Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Распределение введенных в кровоток белковых препаратов при артериальной тромботической окклюзии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Матвеев, Максим Юрьевич, Москва

, * / л уку^ _ I/

^ м" / О / м

ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ КАРДИОЛОГИИ РОССИЙСКОГО КАРДИОЛОГИЧЕСКОГО НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОГО ЦЕНТРА МЗ РФ

на правах рукописи

МАТВЕЕВ МАКСИМ ЮРЬЕВИЧ

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ВВЕДЕННЫХ В КРОВОТОК БЕЛКОВЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРИ АРТЕРИАЛЬНОЙ ТРОМБОТИЧЕСКОЙ

ОККЛЮЗИИ

(03.00.04 - Биохимия; 03.00.13 - Физиология человека и животных)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических

наук

Научные руководители

к.б.н. с.н.с. к.м.н. с.н.с.

Домогатский С.П. Голубых В. Л.

Москва 1999 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 3

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 5

1. Краткие физические характеристики кровеносной системы. 5

2. Тромбообразование в артериях и венах. 8

3. Структура и свойства артериального и венозного тромбов. 10

4. Экспериментальные модели тромбозов. , 13

4.1. Модели артериальных тромбов. 13

4.2. Модели венозных тромбозов. 16

5. Биохимические характеристики основных тромболитических агентов. 17

6. Основные направления исследований, проводимых с целью повышения 21 эффективности тромболитической терапии.

7. Проницаемость фибринового геля и кровяного сгустка. 25

8. Биофизические характеристики тромболизиса. > . ; . 29 Заключение ■. л ■ ■ J2

ГЛАВА П МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 34

1. Реактивы. 34

2. Растворы 35

3. Методы исследования 36 3.1 Выделение и очистка моно- и поликлональных антител и приготовле- 36 ние иммуносорбентов.

3.2. Синтез конъюгатов антител. 37

3.3. Анализ эффективности применения химерных антител для лизиса 39 плазменного сгустка.

3.4. Иммуноферментная тест-система для количественного определения 40 урокиназы в плазме крови.

3.5. Определение скорости диффузии макромолекул в фибриновый гель и 41 в сгустки, образованные из плазмы и крови собаки.

3.6. Определение скорости фильтрации жидкости через обтурирующий 44 тромб сонной артерии кролика.

50

ГЛАВА Ш РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 51

1. Направленная доставка тромболитического агента к сгустку плазмы с 51 помощью конъюгата моноклональных антител против урокиназы и фибрина.

2. Определение скорости диффузии макромолекул в фибриновый гель ив 56 сгустки, образованные из плазмы и крови собаки.

3. Определение скорости фильтрации жидкости через обтурирующий 59 тромб сонной артерии кролика.

4. Определение интенсивности перемешивания крови в закупоренном уча- 60 стке артериального сосуда.

4.1. Эксперименты In Vivo 60

4.2. Эксперименты In Vitro 63

5. Распределение рекомбинантной проурокиназы в закупоренной сонной 65 артерии кролика.

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 69

1. Эффект направленной доставки тромболитика в сгусток плазмы. 69

2. Накопление макромолекул в кровяном сгустке in vitro. 70

3. Проницаемость артериального тромба in vivo. 72

4. Интенсивность перемешивания крови в закупоренном участке артери- 75 ального сосуда.

5. Распределение рекомбинантной проурокиназы в закупоренной сонной 81 артерии кролика.

ВЫВОДЫ 86

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 87

3.7. Определение интенсивности перемешивания в закупоренном участке артериального сосуда.

3.8. Распределение рекомбинантной проурокиназы в закупоренной сонной артерии кролика.

ВВЕДЕНИЕ

Предотвращение кровопотери при нарушении целостности кровеносного русла является основной биологической функцией тромбообразующей системы крови. В разных участках кровеносной системы существуют различные физические и биохимические условия, что приводит к различиям в механизмах образования тромба - основного фактора прекращения кровотока.

При патологическом развитии процесса тромбообразования, в частности, при возникновении обтурирующего тромба, происходит изменение параметров микро- и макроциркуляции крови. При этом включаются компенсаторные механизмы организма, приводящие к функциональным изменениям тромбообразующей и тромбо-литической систем крови. Последняя несет ответственность за своевременную очистку кровеносного русла от выполнивших свою роль тромбов.

Возникновение тромба в магистральном сосуде может привести к ишемии участка органа, за который ответственен пораженный сосуд, и, в дальнейшем, к потере у органа способности выполнять физиологическую функцию (инфаркт миокарда и мозга), а также к гангрене.

На сегодняшний день одним из самых эффективных приемов при лечении подобных заболеваний является применение тромболитических агентов (в частности, активаторов плазминогена), которые представляют собой белки с молекулярной массой 50 - 90 кД. Для повышения эффективности тромболизиса используют комплексы активаторов плазминогена с антителами к компонентам тромба. Молекулярный вес подобных комплексов составляет 200-300 кД. Также для определения бассейна тромбированного сосуда методом иммуносцинтиграфии используются меченые радиоактивной меткой антитела к компонентам тромба (мол. вес 150-170 кД).

Эффективность применения диагностических и тромболитических препаратов связана со скоростью их накопления на поверхности и в глубине тромба. Поэтому понимание механизмов распределения макромолекул (в частности, белков с мол. весом 50-300 кД) в зоне обтурирующего тромба имеет большое значение для разработки методов диагностики и лечения заболеваний, вызванных тромбозом магистральных сосудов.

В последнее время растет число публикаций, посвященных проблеме доставки макромолекул в тромб. В то же время большинство описанных до настоящего времени экспериментов было проведено на образованных in vitro кровяных сгустках. Структура таких сгустков отличается от встречающихся в клинической практике тромбов. Неосвещённым остается такой важный вопрос, как эффективность доставки макромолекул из круга кровообращения к поверхности тромба.

Картина происходящего в зоне артериального тромба невозможна без знания физических аспектов, ответственных за доставку (и вывод) биологически активных соединений, в частности белков, в зону (и из зоны) тромбоза. Распределение макромолекул между кровью и тромбом определяется способностью макромолекул проникать вглубь гелевой структуры тромба. Доступность внутренних структур тромба для белков крови может зависеть от линейных размеров белков, их зарядов и гид-рофобности, от размеров пор в структуре тромба, зарядов и гидрофобности структурных компонентов тромба. Скорость проникновения белков вглубь тромба может быть обусловлена также скоростью фильтрации плазмы крови через тромб и характеристиками потока крови на поверхности тромба.

Распределение белков между кровью и тромбом обусловливается скоростью перемешивания крови в участке сосуда между слоем жидкости на поверхности

тромба и системным кровотоком. Интенсивность этого перемешивания может определяться механическими характеристиками пораженного сосуда.

Нам представляется, что данные о распределении макромолекул могут иметь значение не только для оптимизации применения тромболитических и визуализирующих тромб препаратов в зависимости от места расположения тромба и механических характеристик обтурированного сосуда, но и для понимания процессов роста и лизиса тромба в сосудистом русле.

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Краткие физические характеристики кровеносной системы.

Важнейшими факторами, определяющими механику течения крови по сосуду считаются:

1) реологические свойства крови (кинематическая вязкость и плотность),

2) скорость течения крови,

3) перепад давления на данном участке сосуда,

4) эластичность стенки сосуда и

5) геометрические характеристики сосуда (диаметр, длина, углы ветвлений)

[155].

1) Различие в значениях кинематической вязкости и плотности для венозной и артериальной крови обусловливается, в основном, различием в физических свойствах мембран эритроцитов, которые зависят от соотношения внутриклеточного кальция и магния, концентрации АТФ, рН и рС02 [188]. Агрегационный статус тромбоцитов и эритроцитов, а также значение гематокрита, считаются примерно равными для крови до и после оксигенации. Значение гематокрита в микроциркуляционном русле снижается до 3% при гематокрите в больших сосудах равном 45%, что естест-

венно уменьшает вязкость крови в микрососудах. Однако это, не имеющее пока удовлетворительного объяснения [73], явление характерно как для венозного так и для артериального русла [114]. При построении математической модели течения крови в сосудах большого диаметра считается корректным рассматривать кровь как ньютоновскую жидкость [157].

2) Емкость венозной системы значительно превышает емкость артериальной системы крови. Венозные сосуды содержат 60-70% объема всей крови [199, 40]. Средняя скорость кровотока в органных венах 1 см/сек, а в присердечных участках полых вен 20 см/сек, тогда как в соответствующих частях артериальной системы она значительно больше - 3-4 см/сек в органных артериях и 30 см/сек в аорте [103].

3) В венозной системе давление гораздо ниже, чем в артериальной. Среднее давление в аорте и больших артериях равно 100 (125/75) мм.рт.ст.. в капиллярах 30 мм.рт.ст., в органных венах 15 мм.рт.ст., в нижней полой вене 10 мм.рт.ст. [145, 3].

Пульсация, осуществляемая за счет сердечного выброса, с перидиочностью 5080 ударов в минуту создает в больших артериях перепад давления 40-60 мм.рт.ст. Амплитуда же перепада давления в венулах за счет пульсаци в 5 раз ниже, чем в ар-териолах [84].

4) По сравнению с артериальной, толщина венозной стенки относительно внутреннего диаметра сосуда, существенно меньше. Так, для животных весом более 60 кг толщина артериальной стенки практически не зависит от веса животного [198] и отношение толщина/диаметр приблизительно равно 0.1 на всем протяжении сосуда. Для артериол это отношение может достигать значения 0.4. Толщина стенки венозного сосуда неравномерна по его длине и варьирует в широких пределах в измерениях разных исследователей. Отношение толщина/диаметр для магистральных вен составляет 0.01-0.05. Причем это отношение зависит не только от внутреннего

диаметра сосуда (чем вена крупнее, тем больше отношение), но и от величины гидростатического давления в данном сосуде, которое определяется давлением кровяного столба, основание которого находится на уровне данной вены, а верхушка - на уровне правого предсердия сердца или так называемой флебостатической оси [3]. Модуль упругости артериальной стенки нелинейно растет с увеличением прилагаемого (в пределах физиологической нормы) давления от 0.5 до 1.2 мПа [150]. Величина напряжения сосудистой стенки вен определяется величиной трансмурального давления (величина давления в вене минус величина наружного давления). Поскольку величина наружного давления конкретной вены определяется в большой степени характером ее окружения (скелетные мышцы, кости и т.д.), то модуль упругости венозной стенки определить затруднительно. Можно только предположить, что этот модуль будет зависеть от количества мышечных слоев венозной стенки, число которых варьирует от 1 до 4 [3].

5) Согласно классификации Vadot [184] различают 9 порядков размеров сосудов от аорты до капилляров. Для взрослого человека весом 60 кг и сердечным выбросом 4.5 л/мин предложены уравнения для подсчета количества (Nz), диаметра (Dz) и длины (Lz) артериальных сосудов определенного порядка:

Nz= l*(15.4)z Dz= 2*(0.376)z Lz= 59*(0.475)z,

где z= 0,1,2,...8.

Ветвление кровеносных сосудов характеризуется эмпирически полученными правилами:

а) Если сосуд разделяется на два сосуда одинакового диаметра, то угол ветвления симметричен.

б) Если сосуд ветвится на два сосуда разного диаметра, то меньший сосуд имеет больший угол ветвления.

в) Очень маленькие (по отношению к исходному) сосуды отходят под прямым углом [53].

Характер ветвления сосудов во многом определяет распределение потоков в месте бифуркации. Описание потоков в подобных системах является предметом гидромеханики и в данном обзоре разумно ограничиться замечанием о важности этого параметра для распределения молекул в том или ином месте сосуда.

Наиболее опасными, с точки зрения сохранения жизненных функций, являются патологии, связанные с нарушением кровотока в магистральных сосудах (0-2 порядки). Поэтому при сравнении параметров потока в артериальном и венозном руслах, особое внимание будет обращено на магистральные сосуды этих отделов кровеносной системы.

2. Тромбообразование в артериях и венах.

Как видно из приведенного выше краткого сравнения параметров течения крови в артериальном и венозном русле, наиболее выражено их отличие в скоростях потока и перепаде давления. Стенки сосудов устроены таким образом, чтобы обеспечить сохранность данных параметров кровотока. Различия в параметрах течения крови ответственны за различие механизмов тромбообразования в магистральных артериях и венах. Так, определяющим, основным механизмом образования тромба в артериях является адгезия и активация тромбоцитов на экспонированный в просвет сосуда коллаген базальной мембраны IV типа (без образования агрегатов) [115], а также на коллагены медии и адвентиции I и III типов (с образованием агрегатов) [204,138,87]. Еще одним фактором активации тромбоцитов является наруше-

ние ламинарности потока. Считается, что образование завихрений в зоне атероскле-ротической бляшки провоцирует агрегацию тромбоцитов с последующим тромбо-образованием [68,57].

В то же время роль тромбоцитов в образовании тромба венозного сосуда является предметом оживленных дискуссий: считается, что тромбоциты определяют развитие тромба при повреждении эндотелия, в то время как при отсутствии повреждения более важными факторами являются статус коагуляционной системы крови и наличие стазиса крови. В образовании венозного тромба решающую роль приписывают все же стазису крови и нарушениям коагуляционной системы [169]. Стазис крови наиболее сильно выражен в клапанных карманах и венозных мешочках (saccules). Возможно, сам по себе стазис не включает механизм тромбообразования (за счет увеличения локальной концентрации АДФ, продуцируемой эритроцитами, тромбоцитами и лейкоцитами, а также других факторов свертывания крови, образовавшихся в ближайшем окружении места стазиса), но обеспечивает усиление этого процесса [56]. То есть в патогенезе венозного тромба могут сосуществовать оба механизма тромбообразования, несмотря на малое (относительно артериального тромба) количество тромбоцитов в венозном тромбе.

В последнее время появились работы, исследующие различия в патогенезе венозного и артериального тромбов на фоне измененного тромбофилического статуса [78]. Высказывается мнение, что при патологических изменениях этого статуса часто нельзя предположить, в каком отделе системы - артериальном или венозном -предпочтительно будет образовываться тромб (хотя самими авторами данной работы было замечено, что, например, дефицит антитромбина почти исключительно приводит к образованию венозного тромба). На этом основании говорится о схожести механизмов тромбогенеза в артерии и вене. Очевидно, что без рассмотрения

условий тромбообразования трудно предположить тот или иной механизм этого процесса, ибо этот механизм определяется в том числе и физическими параметрами процесса. Так, например, аспирин (известный ингибитор агрегации тромбоцитов) не влиял на коллаген-индуцируемое тромбообразование при скорости сдвига 650 с"1 (артерия средней величины), но снижал на 38 % интенсивность процесса при скорости сдвига 2600 с"1 (45 % стеноз средней артерии, сила сдвига 80 дин/см2). При скорости сдвига 10500 с"1 (80 % стеноз, сила сдвига 350 дин/см2) эффект ингибирования не проявлялся, как не проявлялся и при силе сдвига более 100 дин/см2.

Предполагается, что блокирование связи фактора фон Виллебранда с глико-протеином Ilb/IIIa может привести к снижению агрегации при больших скоростях сдвига [23]. Значение фактора фон Виллебранда для адгезии и агрегации тромбоцитов именно при больших скоростях сдвига подчеркивается во многих работах [160,82]. При изучении тонких механизмов активации тромбоцитов in vitro, использовали проточную систему (скорость сдвига 300 сек"1) и активировали тромбоциты на коллагене [172]

Таким образом, очевидна взаимосвязь между биохимией процесса тромбообразования и физическими условиями, в которых этот процесс осуществляется.

3. Структура и свойства артериального и венозного тромбов.

При кратком описании условий образования тромба в венозной и артериальной системах крови можно с некоторой долей условности пренебречь фактором локализации отдельно взятого сосуда (хотя, конечно, при построении модели тромбообразования в конкретном сосуде этот фактор имеет определенное значение).

Различия в биофизических условиях тромбообразования обусловливают различие в структуре и размерах образовавшегося тромба. В артериях чаще образуются

так называемые "белые" тромбы, а в венах "красные" [58,66]. Артериальные тромбы короче венозных - длина тромба коронарной артерии при инфаркте миокарда около 1 см [14], в то время как венозные тромбы могут достигать 30 см [188] В не