Получение, свойства и применение композитных полимерных гидрогелей с иммобилизованными белками и пептидами

Купцова, Светлана Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение, свойства и применение композитных полимерных гидрогелей с иммобилизованными белками и пептидами
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение, свойства и применение композитных полимерных гидрогелей с иммобилизованными белками и пептидами"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М. ШЕМЯКИНА и Ю.А.ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

[^¿Ь^ссС: /ас® (

Купцова Светлана Владимировна

ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ КОМПОЗИТНЫХ ПОЛИМЕРНЫХ ГИДРОГЕЛЕЙ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ БЕЛКАМИ И ПЕПТИДАМИ

Специальность 03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2000

Работа выполнена в лаборатории "Полимеры для биологии" Ордена Трудового Красного Знамени Института биоорганической химии им. ММ. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научный руководитель:

кандидат химических наук

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор

Марквичева Елена Арнольдовна

Зубов Виталий Павлович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук доктор биологических наук

Ларионова Наталия Ивановна Валуева Татьяна Александровна

Ведущая организация:

Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева

Защита состоится 27 декабря 2000 г. в " " часов на заседании Специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, Москва ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХРАН.

Автореферат разослан -г?- ноября 2000 г.

Ученый секретарь Специализированногосовета Доктор химических наук

Л £ О У Г)

Актуальность проблемы. Полимерные системы с иммобилизованными белками (ферментами, антителами) и пептидами находят все более широкое применение в биотехнологии и различных областях медицины. Иммобилизованные ферменты используются в качестве эффективных биокатализаторов в различных областях тонкого органического синтеза. Известно, что нестабильность некоторых белков ограничивает их широкое применение. Иммобилизация позволяет успешно решать проблему стабилизации белков, в том числе ферментов, а также многократно их использовать. Однако некоторые лабильные ферменты, например, тромбин или карбоксипептадазу В не удается иммобилизовать общеизвестными методами. Поэтому создание новых материалов и на их основе методов для иммобилизации нестабильных белков, в частности, ферментов становится все более актуальным.

В последнее время особое внимание исследователей привлекают так называемые «умные полимеры», которые способны изменять свои свойства или структуру в ответ на сигнал окружающей среды. При внешнем воздействии (рН, температура, химический сигнал, электрическое поле и др.) микроструктура таких полимеров быстро и обратимо изменяется от гидрофильного до гидрофобного состояния. Особенно привлекательны водорастворимые полимеры, чувствительные к изменению температуры или рН в физиологическом интервале, поскольку их свойства идеально подходят для иммобилизации различных биологически активных веществ (белков, пептидов, ДНК и др.). Введение "умных" полимеров в состав композитных матриц позволяет получать полимерные системы с заданными свойствами. Целью работы являлось создание композитных гидрогелей (в виде полимерных гранул и пленок) на основе синтетического термочувствительного полимера поли-И-вшшлкалролактама (ПВК) и альгината кальция (СаА^) с иммобилизованными в них белками, в частности, протеолитическими ферментами и пептидами; исследование свойств таких иммобилизованных систем и возможностей их применения в качестве биокатализаторов и для ускорения ранозаживления. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

• получить гранулы (в том числе магнитные) композитного ПВК-СаА^ гидрогеля с иммобилизованными в них протеолитическими ферментами;

• разработать методы иммобилизации тромбина/пептидов в полимерные пленки композитного ПВК-СаА^ гидрогеля;

• исследовать свойства протеаз, иммобилизованных в гранулы композитного ПВК-СаА% гидрогеля, в частности, рН- и температурную зависимости, термостабильность, устойчивость в различных водно-органических средах; определить кинетические

параметры ферментативных реакций при различных температурах и в различных водно-органических средах.

• изучить возможность применения полученных гранул композитного гидрогеля с иммобилизованным в них химотрипсином в качестве биокатализатора в водно-органической среде (на примере реакции получения энантаомеров фенилаланина);

• исследовать эффект полимерных пленок ПВК-CaAlg гидрогеля с иммобилизованными в них тромбином/пептидами на процесс заживления ран.

Научная новизна. Впервые получены стабильные в течение длительного времени препараты иммобилизованного тромбина. Изучен эффект полученных полимерных пленок с иммобилизованными в них тромбином и пептидам и- агонистамя тромбина и трипсина иа процесс репарации тканей в экспериментах in vivo.

Создан новый эффективный биокатализатор - химотрипсин, иммобилизованный в гранулы полимерного композитного ПВК-CaAlg гидрогеля. Исследованы свойства иммобшшзоваппого химотрипсина, в частности, рН- и температурная зависимости, термостабильность и устойчивость в различных водно-органических средах. Впервые получены магнитные гранулы полимерного композитного ПВК-CaAlg гидрогеля о иммобилизованными протеолигическими ферментами. Для иммобилизованных в гранулы композитного ПВК-CaAlg гидрогеля протеаз, в частности, трипсина и химотрипсина, определены каталитические параметры при различных температурах и концентрациях органического растворителя.

Практическая значимость работы. Полученные в работе гранулы полимерного композитного ПВК-CaAlg гидрогеля с иммобилизованными ферментами (как магнитные, так и немагнитные), могут быть успешно использованы как биокатализаторы в различных химико-ферментативных реакциях, протекающих в водно-органических средах, в широком интервале температур. Показано, что полимерные композитные пленки на основе поли-N-винилкапролактама и природных полисахаридов с включенными тромбином/пептидами являются перспективными материалами, которые могут найти применение в терапии ран. Апробация работы. Результаты диссертации были представлены на V (Потсдам, Германия, 1996), VI (Барселона, Испания, 1997) н VII (Тронхейм, Норвегия, 1999) Международных конференциях "Bioencapsulation"; на 7-ой Международной конференции по магнитным жидкостям (Плес, Россия, 1996); на IV Симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 1997); на II Съезде российского биохимического общества, (Москва, 1997); на П1 Международной конференции "Новые информационные технологии в медицине и экологии (Ялта-Гурзуф, Украина, 1997); на VIII (Будапешт, Венгрия, 1997) и IX (Брюссель, Бельгия, 1999) Европейских конгрессах по биотехнологии; на XVI Менделеевском съезде по общей и

прикладной химии (С.-Петербург, Россия, 1998); на II Международном семинаре РФФИ "Результаты фундаментальных исследований в медицине и биотехнологии для инвестиций" (Москва, 1998); на Международных конференциях "Биокатализ - 98" (Пущино, Россия, 1998) и "Биокатализ - 2000" (Москва, Россия, 2000); на XII Международном симпозиуме по микрокапсулированию (Лондон, Великобритания, 1999); на школе-конференции "Горизонты физико-химической биологин" (Пущино, 2000); на 18-ом Международном Конгрессе по биохимии и молекулярной биологии: "Beyond the Genome: Understanding and exploiting molecules and cells in the third milleaium" (Бирмингем, Великобритания, 2000); на 11-ом Международном симпозиуме по биотехнологии "Biotechnology 2000" (Берлин, Германия, 2000).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 24 печатные работы. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, результатов и их обсуждения, изложенных в четырех главах, экспериментальной части, выводов, а также списка литературы, включающего наименований. Диссертация изложена на -т страницах машинописного текста, содержит . таблиц и <2^?рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Получение стабильных препаратов ферментов лиофильным высушиванием в присутствии поли-К-вшгиламидоп

Хранение и использование нестабильных белков и ферментов - проблема, одним из путей решения которой может быть их стабилизация включением в полимерную матрицу. При этом особое внимание должно быть уделено выбору метода включения, который позволил бы избежать нарушения третичной структуры белков, а, следовательно, получать биологически активные препараты.

В данной работе для стабилизации белков, в частности, протеолитических ферментов использовали полимеры класса поли-М-вшшламидов, а именно термочувствительные гомо- и сополимеры N-винилкапролактама (ВК). Среди водорастворимых полимеров поли-N-виниламиды привлекают пристальное внимание как модели природных полимеров с амидной группой, например, белков. Они находят широкое применение в медицине и биотехнологии, входят в состав лекарственных препаратов, на их основе готовят носители для биологически активных веществ, мембраны, сорбенты. Ранее было показано, что один из представителей класса поли-Н-виниламидов, а имепно, полн-М-виииякапролактам (ПВК), обладает

способностью образовывать комплексы с белками в растворе при комнатной температуре и в процессе термоосаждения.

Эти данные позволили предположить возможность использования ПВК и его сополимеров для получения стабильных препаратов белков. Особый интерес представляла стабилизация лабильных ферментов, таких как, тромбин и карбоксипептидаза В (КПВ). Было исследовано влияние ПВК и некоторых, сополимеров ВК (с виниловым спиртом (ВК/ВС); с винилметилацетамидом (ВК/ВМА); с виниламином (ВК/ВАм)) на сохранение амидазной и свертывающей активности тромбина в растворе и при лиофилизации, а также протеолитической активности КПВ при лиофилизации.

Показано, что введение гомо- и сополимеров ВК (конц. 2-4%) в растворы ферментов позволяло получать препараты, в которых сохранение ферментативной активности значительно выше, чем в отсутствии полимеров. Так, сохранение активности КПВ при ее лиофильном высушивании в присутствии томо- и сополимеров ВК было почти в 2 раза выше, чем в контроле (раствор фермента без добавления полимеров). Введение сополимеров ВК/ВС, ВК/ВМА и ВК/ВАм в раствор тромбина позволило получить ферментные препараты, активность которых была в 6,5 раз выше активности в контроле. Активность тромбина, лиофильно высушенного в присутствии ПВК, была почти в 9 раз выше, чем в образце без добавления полимеров.

Стабилизирующий эффект гомо- и сополимеров ВК, по-видимому, можно объяснить образованием комплекса полимер-фермент, аналогичного описанным ранее комплексам ПВК с некоторыми белками. На сегодняшний день среда полимеров класса N-вияиламидов способность образовывать комплексы с белковыми молекулами описана лишь для ПВК. Установлено, что взаимодействие молекул ПВК и белка происходит через молекулы воды, образующие водородные связи с участием амидных групп ПВК и функциональных групп на поверхности белка. Это позволяет сделать предположение, что именно количество звеньев ВК, содержащих амидную группу, имеет решающее значения для процесса комплексообразования с белками. Вероятно, этим объясняется тот факт, что наиболее эффективным стабилизатором для ферментов оказался ПВК. Предварительное введение ПВК в растворы тромбина существенно не влияло на сохранение свертывающей активности фермента, но позволяло значительно увеличить сохранение амидазной активности с 11% до 45% при лиофильном высушивании тромбина. Введение ПВК в растворы КПВ позволяло сохранить практически 100% активности фермента при лиофилизации.

Таким образом, добавление ПВК и сополимеров ВК (конц. 2-4%) в растворы лабильных протеаз (тромбин, КПВ) можно успешно использовать для их стабилизации как в водных растворах, так и при получении лиофильно высушенных ферментных препаратов.

2. Иммобилизация протеолитическпх ферментов/пептидов в композитный ПВК-СаА^

гидрогель

2.1. Получение граиул/пленок ПВК- СаА^ гидрогеля

Метод иммобилизации лабильных белков, в частности, ферментов, путем механического включения в полимерную матрицу привлекателен тем, что денатурирующее воздействие на белок при использовании этого метода минимально.

Следует отметить, что гидрогели с иммобилизованными в них протеазами можно получать как в виде гранул, так и в виде полимерных пленок, с учетом их дальнейшего использования. Гранулы с включенными протеазами могут найти применение в биотехнологии и медицине для различных целей, в частности, как биокатализаторы в химических реакциях; в процессе получения аффишшх сорбентов для очистки ингибиторов и рецепторов протеаз. Плеши с иммобилизованными в них протеолитическими ферментами, например, тромбином, трипсином, лизоцимом могут быть использованы для заживления ожоговых, резаных, гнойных ран.

В данной работе проводили иммобилизацию протеолитнческих ферментов в гранулы и пленки композитного ПВК-СаА1д геля. Для этого растворы ферментов вводили при комнатной температуре в полимерную смесь, содержащую ПВК, альгинат натрия, и ароматический сульфосодержащий полимер ПОЛАР-2. В случае получения магнитных гранул в эту смесь дополнительно вводили магнитный наполнитель. Смесь полимеров с ферментом либо вводили по каплям в 1% раствор СаСЬ для получения гранул (Рис. 1), либо помещали в чашку Петри, а затем добавляли 1% раствор СаСЬ для формирования пленок (Рис. 2). При этом раствор СаСЬ предварительно подогревали до 37°С. При данной температуре происходило термоосаждение ПВК с одновременным включением комплекса фермент-ПВК в сетку альгинатного геля, образующегося при замене ионов натрия на кальций в альгинате. ПОЛАР-2 был введен в полимерную матрицу для предотвращения диффузии комплекса ПВК-фермент из композитного гидрогеля после снижения температуры с 37°С до комнатной. Найденное в данной работе оптимальное соотношение ПВК/ПОЛАР-2 составляло 100/1 (масс.).

Осповиое преимущество данного метода по сравнению с традиционно используемыми заключается, прежде всего в том, что процесс включения ферментов в гидрогель происходит в физиологических условиях (температура и рН), что позволяет минимизировать потери ферментативной активности в процессе иммобилизации.

яре

тромбин

37 С

ПОЛЛР-2

СаСЬ

Пленки с тромбином

Рис. 1. Схема получения гранул Рис. 2. Схема получения пленок композитного ПВК-СаА^ гидрогеля с композитного ПВК-СаА^ гидрогеля с иммобилизованными ферментами. иммобилизованным тромбином.

2.2. Получение гранул композитного ПВК-CaAIg гидрогеля с иммобилизованными в них

протеолитичсскими ферментами

В данной работе были получены гранулы композитного ПВК-CaAIg геля (средний диаметр 550 ± 100 мкм) (Рис. 3) с иммобилизованными в них протеолитичсскими ферментами: трипсином, химотрипсином, КПВ и тромбином.

