры_
ncch3)2
Г"1
Id'
Hz
287 СТ1м+т) \
к„. М
rld. Hz 294 СТ1м+т)-1,
№
Hz
KD. к
1,38±0,013 123±1 3 0,020
1,2840.014 62^10 0,013
1,55±0,17 1,38±0,0S 1,02±0,03
230±! 70 70±52 ■ 168±30
1,37±0,013 1,08±0,02 0,93±0,03
128±10 131 ±14 136*25
Зависимость полученных параметров от температуры говорит о том, что для всех групп аминопирина реализуется ситуация быстрого либо промежуточного обмена. Проведенный в работе анализ показывает, что полученные значения Т1М имеют парамагнитную природу и, следовательно, могут быть подставлены в уравнение Соломона-Бломбергена (5) для расчета расстояний от всех наблюдаемых в спектре ЯМР групп протонов субстрата до парамагнитного центра, при условии, что известны все остальные параметры.
>&¥[ Зтс + 7хс
[ГТ^ТТ7 TTZ7Z
+ 2SCS+15А2 V
3ti 1 + usre
i = ascs+n.^^^ т1М Ь + +
уравнение 5
Эти параметры: электронное спиновое число, время корреляции, константа сверхтонкого взаимодействия. На основании литературных данных в работе приняты следующие их значения:
1. Суммарный электронный спин равен 1/2.
2. Время корреляции гс=5-10~*® с {определено для низкослинового цитохрома Р450 ИЗ УоеиЛтотшз ГиШа).
3. Вклад сверхтонкого взаимодействия в скорость релаксации равен 0,05 - 0,2 Нг для ближайших протонов; таким образом, скалярный член (второе слагаемое ур-я 5) при расчетах может быть отброшен.
Используя указанные параметры получаем расстояния около 8А для всех групп аминопирина.
Каким образом происходит реакция между аминопирином и активным центром СГе+^) при расстоянии 8А между ними? Скорее всего, это объясняется тем, что мы наблюдаем в ЯМР первую ступень многостадийного процесса комплексообразования:
Е + 5 Е2* <=? ЕБ** и т.д. С6)
Увидеть остальные стадии не позволяет слишком длинное время жизни комплексов. Этим же можно объяснить и различие констант диссоциации комплексов, полученных из оптических и ЯМР измерений, а именно: оптическая КБ относится к наиболее прочному, долгоживунему комплексу, а Кв полученная из измерений релаксации относится к комплексу с наименьшим временем жизии, т.к. именно для него величина {Т1М + т ) * оказывается максимальной.
2.2. Взаимодействие аминопирина с другими изоформами цитохрома
Р450
Было исследовано взаимодействие аминопирина с фенобарбитал - индуцируемой формой цитохрома Р450 из печени кролика ПЯ,). Фермент для этих экспериментов был выделен в лаборатории профессора А. И. Арчакова, НИИ Физико-Химической Медицины, г.Москва. Эксперименты по измерению Т. аминопирина в присутствии гл'~
Ю
казали слабую зависимость ^ от концентрации аминопирина, сравнимую с ошибкой определения Т|. Поэтому в данном случае можно дать лишь верхнои оценку времени гизни такого комплекса, г а 50 тс. Однако при этом Се случае медленного обмена) оказывается возможным оценить такой важный кинетический параметр, как прямую константу комплексообразования. Анализ, проведенный в работе показывает, что разность наблвдаемых значений Т^ при концентрации субстрата в=0 и 5=®, которуи мы будем называть размахом, равна Р-к,/( (^д/т + 1), а в случае медленного оо'мена, то есть
Т1М/ г « 1 С7)
размах равен Р-к^. Данные для комплексов аминопирина и ьм^ представлены в табл. 5. Поскольку концентрация субстрата фактически не равна нули или бесконечности, эти значения являются нижней оценкой.
Таблица 5
Темп, К
разигл,
-СН0
КССНо)
Г 2
, 1)±г., о; П+2 1 " ■
282 - 0.14±0, ,'!э 15.!
