Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физико-химические свойства биологически значимых термочувствительных полимеров

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Физико-химические свойства биологически значимых термочувствительных полимеров"

На правах рукописи

Горелов Александр Владимирович

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БИОЛОГИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ПОЛИМЕРОВ

03.00.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

ПУЩШЮ-2008

003456065

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики

Официальные оппоненты: Кандидат физико-математических наук

Тиктопуло Елизавета Игнатьевна

Защита диссертации состоится « 24 » декабря 2008 г. в 13.30 на заседании совета Д 002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142 290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская,3, ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН г. Пущино

Автореферат разослан « £1 » ноября 2008 г.

РАН.

Научный руководитель: Доктор физико-математических наук

Харакоз Дмитрий Петрович

Доктор физико-математических наук Акатов Владимир Семёнович

Ведущая организация:

Институт биофизики клетки РАН

Учёный секретарь совета Д 002.093.01 Кандидат физико-математических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Термочувствительные полимеры были открыты в начале 60-х годов прошлого века. Их отличает наличие нижней критической температуры растворения (НКТР). Для концентрированных и полуразбавленных растворов полимеров это проявляется в выпадении полимера в осадок при повышении температуры. В разбавленных растворах при повышении температуры наблюдается переход клубок-глобула на уровне отдельных полимерных цепей. В полимерных сетках НКТР проявляется как переход из набухшего в коллапсированное состояние сетки. Наличие НКТР наблюдается для сравнительно небольшого количества известных полимеров и, почти исключительно, в водных растворах.

В 1990-х годах интерес к данному классу полимеров значительно возрос. В основном это было связано с пониманием, что данные полимеры могут служить как модели для известных биофизических систем или как технологическая платформа для биофизических и биомедицинских приложении. Наиболее популярный полимер данного класса - поли-(К'-изопропилакриламид) (ПНИПАА). Он обладает температурой перехода около 32°С, которая близка к физиологической. Кроме того, температура перехода может быть изменена в любых пределах путём сополимеризации мономера изопропилакриламида с другими мономерами. Для сополимеров включающих в себя мономеры с ионизируемыми группами температура перехода становится чувствительной к значительно большему количеству внешних стимулов, таких как рН, ионная сила, специфические катионы и анионы. Последующая пришивка к полимеру или гелю ферментов катализирующих реакции с выделением или поглощением протона позволяет расширить количество веществ, влияющих на температуру перехода.

Среди многочисленных исследований термочувствительных полимеров как модельных биофизических систем и для биомедицинских приложений в данной работе обсуждаются три основных направления.

Одно из них - исследование перехода клубок-глобула в разбавленных полимерных растворах как модель конформационных переходов в белках.

1

л

л ) -■" /

Существует определённая аналогия между переходом клубок-глобула в ПНИПАА и холодовой денатурацией в белках. В обоих случаях при повышении температуры происходит переход молекулы в компактное состояние. Преимущества исследования модельной системы в данном случае заключается в том, что удается исследовать общие закономерности сворачивания клубка ь компактную структуру и сравнивать их с теоретическими моделями, которые пока достаточно примитивны для применения к реальным белкам.

Два других направления имеют прикладное биомедицинское значение. Конформациокные переходы в термочувствительных полимерах могут быть использованы для контролируемой локальной доставки лекарств, основанной на том, что в полимерных микрочастицах и пленках вблизи температуры перехода диффузия инкорпорированного вещества сильно зависит от параметров среды, например, температуры. Кроме того, термочувствительные полимеры могут использоваться как активные биосовместимые поверхности при изготовлении культуральных сред и при изготовлешш различных имплантируемых устройств.

В связи с вышесказанным изучение биологически значимых физико-химических свойств (включая поверхностные) термочувствительных полимеров является важным фундаментальным направлением биофизики.

Цели и задачи работы.

Цель - изучение конформационных переходов в термочувствительных полимерах как модельных системах для фундаментальных исследований в биофизике и для различных биомедицинских приложений. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Провести исследование конформационных переходов термочувствительных полимеров в растворах и их применимость как моделей конформационных переходов в биополимерах.

2. Исследовать конформационные переходы термочувствительных полимеров, пришитых к поверхности, и обосновать возможность их применения для контролируемой доставки лекарств.

3. Определить поверхностные свойства термочувствительных полимеров, имеющие отношение к их биосовместимости.

Научная новшна.

Впервые прояснены особенности механизма перехода клубок-глобула в разбавленных растворах поли-(М-изопропилакриламида), приводящие к образованию «мезоглобул». Впервые разработан и синтезирован полимер случайно-блочной структуры, который способен переходить из клубка в глобулу без агрегации. Разработан и синтезирован новый класс фото-сшиваемых термочувствительных полимеров, которые могут быть нанесены на поверхность различных имплантируемых устройств и нагружены физиологически активными веществами. Исследована контролируемая доставка лекарств из данных полимеров. Впервые определены поверхностные энергии в серии термочувствительных полимеров разного состава. Впервые объяснены аномалии, возникающие при измерении краевых углов воды на поверхности термочувствительного полимера.

Практическая ценность.

Результаты работы могут, применяться для разработки новых биомедицинских устройств на основе термочувствительных полимеров. В частности, полимеры, исследованные в настоящей работе, находят применение в разработке субстратов для безферментативного снятия тканевых культур с поверхности. Исследованные свойства этих полимеров могут быть использованы для оптимизации этих субстратов. Фотосшиваемые полимеры могут применяться для доставки лекарственных средств с поверхности имплантируемых биомедицинских устройств. Способность полимеров, исследованных в данной работе, испытывать переход клубок глобула без агрегации может применяться для экспериментальной проверки теорий сворачивания белков.

Структура работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов, выводов и списка цитируемой

литературы. Работа содержит 27 рисунков и 4 таблицы. Объём диссертации - 103 страницы.

Апробация.

По теме диссертации опубликовано 11 статей в рецензируемых журналах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования.

В первой главе приводится обзор литературы, где обсуждается современное состояние исследований в области физической химии термочувствительных полимеров и их роли в решении биофизических и биомедицинских задач. В этой главе обсуждаются значение перехода клубок-глобула в термочувствительных полимерах как модели для конформационных переходов в биополимерах. Приводится обзор литературы, посвященной фазовым переходам в тонких плёнках термочувствительных полимеров и доставке лекарств из этих плёнок. Также обсуждаются поверхностные свойства термочувствительных полимеров и их связь с биологическими применениями.

Во второй главе описаны использованные в работе методы получения термочувствительных полимеров и методы экспериментального исследования их свойств.

Третья глава содержит основные результаты работы и их обсуждение. Заключительная часть диссертации содержит выводы и список литературы.

Результаты и обсуждение.

1. Структура полимеров исследованных в диссертации.

Структура полимеров, разработанных и исследованных в работе приведена на Рис. 1. Для исследования перехода клубок-глобула в гомополимерах использовался поли-(Ы-изопропилакриламид) (ПНИПАА). Структура ПНИПАА показана на Рис.1 А, где п=1 и ш=0. Переход кубок глобула в исследовался на примере гетерополимера поли-(М-изопропилакриламид-со-акриламидоундеканоевая

кислота) (поли-{НИПАА-со-ААУДК)) , структура которого показана на Рис. 1Б. Использовались полимеры с различным содержанием акриламидоундеканоевой кислоты: т=0.04 и га=0.15.

Дшг исследования фазового перехода в тонких плёнках термочувствительных полимеров и доставки лекарств использовался п о ли -(К-изопропилакриламид-со-К-т/)ет-бутилакриламид-со-акриламидобензофенон) (Рис.1 В). Содержание мономеров в полимере составляло: п=0.85, ш=0.138, к=0.012.

Для измерения энергий поверхности термочувствительных полимеров использовалась серия сополимеров на основе И-изопропилакриламида (НИПАА) и Ы-трет-бутилакриламида (НТБАА) (Рис. 1А). В частности, исследовались ПНИПАА ( п=1, т=0), ПНИПАА80:НТБАА20 (п=0.8, ш=0.2), ПНИПАА60:НТБАА40 (п=0.6, т=0.4) и ПНТБАА (п=0, т=1).

нГ / \ н,с см,

-Е-">—г~

с=о

I

нн

НС

сна

и

и

С".

о=с

. ПП .VI -Г

н^ 1 V Т

.сн к

?тч

"ЦдСН

Рис. 1. Структура полимеров, исследованных в диссертации, п, ш, к - мольные доли соответствующих мономеров.

2.11ереход клубок глобула в разбавленных растворах поли-(М-изопропилакриламида).

Конформадионные переходы в разбавленных растворах полимеров исследовались методами динамического и статического рассеяния света. При 25°С наблюдается сильная зависимость кажущегося коэффициента диффузии, О^р, от волнового вектора к. Эта зависимость характерна для полимера, находящегося в состоянии клубка. В динамическом рассеянии света кажущийся коэффициент диффузии, полученный из времени релаксации корреляционной функции, соответствует коэффициенту диффузии клубка как целого только в пределе кЯС 1, где Я-размер клубка. При кЯ=1 движение полимерных цепей внутри клубка уменьшает время релаксации и увеличивает Оа1,р. При повышении температуры происходит значительное сокращение размера клубка со стабилизацией размера выше 34°С. При 34.5°С размер, рассчитываемый из коэффициента диффузии, не зависит от угла рассеяния (волнового вектора к), что соответствует поведению компактной, глобулярной конформации полимерных цепей. Из экспериментальных результатов следует, что сокращение размера клубка не сопровождается увеличением интенсивности рассеянного света (пропорциональной молекулярному весу) только до температуры =33°С. Выше этой температуры происходит увеличение молекулярного веса, что указывает на агрегацию полимерных молекул.

в-ю"8"

Рис.2. Зависимость кажущегося коэффициента диффузии, Оар1Ъ от

квадрата величины волнового вектора

к. Круглые символы - полимер в конформации клубка (30°С).

Квадратные символы - глобулярная

-О^, конформация (34.5°С). Вставка:

Изменения радиуса поли-(Ы-изопропилакриламида) с температурой. Молекулярный вес ттпттчера 9.3x10"''. Концентрация 25

2*10"8

40

0

2-Ю-4 ^ 4-у

к\ ны":

6-10-4

Однако механизм этой агрегации и структура агрегатов не является тривиальными. Во-первых, образовавшиеся агрегаты имеют сравнительно узкое распределение размеров, о чём можно судить по ширине распределения релаксационного времени корреляционной функции. Во-вторых, агрегаты сохраняют стабильный размер в течение многих дней ггосле формирования. Мы назвали данные агрегаты мезоглобулами. Дополнительная информация о структуре агрегатов бьиа получена из электронной микроскопии методом негативного контраста (Рис.3).

На основании полученных данных был предложен следующий механизм образования мезоглобул. При повышении температуры происходит сокращение размера клубков. Агрегация происходит до полного коллапсирования клубков. При этом полимерные цепи переплетаются и в дальнейшем коллапсируют в единую глобулу (Рис.4А).

Рис.3. Микрофотография мезоглобул полученная методом негативного контраста. Размер мезоглобул, полученный из динамического рассеяния света-84нм. Масштабная линейка соответствует 500нм.

А _

«

Рис.4. Две возможные схемы образования мезоглобул. А. Агрегация клубков с образованием единой глобулы. Б. Агрегация сформировавшихся глобул.

Механизм образования мезоглобул, изображённый на Рис.4Б, был исключён на основании данных электронной микроскопии, где наблюдались цельные сферические глобулы с размером, соответствующим данным рассеяния света.

На этом этапе можно заключить, что при наблюдении перехода клубок-глобула могут образовываться агрегаты из клубков, которые в дальнейшем испытывают переход очень схожий с поведением одиночной цепи. Хотя мезоглобулы стабильны в течение длительного времени, сам процесс их образования является неравновесным.

Дальнейшее подтверждение этому утверждению было получено при исследования зависимости размера сформировавшихся мезоглобул от концентрации раствора и скорости нагрева. Было показано, что размер мезоглобул увеличивается с увеличением концентрации и уменьшением скорости нагрева.

На основании понимания механизма агрегации гомополимеров был разработан и исследован гетерополимер поли-(Ы- изопропилакриламид-со-акриламидоуядеканоевая кислота), содержащий амфифильный мономер (акриламидоундеканоевая кислота). Путем сравнения перехода клубок-глобула полимеров с различным содержанием амфифильного полимера(4 и 15 мольных %) было показано, что при высоком содержании амфифильного полимера переход клубок-глобула происходит без агрегации (Рис.5 ).

Рис.5 . Переход клубок глобула в полимере, содержащем амфифильный мономер в количестве 4 моль % (•) и 15 моль % (о) Вверху: Зависимость гидродинамического радиуса от температуры. Внизу: Зависимость интенсивности рассеянного света от температуры.

15 20 25 30 35 40 45

1 ,°с

Отсутствие агрегации было объяснено случайно-блочной структурой полимера, образующейся при сополимеризации Ы-изопропилакриламида и мицелл амфифильного мономера. Был сделан вывод, что данный полимер является более удобной моделью для исследования перехода клубок-глобула.

2.Применение конформационных переходов термочувствительных полимеров для контролируемой доставки лекарственных средств.

В предыдущем разделе было показано, что термочувствительные полимеры меняют конформацию в ответ на внешний стимул. Выше температуры перехода полимеры находятся в компактной конформации и содержат небольшое количество воды. В работе исследовалась возможность использования данного свойства Полимеров для локальной доставки лекарств с поверхности имплантированных устройств. Это бы позволило регулировать реакцию живой ткани на имплантированное устройство. На Рис. 6 показаны экспериментальные кривые элюции колхицина из плёнок поли-(НИПАА-НТБАА-ААБФ), пришитых к поверхности чашки Петри при разных температурах. При повышении температуры скорость элюции колхицина из плёнки заметно увеличивается.

!5 20 25 ЗС 35 40 4!

Рис.6. Выход колхицина из пленок термочувствительных полимеров при температурах 30°С(») и 24°С(о). Вставка: Элюция колхицина в логарифмических координатах.

1, Ч

Из закона Фика можно посчитать выход низкомолекулярного вещества из тонкой мембраны находящейся в контакте с бесконечным перемешивающимся объёмом:

где М(1) -количество вещества, вышедшего из мембраны на момент I, М(«>) -полное количество вещества в мембране, Е>- коэффициент диффузии в плёнке, д-толщина плёнки. Для обработки кривых элюции использовался более общий степенной закон в виде:

При этом в зависимости от механизма элюции из плёнки п может варьировать в некоторых пределах.

На Рис. 7 показана зависимость кажущегося коэффициента диффузии, от температуры. При изменении температуры на 6°С Оарр изменяется более чем на два порядка величины, что показывает возможность регулирования выхода лекарств из плёнки небольшими изменениями внешних стимулов.

'......!

Р о,-

I

§ «

Рис. 7. Зависимость коэффициента диффузии в плёнке от температуры

t.°C

На Рис. 8 представлена зависимость показателя п от температуры, из которой можно заключить, что механизм элюции лекарства зависит от конформационного состояния полимера в плёнке. Ниже 27°С п-0.5, что свидетельствует о простой диффузии в соответствии с законом Фика. Выше 27°С п~ 0.3, что свидетельствует о смене механизма диффузии колхицина в плёнке коллапсированного полимера.

Рис.8 . Зависимость показателя степени п от температуры.

Наблюдавшаяся смена механизма диффузии, по видимому, объясняется взаимодействием колхицина с гидрофобной полимерной матрицей в коллапсированном состоянии.

В работе проведено сопоставление диффузии лекарства в плёнки с изменениями толщины полимерной плёнки измеренной методом лазерной интерферометрии. Было сделано заключение, что контроль выхода низкомолекулярных веществ в данной системе возможен только при температуре заведомо выше перехода, где плёнка полимера содержит небольшое количество воды.

3. Поверхностные свойства термочувствительных полимеров.

Как было показано, конформационные переходы термочувствительных полимеров могут быть использованы для контролируемой доставки лекарств из тонких плёнок. Причем пленки полимеров могут быть нанесены на имплантируемые устройства и загружены лекарственными средствами, чтобы контролировать взаимодействие устройств с живой тканью. Другой областью применения полимеров, исследованных в данной работе, было манипулирование клеточными культурами in vitro. В коллапсированном состоянии плёнки полимеров имеют достаточно твердую консистенцию и способны поддерживать адгезию и рост клеток. При понижении температуры полимерные плёнки либо растворяются, либо, в случае химически сшитых пленок, набухают. При этом клетки слетают с полимерной подложки.

В соответствии с общепринятой концепцией, наиболее важным параметром определяющем взаимодействие с живой тканью является поверхностная энергия биоматериала. В эмпирических исследованиях взаимодействие клеток с биоматериалами сопоставляют с краевым углом воды на поверхности материала, который отражает относительную степень гидрофобности материала. Обычно адгезия и рост клеточных культур улучшается с уменьшением гидрофобности подложки. Однако, полимеры, синтезированные и в данной работе, демонстрируют аномальную зависимость адгезии и роста клеточных культур от степени гидрофобности. Это обстоятельство послужило одной из причин того, что в работе были предприняты исследования поверхностных свойств серии термочувствительных полимеров.

В работе была синтезирована серия полимеров с различным соотношением N-изопропилакриламида и более гидрофобного N-wpem-бутилакриламида. Измерялись натекающие краевые углы, 6у , при медленном движении капли по поверхности плёнки полимера толщиной около Зцм.

Рис.9. Изменения радиуса капли и краевого угла в режиме прилипания-соскальзывания. Полимер -ПНИПАА80:НТБАА20, тестирующая жидкость - вода.

Измерение натекающих краевых углов воды показало аномальное движение линии раздела трёх фаз по поверхности всех исследованных полимеров, кроме ПНТБА. При увеличении объёма капли линия трёх фаз не движется при увеличении краевого утла до определённого значения, после чего происходит срыв (Рис.9). В литературе данное поведение получило название режима «прилипания-соскальзывания».

Таблица 1. Углы соскальзывания и прилипания для серии сополимеров при 37°С.

Полимер

Угол Угол

соскальзывания прилипания

ПНИПАм 96-118° 74.0+1.4°

ПНИПАм 80:НТБА20 96-126° 78.6±2°

ПНИПАм60:НТБА40 85-91° 82.9±0.8°

ПНТБА 87.0±0.5° 87.0±0.5°

Угол, при котором происходит срыв капли, был назван углом соскальзывания. Угол, до которого уменьшается значение краевого угла после срыва, получил название угла прилипания. Углы прилипания воспроизводились от эксперимента к эксперименту, а углы соскальзывания варьировали даже в одном эксперименте (Таблица 1).

Исследование поверхности полимерной плёнки методом фазово-контрастной оптической микроскопии выявило серию концентрических колец, соответствующих прилипанию и соскальзыванию капли (Рис. 10).

При большем увеличении видна особенность па поверхности плёнки (отмеченная стрелкой на Рис. 10). Эта особенность была интерпретирована как поднятие (гребень) на поверхности полимера вызванное вертикальной составляющей поверхностного натяжения в области трехфазного контакта.

На основании этих данных был предложен механизм появления режима прилипания-соскальзывания при измерении краевых углов на поверхности термочувствительных полимеров. Если гребень на подложке уже образовался, то дальнейшее движение линии трехфазного контакта становится невыгодным, поскольку микроскопический краевой угол при дальнейшем движении будет меньше равновесного. Только когда микроскопический угол равен равновесному, дальнейшее движение может продолжиться. При этом наблюдаемый угол (угол соскальзывания) будет равен сумме равновесного угла и угла наклона гребня. В общем случае, чем больше деформация подложки, тем больше должна быть разница между углами прилипания и соскальзывания. Интересно, что в ряду исследуемых полимеров эта разница уменьшается с увеличением доли гидрофобного мономера в составе сополимеров. Для гомополимера ПНТБАА

ПНИПАА80:НТБАА20 после измерения наступающего краевого угла. Масштабная линейка -ЮОцм (А) и 25 цм (В). Стрелка указывает положение гребня.

Рис. 10. Оптическая микрофотография (фазовый контраст) поверхности

режим прилипания-соскальзывания вообще не наблюдается. По-видимому, при повышении гидрофобности полимеров уменьшается количество воды находящейся в равновесии внутри полимерной подложки. Хотя «сухой» полимер обладает значительным модулем сдвига, в присутствии воды модуль падает на порядок, то есть, вода служит пластификатором.

Поверхностные энергии серии полимеров были определены путем измерения наступающих краевых углов, используя тестирующие жидкости, которые не взаимодействуют с подложками. Критерием пригодности жидкости было постоянство краевого угла при движении линии трехфазной границы. Различные поверхностные энергии и краевой угол связаны уравнением Юнга:

где уы - свободная энергия раздела жидкость-насыщенный пар, у^ - свободная энергия раздела твердое тело-насыщенный пар, у5; - свободная энергия раздела твердое тело-жидкость. Для определения поверхностных энергий, у№ использовалось полуэмпирическое уравнение Ньюманна, в котором исключена:

где р является эмпирическим параметром, определённым Ньюманном путём измерения краевых углов с использованием ряда тестирующих жидкостей на различных поверхностях. Результаты измерения поверхностных энергий суммированы в Таблице 2. Поверхностная энергия уменьшается с увеличением доли гидрофобного мономера. Термочувствительные полимеры этой серии являются довольно неполярными. Поверхностная энергия ПНТБА сравнима с поверхностной энергией полистирола (29.9±0.5 мДж/м2). Все полимеры имеют энергию сильно ниже оптимального порога для роста клеток (-60 мДж/м2).

//у соэву = у^ - ,

Таблица 2. Поверхностные энергии серии термочувствительных полимеров

Полимер

Поверхностная энергия мДж/мг

ПНИПАА

38.8+0.2

ПНИПАА80:НТБАА20

36.2±0.6

ПНИПАА60:НТБАА40

34.3Ю.5

ПНТБАА

31.0±0.5

Можно предположить, что аномальное поведение серии термочувствительных полимеров связано с их способностью абсорбировать значительное количество воды даже выше температуры перехода, что значительно увеличивает способность субстрата к деформации. Возможно, что в данном случае, механические свойства субстрата оказывают большее влияние на адгезию и рост клеток, чем поверхностные энергии.

1. Исследованы особенности перехода клубок-глобула термочувствительных гомополимеров, имеющих значение для моделирования переходов клубок-глобула в биологических макромолекулах. При переходе клубок-глобула несколько полимерных цепей могут агрегировать и коллапсировать совместно с образованием «мезоглобул», размер которых может быть много меньше размера исходного клубка, но больше размера индивидуальной коллапсированной молекулы полимера.

2. Было показано, что переход клубок-глобула может происходить без агрегации, если полимер имеет блочную структуру. Для этого был разработан случайно-блочный термочувствительный сополимер с включением блоков амфифильного мономера в полимерную цепь. В нем переход из состояния клубка в состояние глобула происходит в отдельной

Выводы.

молекуле, поэтому такой сополимер является более реалистичным объектом для моделирования переходов клубок-глобула в биополимерах.

3. Было показано, что конформационные переходы в термочувствительных полимерах могут быть основой для контролируемой локальной доставки лекарств. Для этой цели был разработан термочувствительный фото-сшиваемый полимер, который может применяться в качестве покрытия на различных имплантируемых биомедицинских устройствах. Было установлено, что коэффициент диффузии колхицина в плёнке полимера изменяется на два порядка величины в районе перехода, что позволяет управлять выходом лекарств внешними стимулами.

4. Определены поверхностные энергии в серии термочувствительных полимеров, применяемых для контролируемой доставки лекарств и в качестве субстратов для роста клеточных культур. Поверхностная энергия уменьшалась с увеличением содержания более гидрофобного мономера с 38.8 до 31.0 мДж/м2. Термочувствительные полимеры этой серии являются довольно неполярными, тем не менее они способны поддерживать рост клеточных культур.

5. Получило объяснение возникновение аномального режима «прилипания-соскальзывания» при измерениях краевого угла воды на поверхности термочувствительных полимеров. Появление такого режима связано с наличием гребня на поверхности полимеров по линии раздела трех фаз. Гребень возникает в результате повышения пластичности полимера связаного с проникновением воды в полимерную плёнку.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. A.V. Gorelov, L.N. Vasil'eva, A. Du Chesne, E.G. Timoshenko, Yu.A. Kuznetsov, K.A. Dawson Analysis of dynamic light scattering of poly(N-isopropylacrylamide) across collapse transition. II Nuovo Cimento 1994;16:711-720.

2. A.V. Gorelov, A. Du Chesne, K.A. Dawson Phase separation in dilute solutions of poly-(N-isopropylacrylamide). PhysicaA 1997,240:443-452.

3. K.B. Doorty, T.A. Golubeva, A.V. Gorelov, Y.A. Rochev, L.T. Allen, K.A. Dawson, W.M. Gallagher, A.K. Keenan Poly(N-isopropylacrylamide) co-polymer films as potential vehicles for delivery of an antimitotic agent to vascular smooth muscle cells. Cardiovascular pathology 2003;12:105-110.

4. S.J. Wilson, A.V. Gorelov, Y.A. Rochev, F. McGillicuddy, K.A. Dawson, W.M. Gallagher, AK Keenan Extended delivery of the antimitotic agent colchicine from thermoresponsive N-isopropylacrylamide-based copolymer films to human vascular smooth muscle cells. Journal of biomedical materials research Part A 2003;67A: 667-673.

5. У. Rochev, D. O'Halloran, T. Gorelova, V. Gilcreest, I. Selezneva, B. Gavrilyuk, A. Gorelov Rationalising the design of polymeric thermoresponsive biomaterials. Journal of materials science-Materials in medicine 2004;15: 513-517.

6. V.P. Gilcreest, W.M. Carroll, Y.A. Rochev, I. Blute, K.A. Dawson, A.V. Gorelov Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) copolymers: Contact angles and surface energies of polymer films. Langmuir 2004^0: 10138-10145.

7. C.A. Kavanagh, T.A. Gorelova, I.I. Selezneva, Y.A. Rochev, K.A. Dawson, W.M. Gallagher, A.V. Gorelov, A.K. Keenan Poly(N-isopropy acrylamide) copolymer films as vehicles for the sustained delivery of proteins to vascular endothelial cells. Journal of biomedical materials research Part A 2005;72A: 25-35.

8. V.P. Gilcreest, K.A. Dawson, A.V. Gorelov Adsorption kinetics of NIPAM-based polymers at the air - water interface as studied by pendant drop and bubble tensiometry. Journal of physical chemistry Б 2006;110: 21903-21910.

9. И.И. Селезнёва, A.B. Горелов, Ю.А. Рочев, Использование термочувствительных полимерных материалов на основе N-изопропилакриламида и N-трет-бутилакриламида в клеточных технологиях. Клеточные технологии в биологии и медицине 2006;2: 231-234.

10. М.Т. Moran, W.M. Carroll, I. Selezneva, A. Gorelov, Y. Rochev Cell growth and detachment from protein-coated PNIPAAm-based copolymers. Journal of biomedical materials research Part A 2007;8IA: 870-876.

11. M.T. Moran, W.M. Carroll, A. Gorelov, Y. Rochev Intact endothelial cell sheet harvesting from thermoresponsive surfaces coated with cell adhesion promoters. Journal of the royal society interface 2007;4: 1151-115.

Подписано в печать 20.11.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ №1279 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Горелов, Александр Владимирович

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Копформационные переходы в термочувствительных полимерах, как упрощённая модель сворачивания белков.

1.2. Фазовые переходы в тонких плёнках термочувствительных полимеров.

1.3. Доставка лекарств из тонких плёнок термочувствительных 14 полимеров.

1.4. Поверхностные свойства термочувствительных полимеров

2. Материалы и методы.

2.1 Синтез и характеризация термочувствительных полимеров

2.1.1. Синтез поли(М-изопропилакриламида) и сополимеров изопропилакриламида с трет-бутилакриламидом.

2.1.2. Синтез поли-(М-изопропилакриламида-со-акриламидоундекановой кислоты) (поли-(НИПАА-со-ААУДК)).

2.1.3. Синтез поли-(Ы-изопропилакриламида-со-1^-трет-бутилакриламида-со-акриламидобензофенона).

2.2. Применение методов рассеяния света для характеризации полимеров.

2.2.1. Статическое рассеяние света.

2.2.2. Динамическое рассеяние света.

2.3. Измерение толщины полимерных плёнок с помощью спектров отражения и лазерной интерферометрии.

2.3.1. Измерение толщины полимерных плёнок с помощью спектра отражения.

2.3.2. Измерение изменений толщины полимерных плёнок с помощью лазерной интерферометрии.

2.4. Разработка системы для исследования выхода лекарств из тонких полимерных плёнок.

2.4.1. Нанесение полимерной пленки и загрузка колхицина.

2.4.2. Ячейка для исследования элюции лекарств из полимерных плёнок

2.5. Измерение поверхностных энергий плёнок термочувствительных полимеров.

2.5.1. Различные теоретические подходы к определению поверхностной энергии.

2.5.2. Экспериментальное определение краевых углов.

2.5.3. Оптическая микроскопия полимерных плёнок.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Структура и основные свойства термочувствительных полимеров.

3.2. Переход клубок глобула в разбавленных растворах поли-N-изопропилакриламида.

3.2.1. Переходы клубок глобула в ПНИПАА и образование мезоглобул.

3.2.2. Переход клубок-глобула в сополимерах поли-(НИПАА-со-ААУДК)

3.3. Фотохимические свойства термочувствительных полимеров содержащих боковую группу бензофенона.

3.4. Фазовый переход в тонких плёнках фото-химически сшитых термочувствительных полимеров.

3.5. Применение конформационных переходов термочувствительных полимеров для контролируемой доставки лекарственных средств.

3.6. Поверхностные свойства термочувствительных полимеров.

3.6.1. Определение поверхностных энергий сополимеров НИПАА и

НТБАА.

3.6.2. Аномальное поведение краевых углов воды на поверхности термочувствительных полимеров.

4. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физико-химические свойства биологически значимых термочувствительных полимеров"

Актуальность проблемы

Термочувствительные полимеры были открыты в начале 60-х годов прошлого века. Их отличает наличие нижней критической температуры растворения (НКТР). Для концентрированных и полуразбавленных растворов полимеров это проявляется в выпадении полимера в осадок при повышении температуры. В разбавленных растворах при повышении температуры наблюдается переход клубок-глобула на уровне отдельных полимерных цепей. В полимерных сетках НКТР проявляется как переход из набухшего в коллапсированное состояние сетки. Наличие НКТР наблюдается для сравнительно небольшого количества известных полимеров и, почти исключительно, в водных растворах.

В 1990-х годах интерес к данному классу полимеров значительно возрос. В основном это было связано с пониманием, что данные полимеры могут служить как модели для известных биофизических систем или как технологическая платформа для биофизических и биомедицинских приложении. Наиболее популярный полимер данного класса - поли-(К-изопропилакриламид) (ПНИПАА). Он обладает температурой перехода около 32°С, которая близка к физиологической. Кроме того, температура перехода может быть изменена в любых пределах путём сополимеризации мономера изопропилакриламида с другими мономерами. Для сополимеров, включающих в себя мономеры с ионизируемыми группами, температура перехода становится чувствительной к значительно большему количеству внешних стимулов, таких как рН, ионная сила, специфические катионы и анионы. Последующая пришивка к полимеру или гелю ферментов, катализирующих реакции с выделением или поглощением протона, позволяет расширить количество веществ, влияющих на температуру перехода.

Среди многочисленных исследований термочувствительных полимеров как модельных биофизических систем и для биомедицинских приложений в данной работе обсуждаются три основных направления.

Одно из них - исследование перехода клубок-глобула в разбавленных полимерных растворах как модель конформационных переходов в белках. Существует определённая аналогия между переходом клубок-глобула в ПНИПАА и холодовой денатурацией в белках. В обоих случаях при повышении температуры происходит переход молекулы в компактное состояние. Преимущества исследования модельной системы в данном случае заключается в том, что удается исследовать общие закономерности сворачивания клубка в компактную структуру и сравнивать их с теоретическими моделями, которые пока достаточно примитивны для применения к реальным белкам.

Два других направления имеют прикладное биомедицинское значение. Конформационные переходы в термочувствительных полимерах могут быть использованы для контролируемой локальной доставки лекарств, основанной на том, что в полимерных микрочастицах и пленках вблизи температуры перехода диффузия инкорпорированного вещества сильно зависит от параметров среды, например, температуры. Кроме того, термочувствительные полимеры могут использоваться как активные биосовместимые поверхности при изготовлении культуральных сред и при изготовлении различных имплантируемых устройств.

В связи с вышесказанным изучение биологически значимых физико-химических свойств (включая поверхностные) термочувствительных полимеров является важным фундаментальным направлением биофизики.

Цели и задачи работы

Цель - изучение конформационных переходов в термочувствительных полимерах как модельных системах для фундаментальных исследований в биофизике и для различных биомедицинских приложений. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Провести исследование конформационных переходов термочувствительных полимеров в растворах и их применимость как моделей конформационных переходов в биополимерах.

2. Исследовать конформационные переходы термочувствительных полимеров, пришитых к поверхности, и обосновать возможность их применения для контролируемой доставки лекарств.

3. Определить поверхностные свойства термочувствительных полимеров, имеющие отношение к их биосовместимости.

Научная новизна

Впервые прояснены особенности механизма перехода клубок-глобула в разбавленных растворах поли-(К-изопропилакриламида), приводящие к образованию «мезоглобул». Впервые разработан и синтезирован полимер случайно-блочной структуры, который способен переходить из клубка в глобулу без агрегации. Разработан и синтезирован новый класс фото-сшиваемых термочувствительных полимеров, которые могут быть нанесены на поверхность различных имплантируемых устройств и нагружены физиологически активными веществами. Исследована контролируемая доставка лекарств из данных полимеров. Впервые определены поверхностные энергии в серии термочувствительных полимеров разного состава. Впервые объяснены аномалии, возникающие при измерении краевых углов воды на поверхности термочувствительного полимера.

Практическая ценность

Результаты работы могут применяться для разработки новых биомедицинских устройств на основе термочувствительных полимеров. В частности, полимеры, исследованные в настоящей работе, находят применение в разработке субстратов для безферментативного снятия тканевых культур с поверхности. Исследованные свойства этих полимеров могут быть использованы для оптимизации этих субстратов. Фотосшиваемые полимеры могут применяться для доставки лекарственных средств с поверхности имплантируемых биомедицинских устройств. Способность полимеров, исследованных в данной работе, испытывать переход клубок глобула без агрегации может применяться для экспериментальной проверки теорий сворачивания белков.

Апробация

По теме диссертации опубликовано 11 статей в рецензируемых журналах.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы разбит на три части. В первой части обсуждается важность переходов клубок-глобула в синтетических полимерах как упрощённых моделей сворачивания белков. Во второй части кратко рассмотрены проблемы применения термочувствительных полимеров для контролированной доставки лекарств. Более подробно рассмотрена проблема доставки лекарств с поверхностей, модифицированных термочувствительными полимерами. Также обсуждается литература, посвящённая фазовым переходам в тонких плёнках термочувствительных полимеров. Третья часть посвящена обзору работ, в которых определялись поверхностные свойства термочувствительных полимеров.

1.1. Конформационные переходы в термочувствительных полимерах, как упрощённая модель сворачивания белков

Глубокая связь между конформационными переходами в синтетических полимерах и биополимерах впервые была отмечена в теоретических работах. Птицин и Лифшиц впервые отметили, что проблема перехода клубок-глобула в макромолекулах может быть информативной моделью для понимания переходов в белках (Ptitsyn et al. 1968, Лифшиц 1968, Lifshitz et al. 1978). Птицын и сотрудники разработали обобщённый подход к теории переходов клубок-глобула типа Флори (Flory, 1953). В их работах было показано, что переход клубок-глобула в гомополимерах может быть как первого, так и второго рода. Этот вывод подвергался критике в литературе (Nishio et al. 1979), поскольку исходная теория Флори предполагает переход только первого рода для гомополимеров. Лифшиц также показал, что переход клубок-глобула может быть первого рода. При этом он использовал теорию самосогласованного поля для расчета плотности внутри глобулы. Развивая идеи Лифшица, Гросберг и Кузнецов показали, что порядок перехода зависит от параметра жёсткости полимерной цепи (Grosberg & Kuznetsov 1992а, Grosberg & Kuznetsov 1992b). Для жёстких цепей переход клубок-глобула является переходом первого рода.

Для гетерополимеров теории типа Флори показывают переход первого рода, за счет того, что мономеры разной природы могут перераспределяться внутри глобулы (Dill & Stigter, 1995, Ganazzoli 1998, Ganazzoli 2000). Надо заметить, что в настоящее время теоретическое рассмотрение перехода клубок-глобула для гетерополимеров в основном ограничено полимерами с двумя типами мономеров. Современное состояние теории пока не позволяет рассматривать переходы в полимерах с 20 различными типами мономеров, что позволило бы сравнить переход клубок-глобула со сворачиванием белков. Необходимы упрощенные экспериментальные модели, которые позволили бы провести сравнения теории с экспериментом (Chan&Dill 1993).

Популярность использования ПНИПАА для изучения конформационных переходов полимеров объясняется тем, что ПНИПАА близок по химической природе к полипептидам (Graziano 2000). ПНИПАА является изомером полилейцина. ПНИПАА имеет амфифильную природу и переход клубок-глобула происходит в водных растворах. Кубота и др. исследовали размер молекулы ПНИПАА как функцию температуры методами динамического и статического рассеяния света (Kubota et al. 1990). В работе использовались фракционированные образцы полимера. В частности, использовался полимер с молекулярной массой 25*10б при концентрации 10 цг/мл. В этой работе удалось достичь сокращения радиуса инерции клубка до 50%, до того как агрегация становилась заметной. При измерении гидродинамического радиуса была получена гораздо меньшая степень сокращения клубка до начала агрегации. Авторы так лее измеряли размер глобул в области, которую они назвали метастабильной. В этой работе была так же определена температура, при которой отталкивание между мономерами сменяется притяжением (0-температура), составляющая 30.59°С для ПНИПАА.

By и сотрудники описали «кинетически стабильное» глобулярное состояние ПНИПАА (Wu & Zhou 1995). Молекулярная масса полимера в этой работе была 10*106 с концентрацией 5 jir/мл. Позже та же группа заявила, что при дальнейшем уменьшении концентрации было получено термодинамически стабильное глобулярное состояние. По поведению отношения Rh/Rg в этих работах было сделано заключение, что переход клубок-глобула происходит через состояние «расплавленной» глобулы.

Можно заключить, что экспериментальное наблюдение перехода клубок-глобула в одиночной полимерной цепи является чрезвычайно трудной задачей. Причина этих трудностей была рассмотрена теоретически путём сопоставления области перехода одиночной цепи с фазовой диаграммой растворов полимеров в области низких концентраций. При этом учитывалась кинетика столкновения полимерных цепей.

По-видимому, единственным примером системы, в которой был получен переход клубок-глобула в одиночной цепи без агрегации, является переход клубок-глобула ПНИПАА в присутствии додецилсульфата натрия (Meewes at al 1991, . Binkert at al. 1991). Додецилсульфат натрия стабилизирует глобулярное состояние полимера, по-видимому, за счёт электростатического отталкивания. Для полимера с молекулярным весом 7*106 при переходе клубок-глобула гидродинамический радиус падает со 101 до 20 нм. Стабилизация глобулы детергентом была использована для прояснения термодинамики перехода клубок-глобула (Tiktopulo at al. 1994, Tiktopulo at al. 1995). Путем сравнения энтальпии полученной из калориметрических измерений с энтальпией Вант Гоффа было показано, что переход клубокглобула является переходом первого рода для доменов внутри цепи. Размер домена составляет около ста мономеров.

В последнее время появились работы, в которых экспериментально исследовалась кинетика перехода клубок-глобула в гомополимерах (Ye et al. 2007). Было показано, что ПНИПАА является удобным объектом для исследований кинетики переходов синтетических полимеров, поскольку доступны методы позволяющие увеличить температуру на несколько градусов в течение нескольких микросекунд. Это открывает возможности исследования зависимости кинетики перехода клубок-глобула от ряда переменных таких, как молекулярная масса и структура полимера. Такие исследования могут дать более глубокое понимание начальных стадий сворачивания белков. Можно заключить, что термочувствительные полимеры являются важными модельными объектами для исследований конформационных переходов в биополимерах.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Горелов, Александр Владимирович

Выводы

1. Изучены особенности перехода клубок-глобула термочувствительного гомополимера поли-(Ы-изопропилакриЛамида), имеющего значение для моделирования переходов клубок-глобула в биологических макромолекулах. При переходе клубок-глобула несколько полимерных цепей могут агрегировать и коллапсировать совместно с образованием «мезоглобул», размер которых может быть много меньше размера исходного клубка, но больше размера индивидуальной коллапсированной молекулы полимера.

2. Было показано, что переход клубок-глобула может происходить без агрегации, если полимер имеет блочную структуру. Для этого был разработан случайно-блочный термочувствительный сополимер поли-(Ъ1-изопропилакриламид-со-акриламидоундекановая кислота) с включением блоков амфифильного мономера в полимерную цепь. В нем переход из состояния клубка в состояние глобулы происходит в отдельной молекуле, поэтому такой сополимер является более реалистичным объектом для моделирования переходов клубок-глобула в биополимерах.

3. Было показано, что конформационные переходы в термочувствительных полимерах могут быть основой для контролируемой локальной доставки лекарств. Для этой цели был разработан термочувствительный фото-сшиваемый полимер поли-(ТЧ-изопропилакриламид-со->Т-трет-бутилакриламид-со-акриламидобензофенон), который может применяться в качестве покрытия на различных имплантируемых биомедицинских устройствах. Было установлено, что коэффициент диффузии колхицина в плёнке полимера изменяется на два порядка величины в районе перехода, что позволяет управлять выходом лекарств внешними стимулами.

4. Определены поверхностные энергии в серии термочувствительных сополимеров N-изопропилакриламида и N-mpem-бутилакриламида, применяемых для контролируемой доставки лекарств и в качестве субстратов для роста клеточных культур. Поверхностная энергия уменьшалась с 38.8 до 31.0 мДж/м с увеличением содержания более гидрофобного мономера. Термочувствительные полимеры этой серии являются довольно неполярными, тем не менее, они способны поддерживать рост клеточных культур.

5. Предложен механизм возникновения аномального режима «прилипания-соскальзывания» при измерениях краевого угла воды на поверхности термочувствительных полимеров. Появление такого режима связано с наличием гребня на поверхности полимеров по линии раздела трех фаз. Гребень возникает в результате повышения пластичности полимера связаного с проникновением воды в полимерную плёнку. Предложен методический подход для получения краевых углов воды на поверхности биоматериалов в условиях появления аномального режима.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Горелов, Александр Владимирович, Пущино

1. Лифшиц И. М. 1968. Некоторые вопросы статистической теории биополимеров. ЖЭТФ; 55:2408-1422.

2. Першуков И.В., Батыралиев Т.А. 2007. Тромбоз стентов, выделяющих лекарственные вещества, и его фармакологическая профилактика. Кардиология',47:60-67.

3. Пискарёва О.А., Рочев Ю.А., Гаврилюк Б.К., Горелов А.В., Голубева Т.А., Даусон К.А. Влияние матрикса на основе термореверсивных полимеров на рост фибробластов человека. 1999. Биофизика)44:281-283.

4. Селезнёва И.И., Горелов А.В., Рочев Ю.А., 2006. Использование термочувствительных полимерных материалов на основе N-изопропилакриламида и N-трет-бутилакриламида в клеточных технологиях. Клеточные технологии в биологии и медицине',2: 231-234.

5. Aseyev У.О., Tenhu Н., Klenin S. I. 1999. Collapse of poly(methacryloylethyl trimethylammonium methylsulfate) on addition of acetone into an aqueous solution. Polymer, 40:1173-1180.

6. Beines P. W., Klosterkamp I., Menges В., Jonas U., and Knoll W. 2007. Responsive thin hydrogel layers from photo-cross-linkable poly(iV-isopropylacrylamide) terpolymers. Langmuir ;23: 2231-2238.

7. Binkert Th., Oberreich J., Meewes M., Nyffenegger R., and Ricka J. 1991. Coil-globule transition of poly(N-sopropylacrylamide): A study of segment mobility by fluorescence depolarization. Macromolecules ;24: 5806-5810.i

8. Brazell C. S., Peppas N. A. 1999. Dimensionless analysis of swelling of hydrophilic glassy polymers with subsequent drug release from relaxing structures. Biomaterials; 20:721-732.

9. Chan H. S., and Dill K. A. 1993. The protein folding problem. Physics today;2:24-32.

10. Chen H., Zhang O., Li J., Ding Y., Zhang G, and Wu C. 2005. Formation of mesoglobular phase of PNIPAM-g-PEO copolymer with a high PEO content in dilute solutions. Macromolecules;38: 8045-8050.

11. Colombo P., Bettini R., Santi P., De Ascentiis A., Peppas N.A. 1996. Analysis of the swelling and release mechanisms from drug delivery systems with emphasis on drug solubility and water transport. Journal of controlled release; 39:231-237.

12. Crank J. 1975. Diffusion in a plane sheet. In: Crank J, editor. The mathematics of diffusion. 2nd ed. Oxford, UK: Clarendon Press; 44-68.

13. Cunliffe D., Alarcon C., Peters V., Smith J., Alexander C. 2003. Thermoresponsive surface-grafted poly(N-isopropylacrylamide) copolymers: Effect of phase transitions on protein and bacterial attachment. Langmui; 19:2888-2899.

14. Delia Volpe C., Cassinelli C., Morra M. 1998. Wilhelmy plate measurements on poly(N-isopropylacrylamide)-grafted surfaces. Langmuir, 14: 4650-4656.

15. Delia Volpe C., Maniglio D., Brugnara M., Siboni S., Morra M. 2004. The solid surface free energy calculation I. In defense of the multicomponent, approach. J. Colloid Interface Sci ;271: 434-453.

16. Dill K.A, Stigter D. 1995. Modeling protein stability as heteropolymer collapse. Adv. Protein. Chem.;46:59-104.

17. Flory PJ. 1953. Principles of Polymer Chemistry. Ithaca: Cornell University Press.

18. Fowkes F. M. 1964. Attractive forces at interfaces. Ind. Eng. Chem.\ 12:4052.

19. Ganazzoli F. 1998. Collapse of random copolymers. Journal of Chemical Physics; 108:9924-9932.

20. Ganazzoli F. 2000. Globular state of random copolymers with arbitrary amphiphilicity. Journal of Chemical Physics ;112:1547-1553.

21. Gorelov A.V., Du Chesne A., Dawson K.A. 1997. Phase separation in dilute solutions of poly-(N-isopropylacrylamide). PhysicaA;240:443-452.

22. Graziano G. 2000. On the temperature-induced coil to globule transition of poly-7V-isopropylacrylamide in dilute aqueous solutions. International Journal of Biological Macromolecules\21: 89-97.

23. Grosberg A.Y., Kuznetsov D.V. 1992a. Quantitative theory of the globule-to-coil transition. 1. Link density distribution in a globule and its radius of gyration. Macromolecules ;25:1970-1979.

24. Grosberg A.Y., Kuznetsov D.V. 1992b. Quantitative theory of the globule-to-coil transition .4. Comparison of theoretical results with experimental data. Macromolecules;25:1996-2003.

25. Kavanagh C.A., Rochev Y.A., Gallagher W.A., Dawson K.A., Keenan A.K. 2004. Local drug delivery in restenosis injury: thermoresponsive copolymers as potential drug delivery systems. Pharmacology & therapeutics; 102 :1-15.

26. Koppel D.E. 1972. Analysis of macromolecular polydispersity in intensity correlation spectroscopy method of cumulants. Journal of Chemical Physics-, 57:4814.

27. Kost J., Langer R. 2001. Responsive polymeric delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews',A6\ 125-148.

28. Krasicky P. D., Groele R. J., Rodriguez F. A. 1987. Laser interferometer for monitoring thin film processes: Application to polymer dissolution. Chemical Engineering Communications', 54:279 — 299.

29. Kubota K., Fujishige S., Ando I. 1990. Single-Chain Transition of Poly( N-isopropylacrylamide) in Water. J. Phys. Chem.; 94:5154-5158.

30. Ruckling D., Harmon M. E., Frank C.W. 2002. Photo-Cross-Linkable PNIPAAm Copolymers. 1. Synthesis and Characterization of Constrained Temperature-Responsive Hydrogel Layers. Macromolecules; 35:63776383.

31. Kujawa P, AseyevV, Tenhu H., Winnik F. M. 2006. Temperature-Sensitive Properties of Poly(A4sopropylacrylamide) Mesoglobules Formed in Dilute

32. Aqueous Solutions Heated aboveTheir Demixing Point. Macromolecules\ 39:7686-7693.

33. Makino K., Hiyoshi J., Ohshima H. 2001. Effects of thermosensitivity of poly (TV-isopropylacrylamide) hydrogel upon the duration of a lag phase at the beginning of drug release from the hydrogel. Colloids and Surfaces В: Biointerfaces; 20:341—346.

34. Meewes M., Ricka J., de Silva M., Nyffenegger R., Binkert Th. 1991.Coil-Globule Transition of Poly (N-isopropylacrylamide). A Study of Surfactant Effects by Light Scattering. Macromolecules; 24:5811-5816.

35. Meyera D.E., Shina B.C., Konga G.A., Dewhirstb M.W., Chilkotia A., 2001. Drug targeting using thermally responsive polymers and local hyperthermia. Journal of Controlled Release; 74:213-224.

36. Moran M.T., Carroll W.M., Selezneva I., Gorelov A., Rochev Y. 2007. Cell growth and detachment from protein-coated PNIPAAm-based copolymers. Journal of biomedical materials research Part A; 81 A: 870-876

37. Moran M.T., Carroll W.M., Gorelov A., Rochev Y. 2007. Intact endothelial cell sheet harvesting from thermoresponsive surfaces coated with cell adhesion promoters. Journal of the Royal Society Interface', 4:1151-115.

38. Nikolov I.D., Ivanov C.D. 2000. Optical plastic refractive measurements in the visible and the near-infrared regions. Applied Optics; 39:2067-2070.

39. Nishio I., Sun S., Swislow G., Tanaka T. 1979. First observation of the coil-globule transition in a single polymer chain. Nature; 281:208-209.

40. Ptitsyn O.B, Kron A.K., Eizner Y.Y. 1968. Models of denaturation of globular proteins .i. theory of globula-coil transitions in macromecules. J. Polym. Sci. PartC\ 16:3509-3517.

41. Peppas N.A., Korsmeyer R.W. 1987. Dynamically swelling hydrogels in controlled release applications. In: Peppas NA, editor. Hydrogels in medicine and pharmacy, vol III. Boca Raton, FL: CRC Press, pp. 109-135.

42. Qiu X., Li M., Kwan С. M. S., Wu C. 1998. Light-scattering study of the coil-to-globule transition of linear poly (N-isopropylacrylamide) ionomers in water. Journal of Polymer Science: Part B: Polymer Physics', 36:1501— 1506.

43. Raos G., Allegra G. 1996. A cluster of chains can be smaller than a single chain: new interpretation of kinetics of collapse experiments. Macromolecules; 29, 8565-8567.

44. Rochev Y., Golubeva Т., Gorelov A., Allen L., Gallagher W.M., Selezneva I., Gavrilyuk В., Dawson K. 2001. Surface modification for controlled cell growth on copolymers of N-isopropylacrylamide. Progress in colloid and polymer science', 118:153-156.

45. Roos A., Klee D., Schuermann К., Hocker H. 2003. Development of a temperature sensitive drug release system for polymeric implant devices. Biomaterials; 24: 4417^423.

46. Schakenraad J. M., Busscher C.R., Wildevuur C. R. H., Arends J. J. 1986. The influence of substratum surface free-energy on growth and spreading of human-fibroblasts in the presence and absence of serum-proteins. J. Biomed. Mater. Res.-, 20:773-784.

47. Siboni S., Delia Volpe C., Maniglio D., Brugnara M. 2004. The solid surface free energy calculation II. The limits of the Zisman and of the "equation-of-state" approaches Journal of colloid and interface science; 271:454-472.

48. Siu M., He C., Wu C. 2003. Formation of mesoglobular phase of amphiphilic copolymer chains in dilute solution: Effect of comonomer distribution. Macromolecules; 36:6588-6592.

49. Tiktopulo E. I., Bychkova V. E., Ricka J., Ptitsyn O.B. 1994. Cooperativity of the coil-globule transition in a homopolymer: Microcalorimetric study of poly(N-isopropylacrylamide). Macromolecules', 27:2879-2882.

50. Tiktopulo E. I., Uversky V. N., Lushchik V.B., Klenin S. I., Bychkova V. E., Ptitsyn O.B. 1995. "Domain" coil-globule transition in homopolymers. Macromolecules', 28:7519-7524.

51. Vogler E. A. 1998. Structure and reactivity of water at biomaterial surfaces. Advances in Colloid and Interface Science; 74:69-117.

52. Wang Z., Kuckling D., Johannsmann D. 2003. Temperature-induced swelling and de-swelling of thin poly(n-isopropylacrylamide) gels in water: Combined acoustic and optical measurements. Soft materials', 3:353-364.

53. Wang W., Troll K., Kaune G., Metwalli E., Ruderer M., Skrabania K., Laschewsky A., Roth S. V., Papadakis С. M., Muller-Buschbaum P. 2008. Thin films of poly(ALisopropylacrylamide) end-capped with n-butyltrithiocarbonate. Macromolecules', 41:3209-3218.

54. Wu C., Zhou S. 1995. Laser light scattering study of the phase transition of poly(N-isopropylacrylamide) in water. 1. Single chain. Macromolecules; 28,:8381-8387.

55. Yakushiji Т., Sakai K., Kikuchi A., Aoyagi Т., Sakurai Y., Okano T. 1998. Graft architectural effects on thermoresponsive wettability changes of poly(N-isopropylacrylamide)-modified surfaces. Langmuir; 14:4657-4662.

56. Ye X., Lu Y., Shen L, Ding Y., Liu S., Zhang G., Wu C. 2007. How many stages in the coil-to-globule transition of linear homopolymer chains in a dilute solution? Macromolecules; 40:4750-4752.

57. Yeoh K. W., Chew С. H., Can L. M., Koh L. L., Teo H. H. 1989. Synthesis and polymerization of surface-active sodium acrylamidoundecanoate. Journal of Macromolecular Science, Part A; 26A:663-680

58. Zanchetta P., Guezennec J. 2001. Surface thermodynamics of osteoblasts: relation between hydrophobicity and bone active biomaterials. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces; 22:301-307.

59. Zhang G., Niu A., Peng S., Jiang M., Tu Y., Li M., Wu C. 2001. Formation of novel polymeric nanoparticles. Acc. Chem. Res.; 34:249-256.

60. Zhang O., Ye J., Lu Y., Nie Т., Xie D., Song O., Chen H., Zhang G., Tang Y., Wu C., and Xie Z. 2008. Synthesis, folding, and association of long multiblock (PEO23-6-PNIPAMi24)750 chains in aqueous solutions. Macromolecules; 41:2228-2234.

61. Zhou, S., Fan S., Au-yeung S., Wu C. 1995. Light-scattering-studies of poly(N-isopropylacrylamide) in tetrahydrofuran and aqueous-solution. Polymer, 36:1341-1346.