Придание носителям с иммобилизованными ферментами магнитных свойств путем введения магнитного материала в полимерную матрицу открывает дополнительные технологические преимущества для их использования в качестве биокатализаторов в различных биотехпологических процессах. В данной работе трипсин и КПВ иммобилизовали в гранулы композитного ПВК-CaAIg гидрогеля, содержащие два типа магнитного наполнителя: 1) суспензию свежеосажденного магнетита (РезОО; 2) полистирольные магнитовосприимчивые латексы (d=l мкм). При этом содержание магнитного наполнителя в полимерной матрице варьировали от 0 до 40% (масс). Полученные гранулы композитного ПВК-CaAIg гидрогеля с достаточно равномерно распределенными по объему полимерной матрицы частицами магнетита(Рис. 4) не обладали остаточной намагничешюстью, то есть ими можно было многократно манипулировать с помощью постоянного магнита (3-4 кЭ).

Разработанные новые магнитные полимерные носители для иммобилизации протеолитических ферментов позволяли существенно упростить технологию их получения и снизить потери ферментативной активности в процессе иммобилизации. Так, использование постоянного магнита в процессе получения магнитных гранул позволяло уменьшить потери

активности ферментов в среднем на 10-15% за счет снижения потери гранул при промывках в процессе иммобилизации. Относительная активность трипсина и КПВ в магнитных гранулах составляла, соответственно, не менее 82 и 70% от исходных, и практически не зависела от типа используемого магнитного наполнителя. Показано, что активность включенных в магнитные гранулы трипсина и КПВ не снижалась при хранении в течение б месяцев.

Рис. 3. Гранулы композитного ПВК-СаА^ Рис.4. Гранула композитного ПВК-СаА^ гидрогеля с иммобилизованным ферментом. гидрогеля с магнетитом.

Мы полагали, что композитный ПВК-СаА^ гидрогель можно использовать для иммобилизации нестабильных ферментов, в частности, тромбина, поскольку процесс протекает в физиологических условиях (температура и рН), что позволяет сохранять достаточно высокую ферментативную активность. Тромбин - неустойчивый фермент, полная инактивация которого происходит за 40-50 минут при комнатной температуре.

Отметим, что полученные результаты по сохранению амидазной активности тромбина, иммобилизованного в грапулы композитного ПВК-СаА^ гидрогеля лучше, чем описаны в литературе (Табл. 1).

Таблица 1.

Сохранение амидазной активности тромбина, иммобилизованного в гранулы композитного ПВК-СаА^ гидрогеля.

Срок хранения образцов*,сутки Амидазная активность иммобилизованного в гранулы тромбина, МЕ/мл гранул Относительная активность иммобилизованного тромбина**, %

0 0.60 17

10 0.42 12

30 0.66 18

* образцы хранились при температуре 20°С; ** за 100% принималась активность тромбина, взятого для иммобилизации (3.62 МЕ/мл).

Так, при ковалентной иммобилизации тромбина и его модифицированных форм на полиакриламидном носителе (Eupergit С) и на агарозе сохранялось не более 2-5%амидазной и свертывающей активностей

Таким образом, в данной работе были получены гранулы композитного ПВК-CaAlg гидрогеля с иммобилизованными в них протеолитическими ферментами: трипсином, химотрипсином, КПВ и тромбином. Максимальная активность иммобилизованных протеиназ достигала 82% от исходной (в случае трипсина), а сохранение ферментативной активности составляло не менее 6 мес., а в случае химотрипсина- не менее 12 месяцев.

2.3. Получение пленок композитного ПВК-CaAlg гидрогеля с иммобилизованными в

них тромбином/пептидами

Тромбин обладает рядом уникальных свойств, в частности, регулирует свертывающие и противосвертывающие механизмы и ангиогенез, является ростовым фактором; включается в воспалительную и пролиферативную фазы заживления ран, при этом стимулируя пролиферацию клеток эндотелия, фибробластов и Т-лимфоцитов, агрегацию клеток, продукцию коллагена. Это позволяет использовать его в медицине, в частности, для терапии ран. Однако применение тромбина ограничено из-за его высокой лабильности и провоспалительного эффекта, который может иметь место в случае использования высоких концентраций. В настоящее время известен только один препарат на основе тромбина, используемый в качестве гемостатического и ранозаживляющего средства - сиалант, или фибриновый клей (фирма Immuno, Austria). Препараты фибринового клея имеют высокую стоимость поэтому практически не используются в России. В литературе не описаны надежные и недорогие способы иммобилизации тромбина в полимерные пленки.

В данной работе были получены пленки композитного ПВК-CaAlg гидрогеля с иммобилизованным в них тромбином (Табл. 2). Для оценки эффективности иммобилизации приготовленные пленки разрушали и определяли амидазную активность тромбина. Видно, что метод позволяет сохранить до 51% активности тромбина при включении его в пленку. Несмотря на возможную инактивацию фермента как в процессе приготовления пленок, так и при последующем их разрушении, активность тромбина в полученных пленках достаточно высока. Кроме того, при хранении пленок в растворе при 37°С и в сухом состоянии (при 37° и 20°С) активность иммобилизованного фермента полностью сохранялась в течение как минимум б месяцев.

Таблица 2.

Сохранение активности тромбина, иммобилизованного в пленки ПВК-CaAlg гидрогеля.

Амидазная активность тромбина в полимерной смеси, взятой для приготовления пленок, МЕ Амидазная активность тромбина в разрушенных пленках*

Общая активность, ME Относительная активность, %

3236 1213,3 ± 80,8 (п=2) 37,5 ±2,5

1618 551,2 ± 71,5 (п=2) 34,1 ±4,4

667 309,0 ±49,0(п=2) 46,4 ±7,4

334 168,5 ± 91,5 (п=2) 50,6 ±4,4

♦Пленки разрушали через 2 ч после иммобилизации тромбина.

В некоторых случаях избежать возможных побочных эффектов тромбина, в частности, провоспалительного эффекта при использовании высоких концентраций, а также преодолеть трудности работы, вызванные быстрой инактивацией фермента, можно путем его замены пептидами. Кроме того, пептиды значительно дешевле тромбина и могут быть получены синтетическим путем. Поскольку действие тромбина на клетки реализуется через мембранные рецепторы семейства PAR (protease-activated receptor), использование пептидов-агоиистов рецепторов PAR (ag-PAR) дает возможность запускать каскад событий, связанных с процессом репарации ткани, минуя стадию протеолиза рецепторов тромбином.

Именно иммобилизация пептидов, во-первых, может позволить защитить их от разрушения пептидазами, которые присутствуют в ране, во-вторых, обеспечить постепенное освобождение пептида, то есть создать препарат пролонгированного действия. Метод ковалентной иммобилизации представляется нецелесообразным, принимая во внимание механизм действия ag-PAR. По нашему мнению, именно механическое включение в гидрогель может дать возможность получения эффективных препаратов с контролируемым освобождением пептидов-агонистов PAR.

В данной работе для включения в полимерные пленки использовали синтетические пептиды: 1) агонисты рецепторов тромбина (ag-PAR-1), а именно, TRAP-6 (SFLLRN) и ha-TRAP [YR(cyclohexylA)R(pFF)A]; 2) агонист рецептора трипсина (ag-PAR-2), имеющий аминокислотную последовательность SLIGKV. Пептиды иммобилизовали либо в пленки композитного ПВК-CaAlg гидрогеля, либо в пленки композитного ПВК-CaAlg гидрогеля, дополнительно покрытые полиэлектролитными мембранами из поли-Ь-лизина, альгината, хитозана. ,

Так как включить в пленки композитного ПВКСа-Alg гидрогеля низкомолекулярные пептиды по схеме, предложенной для тромбина (Рис.2) было невозможно, был разработан

новый метод с использованием целлюлозных мембран, пропитанных раствором 1% хлорида кальция и 0,1% резорцина. Резорцин образует с ПВК нерастворимый комплекс. Кроме того, он широко используется в медицине как антисептик. Создание на поверхности пленки композитного ПВК-CaAlg гидрогеля плотной оболочки (комплекс ПВК с резорцином) препятствовало мгновенному освобождению пептидов. Для конструирования полимерных покрытий с контролируемым освобождением пептида было предложено дополнительно покрывать ПВК-CaAlg пленки пояиэлекгролитными мембранами на основе поли-Ь-лизина, альгината, хитозана. Было показано, что кинетика освобождения пептида зависела от способа его введения в пленку: либо в смесь ПВК и альгината с последующим образованием композитного гидрогеля, либо сорбцией на поверхности геля непосредственно под полиэлекгролитной мембраной. Кинетику освобождения пептидов из пленок in vitro определяли с использованием метода ВЭЖХ.

Выбор альгината натрия (полианион), поли-Ь-лизина и хитозана (поликатионы), был обусловлен как их биодеградируемостью и биосовместимостью, так и широким использованием в медицине для создания покрытий для ран, а также различных препаратов с кон тролируемым освобождением низкомолекулярных веществ.

Таким образом, в работе были получены пленки композитного ПВК-CaAlg гидрогеля с иммобилизованными в них тромбином и синтетическими пептидами ag-PAR-1 и ag-PAR-2.

3. Исследование свойств протсаз, иммобилизованных в гранулы композитного ПВК-

CaAlg гидрогеля

Исследование зависимости активности химотрипсина от рН среды показало, что оптимум рН для нативного и иммобилизованного фермента совпадают (рН 8,0), однако, как и ожидалось, иммобилизованный химотрипсин активен в более широком диапазоне рН.

Известно, что термостабильпость ферментов может возрастать при иммобилизации. В работе было исследовано влияние температуры на активность и стабильность нативного и иммобилизованного в гранулы композитного ПВК-CaAlg гидрогеля химотрипсина. Оптимум активности иммобилизованного фермента смещался по сравнению с нативным ферментом с 37°С до 45° (Рис. 5). Иммобилизованный фермент сохранял активность даже при 60°С, в то время как нативный полностью инактивировался при этой температуре. Величина Km для иммобилизованного химотрипсина практически не менялась с увеличением температуры с 37 до 58°С, а изменение активности иммобилизованного фермента было связано с уменьшением У шах (табл. 3). Иммобилизация приводила к росту термостабильности фермента приблизительно на 15-20°С. Иммобилизованный в гранулы гидрогеля химотрипсин сохранял

38% активности даже после инкубации в течение 1 ч при 70°С, в то время как нативный фермент полностью инактивировапся уже при 55°С (Рис. 6).

«г

? е

29 38

Температура, "С

44 52

•v-

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Температура, °С

- Иммобилизованный химотрипсин

- Нативный химотрипсин

- Иммобилизованный химотрипсин

- Нативный химотрипсин

Рис. 5. Влияние температуры на активность Рис. 6. Термостабильность нативного и нативного и иммобилизованного химотрипсина. иммобилизованного химотрипсина. Активность фермента измеряли при Фермент инкубировали в течение часа при соответствующей температуре. соответствующей температуре, затем измеряли

активность при комнатной температуре. За 100% принимали максимальную активность фермента.

Таблица 3.

Кинетические параметры нативного и иммобилизованного в гранулы ПВК-СаА^ гидрогеля химотрипсина при различных температурах.

1, °с Нативный химотрипсин Иммобилизованный химотрипсин

ка,м V,™, М з1 Утэх 1Кт, Э \,тах, М-я"1 Утах 3

24 9,09-10"4 2,79-Ю-7 3,07 10"4 2,22-КГ4 8.3810"8 3,77-Ю-4

30 1,02-10"3 4,79-10"7 ^ОТО"* 2,86-10"4 1,38-Ю"8 4,8-Ю'4

37 2,83-10'3 6,20-10"7 2,19-Ю"4 3,36-Ю-4 2,48-10"7 7,3 8-10"4

41 3,0Н0"3 1,19 10"6 3,40 104 3,70-Ю4 2,16-Ю"7 5,84-Ю"4

58 - - - 3,73'Ю"4 1,44-Ю-7 3,86-10"4

Примечание: Условия реакции: рН 8.0; 0.1 М СаСЬ; субстрат АТЕБ.

Вероятно, увеличение термостабильности иммобилизованных ферментов по сравнению со свободными можно объяснить двумя причинами. Во-первых, включение в сетку ПВК-СаА^, как и любого геля, приводило к ограничению конформационной подвижности белковой молекулы, а, следовательно, ее стабилизации. Во-вторых, вода, связанная с полимерными цепями ПВК, обеспечивала сохранение водного окружения молекул фермента.

Хотя при повышении температуры наблюдалось частичное вытеснение воды из полимерных глобул, можно предположить, что оставшихся молекул воды было достаточно, чтобы обеспечить каталитическую активность фермента.

Существует концепция, что инактивации фермента под действием температуры или органического растворителя протекает по одному и тому же механизму. Это позволило нам предположить, что наблюдаемая термостабшшзация ферментов при включении их в полимерный ПВК-СаА^ гидрогель может сопровождаться увеличением устойчивости к другим денатурирующим агентам, в частности, к органическим растворителям. В данной работе было изучено влияние полярных органических растворителей на активность нативных и иммобилизованных трипсина и химотрипсина. Для этого были выбраны диметилформамид (ДМФА) и ацетонитрил, отличающиеся по их способности к реализации сольвофобных (гидрофобных) взаимодействий, и, соответственно, воздействию на фермент. Выбор этих растворителей был обоснован также их широким использованием в реакциях, катализируемых протеазами.

