Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пороговые свойства системы свертывания крови

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Пороговые свойства системы свертывания крови"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОФИЗИКИ

Ой

л На правах рукописи

0 0{{1 ш

Похилко Александра Валерьевна

ПОРОГОВЫЕ СВОЙСТВА. СИСТЕМЫ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ

: 03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фнзико - математических наук

ПУЩИ НО - 1994

Работа выполнена в Гематологическом Научном Центре РАМН

Научный руководитель!

доктор биологических наук, Ф.И.Агауллаханов

Официальные оппоненты; •

доктор физике- математических наук, В.З.Смолянннов, кандидат биологических наук, Е.Г.Попав

Ведущее учреждение - Институт ФиэпчссхоЛ Хймми РАН

тошеи 3 " 1994 г.

■ Защита диссертации состоит Л

р> ° час, ка заседании Спей нал га и рои,-ж 11 ого Совета Д 200,22.01 При Институте Теоретической к Экспериментальном Биофизики РАН

(г. Пущина, Московская область,. 142292). . .

С диссертацией можно ознакомиться п библиотеке Института Теоретическом и Экспериментальной Биофизики РАН.

Автореферат разослан " 3" 1994 г.'

Ученый секретарь СпециалиэиронзИтгого Совета,

кандидат биологически* наук л/ . П.А.. Нслипоомч'

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Система свертывания крови яалясгся сферой пересечения интересов научных нсследованиК и практической медицины. На сегодняшний лень получено большое количество биохимических данных об этой системе. Известна молекулярная структура большинства веществ, участвующих в этом процессе, изучены многие особенности их язаимолсйстш друг с другом. Однако на уровне исследования функционирования системы свертывания как целостной физиологической системы имеется болшое количество вопросов, требующих разрешении.

Известно, что система сиершг.ашш кропи представляет собой каскад биохимических реакций, охваченный петлям» положительных обратных crcnefi. Такая сгрукгурз системы обеспечивает антокагалитнческую, взрывную кпнегнку cnepi 1 ья, что полтпержлается имевшимися ■жснерименплыгымп данными. Существующие математические модели (М.Л. Ханин, D.D. Семенов. Биофизика, т.35, 1990) предсказывают наличие порогового поведении в aroii системе. Это означает. что переход кропи из жидкого состояния в 1елеобралсое происходит, когда величина активирующего воздействия превышает некоторое критическое значение. Представляется актуальным экспериментально изучить вопрос, при каких условиях система отвечает на активирующее воздействие аптокагачитпческнм, пороговым образованием активных факторов свертьтапия. Какова кинетика при слабой актинаиип?

Возможны лпа пути экспериментальной проверки гипотезы о существовании в эзои системе порогового поведения. Мерный (прямой

путь) связан с уменьшением уровня активации до подпорогового уровня. 'Активация системы свертывания кроан in vitro, как правило, связана с ее контактом с чужеродными поверхностями, Известно, что всс практически и\учскние'материалы активируют в.той или иной мере эту систему. Причем уровень этой акгньации всегда чьнле порогового, т.к. кровь вне организма »ссгда сворачивается.

Втором подход ¡с эксиеримеитатьному исследованию пороговых свойств системы свертьмания заключается в Том, чтобы, не уменьшая уровень внешней активации системы, поменять степень интснсищюсти положительных обратных связей. Это можно сделать, уменьши» кониадтс.'.цкю кальция в системе, поскольку кальцдй является неодолимым компонентом ферментативных комплексов, входящих в эти обратные-связи. Тем самым, уменьшение концентрации кальция эквивалентно увеличению величины порога свертывания по активирующему воздействию.

Другой важной проблемой, касающейся функционирования системы свертывания, . является вопрос о пространственной организации процесса ' роста тромба. К..кие особенности тромбообразорания связаны с наличием пороговых свойств и взрывной кинетики? Традиционно системы, возбуждаемые пороговым образом, являются объектами теории активных сред. Использование сооттпггствующк:. иетод-jc теории самоорганизации при анализе феноменологической ■ модели позволило недавно показать, что формирование локализованных сгустков в крови может обеспечиваться сугубо авто валковыми механизмами (Ф.И.Атауллаханов, Г.Т.Гурия, АЛО.Сафрошкина. Биофизика, т.39, 1994). Поэтому особый интерес представляет анализ пространственной динамики роста тромба с учетом всей совокупности имеющихся экспериментальных биохимических данных.

яящооь изучение пороговых кинетических свойста системы сперты т<анил крови и обусловленных »мч особенностей динамик»! роста фибриноэого тромба в пространстве.

1. Протеста Жспериме;тгалы'сг исследование зависимости кинетики внутреннего пути слгртывяния' хрош от концентрации калыгля для пространственно' - однородной системы.

2. Построит!» математическую модель внутреннего путя сгердмваиим крови, согласующуюся с экспериментальными данными,

3. С помощью математической модели, описывающей хкнеткху внутреннего пути сзсртшания, и принимая во питание диффузию, рассмотреть задачу о простра! стаенном распространении/ активных факгороз при локальной ахтияанин считывании.

Шштллтт'л-

В работе предстаатело экспериментальное доказательство существовании пороговых эффектов в системе свертывания крови.

На основе построенной математкчесхой модели' оертыя-амия кроги изучена* лШпмихэ пространстпенного тромбообразованил л крови. Показано, что распространение по пространству активны.1; факторе« может иметь "агтоеолновой характер при' наличии в системе положительных обратным связей, осущестпллкнциш! путем активации факторов каскада . репкийП свертывания нижестоящим активным Фактором. В частности, присутствие В системе реакции активации фактора XI тромбином способно обеспечить автаг.онювоЙ характер свертывания.

Ц ДУ.ЧП9_Ы1ря£1 пч е (IЯ 5 ■

Полученные результаты создают новые методические возможности для биомедининского изучения свертыпакия крови и могут быть

использованы в медицинских институтах и лабораториях, занятых исследованием нарушений гемостаза.

Динамические особенности пространственного поведения системы свертывания, полученные D работе, могут Представлять интерес с точки зрения общих свойств динамических систем, исследования которых проводятся в ИТЭБ, МГУ, МФТИ, ФИАН, ИПМ РАН, ИПУ РАН и других организациях.

J3wt<?gnw пдлрксния. buhqphmhs па защиту-

1. Система свертыаания крови обладает пороговым поведением при изменснка концентрации кальция.

2. Пороговая зависимость поведен!Ш системы свертывания крови от концентрации кальция обусловлена существованием D этой системе порога по величине активирующего воздействия.

3. Наличке в системе свертывания крови положительных обратных связей типа реакции активации фактора XI тромбином при запороговой активации приводит к возникновению в пространстве незатухающей самоподдерживающейся волны активных факторов.

Апробация диссертации состоялась 26 апреля 1994 г. на заседании проблемной комиссии "Патологии и физиологи» гемостаза" в Гематологическом Научном Центре РАМН. Материалы диссертации докладывались в Калининграде на Симпозиуме "Математические теории биологических процессов" памяти М.В.Волькенштейна (октябрь 1993 г.), на Гордоновских Конференциях "Hemostasia" (Andover, USA, 12 июня 1994г.) и "Oscillations and Dynamic Instability" (Newport, USA, 7 августа 1994г.).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы.

Струк • ра диссертации.

Диссертация излйжена на 112 страницах машинописного текста и состоит из введения, пяти глав (главы 1- обзора литературы, главы 2-описания материалов и Методов исследования, глав 3,4,5 собственны* исследований), ныподо», обсуждении результатов и списка литературы. В списке литературы указана 94 источника.

Диссертационная работа выполнена в лаборатории физической биохимии системы кропи Гематологического Научного Центра (зап. лаб.- д.б.н., Ф.И. АтауЛлаханав). Айтор благодарит своих коллег Г.Т.Гурию, Е.И.Синауридзе, Р.И.Волкоау, В.Зарницину за помошь в работе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

В главе I приведен обзор литературы.

В niaue 2 описываются материалы н методы исследований.

Все эксперименты были выполнены на обедненной тромбоцитами нитратной плазме. Свертывание запускалось добавлением раствора СаС12- Для измерения концентрации факторов Х1а и тромбина использовались специфичные ' хромогенные и флуорогенные синтетические субстраты.

Концентрация тромбина измерялась двумя методами: 1-флуорнметрическим и 2- спектрофотометрнческим. В методе 1 флуоресценция измерялась в пристеночном слое кюпеты, а методе 2 применялся двухволноиой режим измерений. Такая модификация, известных методов позволило резко уменьшить вклад в оптический сигнал светорассеяния сгустка, образующегося п пробах. Фактор Х1а измерялся спектрофотометрнчески в дпухволновом режиме.

При математическом моделировании гомогенной кинетики свертывания ксгюдьзопатся пакет прикладных программ TRAX версии .1.2 (автор - Левитин В.В.). При исследовании пространственной динамики свертывания . интегрирование системы дифференциальных

уравнений о частных ■ производных произносилось по методу Эйлера с переменным Шагом. При этом использоиалаоь программа Заряпцьцгой В.

Глаьа 3 посвящена экспериментальному исследэьашпо кинетики активации факторов XI и II системы «¡гртыэания ь неразбавленной Цнтратной плазме при добавлении. различны;; концентраций кальция. Опыты проводились в условиях постоянной контактной активами;; стенками, ксарцсеой кюпеты, мерой которой служила измеряемся концентрация фактора Х1а в системе.

Результаты измерения гонцеиграцчи фактора Х1а показывает, ч".;о его актиьацкя в измерительной мосле происходит за среьш мене« 13 секунд-и конечной уровень активации не зависит от концентрации кальция в систем!, а только от материала кюветы.

Изучение времени свертывания плазмы показало, что при концентрациях : свободного кальций нюхе 0.2 мМ в течении эксперимента (70 мин) свертыааннг не происходит. Для концентраций свободного!калщпя, больших 0.2 мМ время свертываний конечно , оно тея больше чем блкхг концентрация »ишьщш к своему критическому значению (0.2м У!). При . этйм сушсстйсшю, что при концентрации кальция ниже критической не ноОлюдагтся рост концентрации

Тромбина со времени.

л .1

Зависимость свертывания концентрации кальций

времени

. ОТ

свободного хорошо

Со,+(тМ) Рис.1.

аппроксимируется 1 гиперболической зависимостью. На рис.)

приведена заоисмость обратного времени свертывания от концентрации свободна]-» кальция к системе. Вшшо, <шо зависимость близка ;; Л1!нён)!о;1. Флхт уменьшения способности крови к све;г,ыяпншг- при у..;е,чьшеш1и концентрации кальция хорошо известен. На этом основан метод консервирования кроен с помощью хелаторон кальция, и частности, цитрг.та. Однако, как показывает данное исследование, эта зависимость носит ярко выраженный пороговый характер.

тромбина_im,,

КПЛШШ!»

Кинетика образования тромбина боПа измерена двумя методами ' (см. Глазу 2 "Материалы л методы"). Оба метода дали схолные результаты.

На рис.2 условными символами изображена кинетика накопления продукта реакции (Р) расщепления тромбинового субстрата при концентрациях Са2+: 1.44, 0.5, 0.36, 0.31, 0.25 и 0..24 м\1.

С уменьшением концентрации хальция . кривые становятся более пологами. Видно, что момент нарастания

концентрации • тромбина сильно зависит от концентрации Са2+. При малых концентрациях (менее 0.19 мМ) скорость расщепления

субстрата мала и практически не меняется за все время опыта.

Для количественной интерпретации полученных результатов была произведена аппроксимация кинетических кривых, Кинетика образования тромбина аппроксимировалась зкепонентей: z(t) => А • (exp(nt) - 1) (1)

' где показатель экпоненты, À- прсдэкспонента. -

40 г

3 £ 20 о.

0

riv D

-II

IЩ,

20 '40 time (min)

Рис.2.

ео

Тогда для первоначальных крнаых накопления продукта гидролиза субстрата Р, опираясь на формулу (1), имеем: у(0 =к2 А-((ехр(Ш) - 1)/о - I) (2)

где у(1) - концентрации Р - продукта расщеНлеинн субарата в каждый момент времени I, к2 - константа скорости растепления субстрата тромбином. Данные этой аппроксимации изображены линиями па рис.2 вместе с экспериментальными результатами. Видно хорошее согласие с экспериментом.

Анализ экспериментально полученных экспоненциальных кривых, образования тромбина показал, что показатель экспоненты зависит от

концентрации кальция . г системе. Эта зависимости приведена на рис.3. Видно,. что имеется. некотора." Предельная (пороговая)

концентрация кальЦия, ниже которой этот показатель равен 0. Она составляет в среднем 0.25 мМ и несколько варьирует для разных плазм,

В главе 4 построена математическая модель внутреннего пути свертывания крови для пространственно - однородного случая. На рис.4 приведена схема биохимических реакций внутреннего пути свертывания крови. Символами 5п обозначены неактивные факторы, уп - их активные формы. Индексы соответствуют общепринятым римским номерам факторов. Каскад реакций рключает активацию факторов . IX, X, И. Первым активным ферментом считается фактор Х1а, концентрация -Которого полагается постоянной. Она обозначена буквой С.

с

Е

1.2

0.0

а'

-ь

0.0 0,6 1 .6 Со2* (тМ)

¡'нс.З.

4

&

С / ^

| у Л

I V*"4' I

12 / \1

1 1 ■ / \1

вю Чг.. -Эз I

I 1

■I «Г ,

I 1 ^

31—У. - ..V......>У1 — ^ '

Рис.4.

Обратные связи обозначены на рис.4 иуиктиро'М. Они осущестшшются через активацию кофакторов VIII и V тромбином и сборку ферментативных комплексов - тэказы и протраиЗйказы, которые обозначены буквами г и V/ соотпетстценно Комплексы ускоряют протекание реакций активации факторов X И 11. На схеме для простоты не указаны пассипные уТечкн Всех актшшых факторов системы.

Основанная на данной схеме математическая модель:

. Ж

= к, • у2 -11, У» - к,■У,•у, г 0)

Л*»

¿г , , ,

•^-=к1у8у,-11,г-11,г

= к» • у} • у ,о - Ь» ■ V - Ь, • »V

Величины кинетических констакг учтенных в этой мйдели реакций, взятые из литературных данных, приведены'в таблице 1.

ГаОдиид

íkj pía констт.гга \ ' . * *10 No (-3 \г i i .,. .1 • 'H 1 ■ ÍW j*10 ?2

¡Значение | i 20 .¡0.2 •.константы ! | O.C04 lips ¡2 j2.3 1.3 ¡!¿o;iee [100 Ьолее [ico' i ¡500 ¡2000

Bes используемые концентрации бгрутся в нМ (кроме

концентрации ксльцая, шракеаиой о мМ), сремк I» минутах.

Югиетичегкиг константы первого- передки (все, кроме kz и );••)

присолены л мин"*, kz и kvv - а мШг'-нМ"*.

Томное аначгние ксистанты к8 не иасгстНо из литер-гуры. На

.основании литературных данных, с учлом конкуренции мек'ду

Несколькими субстратами (факторы V, VI]I, фибриноген) за тромбин

(фактор lío - у2), милю оценить примерное змачеинс stoü комстшп'ы.

Оно равно 0.002 млн"*. Значение к5 с учетом конкуренции оценивается

величиной 0,5 мин* 1. Учитывая, что kz, ¡Цу> ¡<2 много больше

остальных, можно показ ль, что переменные у2, z, ху являются

. быстрыми. Система (1) была редукцнрована до 3 уравнений.

Зависимость скорости сборки фсрме;гпттньй комплексов ' от

концентрации кольцкя (Са), согласно литературным данным, является

ейгмоидиой и описывается функцией f(Ca)="Cüil/(m+Cür'). Н результате

получилась следующая система дифференциальных уришгипй: dx , _ .

dt ' •

(2)

У1 = Р|-У + Рэ'Г(Са)- —

l+f(Ca)y

ki

где к - концентрация фактора ÍXa, у - концентрация фактора Xá, г -величина, пропорциональная концентрации ".coy. форм кофачтора Villa (свободной и связс.ньоЯ в комплекс), у2- концентрация тромбина.

При численном аначнее использоидиеъ 1гулеаые начальные условия, .

Для переменных у, z и фуккини v2' при пролед'жни числи* им* экспериментов наотюдплось 'перогопоч поэедени® пс конце нтрауки кальция. При подкрмтШгском значении хонцентрецнч Са величины у, / н у2 достигали esoux стационарных значений и дх1« на меклпись с течением аремени. При -гонце» ггроини Са больше • крИТНч-:;кой кинетика этих аттокагалитичгских церемонны« носила ьз;швн<Л характер.

Для сравнения модели с экспериментальными данными по кинетике образования tj'o.vOihm при р.цлнчнмл коЦцсгггряцизх кзяымя расчетные кривые для тромбина От'ли аппро*симлрозани функцией z(í) (формула (I).).

Данные о имейщихсч ь литературе значениях кеютпнг к5 и :<8 предегсзллются непшшкмн. После проггдения редукции эти константы вошли, в параметры модели pf и рЗ. Поэтому последние варьировались е целью Получить максимальное соответствие . модели с экспериментал.мшми записимостпмн а и А (показателя зхспонсктм н Предэкспоненты аппроксимирующих кривых для хинетики тромбина) от {Caj. Параметры pt н рЗ. характеризуют интенсивность петель положительных обратных связей в .данной системе« В результате было получено два'набора значений параметров р>1 и рЗ, при которых модель оптимально согласуется с экспериментом (см. таблицуЗ). При этом каждому набору соответствовала споя функция Г(Сп),

характеризующая скорость сборки комплексов, лежащая в диапопе, определяемом литературными данными ляп Г(Са), полученными и экспериментах на очищенных системах /см. таблицу 2). Таблица 2. '___■

| Вариант 1 - • 2

Значение параметра р! 0.0! 2.5

Значение параметра рЗ 240 16

Вил. функции f(Ca) Са2 Са2+0.7 СаЗ 0.5

Для ofioiix наборов параметров р! и рЗ характерно; что одна из двух петель положительных обратных связен значительно более эффективно влияет на кинетику системы, чем другая. Для первого набора - это петля через Villa фактор, для второго - через Va. Ь общем виде вывод о том, что доминирует только одна петля вытекает из факта экспоненциальной аппроксимации экспериментальных кинетических кривых для тромбина. В' случае одинаковой интенсивности обеих петель обратных связей кинетика тромбина должка была бы бы'гь существенно • • незхспаненциапьной. D работе обсуждаются эксперименты, которые позволили бы установить, какая именно петля является наиболее существен ион в кинетике системы.

Исследование модели показало, что динамика системы для обоих набора» параметр»« характеризуется наличием порогового поведения при изменении величины активирующего воздействии (С) для фиксированной KonucHTpaiiim кальции.

Получено также, что учет в рамках рассматриваемой схемы свертывания реакции активации фактора XI тромбином не «лияс! i а кинетику процесс« при значениях кинетической константы с корост пкнташт фактора Х1а тромбином, лежащих в днапаюиг; до 10~4 мин" ' (согласно литературным данным эта константа принимает значение не выше 1Q-4 мин"').

И

Исследование фазового портрета построенной системы показало, что в ней возможно существование двух особых точек: устойчивой- узла (значения переменных в этой особой точке малы) и неустоичипой-седла. Сепаратриса седла делит фазовую плоскость на две области: 1-область притяжения устойчивой точки (соответствует несвернувшемуся состоянию плазмы крови) и 2- область неограниченного роста концентраций активных факторов свертывания (соответствует состоянию свертывания). Значения величины активации системы и концентрации кальция могут меняться. При изменении значений этих параметров в системе наблюдается бифуркация. При докритнческом значении одного из этих параметров система имеет две описанные выше стационарные точки. При запорогопом значении этого параметра система не имеет стационарных точек и при любых начальных условиях в системе происходит неограниченный рост концентраций активных факторов, что соответствует состоянию свертывания.

Глава 5 посвящена изучению кинетики распространения образующегося тромбина в одномерном пространстве (на отрезке хе|0;Ь]) при активации внутреннего пути системы свертывания крови на границе х=0 рассматриваемой области.

Активирующая поверхность, запускающая свертывание в системе, моделируется путем введения постоянно действующего источника фактора ХГа с границы х=0.

Основой для кинетической части модели служит модель кинетики внутреннего пути свертывания, построенная в главе 4. Учитывается диффузия активных факторов. Введено дополнительное уравнение для фактора Х1а, учитывающее его пассивную инактивацию и диффузию. Рассмотрено два случая: 1- отсутствие реакции активации фактора XI Тромбином, 2- наличие этой реакции.

Для обоих случаев .показано наличие порога возбуждения в этой системе. Это означает, что при докрлтическои значении величины потока фактора Х1а с границы х="0, с течением-времени формируется малоамгаитуднос стационарное' распределение активных факторов Ха, УШо, Па по пространству. При ^пороговой величина потока фактора Х1а с граь'ицы. распределен)« актийных факторов Ха, Л'ЗНа, Па происходит и азде концентрационных фронтов. На рис. 5 А изображено распределение кошстр&ции тромбина в пространстве и разные моменты времен;!). Фронт волны тромбина является крутым и резко ■ отличается от характерного диффузионного распрелелсния фактора Х.'а (»а рис. 5 Е изображено распределение концентрецш« фактора К1а » разные моменты ьремени),

А Б

1000

с о

500

1

0.02

1а

I

0.00

0.0,

0.7 •

х, тт

о.о

0.7 ■

ж, тт

1 .4

Рис.5.

На скорость движения фронта тромбина определяющее слияние оказывает наличие реакции активации фактора XI тромбине«. Для

случая отсутств;ш э'гой

с О.ч

£ \ Е Е.

>0.0

{

0.0

0.8 . 1.6 х, тт

Рис.«.

2.4

реакции, на рис.6 приведена кривая 1 скорости движения фронта тромбина » зависимости от координаты. Из этого рисунка видно, что скорость движения фронта