Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-клеточная оценка рекомбинантных белков VP24 в механизмах вирулентности вируса Эбола

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-клеточная оценка рекомбинантных белков VP24 в механизмах вирулентности вируса Эбола"

На правах рукописи

Шелемба Арсения Александровна

МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНАЯ ОЦЕНКА РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ УР24 В МЕХАНИЗМАХ ВИРУЛЕНТНОСТИ ВИРУСА ЭБОЛА

03.03.04 — клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в ФГБУ Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфологии СО РАМН и в ФГБУ Научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики СО РАМН.

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Гуляева Людмила Федоровна

доктор биологических наук,

профессор Лушникова Елена Леонидовна

Официальные оппоненты:

Архипов Сергей Алексеевич, доктор биологических наук, заведующий лабораторией цитологии и клеточных культур ФГБУ Научного центра клинической и экспериментальной медицины СО РАМН.

Постникова Ольга Алексеевна, доктор биологических наук, заведующая кафедрой информатики и математики ГБОУ ВПО Новосибирского государственного медицинского университета МЗ РФ.

Ведущая организация:

ФГБУ Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН.

Защита состоится: « /'¿Р » 2014 г. в /^час.

на заседании совета Д 001.037.01 в ФГБУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН по адресу 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН http://pathomorphology.soramn.ru

Автореферат разослан « /СР »

Ученый секретарь Диссертационного совета

Молодых Ольга Павловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Лихорадка Эбола относится к одному из наиболее опасных и тяжелых вирусных инфекционных заболеваний, летальность при которой достигает 88%. Нарастание миграционных тенденций в мире сопровождается распространением ряда опасных инфекций на неэндемичные территории. Несмотря на значительные усилия ученых многих стран по разрабогке методов специфической профилактики и лечения лихорадки Эбола, следует отметить, что в настоящее время такие средства еще не созданы. Одной из причин этого является недостаточное понимание биологии вируса Эбола (ВЭ). Сложность организации исследований такого опасного возбудителя, как ВЭ, может быть частично компенсирована исследованием его отдельных генов и белков, безопасность которых многократно продемонстрирована (Elliott L. et al., 1985; Elliott L et al., 1993; Licata J. et al., 2004).

Эффективным методическим приемом изучения патогенеза и функций генома ВЭ является селекция вирулентного штамма для морской свинки и сравнение дикого и полученного в результате селекции штаммов. Показано, что природные высоковирулентные для человека штаммы ВЭ слабо патогенны для морских свинок и мышей (van der Groen G. et al., 1979; Bowen E.T. et al., 1980), но в результате серии слепых пассажей удается получить измененный штамм ВЭ, высоко летальный для этих видов (Чепурнов А.А. и др., 1995; Bray М. et al., 1996; Ryabchikova Е. et al. 1996; Conolly B.M. et al., 1999). Данный подход позволил получить не только дешевую и удобную модель для изучения биологии ВЭ и разработки средств профилактики болезни Эбола, но и стал очень удобным для изучения генетических факторов вирулентности ВЭ.

В результате сравнения нуклеотидных последовательностей геномов исходного штамма ВЭ и адаптированного для морских свинок (штамм 8мс) (Volchkov V. et al., 2000), а также исходного и адаптированного для мышей (штамм MA) (Hart М.К., 2003) были выявлены нуклеотидные замены, опосредующие собственно изменение вирулентности для этих видов животных. Сопоставление работ (Волчков В.Е. и др., 2000; Субботина E.J1. и др., 2010) позволяет картировать фактор вирулентности ВЭ для морских свинок генами белков NP и vp24. Критичной является замена в vp24, установлена ее локализация. Показано, что в двух независимо проведенных адаптациях замены были в двух последующих позициях: His на Туг в позиции 186 для штамма 8мс и Thr на Не в соседней позиции 187 для штамма К5 (Volchkov V.E. et al., 2000). Установлена значимость нуклеотидной замены в vp24 для изменения вирулентности ВЭ (Mateo М. et al., 2011).

Успехи в клонировании белков ВЭ в составе экспрессирующих векторов и разработке рекомбинантных конструкций на основе его геномной РНК создали предпосылки для изучения биологических свойств конкрет-

ных вирусных белков. Получен доступ к изучению путей реализации патогенного потенциала ВЭ. Этот подход был использован нами для изучения модулирующих свойств белка vp24, полученного в рекомби-нантных конструкциях, содержащих ген этого белка в оригинальной или измененной в результате адаптации последовательности.

Нарушение гуморального иммунного ответа относится к важным факторам патогенности ВЭ (Peters С.J. et al., 1996). Поэтому мы сочли важным исследовать возможную взаимосвязь особенностей гуморального ответа на ВЭ с выявленными отличиями в геноме авирулентного и вирулентного для морских свинок штаммов ВЭ. Для этого мы использовали рекомбинантные белки vp24 обоих вариантов ВЭ для стимуляции пула мононуклеарных клеток здоровых интакгных животных и последующей оценки продукции специфических антител.

Ранее было показано, что антиген ВЭ способен непосредственно влиять на активность гематопоэтических предшественников у человека, ингибируя рост эритроидных колоний (Чепурнов А.А. и др., 1997). Поэтому при оценке биологической роли отличий, выявленных в структуре генома и белка vp24 в вирулентной и авирулентной конфигурациях, важно было оценить потенциальную роль в этом процессе белка vp24 и способность отличий в конфигурации вариантов этого белка влиять на модуляцию иммунопоэза. С этой целью было исследовано влияние вариантов этого белка на колониеобразующую активность гематопоэтических предшественников у мышей.

Показана значимость интерфероновой блокады в инфекции мышей, зараженных адаптированным к ним ВЭ (Bray М., 2001). Позднее была продемонстрирована корреляция между уровнем вирулентности вируса и его способностью подавлять ИФН-зависимый противовирусный ответ (Ebihara Н. et al., 2006). Поэтому важно было оценить потенциальное влияние белка vp24 и его модификаций на индукцию интерферона.

Большое значение имеет проведение исследований по выяснению влияния встройки разных вариантов гена vp24 непосредственно в трансгенную животную модель, например, в Drosophila melanogaster. Изменение вирусного генома, коррелирующее с возрастанием вирулентности, должно сопровождаться изменением некоторых физиологических реакций, поэтому мы использовали геном белка vp24 в исходной и измененной последовательности для оценки функциональной роли этих отличий. Конструирование трансгенных особей Drosophila melanogaster является перспективным подходом к изучению функциональной роли генов, выполняющих общие для всех клеток функции в соматических и генеративных тканях (Spresser C.R., Carlson К.А., 2005; Wong S.L. et al., 2005).

Цель исследования — изучение биологической роли рекомбинантных белков vp24 в механизмах вирулентности вируса Эбола.

Задачи исследования:

1. Определить содержание суммарных иммуноглобулинов и IgG в

сыворотке морских свинок при стимуляции рекомбинантными белками ВЭ ур24-д и ур24-8мс.

2. Исследовать направленность и уровень воздействия рекомбинант-пых аналогов vp24 на пролиферацию клеток-предшественников грануло-цитарно-макрафагального и эритроидного ростков у мышей.

3. Исследовать способность рекомбинантного белка vp24 в вирулентной и авирулентной для морских свинок конфигурациях воздействовать на индукцию интерферона in vivo и in vitro.

4. Используя технику трансформации, получить трансгенные линии Drosophila melanogaster, содержащие геномные встройки, кодирующие белок vp24 ВЭ дикого типа и белок ур24-8мс.

5. Исследовать экспрессию созданных трансгенных конструкций в различных органах и тканях Drosophila melanogaster.

Научная новизна работы. Впервые создана трансгенная модель Drosophila melanogaster, содержащая геномные встройки, кодирующие белок vp24 ВЭ дикого типа и мутантный белок ур24-8мс с заменой His на Туг в позиции 186, для оценки функциональной роли этой замены.

Впервые на модели Drosophila melanogaster изучены клеточные функции белков ВЭ в исходной (штамм Заир) и модифицированной (штамм 8мс) конфигурации. Ни в одном из проведенных скрещиваний визуально не было выявлено фенотипических отличий от исходных линий, что может свидетельствовать о том, что исследуемый ген не является геном общего действия, а нарушает некую специфическую функцию млекопитающих.

Впервые проведено исследование влияния рекомбинантных аналогов вирулентной и авирулентной конфигурации белка vp24 ВЭ на интерфе-роногенез. Показано, что рекомбинантные аналоги белков ур24-д и vp24-8мс, представляющие белок vp24 ВЭ в авирулентной и вирулентной для морских свинок конфигурации, ингибируют интерфероногенез in vivo и in vitro. При этом не выявлено отличий в способности к ингибированию между этими двумя конфигурациями белков. Продемонстрировано отсутствие супрессорного эффекта для vp24 ВЭ в отношении В-клеток.

Впервые исследованы модулирующие свойства вариантов белка vp24 ВЭ на гемопоэз. Показана способность белка vp24 оказывать негативное воздействие на пролиферацию клеток-предшественников гранулоци-тарно-макрофагального ростка и выявлен более супрессивный эффект вирулентной для морских свинок конфигурации ВЭ.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты настоящего исследования вносят вклад в понимание роли белка vp24 ВЭ в патогенезе лихорадки Эбола. Получены линии мух, несущие последовательности, кодирующие ген белка vp24 штаммов Заир и 8мс вируса Эбола в векторе pUAST. Это позволяет исследовать экспрессию трансгенных конструкций в различных органах и тканях Drosophila melanogaster.

Рекомбинантные белки ур24-д и ур24-8мс, представляющие белок vp24 ВЭ в авирулентной и вирулентной для морских свинок конфигу-

рации, ингибируют интерфероногенез in vivo и in vitro, что делает их перспективным иммуномодулятором. Выявленная способность белка vp24 к ингибированию пролиферации клеток-предшественников грану-лоцитарно-макрофагального ростка имеет большое значение для выбора тактики лечения лихорадки Эбола.

Положения, выносимые на защиту.

1. Белок vp24 вируса Эбола не обладает супрессирующим эффектом в отношении B-лимфоцитов и стимулирует продукцию специфических антител в культуре мононуклеарных клеток морской свинки.

2. Рекомбинантные белки vp24 ВЭ не влияют на колониеобразование эритроцитарного ростка у мышей, но подавляют пролиферацию клеток-предшественников гранулоцитарно-макрофагального ростка.

3. Рекомбинантные белки vp24 вируса Эбола в вирулентной и ави-рулентной для морских свинок конфигурации ингибируют индукцию интерферона in vivo и in vitro в одинаковой степени.

4. Микроинъекции плазмид pUAST/ ур24-д или pUAST/ vp24-8MC в эмбрионы Drosophila melanogaster позволяют получать линии мух, несущих последовательности, кодирующие различные штаммы геморрагической лихорадки Эбола- 8мс и Заир в векторе pUAST. Отсутствие в проведенных скрещиваниях визуальных отличий от исходных линий свидетельствует, что исследуемый ген не является геном общего действия.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных и российских конференциях: Third European Congress of Virology (Nürnberg, Germany, 2007); Winter College on Micro and Nano Photonics for Life Science (Trieste, Italy, 2008); Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: Геномика, протеомика, биоинформатика (Новосибирск, 2011); межлабораторной научной конференции в ФГБУ «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики» СО РАМН (Новосибирск, 2014); межлабораторной научной конференции в ФГБУ «Научно-исследовательский институт региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН (Новосибирск, 2014).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 5 - в журналах по списку ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Материал изложен на 120 страницах компьютерного текста, включающего 7 таблиц и 10 рисунков. Список литературы содержит 206 литературных источников, в том числе 183 иностранных. Результаты исследований получены непосредственно автором. Исследования по получению трансгенных Drosophila melanogaster проведены в ФГБУН Институте цитологии и генетики СО РАН, по конструированию плазмид — в ФГУН Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор».

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. В эксперименте использованы белые мыши линии СБА (п=40), беспородные белые мыши (п=40) массой 18 - 20 г и морские свинки породы Hartley (п=56) массой 200 - 250 г. Животные были получены из вивариев НИИ клинической иммунологии СО РАМН и Института цитологии и генетики СО РАН и содержались на стандартном рационе. Уход за животными и работа с ними осуществлялись с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Рекомбинантные плазмиды. Рекомбинантные плазмиды pUAST/ vp24-WT (дикий тип) и pUAST/VP24-8MC (адаптированный вариант) для конструирования трансгенных мух Drosophila melanogaster были любезно предоставлены Е.Л.Субботиной.

Нуклеотидные последовательности клонированных генов ур24-д и ур24-8мс проверены секвенированием с использованием фланкирующих вставку праймеров (CAGCAACCAAGTAAATCAACTGCAA и GGTAGTTTGTCCAATTATGTCACACC) по методу Сэнгера (Sanger F. et al., 1973) на автоматическом анализаторе ДНК Beckman CEQ2000XL (Beckman Coulter, США) с использованием набора реактивов CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit (Beckman Coulter, США) согласно инструкциям фирмы-производителя.

Плазмида. Для трансформации мух Drosophila melanogaster использовали конструкции на основе плазмиды pUAST, которая содержит UAS промотор, активизируемый белком Gal4. В случае появления трансформантов такой тканеспецифический регулятор транскрипции (драйвер) помогает активизировать клонированные в pUAST гены в определенном органе. Плазмида была наработана в Е. coli (штамм XL-blue). Всего было получено 74 линии мух.

Рекомбинантные белки \р24-д (дикий тип) и ур24-8мс (адаптированный вариант). Рекомбинантные белки, соответствующие белку vp24 дикого штамма Заир (ур24-д) и адаптированного к морским свинкам штамма 8 мс (ур24-8мс), были предоставлены лабораторией особо опасных вирусных инфекций ГНЦВБ «Вектор». Согласно описанию, «из культуры клеток Vero, инфицированной штаммами Заир или 8мс, выделяли вирусную РНК и на ее основе строили соответствующую комплементарную ДНК. Из полученных препаратов вычленяли полноразмерные кДНК генов vp24 обоих штаммов. Нуклеотидные последовательности клонированных генов, обозначенных ур24-д и ур24-8мс, проверяли секвенированием. Выделенные полноразмерные кДНК генов vp24 встраивали в плазмиду pQE(30-32) фирмы Qiagen, США. Плазмиды, в свою очередь, были встроены в E.coli, штамм Ml5. Наработка и очистка рекомбинантных белков проведены с использованием набора QIA express фирмы Qiagen на хрома-тографической колонке со смолой Ni-NTA в 8М мочевине. Рекомбинантные белки диализованы против физиологического раствора и обозначены как

ур24-д для конфигурации, соответствующей дикому штамму, и ур24-8мс для адаптированного штамма ВЭ».

Индуктор интерферона. В качестве индуктора интерферона использован ридостин (натрия рибонуклеат) производства «Вектор-фарм» (Новосибирск). Препарат растворяли в воде для инъекций.

Метод выделения монопуклеарных клеток (МНК) и оценка стимулированпого синтеза иммуноглобулинов. В качестве источника МНК была взята кровь пяти интактных морских свинок, свободных от патогенной флоры. Кровь забирали пункцией сердца в объеме 1 мл от одного животного. МНК выделяли отдельно для каждого животного на градиенте плотности фиколл-верографина 1.076 с последующим тройным отмыванием центрифугированием в среде RPMI-1640 при 1500 об./мин. МНК ресуспендировали в обогащенной среде RPMI-1640 с 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА, «Sigma»), 10-кратной смесью незаменимых аминокислот («Sigma») и L-глютамином (5мМ, «Sigma») до концентрации 2х106 кл./мл. Культивирование МНК проводили в U-образных 96-луночных планшетах для культур клеток («Linbro») в количестве 4x105 кл./лунку, в трех повторах.

Для оценки спонтанного синтеза иммуноглобулинов МНК культивировали отдельно, а для оценки синтеза, стимулированного рекомбинантным белком vp24 в вирулентной и авирулентной для морских свинок конф-гурациях, — с добавлением соответствующего рекомбинантного белка в концентрации (по белку) 2 мкг/мл. В качестве контроля индуцированного синтеза антител МНК культивировали в присутствии стандартного В-клеточного митогена LPS E.coli 055:В5 («Sigma») (Tumang J.R. et al., 1998) в концентрации 2 мкг/мл, оттестированной в предварительных экспериментах как субоптимальная доза митогена. Планшеты с МНК культивировали при 37°С и 5% С02 в течение 7 сут. Через 7 сут собирали бесклеточные супернатанты, которые затем изучали в прямом иммуно-ферментном анализе (ИФА). ИФА проводили по стандартной методике (Кэтти Д., Райкундалиа Ч., 1991) с антителами против иммуноглобулинов морской свинки, меченными пероксидазой хрена, на 96-луночных планшетах, предварительно сенсибилизированных белком А стафилококка в концентрации 5 мкг/мл.

Выделение нлюрнпотентных клеток костного мозга (КМ) и оценка гемопоэзстимулнрующей активности рекомбннантных белков. Для оценки модулирующей способности гемопоэтической активности вариантов белка vp24 ВЭ в вирулентной и авирулентной конфшурациях in vitro использовали плюрипотентные клетки КМ мышей линии СВА. Клетки выделяли из костного мозга мышей, усыпленных согласно «Правилам проведения работ с применением лабораторных животных», введенных приказом МЗ РФ. КМ вымывали из бедренной кости с помощью шприца средой RPMI 1640 с 10% эмбриональной сыворотки КРС и разводили до концентрации 50 тыс. клеток в 1 мл. Для определения числа коммитиро-

ванных предшественников клетки КМ в указанной концентрации вносили в 24-луночные планшеты в составе метилцеллюлозной среды MethoCult GF М3434 (MethoCult® М3334, кат. № 03434 фирмы Stemcell technologies).

Определение числа коммнтированных гсмопоэтических предшественников. Клетки, полученные, как описано выше, из КМ мышей (50000/мл), инкубировали в метилцеллюлозной среде MethoCult GF М3434. Культивирование проводили при температуре 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% С02, в 24-луночных планшетах. В опытные лунки добавляли исследуемые рекомбинантные белки ур24-д и ур24-8мс ВЭ в концентрациях 10, 25, 50, 75 и 100 мкг/мл. В контрольные лунки добавляли соответствующее количество БСА. С учетом наличия БСА в составе метилцеллюлозной среды М3434 мы сочли использование этого препарата оптимальным контрольным фактором, используемым лишь для минимизации отличий в белковой нагрузке. Гранул оцитарно-макрофа-гальные (КОЕ-ГМ) и эритроидные (КОЕ-Э) колонии, содержащие более 20 клеток, подсчитывали с помощью инвертированного микроскопа на 14-й день инкубации.

Оценка индукции интерферона в системе in vivo. Эксперименты проводили согласно методическим подходам (Ершов Ф.И., Парфенов В.В., 2000). Белым беспородным лабораторным мышам массой 18-20 г вводили внутримышечно однократно индуктор интерферона ридостин в количестве 10 мкг на животное и ур24-д либо vp24-8\ic в количестве 1 мкг на животное в объеме 0,2 мл физиологического раствора. Сыворотку экспериментальных животных получали, отбирая кровь капилляром из надреза вены бедра через 4, 24, 48 и 72 ч после введения препаратов. Численность животных в группе составляла по 10 мышей. Всего сформированы 3 группы: ридостин, ридостин и ур24-д, ридостин и ур24-8мс.

^Титрование сывороток проводили по подавлению цитопатического действия тест-вируса на перевиваемой культуре фибробластов легких эмбрионов мышей L929. Для этого в плоскодонные полистироловые планшеты с монослоем фибробластов вносили сыворотки, разведенные в безсывороточной среде с двухкратным шагом от 1:2 до 1:256. Планшеты инкубировали 24 ч (37°С, 5% С02), после чего в лупки вносили вирус энцефаломиокардита мышей (штамм «Колумбия») в количестве, вызывающем цитопатогенное действие 100% фибробластов (ЦПД100)! Планшет инкубировали 24 ч (37°С, 5% С02). За титр противовирусной активности принимали максимальное разведение сыворотки, которое защищало 100% фибробластов от цитодеструктивного действия вируса, и выражали в интерфероновых единицах (ИЕ) на пробу.

Оценка индукции интерферона в системе in vitro. Кровь интакт-ных беспородных мышей в объеме 200 мкл смешивали с 800 мкл среды RPMI1640. Затем добавляли ридостин и вносили препараты ур24-д либо ур24-8мс из расчета 1 мкг/мл. Инкубировали при 37°С и 5% С02, отбирая образцы через 24 ч. Надосадочную жидкость титровали на противовирус-

ную активность, как описано выше. Ранее выявлено, что сами препараты в исследуемых концентрациях не оказывают цитопатического действия на клетки.

Процедура трансформации Drosophila melanogaster. Для трансформации использовали линию у1 w1; Ki1 P{Delta2-3}99B Drosophila melanogaster, полученную из стокового центра в Блумингтоне, несущую кутикулярный маркер у и глазной маркер w. Эта линия дополнительно несет геномную встройку (которая неспособна перемещаться по геному) конститутивно активной транспозазы, обеспечивающей интеграцию ДНК инъецируемой конструкции в геном. Эмбрионы Drosophila melanogaster собирали в течение 20-30 мин после откладки яиц на корм. Под микроскопом наблюдали за тем, чтобы эмбрионы были на стадии образования синцития, до миграции ядер к поверхности ооцита и образования индивидуальных плазматических мембран (целлюляризация).

В каждый эмбрион вводили пузырек ДНК-содержащего раствора диаметром около 30 мкм. После введения препарата эмбрионы инкубировали в термостате при 25°С, а впоследствии, при появлении личинки, пересаживали в стаканы с кормом и выдерживали при температуре 21 °С. Каждого потенциального трансформанта помещали в отдельный стакан с кормом, чтобы предотвратить возможные скрещивания. Для визуализации трансформантов производили скрещивания трансформированных мух с линией у w. Поскольку конструкция содержала ген м>+, то встройку её в геном Dmsophila melanogaster можно было контролировать визуально — трансформанты характеризовались красными глазами, в то время как у нетрансформированных мух глаза оставались белыми.

Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета программ STATISTICA 5.0. Достоверность обнаруженных межгрупповых различий оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Данные представлены как среднее значение ± ошибка среднего значения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Представления о патогенезе лихорадки Эбола у человека до сих пор неполны. Вирус присутствует в большинстве органов больного ЛЭ с наиболее выраженным поражением печени, селезенки и почек. В поздних стадиях заболевания появляются геморрагии в желудочно-кишечном тракте, плевральных, перикардиальной и перитонеальной полостях и в канальцах почек с отложениями фибрина. Эти поздние проявления объясняют дис-семинированным внутрисосудистым свертыванием крови (ДВС).

По целому ряду признаков можно предположить, что поражение иммунной системы играет важную роль в развитии лихорадки Эбола (ЛЭ). Одной из первых концепций иммуносупрессии при ЛЭ является предположение о наличии у ВЭ иммуносупрессивных свойств (Volchkov V.E. et al., 1992). Основанием послужило наличие в поверхностном белке GP ВЭ

аминокислотной последовательности, гомологичной «иммуносупрессив-ному» домену белка pi 5Е онкогенных ретровирусов. В.Е.Волчков и соавт. (1995) и О.Дольник и соавт. (2004) показали значение секретируемого белка sGP и растворимой формы полноразмерного GP ВЭ как ловушки для нейтрализующих антител.

Одним из важнейших механизмов подавления иммунной защиты организма касается подавления интерфероновой защиты организма хозяина (Bray М. et а!., 2001), опосредованной белком vp35 как антагонистом выработки интерферона (Basler C.F. et al., 2000) и белком vp24 как антагонистом сигнальной системы интерферона (Reid S.P. et al., 2006). Ряд авторов считают важнейшим фактором патогенеза массивную вирусную инфекцию клеток важнейших внутренних органов и, в первую очередь, печени (Baskerville A. et al., 1985; Connolly В.М. et al., 1999), что в результате приводит к развитию полиорганной недостаточности (Чепурнов А. А., Шестопалова Л. В., 2010).

Некоторые авторы связывают патогенез с инфекцией эндотелиальных клеток, приводящей к нарушению проницаемости сосудов и активации факторов свертывания, что обусловливает коагуляционные нарушения и развитие синдрома ДВС (Geisbert T.W. et al., 2003). Развитие геморрагического синдрома при филовирусных лихорадках объясняют активацией клеток, продуцирующих фактор некроза опухоли-а, способный усиливать проницаемость сосудистого эндотелия (Feldmann Н. et al., 1996). Выход этого медиатора в кровяное русло способствует, по мнению авторов, увеличению проницаемости сосудов и запуску коагуляционного каскада, приводящего к развитию тромбогеморрагического синдрома и шока. Молекулярная мимикрия (Maksyutov A.Z. et al., 2007) рассматривается и как уже упомянутый фактор, провоцирующий иммуносупрессию (Volchkov V.E. et al., 1992), и как фактор, провоцирующий аутоиммунную агрессию (Tilson M.D. et al., 1996).

Таким образом, пока отсутствуют полноценные знания о патогенезе лихорадки Эбола, как и единая точка зрения Eia приоритет тех или иных патогенетических механизмов в развитии этой болезни (Mahanty S., Bray М., 2004). Большой набор выдвигаемых концепций и гипотез лишь подчеркивает многофакторность патогенетических процессов, развивающихся при данных лихорадках, и требует детального изучения всех звеньев патогенеза. Удобным инструментом выявления молекулярных факторов патогенности ВЭ послужило выявление отличий в молекулярной организации дикого штамма ВЭ и штамма, адаптированного к морским свинкам (Volchkov V.E. et al., 2000).

На основании данных анализа геномов упомянутых штаммов и изменений электрофоретической подвижности белка в денатурирующих условиях В.Е.Волчков и соавт. (2000) связали изменение вирулентности ВЭ для морских свинок с точечными мутациями в гене vp24. Наиболее значимой заменой представлялась С—>U (10904), приводящая к изме-

нению (Thr—>Т1е) в позиции 187, поскольку в повторном эксперименте по адаптации ВЭ к морским свинкам замена обнаружена в соседней позиции 186, приводящей к замене His в нелетальной конфигурации на Туг в летальной.

Исследование модулирующих свойств несущего эту замену белка vp24 в исходной и изменившейся в результате адаптации ВЭ к морским свинкам конфигурации является обоснованным методическим приемом для изучения механизма патогенности ВЭ. С этой целью нами исследовано влияние рекомбинантных белков vp24 соответствующих конфигураций этого белка в диком штамме ВЭ и адаптированном к морским свинкам штамме (ур24-д и ур24-8мс соответственно) на гуморальный ответ моно-нуклеарных клеток морских свинок, колониеобразование гемопоэтиче-скими клетками-предшественниками мышей и индукцию интерферона. Проведено также исследование клеточных функций гена vp24 дикого и адаптированного к морским свинкам штаммов ВЭ на модели Drosophila melanogaster и оценка его возможной принадлежности к генам «домашнего хозяйства» (house-keeping) клеток.

Влияние рекомбинантных белков vp24 на гуморальный иммунный ответ мононуклсарных клеток морских свинок. При исследовании причин отсутствия протективности в результате иммунизации инакти-вированными и рекомбинантными препаратами многие исследователи в первую очередь обращали свое внимание на особенности гуморального иммунного ответа при введении антигена ВЭ. Так, введение невосприимчивым к болезни лошадям, козам и баранам гомогената печени инфицированных ВЭ приматов (содержавшего малое количество специфического белка) приводило к высоким титрам нейтрализующих антител при низком значении титров этих же сывороток в ИФА. И наоборот, иммунизация животных высокими (100 мкг/кг) дозами очищенного, концентрированного, инактивированного ВЭ приводила к образованию сывороток с высоким титром в ИФА и низким индексом нейтрализации (Дедкова J1.M. и др., 1994; Чепурнов A.A. и др., 1995; Ksiazek T.G. et al., 1999). Поэтому, изучая модулирующие свойства белка vp24 ВЭ и возможные иммуномодулирую-щие отличия между выявленными конфигурациями белка, мы исследовали уровень синтеза иммуноглобулинов, стимулируемых рекомбинантными ур24-д и ур24-8мс в культуре МНК. Результаты сравнивали со спонтанной индукцией иммуноглобулинов этими клетками и после их стимуляции липополисахаридом (ЛПС).

На первом этапе мы убедились, что неспецифический белок не влияет на величину абсорбции в используемом нами иммуноферментном анализе. Для этого использовали бычий сывороточный альбумин (БСА) и продемонстрировали отсутствие доза-зависимой связи количества неспецифического белка и значений оптической плотности (ОП) в ИФА на сенсибилизированных белком А стафилококка 96-луночных планшетах (табл. 1). Результаты показывают отсутствие доза-зависимого эффекта,

Таблица 1. Контроль специфичности ИФА посредством различных концентраций БСА

Концентрация БСА (г\мл) Оптическая плотность (ОП)

0,01 0,5

0,005 0,6

0,0025 0,4

0,00125 0,4

0,000625 0,5

0,000312 0,6

0,000156 0,7

0,000078 0,4

т.е. специфичность экспериментов по оценке влияния рекомбинантных вариантов белка vp24 ВЭ на продукцию иммуноглобулинов мононукле-арными клетками морских свинок.

Для оценки результатов планируемых экспериментов были составлены калибровочные кривые. Калибровку проводили с помощью охарактеризованных препаратов суммарных иммуноглобулинов морской свинки отдельно и иммуноглобулина G морской свинки отдельно (использованы препараты производства фирмы Antibody systems, Texas. США). Полученные результаты представлены на рис. 1. Калибровочные кривые были построены на основе проведенного нами ИФА разведений с известной концентрацией как для стандартной смеси всех иммуноглобулинов морской свинки (см. рис. 1, а), так и отдельно для разведений IgG (см. рис. 1, б) с антителами против суммарных иммуноглобулинов морской свинки или антителами к IgG морской свинки, меченными пероксидазой хрена. Оценка результатов проводилась по величине абсорбции при длине волны 492 нм. Величина абсорбции, согласно представленным данным, криволинейно зависит от концентрации иммуноглобулинов в растворе.

После проведения описанных подготовительных этапов были проведены собственно эксперименты по оценке продукции суммарных иммуноглобулинов и IgG мононуклеарными клетками в ответ на стимуляцию «вирулентным» и «авирулентным» вариантами vp24 ВЭ. Мононуклеарные клетки из периферической крови морских свинок выделяли в градиенте плотности фиколл-верографина с последующим тройным отмыванием центрифугированием в среде RPMI-1640 при 1500 об./мин.

В табл. 2 и 3 полученные данные о величине абсорбции (среднее из двух) и соответствующей им концентрации (ME) иммуноглобулинов показаны отдельно для каждого донора. Получены достоверные различия (р<0,05 во всех случаях) при сравнении спонтанного и стимулированного (как митогеном, так и рекомбинантными антигенами vp24 вируса Эбола) синтеза иммуноглобулинов in vitro. При этом отличий в стимуляции гуморального ответа между ур24-д и vp24-8Mc не выявлено.

140 120 100 80 60 40 20 0

О -----.------г---;-----,... ......■■ =•— —*-;

1,492 1,371 1,265 1,075 1,002 0,705 0,665 0,338

Рис. 1. Калибровочные графики суммарных иммуноглобулинов (а) и IgG (б) морской свинки.

Ранее было показано, что поверхностный гликопротеин ВЭ обладает иммуносупрессивными свойствами в отношении Т-лимфоцитов периферической крови (Volchkov V.E. et al., 1992; Chepurnov A.A. et al., 1999). В то же время, как видно из представленных данных, B-клеточный ответ в отношении vp24, как ант игена, весьма эффективен. Это согласуется с ранее опубликованными данными в отношении цельновирионного инактиви-рованного антигена ВЭ, полученными в эксперименте in vivo (Чепурнов A.A. и др., 1995). При этом феномен отсутствия антител в разгар инфекции объясняется связыванием в иммунные комплексы, которые играют важную роль в патогенезе лихорадки Эбола (Дадаева A.A. и др., 1998).

Так как макрофаги являются первичной мишеныо данного инфекционного агента, попадание вируса и/или вирусных белков приводит к их стимуляции и, следовательно, к повышению синтеза интерлейкина-1 и фактора некроза опухоли-a, что стимулирует превращение В-лимфоцитов в антителосекретирующие клетки (Kehrl J.H. et al., 1987; Jones R.A. at al., 1990; Kimata H., Yoshida A„ 1994; Jährling P.B. et al., 1999). Это ведет к появлению интерлейкина-10 и к переключению иммунного ответа с Thl на Th2, что выражается в дальнейшем увеличении синтеза IgA, IgG и IgM (Burdin N. et al., 1995; Bai X.F. et al., 1997). Увеличение содержания иммуноглобулинов G, и особенно подкласса Gl, в сыворотке крови человека усиливает роль комплемента и антителозависимой клеточной

Таблица 2. Концентрация суммарных иммуноглобулинов в супернатантах МНК морской свинки под влиянием белков ур24-д и ур24-8мс

№ эксперимента Спонтанный синтез суммарных иммуноглобулинов Синтез суммарных иммуноглобулинов, стимулированных

ЛПС E.coli белком ур24-д белком ур24-8мс

1 1,525 (46 ME) 1,708(105 ME) 1,645 (59 ME) 1,632 (57 ME)

2 1,499 (42 ME) 1,691 (99 ME) 1,590 (53 ME) 1,585 (52 ME)

3 1,513 (44 ME) 1,723 (125 ME) 1,601 (55 ME) 1,598 (54 ME)

4 1,535 (48 ME) 1,715 (110 ME) 1,638 (59 ME) 1,629 (59 ME)

5 1,479 (37 ME) 1,679 (63 ME) 1,629 (56 ME) 1,606 (54 ME)

Среднее значение и стандартное отклонение ME 43,4*4,21ME 107,8±10,56ME 56,4±2,6 ME 55,2±2,77ME

Таблица 3. Концентрация иммуноглобулинов в в супернатантах МИК морской свинки под влиянием ур24-д и ур24-8мс

№ эксперимента Спонтанный синтез иммуноглобулинов G Синтез иммуноглобулинов G, стимулированных

ЛПС E.coli белком ур24-д белком ур24-8мс

1 1,342 (48 ME) 1,488 (106 ME) 1,402 (64,5 ME) 1,428 (77 ME)

2 1,374 (53 ME) 1,492(108 ME) 1,395 (62 ME) 1,423 (74 ME)

3 1,321 (44 ME) 1,509(115 ME) 1,445 (84 ME) 1,408 (66 ME)

4 1,388 (58 ME) 1,478(101 ME) 1,421 (73 ME) 1,389 (59,5 ME)

5 1,359 (46 ME) 1,493(108,5 ME) 1,415(69 ME) 1,417(71 ME)

Среднее значение и стандартное отклонение ME 49,8±5,67 ME 107,7±5,04 ME 70,5±8,64 ME 69,5+6,91 ME

цитотоксичности (Allison A.C., 1998), что, в свою очередь, провоцирует формирование аутоиммунных комплексов (Tilson M.D. et al, 1996).

В настоящее время накоплено достаточное количество данных, свидетельствующих о том, что гуморальный иммунный ответ играет важную роль в патогенезе лихорадки Эбола. Так, показано, что в Центрально-Африканском регионе в сыворотках крови 21,3% людей циркулируют антитела к ВЭ (Johnson E.D. et al., 1993). В сыворотках выживших после лихорадки Эбола отмечали повышенную концентрацию иммуноглобулинов G при их отсутствии у погибших (Baize S. et al., 1999). Это может быть опосредовано и скоростью развития болезни, и некими механизмами, подавляющими развитие гуморального иммунного ответа, что свидетельствует о его значимости в патогенезе лихорадки Эбола. Проведенные нами эксперименты убедительно показывают увеличение синтеза иммуноглобулинов

(как класса так и, в меньшей степени, других классов), отсутствие супрессорного эффекта для ур24 ВЭ в отношении В-клеток, активное участие гуморального иммунного ответа в течении лихорадки Эбола и создают основу для дальнейших разработок эффективных методов борьбы с этой болезнью.

Влияние рекомбинантных вариантов белка ур24 ВЭ на колоние-образование гемоноэтическими клетками-нредшествепниками у мышей. Проведенная ранее оценка влияния антигена ВЭ на рост гемо-поэтических клеток-предшественников человека показала доза-зависимое снижение эригроидного колониеобразования (Чепурнов А.А. и др., 1997). Хотя при этом не было отмечено влияния на рост гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников, но было установлено, что антиген ВЭ способен непосредственно влиять на гемопоэтическую активность у человека, ингибируя рост эритроидных колоний. Поэтому при оценке биологической роли отличий, выявленных в структуре гена и белка ур24 в вирулентной и авирулентной конфигурациях, важно оценить потенциальную роль в этом процессе белка ур 24, а также способность отличий в конфигурации вариантов этого белка влиять на модуляцию иммунопоэза.

Известно, что такие цитокины, как интерферон-а и у, фактор некроза опухоли-а, являются супрессорами гемопоэза (Матш 8.XV. е! а!., 1985; Вгохтеуег Н.Е. е1 а1., 1986; 11Нс11 Т.К. е1 а1„ 1990). Обладая кроме иммуно-модулирующих эффектов, способностью угнетать гемопоэтическую активность, интерфероны могут являться важным звеном в патогенезе вирусной инфекции. Поэтому данные о способности ур24 ВЭ быть антагонистом интерферона (11е1с1 8.Р. et а1., 2005, 2006) требуют также и проверки этого белка в отношении эффекта активации или ингибирования гемопоэза.

С этой целью рекомбинантные варианты белка ур24 ВЭ в вирулентной и авирулентной конфигурации добавляли в возрастающих дозах к суспензии плюрипотентных клеток костного мозга. Результаты влияния рекомбинантных белков ур24-д и ур24-8мс ВЭ на рост гемопоэтических клеток-предшественников показаны на рис. 2. Различные дозы обоих вариантов рекомбинантного белка ур24 ВЭ не оказывают воздействия на эритроидных предшественников у мышей. Однако сами по себе рекомбинантные белки обладают неким эффектом супрессии эритроидного ростка по сравнению с контрольным белком - БСА. Трудно оценить, является ли столь низкий и не имеющий доза-зависимой динамики эффект существенным для патогенеза лихорадки Эбола. Однако факт некоторого супрессивного воздействия на колониеобразование эритроидных предшественников статистически достоверен.

Другая картина наблюдается при оценке воздействия рекомбинантных белков ур24 на гранулоцитарно-макрофагальный росток (см. рис. 2, б). Здесь отчетливо просматривается доза-зависимая супрессия колониеобразования обоими вариантами рекомбинантного белка ур24 ВЭ.

2 40

Я 8

1 и

8 3

I &

* а.

о с

35

30

20

И

4-I

-ур24-8мс —ур24-д —БСА

20 40 60 80

Концентрация препаратов (мм/мп)

0 20 40 60 80 100

Концентрация препаратов ур24-д ур24-8мс, БСА.

120

Рис. 2. Оценка влияния антигена вируса Эбола на рост эритроидных (а) и грану-лоцитарно-макрофагальных (б) предшественников.

При этом вариант ур24-8мс обладает достоверно более выраженными супрессивными свойствами, чем рекомбинантный аналог ур24 дикого штамма ВЭ.

Единственное доступное в литературе исследование воздействия ВЭ на коммутированные клетки, предпринятое в 1997 г. А.А.Чепурновым и соавт. (1997), выявило отсутствие влияния цельновирионного инакги-вированного антигена ВЭ на гранулоцитарно-макрофагальный росток и способность подавлять рост предшественников эритроцитов. Так, инкубирование мононуклеарных клеток с инактивированным, цельновирионным антигеном ВЭ приводило к доза-зависимому снижению эритроидного колониеобразования, достигавшему максимальных значений при дозе пептидов 75 мкг/мл. Полученные нами результаты существенно отличаются от имеющихся литературных данных, указывающих, что вирусные

пептиды способны непосредственно влиять на гемогюэз, в частности, эритроидную компоненту.

Анализируя причины выявленного отличия от опубликованных данных, мы исходили из того, что описаный в литературе эксперимент проведен на цельновирионном препарате. Показано, что гликозилиро-ванный белок GP, являющийся компонентом вирусной оболочки, имеет аминокислотный участок, в значительной степени гомологичный «им-муносупрессорному домену» трансмембранного протеина р!5Е ретро-вирусов лейкемии животных (Volchkov V.E. al., 1992). Возможно, эффект ингибирования роста ранних эритроидных предшественников (Чепурнов А.А. и др., 1997) опосредован GP, так как аналогичен действию нативного ретровирусного пептида р] 5Е на гемопоэтическую активность клеток у кошек (Wellman M.L. et al., 1984).

Важно также, что в упомянутом исследовании (Чепурнов А.А. и др., 1997) был использован цельновирионный препарат, на поверхности которого представлен гликопротеин и белок vp40, свойства которых, по-видимому, и определяли модулирующие гемопоэтические свойства препарата. Белок vp24, хотя и ассоциирован с мембраной зрелого вириона (Elliott L.H. et al., 1993), не входит в состав образующихся при сборке вирионов филаментозных структур, не критичен при сборке вирусоподобных частиц и, по-видимому, опосредует взаимодействие между белками NP и vp40 ВЭ (Watanabe S. et al., 2004). На поверхности вириона ВЭ белок vp24 не представлен, и это, на наш взгляд, объясняет отличия в результатах воздействия на гемопоэтические клетки-предшественники цельновирионного препарата ВЭ и рекомбинантного белка vp24 в обеих конфигурациях. Нельзя также недооценивать то, что данный эксперимент проводился на клетках мыши, а не морской свинки, что вызвано отсу тствием специальной среды. Тем не менее, и с учетом того, что штамм, адаптированный к мышам, тоже имеет критичную замену в vp24 (Ebihara Н. et al., 2006), представляется важным обнаруженный факт: использованные рекомби-нантные белки не только обладают способностью негативного воздействия на пролиферацию предшественников гранулоцитарно-макрофагального ростка, но и отмечается более супрессивный эффект именно вирулентной для морских свинок конфигурации ВЭ.

Влияние рекомбинантных вариантов белка vp24 вируса Эбола на индукцию интерферона. Вирус Эбола, вызывающий у человека острую геморрагическую лихорадку с летальностью, достигающей 80 - 90% (Baize S. et al., 1999), помимо тяжелых коагуляционных расстройств, вызывает иммуносупрессию (Sanchez A. et al., 2001), которая может иметь важное значение в развитии данного заболевания. Показана значимость интерфе-роновой блокады в инфекции мышей, зараженных адаптированным к ним ВЭ (Bray М., 2001). Установлена корреляция между уровнем вирулентности вируса и его способностью подавлять ИФН-зависимый противовирусный ответ (Ebihara Н. et al., 2006). Известно, что интерфероны являются

——♦— ридостин —■— ридостин+ур24-д - - -А- - ридостин+ур24-8мс

Рис. 3. Динамика содержания противовирусных интерферонов в сыворотке мышей после введения ридостина, ридостина + \ф24-д и ридостина + ур24-8мс. По оси абсцисс - сроки после введения препаратов, по оси ординат - противовирусная активность индуцированного интерферона в сыворотке в интерфероновых единицах (ИЕ).

важной составляющей иммунного ответа против вирусных патогенов (как и бактериальных и онкологических угроз организму хозяина).

Адаптация вируса Эбола к морским свинкам, сопровождающаяся ростом вирулентности для этих животных, коррелирует с появлением единичной замены в геноме белка vp24. Также существуют данные, что белок vp24 является антагонистом ИФН-зависимой сис темы противовирусной защиты организма хозяина (Reíd S.P. et al., 2006). Сопоставив эти и ранее приведенные данные об интерфероновой природе иммунопатоге-неза лихорадки Эбола, мы оценили влияние рекомбинантного белка vp24 ВЭ в авирулентной и вирулентной конфигурациях на интерфероногенез. Для этого in vivo и in vitro исследовали влияние рекомбинантных белков ур24-д и ур24-8мс ВЭ на индукцию интерферона ридостином.

На первом этапе исследовали уровень индукции интерферона ридостином в сыворотке мышей. Для этого вводили мышам ридостин в дозе 10 мкг внутримышечно в заднюю лапу. Образцы сыворотки отбирали через 4, 24, 48 и 72 ч после введения ридостина. Огмечен интерфероногенный эффект с максимальным титром антивирусной активности через 48 ч после введения препарата (рис. 3). В случае введения ридостина одновременно с ур24-д или ур24-8мс по 1 мкг на животное происходило подавление индукции интерферона. При этом не отмечено статистически достоверных отличий влияния авирулентной и вирулентной для морских свинок конфигурации vp24 на подавление иитерфероногенной способности ридостина.

Титрование сывороток проводили по подавлению цитопатического действия тест-вируса на перевиваемой культуре фибробластов легких эмбрионов мышей L929. Также исследована способность рекомбинантных

250

200

ж ш

150

100

50

0

□ Рид остин и Ридостин+ур24-д ® Ридостин+ур24-8мс

4ч

Рис. 4. Противовирусная активность.

По оси абсцисс - сроки после введения препаратов, по оси ординат- противовирусная активность индуцированного интерферона в сыворотке в интерфероновых единицах (ИЕ).

вариантов белка vp24 подавлять синтез интерферонов клетками крови интакгных животных. Активность интерферона оценивали по разведениям, в которых подавлялась цитопатогенная способность вируса энце-фаломиокардита мышей. Выявив таким образом уровень антивирусной шггерферон-индуцирующей активности (рис. 4), опыт повторяли, вводя одновременно две дополнительные группы, где в образцы крови добавляли помимо ридостина по 1 мкг/мл ур24-д или ур24-8мс. Одновременное введение ридостина и рекомбинантного белка ур24-д или ур24-8мс приводило к полному подавлению антивирусной интерфероновой активности супернатантов крови. При этом не выявлено достоверного отличия в способности рекомбинангных аналогов белков ур24-д и ур24-8мс подавлять интерфероногенную активность.

ВЭ подавляет продукцию кле тками интерферонов аир (Harcourt В.Н. et al., 1998; Harcourt В.Н. et al.,1999; Gupta M. et al., 2001; Basler C.F., Palese P., 2004) и блокирует способность клеток реагировать на иитерфероны а, ß и у. Белок ВЭ с молекулярным весом 35 кДа (vp35) осуществляет механизм противодействия, блокируя как продукцию интерферонов a/ß, так и клеточный ответ на применение интерферонов a/ß и у. Инфекция Эбола сопровождается значительным ростом содержания в крови уже через 24 ч многих цитокинов (МСР-1, MIP-1-a, RANTES, and TNF-a). В то же время интерфероны аир, интерлейкины 1 ß и 10 не продуцируются при инфицировании. Более того, с помощью двуспиральной РНК клетки макрофагальной системы подавляют индукцию интерферона а. То же показано и для эндотелиальных клеток. Ингибирующее воздействие vp35 осуществляется активацией интерферон-регулирующего фактора (interferon regulatory factor 3 (1RF-3) (Basler C.F. et al., 2000,2003; Reid S.P. et al., 2005). Показано, что vp35 последовательно блокирует индукцию двуспиральной РНК, нейтрализуя вирус-индуцированный ответ репор-терных генов и наработку промоутеров интерферона.

Таким образом, vp35 ВЭ подавляет индукцию интерферонов в инфицированных клетках, что, видимо, является важным элементом вирулентности ВЭ. Однако механизм, посредством которого осуществляется это подавление сигналов рецепторов интерферонов а, р и у, оставался неясным. Показано, что vp24 ВЭ ингибирует сигнальную систему интерферонов (Reid S. et al., 2006). Экспрессия vp24 приводит к подавлению генов, индуцирующих экспрессию интерферонов, и способность интерферонов индуцировать антивирусный статус клетки. Эта способность vp24 подавлять клеточный ответ интерферонов связана со способностью нарушать систему передачи генных сигналов системы интерферона STAT1, ключевого шага в развитии ответа всех типов интерферона (а/р и у). Задачей нашего исследования было оценить наличие или отсутствие способности белка vp24 блокировать индукцию интерферонового ответа, а также выявить, связано ли с этим феноменом отличие в геноме данного белка, коррелирующее с вирулентностью для морских свинок. Как видно из полученных данных, белок действительно нейтрализует индукцию интерферона, однако не выявлено влияния отличий в конформации белка на антиинтерфероновую активность. Можно сделать вывод, что белок vp24 опосредует изменение вирулентности не за счет усиления антиин-терфероновых свойств, а за счет других свойств, например, изменения продуктивности в клетках нового хозяина.

Изучение функциональной роли мутационной замены в геноме адаптированного к морским свинкам вируса Эбола па модели Drosophila melanogaster. Конструирование трансгенных особей Drosophila melanogaster является перспективным подходом к изучению функциональной роли генов. Дрозофила была успешно использована для изучения генов и белков, связанных с ВИЧ-инфекцией (Spresser C.R., Carlson К.Л , 2005), ТОРС -кв (Wong S.L. et al., 2005) для изучения функциональной роли локуса За, кодирующего белок, экспрессия которого подтверждена для больных ТОРС-кв. Продемонстрирована эффективность использования трансгенных особей дрозофилы для изучения функции вирусных генов. В данном исследовании мы воспользовались этим методом для уточнения функции вирусного белка vp24, а именно: связано ли его функционирование с функцией генов «домашнего хозяйства» (house-keeping) клетки.

В связи с этим были поставлены задачи получить линии дрозофилы, содержащие встройки последовательностей, кодирующих белки в векторе pUAST, который позволяет экспрессировать целевой трансген в различных тканях D. melanogaster, проанализировать экспрессию конструкций вирулентного и авирулентного штаммов ВЭ в составе вектора pUAST, в крыловом имагинальном диске и в соматической ткани D. melanogaster и попытаться оценить роль замены одного нуклеотида для конформации белка, определяющей изменение вирулентности.

Для этого на первом этапе плазмиды, содержавшие ген белка vp24 в исходном или мутированном виде, вводили в эмбрион Drosophila

Таблица 4. Схема скрещиваний полученных трансформантов с тканеспе-цифичными драйверами

Исходная линия Drosophila melanogaster (у' w'; Ki' P{Delta2-3}99B)

Введена плазмида со встроенным геном белка vp24 дикого штамма ВЭ Введена плазмида со встроенным геном белка vp24 адаптированного штамма ВЭ

Полученные мухи скрещены с линией у w

Получено 6 линий мух, трансформированных конструкцией, содержащей встройку гена ур24 ВЭ штамм Заир. Получено 4 линии мух, трансформированных конструкцией содержащей встройку гена ур24 ВЭ штамм 8мс

Проводили скрещивания с драйвером 1096-Са14 Проводили скрещивания с драйвером da-GAL4 Проводили скрещивания с драйвером 1096-Gal4 Проводили скрещивания с драйвером da-GAL4

В одном из экспериментов получена особь с редуцированным крылом. Полученные трансформат ы фенотипически не отличались от особей, содержащих встройку без Оа14 драйвера.

melanogaster, находящийся на стадии, предшествующей расхождению полярных клеток. Мух, появившихся из эмбрионов после введения плазмиды, скрещивали с линиейw (табл. 4). Среди потомков данного скрещивания мы обнаружили Drosophila melanogaster с красньгми глазами. Красные глаза у данггой линии мух (у w - всегда белые) подтверждают наличие встройки конструкции в геном. Всего было получено 74 линии мух, из них 6 линий содержали встройку гена vp24 штамма Заир и 4 линии со встройкой того же гена штамма 8мс.

Специфичность и уровень экспрессии полученных конструкций были проверены при помощи драйвера 1096-Gai4, обеспечивающего высокий уровень экспрессии в дорзальной области почки крылового имагиналь-ного диска (Capdevila J., Guerrero I., 1994) с более слабой экспрессией в вегггральной области (Lunde К. et al., 1998). Для этого линию Drosophila melanogaster, содержавшую драйвер 1096-Gal4, скрещивали с полученными стабилизированными трансформантами и смотрели потомков на предмет фенотипических отклонений. Для каждой линии трансформированных Drosophila melanogaster производили три скрещивания, различные во времени. В первом скрещивании на линию 1096-Gal4 мы получили одну муху с редуцированным крылом. Однако в последующих скрещиваниях данное фенотипическое изменение не воспроизвелось и, по-видимому, было морфозом.

Для экспрессии генов дрозофилы в других соматических тканях мы использовали повсеместный драйвер da-GAL4. Так же, как и в предыдущем случае, мы скрещивали линию Drosophila melanogaster, содержавшую драйвер da-GAL4, активный во всех соматических тканях.

В проведенных экспериментах не было замечено нарушений, вызываемых встроенной конструкцией под действием использованных в работе драйверов. В разных независимых линиях полученные трансгенные Drosophila melanogaster не отличались фенотипически ни от мух, подвергшихся инъекции, но не получивших встройку, ни друг от друга, что, по нашему мнению, свидетельствует о том, что исследуемый ген не является геном общего действия («домашнего хозяйства»), а нарушает некую специфическую функцию млекопитающих.

ВЫВОДЫ

1. Рекомбинантные белки ур24-д и ур24-8мс вируса Эбола не оказывают супрессорного эффекта на продукцию иммуноглобулинов монону-клеарными клетками крови морских свинок. Однонуклеотидная замена C-*U (10904) в гене белка vp24 (ур24-8мс) не влияет на выраженность B-клеточного ответа морских свинок.

2. Рекомбинантные белки vp24 вируса Эбола не обладают активирующим или ингибирующим воздействием на колониеобразующую активность гематопоэтических клеток-предшественников у мышей, но подавляют пролиферацию клеток-предшественников гранулоцитарно-ма-крофагалыюго ростка. Супрессивный эффект вирулентного для морских свинок ур24-8мс более выражен.

3. Рекомбинантные аналоги белков ур24-д и ур24-8мс, представляющие белок vp24 вируса Эбола в авирулентном и вирулентном для морских свинок вариантах, ингибируют продукцию интерферона in vivo и in vitro в одинаковой степени.

4. Генетическая трансформация плазмидой pUAST позволяет получать трансгенные линии Dmsophila melanogaster идя изучения функциональных свойств белка ур24-д и vp24-8Mc.

5. Исходная линия Drosophila melanogaster и линии, несущие встройку плазмидьг с генами белков ур24-д и vp24-8\ic, не различаются фенотипически. Фенотипические различия отсутствуют как при использовании соматического драйвера da-GAL4, так и при использовании драйвера крылового имагинального диска 1096-Gal4.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зубавичене Н.М., Шелемба-Чепурнова A.A., Чепурнов A.A. Гемолитическая активность комплемента при экспериментальной лихорадке Эбола // Сибирский медицинский журнал (Иркутск). - 2010. - Т. 92, № 1. - С. 22-25.

2. Чепурнов A.A., Сизикова Л.П., Шелемба-Чепурнова A.A., Шесто-палова Л.В. Оценка репродукции вируса Эбола в организме взрослых ICR мышей // Вопросы вирусологии. - 2010. - Т. 55, № 4. - С. 33-38.

3. Шелемба-Чепурнова A.A., Омельянчук Л.В., Чепурнов A.A. Изучение функциональной роли мутаций в геноме вируса Эбола, адаптированном к морским свинкам на модели Drosophila melanogaster ll Вопросы вирусологии. - 2011. - Т. 56, № 1. - С. 37-40.

4. Шелемба A.A., Колесников С.И. Влияние рекомбинантных вариантов белка vp24 вируса Эбола на индукцию интерферона // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра.-2011.-№ 1 (77), часть 1.- С.

5. Шелемба А.А., Гуляева Л.Ф. Исследование влияния рекомбинантных белков vp24 вируса Эбола на гуморальный ответ мононуклеарных клеток морских свинок // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра. - 2011. - № 6 (82). - С. 182-186.

6. Arseniya Shelemba-Chepurnova, Leonid Omelyanchuk, Ekaterina Subbotina, Alexander Chepurnov An attempt of "in vivo" functional characterization of the Ebola Zaire virulence-associated changes at vp24 gene in Drosophila // Third European Congress of Virology. - Nurnberg. Germany, 2007.-Abstr.# 01912.

7. Shelemba-Chepurnova A.A., Omelyanchuk L.V. Investigation of cells properties using optical methods // Winter College on Micro and Nano Photonics for Life Sciences. - Trieste. Italy, 2008.

8. Шелемба А.А., Гуляева Л.Ф. Иммуномодулирующие свойства рекомбинантных вариантов белка vp24 Вируса Эбола // II международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: Геномика, протеомика, биоинфоратика». - Новосибирск, 2011. - С. 58.

255-259.

л

Соискатель

А.А.Шелемба

Подписано в печать 31.03.2014. Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл. печ. л. 1,0.

_Тираж 100 экз. Заказ № 13._

Отпечатано в типографии ОАО "НИИ систем" Новосибирск-58, ул. Русская, 39. т. 306-67-39