Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые методы иммобилизации и культивирования клеток в полимерных гидрогелях

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Новые методы иммобилизации и культивирования клеток в полимерных гидрогелях"

Российская академия наук

Ордена Трудового Красного Знамени Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина

На правах рукописи

МАРКВИЧЕВА ЕЛЕНА АРНОЛЬДОВНА

НОВЫЕ МЕТОДЫ ИММОБИЛИЗАЦИИ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК В ПОЛИМЕРНЫХ ГИДРОГЕЛЯХ

03.00.04.— Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва — 1992

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина РАН.

Научный руководитель — доктор химических наук, профессор В. П. Зубов.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор М. И. Штильман; доктор химических наук Л. Д. Румш,

Ведущая организация—Институт цитологии РАН (Санкт-Петербург).«

Защита состоится нр»СРя 1992 г. в_час. на

заседании Специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М. М, Шемякина РАН по адресу: 117871, Москва, ул. Миклухо-Маклая,, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М. М, Шемякина.

Автореферат растяп ^ ок/»ясРя_ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета ИБХ им. М, М. Шемякина РАН кандидат химических наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РЛБОТЬ.

Актуальность______проблемы, Актуальность проблемы

создания пооих методой иммобилизации в полимерные гидрогели живых к,-еток-биокатализаторов определяется быстры»! развитием тех направлений биотехнологии, в которых наиболее полно можно реализовать биотехнологичсский потенциал иммобилиэооанных систем. Из этих направлений прежде всего следует отметить клеточную инженерно (крупномасштабные промессы культивирования клето:; растений, животных и человека для получения различных биологически активных веществ, вакцин и т.д.), гибридокную технологию (крупномасштабное получение моноклоналыных антител), генетическую инженерию (стабилизация клеток и рекомбинантных ДНК при промышленном получении генноинжгнерпых' продуктов),-тохническуя микробиологию' (повышение эффективности биосинтеза),' биомопекулярное приборостроение

(конструирование "биосенсоров), очистку сточнмх вод. Разработан ряд методов иммобилизации клеток в полимерные гидрогели как на основе природных материалов, так и синтетических, однако, все эти методы имеют недостатки. В случае использования природных полимеров (белков, полисахаридов) к недостаткам следует отнести прежде всего нестандартность исходного сырь» для их получения и биологическую нестойкость к экзогенной микрофлоре, что существенно осложняет разработку крупномасштабных процессов на основе иммобилизованных _клеток. Кроме того, источники природных полимеров почерпаемы, а сами пол«м«чч.1, как правило, дороже синтетических. Реализация *е (щчывимстгп известных п насюя!::?«'. впемя методов вк^пченич Iч симюгичесир нолинё?ы попря>.ена с **с.'*игм .<чг».'ими или текнгрэпч'иыми гоэ^ейсшиям-? на кпп::<и, что о тгчютельно п.ниягч' н)' ну нъпчкпрычиюать,

снижая как биокаталитическую, так и биосинтетическую активность. Поэтому проблема создания новых "мягких" методой иммобилизации клеток в гели на основе синтетических полимеров остается важгой и актуальной частью получения биокатализаторов для самых различных биотехнологических процессов.

Иель_..р_або_тьи Целью работы являлось создание новых "мягких" методов иммобилизации «ивых клеток (в частности, микроорганизмов Cluconobacter oxydons, Corynebacterium glutaalcum и различных линий гибридом) в гидрогели на основе поли-Н-винилкапролактама (ПВК) для повышения эффективности биотехнологических процессоа на основе иммобилизованных клеток,. Для достижения поставленной цели были решены.следующие задачи:

- разработаны способы формирования и стабилизации гранул гидрогеля с последующим исследованием их физико-механических и диффузионных характеристик, а такие изученном структуры;

- на основе этих способов созданы новые методики иммобилизации клеток кикрооргонизмов и изучены возможности повышения их Ферментативной активности и биосинтетической продуктивности;

предложены новые методики включения гибридом в гидрогели ПВК и культивирования их в иммобилизованном состоянии. Изучены морфологические особенности иммобилизованных клеток.

Иахчная_.Ш20ИЭНй.. Впервые предложено использовать ПВК для иммобилизации живых клеток. Разработаны новые методы получения полимерных диспарсиП, устойчивость которых в условиях перемешивания достигается введением по побранных экспериментальным путем веществ, выполняющих функцию стабилизаторов. Исследованы Физико-механические и диффузионные характеристики полученных дисперсий гидрогелей в зависимости от способа получения, композиционного состава, типа стабилизатора и его

- у -

концентрации (исследования выполнены в ходе совместной работы с сотрудниками НИТХТ им. Н.В. Ломоносова Кузькиной И.Ф., Пйшкиным И.И. и НИФХИ ии. Карпова Киршем О.Э.). Разработаны новые методики иммобилизации в гидрогели ГШК микроорганизмов Gluconobacter oxydons, осуществлявших процесс трансформации D-сорбита в L-сорбозу и клеток Carynebactcrium glutamlcum. продуцируипнх глутамннопуо кислоту. Предложен ояностаийиый метод иммобилизации о гранулы ГШК различных линий гибридом, продуцирующих моноклонэльные антитела 1дС и IgM классов. Впервые исследованы морфологические особенности иммобилизованных в гидрогели гибридом методом проточной цнтометрии (совместно с группой иммунохимии ИБХ РАН). Показаны морфологические изменения иммобилизованных клеток о сравнении со свободными клетками, которые культивировали в суспензии.

Ардкл:нч&ская_шии1ш1хь_ваб$ши. Разработанные новые простые и "мягкие" методу иммобилизации хивых клеток в полимерные гидрогели на основе ПВК могут быть использованы для включения инрокого спектра ферментов, клеток микроорганизмов, а также растительных и животных клеток в самых различных бнотехнологических процессах длл получения БАВ, применяющихся о медицине и пищевой промышленности.

Апвп0аш1а „eaöoxiL. Основные, результаты диссертационной работы были представлены на VI Международной конференции молодых ученых по органической и биоорганической химии (Бехине, Чехо-Словакия, 1989), Международной конференции "Die Rolle der /Zellkulturen in der Biotechnologie" (НойебранденбурГ, Германия, 1989), на: 20 Международном симпозиуме FEBS (Будапешт, Венгрия, 1990), на Всесоюзной конференции "Волорастоориг'ы? полимеры и их применение" (Иркутск, 1991).

Публикации, По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

- ь -

Структура_____и. „объем диссертации. Диссертация

изложена на страницах машинописного текста, состоит

из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, заключения и выводов. Список литературы содеряит источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Получение полимерных гранул на основе ЛВК и исследование их свойств

1.1. Разработка способов Формирования и стабилизации

гранул

ПВК относится к классу поли-Н-виниламидоо, в водном растворе является обратимо термоосаядаекым полимером и имеет нижниа критическую температуру растворения 30-35°С.

—\ ( >=° ) .

\ 2й / \ сп2----Ыц /п

ПВК

НагреваИие водного растпора ПВК приводит к его

1

термоосакдению с полным разделением фаз в интервале Физиологических температур (37°-40°С) (Кирш Ю.Э и др., 1979). При этом процесс осаждения происходит за счет конФормационных изменений макромолекул н их глобулизашж, которая сопровождается вытеснением части воды и усилением гидрофобных взаимодействий. Вь;ше критической температуры растворения полимерные клубки образуют нерастворимые ассоциаты, которые выпадают в осадок. Ранее было исследовано включение в осадки ПВК различных веществ, в частности белков, которые нековалентно связывались с

полимером (Шерстгл С,0. и др., 1987). Уникальное сочетание описанных выи'е свойств ПВК с его способностью к комплексоо1:разованию с различном соединениями определило выбор этого синтетического полимера-для разработки пссых иетодоа иммобилизации кнсих клеток. \

Установлено, что формирование гранул гиг.погеля легко осуществить путем ¿обазления по каплям pacTDopa полимера о предварительно погогретуо дз 37-';0°С среду (соду, содно.-солеоой раствор, например, ооссатный буфер или Физиологический растпор). Покаоано, что минимальная концентрация полимера, необходимая для получения гранул, определяется молекулярной массой (М.М.) полимера. Тек, при использовании ПВК с H.H. 170 ООО и 900 ООО эта концентрация состаоляла 15" и 3.5%, соответственно. Для всех дальнейших исследований и разработки методик иммобилизации клеток использовался ПВК с H.H. 900 ООО.

в связи с тем, что гранулы агрегировали при переманивании, были найдены вевзства, выполндазде роль стабилизаторов, которые модифицировали поверхность гранул, образуя с ПВК растворимые (после снижения температуры до комнатной) или нерастворимые комплексы (табл.1,2).

Таблица 1

Стабилизаторы, обеспечивающие получение нерастворимых после снижения температуры гранул (Метод Л).

Стабилизатор Иинимальная*

концентрация, X

Таниин 0.5

Резорцин 0.1

Пирокатехин 0.5

Гентизиновая кислота 0.1

J Гидрохинон _ | 0.5

• Минимальная концентрация стабилизатора, необходимая для стабилизации гранул.

- Б -

Таблица 2.

Стабилизаторы, вводимые по методу В, и термообратимость полученных гидрогелей в зависимости от времени.

Стабилизатор Оптимальное Термообратимость

соотношение геля через

1 ! ПВК-стабилизатор 50 мин. 1 5 дней

(масс.)

овальбумин 4.5/2.5 есть нет

яичный порошок 3.0/2.0 есть есть

ИоККи" 4.5/0.5 есть есть

"натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы

А В

Рис./. патодм получения ПВК гранул с иммобилизованными в ник клетками : А - ввгденизм стабилизаыра в среду; В - введением стабилизатора-в полимерный раствор с последувшим их соосаждением.

Растворимость последних определялась • как тип-п стабилизатора, так и истодом его введения (Г^с./.й методе Л стабилизатор (см. табл.1) предварительно вводили в среду, в которую затем по каплям добавляли в полимерный раствор • (в дальнейшем для иммобилизации

клеток смешивали этот раствор с клеточной суспензией). В кетоде В (см.табл.2) стабилизатор вводили непосредственно в раствор полимера, а затем уже формировали. гранулы, добавляя полученную смесь в среду или буфег».

Установлено, что термообратнмость гидрогелей, полученных по методу 8 с использованием стабилизаторов, которые представлены п таблице 2, зависела от времени выдерпвания гранул г,ри температуре 37-Ч0°С.

1.2. Исследование диффузионных характеристик полимерных гранул

Для проведения модельных скспериментов по изучению кинетики выхода низкомолекулярннх веществ из гранул в водную среду использовали краситель пиронин Ж. Накопление его о среде по мере освобождения из гранул фиксировали спектросотометрически по изменению плотности полосы поглощения ( 3 = 550 им). Были исследованы зависимости выхода красителя от размера частиц, типа и концентрации стабилизатора, а также способа его введения; от времени стабилизации и плотности гидрогеля ПВК. Показано, что выход красителя увеличивается при уменьшении размера -грянул. Найдено, что выход .пиронина из гидрогелей, стабилизированных танином по методу А, уменьшается с увеличением концентрации танина, что связано, по-нашему мнению, с увеличением количества водородных связей, между С=0 группой ПВК и гидроксилами танина. Обнаружено, что кинетика выхода пиронина в зависимости от концентрации раствора ПВК, взятого для приготовления гидрогеля, определяется растворимостью комплекса ПВК-стабилизатор. В 'случае образования нерастворимого комплекса ПВК-таннн (рис.2, максимальный выход красителя наблюдался при концентрации ПВК 7 X. Снижение выхода пиронина при концентрациях полимеру, больших 7 X, связано, видимо, с увеличением плотноеt;i

- а -

геля. Уианьионие оыхода красителя при снияе1:ии концентрации ПВК с 7 до 2 можно объяснить

возрастанием глубины проникновения тонина в гранулу с уменьшением концентрации полимера. Результатом этого является увеличение толкины оболочки нерастворимого комплекса "ПВК-танин" на поверхности гранулы, что затрудняет выход красителя.

Таким образом, выход пиронина из полимерных гра::ул, стабилизированных танином, определяется как плотностью гидрогелсвого матрикса, так и плотностью и толшноп оболочки на поверхности гранулы, представлявшей собой нерастворимый комплекс ПВК- танин. При использовании 12% раствора ПВК образуется, вероятно, более плотная и тонкая оболочка, чей в случае 4.5% раствора.

Рис.2 Зависимость выхода пиронина Ж из гранул, стабилиэиро. мных танином (0..5Х), от концентрации ПВК, используемой для формирования гранул : 1 -7 X , 2-1.5 X , 3 - 12Х .

В случае использования в качестве стабилизатора оксипропил-Целлюлоэы, образующей комплекс с ПВК,

растворимый после снижения температуры, выход красителя уменьшается с увеличением концентрации ПВК с 4.5 до 122.0 случае использования в качестве стабилизатора оксипропнл-целлюлозы, образушей комплекс с ПВК, растворимый после сиихе-ия температуры, выход красители уменьшается с увеличением концентрации ПВК С 4.5 до 12Х.

1.2. Исследование механической прочности гранул ПВК

Изучена зависимость прочности гранул от вида стабилизатора и метода его введения. Прочность определяли по времени, необходимому для полного разрушения гранул при интенсивном их перемешивании в колбе с физиологическим раствором на магнитной мешалке (700 об/мин). Показано, что прочность зависит от метода стабилизации : все гранулы (за исключением гранул, стабилизированных ИоКИИ), полученные по методу В, превосходили по своим Физико-механическим характеристикам носители, полученные по методу А. «

Таблица 3

Зависимость механической прочности ПВК гранул от концентрации гидрогеля, типа и концентрации стабилизатора

Конц-я Стабилизатор Концентрация Время полного

ПВК стабилизатора, x разрушения гранул,

мин.

5 танин 1.0 2

10 танин 1.0 Ч

5 резорцин 0.5 1

10 резорцин 0.5 150

Примечание : Время стабилизации гранул при ЧО.^С - 1 час:

Тек, гранулы, стабилизированные яичным порошком (2 % суспонэия) или овальбумином (2 X раствор) не разрушались в услозиях проведения эксперимента о течение С часов. О свою очередь, механическая прочность носителей, стабилизированных по методу . А, зависела от типа стабилизатора и его концентрации, времени его контакта с гранулами, а такяе концентрации полимера (таблица 3) 1.3. Исследование структуры полученных гранул гидрогеля методами микроскопии

Исследование структуры полимерных гранул с использованием методов электронной микроскопии позволило объяснить некоторые результаты, полученные при исследовании Физико-механических и диффузионных свойств гидрогелей. Обнаружена две принципиально отличные друг от друга структуры гранул в зависимости от метода их

Рис.3 Структура гранул ПВК в зависимости от

способа .их получения : а) метод А (стабилизатор тглнм); в) метод В (стабилизатор овальбумин).

Введение стабилизатора по методу Л присолило к образованна гранул с уплотненной, поверхностной оболочкой и ры;;льм, возиокна полукндким при температуре нняе 37° С, неупорядоченным матриксон. При введении стабилизатора по методу В получали гидрогель упорядоченного строения, в котором чередование полнмерных оолокон было равномерным по всему объему грануп, что, вероятно, приводило к увеличению механической прочности гранул..

- 11 -

2. Разреботка методов иммобилизации клеток микроорганизмов

2.1.Изучение влияния ПВК н стсгбилизатсроз на <Ш)мемтативную активность и биосинтетическуо продуктивность свободных клеток

Было показано, что. доЗэвкн ПВК ( в концентрациях, необходимых г,1.я формирования гидрогелевых гранул) в руспен-зионнуо культуру не влияли ни на с^рментативнуэ активностьклеток Sluconobacter oxydons, ни на .выход глутаминовой кислоты, синтезируемой культурой Corynebac-terlum glutamlcum. Сба микробиологических процесса проводили при 28-30эС, что ограничило выбор ранге предложенных стабилизаторов только теми, которые давали комплексы с полимером, нерастворииые после снияения температуры с 10°С до 28°С. Танин и резорцин оказались наименее токсичными из всех веществ, представвеных в табл.1.

Таблица

Влияние стабилизаторов на пазвитие свободных клеток Carynebacterlua glutamlcua п выход продуцируемой ими глутаминовой кислоты,

Стабилизатор Концентрация стаб-ра,Х GÎI» Выход глутаминовой кислоты,г/л

Таннин 0.1 36.5 22.2

0.5 25.5 14. 7

Резорцин 0.1 ,22.3 23.6

0.5 Л11.3 1.5

Контроль - 32. :< 30.9

* Оптическая плотность клеточной суспензии при 546 нм Начальная концентрация клиток 7.5 мг/мл (по сухому весу).

- 12 -

Степень воздействия танина и резорцина на клеточную активность и синтез продукта определялась прежде всего концентрацией этих стабилизаторов (Табл.^) и временем контакта с клетками. Так, ингибирование сорбитолде-гидрогеназной активности суспензионной культуры G. oxydons начинали наблюдать уже через час после добавления 0.7Х танина. Увеличение концентрации до IX, а затем 2.5? привадило к 101 и 701-ной потере Ферментативной активности, соответственно, в сравнении с контрольными пробами. В дальнейшей работе мы использовали концентрации танина 0.5-0.7Х и резорцина - 0.1Х, а оптимальное время стабилизации составляло 30-40 мин.

2.2. Влияние плотности гидрогеля ПВК на ферментативную активность иммобилизованных микробных клеток Увеличение концентрации раствора ПВК, используемого

Рис.^. Зависимость стабильности ферментативной активности клеток в.охуйопз от концентрации раствора ПВК, используемого для получения геля : кривая 1 - 3.5 X; 2-4.2 2; 3 - 6 Л X.

- 13 -

для получения геля, приводило к снижению сорбитолде-гидрогеназной активности клеток G.oxydans. При концентрации геля ниже 3.5 ' наблюдалось механическое разрушение гранул. В случае иммобилизации в ПВК гидрогели клеток С .glutanicwn оптимальная концентрация гидрогеля составляла 5 I.

Зависимость стабильности Ферментативной актноности клеток С.oxydons от концентрации гидрогеля представлена на рис.4 Максимальная активность во всех случаях была на 5 трансформации (91 мМоль/мл гранул час) и превышала таковую, для клеток, иммобилизованных в полиакриламидиый гель о 1,6 раза при сохранении операционной стабильности (Лонова и др., 1991).

2.3. Иммобилизация микроорганизмов в композиционные ПВК-Са-альгинатные гидрогели

Для повышения Ферментативной активности клеток за счет улучшения газо- и массообмена, а также создания максимально благоприятных условий для растущих микробных клеток внутри полимерных гранул был предложен метод получения нопого макропористого носителя. Идея конструирования такого носителя заключалась в использовании свойства термообратимости гелей ПСК. Композиционный ПВК-Са-альгинатный гель получали при 37°С. Затем снижали температуру с 37°С до комнатной, выдерживали 30 мин. при и промывали несколько раз полученные гранулы с иммобилизованными в них клетками Физиологическим раствором. При этом приблизительно 50% от исходного количества ПВК растворялось 'и удалялось при промызке. Сравнительное исследование структуры полученного композиционного гидрогеля с нативным Са-альги-нагным гелем показало, что в первом имеются макрополости (5-10 мкм) с локализованными в них иммобилизованными, клетками (рис. ¿Г.

Рис.¿Г Структуры нативного Са-альгинатного (б) и

композиционного ГШК-Са-альгинатного (û) гидрогелей с иммобилизованными в них клетками C.oxydans.

Рис.*. Динамика изменения скорости окисления сорбита клетками С. oxydons, иммобилизованными в Са-пг^гинатный (кривая 1) и композиционный ПВК-Са-альгинэтный (кривая 2) гидрогели.

Диаметр макрополостей зависел от концентрации ПБК к соотношения компонентов в смесч. Сразу поел" имиО'Хли-*»»-цни клеток C.oxydans в ксмпо.жционный гидрогель наблюл«ли

- 15 -

синаение сорбитолдегидрогеназной активности по сравнения с нативным Са-альгинатным гелем, что, вероятно, объясняется усилением ингибирушего действия ионов Са2+ при повышении температуру до 37°С. Однако уже через 3 суток активность растущих клеток, иммобилизованных о композиционный гидрогель, сравнялась по величине' с активноитью клеток в нативном геле, о через 20 суток превышала последнею вдвое (рис.<>,. Через 45 суток активности клеток о композиционном н нативном Са-альгинатном гидрогелях составляли 3.0 г л-1 час-1 и 0.5 г л~1час~1, соответственно. С помощью электронной микроскопии было показано, что рост активности коррелировал с ростом клеточной популяции внутри геля, при стом по своим размерам микроколонни клеток в композиционном геле превышали ' таковые в натизном. По нашему мнению, описанный выше подход яоляется перспективным и для получения макропористых гелей на основе синтетических полимеров.

3. Разработка методики иммобилизации и культивирования гибридом в гидрогелях ПВК.

3.1. Исследование влияния ПВК на жизнеспособность клеток. Выбор стабилизатора и метода его введения.

При исследовании влияния ПВК на яизнеспособность хивотных клеток (тестировали клеточную линии СКО и 4 различные линии гибридом) было показано, что добавление 3-52-ного раствора полимера в суспензионную культуру не снижало индекс пролиферации - клеток и не увеличивало количество, мертвых клеток о сравнении »с • контрольн^н экспериментами.

При проверке танина н резорцина на токсичность найдено, что оба вещества, успешно использованные при иммобилизации микроорганизмов, даже с низких концентрациях (0.05 -0.5 1) вызывали гибель к*еток животных уже через

- 16 -

несколько часов после их добавления в клеточную суспензию. Выбор в качестве стабилизатора нетоксичного для клеток стандартного яичного порошка (см. табл.3) позволил как сохранить термообратимость геля после окончания процесса культивирования, так и обеспечить хорошие механические свойства полученных гидрогелей.

1.2. Иммобилизация гибридом в ПВК гели

В качестве объектов для иммобилизации были выбраны гибридомные линии 1А10 и ЗВ4, продуцирующие ноноклональные антитела (НА) против вируса мозайки Резухи, которые были получены в ИБХ РАН (Плечко Т.Н. и др., 1991), а также гибрндома Е6/1.2, продуцирующая МА субкласса 1д01 против М-ацетилглюкозанпинл-(|> 1-4)-М-ацетилмурамоил-аланил-С-изоглутамина (ГНДП) (Иареева Т.О. и др, в печати). ГМЛП является перспективным веществом для создания лекарственных препаратов, используемых в клинической практике для вакцинации, _ неспецифической зашиты от инфекций, химиотерапии рака (Ьейегег Е., 1988), Для проведения иммобилизации клетки отбирали в логарифмической Фазе роста, отмывали стерильным физиологическим раствором, смешивали со средой ЯРН1-1640 (либо ЭНЕИ) и раствором полимера, а затем при добавлении этой смеси в среду с помощью специального устройства получали гранулы гидрогеля диаметром 500-1000 мкм. Стабилизацию гранул проводили по методу В. Включенные в гели гибридомы культивировали в среде ЙРН1-1640, содержащей ;Ю2 фетальной телячьей сыворотки (либо безбелковон среды РРИ), в течение 7-10 дней. По окончании процесса культивирования при проведении иммуноФерментного анализа ("Сэндпич'-варнант ИФА) было обнаружено, что концентрирование НА внутри гранул, зависело от молекулярного виса иммуноглобулинов. Так, 98Х от общего количгсша НА класса IеП (И.Н. 900 кДа ), продуцируемых'

- 17 -

клетками 1Л10, оставалось внутри гранул. В случае 1!А IgG2b (I1.ll. ISO кДа)„ синтезируемых гибг^домами 33'f, эта величина составляла приблизительно 80Z. Концентрирование !1А внутри ПВК гранул, по-видимому, можно объяснить нековалентнь'ч связыванием иммуноглобулинов с полимером при температуре культивирования 37°С. Подобное связывание ПВК с бычьим сывороточным альбумином и иммуноглобулинами кролика описано а (Шерстюк С.О. и др., 1S87K

Результаты прямого твердофазного ИОД, полученные для иммобилизованных гибридом Е6/1.2 в Са-альгинатные гели, свидетельствовали о том, что эти гели значительно более проницаемы для выхода иммуноглобулинов в сроду. Так, S0-952 от общего количества HA (IgGl), продуцируемых клетками, обнаружено вне гранул в среде культивирования.

4. Исследование морфологических особенностей п.бридом, включенных в полимерные гидрогели

Исследование морфологических особенностей иммобилизованных в Са-альгинатный гидрогель гибридных клеток Е6/1.2 проводили с помощью лазерного проточного цитоолу-ориметра-сортера EPICS "ELITE" (Coultronics, Франция). Изучали влияние иммобилизации на такие параметры, как размер и гранулярность клеток, содержание ДНК, экспрессия гибридомами поверхностного иммуноглобулина.

В процессе культивирования часто гранул отбирали, освобождали клетки путем растворения гранул в 50 гсМ цитратном- буфере (рН 7.2) и далее подвергали хлеточную суспензии цитоФлуориметрическому анализу. Обнаружено, что уже на 3 день после иммобилизации 6 и </о* клеток, имели размеры, соответственно, в 3. и 2 раза большие по сравнению с контролем - суспензионной культурой (рис.71.

С помощью проточного цитофлуориметро-сортера были получены 3 популяции, причем размеры клеток первой из них были такие же, как для исходной клеточной.линии

Мапоугловоо светорасссянио

Рис.7. Гистограмма распределения свободных клетох Еб/1,2 (кривая 1) и иммобилизованных клеток (кривая 2) по размерам .

(контроль), а второй и третьей - превышали, соответственно, в 2 и 5 раза размеры клеток в контроле. При попытке переведения полученных трех клеточных популяций в условия суспензионного культивирования оказалось, что только клетки первой популяции продолжали нормально расти и делиться, в то время как клетки второй и третьей популяций не пролиФерировали.

Увеличение размеров клеток коррелировало с увеличением их гранулярности и содержания ДНК. Анализ распределения ДНК по фазам клеточного цикла выявил значительные различия для иммобилизованных и суспензионных культур (Pnc.ii). Эти различия свидетельствовали о нарушении гг'оцесса до пения клеток, иммобилизованных в гранулах '■идрогеля.

Визуальные исследования клеток, фиксированных 70%-

- 1Э -

спиртом и окрашенных Hoechst 53258 (1 г-ыг/мл), проводились с помощью Флуоресцентного микроскопа Opton. При этом у клеток второй и третьей популяций обнаружено наличие лзух и более ядер, которые интенсивно окрашивались, Явление полиплоидизации ранее было отмечено для иммобилизованных в агарозный гидрогель гибридных к-.еток, продуцирующие НА к -интерферону человека (Кухарева Л.в, и др., 1990), однако причина увеличения размеров ядер и клеток пока не найдена. 50 -

о ь <11 п ы.

п ю f-i о

£' сг

о

ИНТ9НС пеность '}■ пус^ясцвнцин

Рис."<5' Распределение ДЧК по ©азам клеточного цикла для иммобилизованных Е6/1.2 (А) и свободных, ¡.лоток (2). .

ЦитоФлусрнметрический анализ показалк что с течение исследованного периода культивирования клетки экспрессировали поверхностный иммуноглобулин. Результаты твердофазного ПСА свидетельствовали о том, что, несмотря на произошедшие морфологические изменения, гибридомы продолжали секпетировать достаточно высокие количества МА в среду (26-30 мкг/мл на 7 сутки культивирования).

12

200 100 ООО 600 1000

200 400 600 tOO 1000

- 20 -

Описанные особенности морфологии иммобилизованных гибридом, по-видимому, можно объяснить ограниченным объемом пор гидрогелей, как агарозного, так и Са-а^ьгинатного в нашем случае. Этот объем, соотносимый! по данным электронной микроскопии с размером клеток, не позволял последним расходиться после деления клеточного ядра, что и приводило к появлении полиплоидии.

Хотя о настоящее время развиэсзтся параллельно оба метода иммобилизации гибридом как в гидрогели, tg,; и в капсулы, из полученных результатов следует, что иммобилизация в капсулы предпочтительна, так как, видимо, не будет приводить к нарушению процесса нормального деления клеток.

Мотод проточной цитометрии, впервые использованный в этой работе для исследования морфологии иммобилизованных гибридом, может применяться как эффективный

исследовательский инструмент с цель» получения информации о состоянии иммобилизованных клеток « создания оптимальных структур носителей.

ВЫВОДЫ :

1. Разработаны новые способы получения гранул гидрогеля на' основе синтетического обратимо термоосаждаемого полимера - поли-Н-винилкапролактама (ПВК).

2. Найдены два способа стабилизации частиц гидрогеля ПВК с помощью соответствующих веществ, названных стабилизаторами, и показано, что структура, а также Физико-механические . и диффузионные свойства полученных гидрогелей зависят от типа стабилизатора и способа его введения.

Ъ. Разработана методики включения микроорганизмов Cluconobacter oxydons и Coryhebacterium g lu tu/ni сит как в гидрогели ПВК, так _ й композиционные ПВК-полисахаридные носители. Показано, что повышение Ферментативной

- 21 -

акпшности и еэ стабильности для иммобилизованных клеток в.oxydans, также как биосинтетичсскал продуктивность культуры клеток С. alutanlcua зависели от композиции и плотности гидрогеля, а также от типа используемого для его получения стабилизатора.

'I. Разработан новый одностадийный метод иммобилизации гибридом в гранулы гидрогеля ПВК.

5. Впервые методом проточной цитометрии исследованы морфологические особенности иммобилизованных в полимерные гидрогели гибридом.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях :

1. Е. Harkvicheva, T..Plechko, Immobilization of animal cells in polymer capsules, 5th Conference of young ;

• scietists of socialist countries on bioorganic chemistry, (Pushchino, 21-25 August, 1988), Abstracts,-Pushchino, 1988, P. 136

2. E.A. flarkvicheva, I.F.Kuz'kina, T.N.Plechko, Иен microencapsulation technique for immobilization and cultivation of cells, 6th Conference of.young scientists on organic and bioorganic chemistry (Bechyne, 17-24 June, 1989), Abstracts - Prague, 1989,

p. 154-155.

3. Яонова H.B., Марквичева E.A., Кузькина И.О., Баклашо-за Т.Г., Кузнецов А.А., Коаоенко К.А., Кг.рш Ю.Э., Ка-рапутадзе Т.Н., Пашкин И.П., Зубов В.П., Способ иммобилизации клеток микроорганизмов ej синтетические

- полимерные гранулы. А.С N 1687615, Приоритет от 23.10.89, Опублик. БИ N 20 ( 30.05.1991).

4. Марквичева Е.А., Кузькина И.О., Плечко Т.Н., Амбросо-ва С.И., Кирш D.3., Карапутадзе Т.Н., Завальный И.А., Туркин С.И., Стерлигова Н.Н., Зубов В.П., Спйсоб культивирования клеток животных в полимерных гранулах.

- 22 -

А.С. N 1721088, Приор, от 23.10.1S29 Опублик. Б'Л 11, 1992.

5. flarkvlcheva Е.А.., Kuz'kir.a I.F., Donova H.V., Suzina II.E., Pashkin 1.1., Koshcheyer.ko K.A., Kirsh Yu.E., Zubov V.P., Hew technique for coll immobilization end cultivation using thernally reversible polyraers-. Proceedings of 20th Meeting of ГЕБ5 (Budapest, 17-23 August, 1990), P.1CD.

C. Markvichava E.A., Donova Fl.V., Kuz'kina I.F., Poshkin 1.1., Пек tochniaue for cell inaobilization in therrjully reversible gels, 7th Conference on organic anJbiologicnl chemistry (Varna, 17-23 September, 1990) Abstracts - Sofia, 1390, p. 49-51.

7. r'arkvichova E.A,, Kuzkina I.F., Pashkin I.I., Plechko Т.Н., Kirsti Yu.if. and Zubov V.P., A novel technique for entrapment of hybridoir.a colls in synthetic thermally reversible polymers (1991), Biotechnology Techniques, v.5, H 3, pp. 223-226.

8. Куаькина И.Ф., Пашкин И.П., Карквичеоа Е.Л., Кирш Ю.Э., Анисииова Т.В,, Зубов В.П., Структура и свойства гидрогелей на основе поли-П-иимилкапролактаиа,

IV Всссизнал конференция по водорастворимым полимерам, (Иркутск, 17-21 июня 1991), Тезисы докладов, с. 172.

9. Harkvichava, Т. llareeva, A. Bronin, S. Khaidukov, Investigation of immobilized hybridona cells using flow cytometry, 8th Conference of young scientists on organic and bioorganic chemistry, (Riga,. 2-9 November, 1991), Abstracts, pp. 212-213.

}

/