Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Алгоритм выбора наночастиц как носителей лекарственных субстанций

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Алгоритм выбора наночастиц как носителей лекарственных субстанций"

На правах рукописи

КРАСИЛЬНИКОВА Валентина Владимировна

АЛГОРИТМ ВЫБОРА НАНОЧАСТИЦ КАК НОСИТЕЛЕЙ ЛЕКАРСТВЕННЫХ

СУБСТАНЦИЙ

Специальность 03.00.23 - «Биотехнология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

003471055

Москва 2009

003471055

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Каплун Александр Петрович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Водовозова Елена Львовна

кандидат химических наук Морозова Нина Георгиевна

Ведущая организация:

Институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН

Защита состоится /У¿/С7&/ 2009

мин на заседании

диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова по адресу: 119571, г. Москва, проспект Вернадского, д. 86

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской государственной академии тонкой химической технологии им, М.В. Ломоносова.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru Автореферат разослан . ¿»¿Г . г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Ь л А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ'

Актуальность проблемы. Селективная доставка лекарственных субстанций к мишени представляет собой важную задачу в современной медицине. Введение лекарства в виде раствора, таблетки и т.п. приводит, как правило, к довольно равномерному распределению субстанции по организму, что определяет большую терапевтическую дозу. Некоторые свойства лекарственных субстанций ограничивает их применение: например, существенным недостатком белков является низкая стабильность при введении в организм, вследствие чего практикуется частое введение препарата пациенту; многие соединения очень плохо растворимы в воде, что серьезно ограничивает их применение в медицине. Инкапсуляция лекарственной субстанции в наночастицы изменяет фармакокинетику в нужном направлении, что позволяет уменьшить влияние большинства негативных факторов.

В наши дни уже никого не нужно убеждать, что НЧ очень удобная лекарственная форма. Преимущества таких частиц над раствором следующие:

1. защита включенной в НЧ субстанции от воздействия внешних неблагоприятных факторов при хранении, от разрушения под действием среды, в том числе, ферментов при введении в организм;

2. увеличение концентрации за счет инкапсуляции в НЧ для плохо растворимых в воде субстанций;

3. пассивное нацеливание - накопление инкапсулированного вещества в тканях с повышенной перфорацией сосудов (например, в раковых опухолях);

4. возможность присоединения к 114 молекулярного адреса, обеспечивающего доставку всех молекул лекарственной субстанции, ассоциированных с НЧ, в орган-мишень;

5. постепенное высвобождение инкапсулированной субстанции из НЧ.

В недалеком прошлом в качестве НЧ для доставки лекарственных субстанций использовались исключительно липосомы. Со временем пришло понимание, что они хороши только для довольно ограниченного круга веществ. Например, Лс не подходят для веществ, одинаково хорошо растворяющихся и в воде, и в мембране (с Кр около единицы). Такие вещества очень быстро выходят из обычно используемых Лс при нарушении равновесия, в частности, при удалении не включившейся субстанции. Другой класс веществ, для которых стандартно получаемые Лс малоэффективны - высокомолекулярные полярные соединения (белки, полисахариды и т.п.). В этом случае загрузка зависит только от соотношения объемов воды внутри и снаружи липосом. Например, для Лс диаметром 100 нм при концентрации липидов 50 мг/мл доля внутренней воды меньше 16%. Третья ситуация, неблагоприятная для загрузки в Лс - вещества, плохо растворимые и в воде, и мембране.

Список сокращений: АС - ангиостатин, ВМПС - высокомолекулярная полярная субстанция, ДР -доксорубицин, ДРГХ - гидрохлорид доксорубицина, Е - ёмкость носителя, Лс - липосома, МФФА -метилфеофорбид А, НЧ - наяочастнца, ОРО - относительный размер опухоли, ПАВ - поверхностно активное вещество; СБ - силибинин, СЛМ - склимарин, СТБ - смесь тритерпеноидов лупанового рада, выделенных из бересты, ТГФ - тетрагидрофуран, УСПЖ - увеличение средней продолжительности жизни, Хол - холестерин, ЦС - цереброзидсульфат, ЭС - эндостатин, яФХ - яичный фосфатидилхолин, К„ -коэффициент распределения {|

Сейчас известно более десятка типов НЧ. В состав некоторых из них входят только природные вещества (липосомы, жировые эмульсии, кохлеаты), другие состоят из искусственных полимеров (полимерные мицеллы, полимерные наносферы). ПАВ и полимеры используются также для стабилизации большинства типов частиц. Наиболее подходящий тип частиц-носителей следует выбирать в зависимости от свойств включаемой субстанции, способа применения препарата. Подходящие носители должны обеспечивать, по возможности, наибольшую ёмкость - соотношение вещество/носитель, длительное хранение готового препарата, что подразумевает и химическую стабильность, и агрегационную устойчивость препарата. В табл. 1 показана возможность применения различных типов НЧ (представлены наиболее распространенные) в зависимости от свойств включаемых в частицы субстанций. Следует заметить, что нами не встречалось использование высокомолекулярных гидрофобных веществ как лекарственных субстанций, однако в таблице для них приводятся возможные носители.

Табл. 1. Возможность использования различных типов НЧ в зависимости от свойств

инкапсулируемых субстанций.

Низкомолекулярные вещества Высокомолекулярные соединения

Гидрофобные вещества • Лс • Жировые эмульсии • Твердые липидные частицы • Полимерные мицеллы • Полимерные наносферы •Кохлеаты • Нанокристаллы • Лс • Жировые эмульсии • Твердые липидные наночастицы • Полимерные мицеллы

Полярные вещества • Лс • Кохлеаты • Полимерные нанокапсулы • Лс • Кохлеаты • Полимерные нанокапсулы • Интермолекулярные комплексы

Некоторые из приведенных в табл. 1 типов НЧ дороги, другие довольно токсичны. Таким образом, имеет смысл рассматривать НЧ без синтетических полимеров и ПАВ.

Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре Биотехнологии МИТХТ им. МВЛомоносова в рамках госбюджетной темы 1Б-5-356 «Исследования липидов, нуклеозцдов, пептидов, ретиноидов методами биотехнологии и химического синтеза с целью создания препаратов медицинского назначения (онкологические и вирусные болезни, возрастные патологии)», а также в рамках РНП «Развитие научного потенциала высшей школы» (проект № 2.1.1.3243), госконтрактов с Роснаукой №№ 02.445.11.7355,02.512.11.2144, 02.522.11.20011.

Цель настоящего исследования заключается в построении алгоритма поиска удобного типа НЧ - носителя субстанции, позволяющего добиться наибольшей ёмкости носителя для каждой из субстанций с различными Кр и молекулярной массой.

Научная новизна работы. Разработан и представлен в виде блок-схемы алгоритм

выбора типа НЧ в зависимости от свойств инкапсулируемой субстанции. Получены

липосомальные формы ЭС, семакса. Получена дисперсия смешанных мицелл с яФХ для СБ,

СЛМ и ДР. Установлено, что МФФА не образует подобных дисперсий, а СТБ образует

4

устойчивые дисперсии без яФХ и других ПАВ, исследовано влияние условий получения на свойства дисперсий из СТБ. Показано на примерах СБ, МФФА и ДР что нанодисперсии СТБ могут применяться в качестве носителей для инкапсуляции плохо растворимых в воде субстанций.

Практическая значимость работы. Разработанный алгоритм выбора типа НЧ в зависимости от свойств инкапсулируемой субстанции позволяет значительно сократить затраты на подбор подходящего носителя и получение новых наноформ лекарственных субстанций.

Оптимизация метода инкапсуляции белков позволила добиться увеличения эффективности включения белка в Лс примерно на 60%. В ходе исследований было обнаружено, что пептид семакс обладает способностью к быстрому высвобождению из Лс. Предложен способ инкапсуляции семакса, а также подходы к решению проблемы быстрого высвобождения пептида из Лс при разбавлении.

Предложен способ солюбилизации плохо растворимого в воде вещества СБ за счет получения смешанных мицелл с яФХ. Получен также новый тип НЧ - нанодисперсии СТБ, отличительной особенностью которых, по сравнению со всеми остальными НЧ, является отсутствие каких бы то ни было ПАВ, что снижает токсичность препарата. Выбраны оптимальные условия получения нанодисперсии СТБ. Показано что НЧ из СТБ могут служить в качестве носителей для гидрофобных субстанций.

При использовании антиангиогенных белков АС и ЭС за короткий срок наблюдается значительное уменьшение опухоли, однако при отмене препарата опухоль начинает активно прогрессировать и снова достигает прежних размеров. Нами было обнаружено, что комбинированное применение липосомальных препаратов АС и ДРГХ обладает большей эффективностью, нежели применение растворов этих препаратов или применение липосомальных препаратов АС или ДРГХ по отдельности. В данной работе показано, что комбинированное использование белка ЭС с липосомальным ДРГХ позволяет достичь большей противоопухолевой активности, чем применение комбинированного препарата липосомальных АС и ДРГХ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Алгоритм выбора типа НЧ в зависимости от свойств субстанции.

2. Получение липосомальных форм белков альбумина и ЭС, пептида семакс, водорастворимого низкомолекулярного вещества ДРГХ и плохо растворимых в воде СЛМ, СБ и МФФА.

3. Получение смешанных мицелл с яФХ для СБ, СЛМ и ДР.

4. Способ получения нанодисперсий СТБ в отсутствии ПАВ, зависимость характеристик дисперсии от условий получения, оптимальные условия.

5. Солюбилизация плохо растворимых в воде веществ с помощью инкапсуляции в наночастицы СТБ, выбор оптимальных соотношений.

6. Использование комбинации из липосомальных препаратов ЭС и ДРГХ для противоопухолевой терапии.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи, тезисы 3 докладов на научных конференциях, 1 патент РФ.

Апробация работы. Результаты работы доложены на: Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 20-22 марта 2003 г.); X Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии-2004». (Волгоград, 7-10 сентября 2004); XII Российском национальном конгрессе «Человек и Лекарство» (Москва, 18-22 апреля 2005).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на ¿^страницах, содержит"?»^рисунков и таблиц. Список литературы включает ^источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. ВЫБОР ОБЪЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Выбор типа НЧ

Существует множество различных типов НЧ. Наиболее часто применяемые на сегодняшний день для инкапсуляции различного рода субстанций приведены в табл. 1. Как видно из таблицы, Лс, несмотря на ряд недостатков, имеют наиболее широкий спектр применения. Несомненным плюсом Лс является отсутствие неприродных ПАВ. Если в случае гидрофобных низкомолекулярных веществ Лс являются отнюдь не лучшим вариантом НЧ (включение субстанции с Лс ограничивается растворимостью ее в липидном бислое), то в случае высокомолекулярных гидрофильных веществ (например, белков) Лс все еще остаются одним из наиболее предпочтительных вариантов. Для низкомолекулярных полярных веществ Лс могут оказаться удобным носителем в случае использования активной загрузки, однако этот метод загрузки известен лишь для слабых оснований (N.D. Santos, et. al., 2004; G. Haran, et. ai, 1993).

Для стабилизации жировых эмульсий и твердых липидных наночастиц часто используют неприродные ПАВ. Наличие в составе лекарственных средств токсичных неприродных ПАВ является негативным фактором при выборе типа НЧ.

Полимерные мицеллы целиком состоят из синтетических ПАВ.

Другой тип НЧ, образуемых липидами, - кохлеаты. В состав кохлеатов обязательно входит фосфатидилсерин, причем соотношение липидных компонентов установлено жестко (R. Santangelo et. al., 2000). Фосфатидилсерин - редкий и дорогой фосфолипид, поэтому данный тип частиц целесообразно применять только для очень дорогих субстанций.

В процессе исследования загрузки Лс гидрофобными веществами (гелиомицин, бетулиновая кислота) нами был обнаружен новый тип НЧ, который можно обозначить как смешанные мицеллы с яФХ (Сымон Л.В., 2004). С помощью таких частиц удалось увеличить концентрацию бетулиновой кислоты в 230 раз. Простота получения, отсутствие неприродных ПАВ и доступность яФХ делает такой тип НЧ привлекательным для дальнейшего изучения.

Для создания алгоритма выбора НЧ для субстанций с различными свойствами были

выбраны не содержащие неприродные ПАВ НЧ - Лс и смешанные мицеллы с яФХ.

1.2. Выбор субстанций

При выборе субстанций для исследования руководствовались следующими критериями - в наборе субстанций должны присутствовать:

•как низкомолекулярные (молекулярная масса до 1500 Да), так и высокомолекулярные соединения,

•полярные (С1о§Р«1), гидрофобные (С^Р>1.5) и амфифильные соединения.

Руководствуясь приведенными критериями были выбраны белки ЭС и альбумин, пептид семакс, низкомолекулярные субстанции - ДРГХ, ДР, МФФА, СЛМ, СБ, СТБ (табл. 2).

Табл. 2. Молекулярная масса и десятичный логарифм Кр выбранных субстанций.

Альбумин ЭС Семакс ДРГХ ДР СБ" МФФА СТБ"

ClogP* - - 0.48 -0.81 2.1 2.3 6.0 9.0

MW, г/моль 69366 20000 814 580 544 479 607 443

- ClogP - десятичный логарифм Кр, вычисленный в программе ACD Labs. Для белков расчет не производился.

" - для СЛМ и СТБ принимали значения С1с^Р и молекулярной массы равными значениям этих показателей для основных компонентов субстанций - СБ и бетулина.

ЭС - антиангиогенный белок, применение которого приводит к существенному

снижению объема опухоли, однако при отмене препарата размеры опухоли быстро восстанавливаются. Включение ЭС в НЧ может способствовать увеличению концентрации ЭС в опухоли за счет пассивного нацеливания.

Применение инкапсулированного ДРГХ (или ДР) - противоопухолевого препарата -вместе с ЭС в НЧ может способствовать увеличению противоопухолевой активности комбинированного препарата.

Также в комплексной терапии рака может использоваться в качестве гепатопротектора СЛМ, смесь флавоноидов, основным компонентом которой является СБ. Включение их в НЧ может способствовать преимущественному транспорту субстанции в печень.

Другим противоопухолевым препаратом является МФФА, применяемый в фотодинамической терапии рака. Инкапсуляция в НЧ должна увеличить растворимость вещества в воде.

СТБ, обладает широким спектром биологической активности. Основным недостатком СТБ является крайне низкая растворимость в воде (0.007 мг/мл). Включение этой субстанции в НЧ поможет увеличить концентрацию СТБ в воде, а также даст возможность осуществлять внутривенное введение препарата.

Биологически активный пептид семакс (МеЮ1п-Н18-РЬе-Рго-С1у-Рго), действующий на центральную нервную систему при введении в кровоток быстро подвергается деградации ферментами. Инкапсуляция в НЧ может защитить пептид от деградации.

Альбумин поддерживает коллоидно-осмотическое (онкотическое) давление крови, при внутривенном введении быстро повышает артериальное давление, увеличивает переход и способствует удержанию тканевой жидкости в кровяном русле, повышает резервы белкового питания тканей и органов. Это хорошо изученный белок, часто используемый в качестве модельного белка при изучении НЧ различного типа, несомненным преимуществом такого

белка является его доступность.

1.3. Методы исследования дисперсий НЧ

Для исследования возможности применения выбранных типов НЧ для солюбилизации субстанций с различными свойствами выбранные субстанции инкапсулировались в НЧ и полученные дисперсии оценивались по ёмкости и эффективности включения. Полученные данные использовались для разработки алгоритма инкапсуляции субстанций в НЧ.

Эффективность включения субстанций определяли с помощью гель-эксклюзионной хроматографии (сорбент БерЬагозе СХ-4В), отделяя НЧ от не включившегося вещества.

Размер частиц оценивали с помощью турбидиметрии. Более точные значения получали с помощью электронных микрофотографий* (для мицелл с яФХ и дисперсий СТБ) или с помощью динамического светорассеяния".

2. ИНКАПСУЛЯЦИЯ СУБСТАНЦИЙ В НЧ

2.1. Полярные субстанции

Для инкапсуляции полярных субстанций из выбранных нами типов НЧ подходят только Лс. Полярные вещества, инкапсулированные в Лс, находятся во внутреннем водном объёме. Эффективность включения субстанции (отношение количества включившейся субстанции к общему количеству субстанции в дисперсии) в этом случае зависит от размера Лс, концентрации липидов и от липидного состава - параметров, влияющих на величину внутреннего объема Лс.

2.1.1. Белки (ВМПС)

В случае белков, несмотря на все возрастающее количество различных типов НЧ, наиболее часто используемыми для инкапсуляции НЧ являются Лс. Основным недостатком Лс в качестве носителя для подавляющего большинства белков является малая ёмкость. Увеличения ёмкости можно добиться изменением метода получения Лс или за счёт сорбции белка на поверхности Лс.

Проведенные нами исследования по комбинированному применению липосомальных АС и ДРГХ показали увеличение противоопухолевой активности комбинированного препарата по сравнению с растворами и отдельно липосомальными формами противоопухолевых агентов АС и ДРГХ (Д.А. Безруков, 2007). Однако использование АС для исследования зависимости ёмкости Лс от метода их получения затруднено ввиду малой его доступности. Известно, что более доступный белок альбумин обладает схожими с АС свойствами (в частности, растворимостью). Используя альбумин в качестве модельного белка, исследовали возможность увеличения ёмкости Лс. Также использовали для получения Лс более доступный по сравнению с АС антиангиогенный белок ЭС - рекомбинантный аналог АС. В отличие от альбумина, растворимость ЭС в воде не превышает 4 мг/мл.

Сравнивали параметры загруженных белками липосомальных дисперсий (25 мг/мл)

" Электронные микрофотографии сделаны в ИМБ им. В.А. Энгельгарэта РАН вед. и. сотр., д.б.н. В.И. Попенко

" Измерения проводились в лаборатории разработки лекарственных форм НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН

состава яФХ/Хол 7/3 мольн., полученных различными методами (табл. 3).

Табл. 3. Параметры загруженных белками липосомальных дисперсий (25 мг/мл) состава

яФХ/Хол 7/3 мольн., полученных различными методами.

Белок, исх. загр., мг/мл Метод получения Измеренный диаметр частиц, нм Эфф. вкл. на единицу объёма, % Теор. эфф. вкл. на единицу объёма, % Е, масс.

ЭС, 4 Лип. пленка, экструзия (100 нм) - 0.40 0.15 0.063

Альбумин, 5 Лип. пленка, экструзия (200 нм) - 0.14 0.16 0.030

Альбумин, 5 Лип. пленка, гомогенизатор 128 0.12 0.16 0.029

Альбумин, 5 Обращение фаз, без экструзии 607 0.05 Нет данных 0.057

Альбумин, 5 Обращение фаз, экструзия (200 нм) 175 0.13 0.16 0.045

АС, 6" Лип. пленка, экструзия (100 нм) - 0.14 0.15 0.034

- данные приведены для сравнения с модельным белком альбумином

Из таблицы видно, что при использовании метода липидной пленки для ЭС эффективность включения в 2.5 раза выше, чем для АС и альбумина, показавших сходную эффективность включения. Возможно, в данном случае существенное увеличение этого показателя происходит за счет сорбции белка на поверхности Лс или образования крупных белок-липидных комплексов, элюирующихся с колонки одновременно с Лс.

Использование для экструзии Лс гомогенизатора высокого давления позволяет получать большие объемы липосомальных дисперсий, в случае его использования размер частиц зависит от свойств липидов. Размер полученных нами Лс с альбумином при помощи гомогенизатора высокого давления составил 128 нм, при этом эффективность включения практически совпадает с эффективностью включения достигаемой при экструзии через ядерные поликарбонатные фильтры (табл. 3). Отсюда можно заключить что, использование гомогенизатора высокого давления, пригодно для получения в больших количествах липосомальных дисперсий существенно не уменьшая при этом эффективность включения белка по сравнению с Лс, полученными методом липидной пленки.

Эффективность включения альбумина в Лс при использовании метода обращения фаз также близка как к эффективности включения АС и альбумина в Лс, полученные методом липидной пленки, так и к теоретическим значениям эффективности включения, при этом ёмкость Лс, полученных обращением фаз, выше ёмкости Лс, полученных методом липидной пленки. Из этого можно заключить, что применение метода обращения фаз обеспечивает наилучшее сочетание ёмкость/эффективность включения для получения Лс с белком.

2.1.2. Гидрохлориддоксорубицина

Наибольшая эффективность включения вещества в Лс достигается при использовании активной загрузки слабых оснований. Поэтому ДРГХ, являющийся слабым основанием, следует включать в Лс, используя метод активной загрузки. Получали липосомальную

дисперсию ДРГХ загрузкой против градиента сульфата аммония (табл. 5).

Табл. 5. Параметры липосомальной дисперсии ДРГХ, полученной загрузкой против градиента

сульфата аммония. Липидный состав - яФХ/Хол 7/3 мольн, размер Лс 100 нм.

Исходная концентрация ДРГХ, мг/мл Концентрация липидов, мг/мл Эффективность включения, % Теор. эфф. включения, % Е, масс.

0.95 50.0 85.0 14.6 0.016

Эффективность включения при инкапсуляции ДРГХ методом активной загрузки примерно в 6 раз выше теоретической при пассивной загрузке (табл. 5). Невысокая ёмкость носителя обусловлена маленькими концентрациями загружаемого вещества при относительно высокой концентрации липидов (такая концентрация была необходима для биологических испытаний).

2.2. Амфифильные субстанции

2.2.1 Семакс

Для инкапсуляции пептида семакса (Кр=3) использовали различные методы получения липосомальных дисперсий: липидной пленки, обращения фаз, получение из пролипосом. При получении Лс варьировались также липидный состав и концентрация пептида (табл. 4). Табл. 4. Параметры полученных различными способами липосомальных дисперсий с семаксом.

№ Липидный состав Конц. липидов, мг/мл Конц. семакса, мг/мл Метод получения Эфф. вкл. % Теор. эфф. вкл., % Е, масс.

1 яФХ/Хол, 7/3 50 2 Обращение фаз, экструзия, 100 нм 11.9 18.7 0.0048

2 яФХ/Хол/ЦС, 7/3/1 50 2 Обращение фаз, экструзия, 100 нм 13.4 18.7 0.0054

3 Гликосфинголипиды, пролипосомы 10 0.5 Смешивание; 10 мин, 60-70°С 3.9 - 0.0020

4 Гликосфинголипиды 50 20 Лип. пленка, экструзия, 200 нм 10.8 36.0 0.043

Как видно из табл. 4, при инкапсуляции семакса в «мягкие» Лс (яФХ/Хол 7/3), эффективность включения составила примерно 12%, однако при повторном (через час) прохождении через колонку (контроль высвобождения семакса их Лс) эффективность включения составила примерно 5%, то есть семакс легко походит через мембрану Лс.

Для увеличения вязкости мембраны использовали добавление в липидный состав ЦС, эффективность включения после первого прохода через колонку составляла примерно 13%. Однако при повторном (через час) разделении она также существенно уменьшилась.

Аналогичное явление наблюдалось ранее при получении Лс с доксорубицином (Д.А. Безруков, 2007) - в некоторых случаях, при использовании метода обращения фаз для получения Лс, остаточное содержание эфира (используемого в методе обращения фаз), приводит к увеличению проницаемости бислоя Лс.

10

Для исключения влияния остаточных количеств на проницаемость бислоя исследовали возможность применения для инкапсуляции семакса JTc из гликосфинголипидов, полученных из пролипосом и методом липидной пленки.

Эффективность включения семакса в Лс, полученные из пролипосом, составила менее 5%. Следует упомянуть, что предложенное нами использование пролипосом из гликосфинголипидов для уменьшения проницаемости бислоя Лс дало положительные результаты для другого легко выходящего из Лс амфифильного вещества - изониазида (Кр=0.5) - 13%.

В случае Лс, полученных методом липидной пленки, эффективность включения составила 10.8%. За счёт увеличения исходной концентрации семакса удалось добиться увеличения ёмкости таких Лс. При повторном элюировании (через день) эффективность включения составила 5%.

Из полученных данных можно заключить:

- для амфмифильных субстанций при инкапсуляции в Лс нельзя использовать метод обращения фаз, так как остатки растворителя увеличивают проницаемость мембраны,

- для субстанций с Кр~0.5 увеличение жесткости мембраны может приводить к положительному результату,

- для семакса необходимо использовать Лс с «жесткой» мембраной, состоящей, например, из соевого фосфатидилхолина или дистеароилхолина, у которых температура фазового перехода лежит примерно в той же области что и у гликосфинголипидов.

2.3. Гидрофобные субстанции

Основным недостатком гидрофобных субстанций является плохая растворимость их в воде, что существенно ограничивает их применение. Инкапсуляция таких субстанций в основном осуществляется с помощью ПАВ. Нами были выбраны для инкапсуляции гидрофобных субстанций НЧ, в состав которых не входят синтетические ПАВ: Лс и обнаруженный нами ранее новый тип НЧ - смешанные мицеллы с яФХ.

2.3.1. Смесь тритерпеноидовлуплновогоряда (СТБ)

Ранее нами было показано, что для тритерпеноидов лупанового ряда, таких как бетулиновая кислота, бетулоновая кислота, бетулин (основной компонент СТБ) эффективность включения в Лс составляет 2.5-5%.

Фосфолипиды с гидрофобными и амфифильными веществами могут образовывать не только Лс. Некоторое время тому назад, исследуя липосомальные формы гидрофобных веществ гелиомицина, бетулиновой кислоты (A.B. Сымон, 2004), мы обнаружили, что при соотношении субстанция/яФХ большем, чем растворимость субстанции в бислое, кроме Лс образуются частицы другой природы. В них доля субстанции достигает 0.5, а иногда и выше. Было показано, что для БК оптимальное соотношение БК/яФХ составляет 1/1 мольн., в этом случае образуется практически не содержащая Лс весьма стабильная дисперсия, частицы которой представляют собой стержни, длинной от 100 до 1000 нм и диаметром около 20 нм.

11

Такие частицы были получены добавлением к растворённым в ТГФ яФХ и субстанции 25 кратного избытка воды с последующим удалением органического растворителя.

Для определения оптимального соотношения яФХ и СТБ получали мицеллы с мольными отношениями яФХ/субстанция 0/1, 1/2, 1/1,2/1 и 4/1. Оказалось, что размер частиц в дисперсии монотонно уменьшается с уменьшением доли яФХ (рис. 1).

Рис. 1. Зависимость размера частиц в дисперсиях от массовой доли СТБ.

На электронных микрофотографиях видны частицы трех типов: липосомы, вытянутые кристаллы и сферические частицы, причем с уменьшением доли яФХ Лс в дисперсии становится все меньше, одновременно увеличивается количество вытянутых кристаллов (рис. 2, А, Б, В), в отсутствии яФХ образуются сферические частицы (рис. 2, Г).

Рис. 2. Электронные микрофотографии дисперсий с массовой долей СТБ: А - 0.19 (масштабный отрезок 100 нм), Б - 0.5 (масштабный отрезок 50 нм), В - 0.67 (масштабный отрезок 100 нм) и Г - 1 (масштабный отрезок 100 нм).

Дисперсия, в составе которой яФХ отсутствует, состоит только из аморфных сферических частиц (рис. 2, Г), имеющих размер от 20 до 200 нм (рис. 3). Такая дисперсия обладала и наилучшей стабильностью (более 2 месяцев хранения).

20.00

18.00

* 16 00

X ь 14.00

? 12.00 -

О 10.00 ■

8.00

щ

6 00

о 4 00

2.00 -

0.00

■е

.11

Е

' ^ ^ ^ к размер частиц, нм

Рис. 3. Гистограмма распределения размера частиц дисперсии СТБ.

Концентрация СТБ в дисперсии примерно в 240 раз превышает растворимость основного компонента СТБ - бетулина.

Таким образом, мы обнаружили, что некоторые вещества (смеси веществ), сами не являясь поверхностно-активными, могут образовывать стабильные дисперсии в отсутствии ПАВ. Природа этого явления пока неясна.

2.2.1.1. Подбор оптимальных условий получения нанодисперсий СТБ

Дисперсии СТБ могут представлять интерес как потенциальные носители лекарственных субстанций, но для успешного применения их в этом качестве необходимо было исследовать влияние различных факторов на характеристики конечной дисперсии. Неожиданное открытие таких частиц сделало необходимым подробное исследование полученных НЧ и условий их получения (порядка прибавления компонентов, концентрации СТБ и воды, растворителей, температуры процесса).

Обратный порядок прибавления

Получали дисперсию с использованием обратного порядка прибавления компонентов, то есть в избыток воды добавляли раствор СТБ в ТГФ. Средний размер частиц дисперсии, полученной таким образом, существенно превышал размер частиц дисперсии, полученной обычным методом - 589 нм по сравнению с 120 нм.

Влияние концентрации СТБ в ТГФ на размер частии дисперсии

Определяли размер частиц дисперсий приготовленных с использованием растворов СТБ в ТГФ концентрацией 2.5, 5, 7, 9 и 10 мг/мл. Размер частиц полученных при использовании различных концентраций СТБ в ТГФ показан на рис. 4 следует заметить, что стабильными оказались лишь дисперсии, полученные с использованием растворов СТБ в ТГФ концентрацией 2.5 и 5 мг/мл.

Рис. 4. Зависимость размера наночастиц дисперсий от концентрации СТБ в ТГФ (масса СТБ в 1 мл ТГФ).

Влияние растворителя на свойства дисперсии

Применение ТГФ для получения дисперсии было обусловлено хорошей растворимостью СТБ в нем, однако не исключалась возможность того, что ТГФ может оказаться не самым лучшим растворителем для получения дисперсий СТБ. В качестве возможных вариантов рассматривались смешивающиеся с водой растворители, в которых хорошо растворяется СТБ. Таким условиям наряду с ТГФ соответствуют также ацетон и диоксан.

Рис. 5. Электронные микрофотографии дисперсий, полученных из ацетонового раствора СТБ (А) и диоксанового раствора СТБ (Б), масштабный отрезок 50 нм.

Полученные с использованием ацетона и диоксана дисперсии были менее стабильны. Из электронных микрофотографий данных дисперсий видно, что форма частиц этих дисперсий имеет отклонение от сферической формы частиц (рис. 5), это может быть обусловлено тем, что за время растворения растворителя в воде сферические частицы не успели образоваться. Кроме того, в дисперсии, полученной с применением ацетона, изредка наблюдаются кристаллы бетулина.

Данный эксперимент показал, что природа растворителя является одним из ключевых факторов при получении дисперсий СТБ.

Уменьшение количества добавляемой воды

Возможность использовать вместо 25-ти кратного избытка воды меньшее ее количество могло бы сократить временные и энергетические затраты на получение каждой дисперсии. Исследовали стабильность готовой дисперсии и размер частиц для образцов, полученных при добавлении 12.5 и 6 мл воды (табл. 6).

Табл. 6. Сравнение средних размеров частиц для дисперсий, полученных при добавлении 25, 12.5 и 6 мл воды.

Дисперсии СТБ полученные при добавлении Средний размер частиц, нм

В день приготовления Через неделю

25 мл воды <187 <187

12.5 мл воды 445 848

6 мл воды 259 747

Из табл. 6 видно, что полученные прибавлением 12.5 и 6 мл воды дисперсии имеют более крупные частицы. Электронные микрофотографии показывают, что в них наблюдается кристаллы («нанодоски»), К тому же такие дисперсии являются нестабильными, в то время как дисперсии, полученные по разработанной методике (при добавлении 25 мл воды), стабильны, по крайней мере, в течение двух месяцев.

Влияние температуры на размер частиц и стабильность дисперсий СТБ Оценивали средний размер частиц дисперсий, полученных при температуре близкой к 0°С и 55-60°С. Он оказался равным 100 нм и 2300 нм соответственно (ср. с 120 нм для получаемых по стандартной методике). Существенно то, что дисперсии, приготовленные при пониженной температуре, получались более стабильными (по сравнению с полученными при комнатной температуре).

Также на размер частиц дисперсии оказывает влияние и нагревание (например, стерилизация 1 ч, 100'С) уже готовой дисперсии. Из электронных микрофотографий (рис. 6) видно, что в результате из дисперсий выделяется и кристаллизуется вещество (плоская форма кристаллов характерна для бетулина), причем размер сферических частиц при этом уменьшается (рис. 6).

«16 00 ! м ое I )2оа 5 юоо

')% 03

? воо | «00

I 100

л

чО (Р ,

$ # ^ # # У

<ф ¿р ¿р ^ ^

• # #

Рис 6. Слева: электронная микрофотография дисперсии из СТБ после стерилизации (100'С, 1 ч), масштабный отрезок 100 нм. Справа: гистограммы распределения по размеру частиц, полученных из СТБ до стерилизации (А) и после стерилизации (Б).

Другими словами, нагреванием с последующей фильтрацией через фильтр с диаметром пор 100 нм, можно получать устойчивые к стерилизации нагреванием дисперсии, обедненные бетулином, с меньшим размером частиц, чем при использовании обычной методики.

Суммируя все полученные результаты, можно заключить, что оптимальным для получения нанодисперсии СТБ со сферическими частицами является быстрое прибавление 25-кратного избытка холодной (4°С) воды к раствору СТБ в ТГФ (5 мл/мл).

Таким образом, нами предложен простой способ солюбилизации тритерпеноидов лупанового ряда (СТБ). Так как описываемые 114 состоят исключительно из гидрофобных веществ, мы предположили, что такие НЧ могут использоваться как переносчики гидрофобных субстанций. Для проверки этого предположения получали дисперсии СТБ с МФФА, ДР, СЛМ и СБ, определяли эффективность включения субстанции в частицы, исследовали зависимость размера частиц от доли включенной субстанции и проверяли однородность морфологии частиц полученных дисперсий. Стабильность дисперсий СТБ в случае содержания в ней кристаллов бетулина и частиц несферической формы значительно снижается. Основной задачей при получении нагруженных веществом дисперсий СТБ было нахождение таких соотношений субстанция/СТБ при которых соблюдались следующие условия: 1) максимальная эффективность включения субстанции, 2) отсутствие в дисперсии кристаллов.

Получали дисперсии СТБ с гидрофобными веществами ДР, СЛМ, СБ и МФФА. Изначально готовили дисперсии с массовыми соотношениями субстанция/СТБ 0.1 и 0.2, оценивали эффективность включения субстанции и с помощью электронных микрофотографий определяли наличие в дисперсии кристаллов. Дальнейшие соотношения субстанция/СТБ подбирались исходя из данных, полученных в начальных экспериментах.

2.2.2. Стимлрт(СЛМ)исялиБинин(СБ)

При включении в Лс гидрофобных субстанций увеличения эффективности включения можно достичь, если количество исходно загружаемого вещества близко к количеству вещества, которое способна в себе растворить мембрана Лс. Изменяя липидный состав можно лишь незначительно изменить растворимость вещества в бислое.

Методом липидной пленки с последующей экструзией через ядерные фильтры получали липосомальные дисперсии СЛМ и СБ различного липидного состава и различных концентраций липидов (табл. 7).

Табл. 7. Характеристики липосомальных дисперсий СЛМ и СБ, полученных гидратацией липидной пленки с последующей экструзией через ядерные фильтры с размером пор 200 нм.

Липидный состав, мольн Субст. Конц. липидов, мг/мл Среда гидратации Конц. субст. в дисп., мг/мл Эффективность включения, % Е, масс.

яФХ/Хол, 7/3 СЛМ 25 Физраствор 1.46 53 0.031

яФХ/Хол, 9/1 СЛМ 25 Физраствор 1.76 53 0.038

яФХ/Хол, 9/1 СЛМ 25 Р-р сахарозы 1.56 25 0.015

яФХ/Хол, 9/1 СБ 25 Р-р сахарозы 2.11 40 0.034

яФХ/Хол, 9/1 СЛМ 10 Р-р сахарозы не экструдируется через 200 нм

яФХ/Хол, 9/1 СБ 10 Р-р сахарозы 1.51 26 0.039

яФХ СЛМ 25 Р-р сахарозы 1.42 13 0.0074

яФХ СБ 25 Р-р сахарозы 2.23 45 0.040

яФХ СЛМ 10 Р-р сахарозы 0.53 22 0.012

яФХ СБ 10 Р-р сахарозы 1.66 34 0.056

Как видно из табл. 7 для липосомальных дисперсий в физрастворе с уменьшением содержания Хол в Лс эффективность включения СЛМ практически не изменяется. Использование для гидратации физраствора не предполагает использования лиофилизации для более длительного хранения липосомального препарата. В качестве криопротектора был выбран 10% раствор сахарозы. В случае уменьшения концентрации липидов до 10 мг/мл липосомальная дисперсия экструдируется только через ядерные фильтры с размером пор 400 нм, возможно, это происходит потому, что значительная часть СЛМ не включилась в Лс а образовала кристаллы размером менее 400 нм и более 200 нм. Для СЛМ не удалось достичь эффективности включения большей, чем 25% (яФХ/Хол 9/1 мольн., 2.5% дисперсия) при использовании криопротектора. В случае же СБ при использовании криопротектора максимальная эффективность включения составила 45% (яФХ, 2.5% дисперсия).

Для СБ и СЛМ проверяли возможность увеличения ёмкости частиц за счет включения субстанции в мицеллы с яФХ (мольные соотношения яФХ/субстанция 0/1, 1/1, 1/2 и 1/4). Полученные для СБ дисперсии мицелл с яФХ были стабильны (хранение 3 недели), за исключением дисперсий из чистого СБ (яФХ/СБ 0/1). В случае СЛМ наиболее стабильной была дисперсия с соотношением яФХ/СЛМ 1/4

Рис. 7. Электронные микрофотографии дисперсий яФХ/СБ, полученных при мольных соотношениях яФХ/СБ А - 1/1, Б - 1/2, В - 1/4 и дисперсий яФХ/СЛМ, полученных при соотношениях яФХ/СЛМ Г - 0/1, Д - 1/2, Е - 1/4, масштабный отрезок 100 нм.

Как видно на электронных микрофотографиях (рис. 7), при соотношении яФХ/СБ 1/1 и 1/2 в дисперсии присутствуют в основном частицы неправильной формы, причем в дисперсии с соотношением яФХ/СБ 1/1 присутствуют крупные частицы, вероятно образованные вследствие слипания более мелких частиц, что может говорить о плохой агрегационной устойчивости дисперсии. В случае соотношения яФХ/СБ 1/4 образуются сферические частицы, размер которых составляет примерно 70-150 нм. Ёмкость частиц (масс.) в этой дисперсии составляет 0.71 (примерно в 18 раз выше ёмкости Лс), в случае мицелл с яФХ ёмкость рассчитывалась как отношение массы субстанции к суммарной массе яФХ и субстанции. Для СЛМ, в отличие от СТБ при соотношении яФХ/субстанция 0/1 помимо сферических частиц образуются также кристаллы («нанопалки»), такая дисперсия малостабильна. Размеры сферических частиц в дисперсиях яФХ/СЛМ в основном лежат в пределах 30-60 нм. Наилучшими характеристиками - стабильность и морфология обладает дисперсия с соотношением яФХ/СЛМ 1/4 мольн.

При инкапсуляции СЛМ и СБ в наночастицы СТБ на первом этапе (массовое соотношение субстанция/СТБ 0.1 и 0.2 ) получили дисперсии, эффективность включения субстанции в которых при соотношении 0.1 меньше чем при соотношении 0.2. Причем по электронным микрофотографиям дисперсий с СБ видно, что при соотношении 0.2 и 0.1 в дисперсиях наблюдаются кристаллы (табл. 8). Для дальнейшего исследования были выбраны соотношения субстанция/СТБ 0.05 и 0.02. Эффективность включения составила при обоих соотношениях 100%, электронные микрофотографии показали отсутствие кристаллов в дисперсиях. Максимальное соотношение субстанция/СТБ для СЛМ и СБ при котором эффективность включения максимальна и отсутствуют кристаллы - 0.05.

Табл. 8. Характеристики дисперсий СТБ с СЛМ и СБ при различных массовых соотношениях субстанция/СТБ.

Характеристики дисперсий -эффективность включения (% масс) и наличие кристаллов

Субст./СТБ 0.02 | 0.05 | 0.1 | 0.2

Субстанция

СЛМ 100 100 76 100

СБ 100 100 71, крист. 100

Таким образом, наибольшей ёмкостью для СЛМ/СБ обладают мицеллы с яФХ (0.71), что примерно в 14 раз выше ёмкости дисперсий СТБ (табл. 9).

Табл. 9. Эффективность включения СЛМ и СБ и ёмкость для различных типов носителей.

Субстанция Лс Мицеллы с яФХ Дисперсии СТБ

Эфф. вкл., % Е, Эфф. вкл., % Е, Эфф. вкл., % Е,

масс. масс. масс. масс. масс. масс.

СЛМ 25 0.015 100 0.71 100 0.050

СБ 45 0.040 100 0.71 100 0.050

2.2.3. МетилфеофореидА (МФФА)

Другое гидрофобное вещество - МФФА, ^Р которого в 3 раза больше чем у СБ, включали в Лс, полученные методом липидной пленки, и определяли зависимость эффективности включения от количества исходно загружаемого хлорина. В первом опыте исходное соотношение МФФА/липиды составляло 0.1. В связи с тем, что не включившееся в Лс вещество образовывало крупные частицы, экструзию проводили последовательно через ядерные поликарбонатные фильтры с диаметром пор 1000, 400 и 200 нм. Было замечено, что после экструзии на фильтрах остается значительное количество вещества. Гель-фильтрация показала, что МФФА присутствует только во фракциях соответствующих фракциям Лс, однако возможно также, что кроме Лс в дисперсии могут присутствовать кристаллы МФФА. В дальнейшем для расчета эффективности включения и ёмкости считали, что весь МФФА, присутствующий в дисперсии, инкапсулирован в Лс.

Для оптимизации условий получения Лс, загруженных МФФА, в последующих опытах исходная загрузка МФФА по отношению к липидам была близка к соотношению вещество/липвды в итоговой дисперсии первого опыта (табл. 10).

Табл. 10. Параметры липосомальных дисперсий МФФА (яФХ/Хол 7/3 мольн.), размер частиц 200 нм.

Соотношение МФФА/липиды при загрузке, масс. Итоговая концентрация МФФА в дисперсии, мг/мл Доля включившегося МФФА от исходно загруженного, % масс. Е, масс.

0.10 0.27 10 0.011

0.016 0.30±0.01 75 0.012

0.011 0.24±0.01 87 0.0096

Примечание: для дисперсий с исходным соотношением МФФА/липвд 0.016 и 0.011 масс, эксперименты проводились в трех дублях.

Из табл. 10 видно, что при уменьшении исходной загрузки вещества до 1.1% (масс.) соотношение вещество/липид в конечной дисперсии падает, а процент включившегося

вещества увеличивается. Наибольшая концентрация МФФА в конечной дисперсии достигается при исходном соотношении вещество/липид 0.016 (масс).

Мицеллы с яФХ для МФФА получали с теми же массовыми соотношениями яФХ/субстанция, что и в случае СБ (0/1, 1/1, 1/2 и 1/4). Однако в случае МФФА все полученные дисперсии содержали крупные частицы. При хранении в холодильнике частицы полностью оседали на дно в течение суток, надосадочная жидкость была прозрачной и не опалесцировала. Таким образом, данный тип дисперсии не подходит для солюбилизации МФФА.

На первом этапе при инкапсуляции МФФА в частицы СТБ было показано, что в дисперсиях с соотношениями МФФА/СТБ 0.2 и 0.1 кристаллы не наблюдались, дальнейшее увеличение соотношения до 0.4 привело к появлению в дисперсии кристаллов, максимальное соотношение субстанция/СТБ, при котором в дисперсии не образуются кристаллы, для МФФА составляет 0.2.

Табл. 11. Эффективности включения МФФА и ёмкости для различных типов носителей.

Субстанция Лс Мицеллы с яФХ Дисперсии СТБ

Эфф. вкл., % масс. Е, масс. Эфф. вкл., % масс. Е, масс. Эфф. вкл., % масс. Е, масс.

МФФА 75 0.012 осадок 100 0.20

Ёмкость дисперсий СТБ для МФФА выше ёмкости Лс примерно в 16 раз (табл. 11). Таким образом, использование Лс в данном случае менее целесообразно.

2.2.4.ДОКСОБУБИЦИН (ДР)

Включение доксорубицина в Лс выгоднее осуществлять в виде гидрохлорида (ДРГХ), поэтому эксперименты по включению ДР в Лс не проводились.

При инкапсуляции ДР с помощью мицелл с яФХ, наиболее устойчивой (3 недели хранения) оказалась дисперсия состава яФХ/ДР 1/4 мольн. Дисперсии состава яФХ/ДР 0/1, 1/1 и 1/2 были менее стабильны, наихудшую стабильность при хранении показала дисперсия состава яФХ/ДР 0/1. Были получены электронные микрофотографии дисперсий яФХ/ДР 0/1, 1/1 и 1/4 (рис. 8). Как видно из фотографий, в дисперсиях с соотношением яФХ/субстанция 0/1 и 1/4 присутствуют «нановолокна» - гибкие длинные структуры, в дисперсии с соотношением 1/4 также присутствуют частицы, похожие на Лс, в случае дисперсии с соотношением 1/2 волокон не наблюдалось, однако помимо мелких частиц средний размер которых 30-60 нм (70%), в дисперсии также присутствовали более крупные частицы (до 400 нм), наличие которых уменьшает устойчивость дисперсий при хранении.

Рис. 8. Электронные микрофотографии дисперсий яФХ/ДР, полученных при мольных соотношениях яФХ/ДР А - 0/1, Б - 1/1, В - 1/4, масштабный отрезок 100 нм.

20

Возможно, получением таких дисперсий с последующим фильтрованием можно получить более стабильную и однородную дисперсию.

При включении ДР в частицы СТБ на первом этапе (соотношения субстанция/СТБ 0.1 и 0.2) были получены дисперсии с эффективностью включения менее 100% (67% и 73% соответственно), при уменьшении соотношения ДР/СТБ до 0.05 - 79%. Максимальное соотношение ДР/СТБ, при котором эффективность включения максимальна и отсутствуют кристаллы - 0.02.

Табл. 12. Эффективности включения ДР и ёмкости для различных типов носителей.

Субстанция Лс Мицеллы с яФХ Дисперсии СТБ

Эфф. вкл., % масс. Е, масс. Эфф. вкл., % масс. Е, масс. Эфф. вкл., % масс. Е, масс.

ДР - - - 0.80 100 0.020

Как ввдно из табл. 12, ёмкость дисперсии СТБ для ДР на 20% превышает ёмкость полученных для биологических испытаний Лс для ДРГХ, ёмкость же смешанных мицелл с яФХ превышает ёмкость дисперсии СТБ в 40 раз, однако использование дисперсий с СТБ позволяет получать устойчивые дисперсии без дополнительной обработки (например, без фильтрования). Однако ёмкость дисперсий СТБ для ДР уступает максимальной ёмкости липосом для ДРГХ (0.02 против 0.2), выигрывая незначительно лишь б эффективности включения (100% против 85-92%) (Д.А. Безруков, 2007). Выбор между дисперсиями СТБ, липосомами и смешанными мицеллами с яФХ в данном случае зависит от конкретной конечной задачи.

3. КОМБИНИРОВАННОЕ ДЕЙСТВИЕ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ЭС И ДРГХ

Ранее нами было показано {Д.А. Безруков, 2007), что комбинированное применение липосомальных препаратов АС и ДРГХ обладает большей эффективностью, нежели применение растворов этих препаратов или применение липосомальных препаратов АС или ДРГХ по отдельности. ЭС, по сравнению с АС, более доступный и дешевый белок, обладающий также антиангиогенными свойствами.

Испытание противоопухолевой активности липосомальных препаратов ДР и ЭС проводилось на мышах С57В1/6 с привитой меланомой линии В16 (табл.13). Из представленных в результатов видно, что при использовании комбинированного препарата ЭС и ДРГХ увеличение средней продолжительности жизни примерно на 10% выше, также следует заметить, что применение только липосомального ЭС по эффективности сравнимо с комбинированным применением липосомальных АС и ДРГХ.

Табл. 13. Противоопухолевая активность в отношении солидных опухолей меланомы линии

В16 у мышей липосомальных и нелипосомальных форм АС, ЭС и ДРГХ.

Препарат ОРО, % УСПЖ, %

Контроль (физ. раствор) 100 -

Контроль (ненаполненные липосомы) 110 4

ДРГХ 59 25

липосомальный ДРГХ 24 39

липосомальный ДРГХ и липосомальный АС 15 50

ДРГХ и АС 46 31

ЭС 59' 25

липосомальный ЭС 31* 47

липосомальный ЭС и липосомальный ДРГХ 27' 55

- ОРО измерен на 28 день, для непомеченных звездочкой - на 24 день

4. РАЗРАБОТКА АЛГОРИТМА ВЫБОРА ТИПА НОСИТЕЛЯ

В табл. 14 представлены максимальная эффективность включения каждой из субстанций в носители различного типа и соответствующие ёмкости носителей. Табл. 14. Эффективности включения вещества и ёмкости носителей для различных

субстанций.

Субстанция С1оёР Лс Мицеллы с яФХ Дисперсии СТБ

Эфф. вкл., % Е, Эфф. вкл., % Е, Эфф. вкл., % Е,

масс. масс. масс. масс. масс. масс.

Альбумин 29 0.045 - - - -

ЭС 40 0.063 - - - -

Семакс 1.4 11" 0.043 - - - -

ДРГХ 85 0.016 - - - -

ДР 2.1 - - - 0.80 100 0.020

СЛМ 2.3 25 0.015 100 0.71 100 0.050

СБ 2.3 45 0.040 100 0.71 100 0.050

МФФА 6.0 75 0.012 осадок 100 0.20

СТБ 9.0 5 0.020 - 100 1.00

- для белков не имеет смысла; наличие заряда в молекуле (ДРГХ) не позволяет рассчитать С\о^Р,

приводится значение С^Э.

** - Лс с жестким бислоем (гликосфинголипиды).

Суммируя полученные для каждой субстанции результаты (табл. 10), можно отметить,

что:

1. липосомальные дисперсии уместнее использовать для:

а) ВМПС - белков (метод обращения фаз),

б) пептвдов (метод липцдной пленки, при необходимости увеличение вязкости мембраны),

в) слабых оснований (метод активной загрузки);

2. не все гидрофобные вещества способны, подобно бетулиновой кислоте, образовывать смешанные мицеллы с яФХ, рекомендуемые соотношения для образования таких мицелл субстанция/яФХ 1/0, 1/2, 1/1, 2/1 и 4/1;

3. СТБ - универсальный носитель для гидрофобных субстанций. Эффективность включения достигает 20% и не менее 2% от массы СТБ. При сравнении с Лс, стоит учитывать, что липиды составляют примерно десятую часть массы Лс (остальное

вода), в случае же дисперсий СТБ масса частицы определяется массой СТБ и

включенной субстанции.

Таким образом, алгоритм выбора типа носителя можно представить в виде блок-схемы (рис. 9).

Рис. 9. Блок-схема алгоритма выбора типа НЧ-носителей для инкапсуляции субстанций в зависимости от свойств субстанции.

выводы

1. Разработан и представлен в виде блок-схемы алгоритм выбора типа НЧ-носителя для инкапсуляции различных субстанций.

2. Обнаружено, что пептид семакс легко выходит из липосом, состоящих из яФХ/Хол (7/3 мольн) и из липосом, состоящих из гликосфинголипидов (Тс~60°С) в течении получаса, в то время как изониазид не проходит через бислой липосом из гликосфинголипидов.

3. Получены смешанные мицеллы с яФХ для силибинина и силимарина, ёмкость которых составляет 0.71, что примерно в 18 раз выше максимальной ёмкости при включении силибинина в липосомы и для доксорубицина (ёмкость в 40 раз больше ёмкости дисперсий смеси тритерпеноидов лупанового ряда).

4. Разработан метод получения нового типа наночастиц из смеси тритерпеноидов лупанового ряда, не требующий стабилизации поверхностно-активными веществами.

5. Показано на примере силимарина, силибинина, доксорубицина и метилфеофорбида а, что дисперсии смеси тритерпеноидов лупанового ряда могут служить для инкапсуляции гидрофобных субстанций. Ёмкость этого вида наночастиц достигает от 0.05 до 0.2.

6. Испытанием активности липосомальных препаратов эндостатина и гидрохлорида доксорубицина на мышах С57В1/6 с привитой меланомой линии В16 установлено, что при комбинированном использовании липосомальные формы эндостатина и доксорубицина обладают большей противоопухолевой активностью, чем комбинированный липосомальный препарат ангиостатина и гидрохлорида доксорубицина и липосомальные эндостатин и гидрохлогид доксорубицина в отдельности, а также не липосомальные растворы веществ и их комбинации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. В.В. Ветрова, А.П. Каплун, НА. Михайлова, В.В. Красильникова, Э.И.Мухтаров, В.И. Швец. Выделение из мозга свиньи гликосфинголипидов для получения липосом. // Биотехнология. - 2005. - №2. - С.52-55.

2. А.Н. Бастрич, В.В. Красильникова, Т.Н. Лыу, В.И. Попенко, А.П. Каплун, В.В. Балакшин, Г.А. Преснова, А.Н. Чистяков. Солюбилизация тритерпеноидов лупанового ряда, выделенных из бересты. // Биотехнология. - 2008. - №6 - С.51 -59.

3. В.В. Красильникова, Н.И. Пахарькова, В.И. Попенко, А.П.Каплун. Использование дисперсий, полученных из экстракта бересты, для солюбилизации плохо растворимых в воде веществ. //Вестник МИТХТ. - 2008. - №5 - 85-89.

4. В А. Быков, ДА. Безруков, A.B. Диггярь, А.П. Каплун, В.В. Красильникова, Е.В. Луценко, Фельдман Н.Б., Швец В.И. Ингибитор ангиогенеза, антиангиогенная фармацевтическая композиция на его основе и способ лечения злокачественных новообразований. // Патент РФ №2287341 от 01.03.2005.

5. А.П. Каплун, C.B. Подольская, B.B. Красильникова, A.B. Сымон, В.И. Швец. Солюбилизация с помощью липосом противоопухолевых препаратов на примере бетулиновой кислоты и гелиомицина. // Российский биотерапевтический журнал. - 2003.-№1.-0.24. Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты». Москва. 20-22 Марта 2003.

6. A.B. Сымон, C.B. Бояринова, В.В. Красильникова, C.B. Подольская. Конструирование липосомных антимеланомных препаратов с производными бетулиновой кислоты. // X Международная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии-2004». Тезисы докладов. Волгоград. 7-10 сентября 2004.-Т.1.-С.326-329.

7. C.B. Луценко, А.П. Каплун, В.В. Красильникова, A.B. Дигтярь, И.В. Захарова, Н.Б. Фельдман, В.И. Швец, С.Е. Северин. Липосомная форма ангиостатина и ее применение для лечения онкологических заболеваний. // Материалы XII Российского национального конгресса «Человек и Лекарство», Москва, Россия. - 2005. - С. 678.

Бумага для множительных аппаратов. Печать офсетная. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ №799

Типография ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел. 774-26-96

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Красильникова, Валентина Владимировна

1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

2. ВВЕДЕНИЕ

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ЛЕКАРСТВЕННЫ! ФОРМЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ БЕЛКОВ

3.1. Введение

3.2. Модификации белка

3.2.1. коньюгаты и фыожн-белки

3.2.2. гликозилирование

3.2.3. Ацилирование И

3.2.4. пэгилирование

3.3. Корпускулярные формы для создания белковых препаратов

3.3.1. липосомы-красивое решение, непростое воплощение

3.3.2. Эмульсии - и просто и сложно

3.3.3. Кохлеаты

3.3.4. нанодиски

3.3.5. Кубосомы-еще одна редкость

3.3.6. полые полимерные нанокапсулы

3.3.7. Нанокристаллы или наночастицы?

3.3.8. Магнитные наночастицы - притягательные перспективы

4. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Выбор объектов исследования

4.1.1. Выбор тип а НЧ

4.1.2. Выбор субстанций

4.1.3. Методы исследования дисперсий НЧ

4.2. инкапсуляция субстанций в нч

4.2.1. Полярные субстанции

4.2.1.1. Белки (ВПМС)

4.2.1.2. Гидрохлорид доксорубицина (ДРГХ)

4.2.2. Амфифильные субстанции 51 Семакс

4.2.3. Гидрофобные субстанции

4.2.3.1. Смесь тритерпеноидов лупанового ряда, выделенных из бересты 53 Подбор оптимальных условий получения нанодисперсий СТБ 62 Обратный порядок прибавления 62 Влияние концентрации СТБ в ТГФ на размер частиц дисперсии 62 Влияние растворителя на свойства дисперсии 63 Уменьшение количества добавляемой воды 65 Влияние температуры на размер частиц и стабильность дисперсий СТБ

4.2.3.2. Силимарин и Силибинин

4.2.3.3. Метилфеофорбид а

4.2.3.4. Доксорубицин

4.3. комбинированное действие липосомальных эс и дргх

4.4. разработка Алгоритма выбора типа носителя 5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

5.1. Выделение сфинголипидов

5.2. Синтез меченого тритием семакса

5.3. Получение Лс с белком

5.3.1. Получение Лс с белком методом липидной пленки

5.3.2. получение липосом с белком методом обращения фаз

5.4. Получение лс с МФФА

5.5. Получение Лс с см и сб

5.6. получение Лс с ДРГХ методом активной загрузки

5.7. Определение концентрации субстанции в дисперсии

5.8. Получение Лс с семаксом

5.8.1. Полу чение Лс с семаксом методом ли пи д ной пленки

5.8.2. Получение Лс с семаксом методом обращения фаз

5.8.3. Получение 1% дисперсии пролипосом из гликосфинголипидов

5.8.4. Получение Лс с семаксом с использованием пролипосом

5.9. Определение эффективности включения субстанции в Лс

5.10. Получение смешанных мицелл с яФХ

5.11. ОБщая схема получения дисперсий СТБ прямым прибавлением

5.12. Получение дисперсии СТБ при обратном прибавлении

5.13. получение дисперсий СТБ, загруженных гидрофобными субстанциями

5.14. Приготовление образцов для рентгенофазового анализа

5.15. Определение эффективности включения субстанций в дисперсии СТБ

5.16. Электронная микрофотография

5.17. Определение размеров частиц

5.17.1. Турбидиметрия

5.17.2. Электронная микрофотография

5.18. Определение противоопухолевой активности липосомальных препаратов эндостатина и доксорубицинаin vivo

6. ВЫВОДЫ

7. БЛАГОДАРНОСТИ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Алгоритм выбора наночастиц как носителей лекарственных субстанций"

3.2. Модификации белка 9

3.2.1. коньюгаты и фыожн-белки 103.2.2. гликозилирование 103.2.3. Ацилирование И3.2.4. пэгилирование 113.3. Корпускулярные формы для создания белковых препаратов 123.3.1. липосомы-красивое решение, непростое воплощение 123.3.2. Эмульсии - и просто и сложно. 283.3.3. Кохлеаты 323.3.4. нанодиски 323.3.5. Кубосомы-еще одна редкость 333.3.6. полые полимерные нанокапсулы 343.3.7. Нанокристаллы или наночастицы? 343.3.8. Магнитные наночастицы - притягательные перспективы 414. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ434.1. Выбор объектов исследования 434.1.1. Выбор тип а НЧ 434.1.2. Выбор субстанций 444.1.3. Методы исследования дисперсий НЧ 454.2. инкапсуляция субстанций в нч 464.2.1. Полярные субстанции 464.2.1.1. Белки (ВПМС) 464.2.1.2. Гидрохлорид доксорубицина (ДРГХ) 504.2.2. Амфифильные субстанции 51 Семакс 514.2.3. Гидрофобные субстанции 534.2.3.1. Смесь тритерпеноидов лупанового ряда, выделенных из бересты 53 Подбор оптимальных условий получения нанодисперсий СТБ 62 Обратный порядок прибавления 62 Влияние концентрации СТБ в ТГФ на размер частиц дисперсии 62 Влияние растворителя на свойства дисперсии 63 Уменьшение количества добавляемой воды 65 Влияние температуры на размер частиц и стабильность дисперсий СТБ 664.2.3.2. Силимарин и Силибинин 694.2.3.3. Метилфеофорбид а 744.2.3.4. Доксорубицин 764.3. комбинированное действие липосомальных эс и дргх 784.4. разработка Алгоритма выбора типа носителя 5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ5.1. Выделение сфинголипидов 855.2. Синтез меченого тритием семакса 855.3. Получение Лс с белком 865.3.1. Получение Лс с белком методом липидной пленки 865.3.2. получение липосом с белком методом обращения фаз 865.4. Получение лс с МФФА 865.5. Получение Лс с см и сб 875.6. получение Лс с ДРГХ методом активной загрузки 875.7. Определение концентрации субстанции в дисперсии 875.8. Получение Лс с семаксом 885.8.1. Полу чение Лс с семаксом методом ли пи д ной пленки 8 85.8.2. Получение Лс с семаксом методом обращения фаз 885.8.3. Получение 1% дисперсии пролипосом из гликосфинголипидов 885.8.4. Получение Лс с семаксом с использованием пролипосом 885.9. Определение эффективности включения субстанции в Лс 895.10. Получение смешанных мицелл с яФХ 895.11. ОБщая схема получения дисперсий СТБ прямым прибавлением 905.12. Получение дисперсии СТБ при обратном прибавлении 905.13. получение дисперсий СТБ, загруженных гидрофобными субстанциями 905.14. Приготовление образцов для рентгенофазового анализа 915.15. Определение эффективности включения субстанций в дисперсии СТБ 915.16. Электронная микрофотография 915.17. Определение размеров частиц 925.17.1. Турбидиметрия 925.17.2. Электронная микрофотография 925.18. Определение противоопухолевой активности липосомальных препаратовэндостатина и доксорубицинаin vivo 926. ВЫВОДЫ947. БЛАГОДАРНОСТИ958. ЛИТЕРАТУРА96О

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Красильникова, Валентина Владимировна

6. Выводы

1. Разработан и представлен в виде блок-схемы алгоритм выбора типа НЧ-носителя для инкапсуляции различных субстанций.

2. Обнаружено, что пептид семакс легко выходит из липосом, состоящих из яФХ/Хол (7/3 мольн.) и из липосом, состоящих из гликосфинголипидов (Тс~60°С) в течение получаса, в то время как изониазид не проходит через бислой липосом из гликосфинголипидов.

3. Получены смешанные мицеллы с яФХ для силибинина и силимарина, ёмкость которых составляет 0.71, что примерно в 18 раз выше максимальной ёмкости при включении силибинина в липосомы и для доксорубицина (ёмкость в 40 раз больше ёмкости дисперсий смеси тритерпеноидов лупанового ряда).

4. Разработан метод получения нового типа наночастиц из смеси тритерпеноидов лупанового ряда, не требующий стабилизации поверхностно-активными веществами.

5. Показано на примере силимарина, силибинина, доксорубицина и метилфеофорбида а, что дисперсии смеси тритерпеноидов лупанового ряда могут служить для инкапсуляции гидрофобных субстанций. Ёмкость этого вида наночастиц достигает от 0.05 до 0.2.

6. Испытанием активности липосомальных препаратов эндостатина и гидрохлорида доксорубицина на мышах С57В1/6 с привитой меланомой линии В16 установлено, что при комбинированном использовании липосомальные эндостатина и доксорубицина обладают большей противоопухолевой активностью, чем комбинированный липосомальный препарат ангиостатина и гидрохлорида доксорубицина и липосомальные эндостатин и гидрохлорид доксорубицина в отдельности, а также не липосомальные растворы веществ и их комбинации.

7. Благодарности

Благодарю за помощь в работе:

- ведущего научного сотрудника ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН Попенко В.И. за проведение электронной микрофотосъемки, т фирму «Биолек» за предоставленные липиды,

- профессора Мчедлишвилли Бориса Викторовича (Институт Электрохимии РАН) за предоставленные ядерные поликарбонатные фильтры,

- к.х.н. Шевченко Константина Валерьевича за помощь в работе с изотопно-меченным семаксом,

- сотрудников лаборатории разработки лекарственных форм НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН за предоставленную возможность измерить размер частиц липосомальной дисперсии с помощью динамического светорассеяния,

- студентов кафедры Биотехнологии Бастрич А.Н., Пахарькову Н.И., Лыу Т.Н., Королеву А.И. за помощь и дружескую поддержку,

- мужа за долготерпение и материальное обеспечение на протяжении долгих лет аспирантуры.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Красильникова, Валентина Владимировна, Москва

1. Nanoparticulates as Drug Carriers Ed. V.P. Torchilin//1.perial College Press, 2006, P. 724

2. K. Kawakami, T. Yoshikawa, Y. Moroto, E. Kanaoka, K. Takahashi, Y. Nishihara, K. Masuda. Microemulsion formulation for enhanced absorption of poorly soluble drugs. I. Prescription design// J. Control. Release, 2002, V. 81, P. 65-74

3. E. Marengo, R. Cavalli, O. Caputo, L. Rodriguez, M.R.Gasco/ Scale-up of the preparation process of solid lipid nanospheres. Part I// Int. J. Pharm., 2000, V. 205, P. 3-13

4. S.J. Lim, C.K. Kim/ Formulation parameters determining the physicochemical characteristics of solid lipid nanoparticles loaded with all-trans retinoic acid// Int. J. Pharm., 2002, V. 243, P. 135-1466. http://ru.wikipedia.org/wiki/HncyjiHH

5. M. Brange/ Galenics of Insulin: The Physico-chemical and Pharmaceutical Aspects of Insulin and Insulin Preparations// Springer-Verlag, Berlin, 1987 (103 P.) ^

6. J.M. Beals, A. B. Shanafelt/ Enhancing exposure of protein therapeutics// DDT: Technologies, 2006, V. 3,No. 1,P. 87-94

7. A.M. Sinclair, S. Elliot/ Glycoengineering: the effect of glycosylation on the properties of therapeutic proteins//J. Pharm. Sci., 2005, V. 94, P. 1626-1635

8. A. Abuchowski, T. van Es, N.C. Palczuk, F.F.Davis/ Alteration of immunological properties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol// J. Biol. Chem., 1977, V. 252, No. 11, P. 3578-3581

9. A. Abuchowski, J.R. McCoy, N.C. Palczuk, T. van Es, F.F. Davis// Effect of covalent attachment of polyethylene glycol on immunogenicity and circulating life of bovine liver catalase// J. Biol. Chem., 1977, V. 252, No. 11, P. 3582-3586

10. F.M. Veronese, G. Pasut/ PEGylation, susseful approach to drug delivery//DDT, 2005, V. 10, No. 21, P. 1451-1458

11. L.M. Graham/ PEGASPARAGINASE: a review of clinical studies// Adv. Drug Deliv. Rev., 2003, V. 55, P. 1293-1302

12. Y.S. Wang, S. Youngster, M. Grace, J. Bausch, R. Bordens, D.F. Wyss/ Structural and biological characterisation of pegylated recombinant interferon a-2b and its therapeutic implications// Adv.Drug Deliv. Rev., 2002, V. 54, P. 547-570

13. O.B. Kinstler, D.N. Brems, S.L. Lauren, A.G. Piage, J.B. Hamburger, M.J. Treuheit/ Characterization and stability of N-terminally pegylated rhG-CSF// Parm. Res., 1996, V. 13, P. 996-1002

14. C.P. Caygill, W.D. Stein/ Binding of insulin by liposomes incorporating protein// Life Sci., 1969, V. 8, No 16, P. 809-812

15. A. Graff, M. Winterhalter, W. Meier/ Nanoreactors from Polymer Stabilized Liposomes// Langmuir, 2001, V.17, P. 919-923

16. Liposomes: A Practical Approach. Second edition. Ed. by V.P. Torchilin and V. Weissig// Oxford University Press, 2003, P.396

17. Г.М. Сорокоумова, A.A. Селищева, А.П. Каплун/ Фосфолипиды. Методы их выделения, обнаружения и изучения физико-химических свойств липидных дисперсий в воде// М., 2000

18. J.-P. Colletier, B. Chaize, M. Winterhalter, D. Fournier/ Protein encapsulation in liposomes: efficiency depends on interactions between protein and phospholipid bilayer// BMC Biotechnol., V. 2, P. 9-17

19. D.A. Epstein, Y.V. Marsh, M. van der Pas, P.L. Feigner, A.B. Shreiber/ Biological activity of liposome-encapsulated murine interferon y is mediated by a cell membrane receptor// Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 1985, V. 82, P. 3688-3692

20. M.L. Van Slooten, O. Boerman, K. Romoren, E. Kedar, DJ.A. Crommelin, G. Storm/ Liposomes as sustained release system for humaninterferon-y: biopharmaceutical aspects// Bioch. Biophys. Acta, 2001, V. 1530, P. 134-145

21. Y.Y. Huang, C.H. Wang/ Pulmonary delivery of insulin by liposomal carriers// J. Control. Release, 2006, V. 113, No 1, P. 9-14

22. D. Li, A.J. Hickey/ Liposomal Dry Powders as Aerosols for Pulmonary Delivery of Proteins// AAPS Pharm. Sei. Tech., 2005, V. 6, No 4, article 80, P. E641-E648, http://www.aapspharmscitech.org

23. H. Shreier, W.C. Mobley, N. Concessio, A.J. Hikey, R.W. Niven/ Formulation and in vitro performance of liposome powder aerosols// STP Pharma Sciences//1994, V.4, P. 38-44

24. M.A. Schubert, C.C. Müller-Goymann/ Solvent injection as a new approach for manufacturing lipid nanoparticles evaluation of the method and process parameters// Eur. J. Pharm, and Biopharm., 2003, V. 1, P. 125-131

25. K.-H. Song, S.-J. Chung, C.-K. Shim, Preparation and evaluation of proliposomes containing salmon calcitonin// J. Contr. Release, 2002, V. 84, P. 27-37

26. D.D. Lasic/ Sterisch stabilisierte Vesikel// Angew. Chem., 1994, B. 106, S. 1765-1779

27. J.M. Sual, A. Annapragada, J.V. Natarajan, R.V. Bellamkonda. Controlled targeting of liposomal doxorubicin via folate receptor in vitro// J. Cont. Rel., 2003, V. 92, P. 49-67

28. S.K. Sahoo, V. Labhasetwar. Nanotech approaches to drug delivery and imaging// Drug Deliv. Today, 2003, V.8, No 24, P. 1112-1120

29. C.C. Visser, S. Stevanovic, L.H. Voorwinden, L. van Bloois, P.J. Gaillard, M. Danhof, D.J. Crommelin, A.G. de Boer/ Targeting liposomes with protein drugs to the blood-brain barrier in vitro// Eur. J. Pharm. Sci., 2005, V. 25, No 2-3, P. 299-305

30. M. Furuhata, H. Kawakami, K. Toma, Y. Hattori, Y. Maitani/ Intracellular delivery of proteins in complexes with oligoarginine-modified liposomes and the effect of oligoarginine length// Bioconjug. Chem., 2006, V. 17, No 4, P.935-942

31. M. Singh, D.T. O'Hagan/ Recent Advances in Vaccine Adjuvants// Pharm. Res., 20026, V. 19, No. 6, P. 715-728

32. A. Podda, G. Del Giudice/ MF59-adjuvanted vaccines: increased immunogenicity with an optimal safety profile. Expert Rev.// Vaccines, 2003, V. 2, P. 197-203

33. D.T. O'Hagan/ MF59 is a safe and potent vaccine adjuvant that enhances protection against influenza virus infection. Expert Rev.// Vaccines, 2007, V. 6, No 5, P. 699-710.

34. G. Lindbblom, J.B. Hauksson, L. Rilfors, B. Bergenstahl, A. Wieslander, P.-O. Eriksson/ Membrane Lipid Regulation in Acholeplasma laidlawii Grown with Saturatd Fatty Acids// J. Biol. Chem., 1993, V. 268, No 22, P. 16198-16207

35. T.P. Trouard, D.A. Mannock, G. Lindblom, L. Rilfors, M. Akiyama, R.N. McElhaney/ Thermotropic Phase Properties of l,2-Di-0-Tetradecyl-3-C-(3-0-Methyl-(3-D-Glucopyranosyl)-.sTi-Glycerol// Biophys. J., 1994, V. 67,p.l090-1100

36. R. Mitra, I. Pezron, W. A. Chu, A. K. Mitra/ Lipid emulsions as vehicles for enhanced nasal delivery of insulin// Int. J. Pharm., 2000, V. 205, P. 127-134

37. M. Werle, A. Makhlof, H. Takeuchi/ Oral protein delivery: a patent review of academic and industrial approaches// 2009, V. 3, No 2, P. 94-104

38. D. Papahadjopoulos, W.J. Vail, K. Jacobson, G. Poste/ Cochleate lipid cylinders: formation by fusion of unilamellar lipid vesicles. Biochim Biophys Acta. 1975 Jul 3;394(3):483-91.

39. R.D. Miclea, P.R. Varma, A. Peng, S.V. Balu-Iyer/ Development and characterization of lipidic cochleate containing recombinant factor VIII// Biochim. Biophys. Acta., 2007, V. 1768, No 11, P. 2890-2898

40. C. C. Evans, J. Zasadzinski. Encapsulating Vesicles and Colloids in Cochleate Cylinders. Langmuir. 2003, 19, 3109-3113

41. R. Santangelo, P. Paderu, G. Delmas, Z.W. Chen, R. Mannino, L. Zarif, D.S. Perlin/ Efficacy of Oral Cochleate-Amphotericin B in a Mouse Model of Systemic Candidiasis// Antimicrob. Agents Chemother., 2000, V. 44, P. 2356-2360

42. G. Bracho, M. Lastre, J. del Campo, C. Zayas, D. González, D. Gil, R. Acevedo, C. Taboada, R.L. Solís, O. Pérez/ Proteoliposome derived cochleate as novel adjuvant// Vaccine., 2006, V. 12; 24 Suppl 2:S2-30-31

43. M. Johnsson, K. Edwards/ Liposomes, Disks, and Spherical Micelles: Aggregate Structure in Mixtures of Gel Phase Phosphatidylcholines and Poly(Ethylene Glycol)-Phospholipids// Biophys. J., 2003, V. 85, P. 3839-3847

44. T. H. Bayburt, S. G. Sligar/ Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers// Prot. Sci., 2003, V. 12, P. 2476-2481

45. I. G. Denisov, Y. V. Grinkova, A. A. Lazarides, S. G. Sligar/ Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size// J. Am. Chem. Soc., 2004, V. 126, P. 3477-3487

46. A. Y. Shih, I. G. Denisov, J. C. Phillips, S. G. Sligar, K. Schulten/ Molecular Dynamics Simulations of Discoidal Bilayers Assembled from Truncated Human Lipoproteins// Biophys. J., 2005, V. 88, P. 548-556

47. A. Das, J. Zhao, G.C. Schatz, S.G. Sligar, R.P. Van Duyne/ Screening of type I and II drug binding to human cytochrome P450-3A4 in nanodiscs by localized surface plasmon resonance spectroscopy// Anal. Chem., 2009, V. 81, No 10, P. 3754-3759

48. S. G. Sligar/ Finding a single-molecule solution for membrane proteins// Biochem. Biophys. Res. Communs., 2003; V. 312, P. 115-119

49. S. Egstrom, B. Ericsson, T. Landh/ A cubosome formulation for intravenous administration of somatostatin// Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 1996, V. 23, P. 89-90

50. J. Wang, Q. Zhang/ Uptake of eyelosporine A loaded colloidal drug carriers by mouse peritoneal macrophages in vitro// Acta Pharmacol. Sin., 2001, V. 22, No 1, P. 57-61

51. P. Yilgor, K. Tuzlakoglu, R.L. Reis, N. Hasirci, V. Hasirci/ Incorporation of a sequential BMP-2/BMP-7 delivery system into chitosan-based scaffolds for bone tissue engineering// Biomaterials., 2009, V. 30, No 21, P. 3551-3559

52. M. Aboubakar, F. Puisieux, P. Couvreur, M. Deyme, C. Vauthier/ Study of the mechanism of insulin encapsulation in poly(isobutylcyanoacrylate) nanocapsules obtained by interfacial polymerization// J. Biomed. Mater. Res., 1999, V. 47, No 4, P. 568-576

53. C. Damge, J. Vonderscher, P. Marbach, M. Pinget/ Poly(alkyl cyanoacrylate) nanocapsules as a delivery system in the rat for octreotide, a long-acting somatostatin analogue// J. Pharm. Pharmacol., 1997, V. 49, No 10, P. 949-954

54. N. Rasenack, H. Hartenhauer and B.W. Muller. Microcrystals for dissolution rate of poorly water-soluble drugs// Int. J. Pharm., 2003, V. 254, No 2, P. 137-145

55. K.S. Oh, S.K. Han, H.S. Lee, H.M. Koo, R.S. Kim, K.E. Lee, S.S. Han, S.H. Cho, S.H. Yuk / Core/Shell nanoparticles with lecithin lipid cores for protein delivery// Biomacromolecules. 200, V. 7, No 8, P. 2362-2367

56. T. Akagi, T. Kaneko, T. Kida, M. Akashi/ Preparation and characterization of biodegradable nanoparticles based on poly(gamma-glutamic acid) with 1-phenylalanine as a protein carrier// J. Control. Release., 2005,v. 108, No 2-3, P. 226-236

57. W.T. Leach, D.T. Simpson, T.N. Val, E.C. Anuta, Z. Yu, R.O. Williams III, K.P. Johnston/ Uniform encapsulation of stable protein nanoparticles produced by spray freezing for the reduction of burst release// J. Pharm. Sci., 2005, V. 94, No 1, P. 56-69

58. Y. Li, Y. Pei, X. Zhang, Z. Gu, Z. Zhou, W. Yuan, J. Zhou, J. Zhu, X. Gao/ PEGylated PLGA nanoparticles as protein carriers: synthesis, preparation and biodistribution in rats// J. Control. Release., 2001, V. 71, No 2, P. 203-211

59. J. Vandervoort, A. Ludwig/ Biocompatible stabilizers in the preparation of PLGA nanoparticles: a factorial design study// Int. J. Pharm., 2002, V. 238, P. 77-92

60. T.W. Chung, Y.Y. Huang, Y.L. Tsai, Y.Z. Liu/ Effects of solvent evaporation rate on the properties of protein-loaded PLLA and PDLLA microspheres fabricated by emulsion-solvent evaporation process//J. Microencapsul., 2002, V. 19, No 4, P. 463-471

61. J.X. Zhang, D. Chen, S.J. Wang, K.J. Zhu/ Optimizing double emulsion process to decrease the burst release of protein from biodegradable polymer microspheres// J. Microencapsul., 2005, V. 22, No 4, P. 413-422

62. W.T. Leach, D.T. Simpson, T.N. Val, E.C. Anuta, Z. Yu, R.O. Williams III, K.P. Johnston / Uniform encapsulation of stable protein nanoparticles produced by spray freezing for the reduction of burst release// J. Pharm.Sci., 2005,v. 94, No 1, P. 56-69

63. J.K. Li, N. Wang, X.S. Wu/ Poly(vinil alcohol) nanoparticles prepared by freezing-thawing process for protein/peptide drug delivery// J. Control. Release., 1998, V. 56, No 1-3, P. 117-126

64. N. Wang, X.S. Wu/ Preparation and characterization of agarose hydrogel nanoparticles for protein and peptide drug delivery// Pharm. Dev. Technol., 1997, V.2, No 2, P. 135-142*

65. M. de Cuyper, M. Joniau/ Binding characteristics and thermal behaviour of cytochrome-C oxidase, inserted into phospholipid-coated, magnetic nanoparticles// Biotechnol Appl Biochem., 1992, V. 16, No 2, P.:201-210

66. S.Y. Shaw, Y.J. Chen, J.J. Ou, L. Ho/ Preparation and characterization of Pseudomonas putida esterase immobilized on magnetic nanoparticles// Enzym. Microb. Tech., 2006, V. 39, P. 1089-1095

67. A. Dyal, К. Loos, М. Noto, S.W. Spagnoli, K.V.P.M. Shafi, A. Ulman, M. Cowman, R.A. Gross/ Activity of Candida rugosa lipase immobilized on gamma-Fe203 magnetic nanoparticles// J. Am. Chem. Soc., 2003, V. 125, P. 1684-1685

68. X.D. Tong, B. Xue, Y. Sun/ A novel magnetic affinity support for protein adsorption and purification// Biotechnol. Prog., 2001, V.17, P. 134-139

69. M. Koneracka, P. Kopcansky, M. Timko and C.N. Ramchand/ Direct binding procedure of proteins and enzymes to fine magnetic particles// J. Magn. Magn. Matter., 2002, V. 252, P. 409411

70. G. Haran, R. Cohen, L.K. Bar, Y. Barenholz. Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposome produce efficient and stable entrapment of amphipatic weak basis// Biochem. Biophys. Acta, 1993, V. 1151, P. 201-215

71. R. Santangelo, Р/ Paderu, G. Delmas, Z.W. Chen, R. Mannino, L. Zarif, D.S. Perlin/ Efficacy of oral cochleate-amphotericin В in a mouse model of systemic candidiasis// Antimicrob. Agents Chemother., 2000, V. 44, P. 2356-2360

72. A.B. Сымон/ Молекулярная модификация бетулиновой кислоты как антимеланомного средства и подходы к ее солюбилизации. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук// М., 2004

73. М.Д. Машковский. Лекарственные средства, 15-е изд.//М., РИА «Новая волна», Издатель Умеренков, 2007, С. 526

74. М.Д. Машковский. Лекарственные средства, 15-е изд.//М., РИА «Новая волна», Издатель Умеренков, 2007, С. 713

75. Д.А. Безруков/ Технологии получения комбинированных липосомальных препаратов докеорубицина. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук// М., МИТХТ, 2007

76. Н.Б. Фельдман/ Разработка противоопухолевых препаратов направленного действия на основе пептидных векторов и антиангиогенных агентов. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук// М, 2007

77. М.А. Schubert, С.С. Muller-Goymann. Solvent injection as a new approach for manufacturing lipid nanoparticles evaluation of the method and process parameters// Eur. J. Pharm. Biopharm., 2003, V. 55, P. 125-131

78. K.-H. Song, S.-J. Chung, C.-K. Shim. Preparation and evaluation of proliposomes containing salmon calcitonin// J. Cont. Rel., 2002, V. 84, P. 27-37

79. А.П. Храпко/ Использование фосфолипидных наночастиц для повышения устойчивости семакса в различных биологических средах, обладающих протеолитической активностью. Магистерская диссертация// М, 2009

80. Т. Kai, Y. Akiyama, S. Nomura, M. Sato/ Oral absorption improvement of poorly soluble drug using solid dispersion technique// Chem. Pharm. Bull. (Tokyo), 1996, V. 44, No 3, P. 568571

81. M.J. Francis, N. Gulati, R.M. Pashley/ The dispersion of natural oils in de-gassed water// J. of Colloid and Interface Sci., 2006, V. 299, P. 673-677

82. M.J. Francis, R.M. Pashley/ A study of de-gassed oil in water dispersions as potential drug delivery systems// Colloids Surf. A, 2005, V. 260, P. 7-16

83. V. Tandon, S.K. Bhagavatula, W.C. Nelson, B.J. Kirby/ Zeta potential and electroosmotic mobility in microfluidic devices fabricated from hydrophobic polymers: 1. The origins of charge// Electrophoresis., 2008, V. 29, P. 1092-1101

84. V. Tandon, B.J. Kirby/ Zeta potential and electroosmotic mobility in microfluidic devices fabricated from hydrophobic polymers: 2. Slip and interfacial water structure// Electrophoresis., 2008, V. 29, P. 1102-1114

85. P. \V. binder, A. Voye/ Potentiometric investigations of the equilibria between caffeic acid and copper(II), zinc(II), iron(II) and hydrogen ions in aqueous solution// Polyhedron, 1987,V. 6, Iss. 1,P. 53-60

86. P. Shahgaldian, J. Gualbert, K. Aissa, A.W. Coleman/ A study of the freeze-drying conditions of calixarene based solid lipid nanoparticles// Eur. J. Pharm. Biopharm. 2003, V. 55, No 2, P. 181-184

87. Handbook of organic solvent properties, cons. I. M. Smallwood// Arnold, 1996, P. 241

88. J.L. Rigaud, M. Chami, O. Lambert, D. Levy, J.L. Ranck/ Use of detergents in two-dimensional crystallization of membrane proteins// Biochem. Biophys. Acta, 2000, V. 1508, P. 112-128.

89. V.S. Kulkarni, J.M. Boggs, R.E. Brown/ Modulation of nanotube formation by structural modifications of sphingolipids// Biophysical Journal 1999 - V. 77 - P. 319-330

90. T.C. Bai, G.B. Yan, J. Hu, H.L. Zhang, C.G. Huang/ Solubility of silybin in aqueous polyethylene glycol) solution// Int. J. Pharm., 2006, V. 308, P. 100-106

91. W. Wu, Y. Wang, L. Que/ Enhanced bioavailability of silymarin by self-microemulsifying drug delivery system// Eur. J. Pharm. Biopharm., 2006, V. 63, P. 288-294

92. J.Q. Zhang, J. Liu, X.L. Li, B.R. Jasti/ Preparation and characterization of solid lipid nanoparticles containing silibinin// Drug. Deliv. 2007, V. 14, P. 381-387

93. X. Yan-yu, S. Yun-mei, C. Zhi-peng, P. Qi-neng/ Preparation of silymarin proliposome: a new way to increase oral bioavailability of silymarin in beagle dogs// Int. J. Pharm., 2006, V. 319, P. 162-168

94. Д. В. Белых, А. В. Кучин/ Синтез полифункциональных хлоринов на основе метилфеофорбида а и его аналогов// Химия в интересах устойчивого развития, 2008, No 6, С. 617-629122. http://www.reles.ru/cat/drugs/Doxorubicin/

95. В.В. Ветрова /Выделение гликосфинголипидов головного мозга свиньи и изучение их свойств. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук// М, МИТХТ. 2006

96. К.В. Шевченко, И.Ю. Нагаев,В.П. Шевченко,Н.Ф. Мясоедов/ Использование волокнистого углерода как носителя при введении трития в биологически активные соединения// Радиохимия, 2004, Т. 46, №4, С. 370-372

97. В.П. Шевченко, И.Ю. Нагаев, Л.Ю. Алфеева, Л.А. Андреева, П.А. Климова, А.В.Малкин, К.В. Шевченко, Н.Ф. Мясоедов/ Синтез меченного тритием семакса// Радиохимия. 2006, Т. 48, №3, С. 260-266

98. В.П. Шевченко, И.Ю. Нагаев, Л.Ю. Алфеева, Л.А. Андреева, К.В. Шевченко, Н.Ф. Мясоедов/ Синтез меченного тритием селанка//Радиохимия, 2006. Т. 48, №3, С. 267271

99. К.В. Шевченко, И.Ю. Нагаев,Л.Ю. Алфеева,Л.А. Андреева,А.А. Каменский, Н.Г. Левицкая, В.П. Шевченко,И.А. Гривенников,Н.Ф. Мясоедов/ Кинетика проникновения семакса в мозг и кровь крыс при интраназальном введении// Биоорг. хим., 2006, Т. 32, №1, С. 64-70

100. Л.А. Андреева, В.В. Безуглов, И.Ю. Нагаев, П.А. Климова, К.В. Шевченко, С.Н. Субботин, В.П. Шевченко, Н.Ф. Мясоедов/ Синтез меченного тритием семакса// Тезисы на Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов, Москва, 2003, С.58