Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пространственно-временная динамика тромбообразования при диффузии тромбина в нерекальцифицированную плазму

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Пространственно-временная динамика тромбообразования при диффузии тромбина в нерекальцифицированную плазму"

На правах рукописи

Красоткина Юлия Валерьевна

ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННАЯ ДИНАМИКА ТРОМБООБРАЗОВАНИЯ ПРИ ДИФФУЗИИ ТРОМБИНА В НЕРЕКАЛЬЦИФИЦИРОВАННУЮ ПЛАЗМУ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-1999

Работа выполнена в Государственном некоммерческом учреждении -"Гематологический Научный Центр Российской Академии медицинских наук".

Научные руководители - доктор биологических наук,

профессор Ф.И. Атауллаханов

кандидат химических наук Е.И. Синауридзе

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор В.А. Макаров

кандидат биологических наук С.П. Домогатский

Ведущая организация

Институт эпидемиологии МЗ РФ

Защита состоится "

2000 г. в

час.

на заседании диссертационного совета Д001.45.02 в Государственном некоммерческом учреждении - "Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук" (Москва, 125167, Новозыковский проезд, 4а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН.

Автореферат разослан

1999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук старший научный сотрудник

В.Д. РЕУК

Е9Н-ЧН. ь~ 0

plSl.1U.-i> О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы.

Изучение развития и остановки коагуляционного процесса является одной из важных задач современной биологии и медицины. Нарушения в коагуляционной и противосвертывающей системах приводят к серьезным заболеваниям. Недостаточное тромбообразование вызывает геморрагии (Cawthen et al., 1998), а неконтролируемое свертывание является причиной тромбозов и эмболии (Emmerich et al., 1994).

Известно, что свертывание крови выполняет две задачи. С одной стороны, гемостатический тромб должен образовываться быстро, чтобы эффективно защитить организм от кровотечения. С другой стороны, процесс свертывания должен быть строго локализован в месте повреждения сосуда, для предотвращения тромбозов. Механизмы, обеспечивающие быстрое производство фибрина - основы гемостатического тромба, достаточно хорошо и подробно изучены в настоящее время (Балуда, 1995). Известно, что каскадная организация системы свертывания, при которой каждый активный фактор является продуктом предыдущей ферментативной реакции, приводит к многократному усилению инициирующего сигнала. Кроме того, коагуляционный процесс является самоускоряющимся, благодаря наличию в системе обратных положительных связей (Струкова и др., 1991).

Однако вопрос о локализации процесса свертывания остается до сих пор спорным. Более тога, сравнительно недавнее открытие реакций активации фактора XI тромбином (Naito et al., 1991) и самоактивации фактора X (Jesty et al., 1975) сделало очевидной возможность самоподдерживающегося - автоволнового - способа распространения свертывания, при котором такие ингибиторы, как антитромбин III и система протеина С, не способны обеспечить локализацию тромбообразования без рассмотрения дополнительных механизмов ограничения роста тромба. Учитывая, что в настоящее время уже существуют теоретические (Zarnitsina

etal., 1996) и экспериментальные исследования (Ataullakhanov et al., 1998), результаты которых свидетельствуют в пользу автоволнового механизма распространения свертывания, проблема локализации тромбообразования приобретает особую актуальность.

Пространственно неоднородный процесс остановки роста тромба можно исследовать только в пространственно распределенной системе. В гомогенной системе с полным перемешиванием получить ограниченные тромбы нельзя, т.к. свертывание охватывает весь объем изучаемого образца. В настоящее время практически отсутствуют экспериментальные системы, позволяющие изучать пространственную,динамику свертывания. Поскольку разработка соответствующей методики в данной работе проводилась впервые, то в качестве объекта изучения была выбрана упрощенная модель коагуляции, реализуемая при диффузии тромбина в нерекальцифицированную плазму.

Цель работы: экспериментальное определение пространственно-временной динамики тромбообразования при диффузии тромбина в нерекальцифицированную плазму. Задачи исследования:

1) разработать методику, позволяющую изучать динамику тромбообразования, а также визуализировать пространственное формирование тромба и распределение тромбина в плазме;

2) исследовать динамические характеристики роста тромба и распределения тромбина при его диффузии в цитратную плазму;

3) изучить влияние проницаемости фибринового сгустка для тромбина, сорбции фермента на тромбе, а также выяснить роль фибринолитической системы в процессе тромбообразования;

4) исследовать влияние концентрации антитромбина III и протеина С на характер роста тромба в пространственно распределенной системе. Научная новизна работы. Предложена новая экспериментальная система, которая позволяет исследовать пространственную динамику роста тромба

и изучать влияние различных факторов на динамику роста этих тромбов in vitro. Определена динамика образования фибриновых сгустков в камере, состоящей из двух отсеков, разделенных проницаемой мембраной, где тромбин свободно диффундирует из одного отсека в другой, содержащий раствор фибриногена или нерекальцифицированную плазму. Установлена пространственно-временной динамики фибринообразования и распределения активного тромбина в нормальной цитратной плазме человека, а также в плазмах, истощенных по антитромбину III или протеину С. Показано, что в цитратной плазме пространственная динамика тромбообразования определяется процессом ингибирования тромбина антитромбином III.

Научно-практическим значением данной работы является вклад в понимание механизмов формирования и локализации тромба в пространстве. Результаты данной работы найдут практическое применение для разработки новых экспериментальных систем, позволяющих исследовать коагуляционные процессы, в условиях, максимально приближенным к in vivo. Результаты могут послужить основой для новых методов диагностики антикоагулянтных компонент свертывания крови. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработана экспериментальная система, позволяющая исследовать пространственную динамику коагуляционных процессов.

2. Определена зависимость веса тромба от времени, а также пространственная динамика роста тромба при диффузии разных концентраций тромбина в цитратную плазму.

3. Исследована проницаемость фибринового тромба для тромбина.

4. Показано, что тромбин индуцирует в плазме амидолитическую активность дополнительную к его собственной, и отличную от активностей протеина Са, фактора Xla и тромбин-а2-макроглобулинового комплекса.

Апробация работы. Основные результаты исследования представлены на:

3-м Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (Санкт-Петербург, 1996), 31-й Пинеровской конференции по свертыванию крови (София, 1997), XVII-M конгрессе Международного общества по тромбозам и гемостазу (Вашингтон, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 работы. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов работы и их обсуждения, выводов и списка литературы (181 наименование). Работа содержит 34 рисунка. Материалы изложены на 97 страницах машинописного текста.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

В работе использованы следующие основные реактивы:

• флуорогенные пептидные субстраты BOC-Ala-Pro-Arg-AMC, Gly-Pro-Arg-АМС, где ВОС - это t-N-бутоксикарбонил, а AMC - остаток 4-метил-7-аминокумарина (Институт Биологической и Медицинской Химии РАМН);

• активатор протеина С, Tris-HCI, 4-метил-7-аминокумарин (Sigma, США);

• тромбин бычий, диметилсульфоксид (DMSO) (Merck, Германия);

• тромбин бычий, меченный флуоресцентной меткой флуоресцеинизотиоциа-натом (тромбин-FITC)

• пептид, отщепляемый в ходе активации протеина С тромбином (Институт Иммунологии МЗ P<£);BrCN-Sepharose-4B (Pharmacia, Швеция);

• поликлональные антитела к антитромбину Ш человека, моноклональные тела к протеину С человека, коньюгат антител мыши к ATIII человека с лероксидазой хрена (любезно предоставленные к.б.н. В.А. Навдаевым);

• агароза, этаноламин (Fluka, Германия);

Основными материалами исследования были образцы бедной тромбоцитами плазмы человека. Всего было исследовано более 80 плазм от различных доноров.

Рис.1.

Схема экспериментальной установки.

(а) Схема микрокюветы.

(б) Схема эпериментальной установки:

1- ртутная лампа;

2- светофильтры;

3- термостат;

4- микрокювета;

5- интерференционное зеркало;

6- оптическая система;

7- СОО-камера;

8-комльютер;

9-светодиоды.

Пространственную динамику тромообразования и распространения тромбина исследовали в тефлоновой или полистироловой камерах. Камера состоит из двух отсеков, в один из которых помещается плазма или раствор фибриногена, в другой - раствор тромбина нужной концентрации. При диффузии тромбина в противоположный отсек в нем происходит образование фибринового сгустка. Вес тромба определяли следующим образом. Фибриновый сгусток вынимали из камеры через определенные моменты времени, промывали в дистиллированной воде и растворяли в 0,2М ЫаОН. Концентрацию белка определяли Биуретовым методом и пересчитывали в вес образовавшегося фибрина.

Пространственное распределение фибрина регистрировали оптически по изменению светорассеяния растущим тромбом.

п-п

• ^ шила

О

I

Пространственное распределение тромбина исследовали с помощью флюоресцентно меченного тромбина (тромбина-FITC).

Пространственное распределение активного тромбина с применением флюорогенного субстрата Boc-Ala-Pro-Arg-AMC, который предварительно добавляли в плазму или раствор фибриногена.

Флюоресцентцща тромбина-FITC и флюоресцентна продукта AMC регистрировали оптически методом флюоресцентной микроскопии.

Анализ зависимостей веса тромба от времени, пространственных распределений AMC и фибрина, образующихся в рассматриваемой экспериментальной системе, и некоторых других зависимостей был проведен с помощью математической модели. В ее основу была положена следующая схема биохимических реакций:

(1) T+Fg<=> [T-Fg]->T+Fn k^, = 5040 мин"1, К^=7,5цМ

(2) T+lo[T-l] кг1цМ"1мин~1 , K-i — 1Ч0"4 мин"1

если I - антитромбин; к,=1цМ"'мин"1, Кч=19*10"2 мин"1 если I - аргатробан;

(3) T+oc2MoIT-oc2M] к,=0.1цМ"1мин"1 , мин"1

(4) T+S»[T-S] ->Т+АМС 7800 мин"1, К;!,"<:=13рМ ,

(5) [Т-«2М ]+S»[T-oc2M]-S] ->[Т-сс2М ]+АМС, 4680 мин"1,К^'=13цМ где

Т-тромбин, [Т-1]-тромбин-ингибиторный комплекс, Fg-фибриноген, F-фибрин, S- флюорогенный субстрат, °с2М -ос2макроглобулин.

Данные реакции в рассматриваемой экспериментальной системе могут быть описаны следующей системой дифференциальных уравнений:

а аг ' - 1 1

= т + к/* Т*1 — к ,*[77], ä äc

а скг

ä дх.

= + где

a

D, Ds и Damc - коэффициенты диффузии тромбина, субстрата и AMC,

Ч П 4 О Л 4 Ч О <

равные соответственно 3*10 мм мин", 0.6*10" мм мин", 0.3*10 мм мин' и выбранные исходя из значений их молекулярных масс. Диффузию фибриногена и ос2.макроглобулина не учитывали, так как их масса значительно больше, чем у остальных веществ. Коэффициенты диффузии антитромбина III и тромбин-ингибиторного комплекса полагали равными коэффициенту диффузии для тромбина.

Результаты работы получены в соавторстве с сотрудниками лаборатории физической биохимии крови Гематологического научного центра РАМН Е.И. Синауридзе, Р.И. Волковой, В.И. Сарбашем и студентами физического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова В.В. Савкиным и С.А. Пестовой под руководством заведующего лаборатории Ф.И. Атауллаханова. Всем участникам этой работы автор глубоко признательна и выражает искреннюю благодарность за сотрудничество.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Зависимость веса фибринового тромба от времени при диффузии тромбина в нерекальцифицированную плазму

При диффузии тромбина в раствор фибриногена происходит образование прозрачного гелеобразного тромба практически во всем объеме исследуемого образца. Толщина сгустка составляет 5-7мм и более. Зависимость веса фибринового тромба от времени, полученная в результате усреднения данных трех экспериментов представлена на рис. 2

Время, мин

Рис. 2. Вес фибринового сгустка при диффузии 200нМ тромбина в раствор фибриногена 4мг/мл: ■ - - экспериментальные данные; — - теоретический расчет.

Данная зависимость показывает, что в данной системе тромб образуется непрерывно до полного исчерпания субстрата свертывания. Масса сгустка через 5-6 часов после начала эксперимента составляет 1.9мг, в то время как максимально возможный вес сгустка равен 2.1мг. Таким образом к концу эксперимента происходит расщепление тромбином более 90% всего фибриногена. На рис.2 представлена также зависимость веса тромба от времени, рассчитанная с помощью математической модели, в которой рассматриваются только реакция (1). В данном случае теоретическая и экспериментальная кривые хорошо соответствуют друг

другу как качественно, так и количественно.

При диффузии тромбина в нерекальцифицированную плазму характер образования фибринового тромба меняется. В данном случае всегда образовывались тромбы ограниченного размера (толщиной не более 1мм), локализованные на мембране. Даже через 6 часов большая часть объема плазменного отсека содержала жидкую несвернувшуюся плазму. В плазме вес образующихся сгустков составляет в среднем около 7-10% от максимально возможного.

Усредненные данные для плазм разных доноров представлены на рис.3. Разные графики соответствуют различным концентрациям диффундирующего тромбина в диапазоне от 15 до 350 нМ. В динамике развития тромба выделяемся следующие этапы. В течение первого часа наблюдается быстрый рост, в результате которого образуется большая часть тромба, регистрируемого в конце эксперимента. Затем наступает фаза замедленного роста, которая затем сменяется стадией ускоренного образования тромба. Продолжительность этих фаз, особенно второй и третьей зависит от концентрации диффундирующего тромбина.

Замедление роста тромба и его практическая остановка наиболее четко прослеживается для низких концентраций тромбина (рис.За). При 50нМ диффундирующего фермента через 4 часа резкое замедление роста сменяется незначительным ускорением образования сгустка (рис.36). При больших концентрациях тромбина (от 200 нМ и выше) отчетливо видны все три стадии (рис.Зв.г). Продолжительность первой быстрой фазы не изменяется по сравнению с низкими концентрациями тромбина. Однако фаза замедленного роста уменьшается и составляет не более 2 часов. И наконец в течении последней стадии ускоренного роста вес тромба увеличивается на 1/3 от конечной его массы.

и

Рис. 3. Вес тромба при диффузии (а) 15нМ, (б) 50 нМ, (в) 200 нМ и (г) 350 нМ тромбина в нерекальцифицировнную плазму: • - экспериментальные данные; — - теоретическая зависимость.

На рис.3 также представлены расчетные зависимости веса тромба от времени для используемых в эксперименте концентраций тромбина, с

учетом реакций (1)-(3). Можно видеть, что на модельных кривых, как и на экспериментальных прослеживаются три стадии роста тромба, которые наиболее отчетливо выявлены для концентраций диффундирующего тромбина от 200нМ и выше (рис.Зв.г). Для концентрации фермента 15 нМ ускорения образования сгустка после стадии замедленного роста не происходит, что и наблюдается в эксперименте. В целом модельные кривые хорошо описывают экспериментальные для времен от 2 до 6 часов. Обращает на себя внимание то, что значения экспериментальных данных оказались большими тем теоретически рассчитанные. Эта разница составляет максимум 20% в случае 50нМ тромбина.

Большим концентрациям диффундирующего тромбина соответствуют большие значения весов образующихся тромбов (рис.4). Однако эта зависимость слабая: при изменении концентрации диффундирующего фермента от 15 до 350 нМ, т.е. в 23 раза, вес тромба увеличивается всего в 2 раза. Наиболее сильно эта зависимость проявляется для длительных 1 времен инкубации и высоких концентраций диффундирующего тромбина.

О 100 200 300 400 Тромбин, нМ

—•—2 часа —а—4 часа —■— б часов

Рис. 4.

Зависимость веса тромба от концентрации тромбина.

Для определения роли основного ингибитора свертывания -антитромбина III (ATIII), были использованы плазмы, содержание ATIII в которых не превышало 5%. Можно видеть, что снижение концентрации ATIII приводит к значительному увеличению веса тромба. Зависимость, наблюдаемая для обедненной по ATIII плазме, также хорошо описывается математической моделью, учитывающей реакции (1)-(3).

Время, мин

Рис. 5. Вес тромба при диффузии 200 нМ тромбина в (я формальную плазму и (т ) в плазму, содержащую не более 5% нормальной концентрации АТШ.

2. Проницаемость фибринового сгустка для тромбина

При измерении проницаемости фибринового сгустка для тромбина использовали тромбин, меченый флюоресцентной меткой (тромбин-Р1ТС). На рис.6 представлены результаты измерения количества тромбинаР1ТС, перешедшего в плазменный отсек и выраженное в процентах от начальной концентрации фермента. Как видно из рисунка, доля флюоресцентно меченного тромбина в отсеке с плазмой растет практически линейно в течении всего эксперимента. Таким образом, можно считать, что сгусток сохраняет постоянную проницаемость для тромбина.

10г

5

гг

Рис. б. Содержание тромбина-РТС в плазменном отсеке в % от его начальной концентрации .

с га

' 3"

га х

б 100 200 300 400 Время, мин

3. Исследование пространственной динамики роста тромба и

нерекальцифицированную плазму

Тромбин, проникая в отсек с плазмой, вызывает образование фибринового тромба. Сгусток имеет более плотную структуру, чем плазма, поэтому его присутствие приводит к увеличению светорассеяния по сравнению с наблюдаемым от плазмы, которое принимается за нулевое. На рис.7 приведены профили интенсивности светорассеяния в зависимости от расстояния от мембраны. Различные кривые одного семейства отвечают последовательным временам (через каждые 15 мин.) с момента начала регистрации процесса. Как видно из рисунка 7, область повышенного светорассеяния локализована у мембраны, имеет четкие пространственные границы и характеризует форму сгустка. В динамике изменения светорассеяния растущим тромбом четко выделяются две стадии. На первой из них, продолжительностью 15-30 мин. быстро растущий тромб вызывает соответствующее расширение области светорассеяния до 0,30,5мм. от мембраны, интенсивность которого при этом резко увеличивается. Следующие 1.5 часа пространственная граница тромба остается постоянной, а интенсивность внутри области, занятой сгустком, продолжает увеличиваться, но с меньшей скоростью, чем в первые минуты.

инактивации тромбина при

его

дифф"-»"'

в

Рис. 7. Рост тромба при диффузии (а) 50 нМ и (б) 400 нМ тромбина в нерекальцифицированную плазму.

о 10

время

0,6 0,!

Рсстояние, мм

1,0 5: о,0

1,0

Расстояние, мм

Рис. 8. Образование фибрина при диффузии (а) 50нМ и (б) 400 нМ

тромбина в раствор фибриногена (4мг/мл), содержащий 3 мкМ АТШ. Теоретический расчет.

Кроме того, ни динамика формирования тромба, ни его размер практически не зависят от концентрации диффундирующего тромбина в диапазоне от 50 до 400 нМ.

С помощью математической модели были рассчитаны профили фибрина, образующегося при диффузии в плазму тромбина, используемых в эксперименте концентраций. При этом в модели рассматривали реакции (1)-(3). Концентрации фибриногена и антитромбина III полагали равными ЮмкМ и ЗмкМ соответственно. Результаты теоретического расчета представлены на рис.8. В данном случае образование тромба происходит с максимальной скоростью в течении первых ЗОмин, затем его рост резко замедляется и, наконец, через 45 мин. формирование сгустка полностью останавливается. Величина сгустка при концентрации тромбина 400 нМ менее, чем в 1.2 раза превышает размер тромба, образующегося при 50 нМ тромбина.

Рис. 9. Образование тромба при диффузии 200 нМ тромбина в плазму, содержащую 150. "М ATII): (а) эксперимент; (б) теоретический расчет.

н

Аналогичные опыты и математический расчет были проведены с использованием плазмы, содержащей не более 5% от нормальной

концентрации антитромбина III. В данном случае время быстрого роста увеличивается до 45-60 мин. (рис.Эа), после чего образование тромба несколько замедляется, но остановки роста не происходит вообще. Наблюдаемая экспериментальная зависимость хорошо описывается

теоретическим расчетом в предположении, что тромбин диффундирует в

h

раствор фибриногена, содержащий 150^-М антитромбина III (рис.9б).

В целом математическая модель хорошо описывает динамику изменения геометрического размера растущего тромба, в предположении, что тромбин в рассматриваемой системе ингибируется антитромбином 111. Это позволяет утверждать, Что именно антитромбин III ответственен за динамику роста тромба при диффузии тромбина в цитратную плазму. 4. Пространственное распределение тромбина-FlTC в буферном растворе и плазме

Пространственное распределение молекул тромбина в плазме и буферном растворе регистрировали, используя тромбин-FITC. На рис. 10а,б представлены концентрационные профили тромбина-FITC при его диффузии в имидазольный буфер (а) и плазму (б) в зависимости от расстояния от мембраны.

Рис. 10. Диффузия 200 нМ тромбина-Р1ТС в (а) плазму и (б) буфер.

Диффузионные кривые для плазмы, в которой фермент образует

0,0 0,5 1,0 1,5 Расстояние, мм

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Расстояние, мм

фибриновый тромб и буферного раствора одинаковы. Это позволяет предполагать, что фибриновый сгусткок остается проницаемым для молекул тромбина в течение всего времени эксперимента (2 часа). За это время тромбин успевает распространиться на расстояние около 2 мм, что значительно превышает размер образующегося при этом тромба. 5. Динамика образования AMC в растворе фибриногена

Концентрационные профили AMC при диффузии тромбина в раствор фибриногена (4мг/мл), содержащий флюарогенный субстрат, представлены на рис.11а. В данном случае, как и при диффузии в плазму, в первые минуты образуется максимум концентрации AMC вблизи мембраны, который затем удаляется от нее. Однако, амплитуда этого максимума в дальнейшем не уменьшается, а остается практически постоянной, незначительно увеличиваясь при удалении от мембраны. Наблюдаемая экспериментальная зависимость хорошо описывается математической моделью, с учетом реакций (1) и (4) (рис.116).

Расстояние, мм Расстояние, мм

Рис. 11. Образование AMC при диффузии 200 нМ тромбина в раствор

фибриногена (4мг/мл): (а) эксперимент; (б) теоретический расчет.

Динамика образования AMC качественно меняется если раствор фибриногена содержит 5мкМ аргатробана (рис.12) . Такая концентрация синтетического ингибитора достаточна для того, чтобы инактивировать такое же количество тромбина, как и нормальная концентрация АТШ в плазме (3-5 мкМ), т.к. ингибитор в обоих случаях находится в сильном избытке по сравнению с концентрацией тромбина.

Рис. 12. Образование AMC при диффузии (а) 50 нМ и (б) 400 нМ в раствор фибриногена (4мг/мл), содержащий 5 шМ аргатробана.

В данном случае кинетика образования AMC тромбином остается монотонной на протяжении 2 часов: концентрация AMC непрерывно увеличивается в каждой точке плазмы, хотя значения концентраций ниже, чем при диффузии в плазму или раствор чистого фибриногена. Кроме этого, концентрация образовавшегося AMC в растворе фибриногена прямо пропорциональна концентрации диффундирующего тромбина (рис.12а,б). Однако, такая экспериментальная зависимость хорошо описывается теоретическим расчетом, при учете реакций (1), (2) и (4) (рис.13).

Рис. 13. Образование AMC при диффузии (а) 50 нМ и (б) 400 нМ в раствор фибриногена (4мг/мл), содержащий 5 мкМ аргатробана. Теоретический расчет.

6. Динамика образования AMC в цитратной плазме

Рассматривая систему уравнений (1), (2) и (4) и полагая в уравнении (2) кинетические константы и концентрацию ингибитора, соответствующие антитромбину III, справедливо ожидать, что полученные концентрационные профили образования AMC (рис.1Ч) будут соответствовать образуемым в нерекальцифицированной плазме, при диффузии в нее тромбина. Однако такого соответствия не наблюдается, в отличие от раствора фибриногена и аргатробана. Профили концентраций AMC, образовавшегося в плазме, в зависимости от расстояния от мембраны приведены на рис.45. Для концентраций диффундирующего тромбина от 100 до 400 нМ динамика образования AMC в плазме слабо зависит от концентрации фермента. Как и в случае образования тромба, в процессе наработки AMC можно выделить две качественно различные фазы. В течении первых 15-45 мин. происходит увеличение концентрации AMC в каждой точке репера с образованием максимума вблизи мембраны.

время

12 3 4 Расстояние, мм

12 3 4 Расстояние, мм

Рис, 14. Образование AMC при диффузии (а) 100 нМ и (б) 400 нМ тромбина в раствор фибриногена (4мк/мл) и 3 мкМ ATIII. Теоретический расчет.

0 1 2 3 4 5 6 Расстояние, мм

12 3 4 Расстояние, мм

Рис. 15. Образование AMC при диффузии (а) 100 нМ и (б) 400 нМ тромбина в цитратную плазму.

Затем в последующие 1.5 часа максимум концентрации начинает удаляться от мембраны и его амплитуда непрерывно уменьшается с почти постоянной скоростью. Область, в которой наблюдается падение концентрации AMC, составляет 1-2 мм. Такая же динамика наработки AMC тромбином наблюдаются в случае диффузии фермента в плазму, содержащую не более 5% от нормальной концентрации ATIII или 3% протеина Сив плазму, предварительно проинкубированную с метиламином.

ВЫВОДЫ

1. Разработана экспериментальная система для исследования пространственной динамики тромбообразования.

2. Получены тромбы ограниченного размера и определено влияние различных факторов на процесс роста этих тромбов in vitro.

3. Установлена пространственная динамика роста тромба при диффузии разных концентраций тромбина в цитратную плазму. Определена зависимость веса тромба от времени. Показано, что процесс формирования фибринового тромба является ограниченным благодаря инактивации тромбина предсуществующими ингибиторами.

4. Получено пространственное распределение флюоресцентно меченого тромбина (тромбина-FITC) в плазме. Установлено, что фибриновый тромб является проницаемым для молекул тромбина.

5. Измерено распределение активного тромбина по его активности к флюорогенному субстрату. Показано, что тромбин индуцирует в плазме амидолитическую активность отличную от его собственной и от активностей протеина Са, фактора Xla и тромбин-а2-макроглобулинового комплекса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Sinauridze El, Krasotkina YuV, Savkin V.V., Volkova Rl, Ataullakhanov Fl. Spatio-temporal dynamic of clot formation caused by trombin diffusion

into a blood plasma without Ca2+. Abstracts of the XVII Congress of the International Society on Thrombosis and Hemostasis, Washington, D.C., USA, 1999, p. 93.

2. Sinauridze El, Volkova Rl, Krasotkina YuV, Sarbash VI, Ataullakhanov Fl. Dynamics of clot growth induced by thrombin diffusing into nonstirred citrate human plasma. Biochimica et Biophysica Acta, 1425, p. 607, 1998

3. Синауридзе Е.И., Волкова Р.И., Сарбаш В.И., Красоткина Ю.В., Пестова С.А., Атауллаханов Ф.И. Исследование механизмов остановки роста тромба. Тезисы докладов 3-го Всероссийского съезда гематологов и трансфузиологов, 1996, с.55.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Красоткина, Юлия Валерьевна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Коагуляционное звено системы гемостаза

1.2. Ингибиторы свертывания крови

1.2.1. Структура и механизм действия антитромбина III

1.2.2. Структура и механизм действия протеина С

1.3. Формирование и лизис фибринового сгустка

1.4. Пространственные аспекты свертывания крови

1.5. Экспериментальное исследование пространственно-временных 27 характеристик процесса свертывания крови

Глава 2. Материалы и методы

Глава 3. Результаты

3.1. Динамика роста фибриновых тромбов в плазме и растворе 48 фибриногена

3.2. Влияние антитромбина III и фибринолитической системы на динамику 53 роста тромба

3.3. Проницаемость фибринового тромба для тромбина

3.4. Пространственная динамика тромбообразования при диффузии 57 тромбина в цитратную плазму

3.5. Динамика образования AMC и пространственное распределение 60 тромбина-FITC в цитратной плазме и растворе фибриногена

3.6. Влияние пептида, отщепляемого от протеина С при его активации 66 тромбином, на активность тромбина по отношению фибриногену

Глава 4. Обсуждение результатов

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пространственно-временная динамика тромбообразования при диффузии тромбина в нерекальцифицированную плазму"

Свертывание крови выполняет две задачи. С одной стороны, гемостатический тромб должен образовываться быстро, чтобы эффективно защитить организм от кровотечения. С другой стороны, процесс свертывания должен быть строго локализован в месте повреждения сосуда, для предотвращения тромбозов. Нарушения в коагуляционной и противосвертывающей системах приводят к серьезным заболеваниям. Недостаточное тромбообразование вызывает геморрагии [39,44], а неконтролируемое свертывание является причиной тромбозов и эмболий [171,60]. Поэтому изучение развития и остановки коагуляционного процесса является одной из важных задач современной биологии и медицины.

Механизмы, обеспечивающие быстрое образование фибрина - основы гемостатического тромба, достаточно хорошо и подробно изучены в настоящее время [4]. Известно, что каскадная организация системы свертывания, при которой каждый активный фактор является продуктом предыдущей ферментативной реакции, приводит к многократному усилению инициирующего сигнала [171]. Кроме того, коагуляционный процесс является самоускоряющимся, благодаря наличию в системе обратных положительных связей [14].

Что касается локализации свертывания, то, как показал анализ литературы, посвященной этой проблеме, вопрос о механизмах ограничения роста тромба остается до сих пор спорным. Более того, сравнительно недавнее открытие реакций активации фактора XI тромбином [36,124] и самоактивации фактора X [93] сделало очевидной возможность самоподдерживающегося -автоволнового - способа распространения свертывания, при котором такие ингибиторы, как антитромбин III и система протеина С, не могут остановить рост тромба [19]. Учитывая, что в настоящее время уже существуют теоретические [181] и экспериментальные исследования [1], результаты которых свидетельствуют в пользу автоволнового механизма распространения свертывания, проблема локализации тромбообразования приобретает особую актуальность.

Пространственно неоднородный процесс остановки роста тромба можно исследовать только в пространственно распределенной системе. В гомогенной системе с полным перемешиванием получить ограниченные тромбы нельзя, т.к. свертывание охватывает весь объем изучаемого образца. В настоящее время практически отсутствуют экспериментальные системы, позволяющие изучать пространственную динамику свертывания. Поскольку разработка соответствующей методики в данной работе проводилась впервые, то в качестве объекта изучения была выбрана упрощенная модель коагуляции, реализуемая при диффузии тромбина в нерекальцифицированную плазму.

Цель работы: экспериментальное определение пространственно-временной динамики тромбообразования при диффузии тромбина в нерекальцифицированную плазму.

Задачи исследования:

1) разработать методику, позволяющую изучать динамику тромбообразования, а также визуализировать пространственное формирование тромба и распределение тромбина в плазме;

2) исследовать динамические характеристики роста тромба и распределения тромбина при его диффузии в цитратную плазму;

3) определить проницаемость фибринового сгустка для тромбина, а также выяснить роль фибринолитической системы в процессе тромбообразования;

4) исследовать влияние концентрации антитромбина III и протеина С на характер роста тромба в пространственно распределенной системе.

Научная новизна работы. Предложена новая экспериментальная система, которая позволяет исследовать пространственную динамику роста тромба и изучать влияние различных факторов на динамику роста этих тромбов in vitro. Определена динамика образования фибриновых сгустков в камере, состоящей из двух отсеков, разделенных проницаемой мембраной, где тромбин свободно диффундирует из одного отсека в другой, содержащий раствор фибриногена или нерекальцифицированную плазму. Установлена пространственно-временная динамика фибринообразования и распределения тромбина в нормальной цитратной плазме человека, а также в плазмах, истощенных по антитромбину III или протеину С. Показано, что в цитратной плазме пространственная динамика тромбообразования определяется ингибированием тромбина антитромбином III.

Научно-практическим значением данной работы является вклад в понимание механизмов формирования и локализации тромба в пространстве. 6

Результаты данной работы найдут практическое применение для разработки новых экспериментальных систем, позволяющих исследовать коагуляционные процессы, в условиях, максимально приближенным к in vivo. Результаты могут послужить основой для новых методов диагностики антикоагулянтных компонент свертывания крови.

Основные положения выносимые на защиту:

1. Разработана экспериментальная система, позволяющая исследовать пространственную динамику коагуляционных процессов.

2. Определена зависимость веса тромба от времени, а также пространственная динамика роста тромба при диффузии разных концентраций тромбина в цитратную плазму.

3. Исследована проницаемость фибринового тромба для тромбина.

4. Показано, что тромбин индуцирует в плазме амидолитическую активность, дополнительную к его собственной, и отличную от активностей протеина Са, фактора Xla и тромбин-а2-макроглобулинового комплекса.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Красоткина, Юлия Валерьевна

ВЫВОДЫ

1. Разработана экспериментальная система для исследования пространственной динамики тромбообразования.

2. Получены тромбы ограниченного размера и определено влияние различных факторов на процесс роста этих тромбов in vitro.

3. Установлена пространственная динамика роста тромба при диффузии разных концентраций тромбина в цитратную плазму. Определена зависимость веса тромба от времени. Показано, что процесс формирования фибринового тромба является ограниченным благодаря инактивации тромбина предсуществующими ингибиторами.

4. Получено пространственное распределение флюоресцентно меченого тромбина (тромбина-FITC) в плазме. Установлено, что фибриновый тромб является проницаемым для молекул тромбина.

5. Измерено распределение активного тромбина по его активности к флюорогенному субстрату. Показано, что тромбин индуцирует в плазме амидолитическую активность, отличную от его собственной и от активностей протеина Са, фактора Xla и тромбин-а2-макроглобулинового комплекса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Красоткина, Юлия Валерьевна, Москва

1. Атауллаханов Ф.И., Волкова Р.И., Гурия Г.Т., Сарбаш В.И. Пространственные аспекты свертывания крови. 1.I. Рост тромба in vitro. Биофизика, 1995, 40, с. 1320.

2. Атауллаханов Ф.И., Волкова Р.И., Гурия Г.Т., Сарбаш., Сафрошкина А.Ю. Автоволновая гипотеза свертывания крови. Физическая мысль России, 1995, 1, с. 64.

3. Атауллаханов Ф.И., Гурия Г.Т., Сафрошкина А.Ю. Пространственные аспекты свертывания крови. Биофизика, 1994, 39, с. 97.

4. Балуда В.П., Балуда М. В., Деянов И.И., Тлепшуков И.Л. Физиология системы гемостаза. Под ред. проф. В.П. Балуды, М., с. 47, 1995.

5. Бышевский A.M., Чирятьев Е.А. Система регуляции агрегатного состояния в норме и патологии. М., 1982, с. 89-93.

6. Ена Я.М., Платонова Т.М. Биологическая роль и клиническое заначение протеина С. Врачебное дело, 1993, 6, с. 20.

7. Ена Я. М., Платонова Т.Н., Сушко Е.А., Шевчук Т.В. Антитромбин III: функциональная характеристика и клиническое значение. 1993, Врачебное дело, 9, с. 18.

8. Коган А.Е., Струкова С.М. Протеин С: механизм активации и антикоагулянтный эффект. 1993, Биохимия, 58, с.827.

9. Ленинджер А. Основы биохимии, Москва, Мир, 19?£, стр.460.

10. Ю.Луговский Э.В., Макогоненко Е.М., Чудновец B.C. Исследование процессовполимеризации фибрина с помощью поликпональных антител. Биохимия животных и человека, 1991, 15, с. 77.

11. И.Навдаев A.B. Особенности развития фибринового сгустка в плазме in vitro. Диссертация на соискание степени к.б.н., Москва, с. 38-42, 1997.

12. Полак Л.С., Михайлов A.C. Самоорганизация в неравновесных физико-химических системах. М., с. 152, 1983.

13. Рябов Г.А., Пасечник И.Н., Азизов Ю.М. Протеин С. Терапевтический архив, 1989, 61, с. 151.

14. Струкова С.М., Умарова Б.А., Киреева Е.К., Коган А.Е. и др. Механизмы регуляции свертывания крови. Биохимия животных и человека. 1991, 15,с.1.

15. Фарлоу М. Дифферентциальные уравнения в частных производных. М., с.132-145, 1992.

16. Ханин М.А., Семенов В.В. Нелинейные эффекты в кинетике свертывания крови. Биофизика, 1990, 35, с. 139.

17. Achyuthan КЕ. Characterization of the reciprocal binding sites on human alpha-thrombin and factor XIII A-chain. Mol. Cell Biochem., 1998, 178, p.289.

18. Ataullakhanov Fl, Guria GT, Sarbash VI, Volkova Rl. Spatiotemporal dynamics of clotting and pattern formation in human blood. Biochimica et Biophysica Acta 1998, 1425, p. 453.

19. Ataullakhanov F.I., Pohilko A.V., Sinauridze E.I., Volkova R.I. Calcium threshold in human plasma clotting kinetics. Thromb. Res., 1994, 75, p. 383.

20. Aznar J., Espana F., Estelles A., Royo M. Heparin stimulation of the inhibition of activated protein С and other enzymes by human protein С inhibitor—influence of the molecular weightof heparin and ionic strength. Thromb. Haemost., 1996, 76, p. 983.

21. Bakker H.M., Tans G., Janssen-Claessen Т., Thomassen M.C., et al. The effect of phospholipids, calcium ions and protein S on rate constants of human factor Va inactivation by activated human protein C. Eur. J. Biochem., 1992, 208, p. 171.

22. Barrett A.J. a2-Macroglobulin. Meth. Enzym., 1981, 80, p.737.

23. Bini A., Kudryk B.J. Fibrinogen and fibrin in the arterial wall. Thromb. Res., 1994, 75, p. 337.

24. Berg D.T., Wiley M.R., Grinnell B.W. Enchanced protein С activation inhibition of fibrinogen cleavage by a thrombin modulator. Science, 1996, 273, p. 1389.

25. Berry L., Stafford A., Fredenburgh J., O'Brodovich H., et al. Investigation of the anticoagulant mechanisms of a covalent antithrombin-heparin complex. J. Biol. Chem., 1998, 273, p. 34730.

26. Beattie A.G., Ogston D., Bennett В., Douglas A.S. Inhibitors of plasminogen activation in human blood. Br J Haematol, 1976, 32, p.135.

27. Benson J.M., Phillips D.J., Holloway B.P., Evatt B.L., et al. Oligonucleotideligation assay for detection of the factor V mutation (Arg506->Gln) causing protein C resistance. Thromb. Res., 1996, 83, p. 87.

28. Blomback B. Fibrinogen and fibrin—proteins with complex roles in hemostasis and thrombosis. Thromb. Res., 1996, 83, 1, p. 1.

29. Blomback B. Fibrinogen structure, activation, polymerization and fibrin gel structure. Thromb. Res., 1994, 75, p. 327.

30. Boffa M.C., Karmochkine M. Thrombomodulin: an overview and potential implications in vascular disorders. Lupus, 1998, 7, p. 120.

31. Booth N.A., Reith A., Bennett B. A plasminogen activator inhibitor (PAI-2) circulates in two molecular forms during pregnancy. Thromb Haemost, 1988, 59, p.77.

32. Booth N.A., Simpson A.J., Croll A., Bennett B. et al. Plasminogen activator inhibitor (PAI-1) in plasma and platelets. Br J Haematol, 1988, 70, p.327.

33. Broze G.J. The tissue factor pathways inhibitor. In Haemostasis and thrombosis, A.L. Bloom, C.D.Forbers, D.P. Thomas, E.G.D. Tuddenham (Eds), 1994, p. 349377.

34. Broxe G.J. Jr., Majerus P.W. Purification and properties of human coagulation factor VII. J. Biol. Chem., 1980, 225, p.1242.

35. Brunnee T., La Porta C., Reddigari S.R., Salerno V.M., et al. Activation of factor XI in plasma is dependent on factor XII. Blood, 1993, 81, p.580.

36. Burgering M.J., Orbons L.P., van der Doelen A., Mulders J., et al. The second Kunitz domain of human tissue factor pathway inhibitor: cloning, structure determination and interaction with factor Xa. J. Mo/. Biol., 1997, 3, p. 269, p. 395.

37. Cawthern K.M., van'tVeerC., Lock J.B., DiLorenzo M.E., etal. Blood coagulation in hemophilia A and hemophilia C. Blood, 1998, 91, 12, p.4581.

38. Chesebro J.H. Direct thrombin inhibition superior to heparin during and after thrombolysis: dose, duration, and drug. Circulation, 1997, 96, p. 2118.

39. Christy J.R.I., Macleod N. The role of stasis in the clotting of blood and milk flows around solid objects. Cardiovasc. Res., 1989, 23, p.949.

40. Collen D. Identification and some properties of a new fast-reacting plasmin inhibitor in human. EurJBiochem., 1976, 69, p.209.

41. Cooper D.N., Millar D.S., Wacey A., Pemberton S. Et al. Inherited factor X deficiency: molecular genetics and pathophysiology. Thromb. Haemost, 1997, 78, p.161.

42. Dahlback B. Factor V and protein S as cofactors to activated protein C. Haematologica, 1997, 82, p. 91.

43. Dahlback B. Protein S and C4b-binding protein: components involved in the regulation of the protein C anticoagulant system. Thromb. Haemost., 1991, 66, p. 49.

44. Dahlback B. Purification of human vitamin K-dependent protein S and its limited proteolysis by thrombin. Biochem. J., 1983, 209, p. 837.

45. Danielson A., Bjork J. Slow spontaneous dissociation of the antithrombin-thrombin complex produces a proteolitically modified form of the inhibitor. FEBS Letters, 1980, 119, p. 241.

46. Davie E.W., Ratnoff O.D. Waterfall sequence for blood clotting. Science, 1964,145, p.1310.

47. De Cristofaro R., De Candia E., Landolfi R. Effect of high- and low-molecular-weight heparins on thrombin-thrombomodulin interaction and protein C activation. Circulation, 1998, 98, p. 1297.

48. Demers C., Ginsberg J.S., Hirsh J., Henderson P. Thrombosis in antithrombin-lll-deficient persons. Report of a large kindred and literature review. Ann. Intern. Med., 1992, 116, p. 754.

49. Di Cera E., Guinto E.R., Vindigni A., Dang Q.D. et al. The Na+ binding site of thrombin. JBiolChem., 1995, 270, p.22089.

50. Doolittle R.F. Fibrinogen and fibrin. Annu. Rev. Biochem., 1984, 53, p. 195.

51. Doolittle R.F., Spraggon G., Everse S.J. Three-dimensional structural studies on fragments of fibrinogen and fibrin. Curr. Opin. Struct. Biol., 1998, 8,p. 792.

52. Edy J., De Cock F., Collen D. Inhibition of plasmin by normal and antiplasmin-depleted human plasma. Thromb Res, 1976, 8, p.513.

53. Elisen M.G., von dem Borne P.A., Bouma B.N., Meijers J.C. Protein C inhibitor acts as a procoagulant by inhibiting the thrombomodulin-induced activation of protein C in human plasma. Blood, 1998, 91, p. 1542.

54. Emmerich J., Vidaud D., Alhenc-Gelas M., Chadeuf G., Gouault-Heilmann M., Aillaud M.F., Aiach M. Three novel mutations of antithrombin including high-molecular mass compaunds. Ateriosclerosis and Thrombosis, 1994, 14, p. 1958.

55. Esmon C.T., Esmon N.L., Harris K.W. Complex formation between thrombin and thrombomodulin inhibits both thrombin-catalised fibrin formation and factor V activation. J. Biol. Chem., 257, 1982, p. 7944.

56. Esmon C.T., Esmon N.L., LeBoniec B.F., Johnson A.E. Protein C activation. In: Methods in enzymology, L. Lorand , K.G.Mann (Ed), 1993, pp. 359-385.

57. Fay P.J., Koshibu K. The A2 subunit of factor Villa modulates the active site of factor IXa. J. Biol. Chem., 1998, 273, p. 19049.

58. Fay P.J., Smudzin T.M., Walker F.J. Activated protein C-catalyzed inactivation of human factor VIII and factor Villa. Identification of cleavage sites and correlation of proteolysis with cofactor activity. J. Biol. Chem., 1991, 266, p. 20139.

59. Freyssinet J.M., Gauchy J., Cazenave J.P. The effect of phospholipids on the activation of protein C by the human thrombin-thrombomodulin complex. Biochem. J., 1986, 238, p. 151.

60. Friedberg R.C., Hagen P.O., Pizzo S.V. The role of endothelium in factor Xa regulation. The effect of plasma proteinase inhibitors and hirudin. Blood, 71, 1988, p. 1321.

61. Gan Z.R., Li Y., Chen Z., Lewis S.D. et al. Identification of basic amino acid residues in thrombin essential for heparin-catalyzed inactivation by antithrombin III. Biol. Chem., 1994, 269, p. 1301.

62. Gandossi E., Lunven C., Gauffeny C., Roome N.O. et al. Platelet aggregation induced in vitro by rabbit plasma clot-associated thrombin, and its inhibition by thrombin inhibitors. Thromb. Haemost., 1998, 80, p. 840.

63. Garlund В., Hessel В., Marguerie G. Primary structure of human fibrinogen. Eur. J. Biochem., 77, 1977, p. 595.

64. Gaussem P., Gandrille S., Duchemin J., Emmerich J. Et al. Influence of six mutations of the protein С gene on the Gla domain conformation and calcium affinity. Thromb. Haemost., 1994, 71, p. 748.

65. Gettins P.G., Fan В., Crews B.S. Thansmition of conformational change from the heparin binding site to the reactive center of antithrombin. Biochemistry, 1993, 32, p. 8385.

66. Gorkun O.V., Veklich Y.I., Weisel J.W., Lord S.T. The conversion of fibrinogen to fibrin: recombinant fibrinogen typifies plasma fibrinogen. Blood, 1997,89, p.4407.

67. Gorog P. Modeling thrombosis formation. Заявка 2245061, Великобритания, МКИ 001, №33/49.

68. Griffits M.J., Lundblud R.L. Dissociation of antithrombin-complex. Formation of active and inactive antithrombin III. Biochemistry, 1981, 20, p.105.

69. Guinto E.R, Vindigni A., Ayala Y.M, Dang Q.D., Di Cera E. Identification of residues linked to the slow~>fast transition of thrombin. Proc Natl Acad Sci US A, 1995, 92, p.11185.

70. Hack C.E. The role of factor XII in contact system activation. Blood, 1998, 92, p. 703.

71. Halpel P.C. a2-Macroglobulin. In: The chemistry and physiology of the humanplasma proteins, D.H. Bring (Ed), Pergamon, N.Y., 1979, p.385.

72. Hirahara K., Koyama M., Matsuishi T., Kurata M. The effect of human thrombomodulin on the inactivation of thrombin by human antithrombin III. Thromb. Res., 1990, 57, p. 117.

73. Hjort P.F. Intermediate reaction in the coagulation of blood with tissue thromboplastin. Anti-covertin. Scand. Clin. Lab. Invest., 1957, 9, p. 76.

74. Hockin M.F., Kalafatis M., Shatos M., Mann K.G. Protein C activation and factor Va inactivation on human umbilical vein endothelial cells. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 1997, 17, p. 2765.

75. Hoogendoorn H., Toh C.H., Nesheim M.E., Giles A.R. Alpha 2-macroglobulin binds and inhibits activated protein C. Blood, 1991, 78, 9, p. 2283.

76. Hsieh K. Thrombin interaction with fibrin polymerization sites. Thromb. Res., 1997, 86, p. 301.

77. Hofsteenge J., Taguchi H., Stone S.R. The kinetics of formation and dissosiation of the bovin-antithrombin III complex. Biochem. J., 1986, 237, p. 243.

78. Jesty J. Interaction of feedback control and product inhibition in the activation of factor X by factors IXa and VIII. Haemostasis, 1991, 21, p. 208.

79. Jesty J. The kinetics of formation and dissosiation of the bovin thrombinantithrombin complex. Journal of Biological Chemistry, 1979, 254, p. 10044.

80. Jesty J. The kinetics of inhibition of thrombin in human plasma. J Biol Chem, 1986, 261, p. 10313.

81. Jesty J., Spencer A.K., Nakashima Y., Nemerson Y. et al. The activation of coagulation factor X. Identity of cleavage sites in the alternative activation pathways and characterization of the COOH-terminal peptide. Biol Chem., 1975, 250, p.4497.

82. Jirouskova M., Dyr J.E., Suttnar J., Holada K. Platelet adhesion to fibrinogen, fibrin monomer, and fibrin protofibrils in flowing blood—the effect of fibrinogen immobilization and fibrin formation. Thromb. Haemost, 1997, 78, p.1125

83. Kaczmarek E., McDonagh J. Thrombin binding to the Act, B(3 and v-chains of fibrinogen to their remnants contained in fragment E. J. Biol. Chem., 1988, 263, p. 13896.

84. Kane K.K. Fibrinolysis a review. Ann. Clin. Lab. Sci., 1984, 14, p. 443.

85. Kane W.H., Lindhout M.J., Jackson C.M., Majerus P.W. Factor Va-dependent binding of factor Xa to human platelets. J. Biol. Chem., 1980, 255, p. 1170.

86. Karino T. The effects of disturbed flows on thrombin formation. 18th annual meet. Bioreology, 1996, 33, p. 77.

87. Kato H. Tissue factor pathway inhibitor; its structure, function and clinical significance. Pol. J. Pharmacol., 1996, 48, p. 67.

88. Kawabata S, Miura T., Morita T., Kato H., Fujikawa K., Iwanaga S., Takada K., Kimura T., Sakakibara S. Highly sensitive peptide-4-methylcoumaryl-7-amide substrates for blood-clotting proteases and trypsin, Eur. J. Biochem., 1988, 172, p.17.

89. Kessels H., Willems G., Hemker H.C. Analysis of thrombin generation in plasma. Comput. Biol. Med., 1994, 24, p.277.

90. Lane D.A., Kunz G., Olds R.J., Thein S.L. Molecular genetics of antithrombin deficiency. Blood Review, 1996, 10, p. 59.

91. Lawson J.H., Butenas S., Pibarik N., Mann K.G. Complex-dependent inhibitionof factor Vila by antithrombin III and heparin. 1993, J Biol Chem., 1993, 268, p. 767.

92. Lewis K.B., Teller D.C., Fry J., Lasser G.W. et al. Crosslinking kinetics of the human transglutaminase, factor XIIIA2., acting on fibrin gels and gamma-chain peptides. Biochemistry, 1997, 36, p. 995.

93. Lindhout T., Baruch D., Schoen P., Franssen J. Et al. Thrombin generation and inactivation in the presence of antithrombin III and heparin. Biochemistry, 1986, 25, p. 5962.

94. Lollar P., Parker C.G. pH-dependent denaturation of thrombin-activated porcine factor VIII. 1990, J. Biol. Chem., 1990, 265, p.1688.

95. Lu D., Kalafatis M., Mann K.G., Long G.L. Comparison of activated protein C/protein S-mediated inactivation of human factor VIII and factor V. Blood, 1996, 87, p. 4708.

96. Lush C.J., Armstrong L., Mitchell V.E. Free protein S and C4b binding protein. Am. J. Clin. Pathol., 1991, 96, p. 434.

97. Maaroufi R.M., Jozefowicz M., Tapon-Bretaudiere J., Fischer A.M. Mechanism of thrombin inhibition by antithrombin and heparin cofactor II in the presence of heparin. Biomaterials, 1997, 18, p.203.

98. MacCallum P.K., Cooper J.A., Martin J., Howarth D.J. et al. Associations of protein C and protein S with serum lipid concentrations. Br. J. Haematol., 1998, 102, p. 609.

99. Mammen E.F., Thomas W.W., Seergers W.R. Activation of purified prothrombin to autothrombin I or autothrombin II (platelet cofactpr II) or autothrombin lia. Thromb. Diath. Haemaorrh., 1960, 5, p. 218.

100. Monagle P., Berry L., O'Brodovich H., Andrew M., Chan A. Covalent heparin cofactor ll-heparin and heparin cofactor ll-dermatan sulfate complexes. Characterization of novel anticoagulants. J. Biol. Chem., 1998, 273, p. 33566.

101. Morrissey J.H., Macik B.G., Neuenschwander P.F. Comp P.C. Quantitation of activated factor VII levels in plasma using a tissue factor mutant selectively deficient in promoting factor VII activity. Blood, 1993, 81, p. 734.

102. Mosesson M.W. Fibrinogen and fibrin polymerization: appraisal of the binding events that accompany fibrin generation and fibrin clot assembly. Blood Coagul. Fibrinolysis, 1997, 8, p.2257.

103. Mosesson M.W. Fibrinogen structure and fibrin clot assembly. Semin. Thromb. Hemost., 1998, 24, p. 169.

104. Mourey L., Samama J.P., Delarue M., et.al. Antithrombin III: structure and functional aspects. Biochem. J., 1990, 72, p. 599.

105. Mueller-Mohnssen H., Shauerte W. Fibrinogen and its derivatives. Biochemistry, physiology and pathophysiology. Elsevier Science Publishers B.V. (Biomed. Devision), 1986, p.169.

106. Murano G., Williams L, Miller-Andersson M. Some properties of antithrombin III and its concentration in human plasma. Thromb Res., 1980, 18, p.259.

107. Muszbek L., Adany R., Mikkola H. Novel aspects of blood coagulation factor XIII. I. Structure, distribution, activation, and function. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci., 1996, 33,p. 357.

108. Naito K. Activation of human blood coagulation factor XI independent of factor XII. Factor XI is activated by thrombin and factor Xla in the presence of negatively charged surfaces. J. Biol. Chem., 1991, 266, p. 7353.

109. Naski M.C., Shafer J.A. A kinetic model for the a-thrombin-catalyzed conversion of plasma level of fibrinogen to fibrin in the presence of antithrombin III. J. Biol. Chem., 1991, 266, p.13003.

110. Neerhof M.G., Krewson D.P., Haut M., Librizzi R.J. Heparin therapy for congenital antithrombin III deficiency in pregnancy. Am. J. Perinatol., 1993, 10, p. 311.

111. Nelson R.M., Long G.L. Solution-phase equilibrium binding interaction of human protein S with C4b-binding protein. Biochemistry, 1991, 30, p. 2384.

112. Nemerson Y. Analysis of the kinetics of factor X activation by tissue factorfactor VIIA. Haemostasis, 1996, 26, p.98.

113. Neuenschwander P.F., Jesty J. Thrombin-activated and factor Xa-activated human factor VIII. Differences in factor activity and decay rate. Arch. Biochem. Biophys., 1992, 296, p. 426.

114. Ogston D. Inhibition of the plasminogen activator urokinase by alpha-tocopherol. Acta Haematol. 1982; 67, p. 114.

115. Ogston D., Bennett B., Douglas A.S., Thrombolytic therapy and fibrinolytic inhibitors, In: R. Biggs, C.R. Rizza (Eds.), Human Blood Coagulation, Haemostasis and Thrombosis, Blackweel Scientific Publications, Oxford, 1984, pp. 455-488.

116. Ogston D, Bennett B, Mackie M. Proceedings: Studies on circulating plasminogen activator. Thromb Diath Haemorrh, 1975, 34, p.609.

117. Olson S.T., Bjork I. Regulation of thrombin by antithrombin and heparin cofactor II. 1991, In: Thrombin: Structure and function, L.J. Berliner (Ed), pp. 127134.

118. Pixley R.A., Coleman R.W. Factor XII. 1993, In: Methods in enzymology, L.Lorand, K.G.Mann (Eds), p. 51-64.

119. Pizzo S.V. Serpin receptor-1: a hepatic receptor that mediates the clearance of antithrombin lll-proteinase complex. Am J Med, 1989, 87, p. 10.

120. Rao L.V.M., Rapaport S.I., Hoang A.D. Binding of factor Vlla to tissue factor premits rapid antithrombin lll/heparin inhibitor of factor Vlla. Blood, 1993, 81, p. 2600.

121. Ratnoff O.D. The development of knowledgeabout haemostasis. 1994, In Haemostasis and Thrombosis, A.L. Bloom, C.D. Forbers, D.P. Thomas, E.G.D. Tuddenham (Eds), pp.3-28.

122. Raut S., Corran P.H., Gaffney P.J. Characterisation of the chains of human fibrinogen isolated by perfusion chromatography using fibrin specific monoclonal antibodies. Thromb. Res., 1995, 79, p. 405.

123. Rezaie A.R., Esmon C.T. Calcium inhibition of the activation of protein C bythrombin. Role of the P3 and P3' residues. Eur. J. Biochem., 1994, 223, p. 575.

124. Rezaie A.R., Esmon C.T. Tryptophans 231 and 234 in protein C report the Ca(2+)-dependent conformational change required for activation by the thrombin-thrombomodulin complex. Biochemistry, 1995, 34, p. 12221.

125. Rick M.E. Protein C and protein S. Vitamin K-dependent inhibitors of blood coagulation. JAMA, 1990, 263, p. 701.

126. Rosing J., Hoekema L., Nicolaes G.A., Thomassen M.C., et al. Effects of protein S and factor Xa on peptide bond cleavages during inactivation of factor Va and factor VaR506Q by activated protein C. J. Biol. Chem., 1995, 270, p. 27852.

127. Rudovitch B., Perrand J.J., Dubose E., De Kepper P. Far from equilibrium dynamics of chemichal systems. 1993, International Symposium, Borki, Poland, p.86.

128. Sadler J.E., Lentz S.R., Sheehan J.P., Tsiang M., Wu Q. Structure-function relationships of the thrombin-thrombomodulin interaction. Haemostasis, 1993, 23, p.183.

129. Sakata Y., Aoki N. Cross-linking of a2-plasmin inhibitor to fibrin by fibrin stabilizing factor. L. Clin. Invest., 1980, 65, p. 293.

130. Sakata Y., Aoki N. Significance of cross-linking of a2-plasmin to fibrin in inhibition of fibrinolisis and in hemostasis. J. Clin. Invtst., 1982, 69, p. 536.

131. Sandset P.M. Tissue factor pathway inhibitor (TFPI) an update. Haemostasis, 1996, 26, p. 154.

132. Sato N., Takahashi H., Shibata A. Fibrinogen/fibrin degradation products and D-dimer in clinical practice: interpretation of discrepant results. Am. J. Hematol., 1995,48, p. 168.

133. Scott C.F., Carrell R.W., Glaser C.B., Kueppers F., Lewis J.H., Colman R.W. Alpha-1-antitrypsin-Pittsburgh. A potent inhibitor of human plasma factor Xla, kallikrein, and factor Xllf. J. Clin. Invest., 1986, 77, p. 631.

134. Scott C.F., Colman R.W. Factors influencing the acceleration of human factor Xla inactivation by antithrombin III. Blood, 1989, 73, p.1873.

135. Shainoff J.R., Smejkal G.B., DiBello P.M., Mitkevich O.V., et al. Isolation and characterization of the fibrin intermediate arising from cleavage of one fibrinopeptide A from fibrinogen. Biol. Chem., 1996, 271, p. 24129.

136. Simpson AJ, Booth NA, Moore NR, Bennett B. Distribution of plasminogen activator inhibitor (PAI-1) in tissues. J Clin Pathol, 1991, 44, p. 139.

137. Smith J.W., Dey N., Knauer D.J. Heparin binding domain of antithrombin III. Characterization using a synthetic peptide directed polyclonal antibody. Biochemistry, 1990, 29, p. 8950.

138. Smith J.W., Knauer D.J. A heparin binding site in antithrombin III. Identification, purification, and amino acid sequence. J. Biol. Chem., 1987, 262, p. 11964.

139. Stenberg Y., Julenius K., Dahlqvist I., Drakenberg T. Et al. Calcium-binding properties of the third and fourth epidermal-growth-factor-like modules in vitamin-K-dependent protein S. Eur. J. Biochem., 1997, 248, p. 163.

140. Stenflo J. A new vitamin K-dependent protein. J. Biol. Chem., 251, 1976, p. 255.

141. Stenflo J., Fernlund P. Aminoacid sequence of the heavy chain of bovin protein C. J. Biol. Chem., 1982, 257, p. 12180.

142. Strickland D.K., Kessler C.M. Biochemical and functional properties of protein C and protein S. Clin. Chim. Acta., 1987, 170, p. 1.

143. Tollefsen DM. Heparin cofactor II. Adv. Exp. Med. Biol., 1997, 425, p.35.

144. Vali Z., Scheraga H.A. Localization of the binding site on fibrin for the secondary binding site of thrombin. Biochemistry, 1988, 27, p. 1956.

145. Walker R.K., Krishnaswamy S. The activation of prothrombin by the prothrombinase complex. The contribution of the substrate-membrane interactionto catalysis. J. Biol. Chem., 1994, 269, p.27441.

146. Walker J.B., Nesheim M.E. The molecular weights, mass distribution, chain composition, and structure of soluble fibrin degradation products released from a fibrin clot perfused with plasmin. J. Biol. Chem., 1999, 274, p. 5201.

147. Walker F.J., Scandella D., Fay P.J. Identification of the binding site for activated protein C on the light chain of factors V and VIII. Biol. Chem., 1990, 265, p. 1484.

148. Warn-Cramer B.J., Maki S.L. Purification of tissue factor pathway inhibitor (TFPI) from rabbit plasma and characterization of its differences from TFPI isolated from human plasma. Thromb. Res., 1992, 67, p. 367.

149. Warren R.P., Odell J.D., Warren W.L., Burger R.A., Is decreased blood plasma concentration of the complement C4B protein associated with attention-deficit hyperactivity disorder? J. Am. Acad. Child. Adolesc. Psychiatry, 1995, 34, p. 1009.

150. Weisel J.W., Nagaswami C., Makowski L. Twisting of fibrin fibers limits their radical growth. Proc. Natl., Acad. Sci. USA , 1987, 84, p. 8991.

151. Williams Hematology, E. Beutler, M.A. Lichman, B.S. Coller, T.J. Kipps (Eds), Health Profession division, N.Y., London, Tokio, 1995, p. 1206-1250.

152. Willems G.M., Lindhout T., Hermens W.T., Hemker H.C. Haemostasis, 1991, 21, p. 197.

153. Wiman B., Wallen P. The specific interaction between plasminogen and fibrin. A physiological role of the lysine binding site in plasminogen. Thromb Res., 1977, 10, p.213.

154. Wing L.R., Bennett B., Booth N.A. The receptor for tissue plasminogen activator (t-PA) in complex with its inhibitor, PAI-1, on human hepatocytes. FEBS Lett, 1991, 278, p.95.

155. Wing L.R., Hawksworth G.M, Bennett B., Booth N.A. Clearance of t-PA, PAI-1, and t-PA-PAI-1 complex in an isolated perfused rat liver system. J Lab Clin Med, 1991,117, p.109

156. Wolberg A.S., Morris D.P., Stafford D.W. Factor IX activation by factor Xla proceeds without release of a free intermediate. Biochemistry, 1997, 36, p.4074.

157. Xu J., Esmon N.L., Esmon C.T. Reconstitution of the Human Endothelial Cell Protein C Receptor with Thrombomodulin in Phosphatidylcholine Vesicles96

158. Enhances Protein C Activation. J. Biol. Chem., 1999, 274, p. 6704.

159. Yegneswaran S., Smirnov M.D., Safa O., Esmon N.L. Relocating the active site of activated protein C eliminates the need for its protein S cofactor. A fluorescence resonance energy transfer study. J. Biol. Chem., 1999, 274, p. 5462.

160. Yegneswaran S., Wood G.M., Esmon C.T., Johnson A.E. Protein S alters the active site location of activated protein C above the membrane surface. A fluorescence resonance energy transfer study of topography. J. Biol. Chem., 1997, 272, p. 25013.

161. Zarnitsina V.I, Pokhilko A.V., Ataullakhanov F.I. A mathematical model for the spatio-temporal dynamics of intrinsic pathway of blood coagulation. II. Results. Thromb Res, 1996, 84, p. 333.