Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культивирование клеток на микроносителях в качестве субстрата для накопления вируса Эбола

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Культивирование клеток на микроносителях в качестве субстрата для накопления вируса Эбола"

На правах рукописи

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК НА МИКРОНОСИТЕЛЯХ В КАЧЕСТВЕ СУБСТРАТА ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ ВИРУСА ЭБОЛА

03.00.23. - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Кольцово - 1996

Работа выполнена в НИИ молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" Минздравмедпрома РФ.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Н.Н.Сергеев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор С.Н.Загребельный кандидат медицинских наук Е.Ф.Беланов

Ведущая организация: Научно-производственное объединение

"Вирион", НИИ вакцин и сывороток Минздравмедпрома РФ Л ТанаС

Защита состоится " 30' „-¿¿- СиРь- 1996 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 074.20.01 в НИИ молекулярной биологии ГНЦ ВБ "Вектор" по адресу: 633159, Кольцове, Новосибирской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ "Вектор".

Автореферат разослан "оЬй^ " ¿Ь^Ь^/^ 996

г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Т.Н.Шубина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. В последнее время все большее внимание уделяется развитию методов выращивания большого количества клеток с высокой их концентрацией в аппаратах с управляемыми условиями культивирования, поскольку применение традиционных методов выращивания поверхностно-зависимых клеток в матрасах и роллерных бутылях не отвечает в полной мере современным требованиям, предъявляемым к производству клеточных культур, вирусов и качеству биопрепаратов. Недостатками этих методов являются неконтролируемые условия роста клеток и размножения вирусов, возрастающий риск контаминации при масштабировании, высокая трудоемкость и низкая экономичность технологии. Оптимизация методов культивирования клеток приобретает огромное значение при производстве вирусных вакцин, а также при исследовании малоизученных высокопатогенных вирусов, повышая эффективность и безопасность работы.

Особое место в ряду таких вирусов занимает вирус Эбола, выделенный в 1976 году и вместе с ранее открытым вирусом Марбург отнесенный к семейству ЕПоу1г1с1ае. Вирус Эбола является одним из самых патогенных для человека и во время периодически возникающих вспышек вызывает тяжело протекающую геморрагическую лихорадку с крайне высоким уровнем летальности (77-88 %). Последняя эпидемия разразилась в мае прошлого года в Заире, а также, по сообщениям ВОЗ, вспышка лихорадки Эбола зарегистрирована в феврале сего года в Габоне. Хотя лихорадка, вызываемая этим вобудителем, эндемична для

некоторых районов • центральной Африки, развитие туризма и расширение экономических связей делают эту инфекцию потенциально опасной для территорий других стран. До настоящего времени естественный резервуар и пути распространения вируса в природе неизвестны, однако показано, что его случайными хозяевами могут быть обезьяны и человек, средства специфической профилактики и терапии отсутствуют. Известно, что из экспериментальных животных к вирусу Эбола чувствительны лишь обезьяны, морские свинки и мыши-сосунки.

По названным причинам разработка диагностических препаратов и средств иммунопрофилактики данного вирусного заболевания приобретает особую остроту и актуальность. В свою очередь, решение этих задач требует наработки большого количества вируса, и, следовательно, - создания эффективного и достаточно безопасного способа культивирования вируса Эбола. Поэтому поиск наиболее чувствительной и продуктивной клеточной модели, а также разработка соответствующей системы культивирования и ее применения для создания иммунодиагностических препаратов являются сегодня острой проблемой.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является подбор наиболее чувствительной клеточной модели и разработка научных основ технологии препаративного, эффективного и достаточно безопасного производства вируссодер-жащей культуральной жидкости для изучения возможности приготовления инактивированных вакцин, создания средств иммунодиагностики и профилактики, а также молекулярно-биологических исследований. В соответствии с целью исследо-2

вания были поставлены следующие задачи:

1) провести анализ чувствительности клеточных культур к вирусу Эбола в стационарном монослое;

2) изучить характеристики и провести экспериментальную оценку методов крупномасштабного культивирования чувствительных клеток;

3) изучить факторы, влияющие на выход клеток при крупномасштабном культивировании;

4) провести электронно-микроскопический анализ вирусных препаратов, полученных при культивировании вируса Эбола в клеточных культурах.

Научная новизна. В результате проведенных исследований отработан метод культивирования ряда линий клеток на микроносителях как наиболее перспективный для получения препаративных количеств вируса Эбола, определены наиболее важные факторы, влияющие на результаты культивирования клеток на микроносителях, осуществлен контроль качества микроносителей различного типа, проведена оценка чувствительности 13 различных культур клеток к вирусу Эбола; впервые проведено накопление вируса Эбола в системе культивирования клеток с использованием микроносителей в качестве подложки для клеток и показано, что титры вируса Эбола, полученные с использованием данного метода, превосходят соответствующие показатели вирусных препаратов, полученных традиционным способом. Впервые осуществлен процесс препаративного накопления вируса Эбола в 2-литровом ферментере с использованием микроносителей путем 5 последовательных пассажей отъемно-

3

доливным методом. Проведенное электронно-микроскопическое исследование, а также анализ очищенных вирусных препаратов методом электрофореза белков в полиакриламидном геле показали, что при описанном способе культивирования вируса в клетках, являющихся дериватами тканей обезьян, достигается накопление его препаративных количеств. При этом последовательное пассирование вируса не приводит к снижению продукции и изменению морфологии вирионов на протяжении пяти пассажей.

Практическая значимость работы. Проведенное исследование показало, что способ крупномасштабного культивирования клеток на микроносителях является эффективной системой для накопления вируса Эбола. Метод позволяет получать в препаративных количествах РНК и белки вируса Эбола при значительном сокращении сроков, трудоемкости и опасности работ (Патент 6С12 N 7/00 «Способ суспензионного культивирования филовиру-сов в клеточных культурах на микроносителях», приоритет от 21.10.1993, решение о выдаче 14.04.95, авторы В.Я.Тихонов и А.Н.Котов). Эти данные, а также результаты исследования факторов, влияющих на рост клеток в системе крупномасштабного культивирования на микроносителях, могут быть использованы для получения препаратов других вирусов, относящихся к группе особо-опасных (например, аренавирусов - A.c. N 246733, авторы Г.А.Ерошкина и А.Н.Котов), а также при организации современного производства других необходимых вирусных препаратов и различных биологически активных веществ. Необходимое для этого подробное описание процесса выращива-4

ния клеток изложено в лабораторном регламенте JI.P. 123.01088 «Культивирование клеток линии Vero на микроносителях Цитодекс в 2-х и 12-литровом ферментерах».

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены: 1) на Второй отраслевой конференции молодых ученых «Актуальные проблемы биотехнологии», пос.Кольцово Новосибирской обл., 25-27 апреля 1990. 2) на межведомственной конференции «Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекций», пос.Кольцово, Новосибирской обл., 7-8 апреля 1993. 3) на VII Международной конференции по сравнительной и прикладной вирусологии, Монреаль, Канада, 12-17 октября 1994.

Апробация работы состоялась на заседании научного семинара НИИ молекулярной биологии НПО «Вектор» 20 декабря 1995г.

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, получен 1 патент и 1 авторское свидетельство.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения и трех глав: обзора литературы (глава 1), материалов и методов (глава 2), результатов и обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитируемой литературы (186 ссылок). Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, включая 27 рисунков и 17 таблиц.

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены при непосредственной помощи и в соавторстве с сотрудниками ГНЦ ВБ «Вектор»: В.Я.Тихоновым,

к.б.н. А.А.Царевой!, к.м.н. Ю.И.Рассадкиным, к.б.н. Е.И.Ряб-

5

чиковой, к.б.н. В.Е.Волчковым, В.В.Шапровым, В.К.Ткачевым, А.А.Гражданцевой, Ю.П.Чуевым, Н.Д.Юрченко.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Изучение условий культивирования клеток на микроносителях. В предварительных экспериментах по изучению условий культивирования клеток на микроносителях в качестве модельной культуры были взяты клетки перевиваемой линии Vero, имеющие широкую область применения и обладающие высокой чувствительностью ко многим вирусам животных и человека.

С целью определения оптимальной концентрации микроносителей проводили оценку выхода клеток линии Vero в стационарной фазе роста при содержании гранул в среде культивирования от 1 до 5 мг/мл и начальной концентрации клеток 300 тыс/мл.

Полученные данные показали, что в диапазоне концентраций микроносителей в среде от 3 до 5 мг/мл по выходу клеток Vero в стационарной фазе роста достоверных различий не наблюдали. Конечная концентрация клеток в этот период (4-5 сутки после посева) составляла (1,4±0,3)х106 кл/мл и достоверно превышала плотность клеток, полученную при их выращивании в среде с содержанием микроносителей 1-2 мг/мл.

Для изучения влияния начальной концентрации клеток на их конечную плотность в культуре провели серию экспериментов по выращиванию перевиваемых (линия Vero) и диплоидных (штамм JI-68) клеток. Количество клеток, приходящихся

на каждую частицу микроносителя в момент посева было различным и составляло 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30. Зависимость конечной плотности клеток от соотношения «клетка/микроноситель» при посеве для исследованных культур клеток показана на рис.1.

Результаты наших экспериментов показывают, что для

успешного выращивания (отсутствие длительной лаг-фазы и

6

достижение плотности выше 10 кл/мл) при посеве необходимо выдерживать соотношение около 10 клеток на одну частицу носителя для перевиваемой клеточной линии Vero и около 20 клеток на частицу для диплоидной культуры JI-68 , что при содержании микроносителей в среде 5 мг/мл соответствует посевной концентрации около 250 тыс кл/мл и 500 тыс кл/мл соответственно.

i.8 т

Соотношение клетка/микроноситель при посеве

Рис. 1. Влияние начальной концентрации клеток на их конечную плотность в культуре.

В целом можно считать, что в настоящее время основным каналом управления и регулирования процесса культивирования микроорганизмов и клеток являются аэрация и перемешивание. Одним из наиболее информативных показателей, характеризующих гидродинамическое состояние жидкости в реакторах, является объемный коэффициент массопередачи.

Для того, чтобы стандартизировать условия проведения экспериментов, мы определили массообменные характеристики 2-х и 12-литровых ферментеров, т.е. коэффициенты массопередачи по углекислому газу (KLa) при различных скоростях перемешивания в условиях поверхностной аэрации.

График зависимости коэффициентов массопередачи для 2-х и 12-литровых ферментеров от скорости перемешивания изображен на рис.2.

После определения массообменных характеристик ферментеров мы провели серию экспериментального культивирования клеток Vero на микроносителях Цитодекс в трех

областях значений KLa: (0,4-0,6)хч \ (0,7-0,9)хч1, (1,0-1,2)хч '

Р

при соответствующих скоостях перемешивания.

Полученные результаты, характеризующие выход клеток в зависимости от условий выращивания, отображены на рис.3.

Анализируя полученные данные, можно прийти к заключению о том, что наиболее благоприятные условия для выращивания клеток Vero в данных ферментационных сосудах соответствуют области коэффициентов массопередачи в интервале (0,4-0,6)хч1. Данные условия (скорость перемешивания 72±12 об/мин для 2-х и 48±9 об/мин для 12-литрового ферментера 8

1.4 1,2 1

-о 2-л ферментер ♦-12-л ферментер

30

60 90 120

Скорость перемешивания, об/мин

150

Рис. 2. Зависимость объемных коэффициентов массопередачи (К, а) от скорости перемешивания.

1,6

1,4 1,2

И

si

0,8

о

0,6

0,4

0,2

0,5

0,8 KLa, 1/ч

1,1

Рис. 3. Зависимость выхода клеток Vero при выращивании на микроносителях от объемного коэффициента массопередачи.

при поверхностной аэрации воздухом с расходом 1-4 литра воздуха на литр среды в час) поддерживали в дальнейшем при всех последующих циклах культивирования.

По результатам 8 независимых экспериментов для каждого ферментера плотность клеток в конце 96-часового цикла культивирования составила (1,40±0,22)х10® кл/мл и (1,52±0,14)х106 кл/мл в 2-х и 12-литровом ферментере соответственно при сохранении высокой доли жизнеспособности (94-98 %), рис.4.

При культивировании клеток необходимо иметь информацию о физиологическом состоянии клеточного субстрата. Технология производства клеточных культур с перспективой их использования для получения продуктов с однородными показателями требует изучения параметров метаболизма клеток. В связи с этим мы изучили изменения концентрации глюкозы, бикарбоната натрия, аминокислот в питательной среде, а также дыхательной активности клеток в процессе размножения с одновременной регистрацией доли жизнеспособных клеток в культуре.

Как показали результаты по исследованию содержания глюкозы в питательной среде при выращивании клеток на микроносителях в ферментерах, уже к 48 ч роста в среде остается около 50% от начального уровня глюкозы, а к окончанию цикла культивирования в питательной среде присутствуют лишь ее следовые количества. Учитывая полученную динамику утилизации глюкозы, мы провели 4 опытных цикла культивирования с дробным добавлением ее в питательную среду (дважды по

£ Ц

5

Sí

о i-

0) §

а s X а а ь х ш ZS

X

о Sí

Рис. 4. Вверху: Кинетика размножения клеток линии Vero на микроносителях Цитодекс в 2-х и 12-литровом ферментерах. Внизу: Клетки линии Vero, растущие на микроносителях Цитодекс в 2-х (слева) и 12-литровом (справа) ферментерах. 96 ч роста, увеличение 80.

Время культивирования, ч

1 г/л - на 36 и 60 ч роста, суммарное содержание глюкозы в среде за цикл культивирования составило при этом 3 г/л). Конечная концентрация клеток, однако, в результате достигала значений (1,93±0,32)х106 кл/мл, что превышало плотность клеток в стационарной фазе при обычном составе среды в среднем лишь на 21%. Таким образом, полученные данные подтверждают вывод W.S.Hu с соавторами (1987) о том, что глюкоза метаболи-зируется значительно быстрее, чем это необходимо для поддержания роста и ее концентрация в среде не должна превышать

2 г/л, причем лучше добавлять глюкозу в среду в ходе культивирования, чем повышать ее начальную концентрацию.

Данные измерений концентрации растворенного кислорода в культуральной жидкости в процессе размножения клеток линии Vero на микроносителях в ферментере в условиях поверхностной аэрации показали, что сразу после засева клеток концентрация растворенного кислорода в ферментере была близка к насыщающей, а затем плавно снил<алась до уровня 10-20 % к моменту завершения цикла культивирования. Таким образом, при выращивании клеток почек обезьян в ферментерах при указанных выше условиях и поверхностной аэрации с расходом воздуха 1-4 л/лхчас растворенный кислород в среде культивирования поддерживался на уровне не ниже 10-20% от насыщения воздухом в течение всего периода роста.

Анализ изменения дыхательной активности культуры клеток Vero показал, что она убывает с ростом численности популяции, рис. 5. Согласно модели обратимого автокатали-

2,5

О)

с;

о >

8 1-5

я ,

к га z я

с;

о

Й 0.5

х

о 2-л ферментер ♦ 12-л ферментер

0,28 0,32 0,4 0,54 0,73 0,91 1,07 1,33 Концентрация клеток, млн/мл

1,48 1,72

Рис. 5. Зависимость дыхательной активности клеток Vero от их концентрации в культуре.

С4-

ш

ii - '.. «г j/r:tsrs > <» V

г:, ,v« ivcc» У \

1

Рис. 6. Слева: рост клеток диплоидных фибробластов человека (штамм Л-68) на микроносителях Цитолар. Справа: рост клеток почки макаки-резус (линия П111К-4) на микроносителях Цитодекс. Увеличение 80.

тического роста популяции (Н.А.Васильев, В.А.Амбросов, А.А.Складнев, 1975), линейность этой зависимости свидетельствует о том, что потребление кислорода соответствует потребности в нем данных клеток при изменении его концентрации в процессе культивирования, или, другими словами, концентрация кислорода в течение всего срока культивирования остается выше критической. При этом в стационарной фазе роста при равновесной концентрации клеток величина дыхательной активности отличается от нуля. Отрезок, отсекаемый полученной прямой на оси абсцисс, называется величиной запаса субстрата в питательной среде, выраженной в клеточных единицах (Мо). Связь между равновесной концентрацией клеток (Х^) и теоретически возможной конечной плотностью клеток в культуре Мо выражается коэффициентом полезного использования субстрата, который показывает, какая доля от исходного количества субстрата может перейти в биомассу при данных условиях культивирования:

где К - соотношение констант скоростей синтеза и распада биомассы.

Таким образом, равновесная концентрация клеток, т.е.

их плотность в культуре, достигшей стационарной фазы, зависит

от концентрации субстрата в питательной среде и константы

равновесия, величина которой определяется как свойствами

культивируемых клеток, так и условиями проведения процесса.

Величина коэффициента полезного использования субстрата

является наиболее адекватным критерием степени удаленности 14

условий культивирования от оптимума. Близость величины этого параметра к единице дает все основания считать условия культивирования оптимальными. По нашим оценкам, значения этого коэффициента при культивировании клеток линии Vero на микроносителях составляют 0,73-0,92, что по крайней мере не ниже, чем при суспензионном культивировании клеток ВНК-21(с13), где данный показатель составляет 0,63-0,96.

Для биосинтетической деятельности клеток в культуре помимо неорганических солей, углеводов, витаминов и сывороточных белков необходимо также присутствие аминокислот.

Согласно полученным результатам, наиболее полно при культивировании линии клеток Vero на микроносителях утилизировались глютамин, цистин и метионин.

Для остальных аминокислот значительного уровня потребления не отмечали. После первоначального снижения концентрации в течение первых 24 ч после посева клеток, в дальнейшем их содержание в среде культивирования заметно не изменялось, претерпевая незначительные колебания. К окончанию цикла выращивания остаток большинства аминокислот в культуральной среде составлял 33-62 % от их начальной концентрации.

Сравнительная оценка качества микроносителей разного типа. Несмотря на наличие большого разнообразия, универсального микроносителя, подходящего для выращивания всех типов клеточных культур, все же нет. Для выбранной культуры клеток, как правило, тестируют несколько видов микроносителей и выбирают наиболее пригодный. Кроме того, необходим контроль

1 5

качества каждой вновь поступающей их партии.

На следующем этапе работы была проведена сравнительная оценка качества микроносителей отечественного («Цитопол», «Цитолар») и зарубежного («Цитодекс») производства при выращивании клеток линии Vero.

При статистической обработке результатов было показано, что кратность прироста клеток на микроносителях «Цитодекс» достоверно выше, чем на микроносителях «Цитопол». Достоверных различий между кратностью прироста клеток на микроносителях «Цитодекс» и «Цитолар» не получено. Благодаря использованию полученных результатов представилась возможность успешно культивировать на микроносителях «Цитодекс» и «Цитолар» клетки других перевиваемых линий (FRhK-4, CV-1, ВНК-21(с13), GMK, Е-6 (клон Vero), FLK, CRFK-4, 4647), а также первичные (куриные фибробласты) и диплоидные (JI-68, MRC-5) культуры, рис. 6. Конечная концентрация клеток во всех случаях, за исключением диплоидных культур, превышала 1млн кл/мл (табл. 1). Сравнительная оценка качества микроносителей зарубежного (Цитодекс) и отечественного (Цитолар, Цитопол) производства показала, что лучшие образцы производимых в нашей стране микроносителей ни в чем не уступают зарубежным аналогам, что создает реальные предпосылки для широкого применения этого способа культивирования при решении фундаментальных и прикладных задач биотехнологии.

Одной из таких задач, поставленных в работе, была разработка научных основ технологии препаративного, эффектив-16

Таблица 1.

Характеристика роста клеток разных линий на микроносителях.

Наименование культуры Время формирования монослоя, сут Время достижения максимальной плотности, сут Максимальная плотность клеток, млн/мл

ФЭК 2 5 1,380±0,20

СУ-1 3 5 1Д9±0,16

4647 2 5 1,54±0,23

СЕЕК-4 3 6 1,24±0,17

№11К-4 4 7 1,20±0,15

ПЖ 3 5 1,33±0,21

ВНК-21 2 4 2,76±0,25

Л-68 5 8 0,78±0,14

ного и достаточно безопасного производства вируссодержащей культуральной жидкости и получения в дальнейшем препаративных количеств очищенного вируса Эбола, необходимого для разработки подходов к созданию инактивированных вакцин против этой инфекции, иммунизации крупных лабораторных животных и получения иммуноглобулинов, а также для развития молекулярно-биологических методов изучения филовирусов.

Изучение условий культивирования вируса Эбола в культурах клеток на микроносителях. Для изучения возможности приготовления инактивированных вакцин, получения иммунных сывороток, молекулярно-биологических исследований необходимо достаточное количество вирусного материала из надежного источника.

Экспериментальные животные не могут служить таким источником как из-за высокой стоимости, так и вследствие загрязнения получаемых вирусных препаратов тканевыми белками. Кроме того, невозможно проконтролировать зараженность животных другими патогенами.

Клеточные культуры лишены этих недостатков, кроме того, при работе с высокопатогенными вирусами, каковым является вирус Эбола, важное значение имеет безопасность экспериментальных работ. Использование клеточных культур для наработки вируса Эбола, несомненно, более безопасно, чем работа с животными. Все эти требования определили необходимость разработки производительного и достаточно безопасного способа культивирования вируса Эбола в клеточных культурах.

В предварительной работе оценивали чувствительность

выбранных клеточных культур (11 культур клеток животных различного происхождения и 2 линии клеток комаров) в течение 9-11 сут. методом титрования по бляшкам при монослойном способе культивирования. На первом пассаже культивирования вируса, при использовании в качестве заражающего материала гомогената печени зеленых мартышек, критическим фактором оказалась множественность заражения: повышение ее значений более 0,0001-0,001 БОЕ/клетку приводило к преждевременной дегенерации монослоя и гибели клеток. Из исследованных клеточных культур наиболее высокий уровень накопления вируса Эбола получили в клетках, являющихся дериватами тканей человека и обезьян, табл 2.

Для дальнейших исследований выбрали клеточные линии Еб и Vero, которые, во-первых, обеспечивали высокий уровень накопления (свыше 10>; БОЕ/мл при множественности заражения от 0,0001 до 10 БОЕ/кл) и, во-вторых, уровень накопления вируса Эбола в этих клетках после выхода кинетической кривой на плато (4-8 сутки в зависимости от множественности заражения) является устойчивым и дает стабильный урожай вируса в указанные сроки.

Клеточные линии Е6 и Vero использовали в дальнейшем для препаративного культивирования вируса Эбола в ферментере с применением микроносителей. Сравнительный анализ динамики накопления вируса при его репродукции в условиях стационарного монослоя и на микроносителях показал, что в системе с применением микроносителей выход вируса Эбола с 1 мл культу-ральной жидкости на 0,5-1,0 lg БОЕ/мл выше (Р<0.05).

Таблица 2.

Накопление вируса Эбола в различных клеточных культурах при монослойном способе кул ьтивиров ания.

Наименован ие клеточной культуры Максимальный титр вируса, БОЕ/мл и время его достижения (сут)

1 пассаж вируса Последующие пассажи

Vero 106 (7-8) 1065 (4-5)

Е6 106 5(5-6) 107 (4-5)

BGM +/-

4647 106 (7-8)

FRhK-4 105 (7-8)

GMK 106 (5-6) 107 (3-4)

CV-1 105 (5-6) 10 6 5 (4-5)

BHK-21 (cl3) 103 (3-4)

ЛЭЧ 103 (3-4)

A. aegypty 0

A. albopictus 0

MRC-5 105 (7)

JI-68 105 (4-5) 106 (4-5)

Для экспериментального обоснования возможности получения однородного вирусного материала в препаративных количествах провели 5 последовательных пассажей вируса Эбола в 2-литровом ферментере на микроносителях «Цитодекс» с оценкой инфекционной активности в процессе каждого пассажа, табл. 3.

Полученный вирусный материал 1 и 5 пассажей, собранный через 7 сут культивирования, в дальнейшем был подвергнут расширенному сравнительному анализу. Сравнение проводили по следующим параметрам:

1) количество бляшкообразующих единиц в 1 мл суспензии

БОЕ/мл);

2) количество инфекционных единиц в 1 мл суспензии (-1£ ЛД50/мл для мышей-сосунков при интрацеребральном заражении и ЛД50/мл для макак-резусов при подкожном заражении);

3) количество физических частиц (вирионов) в 1 мл суспензии -абсолютные величины;

4) содержание вирусных частиц тороидной формы от общего числа вирионов (в %).

В табл. 4 представлены сравнительные данные инфекционной активности вирусных пулов 1 и 5 пассажей по ряду характеристик, перечисленных выше.

Приведенные данные позволяют сделать заключение о том, что в течение 5 пассажей в ферментере вирусный пул существенно не изменяет своих показателей ни по одному из анализируемых параметров: БОЕ/мл, времени достижения максимальной концентрации вируса, патогенности для мышей-

2 1

ю ьо

Таблица 3

Накопление вируса Эбола при культивировании в клетках Е6 (клонУего) в 2- литровом ферментере на 1 и 5 пассажах БОЕ/мл).

Пассаж Опыт Время культивирования , сут

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 1 2,07±0,30 0 3,14+0,08 3,47+0,15 3,60±0,15 4,12+0,08 5,25+0,07 5,99+0,14 5,84+0,10 6,61 ±0,04

пассаж 2 2,17+0,20 0 3,17+0,07 3,47+0,15 3,64+0,12 4,24+0,07 4,57+0,14 5,98+0,09 6,09 ±0,08 6,22+0,07

3 1,79+0,42 0 3,15+0,07 3,40±0,20 3,58+0,15 4,18+0,08 5,17±0,07 6,02+0,10 5,90+0,09 6,57+0,05

4 1,97+0,24 0 3,19+0,07 3,49+0,15 3,57±0,14 4,25±0,06 4,60+0,13 5,99+0,09 6,14+0,08 6,33+0,06

5 1 4,40+0,06 4,21 ±0,07 4,83+0,11 5,70±0,11 6,37+0,07 6,53+0,05 6,49+0,05 6,37+0,06 6,42+0,05 _

пассаж 2 4,36±0,16 4,34+0,10 5,49+0,05 6,24±0,07 6,31+0,07 6,49+0,05 6,41+0,05 6,38+0,06 6,51 ±0,05 _

3 4,25+0,08 4,38+0,16 5,13+0,08 5,65+0,13 6,08+0,08 6,22±0,07 6,34±0,06 6,40+0,05 6,46+0,06 _

4 4,58±0,07 4,38+0,06 5,33+0,06 5,85±0,12 6,10+0,08 6,35+0,06 6,45±0,06 6,40+0,07 6,22+0,07 -

Примечание: прочерк в таблице означает, что исследование не проводили.

Таблица 4

Сравнение свойств вирусных пулов 1 и 5 пассажей.

Пассаж Опыт БОЕ/мл ЛД5й/мл мыши-сосунки -1г ЛД5П/мл макаки-резус физ. титр % тороидов

1 пассаж 1 6,02 7,39 8,29 8,69 16

2 5,99 7,17 8,07 _ _

5 пассаж 1 6,39 7,48 8,17 8,86 52

2 6,40 7,62 — 8,91 —

Примечание: прочерк в таблице означает, что исследование не проводили.

Таблица 5

Физический титр вируса Эбола в культуральной жидкости при культивировании на

микроносителях.

Номер пассажа Время после заражения, сутки

3 4 5 6 7 8 9

1 __ _ _ _ 4,9Х108 6,2х10а 8,0х10а

2 _ 1,6Х108 8,5Х108 1,1х109 1,5Х109 2,0Х109 2,0Х109

3 6,6Х107 7,0Х107 2,1х10а 8,3Х108 8,1х108 7,1х108 1,2Х109

4 _ _ 5,6Х108 1ДХ109 1,3Х109 9,7Х108 1,5Х109

5 - 1,5Х108 3,1х108 4,3Х108 7,2Х108 1,1х109 —

со со

Примечание: прочерк в таблице означает, что исследование не проводили.

сосунков, концентрации физических частиц, процентное содержание тороидных форм (колбовидные частицы), возрастает по мере культивирования и составляет на разных пассажах 16-52 % от общего числа вирионов.

При сравнении патогенности для макак-резусов культу-рального вируса с «исходным» вирусным материалом (гомогенат печени зеленых мартышек - инфекционный титр 8,5±0,7 ЛД50/мл) при подкожном заражении можно отметить сохранение патогенности на прежнем уровне.

Электронно-микроскопический анализ репродукции вируса Эбола в клеточных культурах. Методами трансмиссионной электронной микроскопии исследовали культуру клеток Vero на микроносителях, инфицированную вирусом Эбола при пассировании его в данной системе. На ультратонких срезах изучали морфологию клеток и особенности репродукции вируса Эбола в них при культивировании на микроносителях. Кроме того, методом негативного контрастирования исследовали вируссодержащую жидкость. При этом осуществляли подсчет физического титра вируса (используя суспензию латекса известной концентрации) и оценивали количественное соотношение его различных морфологических форм.

Установлено, что использование техники культивирования клеток на микроносителях заметно не отражается на морфологии культивируемых клеток и на особенностях репродукции вируса Эбола в них. Морфогенез вируса Эбола существенно не отличается от описанного для клеток JI-68 и Vero при обычном монослойном культивировании. Свободный вирус в культу-24

ральной жидкости представлен различными морфологическими формами. Основную массу вирионов составляют линейные и тороидные (колбовидные) частицы.

Величина физического титра вируса Эбола в разных пробах культуральной жидкости, отобранных в процессе культивирования его в клетках, растущих на микроносителях, приведена в табл. 5.

В качестве альтернативных методов для накопления вируса Эбола были предприняты попытки его суспензионного культивирования в 2 литровом ферментере с использованием клеток ВНК-21 (с13), ЛЭЧ и HeLa в качестве субстрата, однако уровень репродукции вируса в этих условиях был крайне низким и титры не превышали 103-103 5 БОЕ/мл.

Электронно-микроскопические фотографии очищенного вируса Эбола, приведенные на рис. 7, отражают характерные черты морфологии филовирусов, описанные в литературе, кроме того, проведенное исследование показало также хорошую сохранность вирусных частиц в процессе очистки.

Полученные в результате очистки вирусные препараты были исследованы методом электрофореза белков в нолиакрила-мидном геле. Результаты анализа белкового состава вирусных препаратов показали, что основными белками вируса являются белки с молекулярной массой 125, 104, 40, 35, 30 и 24 кДа, что соответствует данным, полученным L.H.Elliott и M.P.Kiley с сотрудниками (1985). Чистота вирусных препаратов по данным электрофореза белков в полиакриламидном геле составила 90-95% (при визуальной оценке), выход по белку - около 1-3 мг

25

Рис. 7. Негативно окрашенный препарат вируса Эбола, очищенного в градиенте плотности сахарозы. Увеличение 37 ООО.

с 1 л вируссодержащей культуральной жидкости.

Таким образом, анализ результатов, полученных благодаря применению разработанного способа культивирования вируса Эбола в чувствительных клеточных культурах на микроносителях и проведенной процедуры очистки показал высокую производительность и эффективность применяемого метода. Способ может быть использован для получения препаративных количеств вирусных белков и РНК с целью приготовления инактивированных вакцин, иммунизации животных, иммуно-ферментного анализа, а также молекулярно-биологических исследований и разработки в дальнейшем надежных средств диагностики, профилактики и лечения этой инфекции. 26

выводы.

1. Изучена динамика накопления вируса Эбола (субтип Заир) в 13 клеточных культурах разного происхождения. Показано, что наиболее чувствительны к вирусу Эбола клетки Vero и Е6 (клон Vero). Биологическая активность вируса в этих культурах клеток достигает значений 6,02-6,40 (-lg БОЕ/мл). Патогенность вируса, оцененная по величине (-lg ЛД50/мл) для чувствительных животных составляет 7,17-7,62 (мыши-сосунки) и 8,07-8,29 (макаки-резус) и не изменяется с пассажами.

2. Предложен и разработан способ управляемого культивирования клеток Vero и Е6 (клон Vero) на микроносителях, позволяющий получать высокую плотность клеток и урожай вируса, достигающий значений 1-3 мг с 1 л культуральной жидкости.

3. Разработаны условия выращивания культур клеток на микроносителях в 2-х и 12-литровых ферментерах. Установлено, что наиболее важными факторами, влияющими на выход клеток, являются следующие:

- поддержание объемного коэффициента массопередачи С02 в диапазоне (0,4-0,6)хчл в течение цикла культивирования;

- аэрация поверхностным способом с расходом 1-4 литра воздуха на литр культуральной среды в час;

- поддержание рН в интервале 7,2±0,2 полуавтоматическим способом.

4. Проведенное электронно-микроскопическое исследование показало, что при культивировании вируса Эбола в клетках на микроносителях физический титр вирусных частиц в культу -

ральной жидкости составил 8,0х108-1,5х109, а в препаратах, подвергнутых очистке, до 10й частиц в 1 мл.

Методом электрофореза белков в полиакриламидном геле в очищенных вирусных препаратах выявлен набор белковых фракций, соответствующий мажорным белкам вируса Эбола, описанным в литературе (104, 40, 35, 30, 24 кДа), чистота препаратов при визуальной оценке составила 90-95 %.

5. Показано, что последовательное пассирование вируса в клетках Vero на микроносителях не приводит к снижению вирус-продукции, к изменению патогенности вируса и морфологии вирионов на протяжении пяти пассажей, морфогенез вируса Эбола при его размножении в чувствительных клетках на микроносителях не отличается от описанного для клеток Vero и JI-68 при обычном монослойном культивировании.

6. В результате проведенной работы продемонстрирована возможность получения препаративных количеств очищенного вируса Эбола, необходимых для разработки подходов к созданию инактивированных вакцин против этой инфекции, получения препаративных количеств иммуноглобулинов из крови крупных лабораторных животных, а также для развития молекулярно-биологических методов изучения филовирусов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ:

1. В.Я.Тихонов, А.Н.Котов. Патент 6С12 N 7/00 «Способ суспензионного культивирования филовирусов в клеточных культурах на микроносителях». Приоритет изобретения от 21.10.93. Решение о выдаче патента от 14.04.95.

2. В.Я.Тихонов, А.Н.Котов, В.Е.Волчков, А.А.Гражданцева, Ю.Н.Рассадкин, В.К.Ткачев, А.А.Чепурнов. Получение препаратов вируса Эбола на клеточных культурах в препаративных количествах.// «Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекций.» Сборник материалов межведомственной конференции. Тезисы докладов. - Кольцово. -1993. -С.9.

3. V.E.Volclikov, V.M.Blinov, A.N.Kotov, A.A.Cliepurnov, S.V.Netesov. The full-length nucleotide sequence of the Ebola virus. //IXth International Congress of Virology, Glasgow, Scotland, 813 August 1993, P52-2.

4. V.E.Volchkov, A.A.Chepurnov, S.A.Dryga, S.Becker, V.M.Blinov, A.N.Kotov, H.D.Klenk, S.V.Netesov. Molecular characterization of a pathogenicity variant of Ebola virus. //Ninth International Conference of Negative Strand Viruses. Estoril, Portugal, 2-7 October, 1994, p.176.

5. V.Y.Tikhonov, A.N.Kotov, Y.N.Rassadkin, A.A.Grazhdantseva, E.I.Ryabchicova, V.K.Tkachev, V.E.Volchkov, A.A.Chepurnov. The large scale cultivation of Ebola virus in microcarrier cell culture. / /Vllth International Conference of Comparative and Applied Virology. Montreal, Quebec, Canada, 12-17 October, 1994, P4-52.

6. V.E.Volchkov, S.Becker, V.A.Volchkova, V.A.Ternovoj, A.N.Kotov, S.V.Netesov, H.-D.Klenk. GP mRNA of Ebola Virus Is Edited by the Ebola Virus Polymerase and by T7 and Vaccinia Virus Polymerases. // Virology. - 1995. -Vol.214. -P.421-430.