Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Технологии получения комбинированных липосомальных препаратов доксорубицина

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Технологии получения комбинированных липосомальных препаратов доксорубицина"

0030В337В

На правах рукописи

Безруков Денис Алексеевич

Технологии получения комбинированных липосомальных препаратов доксорубицина

03 00 23 - Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 4 МАЙ 2007

Москва - 2007

003063376

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М В Ломоносова.

Научный руководитель

доктор химических наук, профессор Каплун Александр Петрович

Официальные оппоненты-

доктор химических наук Чупин Владимир Викторович

доктор химических наук, профессор Юркевич Александр Морисович

Ведущая организация ГУ Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им Г Ф Гаузе РАМН

Защита диссертации состоится " " -онАлЯ^ 2007 года в /Г часов на заседании Диссертационного совета Д 212 120 01 при Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени MB Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр Вернадского, 86

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им М В Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр Вернадского, 86

С авторефератом диссертации можно ознакомится на сайте МИТХТ им М В Ломоносова www mitht ru

Автореферат разослан " & Ot^X^-J^-^' 2007 года

Лютик А И

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук

" /

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Липосомы как потенциальные средства доставки лекарственных веществ рассматриваются еще с середины 60-х годов прошлого века по ряду причин небольшой размер (минимальный — около 25 нм), благодаря чему достигается эффект пассивного нацеливания (вплоть до 200 нм), биосовместимость (липосомы состоят из фосфолипидов и холестерина — природных, не токсичных веществ), способность к включению как гидрофильных, так и амфифильных и гидрофобных веществ, защита инкапсулированного вещества от преждевременной деградации, обеспечение внутриклеточной доставки Однако наряду с положительными качествами у липосом есть и недостатки, в частности, сложность длительного хранения готовых липосомальных препаратов без лиофилизации и быстрое поглощение липосом макрофагами (без специальной модификации), и, как следствие, малое время циркуляции в кровотоке Для увеличения времени циркуляции были разработаны т н стерически стабилизированные липосомы Дополнительная гидрофильная оболочка подобных липосом (наиболее часто ислопьзуется полиэтиленгликоль) ограничивает их распознавание и захват клетками ретикулоэндотелиальной сиегемы, что приводит к аккумулированию липосом в опухолевой ткани за счет эффекта пассивного нацеливания Важно, чтобы лекарственное вещество надежно удерживалось внутри липосом и вместе с тем выходило (желательно с ре1улируемой скоростью) из липосом при достижении ткани или органа-мишени Данным свойством обладают липосомы с контролируемым высвобождением, к примеру, термо- и рН-чувствшельпые липосомы имеют достаточно жесткую мембрану при нормальных (физиоло1 ических) условиях, но при повышении температуры (в случае термочувствительных липосом) или понижении рН среды (для рН-чувствительных) проницаемость мембраны таких липосом резко увеличивается Термочувствительные липосомы состоят, как правило, из липидных смесей, имеющих температуру фазового перехода несколько выше нормальной температуры человеческого тела (М Н ОаЬег е1 а!,

Сокращения: АС - ангиостатин, Г'Г - гипертермия, Лс - липосомы, ОРО -относительный размер опухоли, ТЛ - термочувствительные липосомы, УСПЖ -увеличение средней продолжительное™ жизни экспериментальных животных, Chol -холестерин, DOX - доксорубицин, DPPC - дипальмитоичфосфатидилхолин. DSPC -дистсароилфосфатидилхолин, DSPE -дистеароилфосфагидилэтаполамин, еРС - яичный фосфагияилхочип, HBS (HEPES-buffered saline) - физиологический раствор, забуфереиный HEPLS, Mal - малсимид, PEG - полиогилеигликоль

1

1995, J Wells et al, 2003), в состав рН-чувствительных липосом вводят липиды, форма молекул которых меняется при изменении рН (J М Kim et al, 2001)

Эффективное комбинирование различных подходов является одним из путей преодоления указанных недостатков, а разработка технологичных схем получения липосомальных препаратов позволит нарабатывать их для полномасштабных испытаний и, при положительном результате последних, для терапии

Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре биотехнологии МИТХТ им М В Ломоносова в рамках госбюджетной темы № 1Б-5-856 «Синтез новых фармакологически активных веществ, изучение их биологических свойств и методов направленного транспорта с целью создания противоопухолевых, противовирусных, антипаркинсонических средств», а также по грантам президента РФ по поддержке ведущих научных школ № НШ-2329 2003 4 и № РИ-112/001/609

Цели работы

1 Разработка и оптимизация полупромышленного метода получения стерически стабилизированных термочувствительных липосом, загружаемых доксорубицином против градиента сульфата аммония Исследования и биологические испытания in vitro и т vivo указатгого препарата

2 Создание и отработка методики, позволяющей получать на основе липосомальной дисперсии доксорубицина препараты с различными нацеливающими лигандами и маркерами, иммобилизованными на поверхность везикул в произвольном соотношении

3 Получение комбинированных липосомальных препаратов на основе веществ, различающихся по природе проявляемой противоопухолевой активности Оценка эффективности in vivo терапии злокачественных новообразований подобными препаратами

Научная новизна работы

Предложена схема полупромышленного получения стерически стабилизированных термочувствительных липосом, загружаемых доксорубицином против градиента сульфата аммония, позволяющая значительно упростить существующую технологию без ухудшения свойств препарата.

Предложена методика, позволяющая почучагь стерически стабилизированный липосомальный препарат, загружаемый доксорубицином против градиента сульфата

аммония, с возможностью одновременной иммобилизации на интегрированных в мембрану липосоч РЕв-цепочках различных химерных белков, содержащих домен барназы

Показано, что мочевина в концентрациях, не превышающих изотонические, увеличивает агрегационную устойчивость липосомалыюй дисперсии и может быть использована как криопротектор при лиофилизации

Получен комбинированный ляпосомальный противоопухолевый препарат Продемонстрирована эффективность совместного применения липосомальных препаратов с различными действующими началами циготоксическим (доксорубицином) и аигиангиогенным (ангиостатином) при терашш опухолей

Практическая значимость работы

Ранее при участии кафедры биотехнологии МИТХТ им М В Ломоносова была разработана и внедрена на Харьковском предприятии «Биолек» технология производства липосомалыюго доксорубицина*, который в настоящее время представлен на фармацевтическом рынке Однако названному препарату присущи все недостатки характерные для дисперсий немодифицированных липосом Данная работа направлена на создание технологии получения улучшенных липосомальных препаратов доксорубицина, одновременно обтадаюпшх преимуществами стерической стабилизации, активной загрузки лекарственной субстанции во внутренний объем липосом, наличия механизмов кошролируемого высвобождения и активного нацеливания Разработка методик, использующих комбинированно различных подходов, позволяет получить гибкий и эффективный инструмент для терапии, в том чиспе и направленной, онкологических заболеваний, а создание надежных и простых в применении систем нацеливания позволит, в перспективе, использование данных препаратов в условиях рядового стационара или амбулатории

Испочьзование в качестве базы уже существующих и одобренных к применению субстанций (в т ч и имеющих простые лгаюсомалыше формы) дает возможность значитетьно повысить эффективность лечения с одновременным снижением токсичности для организма за счет ставшего возможным (при увеличении селективности) уменьшения общей вводимой дозы

В качестве лекарственной субстанции был выбран доксорубицин С одной стороны, это один из самых эффективных противоопухолевых препаратов С другой, его применение в липосомах оправдано необходимостью снизить его кардиотоксичность Кроме того, его

" Препарат «Липодокс», патенты Украины №№ 5664(1995), 6700 (1995), 10187 (1997)

3

флуоресцентные свойства расширяют возможности проводить исследования свойств липосомальных дисперсий Немаловажным фактором, определившим наш выбор, является также возможность концентрировать его внутри липосом активной загрузкой против градиента рН или сульфата аммония

Положения, выносимые на защиту

Полупромышленная технология получения стерически стабилизированных термочувствительных липосом, загружаемых доксорубицином против градиента сульфата аммония

Методика получения препарата стерически стабилизированных термочувствительных липосом с доксорубицином, способных одновременно иммобилизировать в произвольном соотношении различные нацеливающие агенты и маркеры, содержащие домен барназы

Использование мочевины для увеличения агрегационной устойчивости липосомальных дисперсий

Разработка комбинированного лигюсомально) о препарата с различными действующими началами цитотоксическим (доксорубицином) и антиангиогенным (ангиостатином) для терапии опухолей

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи, тезисы 2 докладов на научных конференциях, 1 патент РФ, 1 заявка на патент РФ

Апробация работы. Результаты работы доложены на Открытом научном семинаре «Создание адресных лекарственных препаратов нового поколения методами нанобиотехноло1 ии», проходящего в МИТХТ им М В Ломоносова под руководством академика РАМН Швеца В И , 25-й Московской международной выставке «Образование и карьера - XXI век» в рамках круглого стопа «Лекарства XXI века» (Москва 13-15 марта 2007 г), VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 21-23 марта 2007 г)

Структура и объем диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы Работа изложена на страницах, содержит 36 рисунков и

таблиц Список литературы включает 90 источников

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ОПТИМИЗАЦИЯ ПОЛУПРОМЫШЛЕННОГО МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ СТЕРИЧЕСКИ СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ АКТИВНО ЗАГРУЖЕННЫХ ДОКСОРУБИЦИИОМ ЛИПОСОМ

В ходе данного исследования были оптимизированы условия для получения сгерически стабилизированных липосом, активно загруженных доксорубицином, причем особое внимание было уделено простоте и технологичности разрабатываемого метода, который позволял бы нарабатывать липосомальный препарат в количествах, необходимых для доклинических и клинических испытаний, а в перспективе и для терапии

В качестве базовой была выбрана методика загрузки с использованием градиента сульфата аммония (ЫН^гБО.! (в Нагап е1 а1, 1993) Первоначально использовалась схема, по которой сииртовой раствор липидов смешивается с водным раствором сульфата аммония, после чего спирт удаляется на роторном испарителе, в результате формируется исходная дисперсия мультиламеллярных везикул При очевидной простоте недостатком такого подхода является необходимость заранее добавлять некоторый избыток воды, так как спирт испаряется в виде азеотропной смеси Кроме того, некоторая часть спирта при использовании такого метода может сохраняться в липосомальной дисперсии, что неконтролируемым образом негативно влияет на степень загрузки целевого вещества Для дисперсий, полученных с использованием данного подхода, степень загрузки котебалась от 18% до 60% при весовом соотношении субстанция/липиды 0 14 Кроме того, стабильность липосомальной дисперсии неудовлетворительна (образование агрегатов, видимых невооруженным глазом, происходит в течение первых суток хранения)

Анализ возможных причин плохой воспроизводимости методики привел к использованию следующей схемы получения исходной дисперсии Из раствора липидов в хлороформе на роторном испарителе формируется липидная пленка, которая впоследствии высушивается в вакууме (0 04-0 05 мбар) для удаления остатков органического растворителя Недостаточное высушивание, как и в описанном выше случае, приводит к снижению степени загрузки целевого вещества до значений -40%

Использование серии циклов замораживания-оттаивания, хотя и описывается в классических методиках получения липосом как процедура, увеличивающая

* В руководстве работой принимала участие доктор фармацевтических наук, академик РАЕН, проф Оборотова Наталья Александровна Работа выполнена совместно с лабораторией разработки лекарственных форм, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей, ГУ 1'ОПЦ им Н Н Бтохина РАМН

монодисперсность, а для некоторых веществ и эффективность включения (V Torchilin, V Weissig, 2003), является при получении сравнительно больших объемов трудоемким и нетехнологичным этапом В серии экспериментов мы показали, что в данном случае отсутствие указанной стадии не влияет ни на величину загрузки, ни на стабильность дисперсии

Гидратацию лшщдной пленки проводили 250 мМ раствором сульфата аммония при механическом встряхивании выше температуры фазового перехода используемой смеси липидов (50°С) Образующаяся дисперсия однородна и легко экструдируется при нагревании выше температуры фазового перехода через ядерные поликарбонаткые фильтры с размером пор 200 нм

С целью создания градиента концентрации сульфата аммония часто используются методы, основанные на удалении невключившейся в липосомы соли, такие, как гель-фильтрация и диализ, но эти процедуры требуют значительного времени Увеличение времени отделения от невключившейся соли естественным образом снижает концентрацию соли внутри липосом за счет утечки Гораздо более простым способом создания градиента является разбавление дисперсии моноламеллярных липосом соответствующим буфером

Если концентрация липидов после гидратации 250 мМ раствором сульфата аммония в 20 раз превышает требуемую концентрацию в готовом препарате, то сформированный в результате двадцатикратного разбавления градиент концентрации соли составит не менее 237 5 мМ

Сравнение эффективности загрузки показало, что для липосом данного состава применение гель-фильтрации (степень загрузки 64%) менее эффективно по сравнению с используемым методом (степени загрузки 69-72%)

Важным фактором, требующим контроля и во многом определяющим степень загрузки, является рН среды Для разбавления дисперсии моноламеллярных везикул и проведения собственно активной загрузки брали слабощелочной буфер (10 мМ HFPES, доведенный до требуемого значения рН раствором гидроксида натрия), поскольку с уменьшением кислотности буфера увеличивается доля молекул доксорубицина, находящихся в непротонированной форме и как следствие, способных к более легкому проникновению через липидный бислой Однако непротонированный доксорубицин существенно хуже растворим в воде, поэтому при слишком высоком рН может выпадать в осадок, делая дальнейшую загрузку невозможной Наиболее стабильные результаты потучены для указанного буфера при рН 8 4 (т к для доксорубицина рКА 8 3 (D J Adams, 2005), при рН 8 4 более 50% субстанции будет находиться в неионизироваяной форме) Степень загрузки в

данной серии экспериментов составила от 85% до 92% при массовом соотношении субстанция/липиды 0 2

Заключительным этапом получения готового препарата является лиофильная сушка, поэтому в используемый буфер добавляли криопротектор (лактоза) Было показано, что присутствие лактозы снижает степень загрузки доксорубицина. Минимальное содержание этого криопротектора, которое обеспечивает качественную регидратацию данного липосомального препарата - 5% Использование изотонического раствора лактозы (10%) снижает степень загрузки на 7-10%

Выбор температурного режима загрузки диктовался следующими соображениями Проницаемость бислоя значительно увеличивается при температуре фазового перехода Тт (Рис 1) гель-жидкий кристалл (О РараЬафороиЬз е1 а1, 1973), однако проведение активной загрузки при этой температуре нецелесообразно, так как и скорость истечения сульфата аммония в этом случае максимальна, что приводит к быстрому уменьшению движущей силы процесса.

Рис 1 Фазовый переход в липидном бислос (О ЫееШшт е1 а1, 2001)

Таким образом, представляется целесообразным проводить загрузку при температуре несколько выше температуры фазового перехода Дисперсшо липосом, загруженных сульфатом аммония, используемый для разбавления буфер и раствор доксорубицина следует нагреть до температуры загрузки (50°С), чтобы, как было указано, исключить утечку сульфата аммония из липосом в момент прохождения точки максимума проницаемости мембраны

Флуоресцентные свойства доксорубицина позволяют оценивать высвобождение субстанции из липосом поскольку в результате активной загрузки концентрация

Температура

Жидкий кристалл

Гель

доксорубицина в липосомах превышает концентрацию самотушения, его высвобождение должно приводить к увеличению интенсивности флуоресценции

Разницу в скорости высвобождения доксорубицина из термочувствительных и обычных липосом мы наблюдали в следующем эксперименте Дисперсию отделенных от невключившегося доксорубицина липосом медленно (0 5°С/мин) нагревали от 36°С до 45°С, фиксируя изменение интенсивности флуоресценции (ЕхУЕт 475 нм/590 нм) во времени, причем заметное увеличение скорости истечения доксорубицина происходит при 42 5°С (Рис 2) Далее сравнивали интенсивность выхода доксорубицина из термочувствительных липосом, термостатируя дисперсию при 37°С или 43 °С Относительное изменение интенсивности флуоресценции через 10 мин составило 28 и 118 условных единиц по шкале прибора соответственно (Рис 3) Таким образом, при 43°С изменение интенсивности флуоресценции дисперсии термочувствительных липосом, активно загруженных доксорубицином, более чем в 4 раза превышает изменение данного параметра при 37°С

В контрольном эксперименте было показано, что скорость и степень высвобождения доксорубицина из нетермочувствительных липосом (еРС/СЬо! 7 3) при 37"С и 43°С существенным образом не отличались

Рис 2 Изменение интенсивности флуоресценции дисперсии термочувствительных липосом при нагревании со скоростью 0 5°С/мин

Прямое флуориметрическое количественное определение высвободившегося доксорубицина затруднено рассеяиием света в липосомальной дисперсии, а также возможной частичной ассоциацией доксорубицина с поверхностью бистоя липосом Определение количества вышедшего при термостатировании доксорубишна проводили с помощью колоночной гсль-хроматографии В течение 10 мин при 43°С липосомы,

полученные по предложенной методике, высвобождают в раствор 31% включенной субстанции

Время (мин)

Рис 3 Изменение интенсивности флуоресценции дисперсий термочувствительных липосом, тсрмостатируемых при 43°С (а) или 37"С (б)

Среднии размер термочувствительных липосом в полученной дисперсии составлял после активной загрузки доксорубицином 230-250 им и существенно не изменялся в течение поспедующих двух суток, что дает достаточно времени для проведения лиофилизации

Табл 1 Основные характеристики полученного липосомалыюго препарата доксорубицина

Свойства препарата

Липидный состав ОРРС ОЭРС 05РЕ-РЕС-2000 С1м1 (9 1 0 02 0 2)

Размер липосом 230-250 нм

Размер липосом после регидратации лиофилизированного препарата 240-270 нм

Концентрация доксорубицина 0 4 мг/мл

Степень включения доксорубицина 85-92%

Степень включения доксорубицина посте регидратации лиофилизированного препарата не менее 80%

Соотношение субстанция/липид 02

Регидратацию лиофилнзированной липосомальной дисперсии проводили 0 9% раствором хлорида натрия Показано, что после регидратации полученного по разработанной

9

технологии (Рис 4) лиофшшзированного препарата размеры липосом увеличиваются незначительно и степень включения доксорубицина существенным образом не изменяется (Табл 1)

Биологические испытания полученной липосомальной дисперсии т vitro проводили на двух линиях клеток опухолей мышей (карциноме Эрлиха линии ELD и меланоме В-16), эффект оценивали по уменьшению скорости роста клеток Испытания in vivo проводили на полученных из этих клеток перевиваемых опухолях, в данном случае критериями оценки служили изменение объема опухоли и продолжительность жизни животных

Рис 4 Схема почучения препарата стерически стабилизированных термочувствительных липосом, загруженных: доксорубицином

Термолипосомы с доксорубицином оказались эффективными по критерию соотношения поражения клеток и опухолей в обычных условиях (при 37°С) и при

Биологические испытания проводились в ГУ РОНЦ им Н Н Блохина РАМН

10

проведении сеанса гипертермии (42 5-43°С в течение 40-60 мин), что указывает на повышение селективности воздействия доксорубищша

Полученные данные (Рис 5, Рис 6) свидетельствуют, что термочувствительные липосомы с доксорубицином обеспечивают наибольшее различие в поражении клеток т vitro при 37 и 42 5°С Этот эффект сохраняется и т vivo, при внутривенном введении термочувствительных липосом животным с асцитной карциномой Эрлиха линии ELD (Рис 7) и привитой меланомой В-16 (Рис 8, Рис 9), действие липосомального препарата было оценено как по динамике роста опухолей, так и по продолжительности жизни животных

Концентрация доксорубицина, мкг/мл

Доксорубнцнп ■

лнпосомаж ^— Докюрубицнн

Липосомы (42 5°С) Доксорубяпна ^ (42i°C)

Рис 5 Эффективность in vitro термочувствительных липосом На графике показано угнетение пролиферативной активности клеток мышиной карциномы Эрлиха линии ELD под воздействием ТЛ с или без доксорубицина при 37°С и при гипертермии (42 5°С) в течение 1 ч

Как видно из Рис 9, животные, которым ввели лиофилизированные термолипосомы без проведения сеанса гипертермии, погибли к 22-му дню после эксперимента, показав меньшую токсичность для клеток опухоли даже по сравнению с раствором доксорубицина, в то время как 4 из 7 животных, которых после введения тсрмолипосом подвергли гипертермии, еще живы через месяц после эксперимента.

Показано также, что указанные термочувствительные липосомы сохраняют эффективность после лиофилизации (Рис 8)

Концентрация доксорубицина, мкг/мл 1 10 100

Н----1-1

Доксорубицин, 37°С

Доксорубицин в лнпосомах, 37°С

Доксорубицин в липосомах, 42 5°С, 1 ч

Доксорубицин, 42 5°С, 1 ч

Рис 6 Относительное уменьшение пролиферативной активности клеток меланомы В-16 мышей под воздействием термочувствительных липосом с доксорубицином при гипертермии (42 5°С) в течение 1 ч

"Доксорубицин ■ТЛ с доксорубицином ■ГТ, 43°С, 30 мин ■TJI с доксорубицином + ГТ ■Контроль Доксорубицин + ГТ

6 8 10 12 14 Дни после гипертермии

Рис 7 Относительный рост асцитной карциномы Эрлиха линии ELD мышей после внутривенно! о введения доксорубицина (5 мг/кг массы тела мышей), термочувствительных

липосом с доксорубицином в сочетании с гипертермией (43°С, 30 мин) У0 - исходный объем опухоли, V, - объем опухоли на день I после сеанса гипертермии

Дни после гипертермии

Рис 8 Относительный рост меланомы В-16 мышей после однократного внутривенного введения свободного доксорубицииа в дозе 4 мг/кг массы тела или в составе регидратированных лиофилизированных термочувствительных липосом с последующей гипертермией У0 - исходный объем опухоли, - объем опухоли на день I после сеанса гипертермии

Дни после сеанса гипертермии

Рис 9 Динамика гибели мышей с меланомой В-16 после локальной гипертермии (43°С, 30 мин) на фоне внутривенно! о введения термочувствительных липосом с доксорубицином (Д) Доза вводимою доксорубицина во всех вариантах опыта составляла 4 мг/кг Контроль -фи ¡раствор

СОЗДАНИЕ И ОТРАБОТКА МЕТОДИКИ ПОЛУЧЕНИЯ СТЁРИЧЕСКИ СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДОКСОРУБИЦИНА С ВОЗМОЖНОСТЬЮ ИММОБИЛИЗАЦИИ ХИМЕРНЫХ БЕЛКОВ С ДОМЕНОМ БАРАНАЗЫ

Препарат липосом, полученный по приведенной в предыдущем разделе технологии, обладает всеми преимуществами, связанными со стерической стабилизацией и применением механизмов контролируемого высвобождения Следующим шагом для увеличения его эффективности может быть использование т н активного нацеливания, которое достигается присоединением к поверхности липосом «молекулярного адреса» — молекулы, для связывания с которой клетка-мишень имеет соответствующие рецепторы

Существуют различные стратегии дня присоединения подобного молекулярного адреса к поверхности липосом Молекула может быть присоединена к гидрофобному якорю как непосредственно, так и через спейсер Строение и длина спейсера очень важны, и выбираются таким образом, чтобы исключить препятствия к взаимодействию с маркером со стороны полимерных цепей, осуществляющих стерическую стабилизацию липосомы

Широкие возможности представляют конструкции, в которых к ПЭГ-цепи присоединяют молекулу, способную образовывать прочный комплекс с соответствующим партнером, например, авидин-биотин (Т М Alien et al, 1998) или барегар-барназа (S М Deyev et al, 2003) Весьма привлекательной в этом плане является пара барстар-барназа Барстар (-10 кДа) - ингибитор рибонуклеазы барназы (-12 кДа), образующий с ней комплекс с константой связывания порядка 1014М 1 В лаборатории проф С М Деева (ИБХ им ММ Шемякина и 10А Овчшшикова) созданы генно-инженерные конструкции, позволяющие нарабагывать как эти белки сами по себс, так и химерные, включающие наряду с аминокислотными последовательностями указанных белков последовательности одноцепочечных антигенсвязывающих фрагментов (scFv), гены репортерных белков (зеленого или красного флуоресцирующих белков) и т п Применение данного подхода позволяет создать систему доставки с высокой степенью универсальности, так как к уже готовой липосомальной дисперсии можно добавлять различные полученные генноинженерными методами белковые "молекулярные адреса" и маркеры в требуемом количественном соотношении

Целью данной части работы была разработка технологии получения стерически стабилизированных термочувствительных липосом, загруженных доксорубицином, с блоком "универсального причаливания" - барстаром, присоединенным к липосомам через пегелированный фосфатидилэтаноламин В дальнейшем к таким липосомам планируется присоединять фьюжн-белки барназа-scFv к рецептору Нег2-пео (сверхэкспрессия которого

характерна для 60% опухолей молочной железы), барназа-флуоресцирующий белок, барназа-наночаспщы золота (Рис 10)

Рис 10 Возможные функции, присоединяемые к липосоме через комплекс барстар-барназа

Однако усложнение конструкции липосом приводит к тому, что почучение липосомального препарата становится нетривиальной задачей, требующей поэтапного решети Более того, дополнительные ограничения накладывает выбранный способ загрузки лекарственного вещества

Высокая лабильность барстара в кислых условиях раствора (N114)2804 (рН 5 5), который используется для создаиия градиента, обеспечивающего активную загрузку, не позволяет вводить белково-липидный конъюгат на этой стадии получеши липосом Кроме того, и на следующей стадии активной загрузки его введение невозможно Дело в том, что основным компонентом термочувствительных липосом является ЭРРС, температура фазового перехода которого составляет 415°С Активная загрузка возможна при температуре выше фазового перехода, однако нагревание барстара приводит к потере активности белка

Для решения возникших проблем была выбрана следующая схема Первоначально экструзией получают лииосомы, содержащие сульфат аммония После отделения невключившейся соли, в инертной атмосфере при нагревании к липосомалыюй дисперсии добавляется раствор доксорубицина и раствор, содержащий мицеллы РЕС(2000)-П8РЕ и малеимидного производного РЕС(3400)-08РЕ Таким образом, одновременно производится активная загрузка действующего вещества и инкорпорация в бислой липосом липидов с

полиэтиленглаколевыма цепочками (т. п. метод "post-insertion"), осуществляющих стеричсскую стабилизацию и являющихся спейсером для нацеливающего белка. Важным преимуществом выбранного нами подхода является то, что белок присоединяется к соответствующим спейссрам только на следующей стадии, практически полностью оказываясь на внешней поверхности лигасомального бислоя, Вели нее белково-лщщшый коныогат вводится на стадии формирования липосом: значительная его часть (до 50%) может встроиться в бислой с внугреиней стороны липосомы, тем самым делая бесполезными соответствующие молекулы ценного белка.

Следующим этапом является присоединение SH-группы белка к м алея мил ному производном? (Рис. 1!) в соответствии с методикой (Т, Р Dcrksen et all, 1985). Белок добавляют к липосомам в деокейгеннрованном HBS (10 мМ HF.PES-Na, 135 мМ NaCI, рИ 7,4) в соотношении белок - МаЕ Р EG( 3400)-DS РЕ 1:10 по молям и перемешивают 12 ч при комнатной температуре под аргоном. Непрореагировавшие малеямидцые группы блокируют реакцией о избытком 2 м.М [Рм ср кашоуга н о л н и |СЧС1-ШС 30 мил при комнатной температуре.

/

% < Р —О

к— (сн^о^

- , О-Ч

о о. N—/ (С«г)1вси3 вм—/ 1 V— о

| (сщ.18сн3

-(CHjC^OVs-^

HN-

О

11 I Р— О !

-о О. [

Na 1

НЕ

{^НгЬ бсн3

Бислой

Рис. 11 Схема образования белково-липцдного кот.югата па поверхности линосом.

Табл. 2. Основные характеристики полученного препарата стерически стабилизированных термочувствительных загруженных доксорубицииом липосом с возможностью иммобилизации химерных белков, содержащих домен барназы

Свойства препарата

Липидный состав DPPC: СЬо!: DSPE-PEG-2000: DSPE-PEG-3400-Mal (0.65: 0.3: 0.045: 0.005)

Размер липосом 230-260 нм

Концентрация доксорубищша 0.6 мг/мл

Степень включения доксорубищша 98%

Соотношение су бега» i ция/п и я и д 006

Для оценки количества связанных с лило со мой молекул барстара использовали препарат коллоидного золота, и котором барназа была иммобилизована на поверхность частиц Электронные микрофотографии (Рис. 12)* показывают значительна количество связанных с липосомой молекул барстара, однако их число меньше расчетного, что объясняется, по-видимому, как fio 100% выходом реакции конъюгации, так и характерным для данного метода визуализшши не полным связыванием мембранного комплекса «DSPE-РЕG(3400)-Оарсар» с комплексом «барназа-наночастицы золота»

Рис 12 Электронная микрофотография липооомы с присоединенными мишенями (в качестве Мишеней - чаешцы коллоидного золота, связанные с барназой).

' Электронные микрофотографии получены д.б.Н. В.VII 1опенко (ИME PAI1 им. В А Эшелы ард га).

Таким образом, разработанная технология (Рис 13) позволяет получать термочувствительные сгерически стабилизированные липосомы, загруженные доксорубицином и способные присоединяться к субстанциям, несушим барназу

Рис 13 Схема получения термочувствительных сгерически стабилизированных липосом, загруженных доксорубицином и способных присоединяться к субстанциям, несущим барназу

ПОЛУЧЕНИЕ КОМБИНИРОВАННЫХ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ВЕЩЕСТВ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ НО ПРИРОДЕ ПРОЯВЛЯЕМОЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ

Еще одним методом увеличения эффективности является комбинированное применешге препаратов различной природы и/или механизма действия Перспективным, по нашему мнению, может быть одновременное применение цитотоксических и антиангиогенных субстанций В качестве цитотоксической составляющей использовался доксорубицин, в качестве антиангиогешюй — бсток ангиостатин Применение этого белка существенно замедляет рост опухоти и вызывает устойчивую ремиссию, но отмена терапии

может привести к рецидиву заболевания и повторному развитию опухоли Однако использование ангиостатина затруднено недостаточным временем жизни белка в кровеносном русле Учитывая преимущества пассивного нацеливания и защиты от преждевременной деградации, которую обеспечивают лииосомы, идея использовать липосомальный препарат ангиостатина совместно с липосомальным препаратом доксорубицина кажется привлекательной

В рамках совместных исследований с Инспггутом Экологической Медицины испытывались липосомальные препараты с ангиостатином и доксорубицином для сравнения их активности с активностью растворов этих веществ т vivo

Для биологических испытаний были приготовлены липосомальные препараты

• Ангиостатин в липосомах концентрация липидов 25 мг/мл, размер частиц 100 нч, концентрация ангиостатина 6 мг/мл,

• Доксорубицин в липосомах концентрация липидов 50 мг/мл, размер частиц 100 нм, концентрация доксорубицина 0 95 мг/мл,

• Контроль - пустые липосомы, концентрация липидов 25 мг/мл, размер частиц 100 нм

Липидньш состав для всех образцов — ePC/Chol 7/3 Липосомы с доксорубицином поручали активной загрузкой против градиента сульфата аммония Дисперсию мультиламеллярных везикул получали гидратацией липидной пленки 250 мМ раствором сульфата аммония Моноламеллярные везикулы получали экструзией через мембрану с диаметром пор 100 нм Необходимый для загрузки градиент концентрации соли формировали гель-фильтрацией на колонке NAP 5

Липосомы с ангиостатином получали экструзией через такие же мембраны дисперсии мультиламеллярных везикул, полученных гидратацией липидной пленки водным раствором белка

Совместное применение двух липосомальных препаратов, полученных раздельно, предпочтительно с нескольких точек зрения

1) Различия в методиках получения липосомальных препаратов, вызванные природой загружаемых веществ, могуг существенно усложнить технологию получения препарата, частицы которого будут одновременно содержать обе субстанции

2) Решается проблема возможной химической несовместимости действующих веществ

3) Более гибкая методика применения, позволяющая варьировать соотношение применяемых субстанций в каждом конкретном случае

4) Мишени используемых субстанций могут иметь различную локализацию в опухоли

Эффективность включения веществ в липосомы определяли через сутки после получения

Табл 3 Эффективность включения вещества в липосомы

Образец, срок хранения Эффективность включения, %

Лс с 1ЮХ, сутки 85

Лс с АС, сутки 14

Испытания противоопухолевой активности полученных липосомальных препаратов проводились на мышах С57В1/6 с привитой меланомой линии В16* Препараты вводили внутривенно, один раз в неделю, начиная с 10-го дня посте прививки опухоли Результаты испытаний приведены в Табл 4

Табл 4 Противоопухолевая активность липосомальных форм доксорубицина и ангиостатина в отношении солидных опухолей меланомы линии В16 у мышей

ОРО % УСПЖ, %

24 день 35 день

контроль (физ раствор) 100 100 -

контроль (ненаполненные липосомы) 109 6 106 4 37

доксорубицин 59 4 648 24 8

липосомальный доксорубицин 24 0 38 9 38 7

липосомальный доксорубицин и липосомальный ангиостатин 14 7 30 1 49 7

доксорубицин и ангиостатин 46 2 60 1 31 0

Таким образом, на 38 день эксперимента объем опухоли у животных, для лечения которых применялся раствор доксорубицина совместно с раствором ангиостатина, на 12% меньше, чем в случае применения только доксорубицина, тогда как объем опухоли у животных, дчя лечения которых применялся липосомальный доксорубицин совместно с липосомальным ангиостатином, на 30% меньше, чем в случае применения только липосомального доксорубицина (Рис 14)

Эксперименты проводились в Институте Экологической Медицины

7000-4

6000-

" 50001

| 4000-

о

и

е

О 3000-

1«

о 20001000-

—•— контроль (физраствор) - » - контроль (нснатруленные л!шосомы) -л— доксорубицин

•шпосомальный доксорубицин -*— типосомальный доксорубицин и типосомальный ангиостатин -♦— доксорубицин и анпюстатин

т 10

I

15

~Г~ 20

Т-25

I

30

35

~~I 40

дни после прнппвкн опухоли

Рис 14 Влияние исследуемых препаратов на динамику развития солидных опухолей меланомы В16 у \*ышей

ВЛИЯНИЕ МОЧЕВИНЫ НА СТАБИЛЬНОСТЬ ЛИПОСОМАЛЫЮЙ ДИСПЕРСИИ

Агрсгационная устойчивость является актуальной проблемой при получении липосочальных дисперсий Даже если предполагается хранение препарата в виде лиофилизата, необходимо чтобы за время, которое в производственном цикле липосомальная дисперсия ожидает лиофилизашш, агрегация липосом была минимальной

Нами было обнаружено, что использование для гидратирования липидов при поп учении липосом водного раствора, содержащею мочевину в концентрации от 0 1% до 5%, позволяет повысить агрегационную устойчивость формируемой липосомальной дисперсии

Агрегационную устойчивость оценивали по относительному изменению оптической плотности 8 - £¡—^1. образца липосомальной дисперсии на длине волны 650 им до (Л]) и

после (1)2) центрифугирования при 1 ЮООй в течение 10 мин (Табл 5 ) Очевидно, что чем меньше относительное измените оптической плотности образца, тем более агрегационпо устойчива оцениваемая дисперсия

Табл 5 Влияние мочевины на агрегационную устойчивость липосомальных дисперсий

№ Липидный состав Срок храпения Содержание мочевины, % А

1 еРС/СЬо17 3 1 ч — 0 40

1 5 0 28

2 еРС/СМ 7 3 3 сут — 0 84

15 0 25

3 ПРРС/ОЯРС/СЬо! 9 10 2 1ч — 0 92

1 62 0 7 6

Кроме того, если существует необходимость лиофилизировзгь полученную липосомальную дисперсию, мочевина может выполнять роль криопротектора (] Р С051ап70 й а1, 2005) Липосомы состава ПРРС/ОЗРС/СЬо1 (9 10 2) успешно лиофилизируются при содержании мочевины в дисперсии 1 62%

ВЫВОДЫ

1 Разработана схема полупромышленного получения сгерически стабилизированных термочувствительных липосом, загружаемых доксорубицином против градиента сульфата аммония с эффективностью не менее 85% при массовом соотношении субстанция/липиды 0 2

2 Разработана методика, позволяющая получать сгерически стабилизированный липосомальный препарат с эффективностью загрузки доксорубицина 98% при массовом соотношении субстанция/липиды 0 06 и возможностью иммобилизации на поверхности липосом в произвольном соотношении различных химерных белков, содержащих домен барназы

3 Показано, что мочевина в концентрациях, не превышающих изотоническую, повышает агрегационную устойчивость липосомальных дисперсий различного состава, а также может быть использована в качестве криопротектора

4 Получен комбинированный липосомальный противоопухолевый препарат Продемонстрирована эффективность совместного применения липосомальных препаратов с различными действующими началами цитотоксическим (доксорубицином) и антиангиогсшшм (ангиостатином) при терапии опухолей

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Быков В А, Безруков Д А , Дигтярь А В , Каплун А П, Красильникова В В , Луценко Е В , Фельдман Н Б, Швец В И Ингибитор ангиогенеза, антиангиогенная фармацевтическая композиция на его основе и способ лечепия злокачественных новообразований // Патент РФ №2287341 от 01 03 2005

2 Безруков Д А, Баландин Т Г, Деев С М, Попенко В В , Каплун А П, Возможные подходы к конструированию сложных липосомных систем доставки лекарственных препаратов, ВестникМИТХГ -2006 -т 1 -с 14-18

3 Безруков Д А, Королева А И, Каплун А П, Ланцова А В, Орлова О Л, ОборотоваНА, Оптимизация метода потучения стерически стабилизированных термочувствительных лилосом с активной загрузкой доксорубицином Н Российский биотерапевтический журнал -2006 -№4 -т 5 -с 79-84

4 Безруков Д А, Королева А И , Каплун А П, Орлова О Л, Оценка высвобождения доксорубицина из термочувствительных стерически стабилизированных липосом. Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 21-23 марта 2007 г // Российский биотерапевтический журнал -2007 -№1 -т 6 -с 72

5 Безруков Д А, Королева А И , Каплун А П , Орлова О Л, Игнатьева Е В , Ланцова А В, Оборотова Н А, Модификация метода получения стерически стабилизированных термочувствительных липосом с активной загрузкой доксорубицином, Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 2123 марта2007 г //Российский биотерапевтический журнал -2007 - №1 -т 6 - с 72

6 Каплун А П , Безруков Д А, Родина А В , Попенко В И, Швец В И , Современная наномедищша // «Наномедицина» - Специальный выпуск журнала «Панотехника» -2007 - приложение к №9 -с 132-145

7 Королева А И , Безруков Д А , Михайлова Н А , Каплун А П , Швец В И , Способ получения липосом И Заявка на патент РФ №2007114169 от 17 04 2007

к

Подписано в печать _ Формат 60x84/16 Бумага писчая Отпечатано на ризографе Уч изд листов 1 0 Тираж 100 экз Заказ № 6 (_

Московская Государственная Академия Тонкой Химической Технологии им М В Ломоносова Издательско-полиграфический центр 119571, г Москва, проспект Вернадского, д 86

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Безруков, Денис Алексеевич

1. Список сокращений.

2. Введение.

3. Обзор литературы.

Липосомы, как средство доставки лекарственных препаратов.

3.1. Свойства мембраны.

3.2. Получение липосом и основные способы загрузки веществ.

3.3. Классические липосомы.

3.4. Стерически стабилизированные или Stealth-липосомы.

3.5. Активно нацеленные липосомы.

3.5.1. Липосомы, нацеленные с помощью антител.

3.5.2. Липосомы, нацеленные с помощью других лигандов.

3.6. Липосомы с контролируемым высвобождением.

3.6.1. Термочувствительные липосомы.

3.6.2. рН-Чувствительные липосомы.

3.7. Активная загрузка липосом.

3.7.1. Загрузка липосом с помощью рН-градиента.

3.7.2. Вторичный рН-градиент.

3.7.3. Загрузка липосом с помощью градиента сульфата аммония.

4. Результаты работы и их обсуждение.

4.1. Оптимизация полупромышленного метода получения стерически стабилизированных термочувствительных активно загруженных доксорубицином липосом.

4.1.1. Выбор метода получения первичной дисперсии мультиламеллярных липосом с сульфатом аммония.

4.1.2. Формирование дисперсии одноламеллярных липосом с сульфатом аммония

4.1.3. Создание градиента концентрации сульфата аммония.

4.1.4. Состав буферного раствора для проведения загрузки липосом доксорубицином

4.1.5. Температурный режим загрузки.

4.1.6. Оценка высвобождения доксорубицина.

4.1.7. Биологические испытания полученной дисперсии.

4.2. Создание и отработка методики получения стерически стабилизированных липосомальных препаратов доксорубицина с возможностью иммобилизации химерных белков с доменом барназы.

4.3. Оценка эффективности комбинированной терапии опухолей при одновременном использовании липосомальных препаратов с различными действующими началами

4.4. Влияние мочевины на стабильность липосомальной дисперсии.

4.4.1. Флуоресцентные исследования.

4.4.2. Оценка микровязкости липосомального бислоя.

4.4.3. Влияние мочевины на активную загрузку липосом доксорубицином при использовании градиента сульфата аммония.

5. Экспериментальная часть.

5.1. Материалы и методы.

5.2. Оптимизация полупромышленного метода получения стерически стабилизированных термочувствительных активно загруженных доксорубицином липосом.

5.2.1. Получение липосом.

5.2.2. Определение степени загрузки доксорубицина.

5.2.3. Определение размера липосом.

5.2.4. Оценка термочувствительных свойств полученных липосом.

5.2.5. Определение степени высвобождения доксорубицина из липосом при 43°С.

5.2.6. Биологические испытания.

5.3. Создание и отработка методики получения стерически стабилизированных липосомальных препаратов доксорубицина с возможностью иммобилизации химерных белков с доменом| барназы.

5.3.1. Контрольный эксперимент.

5.3.2. Электрофорез.

5.3.3. Получение электронных микрофотографий.

5.4. Оценка эффективности комбинированной терапии опухолей при одновременном использовании липосомальных препаратов с различными действующими началами

5.4.1. Получение липосом с доксорубицином.

5.4.2. Получение липосом с ангиостатином.

5.4.3. Определение эффективности загрузки.

5.4.4. Схема эксперимента in vivo.

5.5. Влияние мочевины на стабильность липосомальной дисперсии.

5.5.1. Оценка микровязкости липосомального бислоя.

5.5.2. Влияние мочевины на активную загрузку липосом доксорубицином при использовании градиента сульфата аммония.

6. Выводы.

7. Благодарности.

8. Литература.

1. Список сокращений

АС - ангиостатин АХ - амидхлорин ГТ - гипертермия

ЛПВП - липопротеин высокой плотности ЛПНП - липопротеин низкой плотности ЛПОНП - липопротеин очень низкой плотности Лс - липосомы

МАТ - моноклональные антитела

МФФА - метилфеофорбид А

ОРО - относительный размер опухоли

ТГФ - тетрагидрофуран

ТЛ - термочувствительные липосомы

УСПЖ - увеличение средней продолжительности жизни экспериментальных животных

ФДТ - фотодинамическая терапия

ФС - фотосенсибилизатор

ФФнА - феофитин А

ФХ - фосфатидилхолин

ФС - гидрофильный фотосенсибилизатор

Bs - барстар

BSA - бычий сывороточный альбумин Chol - холестерин

DMPC - димиристоилфосфатидилхолин DOPC - диолеоилфосфатидилхолин DOPE - диолеоилфосфатидилэтаноламин DOX - доксорубицин DPPC - дипальмитоилфосфатидилхолин DSPC - дистеароилфосфатидилхолин DSPE - дистеароилфосфатидилэтаноламин ePC - яичный фосфатидилхолин

HBS (HEPES-buffered saline) - физиологический раствор, забуференный HEPES МАА - метакриловая кислота Mal - малеимид

МРРС - монопальмитоилфосфатидилхолин

NIP AM - N-изопропилакриламид

PEG - полиэтиленгликоль.

РОРС - пальмитоилолеоилфосфатидилхолин sPC - соевый фосфатидилхолин

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Безруков, Денис Алексеевич

6. Выводы

1. Разработана схема полупромышленного получения стерически стабилизированных термочувствительных липосом, загружаемых доксорубицином против градиента сульфата аммония с эффективностью не менее 85% при массовом соотношении субстанция/липиды 0.2.

2. Разработана методика, позволяющая получать стерически стабилизированный липосомальный препарат с эффективностью загрузки доксорубицина 98% при массовом соотношении субстанция/липиды 0.06 и возможностью иммобилизации на поверхности липосом в произвольном соотношении различных химерных белков, содержащих домен барназы.

3. Показано, что мочевина в концентрациях, не превышающих изотоническую, повышает агрегационную устойчивость липосомальных дисперсий различного состава, а также может быть использована в качестве криопротектора.

4. Получен комбинированный липосомальный противоопухолевый препарат. Продемонстрирована эффективность совместного применения липосомальных препаратов с различными действующими началами: цитотоксическим (доксорубицином) и антиангиогенным (ангиостатином) при терапии опухолей.

7. Благодарности

За помощь в работе и плодотворное сотрудничество автор благодарит:

Всех сотрудников, аспирантов и студентов кафедры биотехнологии МИТХТ им. М. В. Ломоносова, принимавших участие в работе, и, за неоценимую помощь, лично

Королеву А. И. и Красильникову В. В.

Д. б. н. В. И. Попенко (ИМБ РАН им. В. А. Энгельгардта).

Всех сотрудников лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН и лично руководителя лаборатории д. ф. н., проф. Н. А. Оборотову, а также директора НИИ ЭДиТО д. м. н., проф. А. Ю. Барышникова. Д. б. н., проф. А. А. Вайнсона (НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН)

Д. б. н., проф. С. В. Луценко (Московский НИИ медицинской экологии) и всех его сотрудников, принимавших участие в совместной работе.

Д, б. н., проф. С. М. Деева и Т. Г. Баландина (ИБХ им. Ю. А. Овчинникова и М. М. Шемякина РАН)

Фирму «Биолек» (Харьков, Украина)

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Безруков, Денис Алексеевич, Москва

1. J. Wells, A. Sen, S.W. Hui. Localized delivery to CT-26 tumors in mice using thermosensitive liposomes // 1.t. J. Pharm. V. 261 (2003) P. 105-114.

2. M. H. Gaber, K. Hong, S.K. Huang, D. Papahadjopoulos. Thermosensitive Sterically Stabilized Liposomes: Formulation and in vitro Studies on Mechanism of Doxorubicin Release by Bovine Serum and Human Plasma // Pharm. Res. V. 12 (1995) No. 10, P. 14071416.

3. J.M. Kim, D.H. Thompson. Acid and Oxidatively Labile Vinyl Ether Surfactants: Syntesis and Drug Delivery Applications // Marcel Dekker, New York, Basel, 2001, P. 145-154.

4. D. C. Drummond, M. Zignani, J.-C. Lerox. Current status of pH-sensitive liposomes in drug delivery// Progr. Lip. Res. V. 39 (2000) P. 409-460.

5. J. M. Sual, A. Annapragada, J.V. Natarajan, R.V. Bellamkonda. Controlled targeting of liposomal doxorubicin via folate receptor in vitro // J. Control. Rel. V. 92 (2003) P. 49-67.

6. Г.М. Сорокоумова, A.A. Селищева, А.П. Каплун. Фосфолипиды. Методы их выделения, обнаружения и изучения физико-химических свойств липидных дисперсий в воде // Москва, МИТХТ, 2000,100 с.

7. G. Haran, R. Cohen, L.K. Bar, Y. Barenholz. Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposome produce efficient and stable entrapment of amphipatic weak basis // Biochim. Biophys. Acta V. 1151 (1993) P. 201-215.

8. T. Ishida, Y. Takanashi, H. Doi, I. Yamamoto, H. Kiwada. Encapsulation of an antivasopastic drug, fasudil, into liposomes, and in vitro stability of the fasudil-loaded liposomes // Int. J. Pharm. V. 232 (2002) P. 59-67.

9. S.H. Hwang, Y. Maintani, K. Takayama, T. Nagai. High entrapment of insulin and bovine serum albumin into neutral and positively-charged liposomes by the remote loading method // Chem. Pharm. Bull. (Tokio) V. 48 (2000) No 3, P. 325-329.

10. M. Ceruti, P. Crosasso, P. Brusa, S. Arpicco, F. Dosio, L. Cattel. Preparation, characterization, cytotoxicity and pharmacokinetics of liposomes containing water-soluble prodrugs of paclitaxel // J. Control. Rel. V. 7 (2000) No. 12, P. 1027-1033.

11. M.A. Schubert, C.C. Muller-Goymann. Solvent injection as a new approach for manufacturing lipid nanoparticles evaluation of the method and process parameters // Eur. J. Pharm. Biopharm. V. 55 (2003) P. 125-131.

12. K.-H. Song, S.-J. Chung, C.-K. Shim. Preparation and evaluation of proliposomes containing salmon calcitonin // J. Cont. Rel. V. 84 (2002) P. 27-37.

13. W. Junping, J. Maitani, K. Takayama, T. Nagai. In vivo evaluation of doxorubicin carried with long circulating and remote loading proliposome // Int. J. Pharm. V. 203 (2000) P. 6169.

14. L. Frederiksen, K. Anton, P. van Hoogevest, H.R. Keller, H. Leuenberger. Preparation of liposomes encapsulating water-soluble compounds using sypercritical carbon dioxide // J. Pharm. Sci. V. 86 (1997) N. 8, P. 921-928.

15. S. Vemuri, C.T. Rhodes. Preparation and characterization of liposomes as therapeutic delivery systems: a review // Pharm. Acta Helv. V. 70 (1995) P. 95-111.

16. F. Jiang, L. Lilge, J. Grenier, Y. Li, M.D. Wilson, M. Chopp. Photodynamic therapy of U87 glioma in nude rat using liposome-delivered photofrin // Lasers Surg. Med. V. 22 (1998) P. 74-80.

17. F. Jiang, L. Lilge, B. Logie, Y. Li, M. Chopp. Photodynamic therapy of 9L gliosarcoma with liposome-delivered photofrin // Photochem. Photobiol. V. 65 (1997) P. 701-706.

18. L. Lilge, B.C. Wilson. Photodynamic therapy of intracranial tissues: a preclinical comparative study of four different photosensitizers // J. Clin. Laser Med. Surg. V. 16 (1998) P. 81-91.

19. J.P. Keene, D. Kessel, E.J. Land, R.W. Redmond, T.G. Truscott. Direct detection of singlet oxygen sensitized by haematoporphyrin and related compounds // Photochem. Photobiol. V. 43 (1986) P. 117-120.

20. X. Damoiseau, H.J. Schuitmaker, J.W, Lagerberg, M. Hoebeke. Increase of the photosensitizing efficiency of the Bacteriochlorin a by liposome-delivered incorporation // J. Photochem. Photobiol., B Biol. V. 60 (2001) P. 50-60.

21. D.D. Lasic, F.J. Martin, A. Gabizon, S.K. Huang, D. Papahadjopoulos. Sterically stabilized liposomes: a hypothesis on the molecular origin of the extended circulation times // Biochim. Biophys. Acta V. 1070 (1991) P. 187-192.

22. A.J. Schroit, J. Madsen, R. Nayar. Liposome cell interactions: in vitro discrimination of uptake mechanism and in vivo targeting strategies to mononuclear phagocytes // Chem. Phys. Lipids V. 40 (1986) P. 373-393.

23. P.C. Rensen, W.G. Love, P.W. Taylor. In vitro interaction of zinc (II) phthalocyanine-containing liposomes and plasma lipoproteins // J. Photochem. Photobiol. V. 26 (1994) P. 29-35.

24. C. Milanesi, C. Zhou, R. Biolo, G. Jori. Zn (II)- phthalocyanine as a photodynamic agent for tumours: II. Studies on the mechanism of photosensitised tumour necrosis // Br. J. Cancer V. 61 (1990) P. 846-850.

25. V. Cuomo, G. Jori, B. Rihter, M.E. Kenney, M.A. Rodgers. Liposome-delivered Si (IV)-naphthalocyanine as a photodynamic sensitiser for experimental tumours: pharmacokinetic and phototherapeutic studies // Br. J. Cancer V. 62 (1990) P. 966-970.

26. R.Z. Renno, J.W. Miller. Photosensitizer delivery for photodynamic therapy of choroidal neovascularization // Adv. Drug Deliv. Rev. V. 52 (2001) P. 63-78.

27. C. Milanesi, F. Sorgato, G. Jori. Photokinetic and ultrastructural studies on porphyrin photosensitization of HeLa cells // Int. J. Radiat. Biol. V. 55 (1989) P. 59-69.

28. F. Ricchelli, S. Gobbo, G. Jori, G. Moreno, F. Vinzens, C. Salet. Photosensitization of mitochondria by liposome-bound porphyrins // Photochem. Photobiol. V. 58 (1993) P. 5358.

29. F. Ricchelli, P. Nikolov, S. Gobbo, G. Jori, G. Moreno, C. Salet. Interaction of phthalocyanines with lipid membranes: a spectroscopic and functional study on isolated rat liver mitochondria // Biochim. Biophys. Acta V. 1196 (1994) P. 165-171.

30. J.N. Moreira, R. Gaspar, T.M. Allen. Targeting Stealth liposomes in a murine model of human small cell lung carcinoma // Biochim. Biophys. Acta V. 1515 (2001) P. 167-176.

31. H. Takeuchi, H. Kojima, H. Yamamoto, Y. Kawashima. Passive targeting of doxorubicin with polymer coated liposomes in tumor bearing rats // Biol. Pharm. Bull. V. 24 (2001) P.795-799.

32. D. Needham, T.J. Mcintosh, D.D. Lasic. Repulsive interactions and mechanical stability of polymer-grafted lipid membranes // Biochim. Biophys. Acta V. 1108 (1992) P. 40-48.

33. G.E. Francis, C. Delgado, D. Fisher, F. Malik, A.K. Agrawal. Polyethylene glycol modification: relevance of improved methodology to tumour targeting // J. Drug Target. V. 3 (1996) P. 321-340.

34. N. Oku, N. Saito, Y. Namba, H. Tsukada, D. Dolphin, S. Okada. Application of long-circulating liposomes to cancer photodynamic therapy // Biol. Pharm. Bull. V. 20 (1997) P.670-673.

35. N. Oku, Y. Namba, S. Okada. Tumor accumulation of novel RES-avoiding liposomes // Biochim. Biophys. Acta V. 1126 (1992) P. 255-260.

36. A. Gijsens, A. Derycke, L. Missiaen, D. De Vos, J. Huwyler, A. Eberle, P. de Witte. Targeting of the photocytotoxic compound AlPcS4 to HeLa cells by transferrin conjugated PEG-liposomes // Int. J. Cancer V. 101 (2002) P. 78-85.

37. T.M. Allen. Long-circulating (sterically stabilized) liposomes for targeted drug delivery // TIPS V. 15 (1994) P. 215-220.

38. T.M. Allen, C.B. Hansen, D.D. Stuart. Targeted sterically stabilized liposomal drug delivery // P. Lasic (Ed.), Medical Applications of Liposomes, Elsevier, Amsterdam (1998) P. 297323.

39. T.M. Allen, D. Lopes de Menezes, C.B. Hansen, E.H. Moase. Stealth liposomes for the targeting of drugs in cancer therapy // McC. Gregoriadis (Ed.), Targeting of Drugs 6: Strategies for Stealth Therapeutic Systems, Plenum, New York (1998) P. 61-75.

40. S. Yemul, C. Berger, A. Estabrook, S. Suarez, R. Edelson, H. Bayley. Selective killing of T lymphocytes by phototoxic liposomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA V. 84 (1987) P. 246250.

41. J.A. Reddy, D. Dean, M.D. Kennedy, P.S. Low. Optimization of folate-conjugated liposomal vectors for folate receptor-mediated gene therapy // J. Pharm. Sci. V. 88 (1999) P. 11121118.

42. M.M. Quails, D.H. Thompson. Chloroaluminum phthalocyanine tetrasulfonate delivered via acid-labile diplasmenylcholine-folate liposomes: intracellular localization and synergistic phototoxicity // Int. J. Cancer V. 93 (2001) P. 384-392.

43. A. Gijsens, L. Missiaen, W. Merlevede, P. de Witte. Epidermal growth factor-mediated targeting of chlorin e6 selectively potentiates its photodynamic activity // Cancer Res. V. 60 (2000) P.2197-2202.

44. P. Opanasopit, M. Sakai, M. Nishikawa, S. Kawakami, F. Yamashita, M. Hashida. Inhibition of liver metastasis by targeting of immunomodulators using mannosylated liposome carriers // J. Control. Release V. 80 (2002) P. 283-294.

45. D. Papahadjopoulos, K. Jacobsen, S. Nir, T. Isac. Phase transitions in phospholipid vesicles. Fluorescence polarization and permeability measurements concerning the effects of temperature and cholesterol // Biochim. Biophys. Acta V. 311 (1973) P. 330.

46. G. Mouritsen, K, Jorgensen, T. Honger, Permeability of lipid bilayers near the phase transition, in: H.A. Disalvu, S.A. Simon (Eds.). Permeability and .Stability of Lipid Bilayers CRC Press, Boca Raton, FL (1994) P. 137.

47. J.B. Bassett, R.U. Anderson, J.R. Tacker. Use of temperature-sensitive liposomes in the selective delivery of methotrexate and cis-platinum analogues to murine bladder tumor // J. Urol. V. 135 (1985) P. 612-615.

48. К. Maruyama, S. Unezaki, N. Takahashi, M. Iwatsuru. Enhanced delivery of doxorubicin to tumor by long-circulating thermosensitive liposomes and local hyperthermia // Biochim. Biophys. Acta V. 1149 (1993) P. 209-216.

49. M.H. Gaber, K. Hong, S.K. Huang, D. Papahadjopoulos. Thermosensitive sterically stabilized liposomes: Formulation and in vitro studies on mechanism of doxorubicin release by bovine serum and human plasma // Pharmacol. Res. V. 12 (1995) P. 1407.

50. D. Needham, M. Dewhirst. The development and testing of a new temperature-sensitive drug delivery system for the treatment of solid tumors // Advanced Drug Delivery Reviews V. 53 (2001) P. 285-305.

51. D.C. Drummond, M. Zignani, J.-C. Leroux. Current status of pH-sensitive liposomes in drug delivery // Progress In Lipid Research V. 39 (2000) P. 409-460.

52. L.D. Mayer, M.B. Bally, P.R. Cullis. Uptake of adriamycin into large unilamellar vesicles in response to a pH gradient // Biochim. Biophys. Acta V. 857 (1986) P. 123-126.

53. L.D. Mayer, L.C.L. Tai, M.B. Bally, G.N. Mitilenes, R.S. Ginsberg, P.R. Cullis. Characterization of liposomal systems containing doxorubicin entrapped in response to pH gradients // Biochim. Biophys. Acta V. 1025 (1990) P. 143-151.

54. X. Li, D.J. Hirsh, D. Cabral-Lilly, A. Zirkel; S.M. Gruner, A.S. Janoff, W.R. Perkins. Doxorubicin physical state in solution and inside liposomes loaded via a pH gradient // Biochim Biophys Acta V. 1415 (1998) P. 23^10.

55. Государственная фармакопея СССР, XI изд. вып. 2, Москва.: Медицина, 1987. Т. 1, С. 336; Т. 2, С. 397.

56. А.С. Chakrabarti, I. Clark-Lewis, P.R. Cullis. Influence of charge, charge distribution, and hydrophobicity on the transport of short model peptides into liposomes in response to transmembrane pH gradients // Biochemistry V. 33 (1994) P. 8479-8485.

57. L.D. Mayer, M.B. Bally, H. Loughrey, D. Masin, P.R. Cullis. Liposomal vincristine preparations which exhibit decreased drug toxicity and activity against murine LI210 and P388 tumors // Cancer Res. V. 50 (1990) P. 575-579.

58. N.L. Boman, D. Masin, L.D. Mayer, P.R. Cullis, M.B. Bally. Liposomal vincristine which exhibit increased drug retention and increased circulation longevity cures mice bearing P388 tumors // Cancer Res. V. 54 (1994) P. 2830-2833.

59. P.R. Cullis, M.J. Hope, M.B. Bally, T.D. Madden, L.D. Mayer. Influence of pH gradients on the transbilayer transport of drugs, lipids, peptides and metal ions into large unilamellar vesicles // Biochim. Biophys. Acta V. 1331 (1997) P. 187-211.

60. Liposomes: A Practical Approach, Second Edition; Edited by V. Torchilin and V. Weissig // Oxford University Press, 2003.

61. R. Cohen, G. Haran, L.K. Bar, Y. Barenholz // 15th Int. Cong. Biochem. Abstracts. (1991) P. 97.

62. D.D. Lasic, P.M. Frederick, M. Stuart, Y. Barenholz, T.J. Mcintosh. Gelation of liposome interior. A novel method for drug encapsulation. // FEBS Letters V. 312 (1992) P. 255-258.

63. S. Clerc, Y. Barenholz. Loading of amphipathic weak acids into liposomes in response to transmembrane calcium acetate gradients. // Biochim. Biophys. Acta V. 1240 (1995) P. 257-265.

64. И.В.Жигальцев, С.Н.Коломейчук, А.П.Каплун, В.Г.Кучеряну, В.В.Юрасов, В.И.Швец. Концентрирование допамина в липосомах с помощью трансмембранного градиента концентрации сульфата аммония // Биоорган, химия Т. 25 (1999) № 5. С. 404-408.

65. British pharmacopoeia // London, V. 1 (2001)

66. Регистр лекарственных средств России // Москва: PJIC, 6 изд., 2000, С. 750-769.

67. М.Д. Машковский. Лекарственные средства // Москва: Новая волна, 2002, Т. 2., С. 437.

68. Энциклопедия клинической онкологии. Регистр лекарственных средств России. // Москва: ООО РЛС-2004,12 изд., 2004, С. 218-221.

69. Информация о лекарственных средствах специалистов здравоохранения. Лекарственные средства, применяемые в онкологии. // Москва: РЦ Фарммединфо, 1999, С.92-99

70. М. J. During, A. Freese, A.Y. Deutch et al. Biochemical and behavioral recovery in a rodent model of Parkinson's disease following stereotactic implantation of dopamine-containing liposomes // Exp. Neurol. V. 115 (1992) N. 2, P. 193-199.

71. M. Harrison, D. Tomlinson, S. Stewart. Liposomal entrapped doxorubicin: an active agent in AIDS - related Kaposi sarcoma // J. Clin. Oncol. V. 13 (1995) P. 914-920.

72. D. J. Adams. The Impact of Tumor Physiology on Camptothecin-Based Drug Development // Curr. Med. Chem. Anti-Cancer Agents V. 5 (2005) P. 1-13.

73. S. M. Deyev, R. Waibel, E. N. Lebedenko, A. P. Schubiger, A. Pluckthun. Design of multivalent complexes using the barnase-barstar module // Nature Biotechnology V. 21 (2003) N. 12, P. 1486-1492.

74. T. P. Derksen, G. L. Scherphof. An improved method for covalent coupling of proteins to liposomes // ВВА V. 814 (1985) P. 151-155.

75. В.И. Кленин, С.Ю. Щеголев, В.И. Лаврушин. Характеристические функции светорассеяния дисперсных систем // Издательство Саратовского университета, 1977, С. 176.

76. Ю. А. Владимиров, Г. Е. Добрецов. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран // Москва: Наука, 1980,320 с.

77. J. P. Costanzo, R. Е. Lee, Jr. Cryoprotection by urea in a terrestrially hibernating frog // J. Experim. Biol. V. 208 (2005) P. 4079-4089.

78. W. Wray, T. Boulikas, V.P. Wray, R. Hancock. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels //Anal Biochem (1981) P. 118-197.

79. J. W. Slot, H. J. Geutze. A new metjod of preparing gold probes for multiply-labelling cytochemistry//Eur. J.Cell Biol. V. 38 (1985) P. 87-93.

80. J. Roth. Post-embedding cutochemistry with gold-labelled reagents: a review // J. Microsc. V. 143 (1986) P. 125-137.