Разработка и исследование термочувствительных биоматериалов на основе поли-N-изопропилакриламида

Селезнева, Ирина Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и исследование термочувствительных биоматериалов на основе поли-N-изопропилакриламида
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Разработка и исследование термочувствительных биоматериалов на основе поли-N-изопропилакриламида"

На правахрукописи

Селезнева Ирина Ивановна

РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ БИОМАТЕРИАЛОВ НА ОСНОВЕ ПОЛИ-Н-ИЗОПРОПИЛАКРИЛАМИДА

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

ПУЩИНО - 2004

Работа выполнена в Институте Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН, г. Пущино

Научпые руководители: доктор медицинских наук, профессор

Гаврилюк Борис Карпович

кандидат физико-математических наук Рочев Юрий Алексеевич

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор

Берестовский Генрих Николаевич

доктор физико-математических наук Акатов Владимир Семенович

Ведущая организация: Московский Государственный Университет,

Физический факультет

Защита диссертации состоится мин.

на заседании Диссертационного Совета Д 002.093.01 в Институте Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Московской обл., ул. Институтская, 3

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Московской обл., ул. Институтская 3, ИТЭБ РАН

Автореферат разослан

2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат физико-математических наук

Н.Ф. Ланина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время культуры клеток животных и человека находят все более широкое применение в медицине и биотехнологии. Развитие клеточных технологий и тканевой инженерии выдвигает ряд новых требований к материалам, формирующим субстрат-подложку для культивирования субстратзависимых клеток млекопитающих, и составляющих основу имплантируемых тканевых конструкций. Данпые материалы должны поддерживать адгезию, рост и сохранение функциональной активности клеток, обеспечивать иммобилизацию и направленную доставку факторов, управляющих формированием тканей, быть нетоксичными и, по возможности, имитировать характеристики биополимеров (белков и углеводов).

Понимание механизма кооперативных взаимодействий в биополимерах, являющихся не только существенной составной частью, но и управляющей основой организма, явилось толчком к созданию так называемых "умных" или "восприимчивых" синтетических полимерных материалов. Способность восприимчивых полимеров резко и обратимо реагировать на изменение внешних условий определяет их использование в качестве функциональных материалов в самых разных областях. Восприимчивые полимеры используют для направленной доставки лекарств, разделения макромолекул, иммобилизации биокатализаторов и клеток и многого другого.

В 1990 году группой японских ученых был разработан термочувствительный субстрат на основе поли-Н-изопропилакриламида (ПНИПА), термочувствительного полимера, несущего функциональные С=О и N-H группы, характерные для молекул белков, и являющегося аналогом полилейцина по химическому составу (Bae et а1., 1990). Поли-Н-изопропилакриламид испытывает фазовый переход из нерастворимого в растворимое в воде состояние при температуре около 32°С, называемой нижней критической температурой сольватации (НКТС) (НезКш et а1., 1968). Из всех Н,Н-алкилпроизводных акриламида ПНИПА характеризуется наиболее резким набуханием/коллапсом при переходе температуры через критическую точку, что определяется уникальным балансом гидро-фобно/гидрофильных взаимодействий в молекуле данного полимера. При температуре 37°С полимер находится в нерастворимом состоянии, что позволяет использовать его в качестве твердого субстрата для культивирования клеток. Понижение температуры культивирования ниже НКТС вызывает гидратирова-ние ПНИПА и открепление клеток от поверхности субстрата без применения протеолитических ферментов и диссоциирующих агентов. Было показано, что сохранение целостности связанных с мембраной белков, межклеточных контактов и синтезированного клетками матрикса при бесферментном откреплении клеток позволяет поддерживать специфическую активность клеток на протяжении многих пассажей (уои Яееиш, et а1., 1998). Зависимое от температуры изменение адгезионных характеристик и набухания субстрата ПНИПА позволяет проводить позиционирование двух типов сокультивируемых клеток (УашаШ et а1. 2002) и о с у щ открепленио и пероноо пнтакттлк шов клеток (КПшсЫ с1 а1., 1998). Данные характек^с^й^^й^^^МЫпА подразумева-

1 С.Пе«р»рг ?/Л |

! ОЭ УЛ^лмяУУ }

ют широкие возможности его применения для культивирования специализированных клеток, создания тканевых эквивалентов и проведения исследований в области клеточной биологии. Однако разработанный японскими учеными метод полимеризации ПНИПА при помощи электронного луча высокой энергии непосредственно на покрываемой поверхности, имеет ряд ограничений на тип покрываемой поверхности и приводит к неконтролируемому изменению физико-химических характеристик субстрата. Аппаратура, используемая для формирования электронного луча, недоступна большинству исследователей, работающих с культурами клеток, а низкая плотность наносимого покрытия существенно затрудняет открепление клеток. Таким образом, наряду с несомненными преимуществами субстрата ПНИПА при проведении разработок в области тканевой инженерии, биотехнологии и медицины, недостатки, связанные с существующей технологией формирования данных субстратов, делают актуальной задачу разработки новых композиций и новых методов формирования термочувствительных субстратов.

Как известно, термочувствительные субстраты, сформированные на основе линейных полимеров ППИПА, обладают слабой адгезивностью, вследствие высокой гидратируемости поверхности (Takezawa et в1, 1990). Нами был предложен новый подход к разработке термочувствительного субстрата па основе ПНИПА, заключающийся во введении в состав линейного полимера ПНИПА мономерных звеньев Н-третбутилакриламида (НТБА), отличающегосяся от НИПА наличием одной дополнительной гидрофобной метальной группы. Для обеспечения ковалентного связывания субстрата с поверхностью и формирования сшитого полимерного геля было решено ввести в состав сополимера фото-индуцируемый мономер - акриламидобензофенон (ААБФ). Комплексное исследование особенностей фазовых переходов, физико-химических характеристик поверхности и биосовместимости субстратов ПНИПА/НТБА с различным соотношением мономерных звеньев представляет серьезный интерес для выявления факторов, определяющих свойства термочувствительных субстратов на микро и макроуровне, и их взаимодействие с клетками, жидкостями и тканями нашего организма. Таким образом, данная работа является актуальной не только для решения некоторых задач тканевой инженерии, биотехнологии и медицины, но и для проведения исследований, лежащих на стыке физики, химии и биологии.

Цель и задачи исследования.

Цель данной работы заключалась в разработке на основе сополимеров Н-изопропилакриламида (НИПА) и Н-третбутилакриламида (НТБА) и акрилами-добензофенона (ААБФ) новых термочувствительных материалов, предназначенных для поддержания роста субстратзависимых клеток, а также обеспечения открепления клеток от поверхности культивирования без применения протео-литических ферментов и диссоциирующих агентов.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи: 1. Исследование особенностей фазовых переходов в растворах термочувствительных полимеров и термочувствительных субстратах ПНИПА/НТБА. Выявление возможных механизмов модуляции температуры и кооперативно-

сти фазовых переходов сополимеров ПНИПА/НТБА в

растворах и в пленочных субстратах.

2. Разработка техники приготовления полимерных субстратов ПНИПА/НТБА и проведение анализа физико-химических характеристик их поверхности.

3. Исследование адгезии, роста и бесферментного открепления клеток от поверхности субстратов ПНИПА/НТБА. Определение оптимального композиционного состава субстрата ПНИПА/НТБА, обеспечивающего высокую адгезионную и пролиферативную активность, а также эффективное бесферментное открепление клеток.

4. Разработка методики фотоиндуцируемого формирования полимерных сеток, определение влияния введенных в состав сополимера фотоиндуцируе-мых мономеров акриламидобензофенона (ААБФ) на термочувствительность формируемых субстратов ПНИПА/НТБА/ААБФ и их взаимодействие с клетками.

Научная новизна работы

Впервые исследования кооперативных фазовых переходов в растворах термочувствительных полимеров и полимерных субстратах ПНИПА/НТБА были проведены параллельно с определением физико-химических характеристик поверхности субстратов и исследованием активности клеток, культивируемых на них. В работе впервые получены следующие результаты:

1) обнаружено, что усиление межмолекулярных гидрофобных взаимодействий в сополимерах ПНИПА/НТБА, которое происходит при увеличении процентного содержания НТБА, вызывает изменение конформации сколапсиро-вавшего сополимера и приводит к компактизации его структуры.

2) определено, что усиление межмолекулярных гидрофобных взаимодействий в сополимерах ПНИПА/НТБА при увеличении процентного содержания гидрофобного мономера НТБА приводит к линейному снижению температуры и нелинейному снижению кооперативности фазового перехода в растворах сополимеров ПНИПА/НТБА и пленочных субстратах, приготовленных на их основе.

3) показано, что снижение размеров кооперативных доменов при увеличении процентного содержания гидрофобных мономеров приводит к значительному снижению темпов объемно-конформационных преобразований в растворах полимеров и термочувствительных субстратах ПНИПА/НТБА.

4) установлено, что при увеличении процентного содержания НТБА в сополимере ПНИПА/НТБА происходит снижение числа полярных групп, находящихся в конформации, подходящей для образования водородных связей с молекулами воды, что приводит к изменению гидрофильно/гидрофобных свойств поверхности субстратов при 37°С и обуславливает изменение клеточного ответа.

Практическое значение

Разработанные нами субстраты ПНИПА/НТБА поддерживают адгезию, пролиферацию клеток и экспрессию большинства генов на уровне, сравнимом с культивированием на специально обработанном для роста клеток полистироле, но при этом обеспечивают эффективное открепление клеток без применения ферментов и диссоциирующих агентов. Данные субстраты могут быть исполь-

зованы для позиционирования трех и более типов клеток, создания сложных тканевых конструкций, предназначенных для восстановления поврежденных органов и тканей. Термочувствительные субстраты обеспечивают возможность получения интактных первичных культур клеток и сохранения их специфической активности в течение многих пассажей, что открывает перспективу их применения в биотехнологии, для производства биологически активных препаратов, а также в медицине для проведения клеточной терапии тканей и органов. Высокая эластичность разработанных субстратов в сочетании с возможность контролируемой доставки лекарственных препаратов открывают возможность применения разработанных нами материалов в качестве полимерного покрытия имплантируемых конструкций.

Апробация работы и публикации. Работа была представлена на Втором съезде биофизиков России (Москва, 1999), школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), 14 конференции European Colloid and Interface Society , (Греция, 2000), IV Международной конференции "Современные подходы к разработке и клиническому применению эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных имплантатов"( Москва , 2001), конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" ( Пущино 2001), 18 Европейской конференции по биоматериалам, (Штудтгарт, Германия, 2003). По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, и пяти глав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, а также заключения, выводов и списка цитированной литературы из .flty наименований. Работа изложена на -^%ЯЬтраницах машинописного текста и содержит рисунка и таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Высокомолекулярные полимеры поли-Н-изопропилакриламид (ПНИПА), поли-Н-третбутилакриламид (ГОГГБА), а также сополимеры ПНИПА/НТБА, в соотношении, 85/15, 65/35 и 50/50 моль/моль соответственно, а также фотоин-дуцируемый сополимер, включающий акриламидобензофенон ПНИ-ПА/НТБА/ААБФ в соотношении 85/13.8/1.2 соответственно, были синтезированы, очищены, охарактеризованы и предоставлены для исследований Т.А. Го-лубевой и А.В. Гореловым. (Department of Chemistry, University College Dublin).

Полимерные субстраты формировали на покрываемой поверхности путем медленного высушивания 5% растворов полимеров в 100% этиловом спирте. Толщину пленки определяли микрометром. Формирование поперечных сшивок и ковалентное связывание субстратов с поверхностью полистирола проводили облучением субстратов УФ-лампой ДРТ-220 при энергетической освещенности 0,1 Вт/см2. (Рис.1)

■ сн,-с-сн.—сн—сн,-с-

I I I

С= о с = о с ==о

I I I

N Н N Н NH

/\ О н.с^Ксн,

Н,С СН, ^f CHs

<0*—?—°н

Рис. 1. Схема ковалентного связывания субстрата ГОШПАЛПБА/ААБФ с поверхностью полистирола: 1-ИИПА; 2- ААБФ; 3-НТБА; 4-полистирол

За процессами коллапса/сольватации следили по изменению оптического пропускания 0.02% растворов полимеров, измеренного на длине волны 500 им. Оптическое пропускание водных растворов полимеров было измерено на спектрофотометре "Hitachi U-3410", оснащенном термостатируемыми кюветами с длиной оптического пути 1 см. Скорость прогрева и охлаждения кювет растворов составляла 0.2°С/мин, точность регистрации температуры ±0.1°С.