288 0,14±0, 09 0,14*0.1 0,1 э±0 06 и, 30-Ю . У< Г 7, у
294 0,20*0,06 0,16*0,1 0.30-Ю.Х
300 0,15±0, 09 0,18±0, 07 0,13±0,1 Э,21±0,Г'3
- значение статистически недостоверно.
Полученные цифры согласуются с питеогтурныки. где зна<4ен>у kj для ряда субстратов 1 типа, определенные спектрофотометру. -чески, лежат в диапазоне 104-105 М^с"1. Некоторое уменьшение к, при 300 К связано, по-видимому, с размораживанием медленного обмена и нарушением условия (7)
2.4. Субстраты II типа.
В качестве субстрата II типа был выбран 4-метоксипириднн. Некоторые эксперименты были проведены с 3,5-лутиднном. 2.4.1. 4-метоксипиридин + Р450.
При связывании 4-метоксипиридина с суммарной фракцией ци-тохрома Р450 из печени крыс, индуцированных фенобарбиталом, возникает дифференциальный спектр II типа с Кч=4,5 п>М. Зависимость скорости релаксации протонов 4-МеОРу от концентрации Р450 указывает на более быструю релаксации «-протонов в присутствии Р450. Зависимость скорости релаксации ст концентрации 4-МеОРу позволяет вычислить (Т1И+г) в комплексе, а температурные зависимости Т1оЬд указывают, что г>>Т1М для «-протонов ("медленный обмен"). Учитывая, что время жизни в комплексе С с) должно быть одинаковым для всех групп одной молекулы, вычисляем Тгм для р и -ОСН^-групп (табл. 6). Этот же субстрат с электрофоретически гомогенными формами Р450Ь и ЬМ^ дает зависимости Т1оЬ,, оч концентрации Р450, 4МеОРу и-температуры качественно такие же. как для суммарной фракции, но величины (Т1М+т) 1 значительно меьыие (табл. 7) и близки для Р450Ь и ЬМ?.
Таблица ь
группа (Т1М +г) 1 ,Нг КН - ке+3). А
эксперимент * модель
0 - сн3 830±80 5. 3±0, 2 6.4
э - н 11 00±350 5,0±0, 5 Т. 1
« - Н 2800±600 <4.6 3. и
' - прямая координация 4-метоксипирилмн(Ю - Ке ". .¡¿испоить кольца пиридина перпендикулярна плоскости гема.
Параметры, полученные из зависимости Т] протонов 4-меОРу от концентрации 4-МеОРу в присутствии. Р450Ь и ьМ2 . . Значение ±СК0.
Р450Ь 1.М2
(X Р 0СН3 а 0 ОСН^
КдС шМ) 2, 8±0,8 2,2±0,6
^Т^+тГ1 (Нг) 215 96 60 390 150 64
х (тс) 2,9±0,5 2,6
Т1ч(тс) - 9,0 4,2 13.1
Ьг С А) >6,5 7,0 8,0 >6,4 6,9 8,4
гтоае1СА) 3, 1 5,1 6,4
a) СКО меньше 207» величины
b) СКО меньше 0,5 А
Расстояния, вычисленные по уравнению (5), приведены в табл. 6 и 7.
Для связывания субстратов второго типа общепринятым явлчечся предположение об их вхождении в качестве аксиального лиганда в первую сферу иона Ре , и эксперимент с суммарной фракцией >450 говорит в пользу этого. Однако расстояния, рассчитанные для комплексов 4-метоксипиридина с Р450Ь и (табл. 7), не (.-ответствует прямой координации 4-метоксилиридина с Р450, а говп-рят только о такой ориентации субстрата, при которой азот оказывается направлен к Абсолютные значения расстояний могут измениться, если мы примем другое значение г.,. Однако отнои>«.-.<(-^1МСН2/'''1Мр= Г^сн /г% не зависит от гс и равно 3,8 для прямой
координации при длине связи Ге - N 2А. Экспериментально найденные отношения равны 2,1 ±0,6 (Р450Ь) и 3,1 (I, что укаьньа-ет на отсутствие прямой координации в комплексах, наблюдаемых
методом ЯМР. Otí этом же говорит разница между значениями KD, полученными в оптических и ЯМР экспериментах, если считать, что наименьшая оптическая Ks соответствует комплексу с прямой координацией. Кроме того, оценка времени жизни комплексов с использованием констант, полученных спектрофотометрическим методом, дает г = l/CKskx) от 0,1 до 2 с. Столь долгоживуцие комплексы не могут проявлять себя при данных условиях ЯМР-эксперимента. Из рентгеноструктурных данных для Р450саш следует, что в отсутствии субстрата активный центр фермента занят кластером водо-родно-связанных молекул воды, одна из которых является аксиальным лигандом железа. Эти же данные показывает, что некоторые субстраты могут связываться в активном центре, не вытесняя из комплекса б" лиганд. При этом конкретные значения кинетических констант для данной формы могут привести к тому, что основной вклад в наблюдаемое в ЯМР ускорение релаксации может вносить либо комплекс с прямой координацией, либо с координацией через воду. Этим, скорее всего, объясняется различие данных, полученных для суммарной фракции P4S0 и электрофоретически гомогенных форм.
2.4.2. 3,5 - лутидин + Р450.
3,5 - лутидин при взаимодействии с Р450 LMg дает спектры связывания IX типа, = 426 нм, х^ = 408 нм, Ks = 1,80±0,08 мМ, М^аб.бгЮ.гЫО^см"1 С21°С, ам2]= 1,10. Температурные измерения скорости продольной релаксации протонов лутидина в присутствии Р450 указывают на парамагнитный характер наблюдаемого ускорения релаксации и на .медленный обмен, по крайней мере для о-протонов. При анализе концентрационных зависимостей скорости релаксации протонов лутидина в присутствии Р450 мы сталкиваемся
с тем, что теоретические кривые слабо зависят от значения Кп, поэтому можно указать только интервал значений для Кп, Т1М и. соответственно, расстояний (табл. 8).
Таблица «
Кс(тМ)
Ме
14
СТ1Н + т),
Т1М- с г, А
модель
(2,8-1,1) -10 (2,3+0,9) 10 6,3 + 5,4 5,6
-3
(2,6-1,25-10 (2,1 -0,9) ■ 10 ~ 6,2 + 5,4 5,9
-3
(4,6-2,4 ) -10
<4,7
3,0
7
сг
С
Полученные данные укладываются в модель прямой координации, однако, их большой разброс не позволяет сделать однозначные выводы.
2.5. Конкуренция субстратов.
Для подтверждения специфичности эффекта ускорения релакса- '
ции протонов субстрата ii типа в присутствии цитрохрома Р450 были проведены эксперименты по вытеснению субстрата (лутидина) из комплекса известным ингибитором микросомального окисления -метирапоном, имеющим высокое сродство к цитохрому Р450. Показано, что Т| всех групп лутидина возрастает при увеличении концентрации метирапона - т. е. молекула лутидина удаляется от парамагнитного иона, вытесняется из комплекса с Р450. Для количественного расчета предложена схема, аналогичная конкурентному механизму ингибирования. Проведенный расчет дает значения (Т1М+ х) для всех линий лутидина (таблица 9). Считая, как и раньше СТ1М * х)* г для а - протонов, получаем Т1М и, соответственно, расстояния до железа для СН3 и т -протонов. Эти расстояния, так же как и время жизни, г, отличается от полученных из данных для
комплексов Р450 - лутидин в отсутствие метирапона. По-видимому, это говорит о том, что комплексообразование лутидина и метира-пона с Р450 нельзя рассматривать, как чисто конкурентный п»о-цесс.
Таблица 9
СН
3
СТ1М+г), с (6,33±2,1Ы0
Чм Т1М> с г, с г, А
СЗ,91*2,2Ы0
6,93±0,65
-3 -3
(5,14±1,8Ы0 (2,72±2,0)х10" (г,42±Я,8)х10 6,52±0.8
(2,42±0,8) х! О"
-3
У
а
В диссертации приведены данные по вытеснению метираноном субстрата первого типа, бензфетамина. В то же время вытеснения бензфетамина яутмдином не происходит даже при значительно более высокой концентрации последнего Сдо 12 мМ). Очевидно, это связано с различием в размерах молекул лутидина и метирапона.
2.6. Взаимодействие субстрата II типа с гемином, цитохромом Р420 и миоглобином
Для выяснения особенностей комплексообразовання субстратов II типа с цитохромом Р450 в качестве моделей использовали гении, цитохром Р420 и метмиоглобин. Однако, при взаимодействии 4-метоксипиридина с гемином мы не смогли выйти из области медленного обмена для всех линий в спектре 4-метоксипиридина вплоть до температуры 70°С, поэтому в дальнейшем эта система не рассматривалась. Нерешенным вопросом является отличие строения активного центра цитохрома Р450 и его инактивированной формы Р420. Предполагается, в частности, что меркаптидный лиганд гема заменяется на гистидин при переходе Р450 - Р420. Цитохром Р420, полученный обработкой Р450 высокими концентрациями (6Ю мочеви-
ны, нс давал дифференциальных спектров сняэвания с 4-метоксипи-ридином. При добавлении. Р4Й0 к 4-метоксипнридину скорость релаксации протонов субстрата увеличивается, однако, отсутствует селективность, наблюдавшаяся для нативного Р450. Отсутствует, также зависимость Т^ от концентрации субстрата в присутствии Г420.
Для сравнения с цитохромами Р450 и Р420 проводились измерен,!я релаксации 4-метоксилиридина в присутствии метмиоглобина. Мио-гяобяя, как следует из оптических спектров сьязвания, дает непрочные комплексы с 4-метоксипиридином (КЧ=0,3!5М, дА =7,38-104М ^см Ъ. Концентрационная зависимость скорости релаксации протонов 4-метоксипиридина в присутствии метмиоглобина линейна, как и должно быть при К^'^э (уравнение 4). При повышении температуры скорость релаксации а-протонов резко возрастает, что свидетельствует о медленном обмене при Л96 К. Для метмиоглобина, вследствие низкой стабильности комплекса, оказывается возможным наблюдать >;о релаксации влияние компле-^ог г пряной координацией. Анализ полученных зависимостей с использованием литературных значений т позволяет рассчитать расстояния для комплекса миоглобнн - 4-метоксипиридин (табл. 14. Они хорошо согласуются с моделью прямой координации, если учесть, что плоскость пиридина должна располагаться под малым углом к плоскости тема, так как ориентации, характеризующиеся большими значениями углов стерически затруднены. При 'координации фторида в качестве шестого С аксиального'1 лиганда тема структура комплекса миоглобина с 4-метоксинир:{диком меняется-, причем наиболее быстро релаксируюьеЯ, т.е. ближайшей к 1-е становится ОСН^-группа субстрата
параметры 296 К 310 К
К„. И 0,18 0,21
огСН э-сн осн3 сг-СН е-сн осн3
(Т1М+г), мс 1,25 2,0 3,22 0,49 1,25 2,49
Т1М, мс - 0,75 1,97 - 0,73 2,0
г, А 4,2 5,0 4,1 5,0
* 1 г, А 2,9 3,9 4,9 2,9 3,9 4,9
*
Плоскость пиридинового кольца параллельна плоскости геыа/ атом азота пиридина расположен над атомом железа на расстоянии 2,0 А
Кроме того, температурная зависимость указывает на быстрый, либо промежуточный обмен для всех групп 4-метоксипиридина в таком комплексе. Это означает, что 4-метоксипиридин вытесняется фторидом из первой координационной сферы в результате время жизни комплекса уменьшается.
2.7. Комплексы цитрохрома Р450 с ацетанилидом в системах разного уровня интеграции.
Данная часть работы возникла из вопроса о том, на какой стадии каталитического цикла реализуется специфичность окисления субстратов различными изоформами цитохрома Р450. С этой цельв мы попытались сравнить функциональные и спектральные характеристики взаимодействия одного субстрата с двумя типами макросом и содержащимися в них основными изоформами Р450. В качестве субстрата был использован ацетанилид. Для сравнения выбраны Р450Ь и Р450с из печени крыс, и, соответственно, содержание их микросомы из животных, индуцированных фенобарбиталом и метилхолантреном. В двух использованных типах микросом происхо-
ли'!1 окисление ацетанилида до 4-гидроксиацетанилида. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата имела характер кривой с насыщением, полученные эффективные константа Михаэлиса (Км) и каталитическая константа (кр) в различных системах приведены в таблице 11 . Ацетанилид дает спектры связывания инвертированного 1 типа с обеими типами микросом, xMa)(=422 нм, хм1п=388 нм. Интересно отметить, что Кч, в отличие от К^. меньше для фенобарбиталовых микросом, при этом амплитуды, рассчитанные на моль Р450 близки. При переходе к гомогенным изофер-ментам для Р450ь максимальная амплитуда падает в 2 раза по сравнению с фенобарбиталовыми микросомами, а для Р450с - в двадцать раз, так что спектр связывания практически исчезает. При этом активно окисляет ацетанилид в реконструированной системе именно Р450с, для Р450ь же продукта окисления не обнаружено. Приведенные факта указывают на то, что наблюдаемый спектро-фотометрически комплекс является непродуктивным и не связан с окислением субстрата.
В случае Р450<"1 (не включен в таблицу) кроме основного продукта гидрокеилирования, 4-гидроксиацетанилида (мол. акт. 21 мин'') обнаружен и 3-гидроксиацетанилид (мол. акт. 4мин '), ни других изоформах этот продукт отсутствует в пределах чувствительности анализа.
В ЯМР-экспериментах для упроиения спектра использовали изотопно замещенный г.Д.б-^-ацетанилид. Его спектр содержит два узких синглета от метильных (5=2,15) и фенильных (5=7,4) протонов. В присутствии цитохромов Р-450Ь и Р450с наблюдаемое время продольной релаксации прогонов ацетанилидэ íTlotis), каг. л в случае других субстратов, зависело от концентрации ацетаяилида.
Кинетические константы окисления ацетанилида на микросомах и изолированных формах Р450, спектральные параметры комплексов ацетанилид-Р450 по данным оптической и ^-ЯМР-слектроскопии
фенобарби- таловые микросомы метилхолан треновые микросомы - Р450Ь Р450с
окисление
к£ (мин'Ь 3,8 8,5 <1 ,5 67
КмСшМ) 3,1 0,85 - 1, 0±0,26
спектры связвания (обращенный 1 тип) К3 СшМ) 0,58 1.8 1,4 0,74±0,25
£М СтМ^см"1) 48 36 22 1.8
ЯМР температура (К) 296 КдСтМ) 0,65±0,08 1,6*0,16
1/СТ1М+х)- •метил (Нг) 11348 321 ±19
1/СТ1М+т)- •фенил (Нг) 102±8 542±34
308 Кв(шМ) 2,1±0,24 1,55±0,23
1/(Т1м+т)- ■метил (Нг) 172±18 252±0,23
1/ст1М+о- -фенил (Нг) 151±17 484±39
Полученные параметры (табл. 11) указывают на быстрый обмен в случае Р450с. Это позволяет вычислить расстояния от в активном центре до соответствующей группы протонов субстрата на основании уравнения Соломона-Бломбергена Стабл. 1£). Расстояния практически совпадают для разных температур, что подтверждает незначительный вклад времени жизни в сумму СТ1М+г). Оценка энергии активации, связанной с температурной зависимостью Т1М, дает 2,7 ккал/моль, что близко к значению 3 ккал/моль, нолучен-
ному Филсоном и яр. Значения К() и ( позволят- вычислить прямун кинетическую константу скорости реакции комплексообразования; при 296К к: = С0,3 - 1 ,2) ■106М_,с"1.
Для Р450Ь наблюдаемая ширина в комплексе меньше, а зависимость Кс от температуры - круче. Для оценки можно предположить, что рост целиком связан с уменьшением времени жизни комплекса, что соответствует энергии активации 18 ккал/'моль Это гтозвояяет вычислить т, предполагая, что зависимость Т1М от температуры гораздо слабее. Такой подход дает: гзоз=1-4 мс' Т^=4,4 мс; Т^=5,2 мс; к^З-Ю^М^с"'. Вычисленные из этих данных расстояния от соответствующих протонов до иона Ге+^ в активном центре Р450 приведены в таблице 12-,
Таблица И
Расстояния от иона железа до протонов ацетанилида в комплексе
ацетанилид -Р450
изоформа расстояние (А) температлра (К)
фенил метил
Р450с 6,13 6,84 ЗОЙ
Р450с 6,10 6,66 296
Р450Ь 7, го 7,00
Стандартное отклонение меньше 0,1 А
Близкие цифры получены в работе \'ап По яи-а.-и к., а1 для комплексов парацетамола с изоформами Р450с и Р450Ь. Отмеченное авторами различие ориентации парацетамола в активных центрах Р450с и Р450Ь качественно совпадает с выводами нашей работы.
Суммируем отличия в структуре комплексов ацетанилида с цитохромом Р450Ь и Р450е:
1. Расстояние до иона железа в комплексе с Р450Ь больше. 2 Эти расстояния практически ке отличаются для мет:-л;ьных и фе-
нильных протонов ацетанилида в комплексе с Р450Ь и отличаются для Р450с •
3. Ближе к Fe+^ расположена именно та группа, по которой идет окисление, т.е. фенил.
Резкая зависимость эффективности окисления от расстояния может быть объяснена туннельным переносом атома водорода от субстрата к (Fe=0)+^. Таким образом, сопоставление структуры фермент-субстратного комплекса и каталитической активности разных изо-форм Р450 доказывает, что субстратная специфичность изоформ Р450 связана именно с геометрическими параметрами фермент-субстратного комплекса. v
ВЫВОДЫ
1. Показана возможность использования концентрационной закиси-кости скорости релаксации субстратов для изучения их комп-лексообразования с цитохромом Р-450 и получения структурной и кинетической информации об этих комплексах.
2. Выявлены следующие структурные и кинетические особенности комплексов:
а. Определены расстояния от иона Fe3+ в активном центре до различных групп аминопирина в комплексе с цитохромом Р-450 и кинетические константы для таких комплексов.
б. Обнаружена селективность в ускорении релаксации и разные условия обмена для разных групп субстрата 2го типа, предложена модель координации субстратов 2го типа.
в. Показана возможность наблюдения конкуренции между субстратами цитохрома Р-450 методом ЯМР.
г. Показано отсутствие комплексообразования между инактиви-
рованной формой цитохрома Р-450 Сцитохромом Р-420) и субстратами цитохрома Р-450.
3. Зафиксировано наличие комплексов с прямой координацией Ре3+-мСметоксипиридина) между метмиоглобином и 4-метоксипиридином, показано изменение структуры комплекса в присутствии фторид-иона.
4. Исследованы кинетические и структурные особенности комплексов ацетанилида с двумя изоформами цитохрома Р-450: Р450с и Р450Ь, показано отсутствие продуктов окисления на Р-450Ь, методом ЯМР выявлена различная структура комплексов с двумя изоформами, сделан вывод об отсутствии корреляции между спектрами связывания и метаболической активностью изоформы по отношению к данному, субстрату.
Список работ, опубликованных по тепе диссертации
1. Woldman Ya. Yu. , Weiner L. M. , Gulyaeva L. F., I.yakhovich
V. V. NMR study of the interaction of cytochrome P-450 with 4-met hoxypyr i d i ne.// FEES Lett. 198?. V.212. No. 1. IV 53-57.
2. Вольдман Я. Ю. , Гуляева Л. Ф. , Вайнер Л. М., Ляхович 3 В,
Изучение взаимодействия субстратов с цитохромом Р-450 методом УФ- и '
Вольдман, Яков Юрьевич
-
кандидата химических наук
-
Новосибирск, 1993
-
ВАК 03.00.04
- Индукция цитохром Р-450-зависимой монооксигеназной системы печени полностью фторированными органическими соединениями
- Структура и функция комплекса цитохрома c с кардиолипином
- Влияние модификации цитохрома Р-450 2В4 янтарным ангидридом на межмолекулярные взаимодействия в системе микросомальной моноксигеназы
- Масс-спектрометрическое определение активности и содержания цитохромов P450
- Молекулярные механизмы взаимодействия митохондриальных фосфолипидов с цитохромом c