Известно, что как ДМФА, так и ацетонитрил не являются "благоприятными" растворителями дм протеаз, в частности, трипсина и химотрипсина. Действительно, наблюдали резкое падение активности нативного трипсина в интервале концентраций 40-50% (об.) ДМФА в воде, а далее - полную потерю активности фермента (Рис.7). Влияние органического растворителя на иммобилизованный фермент было выражено гораздо слабее. Преимущества иммобилизованного фермента перед нативным особенно проявлялись в средах, содержащих более 50% (об.) органического растворителя. Так, иммобилизованный трипсин сохранял 30% от исходной активности даже при 85% (об.) ДМФА, тогда как нативный фермент полностью инактивировался уже при 50% (об.) ДМФА (Рис.7). При концентрациях ацетонитрила больше 50% (об.) активность иммобилизованных трипсина и химотрипсина мало отличалась от их активности в воде, в то время как активность нативных протеаз резко падала (Рис.8).

Величины каталитической эффективности (УАт) для нативного и иммобилизованного фермента также уменьшались с увеличением концентрации ДМФА (Табл. 4). Однако, если величина ка1/Кт для нативного трипсина при концентрации ДМФА 50% (об.) достигала 0, то для иммобилизованного фермента эта величина, уменьшаясь в интервале 40-50% (об.) оргапического растворителя в воде, затем оставалась практически неизменной до 90% (об.) ДМФА в воде. Это падение каталитической эффективности для иммобилизованного фермента существенно ниже, чем в случае нативного трипсина.

- Нативный трипсин

- Иммобилизованный трипсин

О 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Содержание ДМФА, %

-Иммобилизованный химотрипсин

- Нативный химотрипсин

- Иммобилизованный трипсин

- Нативный трипсин

^ 140

ё 120

з I "»

Е2 л»

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Содержание ацетонитрила, %

Рис. 7. Зависимость активности нативного Рис. 8. Зависимость активности пативных и и иммобилизованного трипсина от иммобилизованных протеаз от концентрации концентрации ДМФА. ацетонитрила.

Таблица 4.

Кинетические параметры нативного и иммобилизованного в гранулы композитного ПВК-СаА^ гидрогеля трипсина в среде вода-ДМФА.

Конц. ДМФА, % об. Нативный трипсин Иммобилизованный трипсин

АГИ, М ^саЬ 3 АсаД"т, М'1 з'1 гь* М кс&з з А=а/Кт, М'1 в"'

0 1.4-10"5 22.0 1.57-106 1.16-10'5 19.12 1.65-106

10 4.3-10'5 62.83 1.46-106 1.47-10'5 9.54 6.49-! О5

25 3.3-10'5 38.0 1.15-106 2.86-10'5 4.38 1.53-105

40 8.7-Ю-4 1.11 1.3 0-Ю3 3.33-10"5 1.86 5.59-104

50 0.1 - - 7.69-10"5 0.92 1.23-104

70 - - - 1.0-104 1.09 1.09-104

90 - - - 2.13-10"4 2.20 1.03-104

Таким образом, показано, что иммобилизованные в гранулы композитного гидрогеля протеазы сохраняют каталитическую активность в средах с высоким содержанием органического растворителя.

Далее было изучено поведение иммобшшзоваппых протеаз (па примере химотрипсина) в смесях ацетонитрил/вода с содержанием воды >20% (об.) Уменьшение количества воды от 20 до 8,9% (об.) незначительно влияло на ферментативную активность. Даже в среде с содсржапием воды лишь 0,5% (об.) химотрипсин сохранял 40% от исходной активности в воде (Рис. 9).

Чтобы оценить операционную стабильность иммобилизованного фермента в процессе многократного использования, гранулы с включенным химотрипсином инкубировали при

перемешивании в смеси вода-ацетонитрил (12,3 % об. воды) в течение 3-х циклов по 90 часов каждый при 25°С. После каждого цикла определяли активность фермента (рис. 10). Даже после 270 часов, эстеразная активность фермента составляла 30, а амидазная - 47% от начальной активности в воде. Интересно, что эстеразная активность уменьшилась более значительно, чем амидазная. Как известно, лимитирующая стадия гидролиза эфирного субстрата - это распад комплекса ацил-фермент. Для гидролиза амидного субстрата лимитирующей является стадия образования ацил-фермента. Вероятно, в данном случае ацетонитрил воздействует в большей степени на стадию распада ацил-фермента, чем на его образование.

Известно, что стабилизация белка происходит благодаря уменьшению копформационной подвижности его молекул. Кроме того, сохранение локального водного окружения, также чрезвычайно важно для поддержания каталитически активной конформации белковой молекулы в среде органического растворителя. Вероятно, наблюдаемая в данном случае стабилизация фермента, как и описанная выше термостабилизация, при включении белковых молекул в сетку ПВК-СаА^ гидрогеля, обеспечивается соблюдением двух этих условий.

я к

20,0 8,9 0,5

Содержание воды, %

180 270

Время, часы

Ш Амидазная активность □ Эстеразная акивность

Рис. 9. Зависимость эстеразной активности Рис. 10. Операционная стабильность иммобилизованного химотрипсина от иммобилизованного химотрипсина в смеси содержания воды в смеси ацетонитрил-вода. ацетошприл-вода (содержание воды 12,3% об.).

За 100% принимали активность иммобилизованного фермента в воде.

Таким образом, включение в полимерный композитный ПВК-СаА^ гидрогель способствует сохранению каталитической активности ферментов, предохраняя их от инакгивируклцего воздействия органических растворителей, и, следовательно, позволяет использовать ферменты как биокатализаторы в реакциях, протекающих в различных

органических средах, особенно с высоким содержанием органического растворителя (> 80% об.).

4. Применение иммобилизованных в композитный ПВК-СаА^ гидрогель протсолитнческнх ферментов/пептидов 4.1. Использование гранул с иммобилизованным химотрипсипом в водио-оргапипеской среде в качестве биокатализатора в реакции получения эмантиомсров фенилалашша

Возможность многократного использования гранул композитного ПВК-СаА1$ гидрогеля с иммобилизованным химотрипсином в водно-органической среде была продемонстрирована в реакции энантиоселективного гидролиза рацемического субстрата (Рис.11). Работа выполнена совместно с ИНЕОС РАН.

У» .»Л« ♦

I СН^Ь -ПЧ) Д

п ^ - н 012РЬ

Основание Шпффа этилового р ^р^с-ОЕ!

Эфира О, ЫРЬе

химотрипсин

Основание Шиффа этилового Эфира И-РЬе

+ ЕЮН

Ь-РЬе (ОСАДОК)

Рис. 11. Схема катализируемого иммобилизованным химотрипсином энантиомерного гидролиза основания Шиффа этилового эфира Б.Ь-РЬе в среде ацетонитрил-вода (20% об. НгО).

В данной работе в качестве субстрата использовали основание Шиффа этилового эфира Б.Ь-РЬе. Поскольку данное соединение нерастворимо в воде, но растворяется в полярных органических растворителях, реакцию проводили в смеси ацетонитрил-вода (20% об. Иг О). Такое количество воды обеспечивало как высокую растворимость исходного основания Шиффа, так и низкую растворимость продукта реакции- Ь-РЬе, что существенно упрощало процесс его выделения из реакционной смеси. Ь-РЬе удаляли в виде осадка вместе с гранулами биокатализатора, а затем промывали раствором аммиака для растворения аминокислоты. Гранулы с иммобилизованным химотрипсином после промывки водой

использовались в последующих циклах реакции. Реакция проводилась в течение не менее трех циклов (144,168 и 192 ч) при комнатной температуре (Табл. 5).

Таблица 5.

Получение оптически чистого фенилаланяна в реакции, катализируемой химотрипсином, иммобилизованным в гранулы композитного ПВК-СаА^ гидрогеля.

Цикл Количество основания Шиффа этилового эфира D,L-Phe, мг Время цикла, ч Выход L-Phe, % Оптическая чистота L-Phe, % Оптическая чистота D-Phe, %

I 100 144 40 80,9 40,6

II 75 168 90 87,8 87,3

Примечание: в 1 г гранул содержится 0.15 мг хнмогрипсина

Из представленых в Табл. 5 результатов реакции видно, что иммобилизованный в гранулы композитного ПВК-CaAlg гидрогеля химотрипсин эффективно и селективно гидролизовал L-форму основания Шиффа этилового эфира Phe с образованием L-Phe. Максимальным выход L-Phe составил 90%, оптическая чистота - 80,9%, 87,8% и 81,5% в каждом из трех циклов, соответственно. Из D-формы основания Шиффа, которая оставалась в реакционной смеси, затем получали D-Phe (оптическая чистота до 87,3%).Таким образом, было показано, что протеазы иммобилизованные в гранулы композитного ПВК-CaAlg гидрогеля, могут применяться как эффективные биокатализаторы многократного использования в различных реакциях, протекающих в водно-органических средах.

4.2. Исследование возможности применения пленок композитного ПВК-CaAlg гидрогеля с иммобилизованными тромбином/пеатндами дла зажинлеияа pan

Для изучения возможности использования полимерных пленок с иммобилизованным тромбипом/пептидами в качестве эффективных покрытий для заживления ран были проведены эксперименты гп vivo (совместно с Кафедрой физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ). Для этого пленки с тромбином/пептидами апплицировали группе опытных животных на полнослойную рану размером 2*3 см2 (для крыс) и 1*1 см2 (для мышей) непосредственно после ранения. Контрольная группа животных имела рану, закрытую полимерной пленкой без тромбина/пептидов. Степень заживления ран определяли

• по изменению площади раны;

• с помощью гистологических исследований образцов грануляционной ткани, взятых из раны на третий и седьмой дни после ранения.

Процесс репарации тканей и, в частости, заживления ран, включает три фазы: воспаление, пролиферацию и созревание грануляционной ткани. Фаза воспаления, которая обычно длится около трех дней, характеризуется присутствием большого количества макрофагов и других клеток, принимающих участие в остром адаптивном ответе организма в ране. Для фазы пролиферации характерно резкое увеличение количества пролиферирующих фибробластов, продуцирующих коллаген и другие структурные компоненты, участвующие в процессе репарации ткани, а также образование сосудов в грануляционной ткани (ангиогенез). Фибробласты можно наблюдать в ране уже на третий день после ранения; однако, на седьмой день их количество достигает максимального значения.

Исследование динамики заживления показало, что скорость уменьшения размера ран у крыс опытной группы, которым апплицировали гидрогелевые пленки с тромбином, была выше, чем у животных контрольной группы. На Рис. 12 и 13 показано влияние пленок композитного ПВК-СаА^ гидрогеля с иммобилизованным тромбином на общее количество фибробластов и количество пролиферирующих фибробластов; число микрососудов и число микрососудов, содержащих пролиферирующие клетки (меченные [3Н]тимидином) в образцах грануляционной ткани.

вд я

§ 15

В " г §

1 •§

ь. «

1 й 1

№ _О <1 Л ~1а

3-й 7-й 3-й 7-й Дни после ранения

га

а « 15

Я Й

° о.

и г?

О V

а е;

* 8

о .р

0,5 0

3-Й 7-Й 3-Й 7-Й Дни после ранения

Рис. 12. Влияние пленок композитного Рис. 13. Влияние пленок композитного ПВК-ПВК-СаА^ гидрогеля с иммобилизованным СаА^ гидрогеля с иммобилизованным тромбином (В) на общее количество тромбином (Я) на общее количество сосудов фибробластов (А) и количество (А) и количество сосудов, меченных пролиферирующих фибробластов (Б). [3Н]тимидином (Б).

Контроль - пленка без тромбина (□).

Отметим, что количество пролиферирующих фибробластов у опытной группы животных уменьшалось на 75% от третьего к седьмому дню после ранения; в то же время у контрольных животных этот показатель все еще увеличивался на седьмой день после ранения (Рис. 12). Это может свидетельствовать о сокращении стадии пролиферации у опытных животных и, соответственно, об ускорении заживления раны. Увеличение числа микрососудов позволяет

предположить, что тромбин, включенный в полимерные композитные ПВК-СаА^ пленки, стимулировал процесс заживления, ускоряя неоваскуляризацию (Рис. 13).

Таким образом, использование пленок ПВК-СаА^ гидрогеля с иммобилизованным тромбином, позволило ускорить процесс репарации тканей у крыс в среднем на 3-4 дня. Пептиды а£-РАЛ-1 (ТКАР-6) и а§-РАК-2, иммобилизованные в пленки композитного ПВК-СаА^ гидрогеля, также, как и тромбин, ускоряют заживление ран. Так, размер ран у мышей к седьмому дшо после нанесения ран уменьшался, соответственно, на 83 и 57% под пленками с иммобилизованными ag-PAR-l (ТИАР-б) и ag-PAR-2 (Рис.14). Для контрольных животных (рана, покрытая пленкой без пептида/тромбина) эта величина составляла только 37%. Эффект ag-PAR-l (ТЯАР-6) был выражен даже ярче, чем действие тромбина. На 7-й день после ранения площадь раны под пленкой композитного ПВК-СаА^ гидрогеля с включенным ТКАР-6 была в 2,0 - 2,4 раза меньше, чем под пленками с тромбином и в 3,7 раз меньше, чем у контрольных животных.

120

0? та о4- 100

X »о аГ 80-

4) еЗ Си

{к л 60

8 р «3 э о 40

о ч а 20

В Тромбин (10 №Н)

□ Тромбин (3.5 МН) В Агонист РАЯ-2

□ таАР-б (Агонист РА1М)

0 Контроль(пленка без тромбина/пептида)

3-й 7-й

Дни после ранения

Рис. 14. Изменение размера ран под плешами композитного ПВК-СаА^ гидрогеля с иммобилизованными тромбином/пептидами а§-РАР^ За 100% принимали начальную площадь раны.

Анализ проб грануляционной ткани на 3-й и 7-й дни после нанесения раны в опытах с пленками, содержащими тромбин, а также пептиды а§-РАЯ-1 и а§-РАЯ-2, выявил повышение общего числа микрососудов, пролиферирующих клеток и соотношения фибробласты/макрофаги у опытных животных по сравнению с контрольными. Самые высокие показатели заживления также были определены в образцах, взятых из ран под пленками с а§-РАЛ-1 на 7-й день после ранения (Табл.6).

Поскольку наиболее выраженное действие на процесс ранозаживления оказывал ТЯАР-6, в следующей серии экспериментов использовали пленки композитного ПВК-СаА^ гидрогеля, покрытые поли-Ь-лизином или хитозаном, с включенными пептидами ag-PAR-l (ТКАР-6 и Ьа-ТИАР). Ьа-ТИАР имеет более высокое, чем ТКАР-6 сродство к РАЯ-1. Видно, что на 3-й и на 7-й дни после ранения все параметры заживления у опытных животных, которым

апплицировали пленки с ТКАР-6, были лучше, чем у контрольных, имеющих полимерные пленки без пептида (Табл. 7). Уже к третьему дню наименьший размер имели раны под пленкой с ТЯАР-б, покрытой хитозаном.

Таблица 6.

Влияние пленок композитного ПВК-СаА1§ гидрогеля с иммобилизованными тромбином/пептидами ад-РАК на количество клеток, меченных [!Н]-тимидином, в образцах грануляционной ткани.

Пленки с иммобилизованными: Соотношение фибробласты/ макрофаги Количество клеток/поле зрения

фибробластов эпителиальных эндотслиальных

Седьмые сутки после ранения

Тромбином 10 МЕ 3,71 3 19 1,3

Тромбином 3,5 МЕ 0,65 1,8 12,7 0,9

ад-РАЫ-1 (ТИАР-6) 5,79 2,8 20 1,8

а§-РАЯ-2 Контроль (полимерная пленка без тромбина/пептидов) 0,72 1,03 2,3 10,1 1,4

2,5 13,4 1

Таблица 7.

Влияние пленок композитного ПВК-СаА^ гидрогеля с иммобилизованным ТЛАР-6 на заживление ран.

Параметры ранозаживления ПВК-СаА^ пленки ПВК-СаА^ пленки покрытые поли-Ь-лизи1юм ПВК-СаА^ пленки покрытые хитозаном

ТЯАР-б Контроль* | ТКЛР-6 Контроль* ТЯАР-б Контроль*

Третьи сутки после ранения

Относительный размер ран*, % 96.1 113.0 93.6 77.0 64.6 79.3

Соотношение фнбробласты/макрофаги 0.33 1.69 0.75 0.31 0.78 0.35

седьмые сутки после ранения

Относительный размер ран**, % 17.1 63.1 24.9 31.2 16.2 26.2

Соотношение фибробласты/макрофаги 5.79 1.03 7.85 1.75 5.9 1.63

• Контроль - полимерная пленка без пептида; ** За 100% принимали начальный размер

ран.

Эффективность действия иммобилизованного Ьа-ТЛАР была несколько выше, чем ТЯАР-6. Так, к седьмому дню после ранения площадь раны у животных с ашшицированными пленками, содержащими Ьа-ТЯАР, уменьшилась на 90%; у животных, имеющих пленку с ТЛАР-б - на 84%.

Таким образом, показано, что использование иммобилизованных в пленки композитного ПВК-СаА^ гидрогеля тромбина или синтетических пептидов ая-РАК-1 и Эй-РАЛ-г ускоряет заживление ран. Мы полагаем, что на основе полученных пленок композитного ПВК-СаА^ гидрогеля с иммобилизованными в них синтетическими пептидами могут быть создапы новые эффективные покрытия для лечения ран.

ВЫВОДЫ:

1. Получены гранулы композитного ПВК-СаА^ гидрогеля (в том числе с магнитным наполнителем) с иммобилизованными в ни протеолитическими ферментами (трипсином, химотрипсином, карбоксипептидазой В н тромбином). Активность иммобилизованных протеиназ составляла 50-85% от исходной, а сохранение ферментативной активности - не менее 6 мес.

2. Исследованы некоторые свойства химотрипсина, иммобилизованного в гранулы композитного ПВК-СаА^ гидрогеля, в частности, рН- и температурная зависимости, термостабильность и устойчивость в различных водно-органических средах. Впервые для иммобилизованных в гранулы композитного ПВК-СаА^ гидрогеля трипсина и химотрипсина, определены кинетические параметры ферментативных реакций при различных температурах и концентрациях органического растворителя.

3. Показано, что гранулы композитного ПВК-СаА^ гидрогеля с включенным протеазами, могут быть предложены в качестве биокатализаторов в реакциях, протекающих в водно-органических средах. Химотрипсин иммобилизованный в гранулы гидрогеля успешно использовали в среде ацетонитрил-вода для получения энантиомсров фенилаланина с оптической чистотой до 87%.

4. Разработан новый метод иммобилизации тромбина в полимерные пленки ПВК-СаА^ гидрогеля, позволяющий сохранить до 50% исходной фермента.

5. Разработан новый способ иммобилизации пептидов, в частности пептидов-апшиетов рецепторов тромбина ^-РАБЫ) и трипсина ^-РА11-2), в пленки композитного ПВК-СаА^ гидрогеля.

6 Изучен эффект полимерных пленок с включенными тромбином/пептидами на процесс

репарации ткани в экспериментах in vivo. Показано, что эти полимерные покрытия ускоряют

ранозаживление.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. E.A.Markvicheva, N.E. Tkachuk, S.Y. Kuptsova, T.N. Dugina, S.M. Strukova, Yu.E. Kirsh, V.P. Zubov, L.D. Rumsh, Stabilization of proteases by entrapment in a new composite hydrogel, Appl. Biochem. Biotechnol., 1996, V.61, N1-2, pp. 75-84.

2. E. Markvicheva, T. Dugina, S. Kuptsova, S. Strukova, E. Kolokolchikova, I. Chekmareva, L. Rumsh, V. Zubov , and D. Poncelet Bioencapsuleted thrombin as controlled delivery device for wound healing, V International Workshop Bioencapsulation (Potsdam, Germany, 23-25 September, 1996), Abstracts, talk 22.

3. S.V. Kuptsova, A.N. Buryakov, E.A. Markvicheva, V.G. Babak, E.A. Varlamova, G.A. Vikhoreva, M.M. Bodorov, L.D. Rumsh, New magnetic polymer supports for enzymes immobilization. 7th International Conference on Magnetic Liquids (Plyos, Russia, September, 10-12,1996), Abstracts, p. 132-133.

4. Струкова C.M., Душна T.P., Марквичева E.A., Купцова С.В., Колокольчикова Е.Г., Чекмарева И.В., Пянелис В.Г., Румш Л.Д., Зубов В.П. Тромбин - регулятор ранозаживления, IV Симпозиум "Химия протеолитических ферментов" (Москва, Россия, 21-23 Апреля, 1997), Тезисы, с.20.

5. Ткачук Н.Е., Марквичева Е.А., Купцова С.В., Румш Л.Д. Свойства трипсина и карбоксипептидазы В иммобилизованных в гранулы композитного полимерного геля на основе поли-Ы-винилкапролактама, Четвертый Симпозиум "Химия протеолитических ферментов" (Москва, Россия, 21-23 Апреля, 1997), Тезисы, с. 153.

6. S.V. Kuptsova, N.E. Tkachuk, E.A. Markvicheva, L.D. Rumsh, V.P. Zubov, K.A. Kochetkov, Yu.N. Belokon'. Stabilization of the proteases by means of entrapment into poly(N-vinyl caprolactam) gels: utilization in water-organic media, Second Congress of Biochemical Society of Russian Academy of Sciences (Moscow, Russia, 19-23 May, 1997), Abstracts, p.512-513.

7. E.A. Марквичева, C.B. Купцова, H.E. Ткачук, A.A. Вихров, Т.Ю. Мареева, Т.Н. Дугина, C.M. Струкова, Л.Д. Румш Новые методы иммобилизации ферментов и живых клеток и их использование в биотехнологии и медицине, III Международная конференция "Новые информационные технологии в медицине и экологии (Ялта-Гурзуф, Украина, 4-13 мая 1997), Тезисы, с.157.

8. Kuptsova S.V., Markvicheva E.A., Tkachuk N.E., Dugina T.N., Strukova S.M., Babak V.G., Varlamova E.A., Rumsh L.D. and Zubov V.P. Stabilization of proteases by entrapment in composite hydrogels based on poly(N-vinyl caprolaetam), в111 European Congress on Biotechnology (Budapest, Hungary, 17-21 August, 1997), Abstracts, p. 380.

9. E. Shestakova, B. Umarova, T. Dugina, E. Markvicheva, S. Kuptsova, S. Strukova, The effect of encapsulated thrombin on the mast cell heparin secretion at wound healing, Int. Workshop on Bioencapsulation VI (Barcelona, Spain, August 30-September 1,1997), Abstracts, Poster 21.

10. C.B. Купцова, E.A. Марквичева, H.E. Ткачук, JI.Д. Румш, К.А. Кочетков, Ю.Н. Белоконь, В.П. Зубов Иммобилизованные ферменты - биокатализаторы энантоиселективных реакций в водно-органических средах, XVI Менделеевский съезд по общей и прикладной химии (С.-Петербург, Россия, 24-28 мая 1998, Тезисы, г.4, с.92.

11. Yu.N. Belokoti, К.A. Kochetkov, V.I. Lozinsky, F.M. Plieva, N.S. Ikonnikov, V.I. Maleev, V.P. Zubov, E.A. Markvicheva, S.V. Kuptsova, V.S. Parmar Enantioselective hydrolysis of a Schiff s base ofD.L-phenylalanine ethyl ester in water-poor media through the reaction catalyzed with a-chymotrypsin immobilized within hydrophilic gel supports, International Conference "Biocatalysis - 98: Fundamentals & Applications" (Pushchino on the Oka, Russia, June 13-18, 1998), Abstracts, p.27.

12. C.M. Струкова, Т.Н. Дугина, И.В. Чистов, Е.А. Марквичева, С.В. Купцова, Е.Г. Колокольчикова, Л.Д. Румш, В.П. Зубов, Э. Глуза Тромбин - регулятор репаративных процессов при заживлении ран, Биоорганическая химия, 1998, том 24, №.4, с.288-292.

13. S. Strukova, Т. Dugina, В. Umarova, I. Chistov, Е. Markvicheva, S. Kuptsova, Б. Kolokolchikova, L. Rumsh, V,Pinelis, E.Glusa. Thrombin invokes tissue remodelling and contributes to wound healing. Cardiovascular Pathology, 1998, v.6, p.271.

14. E.A. Марквичева, C.B. Купцова, Т.Н. Дугина, C.M. Струкова, В.П. Зубов, Л.Д. Румш. Разработка новых полимерных покрытий с контролируемым освобождением иммобилизованных в них белков и пептидов крови для терапии ран. II Международный семинар РФФИ "Результаты фундаментальных исследований в медицине и биотехпологии для инвестиций" (Москва, 1-3 декабря 1998 г.), Тезисы, с.50-51.

15. Markvicheva Е.А., T.N. Dugina, S.V. Kuptsova, I.V. Chistov, M.A. Lange, V.P. Zubov, and S.M. Strukova, Development of novel polymer dressings with immobilized blood proteins and peptides for wound healing, INTAS Symposium "Microbial and Cellular Systems for Pharmacology, Biotechnology, Medicine and Environment" (Moscow, Russia, 26-30 May, 1999), Abstracts of papers, pp.43-44.

16. S. Kuptsova, E. Markvicheva, K. Kochetkov, Yu. Belokon, L. Rumsh and V. Zubov, Proteases entrapped in hydrogels based on poly(N-vinyl caprolactam) as promising biocatalysts in water-

organic systems, 9th European Congress on Biotechnology (Brussels, Belgium, 11-15 July, 1999), Abstracts, ECB/2795.

17. E.A. Markvicheva, T.N. Dugina, S.Y. Kuptsova, I.V. Chistov, M.A. Lange, L.D. Rumsh, and S.M. Strukova, Development of protein/peptide delivery systems for wound healing, 12th International Symposium on Microencapsulation (London, UK, 6-8 September, 1999), Abstracts, p.92.

18. S. Kuptsova, E. Markvicheva, D. Pavlov, K_ Kochetkov, Yu. Belokon, L. Rumsh and V. Zubov, Proteases entrapped in hydrogels based on poly(N-vinyl caprolactam) as promising biocatalysts in water-organic systems, Sft International Workshop on Bioencapsulation, (Trondheim, Norway, 13-15 September, 1999), Abstracts, 0-8.

19. C.B. Купцова. Синтетические пептиды, иммобилизованные в полимерные гидрогелевые пленки, для репарации тканей, Школа-конференция "Горизонты физико-химической биологии", (Пущино, 28 мая-2 июня 2000г.), тезисы, т. 1, с.89.

20. Е. Markvicheva, S. Kuptsova, A. Buryakov, Т. Dugina, S. Strukova, E. Varlamova, V.Babak, L. Rumsh Proteases entrapped in polymer composite hydrogels: preparation methods and applications, International Conference "Biocatalysis 2000: Fundamentals & Applications " (Moscow, Russia, June 10-15,2000), Abstracts, p.41.

21. S. Kuptsova, E. Markvicheva, T. Dugina, I. Chistov, S. Strukova, and V.P. Zubov. Bioencapsulated thrombin and peptides for wound healing, 18th In ternational Congress of Biochemistry and Molecular Biology "Beyond the Genome" (Birmingham, UK, 16-20 July, 2000), Abstracts, p.349.

22. S. Kuptsova, E. Markvicheva, K. Kochetkov, Yu. Belokon, L. Rumsh and V. Zubov, "Proteases entrapped in composite hydrogels based on poly(N-vinyl caprolactam): preparation, properties and application as promising biocatalysts in water/organic media", 11th International Biotechnology Symposium "Biotechnology 2000", (Berlin, Germany, 3-8 September, 2000), Abstracts, p.500.

23. S. Kuptsova, E. Markvicheva, K. Kochetkov, Yu. Belokon, L. Rumsh and V. Zubov, Proteases entrapped in hydrogels based on poly(N-vinyl caprolactam) as promising biocatalysts in water/organic systems, Biocatalysis Biotransformations, 2000, v. 18, pp.133-149.

24. E.A. Markvicheva, S.V. Kuptsova, T.Yu. Mareeva, A.A. Vikhrov, T.N. Dugina, S.M. Strukova, Yu.N. Belokon, K.A. Kochetkov, E.N. Baranova, D. Poncelet, V.S. Parmar, R. Kumar, V.P. Zubov, and L.D. Rumsh Immobilized enzymes and cells in poly(N-vinyl caprolactam)-based hydrogels: preparation, properties and applications in biotechnology and medicine, Appl. Biochem. Bioteclinol., 2000, V.88,№l-3,pp. 145-157.

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Купцова, Светлана Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Полимеры, чувствительные к изменению внешнего сигнала.

1.2. Полимерные гели на основе термочувствительных полимеров.

1.2.1. Фазовый переход в термочувствительных полимерных системах.

1.2.2. Влияние состава и строения полимерного геля на критическую температуру и набухание.

1.2.3. Особенности термочувствительных полимеров класса 14-виниламидов.

1.3. Применение термочувствительных полимеров и гелей на их основе в биотехнологии.

1.3.1. Использование термочувствительных свойств полимеров в хроматографии.

1.3.2. Использование термочувствительных гелей для концентрирования жидкостей.

1.3.3. Иммобилизация ферментов в матрицы на основе термочувствительных полимеров.

1.3.3.1. Получение конъюгатов ферментов с термочувствительными полимерами.

1.3.3.2. Иммобилизация ферментов в гелях термочувствительных полимеров.

1.3.3.3. Использование ферментов, иммобилизованных в гели на основе термочувствительных полимеров, в водно-органических средах.

1.4. Применение монокомпонентных и композитных гелей на основе термочувствительных полимеров в медицине.

1.4.1. Системы на основе термочувствительных полимеров для перорального введения.

1.4.2. Системы на основе термочувствительных полимеров для введения через слизистые.

1.4.3. Термочувствительные липидные системы.

1.4.4. Полимерные покрытия для заживления ран.

1.4.4.1. Тромбин и пептиды, обладающие тромбиноподобным действием, как пепрспективные средства для заживления ран.

2 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Получение стабильных препаратов ферментов лиофильным высушиванием в присутствии поли-14-виниламидов.

2.2. Иммобилизация протеолитических ферментов/пептидов в композитный ПВК-СаА^ гидрогель.

2.2.1. Получение гранул/пленок композитного ПВК-СаА^ гидрогеля.

2.2.1.1. Получение магнитных гранул композитного ПВК-СаА^ гидрогеля с иммобилизованными протеазами.

2.2.1.2. Получение гранул композитного ПВК-СаА^ гидрогеля с иммобилизованным в них тромбином.

2.2.2. Получение пленок композитного ПВК-СаА

§ гидрогеля иммобилизованными в них тромбином или пептидами.

2.2.2.1. Получение пленок композитного ПВК-СаА^ гидрогеля с иммобилизованным тромбином.

2.2.2.2. Получение пленок композитного геля ПВК-СаА^ с иммобилизованными в них пептидами.

2.3. Исследование свойств протеаз, иммобилизованных в гранулы композитного ПВК-СаА^ гидрогеля.

2.3.1. рН-зависимость для нативного и иммобилизованного химотрипсина.

2.3.2. Влияние температуры на активность нативного и иммобилизованного химотрипсина.

2.3.3. Изучение влияния органических растворителей на сохранение протеолитической активности нативного и иммобилизованного трипсина.

2.4. Использование иммобилизованных в композитный ПВК-СаА^ гидрогель протеолитических ферментов/пептидов.

2.4.1. Использование гранул с иммобилизованным химотрипсином в водно-органической среде в качестве биокатализатора в реакции получения энантиомеров фенилаланина.

2.4.2. Исследование возможности применения пленок композитного ПВК-СаА^ гидрогеля с иммобилизованными тромбином/пептидами как ранозаживляющих средств.

2.4.2.1. Использование пленок композитного ПВК-СаА^ гидрогеля с иммобилизованным тромбином для заживления ран.

2.4.2.2. Использование пленок композитного ПВК-СаА^ гидрогеля с иммобилизованными пептидами для заживления ран.

2.4.2.3. Использование покрытых поли-Ь-лизином и хитозаном пленок композитного ПВК-СаА^ гидрогеля с иммобилизованными пептидами для лечения ран.

3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1 Материалы

3.2 Методы исследования

4 ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение, свойства и применение композитных полимерных гидрогелей с иммобилизованными белками и пептидами"

Данная работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова в соответствии с планом НИР и отражает одно из направлений использования полимерных композитных материалов для биотехнологии и биомедицины.

Полимерные системы с иммобилизованными белками (ферментами, антителами) и пептидами находят все более широкое применение в биотехнологии и в различных областях медицины в качестве терапевтических средств для лечения местных и системных заболеваний [1;2], экстракорпоральной очистки биологических жидкостей [3], поверхностной обработки ран и ожогов [4], в клинических анализах [5]. Иммобилизованные ферменты успешно используются как биокатализаторы в различных областях тонкого органического синтеза, в частности, в синтезе олиго- и полинуклеотидов [6], олиго- и полисахаридов [7;8], олигопептидов [9; 10], для разделения рацемических смесей и получения энантиомеров [8;11;12], для регенерации кофакторов ферментативных реакций [13].

Известно, что нестабильность некоторых белков ограничивает их широкое использование. Иммобилизация позволяет успешно решать проблему стабилизации белков, в том числе ферментов, а также многократно их использовать. Однако общеизвестными методами не удается иммобилизовать некоторые лабильные ферменты, в частности, тромбин и карбоксипептидазу В. Поэтому создание новых материалов и на их основе методов для иммобилизации нестабильных белков, в частности, ферментов, является актуальной задачей.

В последнее время особый интерес исследователей вызывают так называемые «умные полимеры», которые способны изменять свои свойства или структуру в ответ на сигнал окружающей среды. При внешнем воздействии (рН, температура, химический 7 сигнал, электрическое поле и др.) микроструктура таких полимеров быстро и обратимо изменяется от гидрофильного до гидрофобного состояния [14]. Введение "умных" полимеров в состав композитных материалов позволяет получать полимерные системы с заданными свойствами. Особенно привлекательны водорастворимые полимеры, чувствительные к изменению температуры или рН в физиологическом интервале, поскольку их свойства идеально подходят для иммобилизации биологически активных веществ (ферментов, белков, пептидов, ДНК и др.).

Среди таких полимеров пристальный интерес привлекают термочувствительные полимеры класса поли-Ы-виниламидов, в частности, гомо- и сополимеры Ы-винилкапролактама, как модели природных полимеров с амидной группой, например, белков. Они находят широкое применение в медицине и биотехнологии, входят в состав лекарственных препаратов, на их основе готовят носители для биологически активных веществ, мембраны, сорбенты [15].

Как было показано ранее, один из представителей класса поли-Ы-виииламидов, а именно, ПВК, обладает способностью образовывать комплексы с белковыми молекулами, как в растворе при комнатной температуре, так и при термоосаждении при температуре 32-37°С [16].

Целью работы являлось создание композитных гидрогелей (в виде полимерных гранул и пленок) на основе синтетического термочувствительного полимера поли-ТЧ-винилкапролактама (ПВК) и альгината кальция (СаА^) с иммобилизованными в них белками, в частности, протеолитическими ферментами и пептидами; исследование свойств таких иммобилизованных систем и возможностей их применения в качестве биокатализаторов и для ускорения ранозаживления. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

• получить гранулы (в том числе магнитные) композитного ПВК-СаА^ гидрогеля с иммобилизованными в них протеолитическими ферментами; 9

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Купцова, Светлана Владимировна

4 ВЫВОДЫ:

1. Получены гранулы композитного ПВК-CaAlg гидрогеля (в том числе с магнитным наполнителем) с иммобилизованными в них протеолитическими ферментами (трипсином, химотрипсином, карбоксипептидазой В и тромбином). Активность иммобилизованных протеиназ составляла 50-85% от исходной, а сохранение ферментативной активности - не менее 6 мес.

2. Исследованы некоторые свойства химотрипсина, иммобилизованного в гранулы композитного ПВК-CaAlg гидрогеля, в частности, рН- и температурная зависимости, термостабильность и устойчивость в различных водно-органических средах. Впервые для иммобилизованных в гранулы композитного ПВК-CaAlg гидрогеля трипсина и химотрипсина, определены кинетические параметры ферментативных реакций при различных температурах и концентрациях органического растворителя.

3. Показано, что гранулы композитного ПВК-CaAlg гидрогеля с включенным протеазами, могут быть предложены в качестве биокатализаторов в реакциях, протекающих в водно-органических средах. Химотрипсин иммобилизованный в гранулы гидрогеля успешно использовали в среде ацетонитрил-вода для получения энантиомеров фенилаланина с оптической чистотой до 87%.

4. Разработан новый метод иммобилизации тромбина в полимерные пленки ПВК-CaAlg гидрогеля, позволяющий сохранить до 50% исходной фермента.

5. Разработан новый способ иммобилизации пептидов, в частности пептидов-агонистов рецепторов тромбина (ag-PAR-1) и трипсина (ag-PAR-2), в пленки композитного ПВК-CaAlg гидрогеля.

6 Изучен эффект полимерных пленок с включенными тромбином/пептидами на процесс репарации ткани в экспериментах in vivo. Показано, что эти полимерные покрытия ускоряют ранозаживление.

5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Автор выражает глубокую благодарность к.х.н. Марквичевой Е.А. за руководство работой и д.х.н., проф. Зубову В.П. за ценные научные консультации. Автор искренне признателен также д.х.н. Румшу Л. Д. за постоянную помощь в работе.

Автор выражает глубокую благодарность д.б.н., проф. Струковой C.B. и к.б.н. Дугиной Т.Н. за плодотворную и долговременную совместную работу по исследованию влияния пленок композитного ПВК-CaAlg гидрогеля с иммобилизованными тромбином/пептидами на заживление ран. Автор благодарит также к.х.н. Ланге за проведение гистологических исследований. Автор выражает особую признательность к.б.н. Дугиной Т.Н. за постоянную помощь и поддержку в работе и консультации при написании диссертации.

Автор искренне признателен д.х.н., проф. Белоконю Ю.Н. и к.х.н. Кочеткову К.А. за проведение совместной работы по использованию иммобилизованных в гранулы композитного ПВК-CaAlg гидрогеля ферментов в качестве биокатализаторов в реакциях в водно-органических средах.

Автор выражает глубокую благодарность к.х.н. Бурякову А.Н. за предоставленную возможность проведения экспериментов с магнитными носителями.

Автор благодарит также к.х.н. Сергеева Н.В. за помощь и консультации в исследовании кинетики десорбции пептидов из полимерных пленок. Автор искренне признателен м.н.с. Вихрову A.A. и н.с. Старковой H.H. за постоянную помощь и поддержку в работе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Купцова, Светлана Владимировна, Москва

1. Alvarez O.A., Zimmerman G. Pegaspargase-induced pancreatitis. // Med. Pediatr. Oncol., 2000, v. 34, p. 200-205.

2. Ameer GA., Harmon W., Sasisekharan R., Langer R. Investigation of a whole blood fluidized bed Taylor-Couette flow device for enzymatic heparin neutralization. // Biotechnol. Bioeng., 1999, v. 62, p. 602-608.

3. Ruiz S., Feliu J.A., Caminal G., Alvaro G., Lopez-Santin J. Reaction engineering for consecutive enzymatic reactions in peptide synthesis: application to the synthesis of a pentapeptide. // Biotechnol. Prog., 1997, v. 13, p. 783-787.

4. Levitsky V. Y., Lozano P., Iborra J.L. Kinetic analysis of deactivation of immobilized alpha-chymotrypsin by water-miscible organic solvent in kyotorphin synthesis. // Biotechnol. Bioeng., 1999, v. 65, p. 170-175.

5. Bossi A., Cretich M., Righetti P.G. Production of D-phenylglycine from racemic (D,L)-phenylglycine via isoelectrically-trapped penicillin G acylase. // Biotechnol. Bioeng., 1998, v. 60, p. 454-461.

6. Riva S., Bovara R., Pasta P., Carrea G. Oxidoreduction of steroids with immobilized hydroxysteroid dehydrogenases and cofactor regeneration. // Ann. NY Acad. Sci., 1988, v. 542, p. 413-416.

7. Galaev I.Y., and Mattiasson B. 'Smart' polymers and what they could do in biotechnologyand medicine // Trends Biotechnol., 1999, v. 17, p. 335-340.

8. Кирш Ю.Э. Поли-Ы-винилпирролидон и другие поли-Ы-виниламиды. М: Наука, 1998,252 с.

9. Шерстюк С.Ф., Галаев И.Ю., Савицкий А.П., Кирш Ю.Ф., Березин И.В. Поливинилкапролактам обратимо осаждаемый термополимер. Соосаждение белков // Биотехнология, 1987, т. 3, с. 179-183.106

10. Amiya T, and Tanaka T. Coil-globula transition in polymers. // Macromolecules, 1987, v. 20, p. 1162-1164.

11. Tanaka T. Collapse of gels and the critical endpoint. // Phys. Rev. Lett., 1978, v. 40, p. 820-823.

12. Nirokawa Y., Tanaka T. Volume phase transition in nonionic gel. // J. Chem. Phys., 1984, v. 81, p. 6379-6380.

13. Sawai T., Yamazaki S., Ikariyama Y., Aizawa M. pH-responsive swelling of the ultrafine microsphere. // Macromolecules, 1991, v. 24, p. 2117-2118.

14. Akala E.O., Kopeckova P. and Kopecek J. Novel pH-sensitive hydrogels with adjustable swelling kinetics. // Biomaterials, 1998, v. 19, p. 1037-1047.

15. Lee S.J., and Park K. Synthesis and characterization of sol-gel phase reversible hydrogels sensitive to glucose. // J. Molec. Recog., 1996, v. 9, p. 549-557.

16. Obaidat A.A., and Park K. Characterization of protein release through glucose-sensitive hydrogel membranes. // Biomaterials, 1997, v. 11, p. 801-806.

17. Kost J., Leong K. and Langer R. Ultrasound-enhanced polymer degradation and release of incorporated substances. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, v. 86, p. 7663-7666.

18. Kwon I.C., Bae Y.H. and Kim S.W. Electrically erodible polymer gel for controlled release of drugs. //Nature, 1991, v. 354, p. 291-293.

19. Yuk S.H., Cho S.H., Lee H.B. Electric current-sensitive drug delivery systems using sodium alginate/polyacrylic acid composites. // Pharm. Res., 1992, v. 9, p. 955-957.

20. Tanaka T., Nishio I., Sun S-T., Ueno-Nishio S. Collapse of gels in an electric field. // Science, 1982, v. 218, p. 467-469.

21. Kost J., Wolfrum J., Langer R. Magnetically enhanced insulin release in diabetic rats. // J. Biomed. Mater. Res., 1987, v. 21, p. 1367-1373.

22. Shiga T., Kurauchi T. Deformation of polyelectrolyte gels under the influence of electric field. // J. Appl. Polym. Sci., 1990, v. 39, p. 2305-2320.107

23. Hirose Y., Amiya T., Hirokawa Y. and Tanaka T. Phase Transition of Submicron Gel Beads. // Macromolecules, 1987, v. 20, p. 1342 1344.

24. Yoshida R., Uchida K., Kaneko Y., Sakai K., Kikuchi A., Sakurai Y., Okano T. Comb-type grafted hydrogels with rapid de-swelling response to temperature changes. // Nature, 1995, v. 374, p. 240-242.

25. Chytry V., Netoplik M., Bondanecky M., Ulbrich K. Phase transition parameters of potential thermosensitive drug release systems based on polymers of N-alcylmethacrylamides. // J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 1997, v. 8, p. 817-824.

26. Dingenouts N., Norhausen Ch. And Ballauff M. // Macromolecules, 1998, v. 31, p. 89128917.

27. Kono K., Henmi A., Yamashita H., Hayashi H., Takagishi T. Improvement of temperature-sensitivity of poly(N-isopropylacrylamide)-modified liposomes // J. Controlled Release, 1999, v. 59, p. 63-75.

28. Kono K., Nakai R., Morimoto K., Takagishi T. Thermosensitive polymer-modified liposomes that release contents around physiological temperature // Biochim. Biophys, Acta, 1999, v. 1416, p. 239-250.

29. Marquez G., Wang L.V. , Wang C., Hu Z. Development of tissue-simulating optical phantoms: poly-N-isopropylacrylamise solution entrapped inside a hydrogel. // Phys. Med. Biol., 1999, v. 44, p. 309-318.

30. Kawasaki N., Ohkura R., Miyazaki S., Uno Y. Sugimoto S., Attwood D. Thermally reversible xyloglucan gels as vehicles for oral drug delivery. // Int. J. Pharm., 1999, v. 181, p. 227-234.

31. Miyazaki S., Suisha F., Kawasaki N., Shirakawa M., Yamatoya K., Attwood D. Thermally reversible xyloglucan gels as vehicles for rectal drug delivery. // J. Controlled Release, 1998, v. 56, p. 75-83.

32. Rollason G., Davies J.E., Sefton M.V. Preliminary report on cell culture on a thermally reversible copolymer. // Biomaterials, 1993, v. 14, p. 153-155.1.I

33. Kono K., Nakai R., Morimoto K., Takagishi T. Temperature-dependent interaction of thermo-sensitive polymer-modified liposomes with CV1 cells. // FEBS Lett., 1998, v. 456, p. 306-310.

34. Hayashi H., Kono K. and Takagishi T. Temperature sensivitization of liposomes using copolimers of N-isopropylacrylamide. //Bioconjug. Chem., 1999, v. 10, p. 412-418.

35. Aoyagi Т., Ebara M., Sakai K., Sakurai Y., Okano T. Novel bifunctional polymer with reactivity and temperature sensitivity. //J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 2000, v. 11, p. 101110.

36. Kirsh Y. E. Water-soluble poly(N-vinylamides): microstructure, solvation,conformational state and complex formation in aqueous solutions. // Prog. Polim. Sci., 1993, v. 18, p. 519542.

37. Кузькина И.Ф., Пашкин И.И., Марквичева E.A. // Хим.-Фармац. Журнал, 1996, т.1, с. 39-44.

38. Марквичева Е. А., Бронин А. С., Кудрявцева Н. Е., Кузькина И. Ф., Пашкин И. И., Кирш Ю. Э., Румш Л.Д., Зубов В. П. Новый метод иммобилизации протеолитических ферментов в полимерных гидрогелях // Биоорг. Химия, 1994, т. 20, с.257-262.109

39. Markvicheva E.A., Tkachuk N.E., Kuptsova S.V. , Dugina T.N., Strukova S.M., Kirsh Yu.E., Zubov V. P., Rumsh L.D., Stabilization of proteases by entrapment in a new composite hydrogel, Appl. Biochem. Biotechnol., 1996, v. 61, N1-2, p. 75-84.

40. Зубов В.П., Пашкин И.И., Кузнецова O.A., Кузькина И.Ф., Кирш Ю.Э. Синтез сополимеров N-винилкапролактама с N-винилформамидом и физико-химические свойства их водных растворов. // ВМС, 2000, т. 42, с. 1-6.

41. Park T.G. Temperature modulated protein release from pH/temperature-sensitive hydrogels // Biomaterials, 1999, v. 20, p. 517-521.

42. Serres A., Baudys M., Kim S.W. Temperature and pH-sensitive polymers for human calcitonin delivery // Pharm. Res., 1996, v. 13, p. 196-201.

43. Ramkissoon-Ganorkar C., Liu F., Baudys M., Kim S.W. Modulating insulin-release profile from pH/thermosensitive polimeric beads through polymer molecular weight // J. Controlled. Release, 1999, v. 59, p. 287-298.

44. Miyazaki S., Oda M., Takada M., Attwood D. Thermally gelling poloxamine Synperonic T908 solution as a vehicle for rectal drug delivery // Biol. Pharm. Bull., 1995, v. 18, p. 1151-1153.

45. Bochot A., Fattal E., Gulik A., Couarraze G., Couvreur P. Liposomes dispersed within a thermosensitive gel: a new dosage form for ocular delivery of oligonucleotides // Pharm. Res., 1998, v. 15, p. 1364-1369.

46. Han C.K., and Bae Y. H. Inverse thermally-reversible gelation of aqueous N-isopropilacrilamide copolymer solutions. // Polymer, 1998, v. 39, p. 2809-2814.

47. Kim J.-H., and Balauff M. The volume transition in thermosensitive core-shell latex particles containing charged groups. // Colloid. Polym. Sei., 1999, v. 277, p. 1210-1214.

48. Vernon В., Kim S.W. and Bae Y.H. Insulin release from islets of Langerhans entrapped in a poly(N-isopropylacrilamide-co-acrylic acid)polymer gel // J. Biomater. Sei. Polym. Ed., 1999, v. 10, p. 183-198.110

49. Kondo A., Fukuda H. Preparation of thermo-sensitive magnetic microspheres and application to enzyme Immobilization. //J. Ferment. Bioeng., v. 84, p. 337-341.

50. Yuk S.H., Cho S.H., Lee S.H. pH/temperature-responsive polymer composed ofpoly((N,N-dimethylamino)ethyl methacrylate-co-ethylacrylamide) //Macromolecules, 1997, v. 30, p. 6856-6859.

51. Tanaka Т., Fillmore D., Sun S.T., Nishio I., Swislow J., and Shah A. Phase transitions in ionic gels // Phys. Rev. Lett., 1980, v. 45, p. 1636 1639.

52. Tanaka Т., Phase transitions of gels, In:Polyelectrolyte Gels, Harland, R.S. and Prud'homme, R.K., Eds., ACS Symp. Series, 1992, v. 480, p.l.

53. Elliassaf J. Hydrofobic bonding in vinyl polymers // J. Polym. Sci., B, 1965, v. 3, p. 764769.

54. Matsuyama A., Tanaka F. Theory of solvatation-induced reentrant phase separation in polymer solutions // Phys. Rev. Lett., 1990, v. 65, N 3, p. 341-344.

55. Тагер A.A., Сафронов А.П., Шарина С.В., Галаев И.Ю. Термодинамика водных растворов поливинилкапролактама// ВМС, 1990, т.32 А, N 3, с.529-534

56. Тагер А.А., Сафронов А.П., Березюк Е.А., Галаев И.Ю. Гидрофобные взаимодействия и нижняя критическая температура водных растворов полимеров // ВМС, 1991, т.ЗЗ Б, с.572-577.

57. Yuk S.H., and Bae Y.H. Phase-trsansition polymers for drug delivery. // Critical rewiews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1999, v. 16, p. 385-423.

58. Taylor L., Cerankowski L. D. Preparation of films exhibiting a balanced temperature dependence to permeation by aqueous solutions a study of lower consolute behavior // J. Polym. Sci., 1975, v. 13, p. 2551-2570.

59. Schild H.G., Tirrell D.A. Microcalorimetric detection of lower critical solution temperatures in aqueous polymer solutions // J. Phys. Chem., 1990, v. 94, p. 4352-4356.1.l

60. Home R.A., Almeida J.P., Day A.F., Yu N.-T. Macromolecule hydratation and the effect of solutes on the cloud point of aqueous solutions of poly(vinyl-methyl ether) // J. Coll. Interface Sci., 1971, v. 35, p. 77-85.

61. Huang X., Akehata Т., Unno H., Hirasa O. Dewatering of biological slurry by using water-absorbent polymer gel // Biotechnol. Bioeng., 1989, v. 34, p. 102-109.

62. Chakhovsky N., Martin R.H., R.van Neckel. Polyethyleneglycol monoethers. Critical solution temperatures of polyethylene glycol monoether-water mixtures and the influence of a third constituent // Bull. Soc. Chem. Beiges., 1956, v. 65, p. 453-474.

63. Bae Y.C., Lambert S.M., Soane D.S., Prausnitz J.M. Cloud point curves of polymer solutions from thermooptical measurements // Macromolecules, 1991, v. 24, p. 44034407.

64. Будтов В.П. Физическая химия растворов полимеров, С.-П: Химия, 1992, с.53.

65. Karlstrom G. A new model for upper and lower critical solution temperatures in poly(ethyleneoxide) solutions. // J. Phys. Chem., 1985, v. 89, p. 4962-4964.

66. Bae Y.H., Okano T. and Kim S.W. On-off thermocontrol of solute transport: I. Aqueous swelling properties of N-isopropylacrylamide networks modified with hydrophobic components. // Pharm. Res., 1991, v. 8, p. 531-539.

67. Vernon В., Gutowska A., Kim S.W., Bae Y.H. Thermally reversible polymer gels for biohybrid artificial pancreas. // Macromol. Symp., 1996, v. 109, p. 155-160.

68. Hoffman A.S., Afrassiabi A. and Dong L.C. Thermally reversible hydrogels: II. Delivery to and selective removal of substances from aqueous solutions. //J. Controlled Release, 1986, v. 4, p.213-222.

69. Еремеев H.JI., Казанская Н.Ф. Фазовый переход в матрице как регулятор ферментативной активности протеиназ // Биоорганическая Химия, 1998, т. 24, с. 356-363.

70. Василевская В.В., Хохлов А.Р. О влиянии низкомолекулярной соли на коллапс заряженных полимерных сеток. // ВМС, 1986, т. 26 А, с. 316-320.

71. DongL.C., and Hoffman A.S. Thermally reversible hydrogels: III. Immobilization of enzymes for feed-back reaction control. // J. Controlled Release, 1986, v. 4, p. 223-229.

72. Shibayama M. and Tanaka Т., "Volume Phase Transition and Relation Phenomena of Polymer Gels," in: Advances in Polymer Sciences V. 109, Edited by K. Dusek. 1993, p. 1-62. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg.

73. Madsen F., and Peppas N.A. Complexation graft copolymer networks: swelling properties, calcium binding and proteolitic enzyme inhibition. // Biomaterials, 1999, v. 20, p. 1701-1708.

74. Kirsh Y. E. Water-soluble poly(N-vinylamides): microstructure, solvation,conformational state and complex formation in aqueous solutions. // Prog. Polim. Sci., 1993, v. 18, p. 519542.

75. Кирш Ю.Э., Сусь T.A., Карапутадзе T.M., и др. Особенности комплексообразования и конформационных превращений макромолекул поли-1\Г-виниллактамов в водных растворах. // ВМС, 1979, т. 21 А, с. 519-525.

76. Кирш Ю.Э., Галаев И.Ю., Карапутадзе Т.М., Марголин A.M., Швядас В.К. Термоосаждаемые конъюгаты поливииилкапролактам-фермент // Биотехнология, 1987, т. 3, с. 184-189.

77. Hosoya К., Kimata К., Agaki Т., Tanaka N., Frechet J.M. Temperature-controlled highperformance liquid chromatography using a uniformly sized temperature-responsive polymer-based packing material. // Anal. Chem., 1995, v. 67, p. 1907-1911.

78. Lakhiari H., Okano Т., Nurdin N., Luthi C., Descouts P., Muller D., Jozefonvicz J. Temperature-responsive size-exclusion chromatography using poly(N-isopropylacrylamide) grafted silica. // Biochim. Biophys. Acta, 1998, v. 1379, p. 303313.

79. Galaev I.Y., and Mattiasson B. Shielding affinity chromatography. // Bio/technology, 1994, v. 12, p. 1086.

80. Galaev I.Y., Arvidsson P. and Mattiasson B. Protein displasement in dye-ligand chromatography using neutral and charged polymers. // J. Mol. Recognition, 1998, v. 11, p. 255-260.

81. Gehrke S. H., Andrews G. P., Cussler E. L. Chemical aspects of gel extraction // Chem. Eng. Sci., 1986, v. 41, p. 2153-2160.

82. Freitas R.F.S., Cussler E.L. Temperature sensitive gels as extraction solvents // Chem. Eng. Sci., 1987, v. 42, p. 97-103.

83. Park C.H., Hoffman A.S. Concentrating cellulases using a temperature-sensitive hydrogel: effect of gel particle size and geometry // Biotechnol. Prog., 1993, v. 9, p. 640-646.

84. Еремеев H. Л., Сиголаева JI. В., Кост А. О., Казанская Н. Ф. Концентрирование растворов белков при помощи температуро-чувствительных гелей // Биотехнология, 1994, т.8, с.25-29.

85. Roepke DC, Goyal SM, Kelleher CJ, Halvorson DA, Abraham AJ, Freitas RF, Cussler EL Use of temperature-sensitive gel for concentration of influenza virus from infected allantoic fluids. // J. Virol. Methods, 1987, v. 15, p. 25-31.

86. Maheshkumar S., Peterson R.B. and Goyal S.M. Temperature-sensitive gel for virus concentration from urine. // J. Virol. Methods, 1989, v. 23, p. 41-46.

87. Huang X., Akehata T., Unno H., Hirasa O. Dewatering of biological slurry by using water-absorbent polymer gel. // Biotechnol. Bioeng., v. 34, p. 102-109.

88. Trank S.J., Johnson D.W., Cussler E.L. Isolated soy protein production using temperature-sensitive gels. // Food Technol., 1989, v. 43, N 6, p. 78-83.

89. Chilcoti A., Chen G., Stayton P., Hoffman A.S. Site-specific conjugation of temperature-sensitive polymer to a genetically-engineered protein. // Bioconjugate Chem., 1994, v. 5, p. 504-507.

90. Chen G., Hoffman A.S. Preparation and properties of thermoreversible, phaseseparating enzyme-oligo(N-isopropylacrylamide conjugates. // Bioconjugate Chem., 1993, v. 4, p. 509-514.

91. Chen G., Hoffman A.S. Synthesis of carboxylated poly(NIPAAm) oligomers and their application to form thermo-reversible polymer-enzyme conjugates. // J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 1994, v. 5, p. 371-382.

92. Matsukata M., Aoki T., Sanui K., Kikuchi A., Sakurai Y., Okano T. Effect of molecular architecture of poly(N-isopropylacrylamide)-trypsin conjugates on their solution and enzymatic properties. // Bioconjugate Chem., 1996, v. 7, p. 96-101.

93. Matsukata M., Takei Y., Aoki T., Sanui K., Ogata N., Sakurai Y., Okano T. Temperature-modulated solubility-activity alterations for poly(N- isopropylacrylamide)-lipase conjugates. // J. Biochem. (Tokyo), 1994, v. 116, p. 682-686.

94. Hoffman A.S. Application of thermally reversible polymers and hydrogels in therapeutics and diagnostics. // J. Control. Release, 1987, v. 6, p. 297-305.115

95. Кухтин А.В., Еремеев H.JL, Беляева ЕА, Казанская Н.Ф. Relationship between state of а термочувствительной матрицы и активность иммобилизованной в ней уреазы. // Биохимия, 1997, т. 62, с. 371-376.

96. Eremeev N.L., Kukhtin A.V., Belyaeva Е.А., Kazanskaya N.F. Effects of thermosensitive matrix-phase transition on urease-catalyzed urea hydrolysis. // Appl. Biochem. Biotechnol., 1999, v. 76, p. 45-55.

97. Park C.H., Hoffman A.S. Thermal cycling effects on the bioreactor performances of immobilized J3-galactosidase in themperature-sensitive hydrogel beads. // Enzyme. Microb. Technol., 1993, v. 15, p. 476-482.

98. Klibanov A.M., Samokhin G.P., Martinek K., Berezin I.V. A new approach to preparative enzymatic synthesis. // Biotechnol Bioeng., 2000, v. 67, p. 737-747.

99. Gupta, M.N. "Enzyme function in organic solvents" // Eur. J. Biochem., 1992, v. 203, p. 25-32.

100. Wescott CR, Klibanov AM The solvent dependence of enzyme specificity. // Biochim. Biophys. Acta, 1994, v. 1206, p. 1-9.

101. Klibanov A.M. Why are enzymes less active in organic solvents than in water?. // Trends Biotechnol., 1997, v. 15, p. 97-101.

102. Dai L., Klibanov A.M. Striking activation of oxidative enzymes suspended in nonaqueous media. // Proc Natl Acad Sci U S A, 1999, v. 96, p. 9475-9478.

103. Мартинек К., Клибанов A.M., Самохин Г.П., Семенов А.П., Березин И.В. Препаративный ферментативный синтез в двухфазной водно-органической системе. // Биоорганич. химия, 1977, т.З, с.696-702.

104. Zaks, A. and Klibanov, A.M. The effect of water on enzyme action in organic media. //J. Biol. Chem., 1988, v. 263, p. 8017-8021.

105. Белова А.Б., Можаев В.В., Левашов А.В., Сергеева М.В., Мартинек К., Хмельницкий Ю.Л. Взаимодействие между физико-химическими параметрами органических растворителей и их денатурирующим воздействием на белки. // Биохимия, 1991, т. 85, с. 1923-1945.

106. Клибанов A.M., Семенов А.Н., Самошин Г.Р., Мартинек К. Ферментативные реакции в водно-органических средах: критерий выбора оптимального органического растворителя. // Биоорг. Химия, 1978, т.4, с. 82-88.

107. Klibanov А. М. In: Biocatalysis in organic media. Ed. by. Laane C., Tramper J., Lilly M. D., 1987, p. 116. Elsevier, Amsterdam.

108. Khmelnitsky Yu.L., Mozhaev V. V., Belova A.B., Sergeeva M.V., and Martinek K. Denaturation capasity: a new quantitative criterion for selection of organic solvents as reaction media in biocatalysis. // Eur. J. Biochem., 1991, v. 198, p. 31-41.

109. Gupta, M.N., Batra, R., Tyagi, R., and Sharma, A. Polarity index: the guiding solvent parameter for enzyme stability in aqueous-organic cosolvent mixtures. // Biotechnol. Prog., 1997, v. 13, p. 284-288.

110. Ross A.C., Bell G. And Hallinga P.J. Organic solvent functional group effect on enzyme inactivation by the interfacial mechanism. // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2000, v. 8, p. 183-192.

111. Gekko K., Morikawa T. Preferential hydration of bovine serum albumin in polyhydric alcohol-water mixtures // J.Biochem., 1981, v. 90, pp 39-50.

112. Reslow M., Aldercreutz, P. and Mattiasson, B. The influence of water on protease-catalyzed peptide synthesis in acetonitrile/water mixtures. // Eur. J. Biochem., 1988, v. 177, p. 313-318.

113. Kise, H., and Hayakama, A. Immobilization of proteases to porous chitosan beads and their catalysis for ester and peptide synthesis in organic solvents. // Enzyme Microb. Technol., 1991, v. 13, p. 584-588.

114. Adlercreutz P., Clapes P. Catalitic properties of alpha-chymotrypsin in organic media. // Biomed. Biochim. Acta, 1991, v. 50, p. 55-60.

115. Adlercreutz P. Activation of enzymes in organic media at low water activity by polyols and saccharides. // Biochim. Biophys. Acta, 1993, v. 1163, p. 144-148.

116. Batra R., Tyagi R., Gupta M.N. Influence of Immobilization on Enzyme Activity in Aqueous-Organic Cosolvent Mixtures. // Biocatalysis Biotransformation, 1997, v. 15, p. 47-53.

117. Levitsky V. Y., Lozano P., Iborra J.L. Kinetic analysis of deactivation of immobilized alpha-chymotrypsin by water-miscible organic solvent in kyotorphin synthesis. // Biotechnol. Bioeng, 1999, v. 65, p. 170-175.

118. Inada Y., Takahashi K., Yoshimoto T., Ajima A., Matsushima A., Saito Y. Application of polyethileneglycol- modified enzymes in biological processes: organic solvent soluble enzymes. // Trends Biotechnol., 1986, v. 4, p. 190-194.118

119. Adlercreutz P. On the importants of the support material for enzymatic synthesis in organic media // Eur. J. Biochem., 1991, v. 199, p. 609-614.

120. Sakodynskaya I.K., Sorokina E.M., Efremova N.V., Topchieva I.N. Enzymic activity of polymer-protein complexes in water-miscible organic solvents. // Bioorg Khim., 1999, v. 25, p. 439-443.

121. Kwon O.H., Imanishi Y., Ito Y. Catalytic activity and conformation of chemically modified subtilisin Carlsberg in organic media. Biotechnol. Bioeng., 1999, v. 66, p. 265270.

122. Kise, H., Hayakama, A., and Noritomi, H. Protease-catalyzed synthetic reactions and immobilization-activation of the enzymes in hydrophilic organic solvents. // J. Biotechnol., 1990, v. 14, p. 239-254.

123. Tanaka, A. and Kawamoto, T. In: Protein immobilization: fundamentals and apploications. Edited by Taylor, R.F., 1991, p. 183-208. Marcel Dekker. New York.

124. Afrassiabi A., Hoffman A. S., Cadwell L. A. Effect of temperature on the release rate of biomolecules from thermally reversible hydrogels. // J. Membr. Sci., 1987, v. 33, p. 191-200.

125. Yoshida R., Sakai K., Okano T., Sakurai Y. A new model for zero-order drug release 1. Hydrophobic drug release from hydrophilic polymeric matrices/ // Polymer J., 1991, v. 23,p. 1111-1121.

126. Kokufata E., Zhang Y.-Q., Tanaka T. Saccharide-sensitive phase transition of a lectine-loaded gel. //Nature, 1991, v. 351, p. 302-304.

127. Dong L.C., Hoffman A.S. Synthesis and application of thermally reversible heterogels for drag delivery. // J. Control. Release, 1990, v. 13, p. 21-31.

128. Chen S.C., Jones D.H., Fynan E.F., Farrar G.H., Clegg J.C., Greenberg H.B., Herrmann J.E. Protective immunity induced by oral immunization with a rotavirus DNA vaccine encapsulated in microparticles. // J. Virol., 1998, v. 72, p. 5757-5761.

129. Fassano A. Innovative strategies for the oral delivery of drugs and peptides. // Trends Biotechnol., 1998, v. 16, p. 152-157.

130. Bowersock T.L., HogenEsch H., Suckow M., Guimond P., Martin S., Borie D., Torregrosa S., Park H., Park K. Oral vaccination of animals with antigens encapsulated in alginate microspheres///Vaccine, 1999, v. 17, p. 1804-1811.

131. Oku N., Naruse R., Doi K., Okada S. Potential usage of thermosensitive liposomes for macromolecule delivery/ // Biochim. Biophis. Acta, 1994, v. 1191, p. 389-391.

132. Kakinuma K., Tanaka R., Takahashi H., Sekihara Y., Watanabe M., Kuroki M. Drug delivery to the brain usind thermosensitive liposome and local hyperthermia. // Int. J. Hyperthermia, 1996, v. 12, p. 157-165.

133. Wheeler J.J., Palmer L., Ossanlou M., MacLachlan I., Graham R.W., Zhang Y.P., Hope M.J., Scherrer P., Cullis P.R. Stabilized plasmid-lipid particles: construction and characterization. // Gene Ther., 1999, v. 6, p. 271-281.120

134. Mok K.W., Lam A.M., and Cullis P.R. Stabilized plasmid-lipid particles: factors influencing plasmid entrapment and transfection properties. // Biochim. Biophys. Acta,1999, v. 1419, p. 137-150.

135. Hong K., Zheng W., Baker A., Papahadjopoulos D. Stabilization of cationic liposome-plasmid DNA complexes by polyamines and poly(ethylene glycol)-phospholipid conjugates for efficient in vivo gene delivery. // FEBS Lett., 1997, v. 400, p. 233-237.

136. Hayashi H., Kono K. and Takagishi T. Temperature-controlled release property of phospholipid vesicles bearing a thermo-sensitive polymer. // Biochim. Biophys. Acta, 1996, v. 1280, p. 127-134.

137. Hayashi H., Kono K. and Takagishi T. Temperature sensivitization of liposomes using copolimers of N-isopropylacrylamide. // Bioconjug. Chem., 1999, v. 10, p. 412-418.

138. Zignani M., Drummond D.C., Meyer O., Hong K., Leroux J. In vitro characterization of a novel polymeric-based pH-sensitive liposome system. // Biochim. Biophys. Acta,2000, v. 1463, p. 383-394.

139. Levine R., Agren M., Mertz P. Effect of occlusion on cell proliferation during epidermal healing. //J. Cut. Med. Surg., 1998, v. 2, p. 193-198.

140. Bradley M., Cullum N., Nelson E.A., Petticrew M., Sheldon T., Torgerson D. Systematic reviews of wound care management: (2) Dressings and topical agents used in the healing of chronic wounds. // Health Technol. Assess., 1999, v. 3, p. 90.

141. Agren M. An amorhous hydrogel enhances epithelialisation of wounds. // Acta Derm. Venereol., 1998, v. 78, p. 119-122.

142. Rowley J.A., Madlambayan G., Mooney D.J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. // Biomaterials, 1999, v. 20, p. 45-53.121

143. Natsume T., Ike O., Okada T., Takimoto N., Shimizu Y., Ikada Y. Porous collagen sponge for esophageal replacement. // J. Biomed. Mater. Research, 1993, v. 27, p. 867875.

144. Young T. Reaping the benefits of foam dressings. // Community Nurse, 1998, v. 4, p. 47-48.

145. Kushwaha V., Bhowmick A., Behera B.K., Ray A.R. Sustained release of antimicrobial drugs from polyvinylalcohol and gum arabica blend matrix. // Artif. Cells Blood. Substit. Immobil. Biotechnol., 1998, v. 26, p. 159-172.

146. Draye J.P., Delaey B., Van de Voorde A., Van Den Bulcke A., De Reu B., Schacht E. In vitro and in vivo biocompatibility of dextran dialdehyde cross-linked gelatin hydrogel films. // Biomaterials, 1998, v. 18, p. 1677-1687.

147. Segal H., Hunt B.J. The effects of alginate and non-alginate wound dressings on blood coagulation and platelet activation. // J. Biomater. Appl., 1118, v. 12, p. 249-257.

148. Ueno H., Yamada H., Tanaka I., Kaba N., Matsuura M., Okumura M., Kadosawa T., Fujinada T. Accelerating effects of chitosan for healing at early phase of experimental open wounds in dogs. // Biomaterials, 1999, v. 20, p. 1407-1414.

149. Madihally S.V., Matthew W.T. Porous chitosan scaffolds for tissue engineering. // Biomaterials., 1999, v. 20, p. 1133-1142.

150. Healy KE, Rezania A, Stile RA Designing biomaterials to direct biological responses. // Ann N Y Acad Sci., 1999, v. 875, p.24-35.

151. Naldini A., Sower L., Bocci V., Meyers B., Carney D.H. Thrombin receptor expression and responsiveness of human monocytic cells to thrombin is linked to interferon-induced cellular differentiation. // J. Cell. Physiol., 1998, v. 177, p. 76-84.

152. Chambers R.C., dabbagh K., McAnulty R.J., Gray A.J., Blanc-Brude O.P. Thrombin stimulates fibroblasts procollagen production via proteolytic activation of proteases-activated receptor 1. // Biochem. J., 1998, v. 333, p. 121-127.122

153. Stiernberg J., Redin W.R., Warner W.S., Carney D.H. The role of thrombin and thrombin receptor activating peptide (TRAP-508) in initiation of tissue repair. // Thromb. Haemost., 1993, v. 70, p. 158-62.

154. Carney D.H., Redin W., McCroskey L. Role of high-affinity thrombin receptors in postclotting cellular effects of thrombin. // Semin. Thromb. Hemost., 1992, v. 18, p. 91103.

155. Dabbagh K., Laurent G.J., McAnulty R.J., Chambers R.C. Thrombin stimulates smooth muscle cell procollagen synthesis and mRNA levels via a PAR-1 mediated mechanism. //Thromb. Haemost., 1998, v. 79, p. 405-409.

156. Corvera C.U., Dery 0., McConalogue K., Bohm S.K., Khitin L.M., Caugney G.H., Payan D.G., and Bunnet N.W. Mast cell tryptase regulates colonic miocytes through proteinase-activated receptor-2. // J. Exp. Med., 1997, v. 183, p. 821-827.

157. Molino M., Barnathan E.S., Numerof R., Clark J., Dreyer M., Cumashi A., Hoxie J.A., Schechter J.A., Woolkalis M., and Brass L.F. Interaction of mast cell Tryptase with thrombin receptors and PAR-2. // J. Biol. Chem., 1997, v. 272, p. 4043-4049.

158. Grand R.J.A., Turnell A.S. and Grabham P.W. Cellular consequences of thrombin-receptor activation. // Biochem.J., v. 313, p. 353-368.

159. Vu T.K., Hung D.T., Wheaton V.I., and Coughlin S.R. Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolitic mechanism of receptor activation. //Cell, 1991, v. 64,p. 1057-1068.

160. Gerszten R.E., Chen J., Ishii M. Ishii K, Wang L, Nanevicz T, Turck CW, Vu TK, Coughlin SR. Specificity of the thrombin receptor for agonist peptide is defined by its extracellular surface. //Nature, 1994, v. 368, p. 648-651.

161. Bahou W.F., Kutok J.L., Wong A., Potter C.L., Coller B.S. Identification of a novel thrombin receptor sequence required for activation-dependent responses. // Blood, 1994, v. 84, p. 4195-4202.123

162. Nystedt S., Emillson K., Washlested C. and Sundelin J. Molecular cloning of a potential proteinase activated receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, v. 91, p. 92089212.

163. Al-Ani B., Saifeddin M. And Hollenberg M.D. Detection of functional receptors for the proteinase-activated-receptor-2-activating polypeptyde, SLIGRL-NH2 in rat vascular and gastric smooth muscle. // Can. J. Physiol. Pharmacol., 1995, v. 73, 1203-1207.

164. Ishihara H., Connolly A.J., Zeng D., Kahn M.L., Zheng Y.W., Timmons C., Tram T., and Coughlin S.R. Protease-activated receptor 3 is a second thrombin receptor in humans. //Nature, 1997, v. 386, p. 502-506.

165. Xu W., Andersen H., Whitmore T.E., Presnell S.R., Yee D.P., Ching A., Gilbert T., Davie E.W., and Foster D.C Cloning and characterization of human protease-activated receptor 4. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, v. 95, p. 6642-6646.

166. Kahn M.L., Zheng Y.W., Huang W„ Bigornia V. , Zeng D., Moff S., Farese Jr. R.V., Tam C., and Coughlin S.R. A dual thrombin receptor system for platelet activation. // Nature, 1998, v. 394, p. 690-694.

167. Vassallo RR, Kieber-Emmons T, Cichowski K, Brass LF Structure-function relationships in the activation of platelet thrombin receptors by receptor-derived peptides. // J. Biol. Chem., 1992, v. 267, p. 6081-6085.r- . , ,1 • " ^fitflv124

168. Van Obberghen-Schilling E, Rasmussen UB, Vouret-Craviari V, Lentes KU, Pavirani ! A, Pouyssegur J Stracture-activity analysis of synthetic alpha-thrombin-receptor-activating peptides. // Biochem. J., 1993, v. 292, p. 667-671.

169. Vouret-Craviari V, Van Obberghen-Schilling E, Scimeca JC, Van Obberghen E, Pouyssegur J Differential activation of p44mapk (ERK1) by alpha-thrombin and thrombin-receptor peptide agonist. // Biochem. J., 1993, v. 289, p. 209-214.

170. Scardino M.S., Swaim S.F., Morse B.S., Sartin E.A., Wright J.C., Hoffman C.E. Evaluation of fibrin sealants in cutaneous wound closure. // J. Biomed. Mater. Res., 1999, v. 48, p. 315-321.

171. Dunn C.J., Goa K.L. Fibrin sealant: a review of its use in surgery and endoscopy. // Drugs, 1999, v. 58, p. 863-886.

172. Miller-Andersson M., Gaffney P. J. Seghatchian // Thromb. Res., 1980, v. 20, p. 109122.125

173. Heller M.C., Carpenter J.F., Randolph T.W. Effects of phase separating systems on lyophilized hemoglobin. // J. Phasrm. Sci., 1996, v. 85, p. 1358-1362.

174. Anchordoquy T.J., Carpenter J.F., Polymers protect lactate dehydrogenase during freeze-drying by inhibiting dissociation in the frozen state. // Arch. Biochem. Biophys., 1996, v. 332, p. 231-238.

175. Струкова С. М., Умарова Б. А., Киреева Е. Г. и др. Механизм регуляции свертывания крови // Биохомия животных и человека, 1992, с. 1.

176. Ануфриева Е.В., Некрасова Т.Н., Лущик В.Б., Федотов Ю.А., Кирш Ю.Э., Краковяк М.Г. Надмолекулярное структурообразование в водном растворе полиариленамидосульфоната натрия, регулируемое полимерным инициатором // ВМС, 1992, т. 33, с. 31-34.

177. Марквичева Е.А. Новые методы иммобилизации и культивирования клеток в полимерных гидрогелях. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук, М., 1992.

178. Loster, К., Seidel, S., Kirstein, D., Schneider, F., and Noll, F. Novel antibody coating of a magnetizable solid phase for use in enzyme immunoassays. // J. Immunol. Methods., 1992, v. 148, p. 41-47.

179. Suzuki, M., Kamihira, M., Shiraishi, Т., Takeuchi, H., Kobayashi, T. Affinity partitioning of protein using a magnetic aqueous two-phase system. // J. Ferment. Bioengin., 1995, v. 80, p. 78-84.

180. Al-Hassan, Z., Ivanova, V. , Dobreva, E., Penchev, I., Hristov, J., Rachev, R. and Petrov, R. Non-porous magnetic supports for cell immobilization. // J. Ferment. Bioeng., 1991, v. 71, p. 114-116.

181. Туркин С.И., Лукин Ю.В., Марквичева E.A., Али-заде Р.А., Зубов В.П., Завальный М.А., Скуинын А.Г., Клявинып М.К., Зицманис А.Х.// 1990. А.с. СССР 1567623.126

182. Hwang S.J., Park H., Park K. Gastric retentive drug-delivery systems. // Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier. Syst., 1998, v. 15, p. 243-284.

183. Szymonifka, M.J., and Chapman, K.T. Magnetically manipulable polymeric supports for solid phase prganic synthesis. // Tetrahedron Letters, 1995, v. 36, p. 1597-1600.

184. Nakagoni K., Ajisaka K. Immobilization of thrombin and Succinyl-trombin on Eupergit C andaplication to the production of activated protein C // Biotechnol. Letters, 1990, v. 12, N3, p. 179-184.

185. Esmon N. L., Owen W. G. et al. Isolation of a membrane-bound cofactor for thrombin-catalysed activation of protein C // J. Biol. Chem., 1982, v. 257, N2, p. 859-864.

186. Salem H. H., Maruyama I. et al. Isolation and characterization of thrombomodulin from human placenta // J. Biol. Chem., 1984, v. 259, N19, p. 12246-12251.

187. Spotnitz W.D. Fibrin sealant in the United States: clinical use at the University of Virginia. // Thromb.Haemostasis, 1995, v. 74, p. 482-484.

188. Kim H.J., Lee H.C., Oh J.S., Shin B.A., Oh C.S., Park R.D., Yang K.S., Cho C.S. Polyelectrolyte complex composed of chitosan and sodium alginate for wound dressing application. // J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 1999, v. 10, p. 543-556.

189. Ribeiro A.J., Neufeld R.J., Arnaud P., Chaumeil J.C. Microencapsulation of lipophilic drugs in chitosan-coated alginate microspheres. // Int. J. Pharm., 1999, v. 187, p. 115-123.

190. Quong D., Neufeld R.J. DNA encapsulation within co-guanidine membrane coated alginate beads and protection from extracapsular nuclease. // J. Microencapsulation, 1999, v. 16, p. 573-585.

191. Yan X., Khor E., Lim L.Y. PEC films prepared from chitosan-Alginate coacervates. // Chem. Pharm. Bull. (Tokyo), 2000, v. 48, p. 941-946.

192. Esquisabel A., Hernandes R.M., Igartua M., Gascon A.R., Calvo B., Pedraz J.L. Effect of lecithins on BCG-alginate-PLL microcapsule particle size and stability upon storage. // J. Microencapsulation, 2000, v. 17, p. 363-372.127

193. Arnold, F.H. "Engineering enzymes for non-aqueous solvents" // Trends Biotechnol., 1990, v. 8, p. 224-249.

194. Kawakami K, Abe T, Yoshida T "Silicone-immobilized biocatalysts effective for bioconversions in nonaqueous media" // Enzyme Microb Technol., 1992, v. 14, p. 371375.

195. Gekko K., Ohmae E., Kameyama K., Takagi T. Acetonitrile-protein interactions: amino acid solubility and preferential solvation" // Biochim. Biophys. Acta., 1998, v. 1387, p.195-205.

196. Bender, M.L., Kezdy, F.J., and Gunter, C.R. "The anatomy of an enzymatic catalysis, oc-chymotrypsin" // J. Am. Chem. Soc., 1964, v. 86, p. 3714-3718.

197. Zerner, В., Bond, R.P.M., and Bender, M.L. "Kinetic evidence for the formation of acyl-enzyme intermediates in the a-chymotrypsin-catalyzed hydrolyses of specific substrates" // J. Am. Chem. Soc., 1964, v. 86, p. 3674-3678.

198. Воспаление. Руководство для врачей. Под ред. В.В. Серова и B.C. Паукова, М.: Медицина, 1995, 640 с.

199. Regan М.С., Barbul A. The cellular biology of wound healing. In: Wound healing. Ed. by G. Schlag and H. Redl, 1994. Springer Verlag, New York-Berlin-Heidelberg, p. 3-17.128

200. Blackman J.D., Senseng D. "Clinical evaluation of a semi-permeable polymeric membrane dressings for the treatment of chronic diabetic foot ulcers" // Diabetes Care, 1994, v. 17, p. 322-325.

201. Мурадян P.Г., Чекмарева И.А., Адамян A.A. Исследование покрытий на основе коллагена, Бюл. Эксперимент. Биологической Медицины, 1995, т.1, с.529-531.

202. Dery О. Proteinase-activated receptors: novel mechanisms of signaling by serine proteases. //Am. J.Physiol., 1998, v. 274, p. 1429-1542.

203. Саркисов Д.С., Пальцин A.A., Втюрин Б.В. В кн. Электронная микроскопическая радиоаутография клетки, М.: Наука, 1980, 131 с.

Информация о работе

Купцова, Светлана Владимировна
кандидата химических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.04

Диссертация

Получение, свойства и применение композитных полимерных гидрогелей с иммобилизованными белками и пептидами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы