Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование особенностей взаимодействия клетка-субстрат в условиях псевдосуспензионного культивирования
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика
Автореферат диссертации по теме "Исследование особенностей взаимодействия клетка-субстрат в условиях псевдосуспензионного культивирования"
РГ6 од
российская академия наук
1 и ИНСТ^УТ| ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОФИЗИКИ
На правах рукописи
СМИРНОВ СЕРГЕИ ВАСИЛЬЕВИЧ
удк 576.535.5'53э + 57.085.23
ИССЛЕДОВАНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КЛЕТКА-СУБСТРАТ В УСЛОВИЯХ ПСЕВДОСУСПЕНЗИОННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
03.00.02 - Биофизика
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
ПУЩИНО - 1993
Работа выполнена в лаборатории процессов и аппаратуры культивирования клеток Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.
Научные руководители: доктор технических наук, профессор Э.И.Лежнев, кандидат физико-математических наук А.А.Кудрявцев.
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Ю.В.Евтодиенко, кандидат биологических наук Ю.А.Манцыгин.
Ведущая организация: Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, Москва.
Защита диссертации состоится "_"___1993 г.
в _ часов на заседании специализированного совета Д 200.22.01
в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142292 г. Пущино, Московской области.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.
Автореферат разослан __1993 г.
Ученый секретарь Специализированного совета
кандидат биологических наук П.А. Нелипович
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальгость^аботы. В настоящее время культуры клеток животных и человека находят все более широкое применение в медицине и сельском хозяйстве для получения биологически активных веществ, вирусных вакцин, моноклональных антител и др.. Это делает атуальным задачу крупномасштабного выращивания клеточных культур. Существует два принципиальных способа культивирования клеток животных и человека in vitro: монослойное и суспензионное культивирование. Суспензионные культуры наиболее эффективны с точки зрения крупномасштабного культивирования, однако их использование весьма ограничено из-за трансформированное ти большинства клеточных линий растущих в суспензии. Традиционные способы выращивания поверхностно-зависимых культур весьма трудоемки и малоэффективны, что связано в основном с низким отношением поверхности роста к обьему питательной среда и значительной гетерогенностью условий роста клеток.
Использование микроносителей является перспективным способом крупномасштабного культивирования клеток, т.к. позволяет в условиях суспензии выращивать поверхностно-зависимые клеточные культуры. Принцип метода заключается в том, что клетки прикрепляются и растут на поверхности микрочастиц сферической формы (микроносителях), которые поддерживаются в суспензии с помощью перемешивания. Способ позволяет увеличить удельную поверхность роста до (15-30)"см-1,что решает вопрос о построении компактных реакторов большой производительности.
Переход на микроносители, однако, часто приводит к значительному снижению урожая клеток ( до 2-2.5 раз) [Butler et al.,1982] по сравнению с культивированием на макроповерхности (в расчете на единицу затраченной среды). Несомненно, что первоначальная причина этого эффекта - дискретность субстрата. Однако, конкретный механизм его во многом невыяснен. Поэтому следует считать, что применение микроносителей пока что не решило проблемы крупномасштабного культивирования поверхностно зависимых клеток. Увеличение эффективности этого метода связано с необходимостью дальнейшего изучения особенностей культур клеток на микроносителях.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение влияния условий культивирования - режима прикрепления, типа и концентрации микроносителей- на кинетику и эффективность роста клеточных культур на микроносителях. Были сформулированы следующие задачи:
I. Изучение процессов прикрепления клеток к поверхности микроносителей различных типов при разных режимах перемешивания и составе пита-
тельной среды.
2. Выяснение причин возникновения и влияния на клеточный рост неравномерности начального распределения клеток на микроносителях. 3 Исследование кинетики роста клеточной популяции при культивировании на микроносителях разных типов.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА.1Шроведено исследование кинетики процесса прикрепления фибробластов китайского хомяка к различным типам микроносителей в режиме периодического перемешивания и осаждения. Впервые показано наличие интервала времени, необходимого для необратимого прикрепления клеток к поверхности микроносителей, величина которого существенно зависит от типа микроносителя, условий перемешивания и присутствия в среде сыворотки. 2) Выявлено существование зависимости неравномерности начального распределения клеток на микроносителях от параметров режима прикрепления. Исследовано влияние неравномерности распределения клеток по микроносителям на кинетику роста, конечный урожай и распределение клеток по фазам клеточного цикла, з) Методом проточной цитометрии проведено сравнительное исследование кинетики роста клеточных популяций на разных типах микроносителей и определены длительности отдельных фаз клеточного цикла (на стадии логарифмического роста). Впервые показано, что не только кинетика роста, но и длительность всех фаз клеточого. цикла (включая Б фазу)могут в значительной степени определяться типом микроносителей.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Предложена методика оценки адгезивных качеств микроносителей. Получены данные о величине "мертвого времени", необходимого для полного пржрепления клеток к поверхности микроносителей, которые позволяет оптимизировать начальный этап процесса культивирования клеток на микроносителях. Результаты изучения влияния неравномерности начального распределения клеток по микроносителям на дальнейший ход процесса культивирования могут быть использованы при прогнозировании эффективности выбранных режимов культивирования клеток на микроносителях. Данные изучения кинетики роста клеточных культур на разных типа?, микроносителей могут быть учтены при создании и' выборэ микроносителей с максимальной продуктивностью для данной культуры клеток.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 12 работ. Основные результаты работы были представлены и доложены на XI Всесоюзно совещании "Культивирование клеток животных и человека"(Пущино,1985), на конференции молодых ученых и специалистов НЦбИ "Приборное оснащение и автоматизация экспериментальных исследований в области биотехнологии"(Пущино, 1986), на III Всесоюзном совещании "Культивирование клеток животных и .человека" (Пущино,1990).
СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственного экспериментального материала, обсуждения результатов, в ыводов и списка литературы ( наименований из них иностранных). Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит рисунка и таблиц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Работу проводили на следующих культурах клеток: BHK-2I клон 13, фибробласты китайского хомяка (линия B-ll-d-ii-FAF-28, штам 431), Raji; клетки культивироваали на средах Игла с двойным набором аминокислот, смеси сред Игла и 199 (1:1) и RPMI-1640, соответственно, с добавлением ЮЯ5 сыворотки крупного рогатого скота. Снимали клетки смесью трипсина и версена (1:1). Посадочная концентрация в среднем составляла 6-8*104кл/мл.
В работе использовали следующие микроносители: Cytolar 1, Cyto-1агЗ (НПО Biolar, batvia); Cytodexl, Cytodex3 (Pharmacia Fine Ch.); Сополимер стирола с дивинилбензолом - ССДВБ (Биохимреактив, г.Черкассы ), модифицированный сульфированием -с и немодифицированный -н; Ферромагнетик (ИБХ, РАМН). Концентрация микроносителей разных типов выбиралась таким образом, чтобы обеспечивалось равенство площадей ростовых поверхностей.
Для проведения экспериментов была разработана система "Мультипликатор", основой для которой послужил культиватор типа "Пульсатор"[Казаков 1983] с пневмогвдравлическим способом перемешивания.
Система включает в себя следующие блоки (рис.1): 1.семь биореакторов типа "Пульсатор" (обьем одного биореактора -ЮОмл); 2. пневмогенера-тор; 3. система подачи и контроля газовой смеси (воздух-С02); 4. устройство для отбора проб; 5. термостатирующий блок. Данная система позволяет одновременно проводить и изучать несколько (до семи) процессов культивирования клеток на микроносителях. Внутренние поверхности биореакторов силиконизировали для предьотвращения прилипания клеток и микроносителей.
Подсчет клеток производили либо на гемоцитометре либо с помощью счетчика клеток "Cellosoop"(Ljundberg,Sweden). Жизнеспособность определяли по исключению трипанового синего [Sanford 1951]. Клоноген-ную способность культуры оценивали стандартным методом [Пол,1963]. Начальное распределение клеток по микроносителям определяли подсчетом клеток на частице под микроскопом.
Кинетику прикрепления клеток к поверхности микроносителей оценивали по убыли клеток из среды. По окончании процесса прикрепления (через 6-8часов), в качестве контроля, определяли количество клеток на микроноситлях.
ДНК-специфическую окраску клеток (концентрация 106кл/мл) проводили в течении 15 мин в фосфатном буферном растворе (pH 7.2), содержащем I мкг/мл Hoehst-33258 (Н-33258, Serva PRO).
Гистограммы клеточных популяций по содержанию ДНК получали на проточном цитофлюориметре ICP-22 (Ortho Instruments). Длительности отдельных фаз клеточного цикла расчитывали по относительной их населенности.
ОСНОВНЫЕ РАЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ. 1.Прикрепление клеток к поверхности микроносителей.
Существует два способа прикрепления клеток к микроносителям: непрерывное перемешивание суспензии клеток и микроносителей и периодическое перемешивание с осаждением клеток на слой микроносителей. Выбор между ниш определяется взаимной адгезивностью культуры клеток и микроносителей. В связи с этим, сравнительное изучение кинетики прикрепления клеток к микроносителям в разных рекимах представляется весьма необходимым.
Исследоваще_:^етага_11рищещетя_1«ето^ лям_в^егаме_нецрерышого_перемещтащ1я
На рис.2 представлена логарифмические зависимости убыли числа клеток из среды (за счет их прикрепления к микроносителям) от време-
0 12 3 4 5
млн. кл.
ВО + 2
60 л
40
20 /
/ п,___ П о
часы
рис.2.Кинетика прикрепления фиб-роблаетов хомяка при постоянном перемешивании к 4 типам микрокод сителей. 1- Су1;о(1ех1, 2- Су^о-йехЗ, 3- Сз^о1аг1, 4- Су1;о1агЗ. По оси ординат: логарифм числа клеток в среде. По оси абсцисс время процесса прикрепления.
рис.З.Рост фибробластов хомяка на микроносителях при постоянном перемешивании от начала культивирования. 1 )- Су1;ос1ех1 ; 2)- 0у1;ос1ехЗ; 3)- СуЬо1аг1 ; 4)- СуМагЗ. По оси абсцисс: время культивирования. По оси ординат: общее число клеток в биореакторе.
ни процесса прикрепления Клеток к микроносителям 4х типов в режиме непрерывного перемешивания культуры. Высокую скорость прикрепления показали микроносители 2х типов - СуЬойех 1, Су1;ос1ех 3. Эффективность прикрепления клеток к этим микроносителям составила за первые 5 часов Солее 90%. За этот же период к микроносителям типа Су1:о1аг1 прикрепилось 40% клеток и только 20% в случае микроносителей Су1ю1агЗ.
На-рис.3 представлены кривые роста данных культур клеток. Видно, что микроносители показавшие высокую эффективность прикрепления обеспечили также наибольший рост клеток по сравнению микроносителями, имеющими низкую адгезивность. Отметим также, что в первые 24-48 часов процесса культивирования во всех культурах сохранялся некотрый уровень неприкрепившихся клеток.
Низкая эффективность прикрепления клеток к некоторым типам микроносителей при непрерывном перемешивании заставляет применять режим прикрепления с использованием периодического перемешивания и осаждения. Однако, закономерности данного режима изучены недостаточно.
Развитие___методических___подходов___для___исследования___кинетики
пржреплеотя_клеток_к_повершости_ш^ ческогд_перемешвания/осащения.
На рис.4 показана кривая изменения числа клеток на микроносите-
лях (1 ) в зависимости от времени процесса прикрепления при постоянном интервале между перемешиваниями. Считается, что подобные кривые описывают кинетику адгезии клеток к поверхности [Reuveny et al. 1983, Mai et al. 1994]. Однако, можно показать, что это не совсем так: поскольку при отборе пробы для получения очередной точки кривой культуру перемешивают, то в этом случае, клетки, не прикрепившиеся к микроносителям за время осаждения поступают в среду и начинают процесс прикрепления заново в очередном интервале осаждения. В результате имеет место следующее соотношение":
Ы= Ы0(1 -(1 - I)s); ' (1 )
где Nq- начальная концентрация клеток; N - концентрация клеток в среде после S циклов осаждения-перемешивания; I - относительное число клеток прикрепившихся за один цикл. Построение графика в логарифмических координатах (кривая 2) показывает, что эти данные (кривая 1) удовлетворяют соотношению 1. Это означает, что вся кривая (1) описывающая процесс прикрепления клеток к поверхности микроносителей задается одной величиной - "I"(относительное число клеток, прикрепившихся на отрезке времени- между перемешиваниями). Таким образом, чтобы получить полные кинетические кривые, характеризующие процесс прикрепления клеток к микроносителям в режиме
перемешивание/осаждение необходимо изменять промежутки между перемешивания, т. е. время осаждения и определять величину "I". При "этом длительность перемешивания выбирается так, чтобы обеспечить полный выход неприкрепившихся клеток с поверхности микроносителей. ■ Этот параметр во-многом определяется конструктивными особенностями перемешивающегося устройства. В нашем случае, достаточно было 60 сек, чтобы практически все неприкрепившиеся клетки за этот промежуток времени выходили в культуральную среду.
Кщ|ет1жа_1тр^епления__фибробластов__китайского__хомяка__к__разным
тшам_микроносителей.
На рис.5 показаны полные графики зависимостей, описывающие процесс прикрепления клеток к нескольким типам микроносителей. Видно, что кинетические кривые в случае микроносителей типа cytolari,3 и ССДВб(с) отсекая на оси абсцисс отрезок времени больший нуля. Более подробное изучение кинетики взаимодействия клетка-субстрат при временах меньших величины этого отрезка показало, что для необратимого прикрепления клеток к поверхности микроносителей необходимо некоторое время контакта между клеткой и субстратом, в течении которого развивается некий процесс, ведущий к увеличению силы при- крепления. Причем величина отсекаемого отрезка и, тем самым, времени контакта
рис.4.Кривая прикрепления клеток ток к микроносителям.1- обычная кривая, 2- логарифм числа клеток на микроносителях.
рис.5.Кинетика прикрепления фибро-бластов к разным типам микроноси-: телей. 1- Су1;о<1ех1 ; 2- Су1;о<1ехЗ; 3- Су^1аг1 ; 4- Су1;о1агЗ;5-ССДВБс. По оси абсцисс: частота перемешивания культуры, по оси ординат: доля прикрепившихся клеток.
("мертвое" время) варьирует в зависимости от типа микроносителей, т.е. физико-химических свойств поверхности.
Согласно рис.5, в случае микроносителей типа Сукойех 1, 3 кри вые пересекают ось абсцисс в области значений меньше нуля, что свидетельствует о том,что прикрепление данных клеток осуществляется практически мгновенно и, как следствие, может.происходить при непрерывном перемешивании культуры, как это и было показано ранее.
Вжяше_на_ктетж^_щ)жрепле1шя_клетдк __сыворотки
и_сида_гидродша?^ескдгд_воззействия.
Известно, что роль сыворотки на этапе прикрепления клеток определяется наличием в ней факторов адгезии [Сг11Г1^з1986]. Однако, результаты ряда авторов говорят о обратном эффекте сыворотки на прикрепление клеток [Нхшез а1. 1987, вауег et а1. 1987]. На примере микроносителей Су1;о1ар1, нами также было показано (рис.6), что присутствие в среде сыворотки снижает скорость прикрепления клеток к поверхности микроносителей: в среде не содержащей сыворотку величина "мертвого" времени была существенно меньше чем в случае с сывороткой. Возможное объяснение этого эффекта состоит в том, что сыворотка может "маскировать" (экранировать) места связывания на поверхности микроносителя.
К*)
20
15 1 / У / 2/
10 / / у / /У ъУ,
5 /у MUH
То 15 20 2ЕГ
рис.6.Влияние сыворотки на кине- рис.Т.Влияние гидродинамичексих тику прикрепления фибробластов к сил на кинетику прикрепления фиб-микроносителям типа Cytolarl.. робластов к микроносителям Cyto-Обозначения те же, что и к рис.5 1аг1. Зазор: 1) -5мм; 2) -Змм;
3) -2мм; 4) -1мм. Обозначения те же, что и к рис.5
Силы гидродинамического воздействия, возникающие при перемешивании являются одними из лимитирующих' факторов культур клеток на микроносителях. Влияние этого фактора может проявляться на всех эта пах процесса культивирования клеток на микроносителях и, как было показано [Туо et al 1981], на этапе прикрепления клетки особенно чувствительны к его действию. Для изучения влияния гидродинамического воздействия на кинетику прикрепления клеток к микроносителям, мы изменяли зазор между дном биореактора и внутренним стаканом от 1мм до 5мм, получая разные скорости потока среды в зазоре. Результаты изучения зависимости кинетики прикрепления клеток от силы гидродинамического воздействия представлены на рис.7. Видно, что увеличение силового воздействия приводило к возрастанию величины "мертвого" времени и уменьшению угла наклона кривой кинетики процесса прикрепления.
Таким образом, полученные результаты позволяют считать, что после возникновения контакта клетка-микроноситель развивается некоторый процесс, в результате которого увеличивается сила прикрепления клетки к поверхности. По литературным данным (Либерман 1972, Sugimo-to et al.1981, Bell et al. 1984, Белинцев 1988) таким процессом может быть, например, уменьшение расстояния клетка- микроноситель, изменение формы клетки, перераспределения каких-либо структур на поверхности клетки - аккумуляцией рецепторов в зоне контакта и др.. Скорость этого процесса для данной клеточной популяции зависит от типа субстрата, а также окружающих условий. Благодаря этому процес-
су, в наших реакторах при зазоре в 2 мм 100% вероятность - прикрепления клеток достигалась для Cytolari за ~1.5мин, Cytolar3 - ~2.5мин и ССДВБ -~5мин. В случае микроносителей Cytodexi и Cytodex3 этот процесс протекает практически мгновенно. Тем самым, представленные результаты позволяют сделать оптимальный выбор условий процесса прикрепления данной культуры клеток на микроносителях.
2.Изучение влияния гетерогенности начального распределения клеток по микроносителям на рост клеток в культуре на микроносителях.
Отличительная особенность культур клеток на микроносителях состоит в том, что рост клеток происходит на дискретном субстрате, в результате чего, на начальном этапе важно не только прикрепить клетки к поверхности микроносителей, но и добиться более-менее равномерного их распределения по частицам. В работах Butler et а1[1982] Hu et а1[1985] проведен анализ зависимости распределения клеток по микроносителям относительно таких параметров как концентрация и размер микроносителей, начальная концентрация клеток. Отметим, что прикрепление клеток, в этих случаях, происходило в условиях непрерывного перемешивания. Принимая во внимание тот факт, что иногда желательно и необходимо использование на этапе прикрепления режима периодического перемешивания и осаждения, нам представляется не менее интерес-гам подробное изучение неравномерности распределения клеток по микроносителям относительно условий прикрепления и влияния ее на клето-таую пролиферацию.
Неоднородность начального распределения клеток по микроносителям уценивали величиной коэффициента вариации (к.в.):
K.B.=D/n,
пде D-дисперсия распределения, n-среднее число клеток на микроноситель.
Используя разные.частоты режима периодического перемешивания и зсаждения на этапе прикрепления клеток к микроносителям были получе-ш культуры с различными значениями неравномерности начального распределения клеток по микроносителям. На рис.а,9 и в табл.1 представ-тены результаты роста клеток на микроносителях Cytolar 1 при трех шачениях гетерогенности начального распределения клеток по микроно-жгелям. Анализ кривых роста клеток показывает, во-первых, что длительность лаг-периода во всех трех культурах одинакова и экспоненци-игьный (логарифмический) рост начинается практически одновременно; ю-вторых, длительность фазы логарифмического роста зависит от нера-
МЛН.КЛ.
ВО
60 /Г—-1.3
40 J \-2.1
20 ß часы
10
0 20 40 60 80 о 20 40 60 80
рис.8. Рост культуры фибробластов рис.9. Изменение величин фаз
китайского хомяка при разных зна- клеточного цикла в процессе роста
чениях неравномерности начального при разных значениях неравномерно-
распределения клеток по микроно- сти распределения клеток по микро-
сителям типа Cytolarl. К.В.-коэф- носителям. По оси ординат: число
фициент вариации. Обозначения те клеток {%) в G1, G2/M фазах, же, что и к рис.3
Таблица 1.Зависимость клеточного роста от' неравномерности ______________начального_расщ>еделения_кл^
К. .в. т N %
0. .6 20 36 9.4 91 90
1. .3 20 30 9.4 72 90
г. .1 20 20 9.4 50 75
К.В.- коэффициент вариации; 1;(лаг),(ехр) -длительность лаг-периода и экспоненциальной фаз роста (часы); I - время удвоения (часы); Ы- урожай клеток (млн.кл.); % - жизнеспособные клетки.
вномерности распределения - чем больше неравномерность начального распределения клеток по микроносителям, тем короче фаза экспоненциального роста, ниже урожай и жизнеспособность клеток.
Ранее Ни а1.[1985] предложили модель, описывающую поведение клеток в культуре на микроносителях. Модель состоит в том, что для нормального роста требуется определенный уровень числа клеток на частицу; на микроносителях с числом клеток меньше этого уровня рост отсутствует. Результаты наших исследований позволяют говорить об отсутствии либо незначительном проявлении данного механизма, о чем свидетельствует одинаковая длительность лаг-фазы и одновременное вступление в фазу экспоненциального роста культур клеток с разной
величиной неравномерности распределения (рис.8,9).
С учетом данных проточной цитометрии нами был предположен другой механизм влияния неравномерности начального распределения клеток на ход процесса культивирования, который состоит в том, что в культуре с высоким значением гетерогенности распределения одна часть шкроносителей быстро обрастает клетками, в результате чего клетки эстанавливаются в росте либо сильно задерживаются - о чем свидетельствует возрастание количества клеток в 01-фазе. При этом они продолжают потреблять питательную среду и/или выделять какой-либо инги-5итор роста, изменяя тем самым условия существования данной культуры клеток, что в конечном итоге ведет к снижению урожая клеток. Как известно, например, при высокой посадочной концентрации инокулята юдобное снижение длительности логарифмического роста монослойных культур наблюдается за счет лимитирования ростовой поверхности и/или Зыстром истощении питательной среды и накоплении ростингибируицих факторов,.
Сравнение экспериментальных результатов (рис. 8) с расчетами на эснове предлагаемой модели показало, что если эффект снижения урожая клеток объяснять только потреблением питательной среды покоящимися клетками, то покоящиеся клетки должны потреблять питательную среду в 1.5-2 раза быстрее размножающихся клеток. Эта цифра может быть мень-пе, если имеет место ингибирование пролиферации покоящимися клетка-ли. Однако, эта сторона вопроса подробно не изучалась.
Как показывают модельные расчеты, результат которых представлен ia рис.ю, само по себе увеличение общей удельной ростовой поверхности дискретного субстрата повышением концентрации микроносителей не зедет к значительному увеличению урожая клеток, если гетерогенность мчального распределения клеток по микроносителям велика. К тому же, цаже при минимально возможной гетерогенности рспределения, для полугнил максимального урожая клеток необходимо общую поверхность субстрата увеличить в 1.5-2 раза по сравнению с той, которая нужна для размещения клеток на макроповерхности. Однако как было показано экс-юриментально (рис.12) значительное увеличение количества микроносителей может приводить к отрицательным эффектам и снижению урожая, которые могут быть связаны с токсичностью микроносителей за счет зорбции ими питательной среды либо с неблагоприятным гидродинамическими условиями окружения[Croughan 1989, Sherry et al. 1989].
Согласно предлагаемой модели изменение условий культивирования, леняющее начальное распределение клеток по микроносителям ведет к вменению урожая клеток. В частности, при использовании режима пере-лешивания/осаждения все микроносители ложатся на дно культиватора.
э<(кректи6ность роста * .100
от носит ельная площадь субстрата
О 0.2 0.6 1.0 1.4
эффектиЬность роста к а
. \ —__ . б
.60 \ "ч. Ь
40
.20 число слоеЬ микроносителей
10
15 20
рис.10. Влияние поверхности дискретного субстрата на относительный урожай клеток, а) прикрепление при непрерывном перемешивании к.в. =0.27; б),в),г) прикрепление в режиме осаждение- перемешивание, к.в.- 0.6; 1.3; 2.1. Единица по оси абсцисс соответствует поверхности, достаточной для размещения 1.9 Ю клеток. Пунктирная линия - рост на макроповерхности
рис.11. Влияние формы биореактор на эффективность культивирова ния.а) прикрепление при непрерыв ном перемешивании ; б),в),г) при крепление в режиме осаждение/перемешивание: б - перемешивание через 15мин; в -60мин; г без пе ремешивания. Среднее число слоев на дне для данных биореакторов равнялось 10.
При изменении формы культиватора меняется площадь дна и число слоев микроносителей на нем. Это меняет распределение клеток по микроносителям и как следствие урожай- клеток.
На рис.11 показано влияние
млн.кл.
60
50 /"V10д/1
40
30
20 // 40д/1
ю /а /У—°80д/1
часы _--
этоого эффекта. Как видно, для получения большего урожая клеток необходимо использование сосудов с более широким дном, чтобы микроносители располагались на нем меньшим числом слоев. Однако, это практически не возможно, т.к. противоречит цели применения микроносителей - увеличение удельной поверхности субстрата.
20 40 60
рис.12. Рост клеток при различных концентрациях микроносителей типа Су1;о1аг1 . Обозначения те же, что и к рис.3.
Модельные расчеты показывают, что при переходе к дискретной поверхности не только ее часть становится недоступна клеткам, но и часть питательной среды может быть недоступной для растущих клеток. Наиболее гомогенное распределение клеток по микроносителям достигается при непрерывном перемешивании. Тем не менее и в этом случае питательная среда и поверхность микроносителей используется не полностью. Кроме того, этот режим "посадки" клеток в некоторых случаях неприемлем в связи с особенностями процесса прикрепления клеток к микроносителям.
3.Изучение влияния на пролиферацию клеток факторов, связанных со свойствами субстрата микроносителей.
Влияние физико-химических свойств поверхности микроносителей на процесс культивирования проявляется не только на этапе прикрепления клеток к микроносителям, но и на этапе клеточного роста. Известно, что продуктивность клеточных культур может менятся при смене субстрата [FresJiney 1986]. В случае микроносителей причину такого эффекта часто связывают с массообменной емкостью микроносителей, в результате чего имеет место адсорбция факторов роста и питательных веществ в околоклеточном пространстве, приводящее к изменению условий роста клеток [Hirnes et al.,1987]. При этом известно, что обеднение среды ведет к изменению с1-фазы, практически не сказываясь на других фазах клеточного цикла [Shields & Smith,1977].
Мы изучали влияние фактора роста, выделенного из восковой моли [Спиридонов 198S] на динамику клеточного цикла культур на микроносителях одного типа, но обладающих разной сорбционной емкостью -ССДВБ-с и ССДВБ-н. На рис.13 показаны результаты исследований. Согласно этим данным присутствие в среде фактора роста в культуре микроносителей ССДВБ-с (рис.13а) способствовало снижению длительности G1- периода более чем на 2 часа, при этом длительности других фаз клеточного цикла практически остались без изменений (в пределах ошибки). В тоже время, в культуре с микроносителями ССДВБ-н, имеющими меньшую адсорбционную емкость, фактор роста практически не влиял на скорость роста клеток и длительность G1-периода (рис.136).
На рис.14,15. и в табл.2, представлены результаты роста культур клеток на разных типах микроносителей'. Видно, что при переходе от одного типа микроносителя к другому существенно изменяются длительности отдельных фаз клеточного цикла. Наиболее изменчивой фазой клеточного цикла является ог- наблюдаемая разница в 3-4 раза. Неожидан-
10+' О2/и фаза
20 40 60 80
14
кк^ет ок.
60 фаза /у
50
40 Б фаза
30
20 У/^ __ Сг/МфазйХ^.
—"•"Ли.
10/
часы
0 20 40 60 80
рис.13. Зависимость населенности фаз клеточного цикла от присутс твия в среде фактора роста (ФР) при культивировании фиброблатов на микроносителя!: а) ССДВБ(с), б) ССДВБ(н). • - с добавлением в среду ФР; + - без ФР. По оси ординат: число клеток (?) в О^Б^фаз
МЛН.КЛ.
80 ' 2
60 /г
40 // /4п / и/**
20 гЖ 6- ,часы
20 40 60 80
20 40 60 80
рис.14. Рост клеток на разных типах микроносителей. 1- Су1;о(1ех1; 2- Су1;ос1ехЗ; 3- СуЬо1аг1; 4- Суго1агЗ; 5- ССДВБ(с); 6- ССДВБ(н). рис. 15.Изменение величины С..фазы клеточного цикла в процессе культивирования фибробластовна разных типах микроносителей.1- СуЬо-(1ех1 ; 2- Су1;о<1ехЗ; 3- Су1;о1аг1; 4- CytolaгЗ; 5- ССДВБ(с); 6-ССДВБ(н). По оси ординат: число клеток (%) в О^азе.
0
Таблица 2. Зависимость роста и параметров клеточного' ___________цикла культуры клеток от типа микроносителей.
N т Т 101 ts tG2/M
Су^йех 1 73 0, .073 9.5 3.2 4.0 2.3
Су1;ос1ех 3 80 0. .087 8.6 2.6 3.9 2.1
Су1;о1аг 1 52 0, .060 11.5 3.1 5.1 3.4
СугоЗаг 3 43 0. .046 15.0 6.2 5.2 3.6
ССДВБ -с 36 0, ,043 15.4 5.9 6.0 4.5
ССДВБ -н 21 0. .023 30.5 14.1 8.3 7.6
стекло 0. .056 12.3 3.2 5.5 3.6
Ферромагнетик__ 30 0. .037 18.6 8.5 6.4 3.7
N - общий урожай клеток(*10®кл); Ш - удельная скорость роста культуры клеток(1/час); Т - время удвоения ДБ, Юр/М -
длительности 01,3, 02/М ф'=13 клеточного цикла (час).
ними и заслуживающими более глубокого изучения оказались изменения длительности наиболее детерминированной Б-фазы (превышение ошибки измерений более чем в 2 раза). Полученные результаты позволяют говорить, чта влияние поверхности ростового субстрата на продуктивность клеточных культур не сводится к адсорбции на его поверхности питательных веществ и факторов роста, а имеет более глубокую биологическую природу.
ВЫВОДЫ
1.Предложен метод изучения кинетики прикрепления клеток к микроносителям, кЬторый основан на определении относительной доли прикрепившихся клеток за интервал времени между перемешиванием культуры при варьировании длительности этого интервала.
2.Установлено что, процесс прикрепления клеток к микроносителям с различными физико-химическими свойствами поверхности характеризуется наличием для некоторых типов микроносителей отрезка времени ("мертвое время"), необходимого для полного прикрепления клеток. Выявлена зависимость величины этого интервала от силы гидродинамического воздействия и присутствия в культуральной среде сыворотки.
3.Показано,' что уменьшение урожая клеток в расчете на единицу питательной среда при переходе от культивирования на макроговерхности к дискретному субстрату - микроносителям - вызвана появлением в культуре большого количества непролиферирующих клеток за счет значительной неравномерности начального распределения клеток по микроносите-
лям.
4. Показано, что неравномерность начального распределения клеток г микроносителям существенно зависит от режима прикрепления, концеш рации микроносителей и конструкции биореактора.
5. Обнаружено влияние свойств поверхности микроносителей на длител! ности фаз клеточного цикла.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1.Смирнов C.B. Сорбция микроносителями компонентов питательной среды и токсичность микроносителей. II Всесоюзное совещаш "Культивирование клеток животных и человека" Тезисы докл., Пущине 1985,с.159.
2.Смирнов C.B., Пашовкин Т.Н. Адгезивные свойства микроносителей. II Всесоюзное совещание "Культивирование клеток животных и человс ка" Тезисы докл., Пущино, 1985,с.160.
3.Смирнов С.В.Оценка возможности выращивания клеток на различных типах микроносителей, сб.науч.тр.'Приборное оснащение и автомат! зация экспериментальных исследований в области биотехнологиии' Пущино, 1986, с. 16-19-.
4.Макарова О.П.. Смирнов C.B. Аппаратура для культивирования кле ток на микроносителях. Науч.-техн.инф.сб.ст "Передовой произволен венный опыт в медицинской и микробиологической промышленноеи рекомендуемый для внедрения".,М., Биомедэкономика, 1989,
вып.8,с.18-24.
5.Кудрявцев A.A., Смирнов C.B., Лежнев Э.И., Попова И.И. Начальный этап культитвирования клеток животных на микроносителях.1990, Бис технология, N3,с.58-63.
6.Смирнов C.B., Кудрявцев A.A., Усачева A.M. Влияние неоднородное ти начального распределения клеток по микроносителям на конеча параметры их культитвирвоания. сб.статей ^'Ферменты микроорганизм) и деградация биополимеров",1990, М.,с.11-16.
7-Макарова О.П., Смирнов C.B., Казаков В.П., Кудрявцев A.A. Пуль сатор новая система для культивирования клеток на микроносителя; сб.ст."Приборы и оборудование для исследований в области физию химической биологишг', Пущино, 1990,с. 14-18.
8.Макарова О.П., Смирнов C.B., Кудрявцев A.A., Казаков В.П. Изучение роста клеток на разных типах микроносителей в систе! "Пульсатор". III Всесоюзное совещание "Культивирование клеток к вотных и человека", Пущино, 13-15 февраля 1990г., М.1990,с.161.
Э.Кудрявцев A.A., Смирнов C.B., Усачева A.M. Как и почему дискрет ность субстрата влияет на эффективность процесса псевдосуспензио: ного культивирования клеток животных. III Всесоюзное совещан "Культивирование клеток животных и человека", Пущино, 13-15 февр ля 1990г., М.1990,с.7-
Ю.Смирнов C.B., Кудрявцев A.A. Изучение кинетики прикрепления фибробластов китайского хомячка к микроносителям разных типов. Всесоюзное совещание "Культивирование клеток животных и человека Пущино, 13-15 февраля 1990г., И.1990,с.49-
П.Смирнов C.B., Кудрявцев A.A., Усачева A.M. Зависимость экспо ненциально растущей культуры клеток на микроносителях от типа и пользуемого микроносителя. III Всесоюзное совещание "Культивиров ние клеток животных и человека", Пущино, 13-15 февраля 1990г M.1990,с.50
- Смирнов, Сергей Васильевич
- кандидата биологических наук
- Пущино, 1993
- ВАК 03.00.02
- Биоконверсия лигноцеллюлозных субстратов микрохицетами рода Asperctillus в аппаратах эрлифтного типа
- Разработка и исследование термочувствительных биоматериалов на основе поли-N-изопропилакриламида
- Получение и характеристика культур соматических клеток дрозофилы
- Моделирование процессов периодического культивирования микроорганизмов
- Моделирование процессов периодического культивирования микроорганизмов