Метод гравиметрии был применен для исследования процесса набухания полимерных субстратов в воде. Степень набухания полимерных субстратов определяли как отношение массы воды в набухшем полимере к массе сухого полимера. Равновесное содержание воды определяли как отношение сорбированной полимерным субстратом в течение суток воды, к весу набухшего полимера. Взвешивание проводили на весах Mettler HL52, точность определения веса составила ±0.05мг

Кооперативный фазовый переход в водных растворах термочувствительных полимеров был изучен методом дифференциальной адиабатической сканирующей микрокалориметрии. Измерения проводились на микрокалориметре ДАСМ-4 (НПО "Биоприбор") с объемом измерительной ячейки 0.47 мл. Сканирование проводилось в диапазоне температур 1-50°С, при скорости нагрева 5К/мин и избыточном давлении 2 атм. Точность регистрации температуры составляла ±0.1°С.

Метод атомной силовой микроскопии был применен для анализа шероховатости поверхности полимерных субстратов. Измерения проводились на приборе Digital Instruments Dimension 3100 при комнатной температуре и влажности воздуха в контактной моде с использованием наконечника кантилевера изготовленного из нитрида кварца (коэффициент жесткости 0.57 Н/м). Шероховатость субстратов определялась как среднее геометрическое (Root Mean Square roughness (Rms)) стандартное отклонение от среднего значения Z^, высоты в исследуемой области

Метод инфракрасной Фурье- спектроскопии полного отражения был применен для анализа химической композиции поверхности исследуемых субстратов. Измерения проводились на ИК-спектрометре FTIR-8300 фирмы Himadsu, в котором многократное отражение и усиление детектируемого сигнала достигается при помощи кристалла алмаза, входящего в непосредственный контакт с исследуемой поверхностью. Сканирование проводилось в диапазоне длин волн 500 -4000 см-1, результаты измерений усреднялись по 40 сканированиям, разрешение пиков составило 4 см*1.

Измерение эластических свойств поверхности полимерных пленок проводились при комнатной температуре и окружающей атмосфере на приборе Nano-Hardness-Tester (NHT CSM Instruments), при помощи индентора Берковича с алмазным наконечником. В качестве субстрата для нанесения полимерных покрытий мы использовали покровные стекла, глубина индентации (деформации) не превышала 1 мкм. Определение модуля Юнга проводили методом Оливера и Пхарра из кривой разгрузки после третьего цикла индентации.

Исследование краевого угла смачивания поверхности было проведено на гониометре собранном А.В.Гореловым на основе Newport Optics с дополнительными оптомеханическими устройствами Newport Optics и Edmund Optics. Анализ изображения был проведен с использованием программного обеспечения DROPimage (Rame-Hart Inc). Измерения проводились на полимерных субстратах толщиной 5-10 мкм, сформированных на поверхности покровных стекол, на платформе с контролируемой температурой 37°С в атмосфере, насыщенной паром. Деионизованная вода подавалась на поверхность субстрата со скоростью 0.002мл/мин через иглу, соединенную с перистальтическим насосом, что обеспечивало среднюю скорость продвижения линии трехфазного контакта около 0.05мм/мин. Краевой угол смачивания поверхности определялся путем численного анализа профиля капли в точке контакта.

В работе использовали культуры клеток линий Vero, NCTC clone L929, НЕР-2 и ВНК. Клетки культивировали в среде Игла в модификации Дальбекко (ДМЕМ), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС), 50мкг/мл пенициллина, 50мкг/мл стрептомицина и 1% L-глутамина при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5%СОг- Ферментативное открепление клеток проводили в смеси растворов трипсина и версена (1:1). Плотность посева составляла 30-50 тыс.кл/см2. Подсчет живых клеток проводили с использованием камеры Горяева, жизнеспособность клеток определялась по исключению трипанового синего. Посев клеток на поверхность термочувствительных субстратов и наблюдения за клетками проводили на термостатируе-мой поверхности при температуре 37°С, поддерживаемой жидкостным термостатом MLM U10. Кинетику прикрепления клеток к поверхности субстратов оценивали по убыли клеток из среды. Бесферментное открепление клеток от поверхности полимерных субстратов проводили при температуре 5°С. Визуальное наблюдение за процессом открепления клеток проводили при помощи микроскопа Биолам-МПЗ, регистрируя время, в течение которого происходит открепление более 90% клеток с поверхности субстрата. Микрофотосъемка клеток проводилась на микроскопе Peraval Interphako методом дифференциально-интерференционного контраста.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Исследование особенностей фазовых переходов в растворах термочувствительных полимеров и термочувствительных субстратах ПНИПА/НТБА.

Для исследования прямого и обратного фазовых переходов в разбавленных растворах термочувствительных полимеров ПНИПА/НТБА был применен спектрофотометрический метод. Уменьшение оптического пропускания водных растворов полимеров при повышении температуры обусловлено рассеянием света на агрегатах сколапсировавшего полимера, а уменьшение мутности растворов при охлаждении связано с сольватацией полимера. Температуры агрегации/сольватации полимеров мы определяли по точкам перегиба кривых оптического пропускания, полученных при нагреве/охлаждении растворов соответственно. (Рис.2) (Табл. 1)

102 too 98

I 96

л>

S 94 ё-

8. 92 90 88 86

•охлаждение - нагрев

х.

- 30-

а 25

<и

13-

10-

8 10 12 14 .16 18 20 22 24 Температура, С

10 20 30 40 Содержание НТБА, %

Рис.2. Изменение оптического пропускания при нагреве и охлаждении раствора ПНИПА/НТБА 50/50 (А) и критические температуры сольватации и агрегации сополимеров ПНИПА/НТБА, как функция процентного содержания НТБА (Б).

Таблица 1. Температуры агрегации и сольватации полимеров ПНИПА/НТБА, определенные

Полимер Тагрегаиии ^сольватации ДТ

ПНИПА 33,7 32,4 1.3

ПНИПА/ НТБА 85%: 15% 27,4 25,2 2.2

ПНИПА/ НТБА 65%:35% 19,1 15,9 3.2

ПНИПА/ НТБА 50%:50% 13,3 9,6 3.7

Увеличение процентного содержания НТБА в сополимере приводит к практически линейному снижению температур сольватации и агрегации сополимеров ПНИПА/НТБА, и увеличению расхождения (ДТ) между этими двумя температурами. (Рис.2). По нашему мнению расхождение температур агрегации и сольватации сополимеров определяется динамикой объемно-конформационных преобразований структуры полимера, происходящих на

первом этапе фазового перехода. Т.о. темпы объемно-конформационных преобразований структуры сополимеров существенно снижаются при введении гидрофобных мономеров НТБА.

Исследование объемных фазовых переходов в термочувствительных субстратах ПНИПА/НТБА и определение содержания воды в объеме сколапсиро-вавшего полимера было проведено методом гравиметрии (Рис.3).

При относительной плавности процесса набухания полимерных субстратов по сравнению с фазовыми переходами в растворах, температура, при которой набухание субстратов, практически совпадает со значениями температуры сольватации полимеров в растворе, определенными методом микрокалориметрии и спектрофотометрии.

Введение гидрофобных мономеров практически линейно снизило набухание субстратов ПНИПА/НТБА при температуре культивирования клеток (Рис.3Б). Таким образом, при температурах выше критической точки коллапса полимерный каркас сополимеров ПНИПА/НТБА гидрофобизуется и отторгает растворитель тем сильнее, чем выше в нем содержание гидрофобного мономера НТБА.

2. Выявление возможных механизмов модуляции температуры и кооперативное™ фазовых переходов сополимеров ПНИПА/НТБА.

Фазовый переход в разбавленных (0.1%) растворах термочувствительных полимеров ПНИПА/НТБА был изучен методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии. Было показано, что данный переход сопровождается кооперативным поглощением тепла и понижением удельной теплоемкости раствора (Рис 4.), определены термодинамические характеристики фазового перехода сополимеров ПНИПА/НТБА (Табл.2).

Нижняя критическая температура сольватации (НКТС) полимеров определена как температура максимума пиков, представленных на рис.4., параметр Т]/2 (ширина пика на половине высоты), характеризует интервал температур, в котором происходят фазовые превращения в полимерах. Изменение энтальпии (АН), связанное с фазовым переходом при температуре Тмакс, было определено в расчете на грамм полимера и моль мономерных звеньев, изменение энтропии было рассчитано по формуле

Таблица 2. Термодинамические характеристики фазового перехода сополимеров ПНИПА/ НТБА в воде при скорости сканирования 0.5 К/мин. __

Параметр ПНИПА ПНИПА/ НТБА 85/15 ПНИПА/ НТБА 65/35 ПНИПА/ НТБА 50/50

НКТС, °С 32.9±0.1 25.1±0.1 16.110.1 9.8Ю.1

АН, Дж/г 50±1 58±2 67±2 69±2

АН, ккал/моль 1.36±0.03 1.60±0.04 1.87Ю.05 1.9910.05

Т„2,°С 1.2±0.1 2.3±0.1 3.5Ю.1 3.810.1

АБ, Дж/г К 0,163±0.004 0,19610.005 0,23210.006 0,24410.006

Нижние критические температуры сольватации полимеров, определенные методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии (ДСМ), с хорошей точностью совпадают с температурой сольватации полимеров, определенной по изменению мутности охлаждаемых растворов. Совпадают также диапазоны фазовых переходов, определенные по полуширине пика теплопоглощения и по разнице температур, характеризующих процессы коллапса и сольватации полимера

0.60

Температура, °С £ Содержание НТБА, %

Рис.4. Температурные зависимости избыточной теплоемкости 0.1% растворов сополимеров ПНИПА/НТБА в воде при скорости сканирования 0.5К/мин. (А)

и скачок теплоемкости в момент фазового перехода, как функция процентного содержания НТБА в сополимерах ПНИПА/НТБА. (Б)

Экстраполяция кривой теплоемкости от высоких и низких температур к точке фазового перехода позволила выявить скачок теплоемкости соответ-

ствующий переходу полимеров в состояние коллапса. (Рис.4Б) Эти данные являются подтверждением компактизации структуры сополимеров ПНИПА/НТБА при высоких температурах. Увеличение энтальпии фазового перехода свидетельствует о возрастании числа водородных связей, разрушаемых при коллапсе полимера при увеличении процентного содержания НТБА. Таким образом, компактизация структуры сополимеров при температурах выше НКТС (Рис.4Б) сопровождается информационными изменениями, и приводит к снижению числа полярных групп, находящихся в конформации, при которой возможно образование водородных связей с молекулами воды. Это хорошо согласуется с равновесным содержанием воды в сополимерах при 37°С (рис.ЗБ) и свидетельствует о снижении гидратируемости сополимеров по сравнению с ПНИПА.

Воспользовавшись значениями НКТС сополимеров ПНИПА/НТБА, полученными методом микрокалориметрии, мы применили формулу (1), предпо-женную для расчета температуры фазового перехода термочув-

ствительных сополимеров, для определения вида зависимости НКТС сополимеров ПНИПА/НТБА от мольных фракций мономерных звеньев:

где Ц) - молярная фракция мономеров НИЛА, Цг - молярная фракция мономеров НТБА, Ti=306K —НКТС ПНИПА, Тг =267.5К -гипотетическая температура фазового перехода ГОГГБА, К=1.48- вычисленный параметр.

По аналогии с белками количество блоков испытывающих кооперативные фазовые превращения, может быть определено как отношение реально измеренной энтальпии (ДН1""1) к энтальпии перехода Вант-Гоффа (Priva1ov.79V

n=AHKaJ,/AH3i:=QtrMTI/2/4RT2 (2)

где Qtr- теплопоглогцение при фазовом переходе в расчете на грамм полимера, М- молекулярный вес полимера, R- универсальная газовая постоянная, Т-температура фазового перехода, - ширина пика на половине высоты.

Воспользовавшись тем, что средние молекулярные массы всех исследуемых полимеров приблизительно одинаковы, мы рассчитали относительное (по отношению к ПНИПА) число кооперативных блоков:

где количество кооперативных блоков в сополимере ПНИПА/НТБА, пп Н И П А - количество кооперативных блоков ПНИПА.

Полученная зависимость относительного числа кооперативных блоков от процентного содержания НТБА в сополимере показала практически экспоненциальный рост числа кооперативных блоков, свидетельствующий об экспоненциальном снижении кооперативности фазового перехода. (Рис.5)

При возрастании содержания НТБА в полимере до 50% количество кооперативных блоков увеличивается по сравнению с ПНИПА практически в 50 раз. Учитывая чередующееся строение полимера, каждый кооперативный блок ПНИПА в данном случае разбивается на пятьдесят пар звеньев НИПА-НТБА.

А Содержание НТБА, % Б Содеряение НТБА, %

Рис.5. Зависимость относительного числа кооперативных блоков (А) и натурального логарифма этой величины (Б) от молярной фракции мономеров НТБА

Для кооперативного перехода спираль-клубок в белках среднее число спиральных областей для цепи, состоящей из N остатков, как известно, связано следующим соотношением с константой нуклеации а (Кантор, Шиммел, 1985):

Чем меньше ст (что означает более высокий барьер нуклеации), тем большей длины должен быть кооперативный участок, чтобы компенсировать невыгодность акта образования зародыша спирали (нуклеации).

Исходя из того, что каждый второй мономер в цепи ПНИПА/НТБА 50/50 не является термочувствительным и, по сути, происходит независимый переход каждой пары звеньев, т.е. по аналогии с белками была проведена

оценка средней длины кооперативных блоков и константы нуклеации коллапса всех исследуемых полимеров.

Рис.6. Логарифмические зависимости среднего числа звеньев в кооперативных блоках (А) и констант нуклеации (Б) сополимеров ПНИПА/НТБА от молярной фракции мономеров НТБА

Полученные данные, представленные на рис.6 , свидетельствуют о практически экспоненциальном снижении длины кооперативных участков в молекуле сополимеров вызванном усилением гидрофобных взаимодействий при увеличении процентного содержания НТБА Это позволяет сделать вывод о том, что экспоненциальное снижение кооперативности фазового перехода вызвано понижением барьера инициации коллапса при усилении гидрофобных взаимодействий. Уменьшение кооперативности фазового перехода является основной причиной снижения темпов объемно-конформационных превращений в растворах сополимеров и термочувствительных субстратах ПНИПА/НТБА.

3. Разработка техники приготовления полимерных субстратов ПНИПА/НТБА, оптимизация топологических параметров для адгезии и роста субстратзависимых клеток млекопитающих

Выбор этанола в качестве растворителя был обусловлен тем, что приготовление субстратов из спиртовых растворов полимеров не требует длительного времени и дополнительной стерилизации перед применением, а главное, обеспечивает отсутствие цитотоксичности потенциальных биоматериалов. Несмотря на то, что этанол и вода являются хорошими растворителями для ПНИПА, было выявлено, что при некотором их соотношении происходит резкое разделение фаз в растворе, приводящее к формированию плотных глобулярных структур полимера и увеличению шероховатости субстрата. Субстраты, сформированные из растворенных в 96% этаноле полимеров, были абсолютно непрозрачны и имели крайне негомогенную поверхность (Рис.7А). Даже абсолютное обезвоживание этанола не привело к полному сглаживанию поверхности субстратов СРис 7Б).

Было определено влияние влажности воздуха, концентрации полимера в растворе и скорости высыхания пленки на качество получаемой поверхности. На каждом этапе данного исследования методом атомной силовой микроскопии проводилось определение шероховатости поверхностей формируемых поли-

мерных субстратов ПНИПА/НТБА Оптимальная шероховатость поверхности субстратов была получена при медленном (в течение двух суток) высыхании растворов полимеров в парах этанола в присутствии влагопоглоти-телей с последующим прогревом в течение 1-2 часов при 55°С. (Рис 8). Шероховатость поверхности субстратов, приготовленных по оптимальной методике, составляет около 15 нм, что совпадает с шероховатостью специально обработанного для роста клеток полистирола (Lydon , Clay, 1985) и является оптимальным значением для адгезии, роста и функциональной активности большинства субстратзависимых клеток (Dalby et al, 2002). Для сравнения, шероховатость поверхности субстратов ПНИПА, ковалентно связанных с поверхностью при помощи облучения потоком электронов, составляет 250 нм (Ra) (von Recum et al., 1998), что значительно выше полученных нами значений._

4. Анализ физико-химических характеристик поверхности субстратов ПНИПА/НТБА.

Методом ИК-спектроскопии проведено исследование химической структуры исследуемых сформированных нами субстратов. На всех полученных спектрах отмечены отчетливые пики в диапазонах частот резонансного поглощения соответствующих химических связей в молекулах полимеров. На рис.910 приведены ИК-спектры сополимеров ПНИПА/НТБА 85/15 и ПНИПА/НТБА 65/35.

Пик 3290-3280см'1 соответствует нормальным колебаниям ^Н связей, пики 1633.6 см'1 (в спектрах ПНИПА и ПНИПА/НТБА 85/15) и 1643.2 см-1(в спектрах ПНИПА/НТБА65/3 и ПНИПА/НТБА 50/50) соответствуют нормальным колебаниям двойной связи С=О (Амид I). Частота поглощения комбинированной связи С-Ы-Н (Амид II) во всех сополимерах составляет 1537.2 см-1. Частоты поглощения 2870-2970 см-1 групп соответствуют колебаниям С-Н групп, частоты 1454.2см-1 соответствуют антисимметричным деформациям СНз связей. Скелетные колебания С-С связей соответствуют пику поглощения 1224.7см-1. Соотнесение пиков подтверждает практически идентичную химическую структуру исследуемых полимеров.

Частоты полос поглощения, соответствующих колебаниям амидных С=О и CNH групп, позволяют предположить существование водородных связей между С=О и N - Н группами полимеров. Сдвиг частоты поглощения, соответствующей нормальным колебаниям двойной связи С=О с и появление широкого пика поглощения на частотах 900-670см-1 (эта область обычно соотносится с колебаниями С-Н связей в ненасыщенных углеводородах (Coates, 2000)) у полимерных субстратов ПНИПА/НТБА 65/35 и ПНИПА/НТБА 50/50 свидетельствует об изменениях в конформации этих сополимеров и является следствием усиления гидрофобных взаимодействий. Таким образом, можно сделать вывод о том, что предложенный нами метод формирования субстратов приводит к организации полимеров ПНИПА/НТБА в структуры, стабилизированные водородными связями между С=О и N-H группами полимеров.

Эластические характеристики являются важным показателем, определяющим использование биоматериалов для целей биотехнологии и медицины. На рис.11. приведены характерная кривая индентации (мультицикл) и результаты анализа данных 12 измерений механических характеристик субстратов (по 4 измерения на 3 разных поверхностях каждого образца). Достаточно высокие значения модуля Юнга всех исследуемых полимеров свидетельствуют о потенциальной возможности использования данных материалов в качестве покрытия имплантируемых конструкций.

Рис.П. Характерная кривая индентации, получаемая в экспериментах и результаты измерений механических характеристик поверхности субстратов ПНИПА/НТБА и полистирола.

Заряд поверхности и ее смачиваемость, являющиеся физическими следствиями специфической химической структуры поверхности, определяют адгезию и распластывание клеток на поверхности биоматериалов. Т.к. исследуемые нами сополимеры не содержат ионизуемых групп и не подвергаются обработке, являющейся причиной появления на поверхности электрического заряда, то поверхность исследуемых субстратов можно считать в традиционном смысле электронейтральной. На первый план в определении ее взаимодействия с суб-стратзависимыми клетками выходит соотношение гидрофильных и гидрофобных групп, определяющее смачиваемость поверхности.

Мы провели исследование смачиваемости поверхности субстратов ПНИ-ПЛ/НТБЛ водой и обнаружили явление скачкообразного изменения, как угла натекания так и угла оттекания, в разной степени проявляемое на поверхности субстратов ПНИПА/НТВЛ. (Рис.12).

Рис.12. Скачкообразное изменение угла натекания воды на поверхность субстратов ПНИПА/НТБА 85/15 (А) и ПНИПА/НТБА 65/35 (Б)

Данное явление характеризуется постепенным изменением краевого угла смачивания, чередующимся с резкими скачкообразными движениями капли по поверхности и объясняется взаимодействием жидкости с исследуемой поверхностью (Kwok et al., 1998). Оптимизируя свойства поверхности для роста кле-

ток, мы добились снижения шероховатости ниже уровня, определяющего воздействие профиля субстрата на продвижение капли. Таким образом, можно допустить, что изменение краевого угла смачивания при движении капли по поверхности исследуемых нами субстратов определяется исключительно ее химическими свойствами и является подтверждением существования на поверхности исследуемых субстратов гидрофобных и гидрофильных доменов. Гидрофобные домены соответствуют областям, насыщенным СНз-группами, гидрофильные - экспонированным на поверхности С=О и N - Н группам. Мы обнаружили, что диапазон скачков краевых углов натекания у сополимеров ПНИПА/НТБА 65/35 и ПНИПА/НТБА 50/50 оказался значительно ниже, чем у ПНИПА и ПНИПА/НТБА 85/15, что является следствием снижения числа взаимодействующих с водой полярных групп полимера при увеличении процентного содержания НТБА. Эти данные находятся в согласии со значениями равновесного набухания исследуемых субстратов при 37°С (Рис ЗБ) Возможно, наличие энергетического барьера, сдерживающего продвижение фронта жидкости по поверхности, объясняется уменьшением упругих свойств набухшего субстрата и возрастанием гетерогенности субстрата в точке контакта трех фаз.

Результаты исследования гидрофильно/гидрофобных характеристик поверхности сополимеров ПНИПА/НТБА при температуре 37°С представлены на рис.13.

Как известно, угол натекания существенно зависит от дисперсионной, а угол оттекания от полярной компоненты свободной энергии поверхности (Johnson, Dettre, 1964). Хорошая воспроизводимость значений краевого угла смачивания, определенных в момент срыва капли и вхождения ее в контакт с сухой поверхностью, и согласование полученных результатов со значениями свободной энергии поверхности субстратов ПНИПА/НТБА, определенными

стандартными методами (ЯоеЬеу et а!., 2004), свидетельствуют о

корректности метода, примененного нами для определения краевых углов смачивания поверхности.

Увеличение процентного содержания гидрофобного НТБА привело к увеличению как угла натекания, так и угла оттекания, что является показателем возрастания суммарной гидрофобности поверхности сополимеров и подтверждается определенными значениями свободной энергии поверхности. Точка перегиба на представленных на рис. 13 кривых соответствует приблизительно 25% содержания НТБА. Это согласуется с данными, полученными при определении равновесного набухания субстратов при 37°С и конформационными изменениями, выявленными методами ИК-спектроскопии и микрокалориметрии. Мы полагаем, что в результате изменения конформации сополимеров при увеличении процентного содержания НТБА происходит снижение числа полярных групп, доступных для взаимодействия с водой. Это приводит к снижению гид-ратируемости субстратов и изменению гидрофильно/гидрофобных свойств их поверхности в водном окружении.

5. Исследование особенностей взаимодействия клеток с поверхностью субстратов ПНИПА/НТБА.

Введение гидрофобного мономера НТБА позволило существенно улучшить адгезивные характеристики субстратов ПНИПА/НТБА по сравнению с ПНИПА. Адгезия и распластывание основных типов клеток на всех субстратах ПНИПА/НТБА были сравнимы с соответствующими характеристиками специально обработанного для роста клеток полистирола. (Рис.14 и Рис.15) В случае субстрата ПНИПА значительное количество экспонированных полярных групп обеспечивает высокую степень взаимодействя поверхности с водой и низкую степень распластывания клеток вследствие механической нестабильности субстрата.

Рис.14. Внешний вид клеток NCTC L929 через двое суток после посева на поверхность субстратов: А) ПНИПА; Б) ПНИПА/НТБА 85/15. Линейка 100 мкм.

Возрастание количества гидрофобных мономеров НТБА приводит к ком-пактизации структуры сополимеров и снижению числа полярных групп, экспонированных на поверхности субстрата и доступных для связывания с водой.

Это формирует умеренно гидрофобные поверхности и

обеспечивает устойчивую адгезию и хорошее распластывание клеток в случае субстратов ПНИПА/НТБА_

Было показано, что разработанные нами субстраты ПНИПА/НТБА поддерживают пролиферацию клеток на уровне, сравнимом с культивированием на специально обработанном для роста клеток полистироле. (Рис.16)

Проведено исследование процесса бесферментного открепления клеток от поверхности исследуемых субстратов при понижении температуры ниже критической. (Рис.17). Все разработанные нами субстраты обеспечивали открепление клеток от поверхности при снижении температуры культивирования до 5СС. При данной температуре роль клеточного метаболизма в процессе открепления клеток весьма незначительна, поэтому открепление клеток определяется динамическими характеристиками субстратов. Менее резкое открепление клеток от поверхности субстратов ПНИПА/НТБА 65/35 и ПНИПА/НТБА 50/50 приводит к сохранению целостности клеточных пластов в большей степени,

чем при быстром откреплении клеток с поверхности субстратов ПНИПА и ПНИПЛ/НТБЛ 85/15.

О 10 20 30 40 50 о 10 20 30 40 50

А Содержание НТБА, % Б Содержание НТБА, %

Рис.17. Время, необходимое для открепления клеток NCTC L929 от поверхности субстратов ПНИПА/НТБА при понижении температуры до 5°С.

Практически экспоненциальное возрастание времени, необходимого для открепления клеток, свидетельствует о снижении динамических характеристик субстратов и хорошо согласуется с экспоненциальным снижением кооператив-ности фазового перехода при увеличении процентного содержания НТБА в сополимере (Рис.5,6)

На факультете фармакологии Дублинского Университета Лорканом Ал-леном были проведены оценки параметров клеточного цикла и анализ профиля генов, экспрессируемых эпителиальными клетками HeLa и фибробластами MRC-5. Клетки культивировали на поверхности субстратов ПНИПАУНТБЛ с тем же соотношением мономерных звеньев, приготовленных по разработанных нами методикам. Было показано, что незначительное изменение степени рас-пластанности клеток на исследуемых субстратах ПНИПА/НТБА не приводит к изменению клеточного цикла и существенному изменению профиля синтезируемых клетками белков по сравнению с культуральным полистиролом (Allen et al., 2003). Эти данные служат подтверждением того, что разработанные нами субстраты ПНИПА/НТБА поддерживают функциональную активность клеток, культивируемых на их поверхности.

Таким образом, мы определили, что субстрат ПНИПА/НТБА 85/15 имеет оптимальный температурный диапазон и высокую кооперативность фазового перехода, обеспечивает высокую адгезионную и пролиферативную активность, а также оптимальную динамику бесферментного открепления клеток разных типов. Это послужило причиной выбора данной композиции ПНИПА/НТБА в качестве основы для создания фотосшиваемого термочувствительного биоматериала.

6. Обеспечение эффективного фотоиндуцируемого связывания субстратов с поверхностью, определение динамических характеристик и биосовместимости сшитых субстратов.

В качестве сшивающего реагента был выбран акриламидобензофенон (ААБФ), который было решено ввести в состав линейного сополимера. Фотоактивные группы бензофенона при облучении ультрафиолетом формируют кова-лентные связи и связывают молекулы полимера между собой и с поверхностью полистирола (Рис.1). Кроме того, в процессе облучения происходит образование межмолекулярных ковалентных связей и формирование связанных сеток полимера.

Исходя из средней величины кооперативного блока ПНИПА/НТБА 85/15 была проведена оценка, согласно которой плотность сшивок при процентном содержании ААБФ ниже 1.8 % не должна существенно влиять на динамику кооперативных переходов. Для проведения наших исследований методом радикальной полимеризации был синтезирован сополимер ПНИПА/НТБА/ААБФ с молярным соотношением мономерных звеньев 85/13,8/1,2. Сравнение термодинамических характеристик полимеров ПНИПА/НТБА 85/15 и ПНИПА/НТБА/ААБФ 85/13.8/1.2 показало незначительное снижение температуры фазового перехода и значительное снижение его кооперативности. (Таблица 4)

Таблица 4. Сравнение термодинамических характеристик 0.1% растворов ПНИ-ПА/НТБА/ААБФ 85%:13.8%:1.2% и ПНИПА/НТБА 85/15 __

Полимер НКТС°С АН, Дж/г Тш, °С АН, ккал/моль

ПНИПА/НТБА 85%:15% 25.1 58.. : 2.3 1.60

ПНИПА/НТБА/ААБФ 85%: 13.8%: 1.2% 22.3 62Л::' 4.4 1.73

Было проведено определение длительности облучения, необходимой для полного прохождения реакции ковалентного связывания. Для этого было исследовано равновесное набухание субстратов, облученных в течение разных промежутков времени (Рис. 18А).

Выяснилось, что для полного связывания всех хромофоров необходимо время 20-25 сек, при облучении более 40 секунд субстраты плавились под па-гревом лампы. Была проведена оценка температуры нагрева образцов в процессе УФ, сделан вывод о том, что при нагреве образцов до 80°С обеспечивается ограниченной подвижность полимерных цепей, способствующая наиболее полному ковалентному связыванию полимерных цепей.

Сравнение динамики набухания сшитого и несшитого субстратов ПНИ-ПА/НТБА/ААБФ и субстрата ПНИПА/НТБА 85/15. (Рис.18 Б) при снижении температуры ниже НКТС полимеров показало более низкие темпы набухания субстратов ПНИПА/НТБА/ААБФ по сравнению с ПНИПА/НТБА 85/15. Однако температура, при которой начинается процесс набухания сополимеров ПНИ-ПА/НТБА/ААБФ, и его динамика при данной концентрации сшивок различаются несущественно.

1 ' То ' 15 20 ' 5~' 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Время облучения, сек Температура, °С

А Б

Рис 18 Равновесное набухание субстратов ПНИПЛ/НТБА/ААБФ, облученных в течение разных промежутков времени (Л) Набухание сополимеров ПНИПА/НТБА85/15 и ПНИПА/ НТБА/ААБФ в воде через 30 минут выдерживания при различпых температурах (Б)

Сравнительное исследование адгезии и роста культур клеток на поверхности субстратов ПНИПА/НТБА 85/15 и ПНИПА/НТБА/ААБФ 85/13,8/1,2 не выявило существенных отличий между ними. (Рис.19 А).

Рис 19 Рост клеток НЕР-2 и N070 Ь929 на поверхности субстратов через 48 ч после посева (А) Открепление клеток ЫСТС1-929 и НЕР-2 от субстрата ПНИПА/НТБА/ААБФ 85/13 8/1 2 при разных временах облучения субстратов (Б)

Прокрашивание трипановым синим показало отсутствие токсичности у исследуемых субстратов ПНИПА/НТБА 85/15 и ПНИПА/НТБА/ААБФ 85/13 8/1.2. Не более 1-2% клеток связывали краситель, как в опыте, так и в контроле. Таким

образом, введение небольшого количества акриламидобензофенона не привело к изменению биосовместимости субстратов ПНИПА/НТБА/ААБФ

Исследована также зависимость времени открепления клеток от степени ковалентного связывания полимерной сетки (Рис. 19 Б). Показано, что скорость открепления клеток зависит не только от степени ковалентного связывания субстрата с поверхностью полистирола, но также и от типа клеток. Возможность изменять количество поперечных сшивок является существенным достоинством субстрата, ибо позволяет регулировать скорость открепления пластов клеток и позволяет дифференцированно откреплять от субстрата клетки разных типов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование линейных полимеров позволило исключить токсичность субстратов и предпринять комплексный подход к разработке новых биоматериалов. Исследования кооперативных фазовых переходов в растворах термочувствительных полимеров и полимерных субстратах и определение физико-химических характеристик поверхности сополимеров ПНИПА/НТБА с различным соотношением мономеров были проведены параллельно с исследованием клеточной активности. Наряду с оптимизацией свойств субстратов ПНИ-ПА/НТБА для целей тканевой инженерии, биотехнологии и медицины, проведенные исследования позволили также сделать ряд выводов, относительно возможных механизмов модуляции термочувствителыюсти и адгезионных характеристик субстратов ПНИПА/НТБА.

Разработанные нами субстраты ПНИПА/НТБА поддерживают адгезию, пролиферацию клеток и экспрессию большинства генов на уровне, сравнимом с культивированием на специально обработанном для роста клеток полистироле. При этом они обеспечивают эффективное открепление клеток от поверхности культивирования без применения протеолитических ферментов и диссоциирующих реагентов, и не требуют проведения специфической обработки поверхности, приводящей к неконтролируемому изменению ее свойств.

Разработанная нами методика формирования субстратов из спиртовых растворов линейных полимеров не требует проведения многократных промывок и стерилизации поверхности перед использованием для культивирования клеток, как в разработанных ранее методах. Показано, что медленное испарение спирта приводит к организации полимеров в структуры, стабилизированные водородными связями между С=О и N-H группами, формирование ковалентных связей между полимерными цепями позволяет закрепить сформированные структуры и обеспечивает восстановление характеристик поверхности при многократном использовании разработанных нами субстратов.

Снижение температуры фазового перехода, пропорциональное проценту содержащихся в полимерной цепи мономеров НТБА, позволяет проводить манипуляции с клетками без жесткого термостатирования, обычно применяемого при работе с субстратами ПНИПА. Снижение темпов набухания субстратов, вызванное уменьшением кооперативности фазового перехода, позволяет регулировать скорость открепления клеточных пластов.

Эффективность предложенного нами метода УФ-индуцируемого формирования полимерных сеток при использовании акриламидобензофенона в качестве сшивающего реагента существенно выше, чем в методах, предложенных ранее. Плотность наносимого нами покрытия (5ООмкг/см2) существенно превышает максимальную плотность (3 мкг/см2) покрытия ПНИПА, поли-меризуемого электронным лучом, что позволяет исключить влияние подложки на физико-химические характеристики поверхности и обеспечивает эффективное открепление клеток при снижении температуры ниже НКТС полимеров.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что усиление гидрофобных взаимодействий при увеличении количества мономерных звеньев Н-третбутилакриламида приводит к нелинейному снижению кооперативности и линейному снижению температуры фазового перехода в растворах сополимеров и термочувствительных субстратах ПНИПА/НТБА

2. Разработан метод формирования полимерных субстратов с шероховатостью поверхности, оптимальной для культивирования клеток многих типов и обеспечивающей необходимую точность при проведении анализа физико-химических характеристик поверхности.

3. Выявлено, что с увеличением процентного содержания НТБА происходит изменение конформации сополимеров ПНИПА/НТБА в пленочных субстратах и возрастает степень компактизации структуры полимеров в растворе при температурах выше НКТС. Показано, что снижение числа полярных групп, находящихся в конформации, подходящей для формирования водородных связей с молекулами воды, приводит к снижению гидратируемости поверхности субстратов ПНИПА/НТБА при температуре 37°С.

4. Установлено, что снижение гидратируемости поверхности субстратов при температуре культивирования клеток приводит к значительному увеличению адгезионных характеристик субстратов ПНИПА/НТБА по сравнению с субстратами, сформированными на основе линейных полимеров ПНИПА. Показано, что разработанные нами субстраты на основе линейных сополимеров ПНИПА/НТБА и ПНИПА/НТБА/ААБФ поддерживают адгезию, распластывание и рост фибробластов и эпителиальных клеток на уровне, сравнимом с обработанным для роста клеток полистиролом.

5. Разработана методика фотоиндуцируемого формирования полимерных сеток и ковалентного связывания субстратов ПНИПА/НТБА/ААБФ с поверхностью полистирола, установлены режимы формирования субстратов с различной степенью ковалентного связывания.

6. Выявлено, что при снижении температуры ниже НКТС все разработанные нами субстраты обеспечивают открепление клеток от поверхности без применения протеолитических ферментов и диссоциирующих реагентов. Установлено, что время, необходимое для открепления клеток, определяется темпами набухания сополимеров и существенно зависит от типа клеток и степени ковалентного связывания субстратов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Селезнева И.И., Рочев Ю.А.. Гаврилкж Б.К.. Горелов А.В. ГолубеваТ.Н., Даусон К.А. Создание новых биоматериалов на основе термочувствительных биополимеров. Второй съезд биофизиков России, 1999, т.2, с.620.

2. И.И. Селезнева, Ю.А Рочев, Б К. Гаврилюк, А.В.Горелов, Т.Н. Голубева, К.А Даусон. Исследование особенностей взаимодействия клеток с субстратами на основе термочувствительных полимеров. Тезисы стендовых сообщений школы-конференции "Горизонты физико-химической биологии" Пущино, 2000, с. 57-58

3. Iu.Rochev, T.Golubeva,, I.Selezneva, L.Allen, B. Gavrilyuk, A.Gorelov, W.Gallagher, K.Dawson. Cell behaviour on Thermoresponsive Surfaces. Book of Abstracts 14th conference of the European Colloid and Interface Society, p. 156, Greece, 2000.

4. Селезнева И.И, Давыдова ГА Сахно И.В., Рочев Ю.А, Гаврилюк Б.К. Термочувствительные полимеры на основе поли-К-изопропилакриламида для покрытия поверхности хирургических имплантатов. Тезисы докладов IV Международной конференции "Современные подходы к разработке и клиническому применению эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных имплантатов" Москва 2001, с. 175.

5. Селезнева ИИ., Рочев Ю.А, Гаврилюк Б.К., Горелов А.В., ГолубеваТ.Н., Даусон К.А. Термореверсивные субстраты на основе поли-N-изопропилакриламида для целей тканевой инженерии. Тезисы конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" Пущино 2001, с.98.

6. Rochev Yu., T. Golubeva, A.Gorelov, L.Allen W.Gallagher, I.Selezneva, B.Gavrilyuk, K.Dawson. Surface modification for controlled cell growth on copolymers of N-isopropylacrylamide. Progress in Colloid and Polymer Science 2001,v.ll8,p.l53-156.

7. И.И.Селезнева, Г.А. Давыдова, Б.К.Гаврилюк, Ю.А.Рочев, А.В.Горелов, Т.Н.Голубева. Динамические свойства термореверсивных субстратов: зависимость от межмолекулярных сшивок. «Горизонты науки. От теории к практике». Академия наук РФ. Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН. Пущино 2003. с.228-232.

8. Yu. Rochev, D. О Halloran, Т. Golubeva, V. Gilchrest, I. Selezneva, B. Gavrilyuk, A.Gorelov Rationalizing the Design of Polymeric Thermoresponsive Biomaterials Book of Abstracts 18th European Conference on Biomaterials , p. 113, Stuttgart, 2003

9. Yu. Rochev, D. О Halloran, T. Golubeva, V. Gilchrest, I. Selezneva, B. Gavrilyuk, A.Gorelov Rationalizing the Design of Polymeric Thermoresponsive Biomaterials Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 2004, v. 15 (4), 513-517.

Список цитируемой литературы

1. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия. - М.:Мир, 1985.-534 с.

2. Allen L., Fox E.J.P., Blute I., Kelly Z.D., Rochev Yu., Keenan A.K., Dawson KA., Gallagher W.M. // PNAS, 2003, vol. 100, N11,6331-6336

3. Bae YH, Okano T, Kim SW. // J. Polym. Phys. -1990-V.28, p.923-936

4. Coates J. //Encyclopedia of analytical chemistry Ed.RAMeyers /John Wiley &Sons Ltd, Chichester, -2000- p. 10815-10837

5. Dalby M.J., Riehle M.O., Johnstone H.J.H., Affiossman S, Curtis A.S.G7/ Tissue Eng -2002-V.8, p. 1099-1108.

6. Johnson R.E., Dettre R.H. //J.Phys.Chem.68-1964-, 1744-1750

7. Heskins M, Guillent J.E., James E // J. Macromol. Sci.-Chem. -1968- A2, p.1441-1455

8. Kikuchi A; Okuhara M; Karikusa F; Sakurai Y; Okano T // J Biomater Sci Polym Ed - 1998 -v.9,N12,p.l331-1348

9. Kushida A; Yamato M; Konno C; Kikuchi A; Sakurai Y; Okano T // J Biomed Mater Res.- 2000 -51:216-223

10. Kwok D.Y., Lam C.N.C., Li A., Wu L.R., Mok E., Neumann A.W//Colloids and Surfaces. A. -1998-v.l42.,p.219-235.

11. Liu H. Y. and Zhu X. X. // Polymer - 1999-v. 40,25, p 6985-6990

12. Lydon M.J., Clay C.S. // Cell Biol.Inteml.Rep. -1985-V.9, p.911-921

13. Okano T; Yamada N; Sakai H; Sakurai Y /J Biomed Mater Res. - 1993-v. 27,10, p. 1243-1251.

14. Privalov PL// Adv. Protein Chem. -1979 -v.33, p. 167-241.

15. Von Recum H.A., Kim S.W.; Kikuchi A; Okuhara M.; Sakurai Y.; Okano T. /J Biomed Mater Res. -1998 -v. 40,4,p. 631-639

16.Yu. Rochev, D. О Halloran, T. Golubeva, V. Gilchrest, I. Selezneva, B. Gavrilyuk, A.Gorelov // Materials in Medicine, v. 15 (4), 513-517,2004.

17. Takezawa Т., Mori Y., Yoshizato K. //Bio Technology-1990-V.8, p.854-856

18. Yamato M, Konno C, Utsumi M, Kikuchi A, Okano T // Biomaterials -2002-V.23, p.561-567.

Принято к исполнению 14/04/2004 Заказ № 128

Исполнено 14/04/2004 Тираж:80 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 www.autoreferat.ru

m-7739

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Селезнева, Ирина Ивановна

Введение

СОДЕРЖАНИЕ

Глава I. Термочувствительные субстраты, модификация свойств поверхности для целей тканевой инженерии.

1.1. Природа кооперативных фазовых переходов, термочувствительность полимеров и способы ее модификации.

1.2. Методы приготовления субстратов на основе поли-Ы-изопропилакриламида и анализ физико-химических характеристик их поверхности.

1.3 Взаимодействие термочувствительных субстратов на основе поли-Nизопропилакриламида с клетками и белками сыворотки.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Методы исследования фазовых переходов в растворах термочувствительных полимеров и полимерных субстратах.

2.2. Методы формирования субстратов и исследования физико —химических характеристик их поверхности.

2.3. Культура клеток: экспериментальные среды, методы культивирования, подсчета, определения адгезионной, пролиферативной активности и жизнеспособности клеток.

Глава 3. Исследование кооперативных фазовых переходов в растворах термочувствительных полимеров и полимерных субстратах на основе сополимеров N-изопропилакриламида и N-третбутилакриламида.

3.1. Исследование объемных фазовых переходов в разбавленных растворах термочувствительных полимеров методом спектрофотометрии.

3.2. Определение параметров фазового перехода методом микрокалориметрии, выявление возможных механизмов модуляции термочувствительности в сополимерах ПНИПА/НТБА.

3.3. Исследование объемных фазовых переходов в термочувствительных субстратах ПНИПА/НТБА

Глава 4. Разработка техники приготовления полимерных субстратов ПНИ

ПА/НТБА и анализ физико-химических характеристик их поверхности.

4.1. Разработка техники приготовления полимерных субстратов ПНИПА/НТБА.

4.2. Исследование эластических свойств субстратов ПНИПА/НТБА.

4.3. Анализ химической композиции субстратов ПНИПА/НТБА

4.4.Исследование смачиваемости поверхности субстратов ПНИПА/НТБА.

Глава 5. Исследование взаимодействия термочувствительных субстратов ПНИПА/НТБА с клетками, оптимизация свойств субстратов для целей тканевой инженерии.

5.1. Исследование особенностей взаимодействия клеток с термочувствительными субстратами ПНИПА/НТБА.

5.2, Разработка методики фотоиндуцируемого связывания полимеров, исследование объемных фазовых переходов в субстратах ПНИПА/НТБА/ААБФ 113 5.3 Исследование особенностей взаимодействия клеток с термочувствительной поверхностью субстрата ПНИПА/НТБА/ААБФ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и исследование термочувствительных биоматериалов на основе поли-N-изопропилакриламида"

В настоящее время культуры клеток животных и человека находят все более широкое применение в медицине и биотехнологии. Развитие клеточных технологий и тканевой инженерии выдвигает ряд новых требований к материалам, формирующим субстрат-подложку для культивирования субстратзависимых клеток млекопитающих, и составляющих основу имплантируемых тканевых конструкций. Данные материалы должны поддерживать адгезию, рост и сохранение функциональной активности клеток, обеспечивать иммобилизацию и направленную доставку факторов, управляющих формированием тканей, быть нетоксичными и, по возможности, биодеградабельными.

В 1990 году группой японских ученых был разработан субстрат для культивирования клеток на основе поли-Ы-изопропилакриламида (ПНИПА), термочувствительного полимера, несущего функциональные С=0 и N-H группы, характерные для молекул белков, и являющегося аналогом полилейцина по химическому составу. Поли-N-изопропилакриламид испытывает фазовый переход из нерастворимого в растворимое в воде состояние при температуре около 33°С, называемой нижней критической температурой сольватации (НКТС). Из всех Н,Н-алкилпроизводных акриламида ПНИПА характеризуется наиболее резким набуханием/коллапсом при переходе температуры через критическую точку, что определяется уникальным балансом гидрофоб-но/гидрофильных взаимодействий в молекуле данного полимера (Bae et al., 1990). При температуре 37°С полимер находится в нерастворимом состоянии, что позволяет использовать его в качестве твердого субстрата для культивирования клеток. Понижение температуры культивирования ниже НКТС вызывает гидратирование полимера и открепление клеток от поверхности субстрата без применения протеолитических ферментов и диссоциирующих агентов.

На основании анализа опубликованных работ можно отметить несколько основных преимуществ термочувствительных субстратов на основе ПНИПА перед традиционно используемым культуральньш пластиком. Культивирование на термочувствительной поверхности позволяет получать интактные культуры клеток и на протяжении многих пассажей поддерживать специфическую активность клеток (Okano et al, 1993). Гидрофильно/гидрофобные свойства поверхности ПНИПА позволяют управлять не только прикреплением/откреплением культур клеток, но и процессами сорбции/десорбции белков, при откреплении от субстрата клетки сохраняют функциональные белки, межклеточные контакты и синтезированный матрикс (Liu, Zhu 1999). Зависимое от температуры изменение адгезионных характеристик и набухания субстрата ПНИПА позволяет проводить позиционирование двух типов сокультивируемых клеток. (Ito et al., 1997) (Yamato et al., 2002). Данные характеристики субстрата ПНИПА подразумевают широкие возможности его применения для культивирования специализированных клеток, создания тканевых эквивалентов и проведения исследований в области клеточной биологии.

Однако, ряд недостатков, связанных в основном с существующими ныне методами формирования субстратов, ограничивают возможности широкого применения ПНИПА для нужд тканевой инженерии, медицины и биотехнологии. Основным недостатком применяемых в настоящее время методик приготовления субстратов ПНИПА является необходимость ковалентного связывания ПНИПА с поверхностью для обеспечения устойчивой адгезии и роста культур клеток. Эта необходимость вызвана сильной-гидратацией линейных полимеров ПНИПА (Takezawa et al., 1990). В настоящее время для приготовления субстратов ПНИПА чаще всего используется метод полимеризации полимера при помощи электронного луча высокой энергии непосредственно на поверхности, предназначенной для культивирования клеток (Bae et al, 1990, Yamada et al., 1990). Низкая плотность покрытия, формируемого данным методом, ограничивает динамические свойства субстратов и определяет существенное влияние свойств подложки на смачиваемость поверхности субстратов ПНИПА. К недостаткам данного метода; следует отнести также ряд ограничений на тип покрываемой поверхности, необходимость проведения многократных промывок, для удаления непрореагировавших токсичных для клеток мономеров, а также то, что аппаратура, используемая для формирования электронного луча высокой энергии, недоступна большинству исследователей, работающих с культурами клеток.

Разработаны также методы фотоиндуцируемой полимеризации ПНИПА на поверхности полистирола (Chen et al., 98).(Ichimura, Komatsu, 1987) (Moghaddam, Matsuda, 1993) (Liang et al., 2000), однако данные методы также подразумевают проведение ряда промывок и стерилизацию поверхности перед использованием ПНИПА в качестве субстрата для культивирования клеток. Различие в методах синтеза, отсутствие контроля над степенью ковалентного связывания, неконтролируемое изменение шероховатости и смачиваемости поверхности привели к значительному расхождению данных, получаемых различными исследовательскими группами.

Таким образом, наряду с несомненными преимуществами субстрата ПНИПА при проведении разработок в области тканевой инженерии, биотехнологии и медицины, недостатки, связанные с существующими технологиями формирования данных субстратов, делают актуальной задачу разработки новых композиций и новых методов формирования термочувствительных субстратов на основе ПНИПА.

Снижение гидратированности субстрата ПНИПА путем со полимеризации его с гидрофобным мономером является логичным способом повышения его адгезивных свойств. К настоящему времени путем сополимеризации НИПА с гидрофобными мономерами создан целый ряд линейных полимеров, отличающийся по температурам фазового перехода и степени его кооперативности (Takei et al., 1993) (Yoshida et al., 1994) . ( Liu, Zhu, 1999). Однако, большая часть работ, в которых исследуется влияние химической композиции полимеров на параметры фазового перехода, проводится на линейных полимерах, синтезированных стандартными химическими методами. Исследования клеточной активности, за редким исключением, проводят на термочувствительных субстратах, полимеризованных непосредственно на покрываемой поверхности. Различие в применяемых методах синтеза не позволяет корректно сравнить данные, полученные разными авторами, и выявить связь микро и макрохарактеристик субстратов, определяющих их взаимодействие с культурами клеток. Кроме того, вопросы о том, насколько однородной или неоднородной является структура сколапсировавшего полимера, какие факторы отвечают за кооперативность фазового перехода, а также какова связь макропараметров с термодинамическими характеристиками системы остаются до сих пор открытыми вследствие недостатка экспериментальных данных.

Таким образом, существует настоятельная необходимость разработки - подхода,, который позволил бы провести параллельное исследование параметров фазового перехода термочувствительных полимеров в растворах, физико-химических характеристик поверхности формируемых субстратов и особенностей взаимодействия с ними культур субстратзависимых клеток млекопитающих.

Наш подход к модификации свойств ПНИПА заключался в постепенном увеличении числа гидрофобных групп в полимере путем его сополимеризации с N-трет-бутилакриламидом (НТБА). Выбор НТБА определялся требованием минимального изменения химической структуры полимера ПНИПА, поскольку N-третбутилакриламид является наиболее гидрофобным мономером в ряду АА>ДМА>ЭА>ДЭА>ТБА (Liu, Zhu, 1999) и отличается от НИПА наличием одной дополнительной метальной группы.

Для обеспечения эффективности фотоиндуцируемого ковалентного связывания субстрата с поверхностью было предложено ввести в состав линейных полимеров мономерные звенья акриламидобензофенона, т.к. преобразование фенилазидогрупп происходит гораздо быстрее и с большей эффективностью, чем реакции циклодимеризации хромофоров типа циннамолила, кумаролила и производных стилбена.

Цель данной работы заключалась в разработке на основе сополимеров N-изопропилакриламида (НИПА) и N-третбутилакриламида (НТБА) и акриламидобензофенона (ААБФ) новых термочувствительных материалов, предназначенных для поддержания роста субстратзависимых клеток, а также обеспечения бесферментного открепления клеток от поверхности культивирования.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Исследование особенностей фазовых переходов в растворах термочувствительных полимеров и термочувствительных субстратах ПНИПА/НТБА. Выявление возможных механизмов модуляции температуры и кооперативности фазовых переходов сополимеров ПНИПА/НТБА в растворах и в пленочных субстратах.

3. Исследование адгезии, роста и бесферментного открепления клеток от поверхности субстратов ПНИПА/НТБА. Определение оптимального композиционного состава субстрата ПНИПА/НТБА, обеспечивающего высокую адгезионную и пролифера-тивную активность, а также эффективное бесферментное открепление клеток.

4. Разработка методики фотоиндуцируемого формирования полимерных сеток, определение влияния введенных в состав сополимера фотоиндуцируемых мономеров акриламидобензофенона (ААБФ) на термочувствительность формируемых субстратов ПНИПА/НТБА/ААБФ и их взаимодействие с клетками.

Объектом нашего исследования; стали линейные сополимеры N-изопропилакриламида и N-третбутилакриламида с различным соотношением мономерных звеньев, синтезированные на химическом факультете Дублинского Университета А.Гореловым и Т.Голубевой. Учитывая то, что данные полимеры не несут на поверхности электрического заряда и химическая структура в ряду сополимеров НИПА/НТБА меняется минимально, данные сополимеры мы рассматривали в качестве модельной системы для исследования влияния относительного количества гидрофобных групп на термочувствительность полимеров и их взаимодействие с субстратзависимыми клетками млекопитающих. Использование линейных полимеров ПНИПА/НТБА позволило предпринять комплексный подход к разработке новых термочувствительных биоматериалов: исследования кооперативных фазовых переходов в растворах термочувствительных полимеров и полимерных субстратах и определение физико-химических характеристик поверхности сополимеров ПНИПА/НТБА с различным соотношением мономеров были проведены параллельно с исследованием клеточной активности.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственного экспериментального материала, выводов и библиогафического списка использованной литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Селезнева, Ирина Ивановна

124 ВЫВОДЫ

1. Установлено, что усиление гидрофобных взаимодействий при увеличении количества мономерных звеньев N-третбутилакриламида приводит к нелинейному снижению кооперативности и линейному снижению температуры фазового перехода в растворах сополимеров и термочувствительных субстратах ПНИПА/НТБА.

4. Установлено, что снижение гидратируемости поверхности субстратов при температуре культивирования клеток приводит к значительному увеличению адгезионных характеристик субстратов ПНИПА/НТБА по сравнению с субстратами, сформированными на основе линейных полимеров ПНИПА. Показано, что разработанные нами субстраты на основе: линейных сополимеров ПНИПА/НТБА и ПНИПА/НТБА/ААБФ поддерживают адгезию, распластывание и рост фибробластов и эпителиальных клеток на уровне, сравнимом с обработанным для роста клеток полистиролом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Селезнева И.И., Рочев Ю.А. Гаврилюк Б.К. Горелов А.В. ГолубеваТ.Н., Даусон К.А. Создание новых биоматериалов на основе термочувствительных биополимеров.

Ф Второй съезд биофизиков России, 1999, т.2, с.620.

2. И.И. Селезнева, Ю.А. Рочев, Б.К. Гаврилюк, А.В.Горелов, Т.Н. Голубева, К.А. Даусон. Исследование особенностей взаимодействия клеток с субстратами на основе термочувствительных полимеров. Тезисы стендовых сообщений школы-конференции "Горизонты физико-химической биологии" Пущино, 2000, с. 57-58

3. Iu.Rochev, T.Golubeva,, I.Selezneva, L.Allen, В. Gavrilyuk, A.Gorelov, W.Gallagher, K.Dawson. Cell behaviour on Thermoresponsive Surfaces. Book of Abstracts 14th conference of the European Colloid and Interface Society, p. 156, Greece, 2000.

4. Селезнева И.И, Давыдова Г.А, Сахно И.В., Рочев Ю.А, Гаврилюк Б.К. Термочувствительные полимеры на основе поли-Ы-изопропилакриламида для покрытия поверхности хирургических имплантатов. Тезисы докладов IV т Международной конференции "Современные подходы к разработке и клиническому применению эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных имплантатов" Москва 2001, с.175.

5. Селезнева И.И., Рочев Ю.А., Гаврилюк Б.К., Горелов А.В., ГолубеваТ.Н., Даусон К.А. Термореверсивные субстраты на основе поли-Ы-изопропилакриламида для целей тканевой инженерии. Тезисы конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" Пущино 200Г, с.98.

6. Rochev Yu., Т. Golubeva, A.Gorelov, L.Allen W.Gallagher, I.Selezneva, B.Gavrilyuk, K.Dawson. Surface modification for controlled cell growth on copolymers of N-isopropylacrylamide. Progress in Colloid and Polymer Science 2001, v.l 18, p. 153-156.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование линейных полимеров позволило исключить токсичность субстратов и предпринять комплексный подход к разработке новых биоматериалов. Исследования кооперативных фазовых переходов в растворах термочувствительных полимеров и полимерных субстратах и определение физико-химических характеристик поверхности сополимеров ПНИПА/НТБА с различным соотношением мономеров были проведены параллельно с исследованием клеточной активности. Наряду с оптимизацией свойств субстратов ПНИПА/НТБА для целей тканевой инженерии, биотехнологии и медицины, были проведены исследования, направленные на выявление связи микро и макропараметров субстратов, определяющих их взаимодействие с культурами клеток. Проведенные исследования позволили также сделать ряд выводов, относительно возможных механизмов модуляции термочувствительности и адгезионных характеристик субстратов ПНИПА/НТБА.

Таким образом, все поставленные задачи были решены. Разработанные нами субстраты ПНИПА/НТБА поддерживают адгезию, пролиферацию клеток и экспрессию большинства генов на уровне, сравнимом с культивированием на специально обработанном для роста клеток полистироле, но при этом обеспечивают эффективное открепление клеток без применения ферментов и диссоциирующих агентов. Данные субстраты могут быть использованы для позиционирования трех и более типов клеток, создания сложных тканевых конструкций, предназначенных для восстановления поврежденных органов и тканей. Термочувствительные субстраты ПНИПА/НТБА обеспечивают возможность получения интактных первичных культур клеток и сохранения их специфической активности в течение многих пассажей, что открывает перспективу их применения в биотехнологии, для производства биологически активных препаратов, а также в медицине для проведения клеточной терапии тканей и органов. Высокая эластичность субстратов ПНИПА/НТБА в сочетании с возможность контролируемой доставки лекарственных препаратов открывают возможность применения разработанных нами материалов в качестве полимерного покрытия имплантируемых конструкций.

Разработанная нами методика формирования субстратов из спиртовых растворов линейных полимеров не требует проведения многократных промывок и стерилизации поверхности перед использованием для культивирования клеток, как в разработанных ранее методах. Медленное испарение спирта приводит к самоорганизации полимеров, следствиями которого являются минимизация площади поверхности и снижение шероховатости формируемых субстратов до уровня 15 нм, оптимального для адгезии, роста и поддержания функциональной активности клеток разных типов.

Снижение температуры фазового перехода, пропорциональное проценту содержащихся в полимерной цепи мономеров НТБА, позволяет проводить манипуляции с клетками без жесткого термостатирования, обычно применяемого при работе с субстратами ПНИПА. Снижение темпов набухания субстратов, вызванное уменьшением кооперативное™ фазового перехода, позволяет регулировать скорость открепления клеточных пластов.

Эффективность предложенного нами метода УФ-индуцируемого формирования полимерных сеток и ковалентного связывания их с поверхностью полистирола при использовании акриламидобензофенона в качестве сшивающего реагента существенно выше, чем в методах, предложенных ранее, плотность наносимого нами покрытия (500мкг/см2) существенно превышает максимальную плотность (3 мкг/см2) покрытия ПНИПА, полимеризуемого электронным лучом.

Наиболее интересным результатом, полученным на данном этапе, явилось выявление связи термодинамических характеристик с макропараметрами системы. Резкое увеличение числа кооперативных блоков и константы инициации коллапса, характеризующее снижение термочувствительности полимеров, происходит при том же соотношении соотношении мономерных звеньев НИПА и НТБА ( приблизительно 3/1), при котором резко меняются темпы набухания полимерных субстратов и степень связывания ими воды при температуре культивирования. При том же соотношении мономерных звеньев происходит резкое снижение удельной теплоемкости сколапсировавших полимеров. Эта связь может отражать наличие, по крайней мере, двух основных конформаций сополимеров ПНИПА/НТБА. Первая конформация при соотношении мономеров выше 3/1 — характеризуется высокой' кооперативностью фазового перехода, вторая, более компактная конформация, характеризуется низкой кооперативностью фазового перехода и низким содержанием С=0 и N-H групп, находящихся; в конформации, подходящей для образования водородных связей с молекулами воды. Продолжение исследований в данном направлении может привести к лучшему пониманию механизмов кооперативных фазовых переходов.

Результаты данной диссертационной работы можно применить как в дальнейших разработках термочувствительных биоматериалов, предназначенных для поддержания формирования тканей, иммобилизации и направленной доставки лекарственных препаратов, разделения макромолекул и регуляции активности биокатализаторов, так и в проведении исследований в области клеточной биологии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Селезнева, Ирина Ивановна, Пущино

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж, Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки // М. Мир, 1986, т.1., с.64

2. Галаев Ю.В. "Умные "полимеры в биотехнологии и медицине //Успехи химии, 1995, т.64, № 56 с.505

3. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия. — М.:Мир, 1985.-534 с.

4. Киреев В.В. Высокомолекулярные соединения // Высшая школа 1992 с.18

5. Матвеев Ю.И., Аскадский А.А. Влияние физических характеристик и типа надмолекулярной структуры полимера на его растворимость. Высокомолекулярные соединения . серия А, 1994. Т.36, :№3, с. 436-443

6. Попович С.Н. Чупов В.В., Платэ Н.А. Синтез и свойства рН-зависимых термочувствительных сополимеров. Высокомолекулярные соединения, сер. Б- 1997- т. 39, № 12, с 2054-2058

7. Птицын О.Б., Эйзнер Ю.Е. Теория переходов глобула-клубок в макромолекулах // Биофизика 1965-т.Ю, с.З.

8. Сумм Б.Д., Горюнов Ю.В. Физико-химические основы смачивания и растекания. // М., Химия-1976-232с.

9. Сумм Б.Д. Гистерезис смачивания // Соросовский образовательный журнал -1999-№76 с.98-102

10. Филиппова О.Е. "Восприиммчивые" полимерные гели //Высокомолекулярные соединения -2000- серия С, т.42,126, с.2328-2352

11. Abuzakouk М., Feighery С., Farrely С.О. Collagenase and dispase enzymes disrupt lymphocyte surface molecules // J.Immunol. Methods 1996- v. 194, p.211-216.

12. Amiya Т., Hirokawa Y., Hirose Y., Li Y. and Tanaka Т., Reentrant phase transition of N-isopropylacrylamide gels in mixed solvents. //J. Chem. Phys. 86 (1987), pp. 2375-23

13. Andrade J.D., Interfacial phenomena and biomaterials.// Med. Instrumentation- 1973- vl, pllO

14. Anrade J.D., Smith L.M., Gregonis D.E. //Surface and interfacial aspects of biomedical polymers// Andrade J.D. Ed. Plenum Press:New York-1985-voll, chapter7, p.280

15. Bae YH; Okano T; Hsu R, Kim S.W. Thermo-sensitive polymers as on-off switches fordrug release //Makromol.Chem.: Rapid Commun. 1987- v.8, p.481-485

16. Bae YH, Okano T, Kim SW. Temperature dependence of swelling of crosslinked poly(N,N'-alkyl substituted acrylamide) in water.// J. Polym. Phys. -1990-v.28,p.923-936

17. Bae YH; Okano T; Kim SW "On-off' thermocontrol of solute transport. I. Temperature dependence of swelling of N-isopropylacrylamide networks modified with hydrophobic components in water// Pharm Res. 1991 - Apr, 8,N4, 531-537

18. Baier R.E., Conditioning surfaces to suit the biomedical environment // J.Biomech. Eng. 1982, 104, 257

19. Baier R.E., Meyer A.E., Natiella J.R., Natiella R.R., Carter J.M. Surface properties determine bioadhesive outcomes: Methods and results // J .Biomed. Mater. Res. -1984-V.18, pp337-355

20. Banovac F., Saavedra S.S., Truskey G.A. Local conformational changes of vitronectin upon adsorption on glass and silane surfaces. //J.Colloid Int.Sci.-1994-v.165, p.31-40

21. Beake B. D., Leggett G. J.: Nanoindentation and nanoscratch testing of uniaxially and biaxially drawn po!y(ethylene terephthalate) film // Polymer-2002- v.43, p.319-327.

22. Bell E.,Ivarsson B, Merrill C. Production of tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1979-V.76, p. 1274-1278

23. Bhatia S.N., Yarmush M.L., Toner M. Controlling cell interactions by micropatterning in co-cultures: hepatocytes and 3T3 fibroblasts //J. Biomed. Mater.Res -1997-v.34,p. 189199

24. Bhatia S.N., Balis U.J., Yarmush M.L., Toner M. Effect of cell-cell interactions in preservation of cellular phenotype: cocultivation of hepatocytes and nonparenchymal cells. //FASEB J.- 1999-V.13, p. 1883-1990.

25. Birdi K.S., Cell adhesion on solids and role of surface forces //J. Theor.Biol., -1981-V.93, p.1-5.

26. Boutris C., Chatzi E.G., Kiparissides C. Characterization of the LCST behaviour of aqueous poly(N-isopropy!acrylamidesoIutions by thermal and cloud point techniques //Polymer -1997-V.38, N10, p.2567-2570

27. Chen G, Hoffman A.S. Preparation and properties of thermoreversible, phase-separating enzyme-oligo(N-isopropy!acrylamide) conjugates //Bioconjug Chem, -1993-4, 6, p.509-514.

28. Chen G; Imanishi Y; Ito Y. Effect of protein and cell behavior on pattern-grafted ther-moresponsive polymer. // J Biomed Mater Res, 1998 Oct, 42,N1,38-44

29. Clark P., Connolly P., Curtis A.S.G., Dow J.A.T., Wilkinson C.D.W. //Cell guidance byultrafine topography in vitro. // J.Cell Sci.-1991-v.99, p.73-77

30. Clemence J, Ranieri J.P., Aebischer P., Sigrist H. Photoimmobilization of a bioactive laminin fragment and pattern-guided selective neuronal cell attachment //Bioconj.Chem-1995-V.6, p.411-417.

31. Coates J. Interpretation of infrared spectra, a practical approach //Encyclopedia of analytical chemistry Ed.R.A.Meyers /John Wiley &Sons Ltd, Chichester, -2000- p. 1081510837

32. Curtis, A.S.G., Forrester, Clark P. Substrate hydroxylation and cell adhesion // J.Cell Sci. 86,9-24, 1986.

33. Curtis A., Wilkinson C. Topographical control of cells. //Biomaterials -1997-V.18, p.1573-1583.

34. Dalby M.J., Riehle M.O., Johnstone H.J.H., Affrossman S, Curtis A.S.G. Polymer demixed nano-topography: control of fibroblast spreading and proliferation. // Tissue Eng -2002-V.8, p.1099-1108.

35. Desai, N.P., Hossainy S.F.A., Hubbell J.A. Surface-immobilized polyethylene oxide for bacterial repellence// Biomaterials 1992-13,417-420.

36. Ding Z; Chen G; Hoffman AS Unusual properties of thermally sensitive oligomer-enzyme conjugates of poly(N-isopropylacrylamide)-trypsin. //Biomed Mater Res.-1998-39:3, p.498-505

37. Ding Z; Long CJ; Hayashi Y; Bulmus EV; Hoffman AS; Stayton PS .Temperature control of biotin binding and release with A streptavidin-poly(N-isopropylacrylamide) site-specific conjugate.// Bioconjug Chem.-1999 -May, 10:3,395-400

38. Dusek K., Patterson D. //J.Polym. Sci. A-2, 1968, v.6, N7,12

39. Dusek K.,PrinsW.//Adv. Polym. Sci., 1969, v.6, N1, pi.

40. Eriksson K.-O. Hydrophobic interaction chromatography//in: J.-C. Janson, L. Ryden (Eds.), Protein Purification. Principles, High Resolution Methods, and Applications, VCH, New York, 1989, pp. 207-226.

41. Ertel S.I., Chilkoti A., Horbett T.A., Ratner B.D. Endothelial cell growth on oxygen-containing films deposited by radiofrequency plasmas: the role of surface carbonil groups //J. Biomater.Sci., Polym.Edn-1991-v.3, p.163-183

42. Fujishige S., Kubota K.and Ando I., Phase transition of aqueous solutions of poly(Nisopropylacrylamide) and poly(N-isopropylmethacrylamide). J. Phys. Chem. -1989-v. 93, p. 3311-3313.

43. Galaev I.Y. and Mattiasson B. "Smart" polymers and what they could do in biotechnology and medicine. // Tibtech 1999, vol 17, pp 335-340.

44. Gouras P., Cao H., Sheng Y., Tanabe Т., Y. Efremova Y, Kjeldbye H. Patch culturing and transfer of human fetal retinal epithelium // Graefes Arch.Clin. Exp. Opthalmol. — 1994- v. 232, 599-607

45. Grinnel, F. Cellular adhesiveness and extracellular substrata // Int.Rev.Cytol. -1978-V.3, p.65-144

46. Grinnell F., Lang B.S. Binding of soluble plasma fibronectin to baby hamster kidney cells occurs at 4°C. //J.Cell.Biol.-1981-v.87, p. 127

47. Harris A.K., Wild P., Stopak D. Silicon rubber substrate: a new wrinkle in the study of cell locomotion. // Science -1980-v. 208, p. 177-179.

48. Harmon M.E., Kuckling D., Curtis W.F. Photo-cross-linkable PNIPAm copolymers. 2. Effects of constraint on temperature and pH-responsive hydrogel layers. //Macromolecules -2003-V.36, p. 162-172.

49. Heskins M, Guillent J.E., James E. Solution properties of poly (N-isopropylacrylamide) // J. Macromol. Sci.-Chem. -1968- A2, p.1441-1455

50. Hirokava Y, Tanaka T. //J.Chem. Phys. -1984-V.81,12, p6379

51. Hirasa O, Ito S., Yamauchi A., Fujishige S.,Ichijo H.//Polymer Gels. Fundamentals and Biomedical Applications/ Ed. By DeRossi D., Kajiwara K., Osada Y., Yamauchi A. New York; London: Plenum Press-1991- p.247.

52. Hirose M., Kwon O.H., Yamato M, Kikuchi A., Okano T. Creation of designed cell sheets that are noninvasively harvested and moved to another surface. //Biomacromolecules -2000-v. 1, p.377-381.

53. Hoffman A.S., "Intelligent" polymers in medicine and biotechnology //Artif. Organs -1995-v.19, p. 458-467.

54. Hubbell J.A. Biomaterials in tissue engineering //Bio Technology -1995- v. 13, p.565-576

55. Ichijo H, Kishi R., Hirasa O., Takiguchi Y.//Polym. Gels and Networks. -1994- v.2, N3/4, p.315

56. Ichimura K., Komatsu T. //J.Polym.Sci.,Polym.Chem.-1987 -v.25, p.1475-1480

57. Idziak I., Avoce D., Lessard D., Gravel D., Zhu X.X. Thermosensitivity of aqueous solutions of poly(N,N-diethylacrylamide)//Macromolecules -1999-V.32, p. 1260-1263

58. Inomata H., Goto S. and Saito S., Phase transition of N-substituted acrylamide gels.// Macromolecules -1990-V.23, p. 4887-4888

59. Ishidao Т., Hashimoto Y., Iwai Y., Arai Y //Colloid Polym. Sci -1994-V.272, N 10, p.1313

60. Ista LK; Perez Luna VH; Lopez GP .Surface-grafted, environmentally sensitive polymers for biofilm release. //Appl Environ Microbiol.- 1999 v.65, N4, p.1603-1609

61. Ito Y., Chen G., Guan Y., and Imanishi Y. Patterned Immobilization of thermorespon-sive polymer. //Langmuir -1997-13, p.2756-2759.

62. Johnson R.E., Dettre R.H. Contact angle hysteresis. III. //J.Phys.Chem.68 -1964-, p. 1744-1750

63. Johnson R.E., Dettre R.H. Contact angle hysteresis. IV. //J.Phys.Chem.69 -1964-, p.1507-1515

64. Kanazawa H; Kashiwase Y; Yamamoto K; Matsushima Y; Kikuchi A; Sakurai Y; Okano T. Temperature-responsive liquid chromatography. 2. Effects of hydrophobic groups in N-isopropylacrylamide copolymer-modified silica. //Anal Chem. -1997-v. 69,N5, p.823-30

65. Kaneko Y., Yoshida R., K. Sakai, Sakurai Y., Okano T. Temperature-responsive shrinking kinetics of poly(N-isopropylacrylamide) copolymer gels with hydrophilic and hydrophobic comonomers // J.Membrane Science -1995-v.lOl, p.13-22

66. Katsuto O., Inomata H., Goto S. and Saito S., Thermal analysis of the volume phase transition with N-isopropylacrylamide gels.// Macromolecules -1990- v.23, p. 283-289.

67. Kawaguchi H., Fujimoto K., Mizuhara Y. Hydrogel microspheres, III. Temperature-dependent adsorption of proteins on poly-N-isopropylacrylamide hydrogel microspheres // Colloid Plym Sci. -1992-V.270, p.53-57

68. Kidoaki S., Ohya S., Nakayama Y., Matsuda T. Thermoresponsive structural change of a poly(N-isopropylacrylamide) Graft Layer Measured with an atomic force microscope// Langmuir -2001 -v. 17, p.2402-2407.

69. Kim S.W., Kikuchi A., Okuhara M., Sakurai Y., Okano T. Novel thermally reversible hydrogel as detachable cell culture substrate//J Biomed Mater Res-1998-v. 40, p.631-639

70. Klein-Soyer C., Hemmendinger S., Cazenave J.-P. Culture of human vascular endothelial cells on a positively charged polystyrene surface. Primaria: comparison with fibronectin-coated tissue culture grade polystyrene. //Biomaterials —1989-v.lO, p.85-90.

71. Kubota K., Fujishige S. and Ando I., Single-chain transition of poly(N-isopropylacrylamide) in water. // J. Phys. Chem. -1990-V.94, p. 5154-5158.

72. Kushida A; Yamato M; Konno C; Kikuchi A; Sakurai Y; Okano T Temperature responsive culture dishes allow nonenzymatic harvest of differentiated Mardin-Darby canine kidney (MDCK) cell sheets. // J Biomed Mater Res.- 2000 v.51, p.216-223

73. Kwok D.Y., Lam C.N.C., Li A., Wu L.R., Мок E., Neumann A.W. Measuring and interpreting contact angles: a complex issue // Colloids and Surfaces. A. -1998- v. 142, p.219-235.

74. Kwok D.Y., Neumann A.W. Contact angle measurement and contact angle interpretation //Adv.Colloid Interface Sci.-1999-v.81, p.167-249

75. Lakhiari H; Okano T; Nurdin N; Luthi C; Descouts P; Muller D; Jozefonvicz J. Temperature-responsive size-exclusion chromatography using poly(N-isopropylacrylamide) grafted silica.// Biochim Biophys Acta -1998 -vl379, N 3, p. 303-313

76. Lau A.C.W., Wu C. Thermally sensitive and biocompatible poly(N-vinilcaprolactam): synthesis and characterization of high molar mass linear chains //Macromolecules -1999-v.32, p.581-584.

77. Lee J.H., Jung H.W., Kang I.K., Lee H.B. Cell behaviour on polymer surfaces with different functional groups. //Biomaterials -1994-v. 15, N.9, p.705-711.

78. Lee J.S., Sugioka K., Toyoda K, Offenhausser A., Knoll W, Sasabe H. Micropatterning of cultured cells on polystyrene surface by using an eximer laser //Appl.Phys.Lett.-1994-v.65, p.400-402.

79. Li Y., Tanaka T. Kinetics of swelling and shrinking of gels //J.Chem. Phys,-1990-v.92, p. 1365

80. Liang L., Feng X., Liu J., Rieke P.C., Fryxell G.E. Reversible surface properties of glass plate and capillary tube grafted by photopolymerization of N-izopropylacrylamide.// Macromolecules 1998 -v.31, p.7845

81. Liang L., Rieke P.C., Fryxell G.E., Liu J., Engehard M.H., Alford K.L. Temperature-sensitive surfaces prepared by UV photografting reaction of photosensitizer and N-isopropylacrylamide. //J.Phys.Chem. B. -2000-V.104, p.l 1667-11673.

82. Liang L., Rieke P.C., Liu J., Fryxell G.E., Young J.S., Engehard M.H., Alford K.L. Surfaces with reversible hydrophilic/hydrophobic characteristics on cross-linked poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels //Langmuir. -2000-V.16, p.8016-8023.

83. Lifshits I.M., Grosberg A.Yu., Khokhlov A.R. // Rev.Modern Phys., 1978, v.50, p.683.

84. Liu H. Y. and Zhu X. X. Lower critical solution temperatures of N-substituted acrylamide copolymers in aqueous solutions // Polymer 1999-v. 40,25, p 6985-6990

85. Liu H., Avoce D., Song Z., Zhu X. X. N-Isopropylacrylamide Copolymers with Acrylamide and Methacrylamide Derivatives of Cholic Acid: Synthesis and Characterization // Macromolecular Rapid Communications-2001-v.22, N9, p. 675-680

86. Lumry R., Biltonen R.L., Brandts J.F. Validity of the "two-state" hypothesis for conformational transitions of protein. // Biopolymers 1966- v.4, p. 917-944.

87. Lydon M.J., Minett T.W., Tighe B.J. Cellular interactions with synthetic polymer surfaces in culture. // Biomaterials -1985- v. 6, p. 396-402

88. Lydon M.J., Clay C.S. Substratum topography and cell traction on sulphuric acid treated bacteriological-grade plastic. // Cell Biol.Internl.Rep. -1985-V.9, p.911-921

89. Makhaeva E.E., Le Thi Minh Thanh, Starodoubtsev S.G., Khokhlov A.R.// Macromol. Chem. Phys. -1996-V.197, 6, p. 1973

90. Marler J.J., Upton J., Langer R., Vacanti J.P. Transplantation of cells in matrices for tissue regeneration //Advanced Drug Delivery Reviews -1998-V.33, p.165-182

91. Maroudas, N.G., Chemical and mechanical requirements for fibroblast adhesion //Nature -1973-244,353

92. Matsubara C; Izumi S; Takamura K; Yoshioka H; Mori. Determination of trace amounts of phosphate in water after preconcentration using a thermally reversible polymer. // Y Analyst-1993 118:5,553-556

93. Matsuda Т., Sugawaga Т., Control of cell adhesion, migration and orientation on photo-chemically microprocessed surfaces// J. Biomed.Mater.Res.-1996- v32, p. 165-173

94. Matsuyama A. and Tanaka F. Theory of solvation-induced reentrant coil-globule transition of an isolated polymer chain. // J. Chem. Phys. -1991- v.94, p. 781-786.

95. Mikheeva L.M., Grinberg N.V., Mashkevich A.Ya., Grinberg V.Ya. Microcalorimetric study of thermal cooperative transitions in poly(N-vinilcaprolactam) hydrogels //Macromolecules -1997-V.30, p.2693-2699

96. Moghaddam M.J., Matsuda T.J. //J.Polymer Sci., Polym.Chem.-1993-v.31,p.l589-1597

97. Mrksich M., Chen C.S., Xia Y, Dike L.E., Ingber D.E., Whitesides G.M. Controlling cell attachment on contoured surfaces with self-assembled monolayers of alkanethiolates on gold// Proc. Natl. Acad.Sci.-1996- US A,v. 93, p. 10775-10778

98. Oliver, W.C.; Pharr, G.M An improved technique for determining hardness and elastic modulus using load and displacement sensing indentation experiments //Journal of Materials Research-1992 -.v 7, N.6, p.1564-1583

99. Ю9.0капо T, Bae YH, Jacobs H, Kim SW. Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release. // J Control Rel. -1990- v.l 1, p 255-265.

100. Ю.Окапо Т., Molecular design of temperature-responsive polymers as intelligent materials. // Adv. Polym. Sci. -1993-v.l 10, p. 179-200

101. Okano T; YamadaN; Sakai H; Sakurai Y A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide). //J. Biomed Mater Res. 1993-v. 27,10, p. 1243-1251.

102. Park TG; Hoffman AS. Estimation of temperature-dependent pore size in poly(N-isopropylacrylamide) hydrogel beads. //Biotechnol Prog. 1994 -v. 10,1, p. 82-86.

103. Pelham R.J., Wang Y.L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility//Proc.Natl.Acad.Sci.USA -1997-V.94, p.13661-13665

104. Pharr G.M. Measurement of mechanical properties by ultra-low load indentation. //Mater.Science and Engineering A-1998-V.253, p. 151-151

105. Prange M.M., Hooper M.H., Prausnitz J.M. Thermodynamics of aqueous systems containing hydrophilic polymers or gels. //Am. Inst. Chem. Eng. J. -1989-V.35, p. 803-813.

106. Poland D., Scheraga H.A., Theory of Helix-Coil Transitions in Biopolymers //New York, Academic Press, 1970

107. Privalov P.L., Stability of proteins.// Adv. Protein Chem. -1979 -v.33, p. 167-241.

108. Privalov P.L. Stability of proteins.// Adv.Protein Chem.-1982- v.35, p.1-104

109. Privalov P.L., Potekhin S.A. Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins. //Methods Enzymol. —1986 —v.131, p. 4—51.

110. Ramos S.M.M., Charlaix E., Benyagoub A. Contact angle hysteresis on nano-structured surfaces // Surface Science -2003-V.540, p.355-362.

111. Von Recum H.A., Kim S.W.; Kikuchi A; Okuhara M.; Sakurai Y.; Okano T. Novel thermally reversible hydrogel as detachable cell culture substrate. //J Biomed Mater Res. -1998-v. 40,4,p. 631-639

112. Von Recum H; Kikuchi A; Okuhara M; Sakurai Y; Okano T; Kim S.W . Retinal pigmented epithelium cultures on thermally responsive polymer porous substrates.// J Bio-mater Sci Polym Ed.- 1998 -v. 9,11, p. 1241-1253.

113. Rollason G., Davies J.E., Sefton M.V. Preliminary report on cell culture on a themally reversible copolymer// Biomaterials -1993-V.14, p. 153-155

114. Academic Press, 1962, p.l 131.Schild H. G. Poly(N-isopropylacrylamide) experimental, theory and application // Prog.

115. Poly(N-isopropylacrylamide)-based hydrogels that support tissue formation in vitro //Macromolecules -1999-V.32, p.7370-7379

116. Tanaka T. //Phys. Rev. Lett. 1978, v.40, N12, p. 820

117. Takei YG, Aoki T, Sanui K, Ogata N, Okano T, Sakurai Y. Temperature- responsive bio-conjugates. 2. Molecular design for temperature-modulated bioseparations // J. Bioconju-gate Chem. -1993-v.4,p. 341-348.

118. Takei YG, Aoki T, Sanui K, Ogata N, Sakurai Y, Okano T. Dynamic contact angle measurement of temperature-responsive surface properties for Poly(N-isopropylacrylamide) grafted surfaces // Macromolecules -1994-v. 27, p.6163-6166.

119. Takei Y.G., Aoki Т., Sanui K; Ogata N., Sakurai Y., Okano T. Temperature-modulated platelet and lymphocyte interactions with poly(N-isopropylacrylamide)-grafted surfaces.// Biomaterials -1995-v. 16, 9, p. 667-673

120. Takezawa Т., Mori Y., Yoshizato K. Cell culture on a thermo-responsive polymer sur-face//Bio Technology-1990-V.8, p.854-856

121. Takezawa T; Yamazaki M; Mori Y; Yonaha T; Yoshizato К Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes.// J Cell Sci.- 1992 101 (Pt 3):,p. 495-501

122. Takezawa T; Mori Y; Yonaha T; Yoshizato К. Characterization of morphology and cellular metabolism during the spheroid formation by fibroblasts.// Exp Cell Res.- 1993- v. 208,N 2, p.430-41

123. Tateno C., Yoshizato K., Long-term cultivation of adult rat hepatocytes that undergo multiple cell divisions and express normal parenchymal phenotypes. //Am J. Pathol -1996-V.148, p.383-392.

124. Taylor L.D. and Cerankowski L.D. Preparation of films exhibiting a balanced temperature dependence to permeation by aqueous solutions: A study of lower consolute behavior.//!. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. -1975- v. 13 p. 2551-2570.

125. Thom V.H., Altankov G., Groth Th., Jankova K., Jonsson G., Ulbricht M. Optimizing cell-surface interactions by photografting of poly(ethylene glycol) //Langmuir-2000-v.6, p.2756-2765.

126. Tiktopulo E.I., Uversky V.N., Lushchik V. В., Klenin S.I., Bychkova V.T., Ptitsyn O.B. "Domain" Coil-Globule Transition in Homopolymers// Macromolecules-1995- v.28,р.7519-7524.

127. Tiktopulo E.I., Kajava A.V., Denaturation of Type I collagen fibrils is an endothermic process accompanied by noticeable change in the partial heat capacity// Biochemistry1998- v.37, p.8147-8152

128. Uchida K., Sakai K., Ito E., Kwon O.H., Kikuchi A., Yamato M., Okano T. Temperature-dependent modulation of blood platelet movement and morphology on poly(N-isopropylacrylamide)-grafted surfaces. Biomaterials -2000- v.21, p.923-929.

129. Uludag H., Nome B, Kousinioris N.,Gao T. Engineering Temperature-sensitive poly(N-isopropylacrylamide) polymers as carriers of therapeutic proteins //Biotechnol. And Bio-engineering -2001 -v.73,6,20, p.510-521.

130. Vernon B; Kim SW; Bae YH Insulin release from islets of Langerhans entrapped in a poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid) polymer gel. // J Biomater Sci Polym Ed.1999-v. 10, N2,183-98

131. Volpe C.D., Cassinelli C., Morra M. Wilhelmy plate measurements on poly(N-isopropylacrylamide)-grafted surfaces. //Langmuir-1998-v.l4, p.4650-4656.

132. Waymouth C. To disaggregate or not to disaggregate, injury and cell disaggregation, transient or permanent //In Vitro 1974- v. 10, p.97- 111.

133. Winnik F.M. Fluorescence studies of aqueous solutions of poly(N-isopropylacrylamide) below and above their LCST.// Macromolecules -1990-V.23, p. 233-242.

134. Wojciak-Stothard В., Curtis A., Monaghan W., Macdonald K., Wilkinson C. Guidance and activation of murine macrophages by nanometric scale topography //Cell Res.- 1996-v.223, p.426-435.

135. Wu, S., Polar and non-polar interactions in adhesion. //J.Adhesion -1973- 5,39

136. N. Yamada, T. Okano, H. Sakai, F. Karikusa, Y. Sawasaki, and Y. Sakurai, Termo-responsive polymeric surfaces: Control of attachment and detachment of cultured cells, // Makromol. Chem.: Rapid Commun. -1990- 11,571-576

137. Yamato M., Adachi E., Yamamoto K., Hayashi T. Condensation of collagen fibrils to the direct vicinity of fibroblasts as a cause of gel contraction. //J. Biochem 1995-v.l 17, p.940-946.

138. Yamato M., Konno C., Kushida A., Hirose M., Utsumi M., Kikuchi A., Okano T. Release of adsorbed fibronectin from temperature-responsive culture surfaces requires cellular activity. // Biomaterials -2000-V.21, p.981-986.

139. Yamato M., Kushida A., Kwon O.H., Hirose M., Utsumi M., Kikuchi A., Okano T. Cell sheet engineering// In: Ikada Y, Shimizu Y, editors. Tissue Engineering for Therapeutic Use 4. Amsterdam: Elsevier -2000- p. 105-112

140. Yamato M., Kwon O.H., Hirose M., Kikuchi A., Okano T. Novel patterned cell co-culture utilizing thermally responsive grafted polymer surfaces.// J. Biomed. Mater. Res. -2001-v.55, p.137-140.

141. Yamato M., Utsumi M., Kushida A., Konno C., Kikuchi A., Okano T. Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature// Tissue Eng -2001-V.7, p.473-480

142. Yamato M, Konno C, Utsumi M, Kikuchi A, Okano T. Thermally responsive polymer-grafted surfaces facilitate patterned cell seeding and co-culture// Biomaterials -2002-v.23, p.561-567

143. Yoshida R, Sakai K, Okano T, Sakurai Y. Surface-modulated skin layers of thermal responsive hydrogels as on-off switches: II .Drug permeation. //J Biomater Sci Polym End. -1991-v.3, p. 243-252

144. Yoshida R., Sakai K., Okano Т., Sakurai Y. Modulating the phase transition temperature and thermosensitivity in N-isopropylacrylamide copolymer gels //J.Biomater. Sci. Polymer Edn. 1994-V.6, N6., p.585-598

145. Yoshioka H., Mikami M., Nakal t., Могу Y. Preparation of poly (N-isopropylacrylamide)-grafted silica gel and its temperature-dependent interaction with proteins //Polym.Adv.Technol.-1995- 6, p 418-4201. Благодарности

146. Используемые в тексте сокращения

147. НКТС НИПА -ПНИПА -НТВА -ПНТБА1. ПНИПА/НТБА х/у-ААБФ1. ПНИПА/НТБА/ААБФ x/y/z КП1. АСМ1. ПНИПМА1. ЭГДМА1. ПТМГ1. ДМА1. АК

Информация о работе

Селезнева, Ирина Ивановна
кандидата физико-математических наук
Пущино, 2004
ВАК 03.00.02

Диссертация

Разработка и исследование термочувствительных биоматериалов на основе поли-N-изопропилакриламида - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы