Гены, высших эукариот, кодирующие факторы трансляции и триптофанил-тРНК-синтетазу: структурный и функциональный анализ

Фролова, Людмила Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гены, высших эукариот, кодирующие факторы трансляции и триптофанил-тРНК-синтетазу: структурный и функциональный анализ
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Гены, высших эукариот, кодирующие факторы трансляции и триптофанил-тРНК-синтетазу: структурный и функциональный анализ"

ю со

=с 22

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ¡д ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ем В А. ЭНГЕЛЬГАРДТА и- гОНа правах рукописи

.с

ФРОЛОВА ЛЮДМИЛА ЮРЬЕВНА

•ч

ГЕНЫ ВЫСШИХ ЭУКАРИОТ, КОДИРУЮЩИЕ ФАКТОРЫ ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ И ТРИПТОФАНИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗУ: СТРУКТУРНЫЙ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ

03.00.03- Молекулярная биология

' ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА 1995

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор химических наук, профессор, академик РАН А.А.Богданов доктор химических наук, профессор, академик РАН А.А.Краевский доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН, Л.П.Овчинников

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Российский Кардиологический научный центр РАМН (Институт экспериментальной кардиологии)

Завита состоится 1С.. УН^-А...... 1995 в ([Ф.. часов

на заседании Диссертационного совета Д 002.79 .'01 по защите-докторских диссертаций при Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117984 Москва, ул. Вавилова 'д. 32

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельггрдта РАН

Диссертация в виде научного доклада разослана " " ЛУПи ^к 1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Данное исследование начато в 1970 г. после открытия Х.Теминым и Д.Балтимором РНК-направляемого синтеза ДНК (обратной транскрипции). Это открытие, помимо фундаментального вклада в молекулярную биологиюв<- целом, создало принципиально новую, ранее не существовавшую возможность синтеза геиов In vitro. Однако, на этом пути было необходимо решить ряд методических проблем, актуальность которых в то время была 'очевидной. . После успешного синтеза . полноразмерных структурных генбв становилось возможным исследовать индивидуальные гены и их продукты, в том числе гены высших эукариот.

Общая тенденция молекулярной биологии последнего десятилетия состоит в постепенном переходе от изучения прокариот «с эукариотам. Это связано в основном с двумя обстоятельствами: во-первых, стало ясно, что один из старых принципов молекулярной биологии, согласно которому-то, что справедливо для Е. со!}.,..справедливо и для слона, во многом не точен, а "иногда й" ошибочен. Отсюда вытекает необходимость исследования эукариот непосредственно, а не путем экстраполяции данных, полученных на бактериях. .Во-вторых, новый методический арсенал, развитый в последнее десятилетие, позволил перейти к новым, более сложным объектам", каковьаш являются эукариоты по сравнению с прокариотами. Наконец, некоторые области молекулярной биологии прокариот приближаются к исчерпанию в отношении- формулирования некоторых основных принципов, • -тогда: как для высших эукариот это далеко не так.

Исходя из сказанного, проблему синтеза и изучения генов и их продуктов для высших эукариот следует.^„признать безусловно актуальной. Выбор генов, продукты' которых участвуют в биосинтезе белков, оправдан тем, что эти процессы ~-у прокариот изучены достаточно детально, что позволяет сравнивать полученные результаты с известными прокариотическими аналогами. Выбор данных объектов определяется еще и тем, что изучение биосинтеза белков у высших организмов развивалось неравномерно: если для этапов инициации и элонгации трансляции накопление информации шло' достаточно быстро, то изучение таких компонентов белок-синтезирующей машины клетки, как аминоацил-тРНК-синтетазы и факторы терминации трансляции, явно отстало.,Между тем, очевидно, что понимание процесса биосинтеза белков у высших организмов необходимо для воссоздания молекулярных основ жизни клетки в целом

и для анализа многих патологических состояний, в том числе таких важных как злокачественная трансформация. Помимо общетеоретической значимости, очевидно, что знание механизмов белкового синтеза у высших организмов позволит^ использовать этот процесс для биотехнологических целей, а именно для синтеза биологически активных веществ, получение которых иными путями затруднительно.

Цель и задачи работы. Общая цель работы состояла в синтезе in

"ч

vitro, структурном и функциональном анализе генов высших эукариот и их белковых продуктов; участвующих в биосинтезе белков. Конкретные задачи исследования сводились к следующему:

1) развить методологию синтеза генов высших эукариот in vitro с использованием обратной транскрипции по матрицам индивидуальных мРНК для чего: а) изучить способность обратной транскриптазы (ревертазы) преодолевать структурированные участки мРНК-матриц, использовать разные по длинеги нуклеотидному составу затравки и матрицы; б) отработать оптимальные условия синтеза структурных генов in vitro; в) применить разработанную стратегию для синтеза полноразмерных индивидуальных структурных генов высших эукариот (глобинов человека, кролика и голубя, церулоплазмина человека и крысы, 7-кристаллина лягушки), охарактеризовать и использовать полученные продукты для решения ряда конкретных экспериментальных задач; .. .. . . . ..........- .

2) молекулярно клонировать и секвенировать кДНК, кодирующую WRS человека., и на этой основе расшифровать первичную структуру этого белка;

3) установить экзон-интронную организацию гена WRS человека путем анализа геномных клонов, отобранных с помощью кДНК, специфичной для WRS человека;

4) проанализировать взаимосвязь между экзон-интронной организацией гена и доменной структурой 1ÍÍRS;

5) расшифровать регуляторную зону гена WRS и идентифицировать в этой области регуляторные элементы;

6) проверить утверждение других исследователей (Lee ei al., 1990), что WES и eRF имеют структурную гомологию;

7) установить истинную структуру eRF высших организмов, если выяснится, что структура eRF в работе Lee et al. (1990) установлена неверно;

8) идентифицировать, очистить и определить первичную структуру ранее неизвестного eRF, существование которого предсказано нами на

основании косвенных данных.

На\чная новизна и практическая ценность работы. При разработке методологии синтеза генов J л vitro впервые установлена способность обратной транскриптазы а) преодолевать шпилечные структуры в РНК-матрице; б) использовать в • качестве затравок гетерополимерные синтетические олигодезоксирибонуклеотиды и сверхкороткие затравки (динуклеотиды). С учетом этих данных отработана общая стратегия синтеза структурных генов высших эукариот, эффективность которой доказана синтезом четырех индивидуальных структурных генов.L Практическое, значение этих разультатов для биотехнологии состоит в возможности синтезировать in vitro любой нужный ген независимо от его структуры, происхождения и размеров.

Впервые обнаружены IFN-зависимые регуляторные элементы в структуре гена одного из компонентов белок-синтезируюшей машины клетки - WRS человека. Это наблюдение объясняет обнаруженное ранее v

IFN-зависимое повышение уровня WRS и мРНК WRS в культивируемых

клетках человека. Нетривиальность этого феномена состоит в том, что WRS - конститутивный фермент и его участие в ответе клеток на IFN совершенно неожиданно и нуждается в объяснении. Предложены гипотезы о возможной роли SRS в клеточной ответе на IFN, поддающиеся прямой экспериментальной проверке.

Впервые установлена экзон-интронная организация -• гена аминоацил-тРНК-синтетазы человека на примере WRS; обнаружена корреляция между экзон-интронной организацией этого гена и доменной структурой кодируемого белка, что привело к гипотезе о химерной природе гена WRS и его продукта. Опровергнуто мнение (Lee et al., 1990) о том, что eRF и VBS - родственные белги у эукариот. Доказано экспериментально, что это мнение возникло в результате неправильной атрибуции клона кДНК и других ошибок, источники которых установлены. Реатрибуция клона позволила определить первичную структуру WRS кролика, которая имеет высокую степень гомологии с первичными структурами WRS человека, быка и мьшш.

Впервые структурно и функционально идентифицированы два белка - eRFl и eRF3, участвующих в терминации трансляции у высших эукариот. Они принадлежат к семействам Sup45- и Бир35-подобных белков соответственно. eRFl обеспечивает узнавание всех трех терминирующих колонов, a Sup35/eRF3 стимулирует активность eRFl, а также повышает сродство к стоп-кодонам и обеспечивает

5 1

GTP-зависимость реакции терминации. Идентифицированы eRFl для Ното sapiens, Xenopus laevis и Saccharomyces cerevisiae. На основании полученных результатов предложена единая модель терминации трансляции для. всех живых организмов от прокариот до высших эукариот, основанная на представлении о двукоыпонентности системы терминации трансляции, в которой один фахтор обеспечивает узнавание терминирующих кодонов (RF1/2 и eRFl у прокариот и эукариот. соответственно), а второй фактор (RF3\h Sup35/eRF3 у прокариот и эукариот. соответственно) ответствен за узнавание GTP, увеличение сродства eRFl к стоп-кодонам и стимуляцию связывания eRFl с рибосомами.

Благодаря новым данным о структурах eRF наши знания о L процессах терминации белкового синтеза у эукариот практически достигли уровня наших знаний в этой области о прокариотах. Эта новая информация позволяет в дальнейшем исследовать на новом уровне экспрессию многих вирусов животных, которые, как известно, используют считывание терминирующих кодонов своих мРНК как значимых (супрессия), что имеет важное практическое значение для борьбы с вирусными инфекциями у человекам животных.

Апробация работы. Опубликовано 30 статей в отечественных и международных научных журналах, данные по структуре гена WRS помещены в международный банк данных по нуклеотидным последовательностям. 'Работы Л.ЮГФроловой по обратной транскрипции удостоены в составе коллектива авторов Государственной премии СССР 1979 г. Результаты работы по фактору терминации трансляции "комментированы в журнале Nature 372, 614 (1994). Основные результаты работы многократно докладывались на международных научных конференциях и съездах, в том числе в последние 4 года на международных совещаниях по тРНК (Польша, 1991; Франция, 1993; США, 1995) и рибосомам (Канада, 1995), на Российско-Американском симпозиуме ' по геному человека (С.-Пететбург, 1992), на международных конференциях, посвященных 90-летию со дня рождения

A.Е.Браунштейна (Россия, 1993) и 100-летию со дня рождения

B.А.Энгельгардта (Россия, 1994), на международной конференции по биотехнологии (Германия, 1994) и на международной конференции Института Жака Моно (Париж, 1995).

Структура работы. Диссертация изложена в настоящей работе в виде научного доклада. Первая часть работы выполнена в лаборатории энзимологии .белкового синтеза ИМБ РАН (зав. лаб. -

B.А.Энгельгардт, а затем Л.Л.Киселев) совместно с лабораториями 3.А.Шабаровой (МГУ), К.Г.Газаряна (ИМГ РАН), Г.Г.Гаузе (ИБР РАН),

C.А.Лкмборской (1ШГ РАН), Э.Я.Грена (ИОС АН !атв. ССР), 3.Розевталь (ЩШБ АН ГДР), С.А.Нейфаха (ИЭМ РАКШ). Вторая и третья ' части работы выполнены в той же лаборатории ИМБ РАН совместно с лабораторией И.П.Арман (ИМГ РАН), а также в Институте Жака Моно, Париж, Франция (группа A.-L. Haenni), на кафедре молекулярной ■ биологии Орхусского Университета, Дзния (группа J. Jnstesen) и на кафедре генетики развития Университета Ренна, Франция (группа М. Philippe).

Список сокращений АТР - аденозинтрифосфорная кислота GTP - гуанозинтрифосфорная кислота SDS - додецилсульфат Na BSA - бычий сывороточный альбумин моноАТ - моноклональное антитело ~ Ар^А - 5,5'-Р1,Р4-ди( 5'-аденозил) трифосфат PPj - пирофосфат ПААГ - полиакриламидный гель ДТТ - дитиотреитол

ДЭАЭ - диэтиламиноэтил - .

тРНК - транспортная рибонуклеиновая кислота

тРНКТгР - триптофаниловая тРНК

WRS - триптофанил-тРНК-синтетаза (КФ 6.1.1.2)

eRF - фактор терминации трансляции эукариот (polypeptide chain release factor) I FN - интерферон т.п.h. - тысяча пар нуклеотидов

ISRE и GAS - отвечающие на интерфероны регуляторные элементы, локализованные в промоторой области ДНК PCR - цепная полимеразная реакция

HPLC - жидкостная хроматография под высоким давлением

Часть 1. Синтез структурных генов высших эукариот in vitro

1. РНК-направляемый синтез ДНК (обратная транскрипция 1

С'момента открытия РНК-направляемого синтеза ДНК (обратной транскрипции) стало ясно, что возникла принципиально новая возможность получения структурных генов /л vitro с использованием обратной транскрипции с помощью одного и того же фермента -ревертазы,, как назвал РНК-направляемую \ ДНК-полимеразу В.А.Энгельгардт. Однако, чтобы эта теоретическая возможность стала реальностью, было необходимо выяснить основные свойства ревертазы как инструмента синтеза структурных генов in vitro. В цикле работ, выполненных с 1972 по 1975 гг., получены результаты, которые можно суммировать следующим образом.

1. Высокоочшпенная ревертаза из вируса миелобластоза птиц катализирует синтез ДНК по РНК-матрице, имеющей выраженную вторичную структуру (шпильку). Из этого наблюдения вытекает два следствия:

а) при синтезе генов структурированность РНК-матрицы не служит препятствием для обратной транскрипции и, следовательно, любые мРНК могут быть переведены в форму ДНК;

б) возможность копирования структурированных районов РНК-матрицы означает, что ревертаза обладает "расплетающей" способностью, т.е. представляет собой не только ДНК-полимеразу, нэ и "расплетазу"; в дальнейших опытах, выполненных в других лабораториях, это заключение полностью подтвердилось.

2. При репликации онкорнавирусных РНК in vivo происходит переход с одной нити РНК на другую, что не сопровождается нарушением ковалентной структуры ДНК-продукта.v Это удивительное явление нуждалось в объяснении. Мы предположили, что ревертаза обладает способностью "перескакивать" с одной цепи РНК на другую, пространственно сближенную с первой, без прерывания ковалентной структуры ДНК-продукта. Это предположение было . подтверждено модельными опытами, где в качестве матрицы использовали фрагмент РНК с известной первичной структурой, а затем анализировали нуклеотидную последовательность ДНК-продукта. Оказалось, что в ковалентно непрерывном ДНК-продукте соседствуют два участка РНК-матрици, локализованные на 5' и З'-концах.

3. В качестве затравки при обратной транскрипции онкорнавирусных РНК, как известно, используются тРНК. Этот способ неудобен для

синтеза геной in vitra, т.к. он налагает жесткие ограничения на структуру РНК-матрицы. С другой стороны, инициация с помощью олиго(dT)-затравки, комплементарной З'-полиаденилированному участку мРНК, несовершенна, т.к., во-первых, при этом нельзя копировать РНК, не содержащие поли(А) на З'-конце и, во-вторых, синтезирующийся ДНК-продукт гетерогенен по длине за счет нефиксированного положения затравки на матрице. Поэтому мы разработали новый метод инициации синтеза ДНК с использованием коротких гетероолигомерных дезоксирибонуклеотидных затравок к заранее выбранному участку матрицы. Этот метод позволяет копировать любые РНК с заранее -выбранной точки инициации. 4. Для использования ревертазы в синтезе структурных -генов in vitro необходимо иметь представление о механизме ее функционирования. С этой целью мы исследовали два вопроса: каков минимальный размер затравки, способной инициировать реакцию синтеза ДНК, и каковы требования к ее структуре. Была создана модельная система, состоящая из набора коротких олигодезоксирибонуклеотидных затравок и короткой РКК-матрицы с заданной структурой. Используя эту систему, мы установили, что при пониженной температуре, необходимой для стабилизации комплекса матрица-затравка, даже динуклеотид может служить затравкой, и полная комплементарность матрицы и затравки необязательна, однако важна комплементарность 3*-конца затравки РНК-матрице. На основании этих ' данных предложена ' модель образования" тройного комплекса ревертаза - матрица - затравка (рис. 1), существенной чертой которой является идея о том, что ревертаза связывается не с дуплексом матрица-затравка, а с однотяжевым участком матрицы, при этом роль затравки сводится к тому, чтобы поместить 3"—концевой нуклеозид затравки в активный центр фермента. Поэтому из трех возможных способов взаимной ориентации компонентов тройного комплекса мы отдали предпочтение третьему (рис. 1, г).

2. Синтез структурных генов £ использованием обратной транскрипции.

Этот раздел работы, выполненный в основном в 1973—1983 гг., был связан с синтезом индивидуальных структурных генов высших эукариот in vitro с использованием обратной транскрипции. По матрицам высокоочищенных РНК, кодирующих (З-глобин .человека, а-глобин голубя, церулоплазмин человека и т-кристаллин лягушки,

мРНК

5-ШШ 3.

затравка

5' 3' (а) 5,Н

направление обратной транскрипции

-.ПП

Рис. 1. Возможная схема взаимного расположения матрично-затравочного комплекса и ревертазы.

(а) комплекс РНК с олигодезоксирибонуклеотидной затравкой, (б) ревертаза связывается с дуплексом матрица-затравка, (в) ревертаза связывается как с дуплексом, так и с однонитевым участком матрицы, (г) ревертаза связывается с однонитевым участком матрицы, захватывая З'-концевой нуклеозид затравки. <

синтезированы полноразмерные кдНК, которые далее служили матрицами для второй реакции - ДНК-направляемого синтеза ДНК. Полученные двуспиралные ДНК использовали при решении разных задач, в частности для расшифровки первичных структур мРНК а-глобина голубя и г-кристаллина лягушки, для идентификации мРНК церулоплазмина человека и крысы в разных клеточных компартментах и для отбора геномных клонов. Результаты этих работ показали, что отработанная стратегия позволяет на разных матрицах получать полноразмерные структурные гены высших организмов.

Важным итогом изложенных работ было не только освоение методологии синтеза структурных генов, но и их структурный и функциональный анализ. На'этой основе стало возможным детальное изучение ряда генов высших организмов, изложенное в частях II и 111 этой работы.

Часть II. Молекулярное клонирование, структурный и функциональный анализ гена WRS человека.

Структура всех двадцати аминоацил-тРНК-синтетаз Е. coli известна (см. обзоры Carter, 1993; Cusack, 1993). Исследование первичной структуры зтой группы ферментов у высших организмов развивается значительно медленнее, и структура большинства из них остается неизвестной (см. обзор Kisselev 4 Wolf son, 1994). WRS относится к числу наиболее изученных ферментов зтой группы у высших организмов. Это димерный белок, каждая субъедншша которого имеет И 54-58 kDa (Gros et al., 1972; Фаворова и др., 1974). Разработан метод получения WRS в гомогенном состоянии и препаративных количествах, наиболее богатым источником служит поджелудочная железа крупного рогатого скота. Кинетические свойства WRS и механизм, используемый в реакции аминоацилирования тРНК, изучены весьма детально (см. обзор Malygin & Kisselev, 1982).

К моменту начала нашей работы первичная структура ни одной из аминоацил-тРНК-синтетаз человека не была известна,- и мы решили установить структуру WRS, поскольку энзиматические и другие свойства этого белка были уже изучены (си. обзор Kisselev, 1993).

_L_ Молекулярное клонирование кДНК. копирующей WRS человека.

Стратегия установления первичной структуры...WRS .. человека . . заключалась в следующем: в качестве зонда для скринквга клонотеки кДНК из фибробластов человека в AgtlO использовали фрагмент клонированной кДНК, кодирушей WRS крупного рогатого скота (Garret et al. 1991), любезно предоставленный J.Bonnet и B.Labouesse (Университет Бордо II, франция). В результате скрининга отобрано 10 клонов, четыре из которых детально исследованы (рис. 2). Секвенирование вставок клонов 5 и 9 показало, что они содержат перекрывающуюся нуклеотидную последовательность длиной в 49 п.н. Нуклеотидная последовательность кДНК WRS и выведенная из нее аминокислотная последовательность, приведенные на рис. ' 3, свидетельствуют о том, что протяженность кДНК TOS человека составляет 1959 нуклеотидов, она содержит открытую рамку считывания длиной 1413 нуклеотидов, кодирующую полипептид с ' Мг 53027 Da (471 аминокислотный остаток). Перекрывающиеся нуклеотидные последовательности длиной в 49 п.н. клонов 5 и 9

, P SAP A S В Р XX SP is ■-1- "' " - ' ' I I I II "щ -1

АТС ГАС 1 клон 9 878 I_I

829 клон 5 1959 I___1

-- Ч-

-138 *лон 3 495 ч

' 993 клон 1 1800 - 1_1

296 КАОн 4 705

Рис". 2. Физическая карта и стратегия секвенирования клонов кДНК, кодирующих субьединицу WRS человека. Номера сзерху указывают порядковые номера нуклеотидных остатков, где 1 -. первый 5'-концев0й нуклеотид вставки клона 9. Кодирующая область на карте обозначена жирвой линией. Указаны инициирующий ATG и терминирующий TAG кодоны. На карте обозначены участки расщепления рестриктазами: А - Avail, В - BamHI, Р - PstI, S - Sacl и X - Xhol:

идентичны за исключением трех нуклеотидов, два из которых приводят к аминокислотным заменам: в клоне 5 присутствует Gly213 и Asp214, а в клоне 9 - Ser213 и Туг214; третья нуклеотидная замена не меняет аминокислотный остаток. Мы предполагаем, что оба клона кодируют мРНК S2S, а наблюдаемые различия связаны с генетическим полиморфизмом клеток человека.

Сравнение аминокислотных последовательностей WRS человека и быка (Garret et al., 1991) свидетельствует о высокой степени гомологии этих белков (-90%). В обоих ферментах присутствуют так называемые мотивы HI/VGH и KMSAS, участвующие в связывании АТР и

CGAAAAAAGAGGGGAAGAGTATTAAAGACCATTTCTGGCTGGGCAAAACACTCTCAGCAG 6 a CTCAACTGCCCAGCGTGACCAGTGGCCACCTCTGCAGTGTCTTCCACAACCTGCTCTTGA 120 CTCGTCTGCTGAACAAATCCTCTGACCTCAGGCCGGCTGTGAACGTAGTTCCTCAGAGAT 180 AGCAAACATGCCCAACAGTGAGCCCGCATCTCTGCTGGAGCTGTTCAACAGCATCGCCAC 240 MP NS EPASLLELFNSiAT 18 ACAAGGGGAGCTCGTAAGGTCCCTCAAAGCGGGAAATGCGTCAAAGGATGAAATTGATTC 300 QGE LVR S LKA GNASKDE! DS 38 TGCAGTAAAGATGTTGGTGTCATTAAAAATGAGCTACAAAGCTGCCGCGGGGGAGGATTA 360 AVKMLVSLKMSYKAAAC EDY 58 CAAGGCTGACTGTCCTCCAGGGAACCCAGCACCTACCAGTAATCATGGCCCAGATGCCAC 420 • KADCP P GNP AP TSNHG PDA T 78 AGAAGCTGAAGAGGATTTTGTGGACCCATGGACAGTACAGACAAGCAGTGCAAAAGGCAT 480 EAEEDFVDPWTV. QTSSAKGI 98 AGACTACGATAAGCTCATTGTTCGGTTTGGAAGTAGTAAAATTGACAAAGAGCTAATAAA 540 D YDR L I VR FGS S К I D К EL I N 118 CCGAATAGAGAGAGCCACCGGCCAAAGACCACACCACTTCCTGCGCAGAGGCÄTCTTCTT 600 R I ERATGQ RPHHFLRRGI F F 138 CTCACACAGAGATATGAATCAGGTTCTTGATGCCTATGAAAATAAGAAGCCATTTTAÎCT 660 SHRDMN-QVLDAYENXKPFYL158 GTACACGGGCCGGGGCCCCTCTTCTGAAGCAATGCATGTAGGTCACCTCATTCCATTTAT 720 YTGRGPSSEAMHVGHL I P F I 178 TTTCACAAAGTGGCTCCAGGATGTATTTAACGTGCCCTTGGTCATCCAGATGACGGATGA 780 FT KW LQDVFNVPLVI Q MTDD 198

l Ali T] |G]

COAGAAGTATCTGTGGAAGGACCTGACCCTGGACCAGGCCTATGGCGATGCTCTTGAGAA 840 EKYLWKDLTLDQAYGDAVE-N218

I S]l Y J

TGCCAAGGACATCATCGCCTGTGGCTTTGACATCAACAAGACTTTCATATTCTCTGACCT 900 А К D I IACGFDIN KTFI FSDL238 GGACTACATGGGGATGAGCTCAGGTTTCTACAAAAATGTGGTGAAGATTCAAAAGCATGT 960 DYMGMS SGFYKNVVK I Q l H V 258 TACCTTCAACCAAGTGAAAGGCATTTTCGGCTTCACTGACAGCGACTGCATTGGGAAGAT 1020 TFNQVKG I FGFTDSDC I G К 1 278 CAGTTTTCCTGCCATCCAGGCTGCTCCCTCCTTCAGCAACTCATTCCCACAGATCTTCCG 1080 . S .F P.A.I Q.. A,.A P.. S F S N. S F.P Q I F-R 298 AGACAGGACGGATATCCAGTGCCTTATCCCATGTGCCATTGACCAGGATCCTTACTTTAG 1140 DRTD I QCL I PCA I DQDP YFR 318 AATGACAAGGGACGTCGCCCCCAGGATCGGCTATCCTAAACCAGCCCTGTTGOICTCCAC 1200 MTRDVAPRIGYPKPALLHST 338 CTTCÏTCCCAGCCCTGCAGGGCGCCCAGACCAAAATGAGTGCCAGCGACCCAAACTCCTC 1260 FFPALQGAQTKMSASDPHSS 358 CATCTTCCTCACCGACACGGCCAAGCAGATCAAAACCAAGGTCAATAAGCATGCGTTTTC 1320 I FLTDTARQ1 KTKVNKHAFS 378 TGGAGGGAGAGACACCATCGAGGAGCACAGGCAGTTTGGGGGCAACTGTGATCTGGACGT 1380 GGRDT 1 ESHRQFGGNCDVDV 398 GTCTTTCATGTACCTGACCTTCTTCCTCGAGGACGACGACAAGCTCGAGCAGATCAGGAA 1440 SFMYLTF FLEDDDKLEQIRK 418 GGATTACACCAGCGGAGCCATGCTCACCGGTGAGCTCAAGAAGGCACTCATAGACGTTCT 1500 DYTSGAMLTGELKKAL I-EVL 438 GCAGCCCTTGATCGCAGAGCACCAGGCCCGGCGCAAGGAGGTCACGGATGAGATAGTGAA 1560 QPLIAEHQARRK EVTDEIVK 458 AGAGTTCATGACTCCCCGGAAGCTGTCCTTCGACTTTCAGTAGCACTCGTTTTACATATG 1620 EFMTPRKLSFDFQZ 471

CTTATAAAAGAAGTGATGTATCAGTAATGTATCAATAATCCCAGCCCAGTCAAAGCACCG 1680 CCACCTGTAGGCTTCTGTCTCATGGTAATTACTGGGCCTGGCCTCTGTAAGCCTGTGTAT 1740 GTTATCAATACTCTTTCTTCCTGTGAGTTCCATTATTTCTATCTCTTATGGGCAAAGCAT 1800 TGTGGGTAATTGGTGCTGGCTAACATTGCATGGTCGGATAGAGAAGTCCAGCTGTGAGTC 1860 TCTCCCCAAAGCyGCCCCACAGTGGAGCCTTTGGCTGGAAGTCCATGGGCCACCCTGTTC 1920 TTGTCCATGGAGGACTCCGAGGGTTCCAAGTATACTCT 1959

Рис. 3. Нукяеотидная последовательность кДНК ТО5 человека и выведенная из нее аминокислотная последовательность кодируемого белка, приведенная'в однобуквенном коде, расположенным под вторым нуклеотидом каждого кодона. В нуклеотидной и аминокислотной последовательностях буквы в скобках над нуклеотидом и под аминокислотой соответствуют клону 9.

CTTGAAGGTCTGCTCTGATCTGCTGTGGAGTAGGCAGTTTTGCTCTTTACACC-CCCAGT клон 3

120

CTTTTGTTTAGGGAAGATAATAGAGTACTTCACTGGTTATMCTGCATTTCTTTGTTTCA клон 3

180

AGAGTGTAGTATTTGTTAAACAGGTGAATCTACTTCTCTTAACAAAGTCTCAATGTCCTA клон 3

CGAAAAAAGAGGGGAAGAGTATTAAAGACCATTTCTGGCTGG клон 9

_ 240

TTTGCAATTTATGTGGTAAACACTGAAGACAATGGTCCTTAACCTTTTGGCATCTCAGCC клон 3

102

GCAGCGCACTCTCAGCAGCTmCTGCCCAGCGTGACCAGTGGCCACCTCTGCAGTGTCT клон 9

AsuII 300

TCCTTTC2AAGTCTTGACTCGTCTGCTGAACAAATCCTCTGACCTCAGGCCGGCTGTGA клон 3

TCCACMCCTGGTCTTGACTCGTCTGCTGAACAAATC 9

162

328

ACGTAGTTCCTGAGAGATAGCAAACATG клон 3

ACGTAGTTCCTGAGAGATAGCAAACATG клон 9

190

Рис. 4. Сравнение нуклеотидных последовательностей

5'-нетранслируеных областей кДНК WRS человека. Инициирующий кодон ATG в обоих клонах и участок расщепления рестриктазой AsuII в клоне 3 подчеркнуты., Мелду идентичными нуклеотидами поставлено двоеточие (:).

тРНХ соответственно, и характерные для аминоацил-тРНК-синтетаз класса I (см. обзоры Ciisack, 1993; Carter, 1993). Расчетная мол. масса субъединкцы фермента - 53,027 kDa, несколько меньше размера субьединицы WRS, установленного методом электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях (58 kDa) (Фаворова и др., 1974). Эта небольшая разница может быть связана с посттрансляционной

модификацией фермента (фосфорилирование, гликозилирование и т.д.). В структуре белка выявляется несколько потенциальных участков фосфорилирования по. остаткам Ser/Thr, а также два участка гликозилчрования по остаткам Asn. Известно, что WRS фосфорилирована in vivo и in vitro, а также содержит углеводные остатки (см. обзор Kisseíev, 1993).

Одновременно с публикацией нашей работы (Frolova et al., 1991) появились сообщения из трех лабораторий (Fleckner et al., 1991; Rubin et al., 1991; Buwitt et al., 1992) о том, что в клетках человека, обработанных IFN, возрастает количество белка, структура которого была расшифрована. Сопоставление этих структур с установленной нами структурой WRS человека показало, что речь идет об одном и том же белке - WRS. Следовательно, WRS человека относится к числу белков, индуцируемых IFN. Кроме того, установленная нами первичная структура WRS человека получила независимое подтверждение в этих работах.

Сравнение нуклеотидных последовательностей клонов 3 и 9 кДНК WRS (рис. 4) показывает, что эти клоны содержат одинаковые нуклеотидные последовательности на 3*-концах, а структура 5'-концов различна. Эти данные указывают на существование по крайней мере двух изоформ мРНК WRS человека. Их возникновение может быть связано либо с альтернативным сплайсингом, либо с различными стартами транскрипции гена WRS человека. Для выяснения этих, а также других вопросов необходимо * знать * экзон-интронную организацию гена WRS человека.

2. Молекулярное клонирование гена WRS человека и установление его экзон-интронной организации,

Для молекулярного клонирования природного гена WRS человека использовали геномную клонотеку, любезно предоставленную А.Гришиным (ИБХ РАН) и сконструированную из ДНК спермы человека в векторе A.EMBL3. Для скрининга неамплифицированной клонотеки в качестве зондов использовали меченые вставки кДНК WRS клонов 9 и 5, представляющие собой 5' и 3* части кДНК WRS человека соответственно. В результате отобрано 8 гибридизукяцихся клонов. После физического картирования клонированных ' фрагментов геномной ДНК и идентификации фрагментов, содержащих экзоны, для дальнейшей работа отобраны клоны А, В, С и D (рис. 5.). Фрагменты геномной ДНК этих клонов, содержащие нуклеотидные последовательности

экзонов, субзлонированы и секвенированы. Границы экзонов и интронов устанавлены путем сравнения нуклеотидных

последовательностей геномных клонов и кДНК (клоны 3, S и 5). Геномные клоны А, В, С и D содержали все представленные в кДНК WRS экзоны, за исключением фрагмента кДНК размером 120 п.н. (рис. 5).

Для иде1ггификации методом PCR отсутствующего в геномных клонах фрагмента кДНК использовали тотальную, геномную ДНК из лимфоцитов человека в качестве матрицы, а ,в качестве затравок -олигодезоксирибонуклеотиды к известным 5'- и З'-концевым нуклеотидным последовательностям фрагмёнта ДНК, отсутствующего в геномных клонах. Олигонуклеотиды, 5'-AGATATGAATCAGGTTCTTGATG-3' и 5'-TTTGTGAAAATAAATGGAATGAGG-3', комплементарные участкам кДНК клона 9 - 610-732 п.н. и 706-729 п.н. соответственно, синтезированы в любезно предоставлены Б. Черновым (ИМБ РАН). В результате этой реакци синтезируется единственный~ фрагмент ДНК размером 120 п.н., гибридизующийся с кДНК клона 9. Анализ его нуклеотидной последовательности свидетельствует о том, что он соответствует отсутствующему в геномных клонах фрагменту кДНК и, следовательно, представляет собой отдельный и единственный экзон.

3^. Экзон-интронная организация гена WRS человека. ; .

Ген WRS человека состоит по крайней мере из. 12 экзонов, разделенных 11 интронами и имеет протяженность более 35 т.п.н. (рис. 5). Точная длина интрона между зкзонами IX и X неизвестна из-за отсутствия перекрывающихся геномных клонов, так же как размеры интронов, фланкирующих экзон V, структура которого установлена методом PCR.

• Полная нуклеотидная последовательность экзонов гена WRS человека и прилегающих к ним областей интронов показана на рис. 6. По данным гибридизации с кДНК клона 9, первый нетрансли.руемый экзон 1а локализован в геномном клоне А (рис. 5 и 6). Клоны 9 и 3, кодирующие N-концевую часть полипептида (рис. 4), отличаются по нуклеотидной последовательности, начиная с 74 нуклеотида левее от инициирующего содона ATG. Существование двух типов кДНК WRS, содержащих на 5'-концах разные нстранслируемые последовательности, может указывать на возможность альтернативного сплайсинга в этом участке. Для идентификации альтернативного нетранслируемого экзона Ib в качестве пробы для гибридизации с геномными клонами использовали фрагмент .AsulI'-EcoRV (245 п.н.) кДНК клона 3 (сайт

la lb II

Ш IV

l-F-доыен

V VI

VII VIII DC X И

H * 151 ' Г II ' Г

коровий фермент—

S В В BAScScS

III"_UJ

клок A

SScScSlH I IMI_

H H ..I I

клон В

I Т.П.Н.

S В SeBSe BgB S

I I Щ_U-1

клон С

SXHScBXX

I II It If

клон D

Рис. 5. Экзон-интронная организация гена WRS человека. Экзоны -вертикальные линии, пронумерованные римскими цифрами, интроны -горизонтальные линии в масштабе, пронумерованные арабскими цифрами. Разрывы в горизонтальной линии указывают на отсутствующие в геномных клонах участки интронов. Показано соотношение между экзон-интронной организацией гена и доменной структурой субъедикицы WRS. В масштабе представлены физические карты геномных клонов А, В, С и D, содержащих ген WRS человека и отобранных для секвенирования. Участки расщепления рестриктазами: А - AsuII, В ' -BamRl, Bg - Bglll, H - ШпйШ, Р - PslI, S - Sau3A, Sc - SacI, SI - Sail и X - Xhol. Внизу слева указан масштаб.

cccagcgtctgtgaecccagactcctgatctttccactgcactgtgccgcctcggtgaac

ISRE I Spl

agatgcggggaatttacagtttccctttccaccgcccacgactacacaaaatcagtcaca ctgacgctgagggtggggaacgggaagagggtggggaggt tat t tggaggccagcggggg

CAAT box

gtgaggggtggctgatgcaatgâccagctaatggctcgattctcaagagggtttcallfig

CAAT box

tctcaacctggccecccaggcaacccacccctgajJLggacagtctcatcaagaaggt tgg

gas 1

tcaagagctcaagtgtt tctgagaatctgggtgatttataagaaacccttagctgaatgc

ISRE4I

agggtggggagaacgaaagacaaaagcatcttttttcagaagggaaactgaaagAAAGAG TATA box

GGGAAGAGIMIAAAGACCATTTCTGGCTGGGCAGGGCACTCTCAGCAGCTCAACTGCCC Эк зон AGCGTGACCAGTGGCCACCTCTGCAGTGTCTTCCACAACCTGGg t a t gt at t gcca t с 11 I а tgccaggct tagagcttgttcgtgtttttagcaaagtgctgaaaaccttggt ttaggggg tcaggacttgtgtcttaggattagggtgttatgcattttacttcttccattgacçcaaag ttcaggtgattcactgctcccatagggaacagagatcctggctgagcagtcgcgggcttg gatccagaaacactcctgggccacattctcttctcagctgctccagaattggctgtcttg Интрон atgccacccttccccagat tgcagaatcagcgtgtectgatctctgtgagatgattttga la tgcaacccaagtctttatcatgttgttctgttaaacaattctatagtcctttccactcct CAAT box TATA box

catccçaâiacaatacccagtttctt taagtgcctJUilatgctcctccaccgcagtgga

aactttcagaatgagcacaagattcaagttcttcaaaagggggaactgggggttaatt tt caagaggc 1111 tage 111 с t cÇTTGAAGGTCTGCTGTGATCTGCTGTGGAGTAGGCAGT TTTGCTCTTTACACGCCCAGTACTTTTGTTTAGGGAAGATAATAGAGTACTTCACTGGTT Экзон ATAACTGCATTTCTTTGTTTCAGAGTGTAGTATTTGTTAAACAGGTGAA1CTACTTCTCT I b

taacaaagtctcaatgtcctatttgcaatttatgtggtaaacactgaagacaatggtcct

TAACCTTTTGGCATCTCAGCCTCCTTTCGAAAGgtaagaaagccaggagactgctcaaaa

....................Интрон lb...............................

gageteaetttgtcttagagcagctgaccagcagtggaagacatttcctcagcgatatat tagttatggctacaaaagcccaagaattcatcccçaaggcaattaagataaaccacaaat

agagg'atgggtgccttggctcacac'ctataatcccaacagaggatcacctgaggtcagaa

gttcaagaccagcctggccaacatggtgaaaccctccctctacTaaaaatacaaaaat tc

gctgggcatggtggcaggcagcctcaggaggcTgagacagaagaatcgctlgaaccccag

aggtggaggttgcagtgagccaagätcacaccattgcactccägcctgggtggcagagcg

agactccatctcaaaaaaaaaaaaaatcaaatagtaatttgecaaaagtttttagcaatg

aact taggttcattaaaacacattggtat ttataeeetgagcaaacaggagtcctcctgt gt tctgggcactgggtgggggcacaggggcatcgaccagatggaaacttgatcttgacta ggagggcccctcctagtcaagtagattcacaccttaagtcagtaaatcctagccactcct t tagtettcatcactggcatttgatggttttcctcttcttcatggccccaaatttetggt tctctttttattatattatctatgtcctttactgtaactcacctcacaacctttccggaa aaaaggactcaatacaggaaaggaaaaacagccgcgatgttgtgttaacctctggttttt cctctctctccttccccgcccccaccccagTCTTGACTCGTCTGCTGAACAAATCCTCTG ACCTCAGGCCGGCTGIGAACGTAGTTCCTGAGAGATAGCAAACATGCCCAACAGTGAGCC

M P N S E P Экзон CGCATCTCTGCTGGÄGCTGTTCAACAGCATCGCCACACAAGGGGAGCTCGTAAGGTCCCT 11

ASLLELFNSIATQGELVRSL CAAAGCGGGAAATGCGTCAAAGgtacatgat 11 tnctgggttctccacgaaggcagctga К A G N A S К

gcctcccaagtctgtagggttgtgttcctctagaa ........................

.........................Интрон 2...........................

111 сс t с t с t cagGATGAAATTGATTCTGCAGTAAAGATGTTGGTGTCATTAAAAATGAG DE I DSAVKMLV S L К M S

CTACAAAGCTGCCGCGGGGGAGGATTACAAGGCTGACTGTCCTCCAGGGAACCCAGCACC

YKAAACEDYKADCPPGNPAP Э???н TACCAGTAATCATGCCCCAGATGCCACAGAAGCTGAAGAGGATTTTGTGGACCCATCGAC TSNHGPDATEAEEDFVDPWT AGTACAGACAAGCAGTGCAAAAGGCATAGACTACGATAAGCTCATTGg t acg t cc t с t g с

VQTS SAK.G I DYDKL I tttcttcccagaaaaagctgcaacttttagaagtggtcccattgagttgattccattgat

gtttttaaattttgaattaatgatanattcagtgaagctt....................

.........................Интрон 2..........................

agaaag t cat et 111 с 111111t ccagTTCGGTTTGGAAGTAGTAAAATTGACAAAGAGC

VRFGSSKIDIE Экзон TAATAAACCGAATAGAGAGAGCCACCGGCCAAAGACCACACCACTTCCTGCGCAGAGGCA IV L I NR I ERATGQRPHHFLRRG TCTTCTTCTCACACAGgt caggggc t с 11................................

Í..F..?..?..?..!..........Интрон 4,........................

AGATATGAATCAGGTTCTTGATGCCTATGAAAATAAGAAGCCATTTTATCTGTACACGGG

DMNQVLDAYENKKP FYLYTG Экзон CCGGGGCCCCTCTTCTGAAGCAATGCATGTAGGTCACCTCATTCCATTTATTTTCACAAA V RGPSSEAMHVGHLIPF I F-T К

..........................Интрон 5 ............'............

cggcagctgcgcccccgtgtttcttt agGTGGCTCC AGGATGTATTT AACGTGCCC TTGG

WLQDVFNVP L TCATCCAGATGACGGATGACGAGAAGTATCTGTGGAAGGACCTGACCCTGGACCAGGCCT • VI QMTDDEKYLWKDLTL DOA Экзон ATAGCTATGCTGTGGAGAATGCCAAGGACATCATCGCCTGTGGCTTTGACATCAACAAGA V1 YSYAVEN AKD1 I А С G F D F N К CTTTCATATTCTCTGACCTGGACTACATGGGgtaaggagaaaacgtctggctgcct111с TFIFSDL DYMG

aataggtagaggaggatgtcaagttgtcatgaccacagctaaattcgaaacaactgaaat ggtcttaaggcctagtaaatgttcttcttcctttattaaatgctatgagtggccagccat ggtcggtcactcctgtaatcccagcactttgggággccgaggtgggcgggtcacgaggtc aggagttcaagaccagcctgaccaacatggtgaaaccccatctctattgaaaatacaaaa -attagttgggtgtggtggcacgcacctataagcccagctactcaggtggctgaagcagga gaatcgcttgaacccaggaggtggaggttacagtgagttgagatcacgccattgcactcc agcctgggcaacagagcgagactccatctcaaaaaggaaaaaaaaatgctatgagct .

.........................Интрон б...........................

attctcgttgtctt tgcagGATGAGCTCAGGTTTCTACAAAAATGTGGTGAAGATTCAAA

MSSGFYKN V VKIO Экзон AGCATGTTACCTTCAACCAAGTGAAAGGCATTTTCGGCTTCACTGACAGCGACTGCATTG VI I KHVTFNQVKGI FGFTDSDC I

gtaaggggcccactgctgctgtggaccactccctgcacccttcaaaaa............

....................... Интрон 7..........................

ctcatctcacgtgtaaaaatactttttctcattttcagGGAAGATCAGTTTTCCTGCCAT

G К I S F P A I

Экзон

VIII

CCAGGCTGCTCCCTCCTTCAGCAACTCATTCCCACAGATCTTCCGAGACAGGACGGATAT QAAPSF SNS FPQ I FRDRTD I CCAGTGCCTTATCCCATGTGCCATTGACCAGgtcagcaggcagaaaagcaaggctct cta QCLIPCA1DQ

agtctggggcattgacagcaggttcctcttac ...........................

.......i.................Интрон 8 .........................

111 tctggccgccctcatcagggtcct tactctccccacagGATCCTTACTTTAGAATGA

D P Y F R M 3 CAAGGGACGÏCGCCCCCAGGATCGGCTATCCTAAACCAGCCCTGTTGCACTCCACCTTCT TRDVAP R I GYPKPALLHSTF 1A TCCCAGCCCTGCAGGGCGCCCAGACCAAAATGAGTGCCAGCGACCCAAACTCCTCCATCT FPAL OGvAQTKMSASDPNSS I TCCTCACCGACACGGCCAAGCAGATCAAAACCAAGgtgagcagtggcccaggccaga.'.. F L T D T A К -0. I К J К .........................Интрон 9..

ctgcagtgagccccacagtagctcacacccccgcctcacaggaagaacagcagtgggtcc cccactggctgtgcgcccccgsccggctgtgcgccttggcctttccctggtccagaatct gacagcactcacacctctgacttccacacttgggcttctagccagtgtccaggcacagga tgagcaggactgaggagcgtgtctgtgtcctcttctggtgcagGTCAATAAGCATGCGTT

VNKHA F

TTCTGGAGGGAGAGACACCATCGAGGAGCACAGGCAGTTTGGGGGCAACTGTGATGTGGA

SGGRDT IESHRQFGGNCDVD Экзон CGTGTCTTTCATGTACCTGACCTTCTTCCTCGAGGACGACGACAAGCTCGAGCAGATCAG X V SFM YLTFFL:EDDDKLEQIR

GAAGagtgagcagggaaccccaagggcccacagccg .................

К 4

............'............Интрон 10 ..............."л.........

cccctagcatcggtaggggtgggcactgccctccccattggccctItcactgtgagaggc caagtcatggctatcgtcagagcccaggtttctagccgt11taggaaaagtgtagctcaa ggtataggttattgttgtggtaacaacagatctcacttctgagtgccacccacgtgccag gctctgcatgggtggtgagggctgagctggtgcccgaggcaggaaggagccgctcaggac atgtggagccatctctcacgtggctgtcctcctccgggcagGATTACACCAGCGGAGCCA

" ' D Y T S G A TGCTCACCGGTGAGCTCAAGAAGGCACTCATAGAGGTTCTGCAGCCCTTGATCGCAGAGC M L T G E L К К A L I E V L Q P L I A E ACCAGGCCCGGCGCAAGGAGGTCACGGATGAGATAGTGAAAGAGTTCATGACTCCCCGGA HOARRI EVTDEIVKEFM TPR Экзон AGCTGTCCTTCGACTTTCAGTAGCACTCGTTTTACATATGCTTATAAAAGAAGTGATGTA XI KLS FDFQZ

TCAGTAATGTATCAATAATCCCAGCCCAGTCAAAGCACCGCCACCTGTAGGCTTCTGTCT CATGGTAATTACTGGGCCTGGCCTCTGTAAGCCTGTGTATGTTATCAATACTGTTTCTTC CTGTGAGTTCCATTATTTCTATCTCTTATGGGCAAAGCATTGTGGGTAATTGGTGCTGGC TAACATTGCATGGTCGGATAGAGAAGTCCAGCTGTGAGTCTCTCCCCAAAGCAGCCCCAC AGTGGAGCCTTTGGCTGGAAGTCCATGGGCCACCCTGTTCTTGTCCATGGAGGACTCCGA GGGTTCCAAGTATACTCTTAAGACCCACTCTGTTTAAAAATATATATTCTATGTATGCGT ATATGGAATTGAAATGTCATTATTGTAACCTAGAAAGTGCTTTGAAATATTGATGTGGGG AGGTTTATTGAGCACAAGATGTATTTCAGCCCATGCCCCCTCCCAAAAAGAAATTGATAA GTAAAAGCTTCGTTATACATTTGACTAAGAAATCACCCAGCTTTAAAGCTGCTTTJAACA ATGAAGATTGAACAGAGTTCAGCAATTTTGATTAAATTAAGACTTGGGGGTGAAACTTTC CAGTTTACTGAACTCCAGACCATGCATGTAGTCCACTCCAGAAATCATGCTCGCTTCCCT TGGCACACCAGTGTTCTCCTGCCAAATGACCCTAGACCCTCTGTCCTGCAGAGTCAGGGT GGCTTTTCCCCTGACTGTGTCCGATGCCAAGGAGTCCTGGCCTCCGCAGATGCTTCATTT TGACCCTTGGCTGCAGTGGAAGTCAGCACAGAGCAGTGCCCTGGCTGTGTCCCTGGACGG GTGGACTTAGCTAGGGAGAAAGTCGAGCAGCAGCCCTCGAGGCCCTCACAGATGTCTAGG CAC-GCCTCATTTCATCACGCAGCATGTGCAGGCCTGGAAGAGCAAAGCCAAATCTCAGGG AAGTCCTTGGTTGATGTATCTGGGTCTCCTCTGGAGCACTCTGCCCTCCTGTCACCCAGT

сигнал полиаденилировання AGAGTAMIAAACTTCCTTGGCTCCTGc tcttgtcat tgtgctctgtct gggagg t с t ga ggagggagcagagacccctcccctcacccttctgtggatgaccttgagtctgctggagtc aaaatttggggatgaaagcgcacagtcccaggaaccccatggtgttgtgccacagctccc aggaatgggcttgtgctgggagagccttagcagcatc

Рис. 6. Нуклеотидная последовательность экзонов и прилегающих участков интронов гена TOS человека. Нуклеотиды экзонов указаны заглавными буквами, прилегающих участков интронов и 5'- и 3*-нетранслируемых областей - строчными буквами. ISRE, GAS, Spl, СААТ box, TATA box и сигнал полиаденилировання подчеркнуты. Экзоны - римские цифры, интроны - арабские. Аминокислоты указаны в однобуквенном коде. Терминирующий кодон обозначен Z.

Таблица 1. Концевые нуклеотидные последовательности внтронов и экзонов гена WRS человека.

Экзоны 5'конец Экзокы 3'конец Интроны 5'конец Интровы 3'конец 1 Фаза

(п.н.) (донор) ( т.п.н. ) (акцептор)

1а ААА ОАО 108 .АСС тем 1а вТ АТбТАТ 0.5 ?

1Ъ ? >252 СвА ААО 1Ь 6Т ААБААЛ 4.5 САСССС Ав 0

П\ ТСТ ТвА 172 ТСА ААв 2 вТ АСАТбА 615 ТСТСТС АО 1

5 К -

1П ОАТ ОАА 214 АТТ в 3 ОТ АСвТСС 1-2 ТТТТСС Ав 1

В Е 1 V •

IV ТТ ССЮ 109 САС АО 4 ОТ САСХОй >5 ч 0

V й Н Б

V А вАТ 120 АСА АА 5 ? ТТСТТТ Ав 2

Е 0 . Т К -

VI Й Т(Ю 183 АТС СО б ОТ ААООАО 6 СТТТСС Ав 2

К ¥ М й

VII в АТС 101 АТТ О 7 6Т ААСККК; 4 АТТТТС АО 1

0 М I й

VIII СЮ ААв 113 АС САй 8 ОТ САОСАв 0.5 ССССАС АО 0

С К 0 0

IX вАТ ССТ 174 АСС ААО 9 ЙТ ОАвСАО >3 ТОвТОС АО 0

й Р Т " К

X бТС ААТ . 141 А«Г ААв 10 вТ йАйСАО 2.5 ССОООС АО 0

V N Е К

XI вАТ ТАС 1248 СТС СТС

Р У -

В таблице представлены 5*-донорные и 3'-акцепторные концы интронов (8 нуклеотидов), а также 5'- и З'-концевые нуклеотиды каждого экзона; аминокислоты в однобуквенном коде указаны под вторым нуклеотидом каждого кодона. Фазы сплайсинга 1, 2 и 0 указывают на то, что сплайсинг происходит после после первого, второго или третьего нуклеотида соответственно.

£coRV принадлежит полилинкеру вектора pBluescriptSK"1"), содержащий нетранслируему» область, отличающуюся от нетранслируемого участка кДНК клона 9 (рис. 4). Действительно, в геномном клоне А присутствует второй нетранслируемый экзон lb, локализованный правее экзона 1а (рис. 5).

В экзоне II находится инициирующий кодон ATG, кодирующая область расположена в экзонах II-XI, терминирующий кодон TAG - в экзоне XI, а мотивы H1/VGH и KMSAS - в экзонах V и IX соответственно (рис. б).

Нуклеотидвые последовательности на концах интронов в местах сплайсинга во всех случаях, за исключением 3*-конца интрона 1а, укладываются в консенсус, описанный ранее (Shapiro k Senapathy, 1987): все интроны начинаются на 5'-конце с GT и заканчиваются на 3'-конце AG (Табл. 1).

Началу экзона lb предшествует неканоническая

последовательность ТС. Это может быть связано с тем, что З'-конец интрона 1а неизвестен, т.к. кДНК клона 3, с нуклеотидной последовательностью которой сравнивали нуклеотидную

последовательность геномного клона А, может быть неполной на 5'-конце.

Первые пять нуклеотидов - CGAAA 5'-конца кДНК клона 9 не обнаружены на 5'-конце экзона 1а, при этом началу экзона 1а предшествует каноническая' для З'-конца Интрона последовательность AG. Возможно, что первые пять нуклеотидов кДНК клона 9 принадлежат еще одному, пока не идентифицированному, лежащему левее экзона 1а нетранслируемому экзону.

Сплайсинг.между экзонами происходит после первого, второго или третьего нуклеотида кодона (Табл. 1), т.е. встречается фаза сплайсинга типа 1, 2 или 0 соответственно (Sharp, 1981).

10 из 12 экзонов гена WRS человека имеют размер 109-214 п.н. (Табл. 1), как большинство известных экзонов генов млекопитающих (Dorit et al., 1990). Экзон lb (2:252 п.н.) длиннее среднего размера экзонов, однако, его размер окончательно не установлен. Сашй длинный экзон XI (1247 п.н.) кодирует С-конец фермента и З'-нетранслируемую область мРНК, содержащую сигнал полиаденилирования (рис. б). Размеры интронов варьируют от 0,5 т.п.н. (интроны 1а и 8) до 6,5 т.п.н. (интрон 2) (Табл. 1).

Нуклеотидяая последовательность экзонов гена WRS подтверждает структуру кДНХ WRS человека с точностью до нуклеотида. В

анализируемых геномных клонах присутствует нуклеотидная последовательность.. кДНК WRS клона 9. З'-конец экзона XI соответствует кДНК, кодирующей WRS (т2) человека (Fleckner et ai., 1991), и отсутствует в кДНК WRS клона 5.

Методом гибридизации in situ с использованием кДНК WRS человека в качестве зонда установлена точная хромосомная локализация гена WRS человека: он расположен на длинном плече хромосомы 14 в локусе q24.

4. Рагуляторные элементы в. S * -Фланкирующей области гена WRS человека. '

Проведен компьютерный анализ нуклеотидной последовательности 5'-фланкирующих областей гена WRS человека для' выявления предполагаемых регуляторных элементов. . Нуклеотидные

последовательности типа TATA box, характерные для промоторных областей большинства генов (Sawadogo & Roeder, 1985), обнаружены в экзоне 1а и в интроне 1а гена WRS человека (рис. б). Впоследствии экспериментально установлено, что основная точка начала транскрипции мРНК WRS человека находится в экзоне 1а справа от TATA box на расстоянии 23 п.н. (Tolstrup et al., 1995).

В промоторной области гена W8S обнаружено три элемента типа СААТ box, служащего участком связывания транскрипционного фактора NF-1, и элемент Spl - участок связывания транскрипционного фактора Spl (Briggs fet ai., 1986), -часто встречающиеся в промоторных областях генов, транскрибируемых РНК-полимеразой II.

Одновременно в трех лабораториях (Fleckner et ai., 1991; Rubin et al., 1991; Buwitt et al., 1992) из данных молекулярного-клонирования кДНК расширована аминокислотная последовательность белка, индуцируемого в культуре клеток человека , I FN—а и IFN-r, оказавшегося WRS. Таким образом, было, установлено, что WRS является IFN-индуцируемым белком.

Если индукция WRS IFN происходит на уровне активации транскрипции гена, то следует ожидать присутствия в 5'-фланкирующих областях гена регуляторных элементов, характерных для IFN-зависимых генов. Изучение промоторных участков различных IFN-зависимых генов позволило выявить консенсус IFN-зависимого элемента (ISRE) 5'-GGAAAN(N/-)GAAACT (где N может быть G, А, Т или С, а означает «.отсутствие нуклеотида) (Williams, 1991; .Kerr к Stark, 1991), с которым связывается белковый фактор ISGF3. В

некоторых IFN-зависимых генах, например, в гене (2'-5*)олигоаденилатсинтетазы человека, цза 3*-концевых нуклеотида консенсуса (СГ) могут быть заменены другими нуклеотидами. Вторым элементом, присутствующим в промоторньч областях генов, активируемых под действием IFN-тг, является GAS, расположенный обычно вблизи старта транскрипции (Decker е: al., 1991). Индуцируемый IFN-г белковый фактор GAF связывается с этим элементом и регулирует транскрипцию.

Для 'выявления 1SRE и GAS в гене WRS человека проведен компьютерный анализ 5'-фланкирующих областей гена с помощью программы SIGHAL SCAN, версия 3.0. Обнаружено два 1SRE мотива, локализованных левее экзона la - ISRE I и ISRE ¡1 (рис. б). ISRE II находится непосредственно пере^началом экзона la. ISRE I в обратной ориентации (минус цепь ДНК) расположен левее ISRE II на расстоянии 3Î0 п.н. Поскольку расстояние между ISRE невелико, то они могут усиливать активность друг друга, как это показано для ISRE гена (2'-5')олигоаденилатсинтетазы (Cohen et al., 1988; Rutherford et al., 1988). Даже единственная копия ISRE может функционировать как IFN-индуцибельный элемент (Cohen et al., 1988; Dale et al., 1989), однако эффективность индукции существенно зависит от дополнительных регуляторных элементов и фланкирующих ISRE нуклеотидаых последовательностей (Williams 1991).

В непосредственной близости- от старта .транскрипции обнаружен мотив GAS (рис. 6), который связывается с белком GAF (Strehlow et al., 1993) и является IFN-r-i«fly№6enbHbiM элементом при встраивании перед репортерным геном CAT и тестировании его экспрессии в опытах по трансфекции клеток, обработанных и не обработанных IFN-7.

Присутствие IFN-регулируемых элементов в 5'-регуляторной области гена 1ÎRS человека находится в полном соответствии с приведенными выше данными по индуцибельности синтеза WRS IFN. Известно, что ISRE отвечают за индукцию как IFN-a, так и IFN-r (Reid et al., 1989), a GAS за индукцию IFN-y (Decker et al., 1991). Действительно, синтез WRS человека стимулируется и IFN-a, и IFN-r (Rubin et al., 1991). Для выяснения функциональной роли каждого регулаторного элемента, обнаруженного нами в гене WRS человека, необходим функциональный анализ 5'-фланкируещей области гена WRS, проведенный в двух лабораториях (Strehlow et al., 1993; Toistrup et al., 1995).

Многие вирусные и клеточные Spl-зависимые промоторы имеют элемент Spl, локализованный в непосредственной близости от других регуляторных элементов (Kadonaga et al., 1986). Это также верно и для IFN-зависимых генов, в которых элемент Spl расположен вблизи от ISRE (Rutherford et al., 1988; Porter et al., 1988). Подобная организация обнаружена -и в гене WRS человека: потенциальный элемент Spl 5'-GGGCGG-3' в обратной ориентации (минус цепь ДНК) примыкает непосредственно к З'-концу ISRE I (рис. б).

Аминоацил-тРНК-синтетазы - неотъемлемые компоненты клеточного механизма биосинтеза белков - совершенно необходимы для существования живых клеток. Присутствие IFN-зависимых регуляторных элементов в гене, кодирующем , WRS, обнаружено вами . впервые. Индуцибельность WRS человека I FN—at и IFN-7 указывает на то, что WRS может, обладать дополнительными неканоническими функциями, как постулировано ранее (см. обзор Kisselev к Tolfson, 1994).

5. Возможная роль WRS д клеточном ответе на IFN.

Принадлежность .WRS к IFN-зависимым белкам нуждается в объяснении, т.к. участие аминоацил-тРНК-синтетаз в IFN-сигнальном пути ранее в литературе не обсуждалось. Мы выдвинули несколько гипотез о возможной роли WRS в действии IFN.

Как известно (Kisselev к Kovaleva, 1987; Merkulova et al., 1994), ÏRS млекопитающих, в отличие от. подавляющего большинства -других аминоацил-тРНК-синтетаз, катализирует образование Ар^А. Отсюда следует, что при возрастании концентрации 1RS в . клетках количество Ар^А должно увеличиваться. Как показали опыты А.Вартанян и К.Турпаева в нашей лаборатории, при действии IFN-a и -г на моноциты человека в культуре содержание Ар^А резко возрастает, т.е. можно предположить, что Ар^А, образующийся " под действием WRS, участвует в передаче сигнала при клеточном ответе на IFN.

Вторая гипотеза предполагает, что WRS может узнавать определенные нуклеотидные последовательности в ДНК и/или РНК IFN-зависимых генов специфическим образом, что может стимулировать или, напротив, тормозить их экспрессию. Проще всего допустить, что эти нуклеиново-белковые взаимодействия основаны на том же структурном принципе узнавания, который используется при аминоацилировании тРНК. Поскольку тРНКТгР узнается WRS по антикодону (см. обзоры в книге Transfer RNA, 1994, ed. 'D.Sol I к

U.RajBhandary), то можно допустить существование в структуре регуляторной области IFN-зависимых генов и/или их транскриптов антикодоновой петли тРНК^гР, узнаваемой WRS. Компьютерный поиск таких нуклеотидных последовательностей, выполненный В.Блиновым (НПО Вектор), подтвердил это предсказание: в структуре IFN-зависимых генов млекопитающих выявлены участки, структурно близкие к антикодоновой шпильке тРНК^'Р.

Третья гипотеза основана на том, что VfRS млекопитающих содержит уникальный N-домен, обладающий пуриннуклеознд-трифосфатазной активностью (Kovaleva et al., 1993). Возможно, что именно этот домен, не нужный для реакции аминоацилирования тРНК^гР, используется в клеточном ответе на IFN, хотя сам механизм остается неизвестным.

Наконец, последнее предположение исходит из того, что возрастание концентрации WRS в клетках позволяет аминоацилировать те минорные фракции тРНК^г?>, которые при обычных условиях не ацилированы. Эти фракции тРНКТгР могут, в отличие от основной изоакцепторной тРНКТгР, обладать супрессорной активностью и читать мРНК, содержащие терминирующие (стоп) кодоны. Если это действительно так, то после действия I FN в клетках будут экспрессироваться некоторые мРНК, которые обычна- "молчат". Эти мРНК могут кодировать синтез белка(ов), участвующего(их) в клеточном ответе на' IFN;' " ' ' ' " J

Хотя ни одна из изложенных гипотез не доказана, их достоинство, с нашей точки зрения, состоит в том, что они. поддаются экспериментальной проверке, что будет предметом наших дальнейших исследований.

6. Взаимосвязь между экзон-интронной организацией гена и доменной структурой субъединицы WRS.

Известно, что субъединица WRS быка состоит из двух доменов: "корового" (core) и N-домена. " Коровый" домен размером -40 kDa образуется в результате ограниченного протеолиза (Prassolov et а 1, 1975; Lemaire et al., 1975). При протеолизе эластазой или за счет эндогенных протеаз (возможно катепсина, присутствующего в поджелудочной железе) сохранившийся "коровый" домен в составе димера катализировал как Тгр-зависимый РР^АТР-обмен, так и аминоацилирование тРНК^гР. Второй домен, меньший по размеру, чувствителен к протеолизу и расположен, на N-конце полипептидной

цепи субъединицы WRS быка. Поскольку гомология между аминокислотными последовательностями WRS быка и человека составляет более 90%, можно предположить, что субъединица WRS человека также состоит из двух аналогичных доменов.

• N-концевая последовательность субьединицы WRS млекопитающих отсутствует в субъединице бактериальных WRS, в то .время как "коровый" домен WRS- млекопитающих имеет гомология (-30%) с бактериальными WRS. Эти особенности эволюционно более молодых белков дают основание предполагать, что N-домен появился позднее и не несет канонических энзиматических функций. Структура кыне существующего гена WRS млекопитающих, возможно; образована в результате слияния генов или путем генетической рекомбинации.

Поскольку субъединицы бактериальных WRS достаточно для осуществления каталитической активности в составе димера, следовательно, они составляют минимальную корову» структуру. Согласно нашим расчетам, граница между N-доменом и "коровым" доменом находится в районе 147-ой аминокислоты. Как показано Lemaire. ef а1. (1975) N-концевой аминокислотой в знзиматически^ активном "коровом" домене WRS быка является остаток Asp. В районе предполагаемой границы между N-доменом и "коровым" доменом находятся два остатка, Aspl47 и Aspl53 (Garret et al., 1991) в WRS быка и Aspl42 и Aspl48 в WRS человека (Frolova et al., 1991).

Из. структуры гена WRS человека (рис. . б) видно., что первой аминокислотой, кодируемой экзоном V, является - Aspl42. Это

означает, что экзоны со II по IV кодируют N-домен фермента, а "коровый" домен кодируют экзоны V-XI. Таким образом, наблюдается корреляция между экзон-интронной организацией гена и доменной структурой субьединицы WRS. Мы предполагаем, что WRS высших эукариот представляют собой химеры и состоят из двух элементов -"коревого", имеющего общее происхождение для прокариот и эукариот, и N-концевого, присутствующего только у эукариот и выполняющего неизвестные функции.

Часть III. Факторы терминации трансляции высших эукариот и гены, кодирующие эти белки.

eRF и WRS - разные белки jr высших организмов.

В 1990 г. появилось сообщение (Lee et aJ.,1990) о том, что eRF кролика имеет некоторое структурное сходство с WRS (¡актерий. Вскоре была расшифрована первичная структура WRS быка (Garret et а 1. 1991) и человека (Frolova et al. 1991). Оказалось, что ранее установленная первичная структура eRF из ретикулоцитов кролика, выведенная из структуры кДНК, имеет "высокую степень гомологии ( 9096) с WRS млекопитающих (рис. 7). Из этого наблюдения были сделаны два противоположных вывода: Garret et al. (1991) предложили возможные объяснения этой гомологии, тогда как в нашей работе (Frolova et аI. 1991) было высказано мнение, что структурная близость eRF и WRS есть артефакт, возникший в результате неверной атрибуции отобранного клона кДНК.

В работе Lee et al. (1990) для скрининга клонотеки и идентификации кДНК использовали моноАТ, полученное против очищенного eRF кролика, однако, не было доказано, что оно действительно связывается с этим белком. Мы показали, что "анти-RF" моноАТ связывается с высокоочшценной WRS быка (рис. 10, дорожка 1) "и" предположили, что это моноАТ образовалось против WRS, а не против eRF кролика вследствие того, что очищенный eRF кролика (антиген), использованный для иммунизации мышей, был загрязнен WRS. Это предположение подтверждено экспериментально: при фракционировании eRF на колонках ДЭАЭ-целлюлозы и фосфоцелюлозы, использованных Lee et al. (1990) для очистки eRF кролика, eRF и WRS разделяются не полностью (рис. 8). Ш также не обнаружили eRF-активности в очищенных (>9095 чистоты) препаратах WRS быка, и человека (Табл. 2). Полного разделения eRF и WRS удалось достичь только при очистке на колонке с Mono Q (рис.9В) после предварительной хроматографии на колонке с Q-Sepharose (рис. 9А). "Анти-eRF" моноАТ, использованное для скрининга клонотеки, не связывается с фракциями после Mono О, содержащими активность eRF, но связывается с фракциями, содержащими активность WRS (рис. 10). Таким образом, ошибка в атрибуции клона кДНК действительно произошла в результате использования для скрининга .анти-WRS ыоноАТ, а не анти-eRF моноАТ.

Таблица 2. Определение ЙР-ахтивности в высокоочищенных препаратах человека, быка и частично очинённых препаратах ТОБ кролика (рис. 9А и В) в присутствии ро!у(А,С,и)

WRS быка 0

WRS человека (у2) 0

Фракция I 0. .34

Фракция 1I 0- .25

RF-активность измеряли в системе in

Белок fl^SJMet vitro как зависимый от стоп-кодона

(pmol) гидролиз fl35S]Met-tRNAfinet,

ассоциированной с комплексом AUG-80S

рибосома (Tate & Caskey, 1990).

Инкубационная смесь содержала 20 шМ

Tris-HCl, pH 7,5, 15 шМ MgCl2, 8 mM

NH.C1, 0,1 mM GTP, 1,5 pmol комплекса

f[^5S]Met-tRNAfmet-AUG-80S рибосома,

50 jiM стоп-кодона или 0,1 A^gp ед. '

po!y(A,G,U) и указанные количества белка. RF-активность белка

измеряли по количеству освобождающегося f 1 S]Met в присутствии стоп-кодона. Освобождающийся f["^S]Met (0.06-0.08'pmol ) в отсутствие4 стоп-кодона вычитали из всех величин.

Однако оставалось непонятным, почему в работе Lee et al. (1990) в структуре так называемого eRF, а в действительности WRS кролика, не присутствует характерный для аминоацил-тРНК-синтетаз класса I мотив-HI/VGH,' обнаруженный в WRS ■ быка' и- человека. Мы предположили (Frolova et al. 1991), что это является следствием ошибок при секвенировании клона кДНК, что подтвердилось экспериментально. После устранения этих ошибок структура всех WRS млекопитающих имеет высокую степень гомологии (рис. 12), включая мотив HI/VGH.

Оставалось неясным, почему экспрессированный в Я. coli белок, кодируемый этой кДНК, в опытах Lee et ai. (1990) обладал активностью eRF. Повторение этих опытов с одновременным измерением активности, как WSS, так и eRF показало, что активность eRF в белке отсутствует, тогда как активность WRS легко обнаруживается.

Суммируя эти данные, можно сказать, что неверное определение структуры eRF связано с тремя ошибками: использованием моноАТ к другому антигену, ошибками в секвенировании клона кДНК и неверньм определением активности экспрессированного в Е. coli белка.

После того, - как результаты нашей работы были опубликованы (Frolova et al. 1993), лаборатория, где была сделана предыдущая работа (Lee,et al. 1990), признала ошибочность своих результатов и согласилась с нашим выводом о том, что была клонирована кДНК,

XPNSEPASLEELFKSI ATQGfeLYRSLKACNASKDEI DSAVKKLVS 13 HAD ><SHCtOCC;>P""H""A--."-aD"-R" 50

•««YTKCER C«3P0»"S"*»A«-»»K-""RK"P»E""""""I.» 49

hWRS bVRS eKF

LW3YKAAACEDYKADCPPCKPArTSKKCPDATEAEEDFYBPWTYaTSSA 95 hWSS

>«7*aM*T*K*nVn***DB"E*CE*L""'B"Da*"**aBB*"I,aa 100 bWKS

•aT-.-E«*"»—■••-••ST-D*HCD"E"[)QK"-«-—»R"" 99 eRF

KCIDYDKLT YRFGSSU DKELJ HRIERATCQRPHKFLRRGIFFSHT.DHHQ 145 hWRS

твм«тваша«п«а«Уа«*аан«аса«Цма«*а'»ааа'а||в J50 bWRS

..........QQ.........V............ft..............a J 49 pRf

VLPAYEWKKPFYLYTCRCPS5EAKHVCHLIPFIFTK\fl.0DVENTPLYI0K 195 hWRS

J....................................».....■.....* 200 bVRS

.................-UKQCN-................D....v.. 199 eRF

TDDEKYIVKDLTLDOAYGDAVEHAKDIIACCFD1HKTFIFSDLDYMCKSS 245 . hWKS

аваааааааааааааануааааааяу aaaaaaaaaaaaaaaaaaaafa 249 ЬVR3

S»a*»M*»M*E*Y**YTL*"*Q**KP****Y*B**»B*a'******P* 249 cRF

CFYKHWKIQKHYTFHQYKCIFCFTDSDCICKISFPAIQAAPSFSHSFPQ 295 hWRS

.......----....................................... 299 bWRS

.................................................. 299 eRF

IFBDRTDIQCLIPCAIDOOPYFEKTRD YAPHICYPKPALLHSTFFPALOC 345 hVffiS M*M««V*s*«MMK*SM*«**M*«*M*M«««n«M*Ma*c>*35j)' bVRS ...................................... Í49 eRF

AOTKtBASDPHSoIfLTDTAKQIKTKVHKHAFSCCRDTIEEHRQFCGHCP 395 WRS

•aaraatatiaaanaaaaaaaEaaaafaaaaaaaaaaVaaaaaMaa«« 399 ЬиЕЗ

D""«........................................... 399 eRf

TDVSFKYLTFFLEDDDKLEQIRKDYTSGAMLTCELKKALIEVLOPLIAEH 445 hVRS

• tfM*»*a*«MM*««**M{t«B*fWam»«ua*£MB««a«*«M* 449 bWBS

449 eRF

QARSKEVTDE1VKEEKTPRKLSFDFO-COOH 4T1 hVSS

......................y...-СООН 475 bWRS

.~....—.«H.«.....Q.CFHY-COOH " 475 cRF

Рис. 7. Сравнение аминокислотных последовательностей WRS человека (h, наши данные), быка (Ь, Garret et al., 1991) и 'eRF' кролика (Lee et al., 1990), выведенных из структур соответствующих клонов кДНК. Звездочками указаны аминокислотные остатки, идентичные с WRS человека. Предполагаемые ATP- (HI/VGH) и тРНК- (KMSAS) связывающие участки в WRS человека подчеркнуты.

IM uo Fraction number

Phosphocellulose

Рис. 8. Разделение активностей DEAE-cellulose

WRS и RF кролика при д хроматографии на колонках с ДЭАЭ- и фосфо-целлюлозой.

A. SlOO-супернатант лизатов ретикулоцитов фракционировали (NH4)2S04 (30-70%), диализовали против буфера С (0,02 M Trïs-HCl pH 7,8, 1 шМ дтт, 0,1 mM эдта) и наносили (4800 Ajgg ед.) на колонку с дьаэ -целлюлозой (3 х 35 см); колонку отмывали буфером С с 0,1 M KCl, белки элюировали линейным градиентом KCl (0,1-0,4 M, общий объем 2 л). Фра'кции 110-150, содержащие активность WRS и eRF, объединяли и осаждали 60% (NH4)2S04- Осадок растворяли в буфере С и диализовали против того же буфера; эта фракция обозначена FI.

B. FI (18 А280 ед.) наносили на ; | колонку с фосфоцеллюлозой (1,2 х 8 см), колонку отмывали буфером С (фракции 1-30), белки элюировали линейным градиентом KCl (0-0,4 M), содержащим буфер С (объем градиента 30 мл; фракции 31-130). Фракции 88-93, содержащие относительно высокий уровень WRS- и RF-активностей, объединяли и обозначили как FI I. Вертикальные стрелки указывают начало градиента KCl. Активность ws S измеряли в реакции триптофанилирования тРНК, RF-активность определяли в системе /л vitra в присутствии poly(A,G,U), а иммунореактивность (ELISA) с использованием "анти-RF" моноАТ.

50 100

Fraction mrmeer

Рис. 9. Хроматографическое разделение активностей RF и WRS кролика.

A. Q-Sepharose (Fast Flow). SlOO-супернатант лизата ретикулоцитов

фракционировали (NH4JjSO^ (30- 70%), а и ализовали против буфера С и наносили

(3000 Ajgg ед) на колонку с тт

O-Sepharose (2 х 11 си). Колонку отмывали буфером С с 50 шМ КС1, белки элюировали линейным градиентом КС1 (0,05-0,6 М). Фракции 60-75, содержащие RF-активность, объединяли, диализовали

против буфера С с 50 тМ КС1. В. Моно 0. 5 ¿280 ед" белка после колонки Q-Sepharose, содержащих RF-активность, наносили на колонку с Моно Q HR 5/5; колонку отмывали "буфером С, 'белки элюировали 20 мл линейного градиента КС1 (0,05-0,6 М) в буфере С. Во фракциях градиента определяли 1RS- (в реакции триптофанилирования тРНК ) и RF- (в системе in vitro) активности. Фракции 50-62 (WRS-активность) и 72-82 (RF-активность) объединяли и испытывали , их

иммунореактивность с

"анти—eRF" моноАТ (рис. 10).

Ю(М) 0.6

40 БО Fraction number

- 1000

h SOO

40 60 80 Fraction number

1 2 3 4 5 6 7 8

116kDa 96kDa 76kDa 53kDa

Рис. 10. Анализ белковых фракций, содержащих активности eRF и WRS, методом иммуноблота с помощью "анти-eRF" моноАТ.

Белковые фракции после колонок (Q-Sepharose и Mono Q, рис. SA и В), содержащие WRS-й RF-активности, разделяли электрофорезом в SDS-ПААГ, переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Immobilon- Р) и проявляли антителами с помощью ECL.

1 - высокоочищенная WRS быка; 2 и 3 - объединенные фракции 50-62, содержащие WRS-активность, после двух хроматографий на колонках с Mono 0; 4 и 5 - объединенные фракции 78-82, содержащие RF-активность, после двух хроматографий на колонках с Mono Q; 6-8 -белковые фракции (60-75), содержащие как WRS-, так и RF-активности после трех разделений на колонках с Q-Sepharose. Нижняя полоса, соответствующая —40 kDa, в препарате WRS быка (дорожка 1) связана с ограниченным протеолизом этого белка.

специфичная для кролика (ИшсЬепко 4 СаБкеу, 1994). Таким

образом, стало ясно, что работу по установлению структуры еНР следует начинать заново.

MPNSE ASIJ^XTHSIATOGELVRSLKAGNASKDEIDSAVK-II-VS 45 hWRS

MaDbSSNGEQGCG*P***«H***A******D***R*«A***********L* SO bWRS

KADVTNGEK C**PQ***S*********X****RK*P*E*********L* 49 rWRS

MaDMPSGK SCT*P**********************P***********L* 49 шНВ5

IJO«rKAiAEEDin^CTPCKPAl^SiraCn,nATEASEDrVDPKTVOTSS.\ 55 hWKS

**T*****T*****V*****Q***2*5£*2,*****D************** 100 bW3S

**X***E*M************ST*D*BGD*B*VDDK*********R**** 99 zWRS

********H**E***G******XAGR*CDS***K*S*********R**** 99 s&RS

KGXDYDKXIVRrGSSKXDKET.TireiERATGQRPHHrLRRGirgSffllPKHa 145 hHRS *********************у************ц*************н* 15Q tiTiRS ***********Q*********V************K*********ft***** 149 rHRS

**********qP**********************R*************** ~149 aWKS

A**********************! X**********************.

VIMXElKKPr^iTGRGPSSEMpra^PriraimfiDVrNVPLVlQM 195 hWRS

»«»«******..********** 200 bRRS **************£****V** 199 rWRS ********!*****&***** 199 sMRS

* *y**

SY ,

TDDEKyLWKDLTU^VYGQAVI^tAKDILACGFDZUKTFIFSDLI}^MG2-lSS 245 hKRS **********#******G¥******** т*4*******************? 249 biiKo 5************£*V*£ctL******MP****V***************P 249 rWRS 5************E***SYT***********************E***Q*P 249 mWRS

GrmfTVraQKHVTFHQVKGirGFTDSDCIGKlSFPAIQAAPSrSNSrPQ 295 hWRS *.******...*•*****»*******«*..,.***.*.*.*..*»*••**» 299 bWRS ************************************************** 299 rW7iS

***R****************************S****V***********K 299 BURS

IFimRTDlOCIJPCjaDODPYrRMrEIJVMiaCYPKPALLHSTITPALQa 345 hHRS *******V****************************************** 349 UHRS

**HGQft.*****«*************************************D 349 xWKS ****««**.*.*.****.***************a******..<****»** 349 „низ

**i **i

AQTpMSAi DPNSSirLTDTAKQIKTKVNKHArSGGKDTIEEKRQFGGNCD 395 hWRS ******************************V*********** 399 fcHRS r***4399 xUKS ****************s*************v**********E 399 mHKS

VITVSrMlrLTiTI^DDKLEQIKKD'iTSGSMLTGELKKALXEVbQPLIAF.H 445 hWRS A*********************^**************^*****««^**** 449 bWRS *************************£*********£*£**р*****у*** 449 tfHtS .*«*«*.***»*.*»«R*****.»»**«»«»****.*X*«D..***.*.« 449 rtjRs"

QARRKEVTDEIVKEFMTPRXLSFDFQ **********H********Q*C*HY*

471 hHKS 475 ЬНВ5 475 rWRS 481 IOWRS

последовательностей

V/RS

Рис. 11. Сравнение аминокислотных млекопитающих.,

bWRS (Garret et a/., 1991) - бык, hWRS (Frolova et a I., 1991) -человек, mWRS (B.Pajot et ~al., accession number X69657) - мышь, rWRS (Lee et al., 1990 и наши данные) - кролик. Две соседние аминокислоты в WRS человека (Ser213 и Туг214), указанные над аминокислотной последовательностью, отражают различия в двух клонах WRS кДНК человека. В рамке - АТР- и тРНК-связываюпше участки

2. " Эукариотический фактор теоминации трансляции 1.. (eRFl идентификация. структура & свойства.

Как следует из данных предыдущего раздела, исходной причиной неверного определения структуры eRF в работе Lee et al. (1990) было выделение недостаточно очищенного препарата eRF. Поэтому была поставлена задача получить гомогенный препарат eRF кролика. В результате использования ряда хроматографических процедур (рис. 12) удалось получить препарат eRF, гомогенный при электрофорезе в SDS-ПААГ (рис. 13). Этот препарат был подвергнут трипсинолизу, полученные пептиды разделены с помощью HPLC, и четыре из них секвенированы с N-конца методом микросиквенса. Структура этих пептидов, показанная на рис. 14, сопоставлена с данными, имевшимися к тому времени (1993 г.) в банке данных аминокислотных и нуклеотидных последовательностей (SwissProt, PIR, MIPSX и EMBL). Оказалось, что существует несколько белков, в структуре которых в разных участках встречаются пептиды, идентичные или очень близкие по структуре пептидам, присутствующим в eRF кролика (рис. 14).

Пептиды а и b полностью или"частично совпадают с фрагментом белка ТВЗ-1/С11 человека и белка Gil X. Iaevis, дрожжевого белка Sup45 и 5ир45-подобного белка A. thaliana. Пептид с сходен с фрагментом белка ТВЗ-1/С11 человека и белком СИ X. Iaevis, но значительно отличается от дрожжевого Sup45 и 5ир45-подобного белка A. th'aliала." Пептид d сходен только с фрагментом белков ТВЗ-1/С11 человека и Cll X. Iaevis. Пептиды a, b и с плюс d eRF кролика распределены у белков этого семейства вдоль всей полипептидной цепи, а не на ограниченном участке. Поскольку большинство этих белков не было ранее выделено и очищено, а их аминокислотные последовательности установлены на основании нуклеотидных последовательностей соответствующих кДНХ, их функция оставалась неизвестной. Исключение составил белок Sup45 (Supl) дрожжей, продукт гена SÜP45 (SUP1), описанный достаточно давно (Инге-Вечтомов и Адрианова, 1970) как омнипотентный супрессор, и высказано предположение, что белок Sup45, кодируемый этим геном, участвует в трансляции. Многолетние генетические исследования дрожжевого белка Sup45 (см. обзор Surguchov, 1988) не привели к однозначному установлению его функции, хотя среди высказывавшихся предположений были и такие, которые связывали его функцию с терминацией трансляции.

Из данных, приведенных на рис. 14, следует, что все эти белки относятся к семейству eRF. Для прямого доказательства этого

Рис. 12. Последняя стадия очистки eRF кролика -хроматография на колонке с Moco Q.

Белковую фракцию (2 Ajgg ед.), предварительно очищенную из лизатов ретикулоцитов осаждением (NH^^SO^, на колонках Q-Sepharose и Bio-Rex и содержащую RF-активность, наносили на колонку с Mono Q HR5/5. Колонку, урвновешанную буфером С с 0,15 М KCL, отмывали тем же буфером, и белки элюировали 20 мл линейного градиента KCl (0,15-0,75 М) в том же буфере. Во фракциях градиента определяли RF-активность в тесте i о vitro в присутствии poly(A,G,U).

KCl (М) л2,0

а 2000 ■

И 1000

i -0.1—p

[ / / 0.6

Ул 0.«

0.1

.......... T----

fraction number'

' FRACTION NUMBER 43 42 41 40 38 37 36 35

Рис. 13. Анализ в SDS-12.546 ПААГ белковых ' фракций после Mono Q колонки (рис. 12), содержащих RF-активность. Окраска Кумасси голубым. М -белковые маркеры. Стрелка указывает положение eRF.

TrpRs M(kDa)

KADDPSAAD!0rV2tWKrKXlIKSLEA«iC!lGTSMISI.IIPPKDCISBV3U£ 50 ВоХВЗ/Cll

..........................................................50 X1C11

•DNE---VEK*I****V***VQ***K***********V****GI.*FLYQ* 47 YSOP45

*«*aE*—*E*I*********'G**T************M**R**VA**T* 48 ArabSOP45

(a) LSVLGAITSVQQR rab.eBF

MLADEEGTASNIXSRVNRLSYLGAITSVQQRI^IjYNXVPPHGLYVYCGTI 100 EaTB3/Cll

• >...>....»..,.....,•.,.,».,„„,„...,„„„«.. 100 X1C11 **T**Y****************S****T**K*****TI,*K****I.***D* 97 YSTJP45 ..*.*Y***»**.»*.».q***3.*>*a****..,*..*.***,l*t*** 9g AxabSOP45

VTEEGKEXXVNIDFEPFKPINTSLYLCDNKFHTEALTALLSDDSKFGFIV 150 НиТВЗ/Cll ************************************************** X50 XlCll I**D******yi-*I**Y*****************v*SE**QA*D****** 147 Y50P45 **DD******T**********A*****.*******P*NE**ES*D****** 148 ArabSOP45

(b] riVDLP r«b.«RF IDGSGAI,FGTL^GNTREVIJiKFTVDLPKKHGRGGQSAIJlFARIJiHEKRHN 200 BUTB3/C11 ......................................................200 xlcli

M*"Q*T***SVS****T***************************£***** 197 YSOP45 M**N*T** ***S***************** ** «••»**»***•***"**** 198 Ar*bSOP45

rraZVAETWaLFlS--SBKTHVAGLVIAGSAOrKTElSiSDMrDQRMS. 248 ВиТВЗ/Cll *************** — ********************************* 248 XlCll *******V***H**T—N*****K**I***»*****D*AS*EI.**P**AC 245 YSCTP45

j ..*»T..L*T.j-i.spATSCP*»s.«I*.....*»*....,El*.p...x 248 AxabSUPiS

KVLKLVniS*GGENGFHQAIEI.STEVLSHVHElQEKKLXGS«rDEIS5DT 298 ВиТВЗ/Cll .................................................. 298 XlCll

**ISI*WV*****<****.*****A*A*A***YV*****LEA********* 2S5 Y5TJP4S *!T*tIV**V***************A*l**************K**E****** 298 ArabSUP45

I (c)YVLSCQGTEEE ILYITP rab.eRF

{ GKrcrcVEDrLKALEMGAVEILIVYEHLDIKRrVI-HCQGTEEEKILTLTP 348 НцТВЗ/Cll

' .*♦.**.•»••.*.*«...«..*.»...*T.....R.N»S.*..T..**» 34Q XlCll

**F*Y*ID******DL****K***F***ETI**TFKDAEDN*—V*KFAE* 344 YSUP45 ***V****************T***W****IH**E*KNWT*G*IV*mi*G2C 348 Ara±)SOP45

EQEK(d) . rab.eRF

EQEXDKSBFTDKETGQEHELIESMPLLEHFANNYKKFGATLEIVTDKSQE 398 ВиТВЗ/СИ .........j......................s................. 393 XlCll

*A-****FAI**A****KDWSEE**I**t,*A**«H******FI****S* 393 YSOP45 D**NNQ*N*H*A**NA*L*VQ*K******»**E**R**C***F**N**** 398 ArabSOP45

GSQFVKGFGGIGGILRIRVDFQGMEYQGGDDEFFDLDDY - 437 HuT33/Cll

................. ... ...*D...V.,* ....... 437 XlCll

*A***T******AM***K*N*EQLVD£SE*—*YY*E*EGSDYDFI 437 YSTJP45

****CR*******L***QL*MRTFD-ELS*G*VYE---DSD 435 ArabSUP45

Рис. 14. Сравнение предсказанных аминокислотных последовательностей белков С] 1 человека (HuCll) (Tassan et al., 1993), ТВЗ-1 человека (НиТВЗ—1) (Grenett et al., 1992) (после ресеквенирования нами клона ТВЗ-1 кДНК человека, любезно предоставленного flp.G.Fuller), СП X. laevis (Tassan et al., 1993), Sup45 (Supl) дрожжей (Breining et al., 1986) и Sup45- подобного белка A. thai¡ana (ArabSUP45;GenBank, acc. number X69375). Звездочки указывают аминокислотные остатки, идентичные с белком ТВЗ-1/С11 человека. Указана структура четырех пептидов кроличьего белка с мол. массой 50 KDa, обладающего RF-активностыо (rab. . eRF).. Полоса анализируемого белка, подвергшегося микросеквенированию, вырезана из геля.

M (kDa) a

M (kDa)

170 —

.46

-200

-97 Л -69

-30

1 2 3 4 5

Рис. 15. SDS-10% ПААГ' и иммуноблот-анализ белка Cil X. iaevis (экспрессированного в E.coli) и белка ТВЗ-1 человека

(экспрессированного в дрожжах).

а. Окраска Куыасси голубым, b. We s î е rn-иммуноблот, проявленный анти-СП антителами с использованием ECL (Ame г sham). M - белковые маркеры; 1 - лизат Е. coli с экспрессированкым белком СИ; 2 - очищенный белок Cil (BSA добавлен для стабилизации С11; верхняя полоса); 3 - неиндуцированный дрожжевой клеточный лизат, содержащий рекомбинактную плазмиду рТВЗ-lLl; 4 - то же, что 3, но после индукции; 5 - очищенный белок ТВЗ-1.

кДНК СИ X. i'aevis (Tassan et al., 3993) вставлена по участку Psfl плазмиды pQE30, 0IAGEN (рОЕЗО-СП). Е. coli, штамм М15, трансформировали плазмидой " рОЕЗО-СП - и индуцировали ' IPTC для экспрессии His-tagged Cil белка. После элюции с NiNTA колонки сорбировавшегося С11 белка, содержащего гистидиновый хвост (His-tag), 0,25 M имидазолом, к раствору белка добавляли ДТТ и BSA до конечной концентрации 2 шМ и 0.2 мг/мл соответственно. Белок С11 диализовали против буфера, содержащего 50 шМ Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 M KCl и 2 шМ ДТТ, и концентрировали на Centricon-10 (Amicon). EcoRl-EcoRl 2.3 т.п.н. фрагмент кДНК ТВЗ-1 (Grenett et al., 1993) реклонировали в плазмиде pTZ19, после чего EcoRl-Sall (1,7 т.п.н.) фрагмент кДНК ТВЗ-1 встраивали в вектор pJDB219 (Beggs, 1978), содержащий ген LEU2 и ori 2р ДНК дрожжей. В этом TB3-1L1 конструкте кДНК ТВЗ-1 транскрибировалась под промотором и терминатором гена дрожжевой кислой фосфатазы, PHOS. S. cerevi siae, штамм AH22 (MATa' 1еи2-3, 112 his3, canl-II), трансформировали рТВЗ-lLl. Белок ТВЗ-1, экспрессированный в дрожжах, очищали с помощью колоночных хроматографии, описанных для очистки eRF кролика, но не использовали колонку Mono Q..

Таблица 3. eRF-активность очищенных белков С11 X.laevis (экспрессированного в-Е. coli) и ТВЗ-1 человека (экспрессированного в дрожжах).

Белки Терминирующий или Антитела fl SjMet ^

смысловой кодоны (Pmol )

His-tagged СП UAAA - 0, .38

' VGAА - 0. .39

UAGA ' - 0. .35

poly(A,G,Ü) r 0. .28

UGGA - 0 •

UAAA анти-С11 0

UAAA aHTH-Eg5 0. .35

Hi s-tagged

протимозин человека UAAA - 0

His-tagged обратная

транскриптаза HIV UAAA - 0

ТВЗ-1 UAAA - 0. ,20

UGAA 0. .23

UAGA - 0. ,17

UGGA - "o

предположения был предпринят ряд опытов.

Гены человека и X. laevis, кодирующие белки ТВЗ-lt и С11, принадлежащие к этому семейству, экспрессированы в дрожжах и iE. coli соответственно. - Белки очищены с использованием колоночных хроматографии (ТВЗ-1) или афинной колонки (СП). После очистки белок' С11 давал одну полосу при электрофорезе в SDS-ПААГ (рис. 15а), и оба белка связывались с поликлональными антителами против экспрессированного в Е. coli белка С11 (рис. 15Ъ). Белки С11 и ТВЗ-1, испытанные в тесте in vitro, обладали RF-активностью (Табл. 3), которая зависит от присутствия одного из терминирующих кодонов -UAA, UAG или UGA (в опытах , использованы эти кодоны в форме тетраплетов с добавлением А на З'-конце, т.к. ранее показано, что-в системе in vitro активны только тетраплеты, вероятно, вследствие увеличения сродства тетраплета по сравнению с триплетом в отношении рибосом). При замене терминирующих кодонов на смысловой кодон UGG

для Тгр, близкий по структуре к стоп-кодонам, НБ-активности не наблюдали. Анти-С11 антитела ингибировали ВГ-активность (Табл. 3). В качестве дополнительного контроля использовали белки, не принадлежавшие к этому семейству (обратную транскриптазу и протимозин), содержащие, подобно белку СП, так называемый 'гистидиновый хвост' (His-tagged), введенный в конструкцию' для удобства при последующей очистке белка на афинной ЖИТА-колонке. Эти белки, как и следовало ожидать, полностью лишены ЕК-активности (Табл. 3). ■ ~. , " ' '

Из данных Табл. 3 однозначно следует, что по крайней мере два белка этого семейства представляют собой еЯР. Мы предполагаем, что и дрожжевой Зир45р, и белок из А. «ЬаЬ'ала также являются еЯР. Наши результаты подтвердили данные о том, что у эукариот один белок обладает ЕР-активностью в присутствии любого из трех стоп-кодонов (ВеашШ & Саякеу, 1971), тогда как у прокариот ту же функцию выполняют два фактора - ЯП, узнающий стоп-кодоны иАв и 11АА, и ЯР2 -ША и 1)АА (см. обзор Cгaigen е1 а 1., 1990). Мы предложили обозначить этот фактор термикации трансляции высших эукариот. как еКР1.

Сравнение еЕП с ЙР1 и бактерий не выявляет сколь-нибудь

значимой структурной гомологии на уровне первичной структуры. Это несколько неожиданное наблюдение можно объяснить двояким образом: 1) ИР прокариот и эукариот возникли из разных предковых молекул, поэтому, несмотря на функциональное " сходство, они не имеют " структурной гомологии; 2) отсутствие-, сходства- -на . уровне, аминокислотной последовательности еще не означает, что его нет вообще. Известно, что некоторые белки имеют сходную вторичную и/или третичную структуры, хотя их первичная структура сильно различается. В этом случае необходимо искать сходства высших структур белков ИТ 1/2-и eB.Fl.

Следует упомянуть, что у семейства белков ейР есть определенная гомология с другими эукариотическимк белками, связанными с рибосомами (Кооп1п е£ а!., 1994). Как и следовало ожидать, гомологии с таБ не выявляется.

Обращает на себя внимание два обстоятельства. По мере очистки е!1Р1 из ретикулоцитов кролика его удельная активность возрастает на первых стадиях очистки, а на последней стадии резке падает, что может указывать на удаление некоего кофактора неизвестной природы. Мы обратили также внимание на то, что в структуре еЕР1 отсутствует ОТР-связываюдий домен, хотя известно, что терминация трансляции у эукариот нуждается в ОТР (Веаис1е1 & Саькеу, 1971). Оба эти факта

указывают на то, что помимо eRFl в клетках эукариот может присутствовать еще один до сих пор не идентифицированный фактор, участвующий в терминации трансляции. Косвенно на это может указывать и существование у бактерий помимо RF1/2 еще и RF3, стимулирующего связывание RF1/2 с рибосомами и содержащего GTP-связывающий домен (Grentzmann et. aJ. 1994; Mukini et a 1. 1994). Аналога RF3 у эукариот до сих пор описано не было.

Все эти обстоятельства, вместе взятые, побудили нас заняться поисками другого eRF, отличного от eRFl.

3. Идентификация нобого Фактора терминации трансляции х высших эукариот (eRF3'К его структура и свойства.

При поиске неизвестного фактора терминации трансляции у эукариот, аналогичного RF3 прокариот, можно исходить из разных стратегий. Мы решили воспользоваться уже имевшейся в литературе информацией о свойствах, некоторых дрожжевых белков. Как показано в предыдущем разделе^ дрожжевой Sup45p относится к семейству eRFl и поэтому скорее всего обладает RF-активностью. Известно,' что другой дрожжевой vбелок, Sup35p, взаимодействует с Sup45p, содержит GTP-связывающий домен и, вероятно, участвует в трансляции (см. Surguchov, 1988). Эти свойства Sup35p делают его возможным кандидатом на роль неизвестного eRF, аналогичного RF3 у прокариот.

С помощью клонированных проб - фрагмента GST1 кДНК, кодирующей гомолог Sup35p человека (Hoshino et а1., 1989), и геномного клона дрожжевого SUP35 (Kushnirov et al., 1988) - из „клонотеки кДНК X. laevis в XgtlO отобраны гибридизующиеся с этими пробами клоны. Получены физические карты этих клонов; клон, содержалщй наиболее длинную вставку, секвенирован. Как видно из рис. 16, сравнение аминокислотных последовательностей С-доменов анализируемого белка Sup35 X. laevis, дрожжевых белков Sup35 и белка GST1 человека выявляет высокую степень гомологии, что свидетельствует о высоком консерватизме С-концевой области этих белков у эукариот. Что касается N-домена, то здесь структурной информации _^пока недостаточно, чтобы сделать определенные выводы.

Следующий этап работы состоял в получении конструкции, содержащей С-домен - Sup35p X.laevis (Sup35Cp), и экспрессии. этого белка в Е. coli. Соответствующий белок был очищен с использованием афинной колонки (рис. 17) и испытан в тесте на RF-активность в системе in vitro (Табл. 4). Оказалось, что Sup35Cp не обладает RF-активностью в присутствии любого из трех терминирующих кодонов.

к»езт

Х130Р35 3с3и?35

кзсзт Х130РЗЗ ЗСЗЧРЗЗ РрЗОТЭЗ

КЮ3771 Х15ОТЗ» ЗсЗОГЭЭ ¡рЗМЗЗ

ндсзт *

Х13иРЭ5 ЗсЗШЭ5

Н£ЬЗЕР1~УГКСГГЕМЛ?ЕЫК1НКХЕ1ЭЕЛЕР~ СООЗЬСОСЯРР 43 КПУЗВРУ--УСКССТСКЗРСезК1ЖКГЕР:ЕАаР—<МСЗ£С0ССТТ 43

114 гГГКУЕЕткГЕ--КРУ-ОТЕ----ЕКПЕКЗ—КЪР)Л1Х0-иС13СЗТКХТ!.'КА,Ч 231

230 АДОКУС ЕМ КУЕАУТАЛХРУЗ ЕЗ БГРМТ Р КХ ЕАХАЗ КЕУЛЛАЛЛЛЪК- КПУЭ ОЛККЬЗ N 289

С1

ЕгзАНстееБехткз^АРкмюсирогтпсктомзкАТХосогтътсиУйк юз

нстэиовдтхысркггтрдопсвкттскто^^ юз

~УТЗЛОЛ1:КМЕЬгУБОЕУУКШГСОКШ>УЗЬ1ГХС№/^ 299

~УТКАОМ,УК1»«д10МП«0КГеС1аЖ1ШГП^ 347

С2

сз

ктхлктхкамаитастктмУМлтмбЕЛмсоктус^ 1«з

ктаюгвмлюАС1ц*япгт1кот^с»^^ 407

С4

лгпккгоаАяолоиумзнижгктсктжык/иалкгАауюсьмыкрно 22з

£У13ВНТССЛ30А1)Ует1Д/11$11|С0ЕТ[ЕЛСГЕ11ДО03ВДНЛ11ЛКТ0ет>1К.'ЛУ1НЮШ 467

шозт сгтпакг>пЕскг1аугги<1»сп1Р1Чш:нтрс9С1,тсмы(г<иог--сс1П1с г«1

хиипз 8т>жа|(0*кЮ1«1аугг1тегег»р|01В1ттге55Ики(1|ЕГУ5Т"Сигт10 т

зсзирзз оттганзкихоосУаткгшаатмхкгиуутрУзатзсмаюкуОРКЕСР^ггтс 4«9

РРЗОР35 DГrv^«SKrйYtECTTKUU«LK=VCT0-KTOVLn17VЗGrrCW:L}írRVЗQKQAPVr?^G 53«

Кзсзрп ьрг1рт!лыьритмуоср1^1,р1уо|сткпистууиз|а11аз1сксо01,укнри>эшу 341

Х1зирз5 1лг::Ш151>11Плиш;т1Р1Усктк1ж<лпихизз91схегоиннр|1к»1У зп

ЗСЗОРЗ5 ртигшштутЕштрмлхкипсттспглшгясбсзп^рнкглг ¡23

ррзот35 гзш!изкриу|1к1ь'0рпя.>13зпш01лтп1в1аиа<тсдниухр»к1с^ 516

НЗСЗРП " ети;11Л1>-рУЕ11ггУАРСОП.К1ВЬ|Ш11И«ирсП1СВРЮш:нзоа1ГГ»В1У1: <оо

хивиз газизо-птЕИмои11К-вчо1К1ЫЧвяи:п»н1аснзоигша1У11 чао

РрЯОТЗЗ CYTTtr1lCГCЛ£ACSЖGCavRMtяat*SBOUЛerYLSSГ!atPVKГVTRrCAalAZV «4«

1иозрт1 пив11с»оталУ1К11пс1еет»ПА11сыг111ск«:111в1п«И1г»к:овтс1л«л1А 4С0

Х130Р35 *НИ11СРСТНЛУ1Л1ЯТС1ЕЕУг1ТА11СК7СККЗСК|аКГРГйГУК000УС1АД1ГТА 419

гсзирзь («9

ррэорзз сшз1113теп<7П<тотметпоЕшаают11мз1ашрлгАккшс1>хпетт )м

Нзсзт стхситпФГРОксаггиОЕс^Елгскуиаурею

х1зирзз бпсьгтгюгговдмтшдакплшкуисириа

Эсзирз» АРУСУСТ*а0ТРО1ЛИТ1Д00СТТХА1СК1УК1А-С

ррзирз& срусхитооурЬьсигтышасоилгсетгки.

499 499 463 741

Рис. 16. Сравнение предсказанных аминокислотных последовательностей Бир35Ср X. /аеу/у (Х1£ир35), сегеу/я/ае (5с5цр35) (КиБИтгоу ег а!., 1988), Р1сЫа р/лиг (РрБпрЗб) (Ки51пигоу ег аI., 199С) и белка ОБИ человека ({^рИ) (Но51ипо е! аI., 1989). Консервативные мотивы (»-доменов (61-04) (Воигпе ег и1., 1991) подчеркнуты. Идентичные аминокислоты обозначены звездочками, заменимые аминокислоты - точками.

xisupascp

Рис. 17. Анализ в 503- 8% ПААГ очищенного His-tagged белка $ир35С (5ир35Ср) X. 1аеу1 5. М - белковые маркеры.; 1 -.5ир35Ср после окраски Кумасси голубым; 2 - 5ир35Ср, идентифицированный с помощью ^ ] 2 иммуноблота.

Western-блoт анализ проводили с помощью афинноочищенных поликлональных анти-5ир35Ср антител и для проявления использовали ЕСХ-кит (АшегвИаш).

20511697.4" 6645-

205-

П6 -97.4-

"66 -

45-

ХШирЗБр

XI5up35Cp (Н1ИСЗД

Рис.18. Анализ комплекса, образующегося между белками СП и Sup35Cp X. 1 aevi s, с помощью SDS-8% ПААГ и последующего Western-олота. М - белковые маркеры; 1 -очищенный белок Sup35Cp с Hi s-xboctom; 2 - белок CTl с His-хвостом,

инкубированный с буфером и пропущенный через NiNTA колонку; элюированная

фракция (контроль); 3 - то же, что 2, но после инкубации С11 белка ^ с экстрактом яиц Xenopus.

Экспрессированный в Е. coli и очищенный на колонке NiNTA „белок С11 с His-хвостом инкубировали с экстрактом X. laevis в присутствии 1пМ GTP или в тех же условия в присутствии буфера (50 пМ Tris-HCl, pH 7.5,'50 шМ KCl, 2 шМ ДТТ). Оба образца наносли на NiNTA колонку (Q1AGEN). Колонку промывали (20 шМ имидазол) и белок С11 элюировали с колонки (0.25 М имидазол) и концентрировали на Centricon 10. Элюированные с колонки белки после SDS-ПААГ переносили на нитроцеллюлозу и проявляли антителами против Sup35Cp X. laevis с помощью ECL. 43

М-

Таблица 4. Влияние белка Sup35C на RF-активность белка СИ (eRFl) в системе in vitro .

А.___

Белки Sup35Cp fl^S]Met, pmol

X. laevis (tig)__;__

Терминирующий кодон ( дМ) U AAA UAGA UGAA

> „ 50 5 50 5 50 5

СИ _ 0,44 0,01 -0,71 0, ,02 0,48 0, .01.

С11 + Sup35Cp 0.1 0,38 0, ,50 0, ,37

С11 + Sup35Cp 0.2 0,51 0, ,85 0, ,51

СИ + Sup35Cp 0.3 0,56 0, ,88 0, ,63

В.,

Белки ,UAAA (дМ) AHTH-Sup35Cp fl35S]Met, pmol

X. I aevis антитела (д!)

Cli 50 - — 0,40

Cll 50 2 0,37

Cll 50 4 4 0,34

Cll 50 6 0,40

Cll + Sup35Cp 5 - n << -,

С1Г+ Sup35Cp 5 2 ' 0,68" •

Cll + Sup35Cp 5 4 0,22

Cll + Sup35Cp - 5 6 0,10

Однако при низкой концентрации стоп-кодона (1/10 от -насыщающего уровня), когда активность eRFl самого по себе практически равна нулю, добавление Sup35Cp к eRFl (С11) резко стимулирует активность последнего. Реакция стимуляции целиком зависит от присутствия GTP, при этом GTP не влияет на активность одного eRFl (Табл. 5). В присутствии негидрслизуеыого аналога GTP, GTPrS, стимуляции активности eRFl под действием белка Sup35C не наблюдается (Табл. 5), что указывает на необходимость GTP для протекания реакции терминации. Таким образом, необходимость GTP для терминации трансляции у эукариот связана с участием в реакции белка Sup35C, содержащего GTP-связывающий домен (рис. 16), а не eRFl как предполагали ранее.

Таблица 5. Влияние GTP и GTPrS на RF активность белка С11 (eRFl) в системе in vitro и RF-стимулирующая активность белка Sup35C.

1С

Белки ' Гуаниновый f[ S]Met, pmol

X. laevis .нуклеотид-

(0,1 mM) UÁÁA Терминирующий UGAA кодон UAGA

СИ / 1,00 0,87 0,90

CI1 GTP 0,86 1,01 0,75

СИ GTPrS 0,82 ' 0,93 0,72

С11 + Sup35Cp 0,02 0,05 . 0,01

С11 + Sup35Cp GTP 0,97 0,93 0,88

СП + Sup35Cp GTPrS 0,05 0,06 0.03

Известно, что С-домен дрожжевого белка Sup35 обладает /л vivo антисупрессорной активностью (Ter-Avanesyan et al., 1994; Doel et al., 1994). Мы предполагаем, что Sup35Cp конкурирует с супрессорными тРНК за нонсенс-кодоны мРНК в рибосоме, и увеличение концентрации SupSSCp должно вести к усилению терминации на стоп-кодонах за счет вытеснений" супрёссо'рных тРНК из с'вязи "с "ними. ' ■

Как- показано на рис. 18, белки С11 и Sup35 X. laevis физически взаимодействуют друг с другом, образуя комплекс. Это наблюдение прямо подтверждает предположение, делавшееся ранее на основании генетических данных, о том, что белки Sup45 и Sup35 тесно взаимодействуют друг с другом.

Свойства белка Sup35C X.laevis во многом напоминают поведение белка RF3 из E.coli (Grentzmann et al. 1994, Mukini et al. 1994): оба фактора содержат GTP-связывающий домен, оба стимулируют активность другого фактора (eRFl у эукариот и RF1/2 у прокариот) при резко сниженном содержании любого из трех стоп-кодонов.

Открытие Sup35Cp X. laevis как второго фактора терминации трансляции у эукариот, сходного с бактериальным RF3, позволяет предложить именовать его Sup35Cp/eRF3.

Пока остаются нерешенными два существенных вопроса, касающихся Sup35Cp/eRF3: существует ли эта форма белка (С-домен) как самостоятельная iп vivo и как влияет N-домен на С-домен в полноразмерном белке Sup35. Очевидно, что ответить на эти вопросы

можно будет уже в близком будущем.

Общий вывод из нашей работы по эукариотическим факторам терминации состоит в том, что несмотря на отсутствие структурной гомологии между ними и соответствующими 11Р у прокариот (сходство СТР-связывающих доменов ИГЗ и белка БирЗбС неспецифично для данных белков), они функционально сходны. Система терминации трансляции у всех живых организмов устроена принципиально сходным образом: она состоит из двух компонентов, из которых один (1^1/2 и eP.Fl) обеспечивает узнавание стоп кодонов и гидролиз пептидил-тРНК, а второй (1^3 и 5ир35Ср/ейРЗ) обеспечивает связывание и гидролиз бТР. и повышает сродство стоп-кодонов к другим компонентам системы. В

Рис. 19. Схема терминации белкового синтеза.

(1) пептидил-тРНК в "3" участке рибосомы после транслокации, (2) взаимодействие еЕП и еИРЗ с рибосомой б ответ на терминирующий кодон, (3) гидролиз пептидил-тРНК, (4) выход еЯР1 и еНЕЗ из рибосомы.

обоих случаях факторы терминации, помимо взаимодействия с рибосомой, контактируют друг с другом.

Возможно, что такой механизм терминации трансляции более надежен, гарантирует окончание процесса белкового синтеза и освобождение рибосом для нового раунда трансляции, а также делает систему терминации трансляции более помехоустойчивой. Это важно для клетки, поскольку блокирование терминации выводит из 1 функционирования и рибосому, и мРНК, что может привести к снижению скорости синтеза белков в клетках. С другой стороны, двухкомпонентность систем, вероятно, связана с необходимостью тонкой регуляции процесса терминации. Известно, что и инициация, и элонгация трансляции зависят более чем от одного белкового фактора как у прокариот, так и особенно у эукариот.

Приведенная схема терминации трансляции у эукариот, изображенная на рис. 19, основывается на полученных нами в этой работе данных. Видно ее принципиальное сходство с прокариотическойч системой, хотя структурной гомологии между факторами терминации пока обнаружить не удалось.

ВЫВОДЫ ч

1. Развита методология синтеза структурных генов высших эукариот с использованием обратной транскрипции. В ходе этих исследований установлена способность высокоочшценной ревертазы из вируса миелобластоза птиц использовать, в качестве матриц высокоструктурированную РНК, а в качестве затравок - короткие (вплоть до динуклеотида) синтетические гетерополимеры. Обнаружена способность ревертазы считывать ковалентно прерванную цепь РНК-матрицы, что объяснило механизм копирования онкорнавирусных РНК. ' С учетом обнаруженных свойств ревертазы отработана методика синтеза: структурных генов in vitro на примере генов, кодирующих глобины человека, кролика и голубя, церулоплазмины человека и крысы и Г-кристаллин лягушки. Полученные двуспиральные ДНК использованы для решения ряда конкретных задач.

2. Молекулярно клонирована и секвенирована кДНК, кодирующая WRS человека. На основании расшифрованной нуклеотидной последовательности выведена аминокислотная последовательность WRS, высокогомологичная WRS быка (9056) и имеющая незначительную гомологию с бактериальными WRS (30%). В структуре WRS идентифицированы потенциальные участки связывания АТР и тРНК.

3. Молекулярно клонированы, картированы и частично секвенированы геномные клоны, включающие участок генома человека длиной -35 т.п.н., содержащий ген WRS. Установлена экзон-интронная организация гена WES человека, состоявшего из 10 экзонов, кодирующих субъединицу TSRS, и по крайней мере двух 5'-концевых нетранслируемых экзонов - 1а и lb, участвующих в альтернативном сплайсинге. Ген WRS человека картирован на длинном плече хромосомы 14 в локусе q24.

' 4. Расшифрована нуклеотидная последовательность регуляторной области гена WRS, в которой идентифицированы участки, характерные для IFN-a и IFN-r-зависимых генов, что позволило отнести'ген WRS к контролируемым IFN. Сформулированы гипотезы о возможной роли WRS в клеточной ответе на 1FN.

5. Обнаружена корреляция между экзон-интронной организацией гена WRS и доменной организацией белка-продукта. Сделан вывод, что ген WRS имеет химерную природу, причем N-домен, кодируется экзонами II—IV , а С-домен - экзонами V-XI.

6. Установлена первичная структура WRS кролика, оказавшаяся высокогомологичной WRS других млекопитающих. Опровергнуто мнение о том, что WRS кролика и eRF - близкородственные белки.

7. Разработан метод выделения eRF кролика в гомогенном состоянии; чистота препарата доказана возможностью секвенирования пептидов его триптического гидролизата. Сравнение аминокислотной последовательности четырех пептидов с банком данных выявило структурную гомологию между eRF кролика и"рядом белков эукариот с неизвестной функцией (семейство Бир45-подобных белков).

8. Два белка - С11 из X. laevis и ТВЗ-1 из И. sapiens, родственные eRF кролика и белку Sup45 дрожжей, экспрессированы соответственно в Е.' coli и дрожжах. Очищенные белки CI1 и ТВЗ-1 обладают RF-активностыо в тесте in vitro, что доказывает их принадлежность к eRF. Семейству белков эукариот, имеющих структурное и функциональное сходство, присвоено обозначение eRFl. Предсказано, что белок Sup45 дрожжей представляет собой eRFl. Из анализа структуры eRFl предсказано, что в клетках эукариот должен существовать еще, хотя бы один eRF, имеющий GTP-связывающий домен.

9. Идентифицирован новый," ранее неизвестный eRF в клетках высших организмов, оказавшийся С-доменом белков, структурно" родственных дрожжевому белку Sup35. Расшифрованная на .основании структуры кДНК Sup35 X. laevis аминокислотная последовательность имеет высокую гомологию в С-концевой области с белками эволюциокно далеких- эукариот, что свидетельствует о высокой консервативности

С-домена Sар35-подобных белков. Экспрессированный в £. coli и очищенный С-домен белка Sup35 X. laevis способен стимулировать активность eRFl in vitro. Стимуляция терминации трансляции зависит от присутствия GTP. На основании функционального сходства С-домена белка Sup35 и белка RF3 £. coli, а также присутствия в обоих белках GTP-связывающих мотивов, сделан вывод о том, что. С-домен семейства белков Sup35 - это эукариотический аналог прохариотического фактора . RF3.

10. Новая информация о факторах терминации трансляции у высших эукариот позволила предложить унифицированную модель, объединяющую системы терминации белкового синтеза у всех живых организмов. Ее основная черта - двухкомпонентность, причем два компонента у прокариот и один у эукариот узнают три терминирующих кодона (RF1/2 и eRFl), а другой компонент стимулирует активность первого фактора (RF3 и Sup35/eRF3).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Киселев Л., Фролова Л., Газарян К., Тарантул В., Энгельгардт В. Ферментативный синтез ДНК, комплементарной к глобиновой мРНК голубя, путем обратной транскрипции. Докл. АН СССР 213, 1203-1206 (1973)'. " " ' " '

2. Метелев В.,. Степаноча 0., Смирнов В., Шабарова- 3-., Прокофьев М., Фролова Л., Граевская Н., Киселев Л. Избирательная транскрипция фаговой РНК ревертазой с использованием 'адресованной затравки'. Докл. АН СССР 217, 957-960 (1974).

3. Gasaryan К., Tarantul V., Baranov Yu., Frolova L., Kisselev L. , Elements of the secondary structure in the DNA complementary to pigeon globin mRNA. Mol. Biol. Rep. 1, 465-470 (1974).

4. Gasaryan K., Tarantul V., Baranov Yu., Frolova L., Kisselev L. Hybridization of pigeon globin messenger RNA with complementary DNA synthesyzeii in vitro by reverse transcription: influence of the homopolymeric regions. Nucl. Acids Res. 2, 1203-1212 (1975).

5. Фролова Л., Мелдрайс Я., Киселев Л. РНК-направляемый синтез ДНК /я vitro: обнаружение полидезоксиаденилата в ДНК, комплементарной антимессенджер ДНК. Докл. АН СССР 225, 1442-1445 (1975). . ' - - , ; '

6. Фролова Л., Теннов А., Газарян К., Тарантул В., Баранов ¡0., Кутель Ч., Грютцманн Ч., Хан В., Хиипе Ф., Граевская Н., Киселев

JI. Размеры гомо- и гетерополимерных частей ДНК, синтезированных путем обратной транскрипции по матрицам глобиновых иРНКК. Мол. биол. 10, 944-951 (1976).

7. Лимборская С., Фролова Л., Макаровская Е., Хилько С. Выделение глобиновой мРНК человека и синтез комплементарной ей ДНК путем обратной транскрипции. Докл. АН СССР 230, 981-984 (1976).

8. Фролова Л. Синтез генетического материала посредством обратной транскрипции (обзор). Итоги науки и техники, сер. Мол. биол., ВИНИТИ, 7, 143-193 (1976).

9. Фролова Л., Скобелева Н., Прасолов В., Киселев Л. Ферментативный синтез полноразмерного структурного гена глобина, содержащего "лицкие" концы. Докл. АН СССР 235, 1211-1214 (1977).

10. Фролова Л., Берзинь В., Янсоне Э., Грен Э., Метелев В., Смирнов В., Шабарова 3.,.Киселев Л. Обратная транскрипция фрагмента РНК, имеющего Еторичную структуру. Докл. АН СССР 232, 710-713 (1977).

11. Frolova L., ^letelev V., Ratmanova К., Smirnov У., Shabarova -Z., Prokofyev M., Berzin V., Jansone I,, Gren E., Kisselev L. Reverse transcription of phage RNA and its fragment directed by synthetic heteropolymeric primers. Nucl. Acids Res. 4, 2145-2159 (1977).

12. Frolova L., Tennov A., Scobeleva N., Kisselev L., Hahn V., Coutelle Ch., Grutzmann H. Synthesis and characterization -of gloijin DNAs.'Acrta Biol. Med. Gem. 36, 323-333 (1977)."

13. Frolova L., Arsenyan S., Avdonina Т., Gaitskhoki V.,' Kisselev 0., Neifach S., Kisselev" L. Enzymatic synthesis of DNA complementary lo mitochondrial mRNA via reverse transcription. Nucl. Acids Res. 5, 285-295 (1978v).

14. Амбарцумян H., Фролова Л., Киселев Л. Механизм обратной транскрипции; динуклеотид может функционировать в качестве затравки. Докл. АН СССР 247, 732-735 (1979).

15. Фролова Л., Шварцман А., Скобелева Н., Львов В., Гайцхоки В., Нейфах С., Киселеву Л. Энзиматический синтез и характеристика ДНК, комплементарной церулоплазмиковой мРНК из печени крыс. Мол. биол. 13, 1070-1076 (1979).

16. Киселев Л., Амбарцумян Н.', Фролова Л., Грен Э., Берзинь В., Янсоне Э., Шабарова 3., Потапов В., Вейко В. Обратная транскрипция; новый механизм элонгации. Докл. АН СССР 253, 250-253 (1980)."

17. Sclrwarzman A., Gaitshoki V., Lvov V., Nosikov V.j Braga E., Frolova L.p Scobeleva N., Kisselev L., Neifach S. Complex molecular structure of the gene coding for rat ceruloplasmin. Gene 11, 1-10 (1980).

18. Носикоз В., Брага Э., Шварцман А., Львов В., Гайцхоки В., Киселев Л., Скобелева Н., Фролова Л., Нейфах С. Структурная организация гена церулоплазмина крысы. Мол. биол. 15 , 835-844

(1981).

19. Скобелева Н., Козлов К., Прасолов В., Дубовая В., Джумагалиев Е., Гаузе Г., Фролова Л., ферментативеый синтез и молекулярное клонирование структурного гена а глобина голубя. Мол. биол. 15, 1224-1233 (1981).

20. Gaitshoki V., L'vov V., Monakov N., Puchkova L., Schwartzman A., Scobeleva N., Zagaroski W., Neifach S., Frolova L. Intracellular distribution of rat liver polyribosomes synthesizing ceruloplasmin. Eur. J. Biochem. 115, 39-44 (1981).

21. Gaitshoki V., L'vov V., Schwartzman A., Scobeleva N., Neifach S., Fr.olova L. Identification of ceruloplasmin messenger RNA sequences in heterogeneous nuclear RNA. Mol. Biol. Sep. 8, 57-62 (1581).

22. Tomarev S., Dolgilevich S., Koslov K., Zinovieva R., Dzumagaliev E., Kogan G., Scobeleva N., Mikhailov A., Gause G., Frolova L. Molecular cloning, of double-stranded cDNA from eye lens of ihe frog Rana temporaria: construction of the cDNA clonoteque and identification of a clone containing the nucleotide sequences of the r crystal 1 in gene. Gene 17, 131-138

(1982). x

23. Pletnev A., Scobeleva N., Frolova L., Kisselev L. Nucleotide sequence of the anemic pigeon alpha-globin gene. Structural rearrangements in the cloned cDNA. Gene 25, 93-100 (1983),

24. Frolova L.Y., Sudomoina M.A., Grigorieva A.Y., Zinovieva O.L., Kisselev L.L. Cloning and nucleotide sequence of the structural gene encoding for human tryptophany1-tRNA synthetase. Gene 109, 291-296 (1991). "

25. Frolova L.Y., Sudomoina M.A., Grigorieva A.Y., Zinovieva' O.L., -Kisselev L.L. (1991). EMBL Database, Acc. No. M61715.

26. Grigorieva A.Y. Sudomoina M.A. Frolova L.Y. Kisselev L.L. (1992). EMBL Database, Acc. Nos. X67918-X67928.

27. Frolova L.Y., Grigorieva A.Y., Sudomoina. M.A., Kisselev L.L.The human geLne encoding tryptophany 1-tRNA synthetase:

interferon-response elements and exon-intron organization. Gene 12&, 237-245 (1993).

28. Graphodatsky A., Frolova L., Biltuyeva L., Eremina V., Lushnikova Т., Sudomoina M., Zinovieva 0. and Kisselev L. Localization of the tryptophanyl-tRNA "synthetase gene (WRS) on human' and bovine chromosomes by In situ hybridization. Mammalian Genome 4, 183-184 (1993).

29. Kisselev L., Frolova L. and Haenni A-L. Interferon inducibility of mammalian tryptophanyl-tRNA synthetase: new perspectives. Trends in Biochemical Sciences 18, 263-267 (1993).

30. Frolova L.Yu., Fleckner J_., Justesen J., Timms K.M., Tate W.P.", Kisselev L.L. and Haenni A-L. Are the tryptophanyl-tRNA synthetase and the peptide-chain-release factor from higher eukaryotes one and the same protein? Eur. J. Biochem. 212, 457-466 (1993).

31. Frolova L.Yu., DalphinM.E., Justesen J., Powell R.i., Drugeon G., McCaughan K.K., Kisselev L.L., Tate W.P. and Haenni A-L. Mammalian polypeptide chain release . factor and tryptophanyl-tRNA synthetase are distinct proteins. EMBO J. 12, 4013-4019 (1993).

32. Frolova L., Le Goff X., Rasmussen H.H., Cheperegin S., Drugeon G., Kress M., Arman I., Haenni-A-L., Celis J.E., Philippe M., Justesen J. and Kisselev L. A highly- conserved eukaryotic pfoteiii ' family possessing properties o"f 'polypeptide chain release factor. Nature 372, 701-703 (1994).

33. Zhouravleva G., Frolova L., Le Goff X., Le Guellec R., Inge-Vechtomov S., Kisselev L.', Philippe M. Termination of translation in eukaryotes depends on two polypeptide chain release factors, eRFl and eRF3.

Автор приносит благодарность Н.Амбарцумян, А.Григорьевой, О.Зиновьевой, Н.Скобелевой, М.Судомойной и С.Чеперигину в соавторстве с которыми получена -часть результатов. . Автор благодарит ГНТП "Геном человека", РФФИ и D0E за финансовую поддержку части этой работы, а также коллективы лабораторий в Москве, Париже, Gpxyce и Ренне и. их руководителей Л.Киселева, A.L.Haenni, J.Justesen и M.Philippe за помощь в ходе исследований, обсуждение^ результатов и постоянную поддержку.

Информация о работе

Фролова, Людмила Юрьевна
доктора биологических наук
Москва, 1995
ВАК 03.00.03

Автореферат

Похожие работы