Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Включение дельта-сон индуцирующего пептида в биосовместимые носители

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Включение дельта-сон индуцирующего пептида в биосовместимые носители"

На правах рукописи

Суханова Татьяна Владимировна

Включение дельта-сон индуцирующего пептида в биосовместимые носители

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

пАР 2015

Москва - 2015

005561304

005561304

Работа выполнена в лаборатории полимеров для биологии в ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук».

Научный руководитель: доктор химических наук

Официальные оппоненты:

Кильдеева Наталья Рустемовна - доктор химических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет дизайна и технологии», кафедра физической и коллоидной химии, заведующая, Тел: 8(495)955-33-05; Email: kildeeva@mail.ru

Захарова Людмила Алексеевна - доктор биологических наук, профессор ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук», лаборатория клеточных и молекулярных основ гистогенеза, главный научный сотрудник, Тел: +7 906 055 29 56; Email: zakharova-l@mail.ru

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН, Тел.: +7 499 135 7319; E-Mail: office@biengi.ac.ru

Защита состоится «_» _ 2015 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д.220.042.01 при ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ) по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23; тел. (495) 337-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО МГАВМиБ и на сайте http://www.mgavm.ru/.

Автореферат разослан «_»_2015 года и размещен на сайте

http://www.vak.ed.gov.ru.

Марквичева Елена Арнольдовна

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

Т.Н. Грязнева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Аюуальность проблемы. Разработка лекарственных препаратов на основе природных биоактивных соединений (пептидов и ферментов) является перспективным направлением фармакологии, однако их использование лимитируется низкой стабильностью их молекул [Bromberg, 2008]. Таким образом, возникает необходимость стабилизации структуры введенных белков/пептидов и/или включения их в конструкции, пролонгирующие их выход в организме, например, частицы, липосомы, обратные мицеллы, микро- и нанокапсулы, углеродные нанотрубки [Alvarez-Barreto, 2007]. Введение биомолекул в данные носители также позволяет добиться направленной доставки к органам-мишеням и изменения свойств препарата при взаимодействии с носителем [Jung, 2008].

С другой стороны, те же молекулы входат в состав биологически активных имплангагов (полимерных матриц, поддерживающих пролиферацию и направленную дифференцировку кпешк), создание которых является актуальной задачей для тканевой инженерии и регенеративной медицины [М. Zilberman, 2010]. Белки и пептиды в данном случае участвуют в создании благоприятной микросреды для клеток, стимулируя их адгезию и пролиферацию.

Пептиды, в частности нейропептиды, занимают важное место в химической передаче информации и других регуляторных процессах. Дельта-сон индуцирующий пептид (ДСИП, TrpAlaGlyGlyAspAlaSeiGlyGIu, 849 Да) является регуляторным нейропептидом, обладает нейро- и стресс-протекгивным действием, проявляет антиоксидантные свойства [Grigor'ev, 2006; Khvatova, 2003]. Все это делает актуальным его включение в биосовместимые носители. Вместе с этим для молекулы ДСИП характерен низкий уровень стабильности.

Цель работы - разработать системы доставки ДСИП в организм на основе наноэмульсий и полимерных матриц.

В ходе выполнения работы решались следующие задачи:

1. Разработать методы включения ДСИП в обратные наноэмульсии и оптимизировать их состав.

2. Изучить стабильность пептида в наноэмульсиях при хранении в различных

условиях.

3. Исследовать кинетику выхода ДСИП из полученных наноэмульсий в in vitro модели.

4. Разработать методику включения ДСИП в полимерные матрицы на основе различных биосовместимых полимеров.

5. Изучить кинетику выхода пептида из полимерных матриц различного состава в модели in vitro.

6. Исследовать динамику структуры ДСИП в зависимое™ от ионной сипы раствора.

Научная новизна. Впервые в мире разработаны системы включения для ишраназальнош введения ДСИП (обратные наноэмульсии на основе эвкалиптового масла и лимонена). Для использования в тканевой инженерии ДСИП впервые в мире был включен в биосовместимые матрицы на основе модифицированною поливинилового спирта (ЛВС), сополимера ПВС и глицидилмегакрилата (ПВС-ГМА) и сополимера диметиламиноэтилмегакрилагга и метилен-бис-акриламида (Со-ДМАЭМА-МБАА). Впервые в мире была разработана методика модификации матриц Со-ДМАЭМА-МБАА полифенольными соединениями с целью замедления выхода пептида и снижения токсичности матрицы. Ошимизирована кинетика выхода пептида в модели in vitro из носителей различного состава (наноэмульсий и полимерных матриц).

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы состоит в изучении механизмов иммобилизации и высвобождения биологически активных пептидов из полимерных носителей; анализе критических факторов, влияющих на кинетику высвобождения; а также в изучении свойств и совместимости различных биополимеров, применяемых для тканевой инженерии и пролонгированной доставки депонированных лекарств. Практическая значимость работы связана с выбором оптимального состава наноэмульсий и полимерных матриц для доставки ДСИП в центральную нервную систему (наноэмульсии) или локально для репарации иннервации трансплантатов при тканевой инженерии (матрицы). Полученные результаты рекомендуется использовать для разработки новых систем доставки лекарственных препаратов на основе ДСИП и пептидов со схожей структурой и свойствами, а также создания новых биоактивных имплантатов либо раневых покрытий с включенными в них пептидами. Предлагаемые подходы запатентованы и внедрены в педагогическую и лабораторную практику кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева, а также ИБХ РАН Москва.

Связь работы с научными программами. Работа выполнена при финансовой поддержке программы РФФИ 08-04-01828-а 2008-2010.

Апробация работы. Результаты диссертации были представлены на XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам "Ломоносов-2008", Химия (Москва, 2008); Ш International conference on colloid chemistry and physicochemical medians (Москва, 2008), XXI и XXII зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2009 и 2010); 34й1,35th, 36th и 37th FEBS Congress (Prague, 2009, Gothenbing, 2010, Torino, 2011, Seville, 2012); IV Российском симпозиуме Белки и пептиды (Казань, 2009); Международной научной конференций по биоорганической химии, биотехнологии и бионанстехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, 2009); 14-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых Биология - наука XXI века (Пущино, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах, рецензируемых ВАК; получено 2 патента.

Личный вклад соискателя. Все экспериментальные и теоретические исследования по теме диссертации проведены лично соискателем. Соискатель принимал непосредственное участие в выборе направления научного поиска, разработке цели и задач исследований по теме диссертационной работы; проведения биотехнологических, биохимических и цитологических исследований; анализе полученных результатов.

Структура диссертации. Работа изложена на 152 страницах, включает 68 рисунков и 4 таблицы. Список литературы содержит 255 источников, в том числе 245 иностранных авторов. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы и приложений

Основные положения и результаты, выносимые на защиту:

1. Обратные наноэмульсии на основе ЭМ/вода и лимонен/вода сохраняют 90% биологической активности ДСИП в течение 2 месяцев.

2. Наноэмульсия ЭМ/вода в 7 раз лучше, чем лимонена/вода пролонгирует выход ДСИП.

3. Полимерные матрицы на основе ДМАЭМА, ПВС и ПВС-ГМА позволяют

получить депонированную форму ДСИП для тканевой инженерии.

4. Ионная сила окружающей микросреды влияет на стабильность ДСИП и его взаимодействие с полимерной матрицей.

5. Поперечная сшивка положительно заряженной матрицы полифенолами позволяет не только замедлить выход ДСИП в раствор, но и снизить токсичность применяемых матриц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа была выполнена в лаборатории полимеров для биологии ФГБУН ИБХ РАН в период с 2009 по 2013 год. ДСИП (pi 4,7, 849 Da) был синтезирован в Лаборатории химии пептидов ИБХ РАН. Наноэмульсии готовили на основе органической (эвкалиптовой масло (ЭМ), лимонен, изопропилмиристат) и водной (вода, PBS) фаз, стабилизированных парой поверхностно-активных веществ (Aerosol ОТ, Lipoid SI00 или Pluronic Fl27). В качестве дополнительных компонентов в состав водной фазы вводили ДЭАЭ-декстран, модифицированный хитозан, альбумин, дигидрокверцетин (ДГК). Молекулярные характеристики образующихся обращенных мицелл исследовали методом динамического светорассеяния. Стабильность ДСИП и кинетику выхода изучали методом ВЭЖХ масс-спектрометрии. Иммобилизация ДСИП осуществлялась на заряженных (сополимер диметиламиноэтилметакрилата и метилен-бис-акриламида (Со-ДМАЭМА-МБАА) и сополимера акриловой кислоты и метилен-бис-акриламида (Со-АА-МБАА)), незаряженных (акрилированный поливиниловый спирт (ПВС)) и содержащих эпокси-группы полимерных (сополимер ПВС и глицидилметакрилата (ПВС-ГМА)) подложках (криогелях). Включение пептида в заряженные криогели и криогели ПВС-ГМА осуществлялось двумя методами. Для замедления выхода ДСИП в раствор поверхность криогелей Со-ДМАЕМА-МБАА модифицировали с помощью полифенольных соединений (ДГК, кверцетин, байкалин). Цитотоксичность сшивающих агентов (полифенолов) исследовалась с помощью клеточных культур. Динамика пространственной структуры ДСИП моделировалась с помощью программных пакетов GROMACS и МОРАС2009.

Включение ДСИП в обратные наноэмульсии

В качестве систем для включения ДСИП использовали наноэмульсии типа вода/масло (в/м), имеющие внутреннюю полярную полость, образованную полярными группами поверхностно-активного вещества (ПАВ). Такая система предназначена для инграназального введения и доставки пептидов в центральную нервную систему через аксоны обонятельного нерва В качестве органической фазы применяли эвкалиптовое масло, лимонен и изопропилмиристат, содержащие 5% Aerosol ОТ (АОТ) или 10% соевый леиитин Lipoid SI00 в качестве ПАВ. Воду и фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,4, содержащие дополнительно полимерный ПАВ Pluronic Fl 27 (2 %) использовали для растворения пептида. Оптимизация условий получения наноэмульсий представлена в Таблице 1. Показали, что наибольшей солюбилизационной емкостью обладают системы на основе АОТ. Растворы на основе АОТ и Lipoid SI00 в изопропилмиристате не позволяли включать водную фазу (расслаивание эмульсии). Таким образом, для включения ДСИП и изучения его стабильности были выбраны системы на основе АОТ (эвкалиптовое масло и лимонен в качестве органической фазы).

Таблица 1 - Оптимизация условий получения наноэмульсий различного состава

№ Органическая фаза ПАВ Максимальный объем водной фазы в стабильной наноэмульсии, мкл воды /100 мкл органической фазы

1 Эвкалиптовое масло 5% АОТ 10

2 Эвкалиптовое масло 10% Lipoids 100 4

3 Лимонен 5% АОТ 12

4 Лимонен 10% Lipoids 100 эмульсия не формируется

5 Изопропилмиристат 5% АОТ эмульсия не формируется

6 Изопропилмиристат 10% Lipoids 100 эмульсия не формируется

Исследование размеров мицелл, сформированных в системе ЭМ (АОТ)-вода (Р1игошс П27) в зависимости от содержания водной фазы, проводилось методом фотон-корреляционной спектроскопии. Показали, что наночастицы эмульсии гомогенны при каждом заданном соотношении водная фаза/АОТ. Увеличение доли водной фазы было пропорционально радиусу мицелл.

В условиях, выбранных для солюбилизащш пегтщда, гидродинамический радиус частиц составлял 6,75 нм и практически не менялся при внесении в систему 2%-го раствора Р1игогас Н-127. Эмульсии сохраняли гомогенность в течение не менее 2 месяцев хранения.

Изучение стабильности ДСИП в составе наноэмульсии

Образцы пептида в водном растворе в системе 1 (Таблица 2) инкубировали 2 мес. при 22 и 4°С.

Таблица 2 - Изменение концентрации ДСИП при его инкубировании в

Образец Количество ДСИП, %

22° С +4° С

ЭМ + вода 80,2±4,1 91,7±1,1

ЭМ+ PBS - 83,1±2,9

ЭМ+вода + ДЭАЭ-декстран 75,5±3,4 87,8±0,6

ЭМ + вода + хитозан 73,7±0,4 87,2±2,0

В состав наноэмульсий в качестве дополнительных веществ вводили полиэлектролиты (хитозан и ДЭАЭ-декстран, 2 мг/мл водной фазы) для усиления взаимодействий между пептидом и полярными группами АОТ. Для определения содержания ДСИП эмульсию предварительно разрушали 70% раствором ацетонитрила. Количество пептида определяли с помощью ВЭЖХ. Время начала деградации пептида определяли по появлению на хроматограмме дополнительного пика (Рис. 1).

Сохранность пептида определяли по отношению площади пика на хроматограмме, соответствующего ДСИП, к сумме площадей данного пика и дополнительного пика (Таблица 2).

В составе выбранной наноэмульсии в течение 2 месяцев сохранялось 92% исходного пепщда при хранении при 4°С и 73-84% - при 22°С. В водном растворе сохранность ДСИП была ниже и составила 38%. В PBS сохранялось 10% пегтщда через 5 сут., что предполагает влияние ионной силы на стабильность пеппада. Согласно расчетам, выполненным с помощью программы GROMACS 4.5, увеличение ионной силы раствора (вода vs. 0,9% NaCl) приводит к увеличению подвижности молекулы, что может быть причиной деструкции ДСИП в солевом растворе.

Стандарт ДСИП , Разрушенный ДСИП ^

3 *

Рис. 1. Формирование дополнительного пика на хроматограмме ДСИП.

ВЭЖХ ДСИП после инкубации в 0,9% NaCl или PBS.

Исследование выхода ДСИП из наноэмульсий

Для изучения поведения содержащей ДСИП наноэмульсии в организме при контакте с солевым раствором (приближенная модель слизистых оболочек организма) в эксперименте in vitro проводился диализ через полупроницаемую мембрану против воды и PBS. На Рис. 2 приведены данные по изменению концентрации ДСИП при диализе в течение суток. При диализе в течение 24 ч из водного раствора ДСИП практически полностью обнаруживается во внешнем растворе (кривая 1). Выход пептида существенно замедляется при использовании наноэмульсии с различными добавками (Рис. 2, кривые 2-5), концентрация ДСИП во внешнем растворе через 24 ч составляла около 20%. Использование в качестве органической фазы ЭМ почти в 8 раз замедляло скорость выхода ДСИП из эмульсии по сравнению с лимоненом (7% vs. 60% через 24 ч). Спустя 120 ч в контроле (водный раствор ДСИП при диализе против PBS) пептид не регистрировался во внешней среде в отличие от проб, где осуществлялся диализ ДСИП из наноэмульсий. Использование в качестве водной фазы воды, содержащей ПАВ, также существенно замедляло выход ДСИП по сравнению с PBS (4,0% и 31,7% через 24 ч, соответственно (Рис. 3). На основе полученных данных сделали вывод, что состав водной фазы оказывает большее влияние на кинетику выхода ДСИП, чем состав раствора, против которого проводится диализ.

Включение ДСИГТ в полимерные матрицы

Биологически активный имплантаг включает в себя полимерную матрицу, культивируемые на ней клетки и включенные биомолекулы, например, белки и пептиды, высвобождающиеся в процессе диффузии и/или деградации матрицы и ускоряющие процесс репарации тканей.

Время, ч

Рис. 2. Кинетика изменения концентрации ДСИП во внешнем растворе при диализе через полупроницаемую мембрану при 37°С против PBS (рН 7,4). 1 - водный раствор, 2 -

5—5% АОТ в эвкалиптовом масле, содержащий 2% Pluronic F-127, дополнительно содержащий 2 мг/мл БСА (3), хитозана (4), Д ЭАЭ-декстрана (5). Содержание ДСИП -1,5

мг/ мл наноэмульсии.

Время,ч

Рис. 3. Кинетика выхода пептида из наноэмульсий ЭМ/вода (вода vs вода) и ЭМ/PBS (PBS vs PBS) против воды и PBS соответственно, и наноэмульсии ЭМ/вода (вода vs

PBS) против PBS.

В качестве полимерных матриц для включения ДСИП были выбраны макропористые гидрогели модифицированного поливинилового спирта (ЛВС), ПВС, модифицированного глицидилмегакрилатом (ПВС-ГМА), сополимера димегиламиноэтилмегакрилата и мегилен-бис-акриламцда (Со-ДМАЭМА-МБАА), сополимера акриловой кислоты и мегилен-бис-акриламида (Со-АА-МБАА), и изотропный гидрогель на основе модифицированного ПВС. Выбор данных полимеров был обусловлен их высокой биосовмесгимостью, биодеградируемосгью, механическими свойствами и широким использованием в тканевой инженерии и медицине.

Включение ДСИП в матрицы на основе ПВС

Одним из методов получения сшитых гидрогелей на основе ПВС является использование предварительно модифицированного ПВС, содержащего в боковой цепи ненасыщенные группы, образующие межмолекулярные сшивки в присутствии инициаторов радикальной полимеризации (Н202 и аскорбиновая кислота). Данный метод позволяет увеличить термостабильность синтезируемых полимерных систем и делает возможным регулирование размера полимерных фрагментов, образующихся при биодеградации полимерного гидрогеля. В данной работе был использован низкомолекулярный (Мп=12><103) ПВС, модифицированный ГМА. ДСИП включали как в предварительно сформированные макропористые матрицы на основе модифицированного ПВС, так и в процессе приготовления матриц (изотропные гели).

Пептид включали методом нанесения на предварительно сформированную матрицу с последующим лиофильным высушиванием либо в объем изотропного геля, в который пептид включали непосредственно на стадии формирования гидрогеля. Роль инициаторов радикальной полимеризации выполняли аскорбиновая кислота и Н202. Эффективность включения составляла около 100%.

Включение ДСИП в матрицы на основе ПВС-ГМА

Включение ДСИП в матрицы, содержащие эпокси-группы (ПВС-ГМА), осуществлялось путем 12 ч инкубации в растворе ДСИП Процесс контролировался ВЭЖХ. Происходило

100% необратимое связывание ДСИП с подложкой коваленшыми связями через эпоксигруппы.

Включение ДСИП матрицы на основе ионогенных сополимеров (Со-ДМАЭМА-МБАА и Со-АА-МБАА)

Так как ДСИП несет в своем составе заряженные аминокислоты (С-концевую Glu, N-концевой Тгр и боковую Asp), провели его включение в ионогенные заряженные полимеры Со-ДМАЭМА-МБАА и Со-АА-МБАА. Включение пептида, контролируемое ВЭЖХ, осуществлялось посредством 16 ч сорбции из водного раствора. Эффективность включения составляла в Со-ДМАЭМА-МБАА около 100% и в Со-АА-МБАА - 2,5-6%. Низкая эффективность связывания в последнем случае может объясняться отрицательным зарядом поверхности данной матрицы, удерживающей ДСИП с помощью слабых водородных и Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий. Таким образом, для включения ДСИП в состав матриц, основанных на ионогенных полимерах, был выбран Со-ДМАЭМА-МБАА.

Модификация матриц Со-ДМАЭМА-МБАА полифенольными соединениями

В связи с быстрым выходом ДСИП из матриц Со-ДМАЭМА-МБАА, была осуществлена модификация матрицы псшифенолами (кверцетин, дигидрокверцетин, байкалин), которые образуют водородные, электростатические и ковалентные связи с положительно заряженной матрицей и самим пептидом.

Матрицы Со-ДМАЭМА-МБАА (6-20 мг), содержащие ДСИП, инкубировали в течение 3 сут. в 25% спиртовом растворе ДГК и 96% спиртовом растворе кверцетина и байкалина (0,1 мг/мл), затем высушивали на воздухе в течение 1 сут. При использовании в качестве модификатора байкалина (0,1 мг/мл) выхода ДСИП в раствор полифенола в процессе инкубации не происходило; при использовании кверцетина данный показатель составил 30±3%, ДГК - 15±2%, что может объясняться тем, что кверцетин является более сильной кислотой, чем два других флавоноида. Эти данные также подтверждают роль ионной силы раствора в инициации выхода ДСИП из матрицы.

Выход ДСИП из различных матриц

Выход из ПВС-матриц. На Рис. 4 представлена кинетика выхода пептида из макропористого геля на основе Акр-ПВС. Пептид включали методом нанесения на предварительно сформированную матрицу с последующим лиофильным высушиванием (Кривые 1,2, 3) или при включение пептида а изотропный гель на стадии его формирования (Кривая 4).

При инкубации гидрогеля с включенным пептидом в 0,9% р-ре NaCl и PBS (рН 7,4) практически полный выход ДСИП наблюдали в течение 3 ч, а в воде - за 1 ч. (Рисунок 4, кривые 1, 2, 3). Выделение ДСИП из изотропных гелей ПВС происходило значительно медленнее: 26% спустя 30 мин и 75% спустя 33 ч (Рис. 4, кривая 4). Достаточно быстрое высвобождение пептида из макропористых гидрогелей может быть объяснено их высокой удельной поверхностью, обусловленной наличием в них развитой пористой структуры.

100 90

с s

о

а

о

80 70

60 50

40

30

20

1Z

■л—I—I—1

0 1 2 3 4 5

6 7 9 30 31 32 33 34

Время, ч

Рис. 4. Кинетика выхода ДСИП из макропористого гидрогеля Акр-ПВС в воде (1), физ. растворе (2), фосфатно-солевом буфере, рН 7,4 (3), и из влажного изотропного геля в физ. растворе (4). За 100% принимали кол-во ДСИП, включенного в матрицу.

Кроме того, связывание пептида с поверхностью матрицы обеспечивалось лишь за счет образования непрочных водородных связей между гидроксигруппами ПВС и функциональными группами молекул пептида

Выход пептида из лиофилизированных образцов изотропных гидрогелей Акр-ПВС происходил существенно быстрее, чем из влажных свежеприготовленных.. Так, из лиофилизированного образца за первые 30 минут выделялось 62% пептида, а максимальная

концентрация пептида в растворе (85 %) достигалась после 3-х часов инкубирования (Рис. 5). Таким образом, кинетика выделения пептида из лиофилизированного изотропного геля была сравнима с таковой для образцов макропористого гидрогеля. Быстрый выход пегпкда может объясняться образованием при кристаллизации воды в объеме гидрогеля пор-дефектов структуры, существенно увеличивающих его удельную поверхность. При высушивании на воздухе этот процесс занимал до 3 сут. в силу высокой гидрофильное™ ПВС. При этом было обнаружено разрушение значительной доли включенного пептида (Рис. 5, кривые 2а и 26).

90

80

С 70

s

О НО

а

о Ы)

m

1- о 40

ф

т s 30

¡S 70

10

0

О 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 Время, ч

Рис. 5. Кинетика выхода ДСИП из изотропного гидрогеля Акр-ПВС при инкубации в

0,9% NaCI в зависимости от способа его высушивания: 1 -свежеприготовленный влажный образец (без сушки), 2—образец после сушки в течение 3 сут. при комнатной температуре (2а - основной пик, соответствующий ДСИП, 26 - дополнительный пик), 3 -лиофильно высушенный образец. За 100% принимали количество ДСИП, введенное в

матрицу.

Выход ДСИП из ПВС-ГМА-матрицы. Изучение кинетики выхода ДСИП из макропористых гидрогелей, содержащих эпоксидные группы, показало, что практически весь пептид связывается полимерным носителем через 16 ч инкубации матрицы в водном растворе пептида. При инкубации матрицы с иммобилизованным пегпвдом в физ. растворе спустя 48 ч не наблюдали выхода ДСИП или продуктов его распада Этот факт можно объяснить взаимодействием эпоксидных групп носителя с карбокси- и аминогруппами С- и N-концевых аминокислот пептида - Glu и Тгр, соответственно, а также с карбоксильной группой Asp с образованием негидролизуемых в ковапентных связей.

Выход ДСИП из Со-ДМАЭМА-МБАА-матрицы. В ходе 24 ч инкубации образца Со-ДМАЭМА-МБАА, содержащего ДСИП, в воде или 25% растворе ЕЮН выхода пептида в раствор не наблюдали. Возрастание ионной силы способствовало выходу ДСИП. В связи с тем, что уровень рН внутренней среды организма варьирует, а в области травмы или хирургического вмешательства формируется окислительный стресс, необходимо было исследовать влияние рН на кинетику выхода пептида Мы изучали выход ДСИП при нейтральном (7,4) и кислом рН (5,0 - 5,9) среды (Рис. 6).

♦ 0,9% №С1

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Время, ч

Рис. 6. Кинетика выхода ДСИП из гидрогеля Со-ДМАЭМА-МБАА (6%) при разных

рН

При кислом рН образец Со-ДМАЭМА-МБАА увеличивался в размерах вследствие формирования солевых групп, значительно увеличивающих гидрофильность полимера и выход ДСИП происходил медленнее, чем при нейтральном. При возрастании рН и ионной силы раствора происходило уменьшение объема гидрогеля. Таким образом, увеличение положительного заряда матрицы уменьшает выход пептида Замена статической системы (постоянный объем среды) на динамическую (замена всего объема среды через каждые 60 мин) приводила к полному выходу ДСИП в течение 2 ч, что подтверждает факт реадсорбции пептида.

Выход ДСИП из матриц Со-ДМАЭМА-МБАА, модифицированных флавоноидами. Модификация Со-ДМАЭМА-МБАА флавоноидами замедляет выход пептида по сравнению с контролем, и пролонгирует его до 9-10 ч и более. Введение байкалина существенно снижало выход ДСИП (Рис. 7).

™ 20 - ^ _______- ж ........г

0 -т-1--,-I-т-Т-I-т-,-,-т-,-Т-1-,

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Время, ч

Рис. 7. Выход ДСИП из матриц Со-ДМАЭМА-МБАА, модифицированных полифенолами (0,1 мг/мл в 25% этаноле).

Причиной замедления выхода ДСИП является преимущественно формирование дополнительных поперечных сшивок на поверхности матрицы, что создает затруднения для выхода пептида и его частичную пришивку к матрице. Исходя из вышеприведенных данных, для дальнейшего исследования был выбран дигцдрокверцетин.

При изменении концентрации ДГК в пределах 0,1-10 мг/мл было показано, что разница в скорости выхода пептида при концентрациях ДГК 0,1-1 мг/мл незначительна и обе эти концентрации позволяют пролонгировать выход ДСИП по сравнению с контролем (Рис. 8).

Модификация Со-ДМАЕМА-МБАА ДГК с последующим удалением остатков полифенола при промывке физ.раствором в течение 2 суток позволяет устранить токсичность матрицы (Рис. 9). Более желательная с точки зрения сохранности пептида внутри матрицы промывка этанолом не снижала токсичности матрицы (Рис. 9, В).

-*— Контроль -я- Кверцетин Байкалин

Дигцдрокверцетин --4

ф контроль —•—0,1 мг/мл л 1 мг/мл

о ,

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Время, ч

Рис. 8. Выход ДСИП из матриц Со-ДМАЭМА-МБАА после инкубации с 0,1

мг/мл и 1 мг/мл ДГК

Взаимодействие окисленных полифенолов с аминогруппами Со-ДМАЭМА-

МБАА

Высушивание матриц Со-ДМАЭМА-МБАА, модифицированных псшифенолами, на воздухе сопровождалось потемнением их окраски вследствие окисления полифенольных соединений, в процессе которого образуются дополнительные связи полифенолов как с аминогруппами Со-ДМАЕМА-МБАА затрудняющие выход ДСИП, так и с аминокислотами пептида.

Добавление в систему 3% Н2С>> приводило к ускоренному (в течение 24 ч уб. 72 ч) развитию качественной окраски модифицированной матрицы. Аминогруппы полимера являются причиной окисления гидроксигрупп ДГК до оксигрупп. Для проверки этого было проведено исследование взаимодействия ДГК с полиэтиленимином (ПЭИ, М\¥ 25000). В результате были получены аналогично окрашенные водо- и спиртонерастворимые пленки, что подтверждает участие положительно заряженных аминогрупп в процессе формирования дополнительных сшивок и создания стерических затруднений для выхода ДСИП.

*

Ф г:л

В

Рис. 9. Состояние клеток в присутствии матриц Со-ДМАЭМА-МБАА, модифицированных ДГК. А, В-линия HBL, отмывка матриц PBS, рН 7.4 (А) и 96% этанолом (В) (ЗООх), рост клеток линии НаСаТ вокруг фрагмента матрицы (отмывка PBS, рН 7,4) (100х) (С) и А431 (D).

Влияние ионной силы раствора на динамику структуры ДСИП

Сохранность ДСИП различалась в растворах с различной ионной силой. Так, в дистиллированной воде структура ДСИП оставалась неизменной в течение, по крайней мере, нескольких суток, в то время как в физ. растворе оно сокращалось до 12-24 ч. Для анализа роли ионная сила (ИС) раствора на стабильность структуры ДСИП провели исследование молекулярной динамики ДСИП при изменении ИС с помощью программы GROMACS 4.5 (100 не, 310 К, 5Х5*5 нм3 ячейка с явно заданной водой). ИС брали равную 0 М, 0.154 М и 1,54 MNaCl.

Показали, что с увеличением ИС пептид больше времени проводит в развернутой конформации, т.е. он менее стабилен. Добавление солей резко увеличивает подвижность пептида. С увеличением ионной силы доля вторичной структуры (бета-повороты) падает, а доля неупорядоченной конформации возрастает (0,54 уб. 0,60-0,63); доля "основного" кластера (свернутая молекула) уменьшается за счет второстепенных кластеров (например, развернутых конформаций); общее число кластеров (а значит, и конформационная гетерогенность) растет. Таким образом, в результате дестабилизации структуры ДСИП в растворах с высокой ионной силой и повышенной подвижности молекулы происходит ускоренная деградация ДСИП.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и оптимизированы способы включения ДСИП в обратные наноэмульсии на основе: 1) эвкалиптового масла и воды и 2) лимонена и воды.

2. Показано, что в составе наноэмульсии сохраняет стабильность 80-90% ДСИП при хранении в течение не менее 2 месяцев.

3. Показано, что скорость выхода ДСИП из наноэмульсий на основе эвкалиптового масла в 7 раз ниже по сравнению с выходом из наноэмульсий с использованием лимонена.

4. Разработаны способы включения ДСИП в полимерные матрицы (гидрогели) на основе поли(диметиламиноэтилметакрилата) (ДМАЭМА), поливинилового спирта (ЛВС) и ПВС, модифицированного группами глицидилмегакрилата (ПВС-ГМА).

5. Модификация матриц ДМАЭМА и ПВС полифенольными соединениями, включая дигидрокверцетин, позволяет снизить скорость выхода ДСИП в 3 раза.

6. Методами математического моделирования показано возрастание вероятности нахождения молекулы ДСИП в состоянии неупорядоченной конформации при увеличении ионной силы раствора, чт о приводит к ее деградадии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Рекомендовать использование полученных w/o наноэмульсий на основе эвкалиптового масла и воды для включения коротких гидрофильных пептидов, в том числе ДСИП, с целью применения в фармацевтических и медицинских исследованиях для разработки лекарственных препаратов пролонгированного действия.

2. Рекомендовать использование полученных матриц на основе модифицированного поливинилового спирта и сополимера диметиламиноэтилметакрилата и метилен-бис-акриламида, содержащих ДСИП, для разработки тканеинженерных конструкций для замещения и восстановления поврежденных / утраченных тканей и применения их в репаративной медицине.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Биомолекулы в коллоидных наноконтейнерах для доставки лекарств: включение и свойства дельта-сон индуцирующего пептида / Т.В. Суханова, ИА. Прудченко, Е.С. Ефремов и др. // Вестник Московского университета, Химия,- 2010-Т.51(3).-С. 209-214.

2. Entrapment and In Vitro Release of Delta-Sleep Inducing Peptide from Polymer Hydrogels Based on Modified Polyvinyl Alcohol / T.V. Sukhanova, AA. Artyukhov, LA. Prudchenko, et al. // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry.- 2012.-V. 6(2).- P. 149-155.

3. Delta-Sleep Inducing Peptide Entrapment in the Charged Macroporous Matrices / T.V. Sukhanova, A.A. Artyukhov, Y.M. Gurevich, et al. // Materials Science and Engineering.- 2014,- V.42.- P. 461^165.

4. Способ включения квантовых точек методом соосаждения в пористые частицы карбоната кальция / Т.В. Суханова, А.Ф. Щапов, В.В. Манохина, и др. // Патент России № 250957. 2013. Бюл. № 27.

5. Способ формирования многофункциональных систем. / А.Н. Генералова, Т.В. Суханова, С.В. Сизова и др. // Патент России № 2532559. 2014. Бюл. №31.

Заказ № 61-Р/02/2015 Подписано в печать 13.02.15 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,0

ООО "Цифровичок", Москва, Большой Чудов пер., д.5 тел. (495)649-83-30 v О^У) www.cfr.ru ; e-mail: zakpark@cfr. ru