Выявление нарушений гемостаза при сепсисе с помощью метода пространственного роста сгустка

Сошитова, Наталья Павловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выявление нарушений гемостаза при сепсисе с помощью метода пространственного роста сгустка
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Выявление нарушений гемостаза при сепсисе с помощью метода пространственного роста сгустка"

005043885

На правах рукописи

СОШИТОВА Наталья Павловна

Выявление нарушений гемостаза при сепсисе с помощью метода пространственного роста сгустка

03.01.02 - биофизика 14.01.21 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 МАЙ 2012

Москва 2012

005043885

Работа выполнена б Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении Гематологический научный центр Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, директор Алтайского филиала ФГБУ Гематологический научный центр МЗСР РФ

доктор биологических наук, профессор, заместитель директора по науке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Центр теоретических проблем Радкевич

физико-химической фармакологии РАН Людмила Александровна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита диссертации состоится «06» июня 2012 года в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.135.02 при ФГБУ Гематологический научный центр МЗСР РФ по адресу: 125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд, д.4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ Гематологический научный центр МЗСР РФ.

Автореферат разослан «_»_2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Е.Е. Зыбунова

Атауллаханов Фазоил Иноятович

Галстян

Геннадий Мартинович

Момот

Андрей Павлович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Нарушения гемостаза при сепсисе характеризуются активацией свертывания, снижением активности системы естественных антикоагулянтов и подавлением системы фибринолиза. Возникающее в результате диссеминированное внутрисосудистое свертывание (ДВС) является частым осложнением сепсиса, ведет к появлению тромбов в микрососудистом русле и, как следствие, к нарушению работы отдельных органов и систем, развитию полиорганной недостаточности, что значительно отягощает состояние больных. Важная роль, которую играют нарушения в системе гемостаза при сепсисе, делает необходимым мониторинг за показателями этой системы, а воздействия на отдельные ее звенья позволяют улучшить течение и прогноз при сепсисе.

Современные диагностические методы малочувствительны к активации свертывания при сепсисе. Большинство клоттинговых тестов направлены на выявление, прежде всего, гипокоагуляции и проводятся в условиях максимальной активации свертывания, поэтому могут не регистрировать гиперкоагуляцию в системе гемостаза. Из-за потребления факторов свертывания крови при сепсисе времена свертывания в этих тестах, несмотря на активацию свертывания, могут быть удлинены, а не укорочены. О гиперкоагуляции и тромбообразовании свидетельствует повышение концентрации в плазме крови Д-димеров, однако этот тест неспецифичен и отражает уже состоявшееся тромбообразование. Такие глобальные тесты свертывания, как тромбоэластография (ТЭГ) и тест генерации тромбина, выявляют при сепсисе замедление фазы активации свертывания с последующей нормальной либо ускоренной фазой распространения процесса. Гипокоагуляция, согласно ТЭГ, чаще наблюдается у больных с ДВС, аналогичные результаты получены и в исследованиях с помощью теста генерации тромбина. Эти данные не позволяют сделать однозначный вывод о возможности использования глобальных тестов для мониторинга системы гемостаза при сепсисе.

Тест пространственного роста сгустка основан на принципе видеомикроскопического наблюдения за ростом фибринового сгустка в плазме после активации свертывания иммобилизованным на поверхности тканевым фактором. Этот метод моделирует условия протекания процесса свертывания in vivo, т.к. отражает как биохимические реакции каскада свертывания, так и процессы диффузии. Данный тест ранее использовался при изучении нарушений свертывания при гемофилиях А и В и других врожденных и приобретенных дефицитах факторов свертывания. Кроме того, он оказался чувствительным к прокоагулянтным изменениям в плазме, вызванным добавлением тромбоцитарных микровезикул, рекомбинантного активированного фактора VII и аптамера - антагониста ингибитора пути тканевого фактора. Эти результаты позволяют предполагать, что тест пространственного роста сгустка может

быть чувствителен к изменениям гемостаза, возникающим при сепсисе. Однако данные о применении данного метода для диагностики нарушений системы гемостаза у больных сепсисом отсутствуют.

Цель работы: Исследовать изменения пространственного роста сгустка у больных сепсисом и септическим шоком в процессе их лечения и сравнить информативность нового метода с традиционными методами оценки состояния гемостаза.

Задачи исследования:

1. Исследовать стабильность параметров пространственного роста сгустка к преаналитическому и аналитическому этапам проведения теста, определить диапазоны нормальных значений параметров теста.

2. Исследовать изменения пространственного роста сгустка и показателей стандартных тестов состояния системы свертывания у больных с сепсисом и септическим шоком в процессе их терапии.

3. Сравнить чувствительность метода пространственного роста сгустка с чувствительностью стандартных тестов времени свертывания и тромбоэластографии.

Научная новизна. В работе оценен диагностический потенциал пространственно гетерогенной экспериментальной модели свертывания крови, изначально разработанной как модель для фундаментальных и прикладных научных исследований. Исследованы изменения динамики пространственного роста сгустка у 16 больных с сепсисом и септическим шоком на протяжении месяца с момента выявления инфекции, измерена стационарная скорость роста сгустка — показатель, учитывающий принципиальную особенности протекания свертывания крови в организме -пространственную неоднородность. Показано, что увеличение стационарной скорости роста сгустка ассоциируется с последующим увеличением в плазме крови концентрации Д-димеров. Таким образом, появление гиперкоагуляции в тесте пространственного роста сгустка в свободной от тромбоцитов плазме по времени опережает повышение концентрации Д-димеров в плазме у больных с сепсисом и септическим шоком и позволяет раньше выявить протромботические состояния.

Научно-практическое значение. Возможность выявлять с помощью пространственного роста сгустка гипо- и гиперкоагуляцию, а также изменения, возникающие при проведении антикоагулянтной терапии, открывает широкий спектр для применения этого метода как для проведения исследований системы гемостаза у больных со склонностью к кровоточивости либо тромбообразованию так и для изучения действия препаратов, воздействующих на свертывание крови.

Положения, выносимые на защиту.

1. Диапазоны нормальных значений параметров пространственного роста сгустка: лаг период от 0.4 до 0.8 мин, начальная скорость от 41 до 51 мкм/мин, стационарная -от 22 до 28 мкм/мин.

2. Параметры пространственного роста сгустка стабильны на этапах подготовки образца и постановки теста. Относительные погрешности определения начальной и стационарной скоростей роста сгустка в тесте не превышают 8%.

3. У больных с сепсисом традиционные клоттинговые тесты, а также параметры ТЭГ не отражают активацию свертывания крови.

4. Пространственный рост сгустка отражает развитие гиперкоагуляции у больных с сепсисом и септическим шоком и гипокоагуляцига на последней стадии ДВС при коагулопатии потребления.

5. Пространственный рост сгустка регистрирует развитие гиперкоагуляции у больных с сепсисом и септическим шоком раньше, чем в плазме крови выявляется повышение концентрации Д-димеров. Средняя концентрация Д-димеров в плазме у больных, у которых по данным теста пространственного роста сгустка была зарегистрирована гиперкоагуляция, достоверно выше, чем у больных, у которых по данным этого теста выявлялась нормо- либо гипокоагуляция (457 мкг/л и 234 мкг/л, соответственно; р<0.05).

Апробация работы состоялась 19 сентября 2011 года на заседании проблемной комиссии "Биохимия, биофизика и реология крови" в ФГБУ Гематологический научный центр МЗСР РФ.

Результаты диссертационной работы представлены на научных конференциях: 5-я Всероссийская конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии" (Москва, 3-5 февраля 2011), Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых «Современные проблемы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 24-25 марта 2011), 16th Congress of the European Hematology Association (Лондон, Великобритания, 9-12 июня 2011), XXIII Congress of the International Society of Thrombosis and Haemostasis (Киото, Япония, 23-28 июля 2011).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 12 научных работ. Статей в рецензируемых журналах - 2; публикаций в трудах конференций и съездов-10.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, выводов, практических рекомендаций, приложения и библиографического указателя, включающего 157 источников. Текст диссертации иллюстрирован 6 таблицами и 28 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы. Для проведения теста пространственного роста сгустка использовались следующие реагенты, полученные из ресурсов, указанных в скобках: полиэтиленимин (ICN Biomedicals, США), 10% раствор молочной кислоты (Лабхим, Россия), рекомбинантный фактор Vila (Novo Nordislc, Дания), тромбопластин (Ренам, Россия), хромогенный субстрат для фактора Ха S-2765 (Chromogenix, США), глутаровый альдегид 25% (TED Pella, США), фактор X (Enzyme Research Laboratories, США) и Патромбин SL, Тромборель С, Тромбин-тест, реагент Д-димер (Dade Behring, Германия). Остальные реагенты, используемые в работе, были производства фирмы Sigma-Aldrich (США). Ингибитор фактора ХПа - КТИ - был получен в Институте белка РАН (Россия).

Для проведения контрольных тестов и определения диапазонов норм параметров пространственного роста сгустка использовано 56 образцов плазмы здоровых доноров и 15 образцов плазмы больных различными заболеваниями без признаков инфекции.

Изменения параметров пространственного роста сгустка при сепсисе изучено у 16 больных гемобластозами (3 женщины и 13 мужчин), у которых течение миелотоксического агранулоцитоза осложнилось развитием сепсиса, септического шока. Больные включались в исследование не позже 24 - 48 часов после появления признаков инфекции. После включения в исследование больные обследовались ежесуточно в течение первых пяти дней, а затем раз в неделю на протяжении 28 дней. Часть больных получала антикоагулянтную терапию (антитромбин III, активированный протеин С, неактивированный протеин С и/или гепарин). Обследование больных включало: тест пространственного роста сгустка, активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбин по Квику (ПВ), тромбиновое время (ТВ), ТЭГ и тест на Д-димеры, активность факторов и ингибиторов свертывания крови, выполнялся клинический анализ крови.

Подготовка плазмы крови. Кровь получали путем венепункции и забирали в силиконированные пробирки, содержащие 3.8% раствор цитрата натрия, соотношение объемов крови и цитрата натрия - 9:1. После перемешивания часть крови забиралась для выполнения ТЭГ. Оставшуюся часть заготовленной цитратной крови использовали для приготовления свободной от тромбоцитов плазмы. Для этого из крови отделяли эритроциты путем центрифугирования в течение 15 минут при 1600g, затем отбирали бедную тромбоцитами плазму - надосадок. Полученную бедную тромбоцитами плазму центрифугировали 5 минут при 10000g для удаления тромбоцитов. pH плазмы стабилизировали в диапазоне 7.2-7.4.

Коагулологические тесты и ТЭГ. Определение АЧТВ, ПВ, ТВ и концентрации Д-димеров проводилось на образцах бедной тромбоцитами плазмы на автоматическом

коагулометре «Sysmex СА-1500» (Sysmex Corporation, Япония). ТЭГ выполняли на тромбоэластографе TEG 5000 с использованием одноразовых чашечек с гепариназой (Haemonetics Corporation, США). Тест выполнялся через 10-40 мин после взятия крови. Анализировались следующие параметры ТЭГ: R - время реакции, к - время свертывания, а - угол наклона восходящей части ТЭГ и МА - максимальная амплитуда.

Пространственный рост сгустка. Тест выполнялся на приборе Тромбоимаджер («ООО» Гемакор, Россия). Особенностью метода является локальная активация свертывания поверхностью с иммобилизованным тканевым фактором и регистрация растущего фибринового сгустка в неперемешиваемом тонком слое свободной от тромбоцитов плазмы, содержащей ингибитор контактной активации, по светорассеянию, методом темного поля (рис. 1А). За 10 мин до постановки теста к 300 мкл плазмы добавляли 12 мкл 10 мг/мл раствора КТИ. Активатор помещался в буфер (20 нМ HEPES, 150 мМ NaCl, рН 7.2-7.4) для предотвращения формирования пузырей у активатора. Раствор 1 М СаСЬ, активатор в буфере и плазма инкубировались при 37°С 10 мин. Тонкая плоская измерительная кювета помещалась в термостат прибора при 37°С. Затем плазма рекальцифицировалась добавлением б мкл 1 М СаСЬ, и 300 мкл плазмы помещалось в кювету. Активатор вынимался из буфера, излишки которого удалялись фильтровальной бумагой, и помещался в кювету для запуска свертывания. Фотографии растущего сгустка выполнялись каждые 15с в течение 60 мин.

Обработка экспериментальных кадров и анализ данных. На основании серии фотографий для каждого эксперимента рассчитывались параметры пространственного роста сгустка. Первый кадр серии считался фоновым, и при обработке из интенсивности каждого пикселя каждого кадра вычиталась интенсивность соответствующего пикселя фонового кадра. Вдоль линии, перпендикулярной к активатору, рассчитывались профили роста сгустка (рис. 1Б) как средняя интенсивность светорассеяния в зависимости от расстояния от активатора. Для каждого профиля рассчитывался размер сгустка как координата, при которой интенсивность светорассеяния равнялась 50% от максимальной, что соответствует превращению половины всего фибриногена в фибрин. На основании зависимостей размера сгустка от времени определяли следующие параметры (рис. 1В): лаг период (задержка между моментом контакта плазмы с активатором и началом роста сгустка); начальная скорость роста сгустка (тангенс угла наклона прямой, аппроксимирующей участок зависимости размера сгустка от времени с момента начала роста сгустка и последующие 10 минут); стационарная скорость (тангенс угла наклона прямой, аппроксимирующей участок зависимости размера сгустка от времени между 10-й и 40-й минутами после начала роста сгустка). При постановке каждого теста рассчитывались 3 значения каждого из параметров в разных областях активатора и усреднялись для вычисления среднего. Состояние гиперкоагуляции также

характеризовалось образованием спонтанных фибриновых сгустков вдали от активатора свертывания. Для описания процесса появления спонтанных сгустков строилась зависимость средней интенсивности светорассеяния в области их формирования от времени (рис. 1В) и вычислялось время их появления как время достижения 5% от максимальной интенсивности светорассеяния. Для определения диапазонов нормальных значений параметров пространственного роста сгустка тест был проведен на плазмах 15 здоровых доноров (возраст 23-62 года, среднее 29, медиана 26; 8 женщин и 7 мужчин). Диапазоны норм были приняты равными средним значениям рассматриваемых параметров ± стандартное отклонение.

Статистическая обработка результатов. Анализ статистических различий выполнялся по двухвыборочному ^критерию Стьюдента для двух независимых выборок и по и-критерию Манна-Уитни с уровнем статистической значимости (р) равным 0.05. Корреляция между данными оценивалась по коэффициенту корреляции Спирмена. При статистическом анализе данных вычислялись среднее значение, медиана и стандартное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Пространственный рост сгустка в норме и при нарушениях свертывания. Поскольку метод пространственного роста сгустка является новым, приводятся результаты исследования этим методом в различных ситуациях. На рисунке 1А приведены примеры фотографий пространственного роста сгустка при выполнении теста с образцами плазмы здорового донора и больных с гипо- и гиперкоагуляцией. Поскольку фибрин хорошо рассеивает излучение в видимом диапазоне, сгусток выглядит на фотографиях как увеличивающаяся светлая область на фоне темной, несвернувшейся плазмы. После приведения плазмы в контакт с поверхностью с нанесенным тканевым фактором с высокой плотностью, фибриновый сгусток через небольшой промежуток времени начинает формироваться на активаторе, затем он постепенно распространяется от активатора вглубь плазмы, одновременно уплотняясь. В норме сгусток растет только от активатора, однако при гиперкоагуляции может наблюдаться феномен активатор-независимого свертывания — появление и рост фибриновых сгустков вдали от активатора в объеме плазмы. Такие сгустки обозначаются как спонтанные сгустки, а сам феномен - образование спонтанных сгустков (область их появления выделена на рисунке белым прямоугольником).

На рисунке 1Б приведены профили роста сгустка для тестов, представленных на панели А. По профилям роста сгустка видна разница в характере роста сгустка в пространстве в норме и при патологиях. В случае нормального роста сгустка и гиперкоагуляции, профили растущего сгустка имеют плато - то есть интенсивность светорассеяния растущего сгустка выглядит как ступенька, а при гипокоагуляции такая ступенька отсутствует и профили имеют пологий, «диффузный» вид.

А гипо- нормальный гиперкоагуляция рост сгустка коагуляция

20 мин

30 мин

60 мин

1 мм 1 щ

■ ■

шшш

...........;

тт

ш ■

—

я ■

1 ■

нормальный рост сгустка ш ^

I..............г я г

Расстояние от активатора, мм

О 10 20 30 40 60 60

Время, мин

Рис. 1. Пространственный рост сгустка: чувствительность к различным состояниям системы свертывания. (А) Фотографии растущего сгустка в образцах плазмы здорового донора и больных с гипо- и гиперкоагуляцией. Активатор с нанесенным тканевым фактором виден сверху каждой фотографии как горизонтальная черная полоска. Белый прямоугольник обозначает область образования спонтанных сгустков. (Б) Профили роста сгустка для экспериментов на панели (А). (В) Зависимость светорассеяния в области роста спонтанных сгустков от времени (слева) и зависимость размера сгустка от времени (справа) для экспериментов на панели (А). Основные параметры пространственного роста сгустка: начальная скорость роста сгустка, Устац - стационарная скорость роста сгустка. Теп - время возникновения спонтанных сгустков

с * ?. з Время, мин

Расстояние от активатора, мм

гипокоагуляция 1С ^

8 г

гиперкоагуляция

Время, мин

Расстояние от активатора, мм

гиперкоагуляция нормальный рост сгустка гипокоагуляция

20 30 40 30 60 Время, МИН

На профилях, соответствующих пространственному росту сгустка в плазме больного с гиперкоагуляцией, видно появление со временем дополнительного центра образования сгустка вдали от активатора. В случае выраженной гиперкоагуляции весь объем образца плазмы может свернуться за время эксперимента. Состояния гипо- и гиперкоагуляции характеризуются пониженными и повышенными скоростями роста сгустка, соответственно (рис. 1Б).

Слева на рисунке 1В показана зависимость средней интенсивности светорассеяния в области образования спонтанных сгустков от времени. В случае нормального роста сгустка и гипокоагуляции спонтанные сгустки не образуются в течение всего времени эксперимента. При гиперкоагуляции спонтанные сгустки начинают активно появляться и расти через некоторое время после начала исследования. В качестве характерного времени возникновения спонтанных сгустков было принято время достижения 5% от максимальной интенсивности светорассеяния в области образования спонтанных сгустков. В приведенном примере за счет образования спонтанных сгустков весь объем плазмы свернулся меньше, чем через 50 минут от начала эксперимента. На рисунке 1В также представлены основные параметры метода пространственного роста сгустка.

В результате обследования здоровых доноров определены следующие диапазоны нормальных значений параметров пространственного роста сгустка: время задержки роста сгустка - от 0.4 до 0.8 мин, начальная скорость роста сгустка - от 41 до 51 мкм/мин, стационарная скорость роста сгустка - от 22 до 28 мкм/мин. В норме на протяжении всего времени исследования (60 мин) спонтанные сгустки не должны появляться.

Контрольные исследования для теста пространственного роста сгустка. Была изучена зависимость пространственного роста сгустка от условий осаждения клеток, пространственный роста сгустка в бедной и свободной от тромбоцитов плазмах, стабильность пространственного роста сгустка на бедной тромбоцитами плазме, пространственный рост сгустка на образцах крови, полученной из разных вен, стабильность пространственного роста сгустка на одном и том же образце плазмы крови, изменения параметров пространственного роста сгустка у здоровых доноров при наблюдении за ними в течение 8 недель. Эти исследования показали, что параметры теста при выполнении его со свободной от тромбоцитов плазмой стабильны и не зависят от процесса приготовления образца плазмы для анализа.

Относительные ошибки определения параметров пространственного роста сгустка на аналитическом этапе составляют 4% для начальной скорости, 7% - для стационарной скорости, 23% - для лаг периода. Относительные погрешности, получаемые при повторном заборе крови, в среднем равны 7% для начальной скорости, 8% - для стационарной скорости, 12% - для лаг периода. Они практически совпадают по величине с разбросами, получаемыми при повторных выполнениях теста на одном и

том же образце плазмы.

При выполнении теста пространственного роста сгустка с бедной тромбоцитами плазмой было показано, что наличие тромбоцитов сказывается на его результатах. Скорости сроста сгустка в тесте с бедной тромбоцитами плазмой были значительно выше, чем в тесте со свободной от тромбоцитов плазмой. Средние значения и стандартные отклонения для стационарных скоростей, полученные на образцах бедной и свободной от тромбоцитов плазмы, равны, соответственно, 28 ± 5 мкм/мин и 23 ± 4 мкм/мин (р<0.05). Результаты, получаемые на бедной тромбоцитами плазме, оказались значительно менее стабильными и более чувствительными к процессу подготовки образца, чем результаты на свободной от тромбоцитов плазме. При выполнении теста с бедной тромбоцитами плазмой чаще возникали спонтанные сгустки как у здоровых доноров, так и у больных с различными патологиями.

По результатам исследования пространственного роста сгустка у здоровых доноров на протяжении 8 недель обнаружены значительные колебания всех параметров: лаг период варьировал на 79%, начальная скорость - на 24%, стационарная - на 34%. Эти изменения, в основном, происходили в пределах нормальных диапазонов параметров. Показатели стандартных тестов свертывания находились в пределах нормальных значений на протяжении всего времени наблюдения.

Пространственный рост сгустка у больных с сепсисом и септическим шоком. На рисунке 2 представлена динамика параметров гемостаза больного с септическим шоком, у которого развился тромбоз левой внутренней яремной вены на 5 день наблюдения. Больной получал терапию активированным протеином С с первого дня шока. В день окончания курса терапии у него развился тромбоз, и больному с 5 по 22 дни была назначена терапия нефракционированным гепарином, а затем с 23 по 27 день - терапия низкомолекулярным гепарином (фраксипарином). Пространственный рост сгустка выявил у больного гиперкоагуляцию с образованием спонтанных сгустков уже на 4 сутки наблюдения, т.е. за сутки до появления клинических признаков венозного тромбоза.

Среди параметров пространственного роста сгустка для выявления гиперкоагуляции наиболее чувствительной оказалась стационарная скорость роста сгустка. Она была на 80% выше нормы на момент выявления тромбоза, в то время как начальная скорость превышала норму всего на 12%. Образование спонтанных сгустков на рис. 2 характеризуется зависимостью от времени величины 1/Тсп, обратной времени появления спонтанных сгустков - чем больше эта величина, тем раньше появляются спонтанные сгустки в тесте, и тем более выражена гиперкоагуляция.

Дєиь

гипокоагупяция норма-коагуляция гиперкоагуляция день тромбоза

Рис. 2. Динамика параметров коагулологических тестов у больного с септическим шоком.

Концентрация Д-димеров в плазме оставалась в пределах нормальных значений на момент тромбоза и повысилась лишь на 22 сутки. Значения тестов АЧТВ, протромбина по Квику, ТВ и ТЭГ были на момент выявления тромбоза в пределах соответствующих диапазонов норм. Таким образом, пространственный рост сгустка оказался более чувствительным методом выявления активации системы свертывания крови при сепсисе, чем стандартные клоттинговые тесты свертывания, ТЭГ, а также тест на Д-димеры.

После назначения гепарина по данным пространственного роста сгустка, АЧТВ и ТЭГ выявляли гипокоагуляцию. В день перерыва в антикоагулянтной терапии с помощью теста пространственного роста сгустка вновь выявили гиперкоагуляцию, а в конце периода наблюдения параметры теста вернулись в область нормальных значений.

Значения тестов времени свертывания (АЧТВ, протромбин по Квику, ТВ) на протяжении всего периода наблюдения находились в области нормы либо регистрировали гипокоагуляцию. Аналогичная динамика показателей клоттинговых тестов и ТЭГ наблюдалась у всех больных, включенных в исследование. Из всех общепринятых тестов для выявления активации свертывания при сепсисе наиболее чувствительным было исследование плазменной концентрации Д-димеров. Но повышение плазменной концентрации Д-димеров отражает процесс лизиса тромбов и, следовательно, свидетельствует об уже состоявшемся тромбообразовании, т.е. является поздним маркером.

По результатам пространственного роста сгустка состояние гиперкоагуляции наблюдалось в 36 из 116 (31%) случаев, при этом в 33 из 36 (92%) случаев увеличение скоростей сопровождалось наличием спонтанных сгустков.

Пространственный рост сгустка позволял отслеживать эффекты, вызванные назначением и отменой антикоагулянтов (гепарина, антитромбина III).

Динамика стационарной скорости роста сгустка и плазменной концентрации Д-димеров у больных с гиперкоагуляцией. Всего по результатам исследования пространственного роста сгустка у 6 больных наблюдалось развитие гиперкоагуляционного состояния. У 5 из 6 гиперкоагуляция подтвердилась последующим увеличением концентрации Д-димеров в плазме крови (рис. ЗА). При этом резкого повышения уровня Д-димеров не наблюдалось, если параметры пространственного роста сгустка у этих больных находились в области нормальных значений или гипокоагуляции. На рисунке ЗА показана динамика стационарной скорости роста сгустка и концентрации Д-димеров в плазме для этих 5 больных. На рисунке ЗБ приведено сравнение концентраций Д-димеров в плазме крови между группами больных с гиперкоагуляцией, либо нормальными значениями и гипокоагуляцией, оцененными по тесту пространственного роста сгустка.

Статистическое сравнение проводилось на основании 39 пар данных по плазменным концентрациям Д-димеров и стационарным скоростям, полученных при наблюдении за б больными с гиперкоагуляцией.

с х 60

ї 1 40

300 § 2 20 и

Ч >

10 15 20 25

День

О 5 10 15 20 25 30 День

™ к;

С >

10 День

V стац Д-димеры

V стац превысила норму увеличился уровень Д-димеров диапазон норм V стац диапазон норм Д-димеров

л л

а і (

ф о

2 4

<29 Ъ 4 >29

МШ 'М'.ІН \ / МКМ'Г.'ИН

Усгац (день п)

I 900

3 =

о- л 600

V X

5 (и

3 а

9 300

<29 * 4 >29

МКМ/МИН\ / мкмУмин \/сгац (день л)

Рнс. 3. Сравнение динамики стационарной скорости роста сгустка и концентрации Д-димеров. На рисунке ЗА представлена динамика стационарной скорости и концентрации Д-димеров в плазме у 5 больных за время наблюдения. На рисунке ЗБ - статистическое сравнение плазменных концентраций Д-димеров, разделенных на группы по соответствующим значениям стационарной скорости в тот же день (слева) либо на момент предыдущего измерения (справа). * - р <0,05.

Значения концентраций Д-димеров в плазме в группах, разделенных в соответствии со значениями стационарной скорости роста сгустка, измеренными в тот же день, статистически значимо не отличались. Среднее значение уровня Д-димеров в группе, соответствующей Устац > 29 мкм/мин, составляло 402 мкг/л, а в группе, соответствующей Устац < 29 мкм/мин - 359 мкг/л. Значения концентраций Д-димеров в плазме в группах, разделенных в соответствии со значениями стационарной скорости роста сгустка на момент предыдущего измерения, статистически достоверно отличались по и-критерию Манна-Уитни (р < 0.05). Средние значения уровней Д-димеров составляли 457 мкг/л и 234 мкг/л для групп, соответствующих по тесту пространственного роста сгустка гиперкоагуляции (Устац > 29 мкм/мин) либо норме и гипокоагуляции (Устац < 29 мкм/мин), соответственно.

Таким образом, с помощью теста пространственного роста сгустка гиперкоагуляцию регистрировали раньше повышения концентрации Д-димеров в плазме крови.

Оценка различий в плазменной концентрации Д-димеров у больных с гипокоагуляцией, либо нормой и гиперкоагуляцией по данным АЧТВ и ТЭГ. Поскольку клоттинговые тесты и ТЭГ выявляли гиперкоагуляцию достаточно редко (в 1-2 случаях), было решено сравнить концентрации Д-димеров в плазме, соответствующие гипокоагуляции, либо норме и гиперкоагуляции, которые регистрировались по тестам АЧТВ и ТЭГ. Группы Д-димеров разделялись в соответствии со значениями рассматриваемых тестов в этот же день либо на момент предыдущего измерения.

Не найдено статистически значимых различий между плазменными концентрациями Д-димеров как в группах, разделенных в соответствии со значениями АЧТВ и ТЭГ (гипо- либо норма- и гиперкоагуляция), измеренными в тот же день, так и в группах, разделенных в соответствии со значениями параметров этих тестов на момент предыдущего измерения (рис. 4).

Таким образом, ни один из рассматриваемых тестов не выявлял гиперкоагуляцию раньше или одновременно с тестом на уровень Д-димеров в плазме.

Информативность теста пространственного роста сгустка у больных без прогрессирую1цей гиперкоагуляции. У оставшихся 10 больных с сепсисом и септическим шоком в первые дни наблюдения плазменная концентрация Д-димеров значительно превышала норму, в дальнейшем она оставалась такой же или постепенно снижалась. По данным теста пространственного роста сгустка в случае выздоровления наблюдалась нормализация свертывания (4 больных), либо в случае летального исхода (6 больных) регистрировалось развитие гипокоагуляции. Параметры остальных тестов также находились в пределах нормы либо гипокоагуляции. По данным теста пространственного роста сгустка, у 3 из 6 больных с летальным исходом изначально наблюдалась гиперкоагуляция, у других 3 - гипокоагуляция. Скорости роста сгустка во

второй группе так и оставались сниженными все время наблюдения, а в первой группе наблюдалось изменение параметров пространственного роста сгустка из области гипер-в область гипокоагуляции. В целом, у всех умерших больных наблюдалась схожая картина уменьшения стационарной скорости роста сгустка в терминальной стадии болезни. Такое уменьшение скорости наряду со значительным повышением концентрации Д-димеров свидетельствует о развитии коагулопатии потребления.

О. І і О) 0) 1

5 Ч

5Г

? : сг

ч ч

»38 с\ /*<38 с

АЧТВ (день п)

»38 с\ /-ЛІ с

АЧТВ (деньп)

X 600

300

>27 мин\ /<21 I

Й (день п)

2 ©

§ 300

»27 мин\ / <21 г ^ (день 11)

2 л

О. X ф ф

Ч СГ

<22'\ />22' и (день п)

5 Щ

§ 300

<22" \ />22." а (день п)

Рнс. 4. Статистическое сравнение различных групп значений концентраций Д-димеров.

Прямоугольные диаграммы соответствуют группам значений концентраций Д-димеров в плазме, разделенных в соответствии со значениями АЧТВ (А) либо параметрами ТЭГ - Я (Б) и а (В) в тот же день (слева) либо на момент предыдущего измерения (справа). Рассматриваемые пары групп значений Д-димеров статистически значимо не отличались.

Корреляции между параметрами коагулологических тестов. В работе была проведена оценка корреляции между различными параметрами рассматриваемых тестов по данным всех анализов исследуемой группы больных (16 больных, 120 значений для каждого параметра). Наблюдалась достоверная корреляция внутри тестов. У АЧТВ и ПВ коэффициент корреляции Спирмена составлял -0.65. Коэффициент корреляции Спирмена между параметрами ТЭГ Я и а равен -0.82. Между начальной и стационарной скоростями роста сгустка коэффициент корреляции составлял 0.74.

В то же время, корреляция между параметрами различных тестов была низкой. Между параметрами ТЭГ и тестами АЧТВ и протромбина по Квику не было статистически достоверной корреляции. Выявлена статистически достоверная слабая корреляция между стационарной скоростью роста сгустка и всеми рассматриваемыми тестами. Такая слабая корреляция между параметрами рассматриваемых тестов может объясняться принципиальными различиями в принципах их проведения. Тесты АЧТВ и ПВ моделируют свертывание вблизи активатора в условиях максимальной активации. ТЭГ также проводится в гомогенной системе, и ее результаты дополнительно зависят от функции тромбоцитов, так как анализ проводится на цельной крови. Пространственный рост сгустка проводится в реакционно-диффузионной системе и отражает процесс формирования сгустка в пространстве. Таким образом, все тесты регистрируют процесс свертывания в разных условиях.

Важным результатом данной работы является установление факта, что у больных с сепсисом тест пространственного роста сгустка в свободной от тромбоцитов плазме может выявлять гиперкоагуляцию значительно раньше, чем регистрируется повышение плазменной концентрации Д-димеров. Эта работа является первой попыткой оценить диагностический потенциал данного метода, который изначально разрабатывался как метод для фундаментальных и прикладных научных исследований. Основная идея этой модели свертывания состоит в том, что процесс формирования фибринового сгустка пространственно неоднороден, и диффузия факторов свертывания — важный компонент, регулирующий этот процесс. В отличие от большинства применяемых в клинической практике тестов, в которых свертывание происходит в гомогенной среде, в модели пространственного роста сгустка свертывание активируется не гомогенно распределенным тканевым фактором, а поверхностью с иммобилизованным тканевым фактором. Известно, что чувствительность клоттинговых тестов увеличивается при уменьшении уровня активации, поэтому логично было предположить, что гиперкоагуляцию проще обнаружить в системе с локализованным тканевым фактором.

В этой работе показано, что ускоренный рост сгустка в пространстве ассоциируется с последующим увеличением концентрации Д-димеров в плазме крови. Средняя концентрация Д-димеров в плазме в группе больных, у которых наблюдалась гиперкоагуляция по данным пространственного роста сгустка, достоверно выше

средней плазменной концентрации Д-димеров в группе больных, у которых наблюдалась норма либо гипокоагуляция по данным этого теста. Таким образом, пространственный рост сгустка оказался чувствительным к активации системы свертывания крови при сепсисе, причем он способен регистрировать гиперкоагуляцию раньше теста на Д-димеры и может быть использовании как ранний маркер тромботических осложнений.

Ограничением данной работы является относительно небольшое число больных, включенных в исследование. Всего было включено 16 больных, из которых только у 6 наблюдалось развитие гиперкоагуляционного состояния с момента начала исследования; у остальных 10 больных плазменная концентрация Д-димеров изначально значительно превышала норму. Однако по результатам проведения исследования для указанных шести пациентов было собрано 39 пар данных о параметрах пространственного роста сгустка и уровнях Д-димеров в плазме, что позволило получить статистически значимые предварительные результаты.

По результатам проведенного исследования установлено, что такие широко распространенные коагулологические тесты, как АЧТВ, протромбин по Квику и ТЭГ, малочувствительны к активации свертывания при сепсисе.

Диапазоны нормальных значений параметров пространственного роста сгустка, полученные в данной работе, были рассчитаны на основании результатов теста пространственного роста сгустка, выполненного у небольшой выборки здоровых (в основном, молодых) доноров. Эти диапазоны, безусловно, не являются истинными диапазонами норм, которые используются при работе с утвержденными общепринятыми диагностическими методами. Это, скорее, референсные значения, полученные в контрольной группе для данного исследования. Однако такое ограничение не влияет на интерпретацию полученных результатов.

В методе пространственного роста сгустка состояние гиперкоагуляции характеризуется не только количественными, но и качественными изменениями: появлением спонтанных сгустков в объеме плазмы вдали от активатора свертывания. Природа появления спонтанных сгустков пока не выяснена. Их появление может быть объяснено присутствием прокоагулянтного материала в плазме крови: при сепсисе регистрируется увеличение количества прокоагулянтных фосфолипидных микровезикул, несущих тканевой фактор; под действием провоспалительных цитокинов эндотелиальные клетки могут экспрессировать и выделять растворимый тканевой фактор; некоторые бактерии выделяют протеиназы, способные напрямую активировать факторы свертывания. Какой из этих механизмов является причиной появления спонтанных сгустков, еще предстоит выяснить, и эта причина может оказаться разной у разных больных. Однако уже сейчас очевидно, что их наличие может служить дополнительным диагностическим маркером гиперкоагуляции.

Ограничением данной работы является и то, что, несмотря на выявленную гиперкоагуляцию, только в одном случае было зарегистрировано тромботическое осложнение. Вывод о более раннем выявлении гиперкоагуляции с помощью теста пространственного роста сгустка сделан на основании сравнения его результатов с данными о концентрации Д-димеров в плазме крови. Уровень Д-димеров в плазме крови является маркером активации системы свертывания при сепсисе. Повышение уровня Д-димеров при сепсисе может происходить еще до появления клинической картины сепсиса, что объясняет выявление повышенной концентрации Д-димеров в плазме крови у части больных в первый же день включения их в исследование. При этом Д-димеры достаточно долго циркулируют в крови, их уровень может оставаться высоким в течение нескольких недель после состоявшегося тромбообразования. Таким образом, Д-димеры отражают существующую либо бывшую активацию системы свертывания при сепсисе и сопутствующее микротромбирование, тромбозы. Повышение уровня Д-димеров в плазме крови подтверждает факт того, что у больного есть гиперкоагуляция. Это свойство позволяет использовать тест на Д-димеры для оценки возможности определения гиперкоагуляции с помощью теста пространственного роста сгустка.

Проведенные в работе контрольные исследования показали, что параметры теста пространственного роста сгустка в свободной от тромбоцитов плазме стабильны как в отношении этапа приготовления образца к анализу, так и в отношении самого аналитического этапа. Причины наблюдаемых колебаний параметров пространственного роста сгустка у здоровых доноров в пределах диапазонов норм еще предстоит выяснить.

Полученные данные открывают широкие перспективы для проведения дальнейших прикладных исследований. В частности, на основании описанной в работе методики возможна разработка различных модификаций для улучшения ее чувствительности. Например, использование в тесте пространственного роста сгустка гепариназы могло бы быть полезным для оценки эффектов гепарина.

Полученные в этой работе данные позволяют заключить, что системы, исследующие свертывание в пространстве от локализованного на поверхности активатора, имеют хороший диагностический потенциал.

ВЫВОДЫ

1. Широко применяемые в клинической практике клоттинговые тесты, а также тромбоэластография малочувствительны к активации свертывания крови, происходящей при сепсисе. Их нормальные значения не позволяют исключить гиперкоагуляцию у больных с сепсисом.

2. Процесс подготовки плазмы оказывает влияние на результаты теста

пространственного роста сгустка. Результаты, получаемые на бедной тромбоцитами плазме, менее стабильны и более чувствительны к процессу подготовки образца плазмы для исследования, чем результаты на свободной от тромбоцитов плазме. В связи с этим тест должен выполняться на свободной от тромбоцитов плазме крови. В этом случае его отличает высокая воспроизводимость, относительная погрешность определения его параметров не превышает 8%.

3. Метод пространственного роста сгустка позволяет выявлять активацию свертывания, возникающую на ранних стадиях сепсиса. Метод пространственного роста сгустка регистрирует развитие гиперкоагуляционного состояния у больных с сепсисом и септическим шоком раньше, чем тест на Д-димеры, и может быть использован как ранний маркер тромботических осложнений.

4. С помощью параметров пространственного роста сгустка можно верифицировать различные стадии нарушений гемостаза при сепсисе: активацию свертывания в дебюте заболевания, нормализацию параметров при успешной терапии сепсиса и благоприятном исходе и гипокоагуляционное состояние, развивающееся вследствие коагулопатии потребления, нарушения функции печени.

5. С помощью метода пространственного роста сгустка можно мониторировать у больных с сепсисом эффективность антикоагулянтной терапии гепарином, концентратом антитромбина III. Метод малочувствителен к изменениям гемостаза, возникающим при терапии активированным протеином С.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Soshitova NP, Karamzin SS, Balandina AN, Fadeeva OA, Kretchetova AV, Galstian GM, Panteleev MA, Ataullakhanov FI. Spatial clot growth can predict prothrombotic changes of coagulation state in sepsis. J Thromb. Haemost. 2011; 9 (Suppl 2): 423.

2. Дашкевич H.M., Ованесов M.В., Пантелеев М.А., Шестаков П.И., Сошитова Н.П., Баландина А.Н., Карамзин С.С., Атауллаханов Ф.И. Новый метод изучения системы свертывания: исследование пространственной динамики тромбина. Материалы 5-й Всероссийской конференции "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии", 3-5 февраля 2011, Москва, с. 162-163.

3. Сошитова Н.П., Карамзин С.С., Баландина А.Н., Фадеева О.А., Дашкевич Н.М., Кречетова А.В., Галстян Г.М., Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. Метод пространственного роста сгустка детектирует развитие гиперкоагуляционного состояния при сепсисе на несколько дней раньше теста на Д-димеры. Материалы 5-й Всероссийской конференции "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии", 3-5 февраля 2011, Москва, с. 481-482

4. Soshitova NP, Karamzin SS, Balandina AN, Fadeeva OA, Kretchetova AV, Galstian GM, Panteleev MA, Ataullakhanov FI. New method of prothrombotic tendencies prediction in sepsis: spatial clot growth. Haematologica. 2011; 96 (Suppl 2): 262.

5. Сошитова Н.П., Карамзин С.С., Баландина А.Н., Фадеева О.А., Кречетова А.В., Гапстян Г.М., Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. Новый метод пространственного роста сгустка чувствителен к нарушениям гемостаза при сепсисе. Вестник гематологии, 2011; 7 (1): 121-122.

6. Пантелеев М.А., Баландина А.Н., Сошитова Н.П., Галстян Г.М., Емельяненко В.М., Воробьев А.И., Атауллаханов Ф.И. Пространственная динамика гемостаза и тромбоза: теория и практика. Тромбоз, гемостаз и реология, 2010 4 (44), с. 48-60.

7. Атауллаханов Ф.И., Баландина А.Н., Пантелеев М.А., Емельяненко В.М., Галстян Г.М., Копылов К.Г., Кумскова М.А., Карамзин С.С., Фадеева О.А., Сошитова Н.П., Липец Е.Н., Тарандовский И.Д., Щербина И.А. Пространственный рост фибринового сгустка как новый метод диагностики кровоточивости и тромбозов. Материалы 5-й Всероссийской конференции "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии", 3-5 февраля 2011, Москва, с. 43-44.

8. Баландина А.Н., Урнова Е.С., Марголин О.В. Сошитова Н.П., Липец Е.Н., Тарандовский И.Д., Щербина И.А., Карамзин С.С., Фадеева О.А., Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. Оценка системы гемостаза у пациентов с онкогематологическими заболеваниями на основе нового диагностического метода регистрации пространственного роста сгустка. Материалы 5-й Всероссийской конференции "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии", 3-5 февраля 2011, Москва, с. 49-50.

9. Щербина И.А., Баландина А.Н., Емельяненко В.М., Соловьева А.А., Леонтьева Т.Н., Карамзин С.С., Фадеева О.А., Сошитова Н.П., Липец Е.Н., Тарандовский И.Д., Полохов Д.М., Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. Исследование пространственного роста фибринового сгустка как новый метод мониторинга состояния пациентов с ишемической болезнью сердца. Материалы 5-й Всероссийской конференции "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии", 3-5 февраля 2011, Москва, с. 577-578.

10. Parunov L.A., Fadeeva О.A., Balandina A.N., Soshitova N.P., Kopylov K.G., Kumskova M.A., Gilbert J.С., Schaub R.G., McGinness K.E., Ataullakhanov F.I., Panteleev M.A. Improvement of spatial fibrin formation by the anti-TFPI aptamer BAX499: changing clot size by targeting extrinsic pathway initiation. J. Thromb. Haemost. 201 1 9 (9): 1825-1834.

11.Panteleev MA, Balandina AN, Emelianenko VM, Fadeeva OA, Galstian GM, Karamzin SS, Lipets EN, Soshitova NP, Tarandovskii ID, Ataullakhanov FI. Imaging spatial dynamics of fibrin clot formation: possibilities for detection of prothrombotic and bleeding tendencies. J. Thromb. Haemost. 2011; 9 (Suppl 2): 495 p.

12. Parunov L.A., Fadeeva O.A., Balandina A.N., Soshitova N.P., Kopylov K.G., Kumskova M.A., Gilbert J.C., Schaub R.G., McGinness K.E., Ataullakhanov F.I., Panteleev M.A. Improvement of spatial fibrin formation by the anti-TFPI aptamer BAX499: changing clot size by targeting extrinsic pathway initiation. J. Thromb. Haemost. 2011; 9 (Suppl 2): 230.

Подписано в печать:

02.05.2012

Заказ № 7329 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сошитова, Наталья Павловна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Современные представления о системе гемостаза.

1.1.1. Плазменное звено системы свертывания крови.

1.1.2. Активация свертывания.

1.1.3. Рост сгустка в пространстве, петли положительной обратной связи.

1.1.4. Ингибиторы свертывания.

1.1.5. Роль диффузии в процессе свертывания.

1.1.6. Взаимодействие системы свертывания с другими системами.

1.2 Нарушения плазменного звена системы свертывания крови.

1.3 Современные методы диагностики состояния системы свертывания.

1.3.1. Тесты времени свертывания.

1.3.2. Маркеры активации свертывания.

1.3.3. Тромбоэластография.

1.3.4. Тест генерации тромбина.

1.4 Пространственный рост сгустка.

1.5 Нарушения свертывания при сепсисе. ДВС-синдром.

1.5.1. Взаимодействие систем свертывания и воспаления.

1.5.2. ДВС-синдром.

1.6 Постановка задачи.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Общий объем работы.

2.2 Материалы.

2.3 Контрольные группы.

2.3.1. Здоровые добровольцы.

2.3.2. Больные с различными нарушениями в системе свертывания крови.

2.4 Больные в состоянии сепсиса, септического шока.

2.5 Дизайн исследования.

2.6 Подготовка плазмы крови.

2.6.1. Получение крови и плазмы.

2.6.2. Стабилизация рН плазмы.

2.6.3. Ингибирование контактной активации.

2.6.4. Рекальцификация плазмы.

2.7 Стандартные коагулологические тесты и ТЭГ.

2.7.1 Клоттинговые тесты и тест на Д-димеры.

2.7.2 Тромбоэластография.

2.8 Иммобилизация тромбопластина на пластиковый активатор.

2.9 Пространственный рост сгустка.

2.9.1. Метод пространственного роста сгустка.

2.9.2. Схема и принцип работы прибора Тромбоимаджер.

2.9.3. Обработка полученных при исследовании кадров и анализ данных.

2.10 Контрольные исследования для теста пространственного роста сгустка.

2.10.1 Диапазон нормальных значений параметров пространственного роста сгустка.

2.10.2 Влияние условий осаждения клеток на пространственный рост сгустка.

2.10.3 Пространственный рост сгустка в бедной тромбоцитами плазме.

2.10.4 Стабильность параметров пространственного роста сгустка.

2.11 Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Пространственный рост сгустка в норме и при нарушениях свертывания. . 51 3.1.1 Диапазон нормальных значений параметров пространственного роста сгустка.

3.2 Контрольные тесты для пространственного роста сгустка.

3.2.1 Зависимость пространственного роста сгустка от условий осаждения клеток.

3.2.2 Пространственный рост сгустка в бедной и свободной от тромбоцитов плазмах.

3.2.3 Стабильность пространственного роста сгустка в бедной тромбоцитами плазме.

3.2.4 Воспроизводимость теста пространственного роста сгустка на образцах плазмы крови, полученной из разных венозных сосудов.

3.2.5 Воспроизводимость теста пространственного роста сгустка, выполненного на одном образце плазмы крови.

3.2.6 Изменение параметров пространственного роста сгустка у здоровых доноров в течение длительного периода времени.

3.3 Пространственный рост сгустка у больных с сепсисом и септическим шоком.

3.3.1. Изменения параметров пространственного роста сгустка у больного с септическим шоком, осложнившимся тромбозом внутренней яремной вены.

3.3.2. Больная с повторными эпизодами септического шока.

3.3.3. Влияние антикоагулянтной терапии на пространственный рост сгустка.

3.4 Динамика стационарной скорости роста сгустка и плазменной концентрации Д-димеров у больных с гиперкоагуляцией.

3.5 Оценка различий в плазменной концентрации Д-димеров у больных с гипокоагуляцией, либо нормой и гиперкоагуляцей по данным АЧТВ и ТЭГ.

3.6 Информативность теста пространственного роста сгустка у больных без прогрессирующей гиперкоагуляции.

3.7 Корреляции между параметрами коагулологических тестов.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Чувствительность метода пространственного роста сгустка к нарушениям гемостаза при сепсисе.

4.2. Стабильность параметров пространственного роста сгустка.

4.3. Перспективы дальнейших исследований и применения метода пространственного роста сгустка в клиниках для лабораторной диагностики.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выявление нарушений гемостаза при сепсисе с помощью метода пространственного роста сгустка"

Нарушения гемостаза при сепсисе характеризуются активацией свертывания, снижением активности системы естественных антикоагулянтов и подавлением системы фибринолиза [1,2]. Возникающее в результате диссеминированное внутрисосудистое свертывание (ДВС) [3] является частым осложнением сепсиса [4], ведет к появлению тромбов в микрососудистом русле и, как следствие, к нарушению работы отдельных органов и систем, развитию полиорганной недостаточности, что значительно отягощает состояние больных [5]. Важная роль, которую играют нарушения в системе гемостаза при сепсисе [6] делает необходимым мониторинг за показателями этой системы, а воздействия на отдельные ее звенья позволяют улучшить течение и прогноз при сепсисе [7,8].

Современные диагностические методы малочувствительны к активации свертывания при сепсисе [9]. Большинство клоттинговых тестов направлены на выявление, прежде всего, гипокоагуляции и проводятся в условиях максимальной активации свертывания, поэтому могут не регистрировать гиперкоагуляцию в системе гемостаза [10]. Из-за потребления факторов свертывания крови при сепсисе времена свертывания в этих тестах, несмотря на активацию свертывания, могут быть удлинены, а не укорочены [11,12]. О гиперкоагуляции и тромбообразовании свидетельствует повышение концентрации в плазме крови Д-димеров [13], однако этот тест неспецифичен и отражает уже состоявшееся тромбообразование. Такие глобальные тесты свертывания, как тромбоэластография (ТЭГ) и тест генерации тромбина, выявляют при сепсисе замедление фазы активации свертывания с последующей нормальной либо ускоренной фазой распространения процесса [12]. Гипокоагуляция, согласно ТЭГ, чаще наблюдается у больных с ДВС [14,15]. Аналогичные результаты получены и в исследованиях, проведенных с помощью теста генерации тромбина [16]. Эти данные не позволяют сделать однозначный вывод о возможности использования глобальных тестов для мониторинга системы гемостаза при сепсисе.

Тест пространственного роста сгустка основан на принципе видеомикроскопического наблюдения за ростом фибринового сгустка в плазме после активации свертывания иммобилизованным на поверхности тканевым фактором (TF). Этот метод моделирует условия протекания процесса свертывания in vivo, так как отражает как биохимические реакции каскада свертывания, так и процессы диффузии [17]. Данный тест ранее использовался при изучении нарушений свертывания при гемофилиях А и Б [17-19] и других врожденных и приобретенных дефицитах факторов свертывания [20,21]. Кроме того, он оказался чувствительным к прокоагулянтным изменениям в плазме, вызванным добавлением тромбоцитарных микровезикул [22], рекомбинантного активированного фактора VII (БVI 1а) [23] и аптамера - антагониста ингибитора пути тканевого фактора (ТРР1) [24]. Эти результаты позволяют предполагать, что тест пространственного роста сгустка может быть чувствителен к изменениям гемостаза, возникающим при сепсисе. Однако данные о применении этого метода для диагностики нарушений системы гемостаза у больных сепсисом отсутствуют.

Задачи исследования:

2. Исследовать изменения пространственного роста сгустка и показателей стандартных тестов состояния системы свертывания у пациентов с сепсисом и септическим шоком в процессе их терапии.

Научная новизна. В работе оценен диагностический потенциал пространственно гетерогенной экспериментальной модели свертывания крови, изначально разработанной как модель для фундаментальных и прикладных научных исследований. Исследованы изменения динамики пространственного роста сгустка у 16 больных с сепсисом и септическим шоком на протяжении месяца с момента выявления инфекции, измерена стационарная скорость роста сгустка - показатель, учитывающий принципиальную особенности протекания свертывания крови в организме - пространственную неоднородность. Показано, что увеличение стационарной скорости роста сгустка ассоциируется с последующим увеличением в плазме крови концентрации Д-димеров. Таким образом, появление гиперкоагуляции в тесте пространственного роста сгустка в свободной от тромбоцитов плазме по времени опережает повышение концентрации Ддимеров в плазме у больных с сепсисом и септическим шоком и позволяет раньше выявить протромботические состояния.

Положения, выносимые на защиту.

4. Пространственный рост сгустка отражает развитие гиперкоагуляции у больных с сепсисом и септическим шоком и гипокоагуляцию на последней стадии ДВС при коагулопатии потребления.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Сошитова, Наталья Павловна

Выводы

2. Процесс подготовки плазмы оказывает влияние на результаты теста пространственного роста сгустка. Результаты, получаемые на бедной тромбоцитами плазме, менее стабильны и более чувствительны к процессу подготовки образца плазмы для исследования, чем результаты на свободной от тромбоцитов плазме. В связи с этим тест должен выполняться на свободной от тромбоцитов плазме крови. В этом случае его отличает высокая воспроизводимость, относительная погрешность определения его параметров не превышает 8%.

Практические рекомендации

1. Рекомендуется выполнять тест пространственного роста сгустка на свободной от тромбоцитов плазме крови, так как процесс подготовки плазмы оказывает влияние на результаты теста пространственного роста сгустка. Результаты, получаемые на бедной тромбоцитами плазме, менее стабильны и более чувствительны к процессу подготовки образца плазмы для исследования, чем результаты на свободной от тромбоцитов плазме. При проведении на свободной от тромбоцитов плазме тест отличается высокой воспроизводимостью.

2. Рекомендуется использовать метод пространственного роста сгустка для исследования состояния системы свертывания у больных сепсисом, септическим шоком. Этот метод позволяет выявлять активацию свертывания, возникающую на ранних стадиях сепсиса. Метод пространственного роста сгустка регистрирует развитие гиперкоагуляционного состояния у больных с сепсисом и септическим шоком раньше, чем тест на Д-димеры, и рекомендуется для использования в качестве раннего маркера тромботических осложнений.

3. Рекомендуется ориентироваться на величину стационарной скорости роста сгустка и наличие спонтанных сгустков для выявления гиперкоагуляции, так как эти параметры наиболее чувствительны к активации свертывания при сепсисе. Нормальные значения параметров теста пространственного роста сгустка: время задержки роста сгустка от 0.4 до 0.8 мин, начальная скорость роста сгустка от 41 до 51 мкм/мин, стационарная скорость роста сгустка от 22 до 28 мкм/мин. Спонтанные сгустки в норме не должны появляться.

4. Активация свертывания характеризуется повышением стационарной скорости роста сгустка выше 29 мкм/мин и появлением спонтанных сгустков. Гипокоагуляционное состояние, развивающееся вследствие коагулопатии потребления, нарушения функции печени, характеризуется снижением скоростей роста сгустка до гипокоагуляционных значений (начальная скорость роста сгустка ниже 41 мкм/мин, стационарная скорость роста сгустка ниже 22 мкм/мин).

5. Рекомендуется мониторировать с помощью метода пространственного роста сгустка у больных с сепсисом эффективность антикоагулянтной терапии гепарином, концентратом антитромбина III.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сошитова, Наталья Павловна, Москва

1. Esmon СТ, Fukudome К, Mather Т, Bode W, Regan LM, Steams-Kurosawa DJ, Kurosawa S. Inflammation, sepsis, and coagulation. Haematologica 1999; 84: 254-259.

2. Levi M. The coagulant response in sepsis and inflammation. Hamostaseologie 2010; 30: 10-16.

3. Levi M, Opal SM. Coagulation abnormalities in critically ill patients. Crit Care 2006; 10: 222.

4. Semeraro N, Ammollo CT, Semeraro F, Colucci M. Sepsis-associated disseminated intravascular coagulation and thromboembolic disease. Mediterr J Hematol Infect Dis 2010; 2:e2010024.

5. Voves C, Wuillemin WA, Zeerleder S. International Society on Thrombosis and Haemostasis score for overt disseminated intravascular coagulation predicts organ dysfunction and fatality in sepsis patients. Blood Coagul Fibrinolysis 2006; 17: 445-451.

6. Bastarache JA, Ware LB, Bernard GR. The role of the coagulation cascade in the continuum of sepsis and acute lung injury and acute respiratory distress syndrome. Semin Respir Crit Care Med 2006; 27: 365-376.

7. Галстян ГМ, Шутова НА, Городецкий ВМ. Антитромбин III в лечении сепсиса -новые подходы к назначению старого препарата. Анестезиология и реаниматология 2007; 6: 66-71.

8. Knoebl Р, Dempfle СЕ. Blood coagulation and inflammation in critical illness. Bremen: UNI-MED, 2008.

9. Baglin T. Using the laboratory to predict recurrent venous thrombosis. Int J Lab Hematol 2011;33:333-342.

10. Dempfle CE. Coagulopathy of sepsis. Thromb Haemost 2004; 91: 213-224.

11. Collins PW, Macchiavello LI, Lewis SJ, Macartney NJ, Saayman AG, Luddington R, Baglin T, Findlay GP. Global tests of haemostasis in critically ill patients with severe sepsis syndrome compared to controls. Br J Haematol 2006; 135: 220-227.

12. Stief TW, Ijagha O, Weiste B, Herzum I, Renz H, Max M. Analysis of hemostasis alterations in sepsis. Blood Coagul Fibrinolysis 2007; 18: 179-186.

13. Sivula M, Pettila V, Niemi TT, Varpula M, Kuitunen AH. Thromboelastometry in patients with severe sepsis and disseminated intravascular coagulation. Blood Coagul Fibrinolysis 2009; 20: 419-426.

14. Daudel F, Kessler U, Folly H, Lienert JS, Takala J, Jakob SM. Thromboelastometry for the assessment of coagulation abnormalities in early and established adult sepsis: a prospective cohort study. Crit Care 2009; 13: R42.

15. Seo JW, Kim HK, Kim JE, Park S, Cho HI. Prognostic values of the factor Xa-activated clotting time and endogenous thrombin potential in patients suspected of having disseminated intravascular coagulation. Thromb Res 2009; 123: 565-572.

16. Ovanesov MV, Krasotkina JV, Ul'yanova LI, Abushinova KV, Plyushch OP, Domogatskii SP, Vorob'ev AI, Ataullakhanov FI. Hemophilia A and В are associated with abnormal spatial dynamics of clot growth. Biochim Biophys Acta 2002; 1572: 45-57.

17. Ovanesov MV, Lopatina EG, Saenko EL, Ananyeva NM, Ul'yanova LI, Plyushch OP, Butilin AA, Ataullakhanov FI. Effect of factor VIII on tissue factor-initiated spatial clot growth. Thromb Haemost 2003; 89: 235-242.

18. Negrier C, Dargaud Y, Bordet JC. Basic aspects of bypassing agents. Haemophilia 2006; 12 Suppl 6: 48-52.

19. Ovanesov MV, Ananyeva NM, Panteleev MA, Ataullakhanov FI, Saenko EL. Initiation and propagation of coagulation from tissue factor-bearing cell monolayers to plasma: initiator cells do not regulate spatial growth rate. J Thromb Haemost 2005; 3: 321-331.

20. Sinauridze EI, Kireev DA, Popenko NY, Pichugin AV, Panteleev MA, Krymskaya OV, Ataullakhanov FI. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost 2007; 97: 425-434.

21. Шмидт P, Тевс Г. Физиология человека (том2). Москва: Мир, 1996.

22. Knoebl Р, Dempfle С, Levi М, Pabinger I, Quehenberger Р, Turecek Р, Veldman А, Watzke Н. Blood coagulation and inflammation in critical illness: the importance of the protein С pathway. Bremen: UNI-MED, 2008.

23. Michelson AD. Plateletes, second edition. Elsevier, 2007.

24. Butenas S, Mann KG. Blood coagulation. Biochemistry (Mose) 2002; 67: 3-12.

25. Mann KG, Brummel K, Butenas S. What is all that thrombin for? J Thromb Haemost 2003; 1: 1504-1514.

26. Colman RW, Hirsh J, Marder VJ, Saltzman EW. Hemostasis and Thrombosis:Basic Principles and Clinical Practice. Philadelphia: Lippincott Company, 2010.

27. Bajaj MS, Birktoft JJ, Steer SA, Bajaj SP. Structure and biology of tissue factor pathway inhibitor. Thromb Haemost 2001; 86: 959-972.32. van H, V. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur J Obstet Gynecol ReprodBiol 2001; 95: 198-201.

28. Becker BF, Heindl B, Kupatt C, Zahler S. Endothelial function and hemostasis. ZKardiol 2000; 89: 160-167.

29. Heemskerk JW, Bevers EM, Lindhout T. Platelet activation and blood coagulation. Thromb Haemost 2002; 88: 186-193.

30. Chesney CM, Pifer D, Colman RW. Subcellular localization and secretion of factor V from human platelets. Proc Natl Acad Sci USA 1981; 78: 5180-5184.

31. Monkovic DD, Tracy PB. Functional characterization of human platelet-released factor V and its activation by factor Xa and thrombin. J Biol Chem 1990; 265: 17132-17140.

32. Пантелеев MA, Васильев CA, Синауридзе ЕИ, Воробьев АИ, Атауллаханов ФИ. Практическая коагулология. Москва: Практическая медицина, 2011.

33. Балуда ВП, Балуда MB, Деянов ИИ, Тлепшуков ИЛ. Физиология системы гемостаза. Москва: 1995.

34. Зубаиров ДМ. Биохимия свертывания крови. Москва: Медицина, 1978.

35. Dahlback В. Blood coagulation. Lancet 2000; 355: 1627-1632.

36. Mann KG. Biochemistry and physiology of blood coagulation. Thromb Haemost 1999; 82:165-174.

37. Glover CJ, Mclntire LV, Brown CH, III, Natelson EA. Rheological properties of fibrin clots. Effects of fibrinogen concentration, Factor XIII deficiency, and Factor XIII inhibition. J Lab Clin Med 1975; 86: 644-656.

38. Lim BB, Lee EH, Sotomayor M, Schulten K. Molecular basis of fibrin clot elasticity. Structure 2008; 16: 449-459.

39. Blomback B, Hessel B, Hogg D, Therkildsen L. A two-step fibrinogen—fibrin transition in blood coagulation. Nature 1978; 275: 501-505.

40. Blomback B. Fibrinogen and fibrin-proteins with complex roles in hemostasis and thrombosis. Thromb Res 1996; 83: 1-75.

41. Brummel KE, Butenas S, Mann KG. An integrated study of fibrinogen during blood coagulation. J Biol Chem 1999; 274: 22862-22870.

42. Marx G, Blankenfeld A. Kinetic and mechanical parameters of pure and cryoprecipitate fibrin. Blood Coagul Fibrinolysis 1993; 4: 73-78.

43. Furie B, Furie ВС. Mechanisms of thrombus formation. N Engl J Med 2008; 359: 938949.

44. Fuss C, Palmaz JC, Sprague EA. Fibrinogen: structure, function, and surface interactions. J Vase Interv Radiol 2001; 12: 677-682.

45. Lawson JH, Kalafatis M, Stram S, Mann KG. A model for the tissue factor pathway to thrombin. I. An empirical study. J Biol Chem 1994; 269: 23357-23366.

46. Wiiger MT, Prydz H. The changing faces of tissue factor biology. A personal tribute to the understanding of the "extrinsic coagulation activation". Thromb Haemost 2007; 98: 38-42.

47. Mackman N. Role of tissue factor in hemostasis, thrombosis, and vascular development. Arterioscler Thromb Vase Biol 2004; 24: 1015-1022.

48. Colman RW, Schmaier AH. Contact system: a vascular biology modulator with anticoagulant, profibrinolytic, antiadhesive, and proinflammatory attributes. Blood 1997; 90: 3819-3843.

49. Revak SD, Cochrane CG, Bouma BN, Griffin JH. Surface and fluid phase activities of two forms of activated Hageman factor produced during contact activation of plasma. J Exp Med 1978; 147: 719-729.

50. Seligsohn U. Factor XI deficiency. Thromb Haemost 1993; 70: 68-71.

51. Пантелеев MA, Атауллаханов ФИ. Свертывание крови: биохимические основы. Клиническая онкогематология 2008; 1: 50-62.

52. Renne T, Nieswandt B, Gailani D. The intrinsic pathway of coagulation is essential for thrombus stability in mice. Blood Cells Mol Dis 2006; 36: 148-151.

53. Ованесов MB. Влияние факторов внутреннего пути свертывания крови на пространственную динамику роста сгустка. 2002.

54. Mann KG, Krishnaswamy S, Lawson JH. Surface-dependent hemostasis. Semin Hematol 1992; 29: 213-226.

55. Hill-Eubanks DC, Lollar P. von Willebrand factor is a cofactor for thrombin-catalyzed cleavage of the factor VIII light chain. J Biol Chem 1990; 265: 17854-17858.

56. Mann KG, Nesheim ME, Church WR, Haley P, Krishnaswamy S. Surface-dependent reactions of the vitamin K-dependent enzyme complexes. Blood 1990; 76: 1-16.

57. Nesheim ME, Mann KG. Thrombin-catalyzed activation of single chain bovine factor V. J Biol Chem 1979; 254: 1326-1334.

58. Pieters J, Willems G, Hemker HC, Lindhout T. Inhibition of factor IXa and factor Xa by antithrombin III/heparin during factor X activation. J Biol Chem 1988; 263: 1531315318.

59. Rick ME, Hoyer LW. Thrombin activation of factor VIII: the effect of inhibitors. Br J Haematol 1977; 36: 585-597.

60. Brummel KE, Paradis SG, Butenas S, Mann KG. Thrombin functions during tissue factor-induced blood coagulation. Blood 2002; 100: 148-152.

61. Butenas S, Mann KG. Kinetics of human factor VII activation. Biochemistry 1996; 35: 1904-1910.

62. Andrews DA, Low PS. Role of red blood cells in thrombosis. Curr Opin Hematol 1999; 6: 76-82.

63. Moyer MP, Tracy RP, Tracy PB, van't VC, Sparks CE, Mann KG. Plasma lipoproteins support prothrombinase and other procoagulant enzymatic complexes. Arterioscler Thromb Vase Biol 1998; 18: 458-465.

64. Tracy PB, Eide LL, Mann KG. Human prothrombinase complex assembly and function on isolated peripheral blood cell populations. J Biol Chem 1985; 260: 2119-2124.

65. Bajaj SP, Harmony JA, Martinez-Carrion M, Castellino FJ. Human plasma lipoproteins as accelerators of prothrombin activation. J Biol Chem 1976; 251: 5233-5236.

66. Gailani D, Braze GJ, Jr. Factor XI activation in a revised model of blood coagulation. Science 1991; 253: 909-912.

67. Naito K, Fujikawa K. Activation of human blood coagulation factor XI independent of factor XII. Factor XI is activated by thrombin and factor XIa in the presence of negatively charged surfaces. J Biol Chem 1991; 266: 7353-7358.

68. Атауллаханов ФИ, Зарницына ВИ, Кондратович АЮ, Лобанова ЕС, Сарбаш ВИ. Особый класс автоволн автоволны с остановкой - определяет пространственную динамику свертывания крови. Успехи физических наук 2002; 172: 671-690.

69. Атауллаханов ФИ, Волкова РИ, Похилко АВ, Синауридзе ЕИ. Пороговое поведение системы свертывания крови при изменении концентрации кальция. Биофизика 1994; 39: 713-720.

70. Hoffman М, Monroe DM, Oliver JA, Roberts HR. Factors IXa and Xa play distinct roles in tissue factor-dependent initiation of coagulation. Blood 1995; 86: 1794-1801.

71. Шиффман ФДж. Патофизиология крови. СПб: Бином, 2000.

72. Esmon СТ. Regulation of blood coagulation. Biochim Biophys Acta 2000; 1477: 349360.

73. Shen F, Kastrup CJ, Liu Y, Ismagilov RF. Threshold response of initiation of blood coagulation by tissue factor in patterned microfluidic capillaries is controlled by shear rate. Arterioscler Thromb Vase Biol 2008; 28: 2035-2041.

74. Kastrup CJ, Shen F, Runyon MK, Ismagilov RF. Characterization of the threshold response of initiation of blood clotting to stimulus patch size. Biophys J 2007; 93: 29692977.

75. Nesheim M. Thrombin and fibrinolysis. Chest 2003; 124: 33S-39S.

76. Долгов BB, Свирин ПВ. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. Москва: ООО «Издательство «Триада», 2005.

77. Shrivastava S, McVey JH, Dorling A. The interface between coagulation and immunity. Am J Transplant 2007; 7: 499-506.

78. Strukova S. Blood coagulation-dependent inflammation. Coagulation-dependent inflammation and inflammation-dependent thrombosis. Front Biosci 2006; 11: 59-80.

79. Ryan J, Geczy C. Coagulation and the expression of cell-mediated immunity. Immunol Cell Biol 1987; 65 (Pt 2): 127-139.

80. Cirino G, Vergnolle N. Proteinase-activated receptors (PARs): crossroads between innate immunity and coagulation. Curr Opin Pharmacol 2006; 6: 428-434.

81. DeLoughery TG. Hemostasis and thrombosis. Georgetown: Tex: Landes Bioscience, 2004.

82. Галстян ГМ. Сепсис у гематологических больных. In: Воробьев АИ (editor). Рациональная фармакотерапия заболеваний системы крови. Москва: Литтера, 2009;605-613.

83. Исследование системы крови в клинической практике. Под ред. Г.И. Козинца и В.А. Макарова. Москва: Триада-Х, 1997.

84. Баркаган ЗС, Момот АП. Основы диагностики нарушений гемостаза. Москва: Ньюдиамед-АО, 1999.

85. Ройтберг ГЕ, Струтынский АВ. Лабораторная и инструментальная диагностика внутренних органов. Москва: Бином, 2003.

86. Hemker НС, A1 DR, De SE, Beguin S. Thrombin generation, a function test of the haemostatic-thrombotic system. Thromb Haemost 2006; 96: 553-561.

87. Hemker HC, Beguin S. Phenotyping the clotting system. Thromb Haemost 2000; 84: 747-751.

88. Hemker HC, A1 DR, Beguin S. Thrombin generation assays: accruing clinical relevance. Curr Opin Hematol 2004; 11: 170-175.

89. Mosesson MW. Fibrinogen and fibrin structure and functions. J Thromb Haemost 2005; 3: 1894-1904.

90. Cesarman-Maus G, Hajjar KA. Molecular mechanisms of fibrinolysis. Br J Haematol 2005; 129:307-321.

91. Taylor FB, Jr., Toh CH, Hoots WK, Wada H, Levi M. Towards definition, clinical and laboratory criteria, and a scoring system for disseminated intravascular coagulation. Thromb Haemost 2001; 86: 1327-1330.

92. Bounameaux H, de MP, Perrier A, Miron MJ. D-dimer testing in suspected venous thromboembolism: an update. QJM1997; 90:437-442.

93. Salooja N, Perry DJ. Thrombelastography. Blood Coagul Fibrinolysis 2001; 12: 327-337.103. , Luddington RJ. Thrombelastography/thromboelastometry. Clin Lab Haematol 2005; 27:81.90.

94. Карамзин, С. С. Исследование биофизических аспектов пространственной динамики роста фибринового сгустка in-vitro. Москва: 2010.

95. Кречетова АВ. Нарушение гемостаза при сепсисе у онкогематологических больных в период миелотоксического агранулоцитоза. Москва: 2011.

96. Hemker НС, Giesen PL, Ramjee М, Wagenvoord R, Beguin S. The thrombogram: monitoring thrombin generation in platelet-rich plasma. Thromb Haemost 2000; 83: 589591.

97. A1 DR, Peyvandi F, Santagostino E, Giansily M, Mannucci PM, Schved JF, Beguin S, Hemker HC. The thrombogram in rare inherited coagulation disorders: its relation to clinical bleeding. Thromb Haemost 2002; 88: 576-582.

98. Dargaud Y, Trzeciak MC, Bordet JC, Ninet J, Negrier C. Use of calibrated automated thrombinography +/- thrombomodulin to recognise the prothrombotic phenotype. Thromb Haemost 2006; 96: 562-567.

99. Allen GA, Monroe DM, III, Roberts HR, Hoffman M. The effect of factor X level on thrombin generation and the procoagulant effect of activated factor VII in a cell-based model of coagulation. Blood Coagul Fibrinolysis 2000; 11 Suppl 1: S3-S7.

100. Ataullakhanov FI, Volkova RI, Guriia GT, Sarbash VI. Spatial aspects of blood coagulation dynamics. III. Growth of clots in vitro., Biofizika 1995; 40:1320-1328.

101. Campbell RA, Overmyer KA, Bagnell CR, Wolberg AS. Cellular procoagulant activity dictates clot structure and stability as a function of distance from the cell surface. Arterioscler Thromb Vase Biol 2008; 28: 2247-2254.

102. Faxalv L, Tengvall P, Lindahl TL. Imaging of blood plasma coagulation and its propagation at surfaces. JBiomedMater Res A 2008; 85: 1129-1134.

103. Hoffman M, Monroe DM, Oliver JA, Roberts HR. Factors IXa and Xa play distinct roles in tissue factor-dependent initiation of coagulation. Blood 1995; 86: 1794-1801.

104. Sinauridze EI, Volkova RI, Krasotkina YV, Sarbash VI, Ataullakhanov FI. Dynamics of clot growth induced by thrombin diffusing into nonstirred citrate human plasma. Biochim BiophysActa 1998; 1425: 607-616.

105. Ataullakhanov FI, Guria GT, Sarbash VI, Volkova RI. Spatiotemporal dynamics of clotting and pattern formation in human blood. Biochim Biophys Acta 1998; 1425: 453468.

106. Kondratovich AY, Pokhilko AV, Ataullakhanov FI. Spatiotemporal dynamics of contact activation factors of blood coagulation. Biochim Biophys Acta 2002; 1569: 86-104.

107. Бокерия JIA, Белобородова HB. Инфекция в кардиохирургии. Москва: НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, 2007.

108. Wheeler АР, Bernard GR. Treating patients with severe sepsis. N Engl J Med 1999; 340: 207-214.

109. Levi M, de JE, van der PT. Sepsis and disseminated intravascular coagulation. J Thromb Thrombolysis 2003; 16: 43-47.

110. Levi M, Ten CH. Disseminated intravascular coagulation. N Engl J Med 1999; 341: 586592.

111. Marder VJ, Feinstein D, Francis C. Consumptive thrombohemorrhagic disorders. In: Colman RW, Hirsh J, Marder VJ (editors). Hemostasis and thrombosis. Basic principles and clinical practice. Philadelphia: JB Lippincott Co, 2001; 1023-1063.

112. Levi M, Marder VJ. Coagulation abnormalities in sepsis. In: Colman RW, Clowes AW, Goldhaber SZ, Marder VJ, George JN (editors). Hemostasis and thrombosis: basic principles and clinical practice. Philadelphia: Lippincott Company, 2006.

113. Schouten M, Wiersinga WJ, Levi M, van der PT. Inflammation, endothelium, and coagulation in sepsis. JLeukoc Biol 2008; 83: 536-545.

114. McGilvray ID, Rotstein OD. Role of the coagulation system in the local and systemic inflammatory response. World J Surg 1998; 22: 179-186.

115. Sun H, Wang X, Degen JL, Ginsburg D. Reduced thrombin generation increases host susceptibility to group A streptococcal infection. Blood 2009; 113: 1358-1364.

116. Szotowski В, Antoniak S, Poller W, Schultheiss HP, Rauch U. Procoagulant soluble tissue factor is released from endothelial cells in response to inflammatory cytokines. CircRes 2005; 96: 1233-1239.

117. Zeerleder S, Hack CE, Wuillemin WA. Disseminated intravascular coagulation in sepsis. Chest 2005; 128: 2864-2875.

118. Carey MJ, Rodgers GM. Disseminated intravascular coagulation: clinical and laboratory aspects. Am JHematol 1998; 59: 65-73.

119. Amaral A, Opal SM, Vincent JL. Coagulation in sepsis. Intensive Care Med 2004; 30: 1032-1040.

120. Vary TC, Kimball SR. Regulation of hepatic protein synthesis in chronic inflammation and sepsis. Am J Physiol 1992; 262: C445-C452.

121. Seitz R, Wolf M, Egbring R, Havemann K. The disturbance of hemostasis in septic shock: role of neutrophil elastase and thrombin, effects of antithrombin III and plasma substitution. Eur J Haematol 1989; 43: 22-28.

122. Nawroth PP, Stern DM. Modulation of endothelial cell hemostatic properties by tumor necrosis factor. J Exp Med 1986; 163: 740-745.

123. Coughlin SR. Thrombin signalling and protease-activated receptors. Nature 2000; 407: 258-264.

124. Esmon CT. Role of coagulation inhibitors in inflammation. Thromb Haemost 2001; 86: 51-56.

125. Mammen EF. Antithrombin III and sepsis. Intensive Care Med 1998; 24: 649-650.

126. Баркаган ЗС. Патогенез, диагностика и принципы терапии ДВС синдрома. Materia Medica 1997; 1: 5-14.

127. Воробьев АИ, Городецкий ВМ, Шулутко ЕМ, Васильев СА. Острая массивная кровопотеря, Москва: Гэотар-Медиа, 2001.

128. Dhainaut JF, Shorr AF, Macias WL, Kollef MJ, Levi M, Reinhart K, Nelson DR. Dynamic evolution of coagulopathy in the first day of severe sepsis: relationship with mortality and organ failure. Crit Care Med2005; 33: 341-348.

129. Васильев СА, Воробьев АИ, Городецкий ВМ. Протокол диагностики и лечения острого ДВС синдрома. Проблемы гематологии и переливания крови 1999; 3: 40-44.

130. Баркаган ЗС, Момот АП. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. Москва: Ньюдиамед, 2001.

131. Савельев ВС, Гельфанд БР. Сепсис: классификация, клинико-диагностическая концепция и лечение. Практическое руководство . Москва: ООО «Медицинское информационное агентство», 2010.

132. Ованесов MB, Красоткина MB, Абушинова KB, Лопатина ЕГ, Коротина НГ. Независимо от пути инициации свертывания при гемофилии нарушена пространственная динамика роста сгустка. Тромбоз, гемостаз и реология 2002; 1: 87-91.

133. Krasotkina YV, Sinauridze EI, Ataullakhanov FI. Spatiotemporal dynamics of fibrin formation and spreading of active thrombin entering non-recalcified plasma by diffusion. Biochim BiophysActa 2000; 1474: 337-345.

134. Баландина, A. H. Пороговые свойства системы свертывания крови in vitro при активации тканевым фактором. Москва: 2010.

135. Ованесов, М. В. Влияние факторов внутреннего пути свертывания на пространственную динамику роста сгустка. 2002. Ref Type: Thesis/Dissertation

136. Rylatt DB, Blake AS, Cottis LE, Massingham DA, Fletcher WA, Masci PP, Whitaker AN, Elms M, Bunce I, Webber AJ, . An immunoassay for human D dimer using monoclonal antibodies. Thromb Res 1983; 31: 767-778.

137. Самбурский АИ. Лабораторные центрифуги. Классификация и рекомендации по использованию. Медтехника имедизделия 2008; 46.

138. Gando S, Kameue Т, Nanzaki S, Nakanishi Y. Disseminated intravascular coagulation is a frequent complication of systemic inflammatory response syndrome. Thromb Haemost 1996; 75:224-228.

139. Smeeth L, Cook C, Thomas S, Hall AJ, Hubbard R, Vallance P. Risk of deep vein thrombosis and pulmonary embolism after acute infection in a community setting. Lancet 2006; 367:1075-1079.

140. Imamura T, Potempa J, Tanase S, Travis J. Activation of blood coagulation factor X by arginine-specific cysteine proteinases (gingipain-Rs) from Porphyromonas gingivalis. J Biol Chem 1997; 272: 16062-16067.

141. Oehmcke S, Herwald H. Contact system activation in severe infectious diseases. J Mol Met/2010; 88: 121-126.

142. Di NM, Squizzato A, Rutjes AW, Buller HR, Zwinderman AH, Bossuyt PM. Diagnostic accuracy of D-dimer test for exclusion of venous thromboembolism: a systematic review. J Thromb Haemost 2007; 5: 296-304.

143. Ho CH. Can very high level of D-dimer exclusively predict the presence of thromboembolic diseases? J Chin Med Assoc 2011; 74: 151-154.

Информация о работе

Сошитова, Наталья Павловна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.02

Диссертация

Выявление нарушений гемостаза при сепсисе с помощью метода пространственного роста сгустка - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы