Клетки, белки и пептиды, иммобилизованные в композитные гидрогели: получение, свойства, применение в биотехнологии и биомедицине

Марквичева, Елена Арнольдовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клетки, белки и пептиды, иммобилизованные в композитные гидрогели: получение, свойства, применение в биотехнологии и биомедицине
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Клетки, белки и пептиды, иммобилизованные в композитные гидрогели: получение, свойства, применение в биотехнологии и биомедицине"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. ШЕМЯКИНА и Ю.А.ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

МАРКВИЧЕВА Елена Арнольдовна

КЛЕТКИ, БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ, ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ В КОМПОЗИТНЫЕ ГИДРОГЕЛИ : ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА, ПРИМЕНЕНИЕ В БИОТЕХНОЛОГИИ И БИОМЕДИЦИНЕ

03.00.04 - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук

в форме научного доклада

Москва 2005

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им академиков М М. Шемякина и Ю.А Овчинникова РАН

Официальные оппоненты :

доктор химических наук, профессор Н.В Бовин доктор химических наук, профессор М И Штильман доктор химических наук, профессор Г А Вихорева

Ведущая организация :

Центр "Биоинженерия" РАН

Защита состоится ^'октября 2005 г в 10 час на заседании специализированного совета Д 002 019 01 при Институте биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу 117997 Москва В-437, ул Миклухо-Маклая, 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганичсской химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Диссертация в виде научного доклада разослана " " сентября 2005 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор химических наук, профессор

В А Несмеянов

Moe-Y- 11 1 DSM

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Полимерных системы с иммобилизованным в них биоматериалом находят все более широкое применение в битехнологии и биомедицине. Биоматериал может быть представлен различными биологически активными веществами (белками, в том числе ферментами, ДНК, пептидами, низкомолекулярными гормонами и др.), а также живыми клетками-продуцентами различных биологически акт ивных веществ (БАВ). Наиболее перспективными в ближайшем будущем, на наш взгляд, являются следующие области применения таких иммобилизованных систем в биотехнологии и биомедицине • 1) создание новых высокоэффективных технологий с использованием иммобилизованных клеток-продуцентов и биокат&лизаторов на основе иммобилизованных ферментов для получения различных БАВ; 2) получение полимерных покрытий (в виде пленок или микрочастиц) с иммобилизованными в них различными лекарственными препаратами (ферментами, пептидами, аншбиотиками, антиоксидантами и др.) для терапии ран; 3) разработка препаратов с конторолируемым пролонгированным высвобождением лекарств (БАВ) из полимерной матрицы; 4) получение пероральных и назальных вакцин пролонгированного действия; 5) конструироние ДНК-содержащих носителей для получения генетически модифицированных клеток; 6) трансплантация генноинженерных животных клеток-продуцентов белков, ферментов, факторов роста, гормонов, пептидов и др. для лечения наследственных и ненаследственных болезней.

Особое внимание исследователей привлекают так называемые «умные» (smart) полимеры, которые способны изменять свои свойства в ответ на внешний сигнал (изменение различных факторов, например, рН, температуры, химический сигнал, электрическое поле и др) Особенно интересны водорастворимые полимеры, чувствительные к изменению

температуры или рН в физиологическом интервале, поскольку их свойства

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ| БИБЛИОТЕКА 1 С. Летев ОЭ

I пи I I

идеально подходят для включения в гидрогелевую матрицу различного биоматериала (клеток, белков, пептидов, ДНК и др.). Введение "умных" полимеров в состав композитных матриц позволяет получать полимерные системы с новыми или заранее заданными свойствами. Такими системами с включенным в них биоматериалом можно управлять путем изменения внешнего сигнала (рН, температуры и т.д.), тем самым создавая новые эффективные методы иммобилизации биоматериала при максимально возможном сохранении его биологической активности (например, ферментативной активности в случае иммобилизации ферментов) или жизнеспособности (в случае иммобилизации клеток). Цель и задачи исследования. Целью работы было создание новых методов с использованием композитных гидрогелей (в виде микрогранул, микрокапсул или пленок) на основе природных и биосовместимых синтетических полимеров для иммобилизации клеток, белков (в том числе ферментов) или пептидов; исследование свойств таких иммобилизованных объектов и возможностей их применения в биотехнологии и биомедицине. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

• Получить новые композитные микрогранулы/микрокапсулы из природных и синтетических smart-поущмеров с иммобилизованными в них клетками.

• Всесторонне исследовать морфологические особенности иммобилизованных клеток, их рост и пролиферацию, способность продуцировать биологически активные вещества (например, моноклональные антитела в случае гидридом) в процессе длительного in vitro культивирования в зависимости от состава, физико-химических свойств и структуры микрогранул/микрокапсул.

• Разработать новые биокатализаторы - протеолитические ферменты, иммобилизованные в микрогранулы композитного гидриеля (в том числе микрогранулы с магнитными свойствами).

• Исследовать энзиматические свойства иммобилизованных ферментов (на примере трипсина, химотрипсина, тромбина, карбоксипепшдазы В), в частности, рН- и температурную зависимости, термостабильиость, устойчивость в различных водно-органических средах; определить кинетические параметры ферментативных реакций при различных температурах и в различных водно-органических средах

• Изучить возможность применения полученных гранул композитного гидрогеля с иммобилизованным в них протеазами в качестве биокатализаторов.

• Получить новые препараты на основе тромбина и/или пептидов (которые могут имитировать механизм действия тромбина в процессе репарации тканей), иммобилизованные в биосовместимые полимерные матрицы (пленки композитного гидрогеля и биодеградируемые микросферы).

• Изучить ранозаживляющие эффекты иммобилизованных тромбина и/или пептидов и продемонстрировать эффективность этих полимерных покрытий в процессах репарации тканей в моделях in vivo (мыши, крысы).

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые для иммобилизации животных клеток предложены микрогранулы композитных i идрогелей на основе биосовместимых синтетических полимеров класса N-виниламидов и природных полисахаридов-альгинатов. Методом проточной цитометрии (совместно с лабораюрией иммунохимии ИБХ РАН) исследованы морфологические особенности иммобилизованных гибридом. Новые методы иммобилизации клеток в композитные гидрогели могут найш применение в биотехнологии для получения различных биологически активных веществ (моноклональных антител, рекомбинантных белков и пептидов и др.), а также в биомедицинских исследованиях, в частности при создании искусс! венных

органов, в генной терапии и трансплантологии Впервые получены микрокапсулы на основе альгината и олигохитозанов для длительного in vitro культивирования животных клеток. На основе инкапсулированных раковых клеточных линий продемонстрирован новый метод для получения мильтиклеточных раковых сфероидов, которые имитируют малые солидные опухоли in vivo, и могут быть использованы в биомедицине для исследования механизмов действия различных видов противораковой терапии (радио-, химо- и фотодинамической терапии). Разработаны новые биокатализаторы - протеолитические ферменты (трипсин, химогрипсин, тромбин, карбоксипептидаза В), иммобилизованные в микрогранулы композитного гидрогеля на основе поли-Ы-винилкапролактама (ГГВК) и альгината кальция (CaAlg), в том числе и обладающие магнитными свойствами, а также исследованы энзиматические свойства иммобилизованных ферментов. Предложенные системы на основе различных иммобилизованных ферментов могут найти применение в различных химико-ферментативных реакциях, протекающих в водпо-органических средах в широком интервале температур, для получения оптически чистых продуктов для фармакологии и пищевой промышленности Созданы новые полимерные системы - композитные пленки на основе ПВК и альгината кальция (ПВК-CaAlg). а также биодергадируемые микросферы - на основе сополимера молочной и гликолевой кислот (poly(D,L-lactide-co-glycolide, PLGA)- с иммобилизованными в них тромбином или пептидами, имитирующими ранозаживляющий эффект тромбина Показано, что данные покрытия являются перспективными материалами для получения новых препаратов пролонгированного действия для терапии ран.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены более, чем на 75 конференциях и симпозиумах в России и за рубежом, в частности ■ на XX, XXII и XXIII конференциях FEBS

(Будапешт, 1990; Стокгольм 1993; Базель 1995), 40, 41 и 43 Международных конференциях Европейского общества клеточных культур ETCS (Ренн, Франция, 1993; Верона, 1994; Гранада 2001), III Международном симпозиуме IUPAC по биоорганической химии (Дагомыс, 1995), на Международном симпозиуме по иммобилизованным клеткам (Ноордвикерхоут, Голландия, 1995), ежегодных Международных конференциях немецкого общества клеточной биологии Deutsche Gesellschaft fuer Zellbiologie (Гамбург, 1996; Штутгарт 1997, Заарбрюкен, 1998; Бонн, 2002; Берлин, 2004; Гейдельберг, 2005), на ежегодных V-XT Международных конференциях по биокапсулированию (Потсдам, 1996; Барселона, 1997; Истон, США, 1998; Тронхейм, 1999; Варшава, 2000; Прага, 2002; Страсбург, 2003; Витория, Испания, 2004, Кингсюн, Канада, 2005), на IV и V симпозиумах по химии протеолитических ферменюв (Москва, 1997, 2002), на XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (С-Петербург, 1998), на VIII и IX Европейских конгрессах по биотехнологии (Будапешт 1997, Брюссель 1999), Международной конференции по биокатализу (Пущино-на-Оке,1998-Москва,2000), на XII Международном симпозиуме rio микрокапсулированию (Лондон, 1999), на II Европейском конгрессе по химической инженерии (Монпепье, 1999), Всемирном конгрессе по фибринолизу и протеолизу (Химамацу, Япония 2000), на XI Всемирном конгрессе "Биотехнология 2000" (Берлин, 2000), на 18 Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Бирчишем, 2000), на VI-VII Международных конференциях по исследованию хитина и хитозана, (Москва-Щелково, 2001; С-Петербург-Репино, 2003); Международном симпозиуме по использованию мультиклеточных сфероидов в раковой биологии и терапии (Рим, 2002, приглашенный лектор) ), на IX Конгрессе французского общества химической инженерии (С-Назэр, Франция, 2003), на конференции экспертов COST "Применение

иммобилизации/биокапсулирования в медицине, фармакологии и биотехнологии (Белград, 2004, приглашенный лектор), на Международной конференции IUPAC ICOB-4 & ISCNP-24 (Дели, 2004, прикрашенный лектор), на VII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2004), на ГГ1 Международном симпозиуме по биоматериалам ISAB 2005 (Монреаль, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано более 120 работ, в том числе 6 глав в книгах, 27 статей, получено 4 авторских свидетельства СССР.

Личный вклад автора. Автором предложены основные направления исследования и разрабо1аны основные подходы для экспериментального подтверждения предложенных идей, ему же принадлежит решающая роль при обсуждении и литературном оформлении полученных результатов Все основные эксперименты выполнены автором, аспиратами и студентами (под руководством автора). В исследованиях, которые были выполнены в соавторстве с зарубежными коллегами, личный вклад автора заключался в постановке задачи, непосредственном проведении экспериментов как в России, так и в зарубежных лабораториях (во Франции, Бельгии, Германии), и оформлении полученных резулыашв в виде печатных работ. Автор благодарит всех сотрудников, студентов и аспирантов своей группы, а также всех своих российских и зарубежных коллег за плодотворное сотрудничество.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Клетки, иммобилизованные в композитные микрогранулы и микрокапсулы на основе природных и синтетических полимеров : получение, свойства и применение

1.1. Клетки, иммобилизованные в макропористые композитные микрогранулы

Клетки животных, иммобилизованные в гидрогели, представляют собой систему in vitro, в которой можно создать условия, наиболее близкие к условиям существования клеток т vivo, имея в виду рост и пролиферацию клеток в трехмерной структуре. Культивирование иммобилизованных клеток имеет ряд преимуществ в сравнении с суспензионными культурами, в частности защищает клетки от механического стресса, позволяет получать высокие концентрации продуктов, секретируемых клетками, за счет достижения высоких концентраций иммобилизованных клеток (107 кл/мл среды и выше, что как минимум на порядок превышает максимально достижимые концентрации в случае суспензионных культур). Наконец, метод культивирования иммобилизованных клеток существенно удешевляет и упрощает технологию выделения и очистки продуктов, секретируемых клежами, поскольку позволяет легко разделить клетки и продукты, находящиеся в разных фазах (например, клетки - в микрогранулах, а продукты- в среде культивирования). Особый интерес представляет иммобилизация клеток животных в композитные гидрогели, т.е. полученные из двух или более компонентной полимерной смеси Развитие данной технологии позволит получать гидрогели с оптимальными физико-химическими свойствами, в частности, с заданной внутренней сгрукгурой гидрогеля (пористостью, плотностью и др.). В случае использования smart-полимеров, которые способны изменять свои свойства или структуру в ответ на сигнал окружающей среды (рН, температура, химический сигнал, электрическое поле и др.) микроструктура таких полимеров может быстро и обратимо изменяться от гидрофильного до гидрофобного состояния. Введение smart-полимеров в состав композитных гидрогелей позволяет получать полимерные системы с заданными свойствами. Так, например, используя

БтаП-полимеры. нами предложено модифицировать структуру микрогранулы с целью создания макропор, обеспечивающих более "комфортные" условия для роста колоний клеток Из 8шаг1-полимеров особенно привлекательны водорастворимые полимеры, чувствительные к изменению температуры или рН в физиологическом интервале, поекольк> их свойства идеально подходят для иммобилизации биоматериала (клеток, ферментов, белков, пептидов, ДНК и др.). Среди таких полимеров нами впервые были предложены термочувствительные полимеры класса поли-М-винил амидов, в частности гомо- и сополимеры Ы-винилкапролактама (ПВК). В настоящее время они находят все более широкое применение в медицине и биотехнологии, входят в состав лекарственных препаратов, на их основе готовят носители для биологически активных веществ, мембраны, сорбенты.

Нами было показано, что ПВК (ММ 900 ООО) обладает способностью образовывать гидрогели с одновременным включением в них биоматериала (клеток, белков) при термоосаждении в физиологическом интервале температуре 35-39°С. Разработанные нами микрогранулы на основе ПВК были успешно использованы для культивирования в них как микроорганизмов (в частности, ЯисопоЬайег охуёапя, СогупеЬайепит §1и1аггпсит) так и животных клеток. В качестве модельных животных клеток использовали гибридные линии 1А10 и ЗВ4, продуцирующих моноклональные антитела (МА) ^М и ^02Ь, соответственно, к вирусу арабской мозайки резухи (работа совместно с группой фитоиммуннодиагностики ИБХ РАН). Однако такие микрогранулы имели ряд недостатков, в частности недостаточную механическую прочность при длительном культивитровании в них клеток. Использование композитных I елей (в которых ПВК был одним из компонентов) позволило как снизить средний размер микрогранул, что привело к улучшению диффузии питательных веществ, так и улучшить физико-механические свойства

микрогранул, а 1акже обеспечить макропористую структуру, которую невозможно получить для однокомпонентных гелей. В качестве второго компонента использовали природный полисахарид - альгипат натрия (ЫаА1ё).

Другой представитель класса поли-Ы-виниламидов (очень близкий химический аналог 11ВК), предложенный нами при разработке композитных гелей, был поли-М-винилпирролидон (ПВП) с ММ 12500 (рис. 1 а,Ь, с).

н2с с—о

н2с-

/-V

н2с с=о

I I

сн2 сн2 н,с--сн,

Рис 1 Структурные формулы ПВП (а), ПВК(Ь) и альгипата (с)

Получение композитных ПВК (или ПВП)-СаА1§ микрогранул сферической формы с иммобилизованными в них клетками осуществляли путем внесения суспензии клеток в смесь полимеров NaAlg (ММ 400 ООО) и ПВК (или ПВП, ММ 12500) и добавления по каплям полученной смеси в раствор СаС12, предварительно нагретый до 37-40°С Микрокапсулы (размером 650-950 мкм) получат и с помощью специального прибора с коаксиальным подводом сжатого воздуха. При этом размер их определялся совокупностью различных параметров, в частности, скоростью подачи полимерной смеси раствора, его вязкостью, (которая в свою очередь определялась ее составом и cooi ношением отдельных компонентов, входящих в нее), скоростью подачи воздуха, диамегром иглы, рассюянием до поверхности раствора СаС12 и др. Добавление полимерной смеси с клетками в подогретый до 37-40° С раствор СаС12 позволяло осаждать полимерные клубки ПВК с включенными в них клетками внутри

полисахаридной сетки альгината, образующейся при замене ионов натрия на ионы кальция.

Таким образом, были получены микрогранулы композитного ПВК(ПВП)-СаА^ геля с иммобилизованными в него клетками. Такие композитные микрогранулы отличались от классических Са-альгинашых прежде всего структурой, так как термоосаждение ПВК внутри полисахаридной сетки или просто введение ПВП (с последующей частичной диффузией) приводило к образованию макропор - зон, не сшитых ионами кальция (рис. 2).

В случае ПВП-СаА1§ микрогранул макропористая структура достигалась за счет введения низкомолекулярного ПВП (ММ 12500), который затем частично удалялся путем диффузии (до 70% от исходною количества, введенного в полимерную смесь в течение последующих 2 час при инкубировании в физиологическом растворе, при 37°С). В аналогичных условиях СаА^-ПВК гранулы теряют не более 5% ПВК В качестве модельных клеток для иммобилизации были выбраны гибридомы. Эти клетки часто характеризуются более высокой скоростью роста по сравнению с другими культурами клеток животных. Кроме того, для тестирования МА, продуцируемых гибридомами, разработаны точные и надежные методы их определения. В работе была использованы 2 гибридные линии : гибридома ЫЧКВ-2, продуцирующая моноклональные антитела к рекомбинантному интерлейкину-2 человека и линия Е6/1.2,

№А1^ПВК(ПВП) в

почимерной смеси

1,0/1,) (масс) Масштабная линейка 10 мкм

Рис 2 Структура гранул гидрогелей различно! о состава а) СаА^, Ь) ПВК-СаА1& с) ПВП-СаА^

Соотношение

смеси

продуцирующая MA к Ы-ацетилглюкозаминил-(3(1-4)-Ы-ацетилмурамоил-аланил-Б-изоглутамину (ГМДП). Работы были выполнены в сотрудничестве с лабораторией иммунохимии ИБХ РАН.

Для изучения морфологических изменений, происходящих в клетках, иммобилизованных в ПВК-CaAlg и CaAIg "классические" микрогранулы, был проведен цитофлуориметрический анализ. Для этого в процессе культивирования иммобилизованных гибридом (ИмГ) отбирали аликвоты микрогранул, освобождали клетки путем растворения в 50 мМ цитратном буфере (рН 7,2), а далее анализировали клеточную суспензию с помощью лазерного проточного цитофлуориметра-сортера EPICS "ELITE" (Coultronics, Франция). Использованием малоуглового светорассеяния позволяюло судить о распределении клеток по размерам. Из гистограмм распределения ИмГ и свободных клеток суспензионной культуры (СК) по размерам (рис. 3.1), видно, что максимум пика интенсивности светорассеяния для ИмГ, включенных в CaAIg гель (В), значительно сдвинут вправо, что свидетельствует об увеличении среднестатистического размера ИмГ в классическом CaAIg геле в сравнении с композитным гелем ПВК-CaAlg и с СК. Увеличение среднестатистического размера ИмГ коррелировало с увеличением гранулярности их цитоплазмы, отражающей внутреннюю структуру клеток, которую определяли по светорассеянию под углом 90° (рис. 3.2). Изменение гранулярности ИмГ может быть связано как с изменением внутренней структуры клеток, так и с изменением соотношения размеров ядра и цитоплазмы. Следует отметить, что величина данных отклонений от контрольных значений уменьшалась при увеличении пористости композитных гидрогелей.

Культивирование клеток гибридом осуществляли на средах DMEM или RPMI-1640, содержащих 10% фетальной сыворотки теленка (FCS). Мы не обнаружили существенных различий ни в пролиферации, ни в продукции МА суспензионными культурами гибридом LNKB-2 и Е6/1.2.

О НЮ 4(Ю М* Ш )00в М«.ю>| юялс свтркснвк, оти. ел.

< мг<чм(сеяииг пол умом 90" оти

Рис.3 Гистограммы распределения клеток гибридомы ЬЫКВ-2 1. по размерам, 2 по гранулярности А - клетки, освобожденные из ПВК СаА^ гранул, В - клетки из СаА!е

гранул, ( - суспензионная культура клегок (контроль) ИмГ анализировали пocJle 6 дней культивирования в микрограну пах

Однако использование среды КРМ1-1640 для культивирования ¡ибридом, иммобилизованных в композитные гранулы, оказалось невошожным, т.к гранулы разрушались, очевидно, из-за высокого содержания фосфатов в этой среде.

Было показано, что иммобилизация гибридом в композитные гидрогели позволяла увеличить продукцию МА по сравнению с количеством МА, секретируемых гибридомами, иммобилизованными в традиционный СаА1§ гидрогель (рис. 4).

Однако особый интерес представляло культивирование иммобилизованных гибридом в бессывороточной среде. Известно, что использование бессывороточных сред для культивирования клеток животных обеспечивает ряд преимуществ перед культивированием на средах, содержащих сыворотку. Одним из важных преимуществ являетяся возможность получения МА, не загрязненных белками сыворотки

100 90 80 70 ¡60

¡50 <

S 40 30 20 10 0

Рис 4 Кинетика накопления МА, продуцируемых 1ибридомами INKB-2, иммобилизованными в различные гранулы Среда DMFM, содержащая 10 % FCS Смена среды обозначена стрелками Соотношение NaAlg/ПВК (ПВП) составляло 1,0/0,9 (масс)

Применение технологии культивирования иммобилизованных клеток-продуцентов позволяет снизить стоимость получаемых продуктов за счет упрощения и удешевления процесса очистки. Наилучшие результаты были получены нами при культивировании на бессывороточной среде DMEM/F-12, обогащенной аминокислотами и витаминами (DMEM/SPITE). Белково-минеральная добавка SPITE (Sigma) была специально разработана для культивирования гибридом и содержала инсулин, трансфсррин, селенит натрия.

Наработку препаративных количеств МА проводили при периодическом культивировании ИмГ в спиннере (V=500 мл) При эюм посевная концентрация 1ибридом была 1x106 кл/мл полимерной смеси, степень загрузки спиннера составляла 0,5, соотношение гранулы/среда культивирования было 1 /10 (v/v), скорость перемешивания- 80 об/мин Культивирование проводили в СОг-инкубагоре в газовой среде.

„ 10 15

Время культивировании, с> гки

-CaAlg ПВК гранулы -

-CaAlg ПВП гранулы

-CaAlg гранулы

содержащей 5% СОг. Первые три дня клетки культивировали на среде ПМЕМ/РСЯ. Затем проводили полную замену среды ОМЕМ/ГС8 на бессывороточную среду. Далее полную замену бессывороточной среды осуществляли через каждые три дня культивирования. Применение данной технологии позволило значительно повысить продуктивность процесса культивирования ИмГ (рис.5).

Время культивировании (дни )

Рис 5 Кинетика накопления моноклональных антител, секретируемых иммобилизованными в микрогранулы ЬМКВ-2 гибридомами, при культивировании в бессывороточной среде ОМЕМ/5Р1ТЕ (") - СаА^-ПВК микрогранулы, (V) - СаА|ц микрогранулы Микро|ранулы были покрыты оболочкой из поли-Ь-лизина Смена среды обозначена стрелками

Следует также отметить, что 94 кОс использование бессывороточной среды 67 позволило непосредственно из супернатанта

43 получить препараты МА, содержащие только

5% примесей, состоящих из единственного белка - трансферрина, входящего в состав ЯРТТЕ (рис. 6).

»-30

1 2 3

Рис 6 Электрофорез моноклональных антител к интерлейкину-2 в полиакриламидном геле (ПААГ-ДСН) 1- из супернатанта после культивирования иммобилизованном в ПВК-СаА1^' микрогранулы гибридомы 1.МКВ-2; 2 - из очищенной асцитной жидкости, 3 - стандарты молекулярной массы

Максимальная концентрация МЛ и я п'ри i í N ivB _ иммобилизованных в ПВК-CaAIg- гранулы, бы i j ч нч 1,1 i ^ ,, составил 150 мкг/мл среды. Эю превышало про i\k , m \ , и,,и ipaoii культуры клеток и продукцию ИмГ, культивир>емь ч ¡c ^ u,>rsopoiкип DMEM/FCS, соответственно, в 5 и в 2 раза 13 л ,ы .i. i^m im i\чс mi к препарагы MA были использованы corp> uim амл u,G< ¡¡ашрки иммунохимии ИБХ РАН для проведения решгемо. ■] < \piioio анали пространственной структуры ГаЬ-фрагмента МА к чн р ichküh 2 il чинка и его комплекса с пептидным фрагменюм этого ци i n, ич i

1.2.Клетки, иммобилизованные в полиэлектролшные мнкроклгил n,i

Альтернативой макропористым композитным н > р> ,>ан. мм " п считать микрокапсулы. Классическими системами мчи a ¡ ¡я,< l.i полиэлекторолитные микрокапсулы на основе аил, >> ¡i i п ь' I - ш им Получение последних проводится в 3 статии , , и^

сферических микрочастиц - "каркаса" из альгината i <, н.ция 2' но ченио\ полиэлектролитного комплекса альгинат-поли-1 - ,,, ¡юь^pxi'ov.,,,

этих микрочастиц; 3) растворением "каркаса" с п '\,ы>а к> ^ i^nip^ 'они агентов (ЭДТА, цитрата натрия). Именно такие системы . и 1 1 оу iL 1

разрабатываются для трасплантации клеток-про i\ iiuiidh (например инсулина или рекомбинангных белков для лечения например i емофи ши ) Недостатком их является иммунногенность и высчк.ы i |инч«и, тми-1 -лизина. Альтернативой поли-Ь-лизину может бч „ ¡ч" .mi м.мр„,1 является менее токсичным, чем лизин, и в насгояыч. чремя псе бьке широко используется в медицине и фармаколо! им Чию-иш яшят.^ производным природного полисахарида хитина Хипш - ншеишш аминополисахарид, состоящий из N-aueTMi-2- гнию 1 кчьы! I)-гликопиранозных звеньев (рис. 7). Основной источник \,i intuí i рамы н другие морепродукты. В отличие от альгината (изменение ^т>римпи,1

при замене иона) и ПВК (термочувствительный полимер), хитозан является рН-зависимым 5таг1-полимером. СИ, он и ^ СИ, он

Рис 7 Структурная формула хитозана

Единственным недостатком коммерческих хитозанов применительно к инкапсулированию животных клеток является их нерастворимость в физиологическом интервале рН (рН 6-7) Все ранее предпринятые попытки использовать коммерческие хитозаны, имеющие мол. массу 200 кДа и выше, в качестве поликатиона для получения микрокапсул с целью включения в них животных клеток, были безуспешными. Нами предложено заменить высокомолекулярные хитозаны, которые растворяются только при рН 4 и ниже, на низкомолекулярные (30-50 кДа), полученные экструзионным методом (любезно предоставлены МГТУ) и олигохитозаны (ММ 3-20 кДа), которые можно получить, например, методом радикальной деградации высокомолекулярных хитозанов.

рН р-ра Толщина

хитозана мембраны,

мкм

5,0 36±6

5,5 ¿7) 40±8

63+7

7,0 не обнаруж

рН 5 0 рН 5,5 рН 6,0 рН 7,0

Рис 8. Толщина альгинат-хитозановой мембраны в зависимости от рН раствора хитозана Время инкубации СаА^ микрогранул в 0,2 % растворе хитозана (ММ 30 кДа) составляло 10 мин Масштабная линейка - 100 мкм

Такой подход позволил решить главную задачу - получить

хитозаны, растворимые в интервале рН 6,6-6,8, и, следовательно, провести

иммобилизацию клеток в физиологических условиях для сохранения максимально возможного количества жизнеспособных клеток.

Нами были разработаны методы получения альгинат-хитозановых микрокапсул и показано, что толщину полиэлектролитной мембраны микрокапсул можно регулировать путем изменения нескольких параметров, например мол. массы олигохитозанов, концентрации и рН их растворов (рис.8), в которых инкубируются альгинагные микрогранулы, временем инкубации микрогранул (рис.9).

2 мин. 15 мин. Время инкубации Са-альгинатных микрогранул в растворе хитозана, мин Толщина мембраны, мкм

Г ) 2 Зо±6

4 45±8

6 54+8

8 60±6

10 63+7

15 72±9

20 85+8

30 95+6

Рис 9 Толщина альгинат-хитозановой мембраны в зависимости от времени инкубации Са-альгинатных микрогранул в 0,2 % растворе хиюзана (ММ 30 кДа, рН б 0) Масштабная линейка - 100 мкм.

После анализа жизнеспособности клеток при варьировании рН и времени инкубации гранул в растворе хитозана были выбраны оптимальные условия для инкапсулирования животных клеток : 10 мин при рН 6.0. Микрокапсулы при необходимости можно растворить путем увеличения рН до 7.8-8.0.

Динамика роста клеток яичника китайского хомячка СНО (Chinese hamster ovary), иммобилизованных в микрокапсулах, при их длительном культивировании представлена на рис. 10. Видно, что трехмерный (3D) характер роста клеток отличается от монослойной культуры, которую можно получить при культивировании поверхностно-зависимой клеточной линии СНО во флаконах. Клетки, включенные в микрокапсулы (рис. 10 а) не распластывались на внутренней поверхности мембраны, а пролиферировали в агрегатах (рис. 10 Ь), которые со временем

увеличивались в размерах (рис 10 с) и превращались в плотные мультиклеточные кластеры, заполняющие весь объем микрокапсулы (рис. 10 (1). В процессе культивирования первоначальная концентрация клеток может увеличиваться в 10-100 раз и достигать плотности 107-108 клеток/мл среды, тогда как максимальная концентрация клеток в суспензионных культурах не превышает 106 кл/мл среды.

Рис 10 Длительное культивирование клеток СНО в альгинат-хитозановых микрокапсулах' а) сразу после иммобилизации Ь) на 5-й день посте иммобилизации, с) на 12-й день, d) на 21-й день Среда а-МЕМ, 10% FCS

Для демонстрации возможности получения продукюв,

секретируемых животными клетками, иммобилизованными в альгинат-

хитозановые микрокапсулы, нами были использованы в качестве

модельных гибридные линии G3/H3 and G4/H4, любезно предоставленные

в лаборатории иммунохимии. Клетки культивировали в ССЬ-инкубаторе

при 37° С на среде DMEM/Ham's F-12 (1/1, v/v), содержащей 10% FCS в

течение 4 недель. Типичная кривая роста иммобилизованных клеток

представлена на рис. 11. Для подсчета количества клеток в процессе

длительного культивирования отбирали аликвоты микрокапсул (по 0,1 мл)

через каждые 3 дня культивирования, освобождали клетки из микрокапсул

и определяли общее количество клеток и количество живых клеток (после

окрашивания трипановым синим) в гемоцитометре. Hi кривой роста видно,

что через 4 недели культивирования концентрация клеток увеличилась в

100 раз и достигла 107 кл/мл среды. Гибридные линии G3/H3 and G4/H4

продуцировали иммуноглобулины IgG (160 кДа) и IgM (950 кДа) классов,

соответственно, к трансферрину, которые тестировали методом

твердофазного иммуноферменгного анализа (ELISA) Для этого в процессе культивирования иммобилизованных клеток отбирали пробы супернатантов. Кинетика накопления МА класса IgG, продуцируемых клетками G3/H3 представлена на рис.12. Концентрация МА, секретируемых иммобилизованными клетками, варьировала в интервале 45-80 ng/мл, в то время как максимально возможный уровень МА, полученный от суспензионной культуры (свободные клетки) был достигнут после 4 дней культивирования и не превышал 95 (¿g/мл. Анализ МА IgM класса показал, что эти иммуноглобулины накапливались в микрокапсулах и не выходили в среду культивирования (супернатант), что можно объяснить их высокой мол массой. Таким образом, разработанные нами микрокапсулы на основе альгинага и низкомолекулярных хитозанов или олигохитозанов были успешно испольюваны для длительною культивирования различных клеточных линий. При этим было продемонстрировано, что этот метод иммобилизация клеток может быть

4 S 12 16 20 24 28 Время культивирования, дни

0 2 4 7 9 И 13 15 17 19 21 Время культивирования, дни

Рис 11 Рост гибридных клеток G3/H4 и G4/H4 в альгинат-хитозановых микрокапсулах Среда DMEM, 10%

res

Рис 12 Накопление в среде культивирования МА класса ^О, секретируемых инкапсулированными гибридными клетками СЗ/НЗ Полная замена среды (ОМЕМ, 10% ГCS) обо!начена арелками

1.3. Иммобилизованные раковые клетки для генерирования мультиклеточных сфероидов

Мультиклеточные сфероиды, состоящие из раковых клеток, в настоящее время широко используются в различных медико-биологических исследованиях, посвящённых терапии раковых заболеваний (например, фотодинамическая терапия (ФП), радиотерапия и др.). Особо следует отметить ФП, которая является эффективным и в тоже время щадящим методом лечения раковых заболеваний Однако для дальнейшего развития ФП необходимы оптимальные объекты, на которых можно проводить исследования перспективных фотосенсибилизаторов (ФС), которые способны накапливают раковые клетки (в отличие от нормальных). Мультиклеточные опухолевые сфероиды могут стать одним из таких объектов. Существует три классических способа получения сфероидов, суть которых сводится к тому, что поверхностно-зависимые клетки культивируются в суспензии при непрерывном перемешивании, где они вынужденно растут в агрегатах, образуя сфероиды (с широким распределением по размерам). Нами для получения унимодальных сфероидов был впервые предложен метод инкапсулирования. Для этого раковые клетки иммобилизовали в полупроницаемые полимерные микрокапсулы (400-700 мкм), полученные с помощью электростатического генератора (5.8. кВ), а далее культивировали их in vitro с целью получения сфероидов внутри микрокапсул. Использование электростатического генератора позволило снизить средний размер микрокапсул, обеспечить узкое распределение микрокапсул по размерам и таким образом, получить модель, адекватную солидной опухоли m vivo (Работа была выполнена совместно с онкологическим центром Alexis Vautrin, и Политехническим университетом Лотарингии, Нанси, Франция).

В отличие от классических методов генерирования сфероидов, метод инкапсулирования позволяет:

• Получать сфероиды -заданного диаметра, при этом с узким распределением по размерам.

• Генерировать сфероиды, состоящие из культур раковых клеток, которые в норме не образуют агрегаты в суспензионной культуре .

• Проводить совместное культивирование раковых клеток с другими типами клеток (макрофагами, моноцитами и др.), что обеспечивает возможность лучше имитировать солидные опухоли in vivo .

На рис 13 представлена динамика роста раковой клеточной линии MCF-7 при длительном культивировании в альгинат-олигохитозановых микрокапсулах (ММ олигохшозана 3500 Да). Видно, что отдельные раковые клетки (рис.13 а) пролиферируют с ючением времени и, будучи ограниченными мембраной микрокапсулы, расту i в

abc

Рис 13 Рост клеток аденосарциномы молочной желеш человемка МС F-7 в альгина!-олигохитозановых микрокапсулах а) сразу после инкапсулирования Ь) на 23 лень поспе инкапсулирования , с) на 28 день после инкапсулирования Среда OMEM/Ham s F-12, содержащая 10% FCS Масштабная линейка соответствует 500 мкч

агрегатах (рис.13 б), которые постепенно уве шчиваются в размерах,

образуя клеточные кластеры (сфероиды), заполняющие весь объем

микрокапсулы (рис.13 с)

Для исследования сорбции фотосенсибилизатора

инкапсулированными сфероидами, был выбран протопорфирин IX (ПП-

IX). Известно, что ПП-IX хорошо флуоресцирует и является соединением,

которое активируется видимым светом (>.волжл 640 нм) Для оценки

накопления ПП-IX образцами (суспензионной клеточной культурой-

контроль 1, пустыми микрокапсулами- контроль 2, и сфероидами в микрокапсулах) была получена калибровочная кривая зависимости флуоресценции I11I-IX (при 700 нм ) от его концентрации в среде культивирования. Далее суспензию клеток (1 0*106 кл/мл), аликвоту микрокапсул (1 мл), и аликвоту сфероидов (1 мл) инкубировали в присутствии 10"2М ПП-1Х и растворителя (ПЭГ-400/этанол; 0,6%/0,4%) в среде DMEM/Ham's F-12, содержащей 10% FCS при 37° в 5% атмосфере С02. Через 17 ч из проб отбирали супернатанты и регистрировали спектры флуоресценции. Таким образом, о накопление ПП-IX образцами (суспензионными клетками и инкапсулированными сфероидами) судили по уменьшению его концентрации в супернатантах. Было продемонстрировано, что сфероиды, полученные предложенным нами методом, могут накапливать значительные количества ФС (1 5х1016 молекул ПП-IX на 1 мл аликвоты сфероидов).

Таким образом, при использовании предложенного нами метода генерирования мультиклеточных сфероидов открывается возможность создания в будущем новой in vitro модели для исследования эффектов фото динамического воздействия на малые солидные опухоли. При этом, в отличие, от ранее известных моделей с использованием одной клеточной культуры, новая модель может позволить генерировать сфероиды на основе нескольких типов клеток, в том числе поверхностно-независимых, из которых вообще невозможно получить сфероиды классическими методами.

2. Белки и пептиды, иммобилизованные в композитные гидрогели

2.1. Получение протеолитических ферментов, иммобилизованных в микросферы композитного ПВК-CaAlg гидрогеля

Метод иммобилизации нестабильных белков, в частности ферментов,

путем механического включения в полимерную матрицу в сравнении с

методом ковапентного связывания фермента с носителем, привлекате юн своей простотой и тем, что денатурирующее воздействие различных химических реагентов на белок при этом методе минимально. Процесс включения ферментов в полимерную матрицу гидрогеля происходит в физиологических условиях (температура, рН), что позволяв I минимизировать потери ферментативной активности в процессе иммобилизации Ото особенно важно для таких чувствительных ферментов, как, например, карбоксипептидаза В или тромбин В литературе описаны методы ковалентной иммобилизации нестабильных ферментов, однако эти методы позволяли сохранить не более 5-10% активности этих ферментов.

Использование именно композитных гелей позволило разработать (совместно с лабораторией химии про политических ферментов ИБХ) новый универсальный метод иммобилизации протеолитических ферментов (трипсина, химотрипсина, карбоксипептидазы В, тромбина) в ПВК-СаА1§ микрогранулы. Растворы ферментов вводили при комнатной температуре в полимерную смесь, содержащую ПВК, альгинат нагрия, и ПОЛАР-2 (ароматический сульфосодержащий полимер). Для получения магнитных гранул в эту смесь дополнительно вводили магнитный наполнитель магнетит (Ее30<|) Затем с помощью специально рафаботанного прибора смесь полимеров с ферментом вводили по каплям в 1% раствор СаС^ для получения микрогранул (средний диаметр 650 ± 100 мкм) При этом раствор СаС12 предварительно подогревали до 37°С, чтобы обеспечшь термоосаждение ПВК с одновременным включением комплекса фермент-ПВК в сетку альгинатного геля, образующегося при замене ионов натрия на кальций в альгинате. ПОЛАР-2 был введен в полимерную матрицу для предотвращения диффузии комплекса ПВК-фермент из композитного гидрогеля после снижения температуры с 37°С до комнатной ПОЛАР-2 образует с ПВК нерастворимый интерполимерный комплекс, аналогичный

комплексу поливинилпирролидон-ПОЛАР-2, описанному в литературе ранее. Найденное в данной работе оптимальное соотношение ПВК/ПОЛАР-2 составляло 100/1 (масс.). Для использования иммобилизованного фермента в качестве биокатализатора необходимо предотвратить возможную неспецифическую сорбцию белков, пептидов и др. соединений на микрогранулах геля. В данном случае, введение в состав магрицы овальбумина (0,02 г на 1 г ПВК) позволило предотвратить неспецифическую сорбцию и улучшить механические свойства микрогранул за счет образования комплекса ГТВК-овальбумин.

2.2. Исследование свойств протеаз, иммобилизованных в микросферы композитного ПВК -СаА1д гидрогеля

2.2.1. Исследование термостабильности нативного и иммобилизованного химотрипсина

Известно, что температурная устойчивость ферментов может возрастать при иммобилизации. В работе исследовали влияние температуры на активность и стабильность нативных и включенных в гранулы композитного ГГВК-СаА^ гидрогеля ферментов (на примере химотрипсина). Было показано, что оптимум активности иммобилизованного химотрипсина смещался в область более высоких температур по сравнению с нативным ферментом (с 37°С до 45°С). Кроме того, иммобилизованный фермент был активен в более широком интервале температур, при этом наблюдали сохранение активности (33 % от максимальной) даже при 60°С, в то время как нативный фермент полностью инактивировался при этой температуре.

Величина Кт для иммобилизованного химотрипсина практически не менялась при увеличении температуры с 37 до 58°С, а изменение активности иммобилизованного фермента было связано с уменьшением Углах (табл.1). Иммобилизация приводила к росту термостабильности

фермента на 15-20°С. Исследование температурной стабильности химотрипсина показало, что для иммобилизованного фермента она была на 20°С выше, чем для нативного (рис.14). Иммобилизованный в гранулы гидрогеля химотрипсин сохранял 38 % активности даже при инкубации в течение 1 ч при 70°С, в то время как нативный фермент полностью инактивировался уже при 55°С.

Таблица I

Кинетические параметры химотрипсина, нагивною и иммобили-зованного в ПВК-СаА1§ микрогранулы, при различных температурах

t,°C Нативный химотрипсин Иммобилизованный химотрипсин

Кт, М v™„ М s 1 ^max Vmaxi М S Vinax -^m,

24 9,09-10"4 2,79 10' 3,07 104 2,22 10 4 в.зТш5 3,77 10 4

30 1,02 10"J 4,79 10 ' 4,70 10'4 2.86~ЙГГ 1,38 108 4,8 Ю-4

37 2,83 10"' 6,20 10' 2,19 104 3,36-104 2,48 10 ' 7,38-104

41 3,01 101 1 1,19 10б 3,40 10" 3,70 104 2,16 10' 5,84 10"4

58 i - 3,73 10" 1,44 101 3,86 10"4

Примечание условия реакции рН 8 0, 0 1 М С аСЬ, субстрат AILt

Увеличение термостабильности иммобилизованных ферментов но сравнению со свободными можно объяснить двумя причинами. Во-первых, включение в сетку TTBK-CaAIg геля, как и любого геля, приводит к ограничению конформационной подвижности белковой молекулы, а, следовательно, ее стабилизации. Во-вторых, наличие молекул воды, связанных с полимерными цепями ПВК, обеспечивало сохранение водного окружения молекул фермента. Хотя, при повышении температуры, наблюдается частичное вытеснение воды из полимерных глобул, можно предположить, что оставшихся молекул воды было достаточно для обеспечения каталитической активности фермента.

о 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

Температура, °С

—А-Нативный химотрипсин —♦—Иммобилизованный химотрипсин

Рис 14 Температурная стабильность химотрипсина, нативного и иммобилизованного в гранулы композитного ПВК-СаА^ гидрогеля За 100% принимали максимальное значение активности фермента Примечание фермент инкубировали I ч при данной температуре, затем измеряли его активность при комнатной температуре

2.2.2. Изучение влияния органических растворителей на сохранение протеолитической активности нативных и иммобилизованных протсаз

Существует концепция, что инактивация фермента под воздействием высокой температуры и органического растворителя протекает по одному и тому же механизму. Это позволило нам предположить, что наблюдаемая термостабилизация ферментов при включении их в полимерный ПВК-СаА1§ гидрогель может сопровождаться увеличением устойчивости к другим денатурирующим агентам, в частности, органическим растворителям. Было изучено влияние полярных органических растворителей на активность нативных и иммобилизованных трипсина и химотрипсина. Для этого были выбраны диметилформамид (ДМФА) и ацетонитрил, отличающиеся по их способности к реализации сольвофобных (гидрофобных) взаимодействий, и, соответственно, воздействию на фермент. Выбор этих растворителей был обусловлен также их широким использованием в реакциях, катализируемых протсазами

Известно, что как ДМФА так и ацетонитрил не являются "благоприятными" растворителями для ферментов, в частности, для трипсина и химотрипсина. Мы действительно наблюдали резкое падение активности нативного трипсина в интервале концентраций 40-50% ДМФА в воде, а далее - полную инактивацию фермента. Влияние органического растворителя на иммобилизованный фермент было выражено гораздо слабее : иммобилизованный трипсин сохранял 30% от исходной активности даже при 85% (об.) ДМФА, тогда как нативный фермент полностью инактивировался уже при 50% (об.) ДМФА. В случае использования в качестве органического растворителя ацетонитрила (в концентрациях более 50% об.) активность иммобилизованных трипсина и химотрипсина мало отличалась от их активности в воде, в то время как активность нативных протеаз резко падала (рис. 15).

Величины каталитической эффективности для (кш/Кт) нативного и иммобилизованного фермента также уменьшались с увеличением концентрации ДМФА (табл.2). Однако, если величина Ка!Кт для нативного трипсина при концентрации ДМФА 50% (об.), достигает 0, го для иммобилизованного фермента эта величина, уменьшаясь в интервале концентраций ДМФА 40-50% (об.), затем оставалась практически неизменной до 90% (об.) ДМФА в воде. Это падение каталитической эффективности для иммобилизованного фермента было существенно ниже, чем в случае нативного трипсина.

Таким образом, на примере трипсина показано, что иммобилизованные в микрогранулы композитного гидрогеля протеазы сохраняют каталитическую активность в средах с высоким содержанием органического растворителя. Далее было изучено поведение иммобилизованных протеаз (на примере химотрипсина) в смесях ацетонитрил-вода с содержанием воды менее 20% (об.). Уменьшение количества воды до 8,9% (об.) незначительно влияло на ферментативную

активность. Даже в среде с содержанием воды лишь 0,5% (об.) химотрипсин сохранял 40% от исходной активности в воде (рис 16)

-Нативныи трипсин -Нативный химотрипсин - Иммобилизованный трипсин -Иммоби шзованный химотрипсин

= 3

л о.

^ К

= ¡5;

¡1 £ 2

20 30 40 50 60 70 80 90 Содержание ацетонитрила, % (об )

Рис 15 Зависимость активности нативных и иммобилизованных протеаз от концентрации ацетонитрила

Таблица 2

Кинетические параметры нативного и включенною в микрогранулы композитного ПВК-СаА^ геля трипсина в среде вода-ДМФА (25°С)

Конц ДМФА, % об Нативный зрипсин Иммобизизованный трипсин

кт, М кем, ь' кш/Кт. М 1 ч1 Кт, М

0 1 4 10" 22 0 1 57 10" 1 16 Ю* 19 12 1 65 106

10 4 3 105 62 83 1 46 !06 1 47 10 ^ 9 54 6 49 105

25 3 3 105 38 0 1 15 106 2 86 10 ^ 4 38 1 53 105

40 87 10" 1 11 1 30 10' 3 33 105 1 86 5 39 104

50 0 1 - - 7 69 10 ь 0 92 1 23 10"

70 - - - 1 0 Ю-4 1 09 1 09 10"

90 - - - 2.13 104 2.20 1 03 104

Чтобы оценить операционную стабильность иммобилизованного фермента в процессе многократного использования, микрогранулы с включенным химотрипсином инкубировали при перемешивании в смеси вода-

ацетонитрил (12,3 % об. воды) при 25°С в течение 3-х циклов по 90 часов каждый. После каждого цикла определяли эстеразную и амидазную активности фермента (рис. 17).

||в 11ГГ|

1-1—^-—90 НО 270

Рис 16 Зависимость эстеразной активности Рис 17 Операционная стабильность иммобилизованного химотрипсина от иммобилизованного химотрипсина в смеси содержания воды в смеси ацетонитрил-вода ацетонитрил-вода (12,3 % об 1120)

Примечание • за 100% принимали активность иммобилизованного фермента в воде

Видно, что даже после 270 часов в смеси ацетонитрил-вода, эстеразная активность фермента составляла 30 %, а амидазная - 47% от начальной активности в воде.

Интересно отметить, что эстеразная активность уменьшилась более значительно, чем амидазная. Как известно, лимитирующая стадия I идролиза эфирного субстрата - это распад комплекса ацил-фермент. Для гидролиза амидного субстрата лимитирующей является стадия образования ацил-фермента. Вероятно, в данном случае ацетонитрил воздействует в большей степени на стадию распада ацил-фермента, чем на его образование. Известно, что стабилизация белка происходит за счет уменьшения конформационной подвижности его молекул. Кроме того, для поддержания каталитически активной конформации белковой молекулы важно сохранение локального водного окружения. Вероятно, наблюдаемую в данном случае стабилизацию фермента, как и ранее

описанную термостабилизацию, можно объяснить наличием обоих этих явлений при включении фермента в композитный гидрогель.

2.3. Применение протеаз, иммобилизованных в микрогранулы композитного ПВК -СаА1^ гидрогеля

2.3. 1. Использование микрогранул с иммобилизованным химотрипсином в водно-органической среде в качестве биокатализатора для получения энантиомеров фенилаланина

Возможность многократного использования гранул композитного ПВК-СаА1е геля с иммобилизованным химотрипсином в водно-органической среде была продемонстрирована в реакции энантиоселективного гидролиза рацемического субстрата (рис. 18). Работа выполнена совместно с ИНЬОС РАН В данной работе использовали основание Шиффа этилового эфира 0,Ь-Р1те Поскольку данное соединение нерастворимо в воде, но растворяется в полярных органических растворителях, реакцию проводили в смсси ацетонитрил-вода (20% об. Н20). Такое количество воды обеспечивало как высокую растворимость исходного основания Шиффа, так и низкую растворимость продукта реакции Ь-РЬе, что существенно упрощало процесс ею выделения. Ь-РЬе удаляли из реакционной смеси в виде осадка в смеси с микрогранулами катализатора фильтрованием, а затем промывали раствором аммиака для растворения аминокислоты Микрогранулы с иммобилизованным химотрипсином после промывки водой использовались в последующих циклах реакции. Реакция проводилась в течение не менее трех циклов (144, 168 и 192 ч) при комнатной температуре.

Из представленых в табл.3 результатов реакции видно, что иммобилизованный в гранулы композитного ПВК-СаА1е гидрогеля

химотрипсин эффективно и селективно гидролизовал Ь-форму основания

зо

Шиффа этилового эфира РЬе с образованием Ь-РЬе Максимальный выход Ь-РЬе составил 90%, оптическая чистота (е е.) была 80,9%, 87,8% в каждом из двух циклов, соответственно. Из О-формы основания Шиффа, которая оставалась в реакционной смеси, затем получали О-РЬе (оптическая чистота до 87,3%).

Таким образом, химотрипсин, иммобилизованный в микрогранулы композитного ГТВК-СаА^ гидрогеля, может найти применение как биокатализатор многократного действия в различных реакциях, протекающих в водно-органических средах.

н ^ н СН2РЬ

Основание Шиффа этилового р Ь-РЬе-ОЕ!

Эфира О, Ь-РЬе

химотрипсин

с,нОк V

1чгн

ок снгрь

I-

о/сн.с>

Н СН2И1

ЕЮН

Ь-РЬе

(ОСАДОК)

Основание Шиффа этилового Эфира В-РЬе

Рис 18 Схема катализируемого иммобилизованным химотрипсином гидролиза основания Шиффа этилового эфира Э,Ь-РЬе в среде ацетонитрил-вода (20% об. Н20)

Таблица 3

Получение оптически чистого фенилаланина в реакции, катализируемой химотрипсином, иммобилизованным в микрогранулы композитного ПВК-СаА1§

Цикл Количество основания Шиффа этилового эфира 0,Ь-РЬе, мг Время цикла, час Выход I -РЬе, % Оптическая чистота Ь-РИе, % Оптическая чистота О-РИе, %

1 100 144 40 80,9 40,6

II 75 168 90 87,8 87,3

Примечание' в 1 г гранул было иммобилизовано 0 15 мг химотрипсина

Микрогранулы на основе композитных гелей с включенными протеазами могут применяться в биотехнологии и медицине для различных целей, в частности, как биокатализаторы в химико-энзиматическом гидролизе или синтезе; в процессах получения аффинных сорбентов, для очистки ингибиторов и рецепторов протеаз.

Отметим, что иммобилизованный описанным методом в микрогранулы тромбин (помимо применения для терапии ран, которое будет подробно описано в следующих главах) может быть использован для скрининга потенциальных пептидных ингибиторов этого фермента в процессе создания диагностикумов для определения системы свертывания крови, в частности, для определения активности протеина С.

2.4. Тромбин и пептиды, иммобилизованные в композитные полимерные матрицы : получение и применение дли ранозаживления

2.4.1. Получение пленок с иммобилизованным в них тромбином

Тромбин - это протеаза семейства трипсина, которая обладав! рядом уникальных свойств, в частности, регулирует свертывающие и противосвертывающие механизмы и ангиогенез, является ростовым фактором; включается в воспалительную и пролиферативную фазы заживления ран. стимулируя ири этом пролиферацию клеток эндотелия, фибробластов и Т-лимфоцитов, а)регацию клеток, продукцию коллагена Эти свойства могут позволить использовать его в медицине, в частности, для терапии ран. Попытки использовать нативный тромбин и его пептидные фрагменты как факторы роста для репарации тканей предпринимались неоднократно Однако применение тромбина ограничено из-за его нестабильности и провоспалительного эффекта, коюрый может иметь место в случае использования его высоких концентраций. В

настоящее время достаточно широко известен препарат на основе тромбина, используемый в качестве гемостатического и ранозаживляющего средства - это сиалант, или фибриновый клей (фирма Immuno, Austria). Сиалант представляет собой сгусток фибрина, образуемый непосредственно на поверхности раны при ее обработке свежеприготовленной смесью растворов фибриногена и тромбина в присутствии ионов кальция, адгезивных белков и ингибиторов фибринолиза. Препараты фибринового клея имеют высокую стоимость, поэтому практически не используются в России. В литературе не описаны надежные и недорогие способы иммобилизации тромбина в полимерные пленки. Ранее предпринятые попытки иммобилизации тромбина на полиакриламидном носителе (Fupergit С) и на сефарозе методом ковалентной иммобилизации, описанные в литературе, позволяют сохранить не более 2- 5 % активностей тромбина.

В данной работе были получены пленки композитного ПВК-CaAlg гидрогеля с иммобилизованным в них тромбином. Метод получения отличался от ранее описанного для ферментов только тем, что смесь полимера с тромбином не добавляли по каплям в желирующий раствор хлорида кальция, а помещали в чашку Петри, а затем добавляли в нее 1% раствор СаС12 для формирования пленок. Для оценки эффективности иммобилизации приготовленные пленки разрушали и определяли амидазную активность тромбина Было показано, что такой метод иммобилизации позволял сохранять до 51% амидазной активности тромбина при включении его в пленку. Кроме того, было продемонстрировано, что при хранении пленок с иммобилизованным тромбином в сухом виде активность фермента полностью сохранялась в течение как минимум 6 месяцев

2.4.2. Получение пленок композитного ПВК-CaAlg гидрогеля с иммобилизованными в них пептидами j рос. ндцивнлльнА t

33 I библиотека

| с.Петербург «

1 О» >00 <«т ' '—----i

Избежать возможных побочных эффектов тромбина, в частности, провоспапительного эффекта при использовании высоких концентраций, а также преодолеть трудности работы, вызванные быстрой инактивацией фермента, можно путем его замены пептидами, которые могут имитировать ранозаживляющий эффект тромбина. Кроме того, пептиды значительно дешевле тромбина и могут быть получены синтешчсским путем

Поскольку действие тромбина на клетки реализуется через мембранные рецепторы семейства PAR (protease-activated receptor), использование пептидов-агонистов рецепторов PAR (ag-PAR) дает возможность запускать каскад событий, связанных с процессом репарации ткани, минуя стадию протеолиза рецепторов тромбином.

Иммобилизация пептидов, во-первых, может позволить защитить их от разрушения пептидазами, которые присутствуют в ране, а во-вторых, обеспечить постепенное освобождение пептида, ю есть создать препарат пролонгированного действия Поскольку действие пептидов-агонистов PAR (активация рецепторов протеаз) осуществляется через взаимодействие с одной из внеклеточных цепей и/или с Ы-концсвым экзодоменом рецептора, в данном случае метод ковалентной иммобилизации пептида представлялся нецелесообразным По нашему мнению, именно механическое включение в гидрогель могло бы дать возможность получения эффективных препаратов с контролируемым освобождением пептидов-агонис тов PAR.

В данной работе для включения в пленки использовали сижетические пептиды: 1) агонист рецептора тромбина (ag-PAR-1), а именно, TRAP-6 (SFLLRN) и 2) агонист рецептора трипсина (ag-PAR-2), имеющий аминокислотную последовательность SLIGKV. Пептиды иммобилизовали либо в пленки композитного ПВК-CaAlg гидрогеля, либо в эти же пленки,

но дополнительно покрытые полиэлектролитными мембранами из поли-L-лизина, альгината, хитозана.

Так как иммобилизовать в пленку композитного ПВК-CaAlg гидрогеля низкомолекулярные пептиды по схеме, предложенной ранее для тромбина, было невозможно, был разработан новый метод с использованием целлюлозных мембран, пропитанных раствором 1% хлорида кальция и 0,1% раствора резорцина Выбор последнего был обусловлен тем, что наряду с другими низкомолекулярными соединениями, в частности, фенолами различного строения (таннином, флороглюцином), резорцин образует нерастворимые комплексы с ПВК Кроме того, он обладает антисептическими свойствами, поэтому широко используется в медицине. Создание на поверхности пленки композитного ПВК-CaAlg гидрогеля плотной оболочки (комплекс ПВК с резорцином) препятствовало мгновенному освобождению пептидов.

Определение количества пептида в пленке после ее разрушения, например, методом ВЭЖХ, оказалось невозможным, поскольку не удавалось его выделить из полимерной смеси. Пептид тестировали косвенным методом по разности концентрации пептида в исходной полимерной смеси и смыве с целлюлозных фильтров, использованных для приготовления пленки. При этом было показано, что на фильтре оставалось не более 0,9% от вводимого в исходную полимерную смесь пептида Таким образом, было продемонстрировано, что пептид практически полностью включался в пленки.

Для увеличения времени высвобождения пептидов из пленок, было предложено дополнительно покрывать последние полиэлектролитными мембранами на основе поли-Ь-лизина, альгината, хитозана.

Таким образом, были получены пленки композитною ПВК-CaAlg гидрогеля, содержащие синтетические пептиды ag-PAR-1 (TRAP-6) и ag -PAR-2. Исследования кинетики десорбции пептидов из пленок

in vitro показали, что последняя зависела от состава пленок и способа введения пептидов в пленку.

2.4.3. Исследование возможности применения тромбина и пептидов, иммобилизованных в пленки композитного ПВК-CaAlg гидрогеля, для заживления ран

Для изучения возможности использования полимерных пленок с иммобилизованным тромбином/пептидами в качестве эффективных покрытий для заживления ран были проведены эксперименты in vivo (совместно с Кафедрой физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ). Для этого пленки с тромбином/пептидами апплицировали на полнослойную рану размером 2*3 см2 (для крыс) или 1*1 см2 (для мытей) непосредственно после ранения Контрольная группа животных имела открытую рану, либо рану, закрытую полимерной пленкой без тромбина/пептидов.

Степень ранозаживления определяли : 1) по изменению площади раны; 2) с помощью гистологических исследований образцов грануляционной ткани.

Известно, что процесс репарации тканей и, в частности, ранозаживления включает три фазы: воспаление, пролиферацию и созревание грануляционной ткани. Обычно фаза воспаления длится около трех дней, стадия пролиферации завершается к седьмому - десятому дням после ранения. Фаза воспаления характеризуется присутствием большого количества макрофагов и других клеток (нейтрофилов, лимфоцитов), принимающих участие в остром адаптивном ответе организма в ране, фаза пролиферации - резким увеличением количества пролиферирующих фибробластов, продуцирующих коллаген и другие структурные компоненты, участвующие в процессе репарации ткани, а также образованием сосудов в грануляционной ткани (ангиогенез). Фибробласты

можно наблюдать в ране уже на третий день после ранения; однако, на седьмой день их количество достигает максимального значения.

Ниже показаны результаты гистологических исследований : влияние пленок композитного ПВК-СаА^ гидрогеля с иммобилизованным тромбином на общее количество фибробластов и количество пролиферирующих фибробластов (рис. 19), а также продемонстрирован эффект этих покрытий на процесс ангиогенеза (формирования сосудов) в образцах грануляционной ткани, взятых из ран (модель на крысах) на 3 и 7 дни после ранения (рис.20).

1 & § §

5 I

§ "¡2 * г

Дни после ранения

□ Контроль (пленка без тромбина)

■ Пленка с тромбином

•а 15

3 7 3 7 Дни после ранения

□ Контроль (пленка без тромбина)

■ Пленка с тромбином

Рис 19 Влияние

иммобилизованного

тромбина, Рис 20 Влияние тромбина, иммобилизованного пленки в пленки композитного ПВК-СаА^ геля на

композитного ПВК-СаА^ геля, на общее общее кол-во сосудов (А) и кол-во сосудов

кол-во фибробластов (А) и кол-во мсченных [Зщтамидином (В) в образцах пролиферирую-щих фибробластов (В) в

образцах грануляционной ткани резаных ран.

грануляционной ткани из резаных ран.

Видно, что параметры заживления лучше у опытных животных по сравнению с контрольными, имеющими полимерную пленку без тромбина Отметим, что количество пролиферирующих фибробластов у опытной группы животных уменьшается на 75% от третьего к седьмому дню после ранения, в то время как у контрольных животных оно все еще увеличивается на 7-й день после операции. Это может

свидетельствовать о сокращении стадии пролиферации у опытных животных и, соответственно, об ускорении заживления раны. Увеличение числа микрососудов (рис.20) позволяет предположить, что тромбин в

композитных ПВК-СаА1§ пленках, стимулирует процесс заживления, ускоряя неоваскуляризацию. Таким образом, использование ПВК-СаА1§ пленок с включенным тромбином, позволяет ускорить процесс репарации тканей в среднем на 3-4 дня.

Далее было показано, что пептиды-агонисты рецепторов, акшвируемых протеиназами РАЯ-! и РАЯ-2, включенные в пленки композитного ПВК-СаА^ гидрогеля, также, как и тромбин, ускоряли заживление ран (рис.21). Так, размер ран у крыс под пленками, содержащими пептиды-агонисты РАЛ-1 ^-РА11-1) и РАЯ-2 ^-РАЯ-2), был, соответственно, в 2 и 1,6 раза меньше, чем у животных контрольной группы.

3-й 7-й

Дни после ранения

■ Тромбин (10 NIH)

□ Iромбин (3 5 NIH)

■ Агонист PAR-2

□ TRAP-6 (Агонист PAR-I)

■ Кот ролы пленка без тромбина/пептида)

Рис 21 Изменение размера ран под ппенками композитного ПВК-CaAlg гидрогеля, с иммобилизованными тромбином или пептидами-а1 онж гами PAR За 100% принимали начальную площадь раны

Для контрольных животных (с пленкой без пептида) эта величина составляла только 37%. Эффект ag-PAR-1 (TRAP-6) был выражен даже ярче, чем действие тромбина. На 7-й день площадь раны под пленкой композитного ПВК-CaAlg гидрогеля с TRAP-6 была в 2,0 2,4 раза меньше, чем под пленками с тромбином и в 3,7 раз меньше, чем у контрольных животных. Гистологические исследования образцов грануляционной ткани коррелировали с результатами по определению размера ран.

Таким образом, иммобилизованные в пленки композитного ПВК-CaAIg гидрогеля ag-PAR-1 и ag-PAR-2 эффективно ускоряли процесс репарации тканей. Отметим, что действующая концентрация пептидов (1 мМ) была на несколько порядков выше, чем для тромбина. Это согласуется с литературными данными о том, что синтетические пептиды - слабые агонисты PAR. Несмотря на это, использование синтетических пептидов для ускорения ранозаживления более перспективно, чем тромбина, благодаря их дешевизне и отсутствию побочных эффектов.

Поскольку наиболее выраженное действие на процесс ранозаживления оказывал пептид-агонист PAR-1 (TRAP-6), в следующей серии экспериментов использовали пленки с TRAP-6, а именно, композитные пленки ПВК-CaAlg гидрогеля, покрытые поли-Ь-лизином (ММ 30-35 ООО) или хитозаном (ММ 70-150 ООО). Результаты по исследованию влияния пленок с иммобилизованным TRAP-6 на заживление резаных ран представлены в табл. 4. Видно, что на 3 и на 7 дни после ранения все параметры заживления у опытных животных, которым апплицировали пленки с TRAP-6, лучше, чем у контрольных, имеющих пленки без пептида. Уже к третьему дню наименьший размер имели раны под пленкой с TRAP-6, покрытой хитозаном. На седьмые сутки под пленкой с TRAP-6, покрытой хитозаном, наблюдали многослойный эпителий, хорошо развитую капиллярную сеть, сформированные плотный струп и волосяные луковицы.

Таким образом, было показано, что тромбин или синтетические пептиды ag-PAR-1 (TRAP-6) и ag-PAR-2, иммобилизованные в пленки композитного ПВК-CaAlg гидрогеля, ускоряют заживление ран. На основе полученных пленок композитного геля с иммобилизованными в них пептидами могут быть созданы новые эффективные покрытия для лечения ран с контролируемым высвобождением этих пептидов.

Таблица 4

Влияние пленок композитного ПВК-СаА^ гидро! еля с иммобилизованным ТЯАР-6 на заживление ран_

Параметры раиозаживления ПВК-CaAlg пленки ПВК-CaAlg пленки,покрытые поли-I -лизином ПВК-CaAlg пленки, покрытые хи гозаном

TRAP-6 Контрочь* TRAP-6 Контроль* 1RAP-6 1 Контроль*

Третьи сутки после ранения

Относительный размер ран*, % 96.1 ИЗО 93 6 77 0 64.6 79 3

Соотношение фибробласты/ макрофаги 0 33 1 69 0 75 0 31 0.78 0 35

Седьмые сутки после ранения

Отопительный размер ран**, % 17 1 63 1 j 24 9 31 2 16.2 26 2

Соошошение фибробласш/ макрофаги 5 79 1 03 ! 7 85 S 1 1 75 5.9 1 63

• Контроль пленка без пенIила, ** За 100% принимали начальный размер ран 2.4.4. Пептид ТИАР-б, иммобилизованный в биодеградируемые микрочастицы на основе сополимера молочной и гликолевой кисло!

2.4.4.1. Получение PLGA микрочасшц с иммобилизованным TRAP-6

В настоящее время полимерные матрицы на основе биосовместимых биодеградируемых полиэфиров, например, сополимера молочной и гликолевой кислот (PLGA), широко используются для биокапсулирования широкого спектра лекарственных препаратов, включая белки и пептиды Иммобилизация TRAP-6 в биодеградируемые микрочастицы открывает новые возможности для создания систем пролонгированного действия, которые могут быть использованы для лечения внутренних ран, например, язвы желудка или ран после хирургических вменшельств.

Иммобилизацию TRAP-6 в PLGA микрочастицы проводили методом двойного эмульгирования. Работа выполнена совместно с Центром биоматериалов университета г. Льежа (Бельгия) Для приготовления

первичной эмульсии желатиновый раствор смешивали с раствором пептида и полученную водную фазу после гомогенизации диспергировали в гидрофобную фазу PLGA (P(d,l)LA-GA 50/50, Mw 29 ООО; Мп 7 ООО) при 40°С. Полученную эмульсию гомогенизировали, охлаждали до 15°С и далее вводили при перемешивании в раствор поливинилового спирта. После инкубирования микрочастиц (15 мин) температуру поднимали до 30°С, а растворитель испаряли. Полученные микрочастицы собирали на фильтре, промывали и лиофильно сушили. Полученные PLGA микрочастицы были исследованы методами световой и электронной микроскопии. Биодеградируемость PLGA микрочастиц (с иммобилизованным в них пептидом ) в зависимости от времени продемонстрирована на рис. 22 (модель in vitro).

Рис. 22. Разрушение PLGA микрочастиц с иммобилизованным TRAP-6 при инкубации в PBS при 37 С • а) до инкубации, Ь) после 2 дней инкубации, с) после 7 дней инкубации

2.4.4.2. Изучение эффекта TRAP-6, иммобилизованного в PLGA микрочастицы, на заживление ран в моделях на мышах

Для проведения гистологических исследований использовали образцы грануляционной ткани из области раны. Экспресс-диагностику процесса заживления проводили по анализу отпечатков. Исследование динамики ранозаживления в модели на мышах на 7 день (рис.23) выявило сокращение количества макрофагов по сравнению с первым контролем

(рана под микрочастицами без пептида) и вторым контролем (открытая рана). Количество же фибробластов в исследуемом образце грануляционной ткани напротив увеличилось. Так как соотношение фибробласты/макрофаги отражает процессы пролиферации/воспаления, можно сделать заключение, что пролиферативная фаза для ран, закрытых PLGA микрочастицами с иммобилизованным пептидом, сократилась, следовательно, процесс репарации тканей ускорился. Кроме того, в образцах поперечнБгх срезов грануляционной ткани наблюдали 7-8 слоев ороговевшего эпителия в случае ран, закрытых микрочастицами с иммобилизованным пептидом. Образцы срезов грануляционной ткани из открытой раны и раны, покрытой микрочастицами без пептида, имели 4 и 5 слоев эпителия, соответственно.

Анализ размеров ран показал, что на 7-ой день средний размер раны у опытных животных (покрытой микрочастицами с иммобилизованным пептидом) был вдвое меньше, чем в случае контроля (раны закрыты пустыми микрочастицами) и составлял 8,5 and 15,6 %, соответственно. В то же время для открытой раны этот размер составлял 28 % от исходного, взятого за 100%. Таким образом, тромбин и пептиды, иммобилизованные в полимерные матрицы (в виде полимерных пленок или микрочастиц) действительно вовлечены в воспалительную и пролиферативную фазы репарации тканей и могут ускорять ранозаживление. На основе инкапсулированных в полимерные матрицы синтетических пептидов могут быть созданы новые эффективные покрытия пролонгированного действия с контролируемым высвобождением пептидов для терапии ран.

В заключение отметим, что в ближайшем будущем планируется как оптимизация разработанных методов, в частности с привлечением новых перспективных полимерных материалов для инкапсулирования биообъектов, так и расширение спектра этих биообъектов (например, использование новых белков-антигенов, гликоконъюгатов, ДНК и др.).

~ " Рис 23 Макрофаги и

фибробласты в образцах im отпечатки срезы грануляционной на 7 день

JJ I ^jTf* _ I после нанесения раны

| ■ М flf Приведены данные 3

Кол-во« , Н M ^В независимых эксперименто

■ II 18

=И II Ы II

макрофаги фибробласты макР°Фа'и фибробласты "пустые ^микрочастицы ® открытая

микрочастицы с TRAP-6__рана__

Такие работы могут позволить выйти на новые перспективные области применения в биотехнологии и биомедицине, например, создание новых вакцин пролонгированного действия на основе инкапсулированных антигенов, новых эффективных сорбентов для биомедицины и др.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны новые методы иммобилизации клеток (в том числе нескольких линий гибридных клеток, клеток яичника китайского хомячка СНО, аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 и др.) в композитные микрогранулы (ПВК-CaAlg или ПВП-CaAlg) или альгинат-хитозановые микрокапсулы.

2. Изучены морфологические особенности иммобилизованных клеток, их рост и пролиферация, а также продукция биологически активных веществ (например, моноклональных антител в случае гидридом) в процессе длительного культивирования в зависимости от состава, физико-химических свойств и структуры микрогранул/микрокапсул.

3. Показано, что иммобилизованные клетки могут применяться в биотехнологии для наработки in vitro различных биологически активных веществ, а также получения чистых веществ (в частности, моноклональных анител) при культивировании иммобилизованных клеток в бессывороточных средах.

4. На основе линии раковых клеток MCF-7, иммобилизованных в

альгинат-олигохитозановые микрокапсулы предложена новая in vitro модель, которая может использоваться для изучения эффекта фотодинамической терапии на малые солидные опухоли.

5. Впервые предложены биокатализаторы - протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин, тромбин, карбоксипептидаза В), иммобилизованные в микро1 ранулы композитного ПВК-CaAlg гидрогеля (в том числе микрогранулы с магнитными свойствами).

6. Всесторонне исследованы энзиматические свойства иммобилизованных ферментов на примере трипсина и химотрипсина (рН-и температурная зависимости, термостабильность, устойчивость в различных водно-органических средах; определены кинетические параметры ферментативных реакций при различных температурах и в различных водно-органических средах).

7. Показана возможность применения иммобилизованных в микрогранулы композитного ПВК-CaAlg гидрогеля протеаз в качестве биокатализаторов в водно-органических средах (для получения L-фенилаланина).

8. Впервые получены препараты на основе тромбина и/или пептидов, которые могут имитировать механизм действия тромбина в процессе репарации тканей, в полимерные матрицы (пленки композитного ПВК-CaAlg гидрогеля и биодеградируемые микрочастицы на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот).

9. Изучены ранозаживляющие эффекты иммобилизованных тромбина и пептидов и продемонстрирована эффективность этих полимерных покрытий в процессах заживления ран в моделях т vivo.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих

публикациях :

Главы в книгах :

1. Марквичева Е А Хитозан и его производные в биокапсулировании, Глава 6, В кн Хитин и хитозан ■ получение, свойства и применение, под ред К Г Скрябина, Г А Вихоревой, ВП Варламова, М Наука, 2002, с 315-326

2. Markvicheva Е, Bioencapsulation in polymer micro- and nanocarriers and applications m biomedical fields, In: Finely dispersed particles' micro-, nano-, and atto-engineering, Spasic A , Hsu J-P (Eds), Marcel Dekker Inc , New-York, 2005, pp 853-868

3 Poncelet D and Markvicheva E, Microencapsuation and alginate, In- Microencapsulation of Food Ingredients, Per Vilstrup (Ed ), Leatherhead Publishing Food RA London, 2001, pp 215-223

4 Markvicheva E and Grandfils Ch, Microcarriers for animal cell culture, In Fundamentals of Cell Immobilisation Biotechnology, Series Focus on Biotechnology, Willaert R , Nedovich V (Eds) Kluwer Academic Publishers Dordrecht-Boston-London, 2004, v 8A, pp 441-461

5. Markvicheva E, Dugina T, Grandfils Ch , Lange M , Stashevskaya К , Vasilieva Г , Rumsh L, Strukova S , Application of bioencapsulated proteinases and peptides for wound healing, Charter 12, In- Advanced Biomaterials for Medical Applications, Series II Mathematics, Physics and Chemistry, Ihomas D W (Ed ), Kluwer Academic Publishers Dordrecht-Boston-London, 2004, pp 165-176

6 Marc A., Markvicheva E , Jourdain С , Bezdetnaya L , Merlin J-L , Guillemin F , Zubov V , Goergen, J-L, Spheroids formation by encapsulation of cancer cells to mimic small size tumors. In . Animal Cell Technology meets Genomics, Godia F and Fussenger M (Eds.), Springer, Netherlands, 2005, pp 261-263

Авторские свидетельства

7 Туркин С.И , Лукин Ю В , Марквичева Е А , Али-Заде Р.А , Скуиньш А Г , КлявиньшМ К., Зицманис А X , Зубов В.П , Способ получения желатиновых микроносителей для культивирования клеток, Авт свидетельство N 1486515, С 12 N 5/00, 11/00, Приоритет от 6 10.1987, Бюлл. N22 от 06. 12. 1989.

8 Туркин С И., Лукин Ю.В., Марквичева Е А , Али-Заде Р А , Скуиньш А Г, Завальный М.А., Клявиньш М К., Зицманис А X , Зубов В.П, Способ получения магнитных микроносителей для культивирования клеток эукариот, Авт свидетельство N 1567623, С 12 N 5/00, 11/02, Приоритет от 6 10 1987, Бюлл N20 от 30 05.1990

9 Донова М В , Марквичева Е А , Кузькина И Ф , Кузнецов А И , Баклашова Т Г Кощеенко К А , Кирш Ю Э , Карапутадзе Г.М , Зубов В Г1, Пашкин И.И , Способ иммобилизации микроорганизмов, Авт свидетельство N 1687615, С 12 N 11 /00, 11/04, 11/08, Приоритет от 23 10 1989, Ьюлл N 40 от 30 10 1991

10 Марквичева ЕА, Кузькина ИФ, Плечко Г.Н., Амбросова СМ, Кирш ЮЭ, Карапутадзе Т М , Завальный М А , Туркин С И., Стерлигова Н Н , Зубов В П Способ культивирования клеток животных в полимерных гранулах, Авт свидетельство N 1721088, С 12 N 5 /00, Приоритет от 23 10 89, Бюлл N11 oi 23.03.1992

Обзор

11 Марквичева Е А , Туркин С И , Лукин Ю В , Подойницын С Н , Зубов В П , Магнитные микроносители в биотехнологии и медицине, Материалы Московского института химической технологии им ДИ Менделеева, М МХТИ, 1985, 135, 5965

Статьи

12 Markvicheva Е А , Kuz'kina I F , Pashkin I I, Plechko T N , Kirsh Yu F., /.ubov V P , A novel technique for entrapment of hybridoma cells in synthetic thermally reversible polymers, Biotechnol. Techniq , 1991, v 5, (3), pp.223-226

13 Donova M V , Markvicheva E A , Ku?'kina I F, Baklashova T G , Arinbasarova A Yu , Pashkin 11, Sukhodolskaya G V , Fokina V V , Kirsh Yu F , Koshcheyenko К A., Zubov V P , Poly-N-vinyl caprolactam gel a novel matrix for entrapment of microorganisms, Biotechnol Techniq., 1993, v 7, (6), pp.415-422

14 Марквичева E A , Бронин А С , Кудрявцева H E , Пашкин И И , Кузькина И Ф , Кирш Ю.Э., Румш JI Д., Зубов В.П, Новый метод иммобилизации протеолитических ферментов в полимерных гидрогелях, Биоорган химия, 1994, т 20, (3), стр. 257-261.

15. Markvicheva Е.А , Bronin AS, Kudryavtseva NE, Rumsh L D., Kirsh Yu E and Zubov V P , Immobilization of proteases in composite hydrogel based on poly(N-vinyl caprolactam), Biotechol. Techn , 1994, v 8, (3), pp. 143-148.

16 Markvicheva E A., Khaidukov S V., Marecva T Yu , Bronin A S , Ncsmeyanov V A , Zubov V.P. Effect of cell immobilization into hydrogel beads on monoclonal antibody production by hybridoma cells during a cultivation period, Membr and Cell Biol, 1995, v 9, pp 127-134 (англ версия)

17 Markvicheva E , Khaidukov S , Mareeva T , Nesmeyanov V., and Zubov V , Effect of cell entrapment in calcium alginate gel on a structure and functions of hybridoma, J Experiment Clin Cancer Research, 1995, v. 14,(1), pp 212-213

18 Кузькина И.Ф , Пашкин И И , Марквичева Е А , Кирш Ю Э., Бакеева И.В., Зубов В.П. Гранулы на основе поли-Ы-винилкапролактама' получение, свойства и применение, Хим.-фарм журнал, 1996, т 1,стр 39-41

19 Markvicheva Е А , Tkachuk N Е., Kuptsova S V , TN Dugina, S М Strukova, Kirsh Yu.E , Zubov V P, and Rumsh L D , Stabilization of proteases by entrapment in a new composite hydrogel, AppI Biochem Biotechnol , 1996, v 61, pp 75-84

20. Markvicheva E, Kuptsova S., Dugina T, Strukova S., Kolokolchikova E, Rumsh L , Zubov V., Poncelet P , Immobilized thrombin as a promising system for wound healing, Eur. J.Cell Biol, 1997, v.72, (Suppl 43), p.108-109.

21 Vikhrov A A., Markvicheva E.A., Mareeva T Yu , Khaidukov S V., Nesmeyanov V A , Manakov M N , Goergen J-L, Marc A , and Zubov V P , Preparation of pure monoclonal antibody to mterleukin-2 by cultivation of hybridoma cells entrapped in novel composite hydrogel beads, Biotechnol Techn, 1998, v 12, (1), pp 11-14

22 Струкова C.M , Дугина T H., Чистов И В , Марквичева Е.А , Купцова С В , Колокольчикова F Г, Румш Л.Д., Зубов В П., Глуза Э, Тромбин-регулятор репаративных процессов при заживлении ран. Биоорган химия, 1998, т 24 (4), стр 288-292 .

23 Strukova S., Dugina Т, Umarova В , Chistov V, Markvicheva Е, Kuptsova S , Kolokolchikova E , Rumsh L., Pinelis V , Glusa E, Thrombin invokes tissue remodeling and contributes to wound healing, Cardiovascular Pathology, 1998, v 6, p 271-273.

24 Михайлова И Ю., Мареева Т Ю , Цыганник И.Н., Михалева И И , Оноприенко J1 В., Вихров А.А , Марквичева Е А., Пэнгборн В., Дюэкс В., Несмеянов В А, Плетнев В.З , Получение, кристаллизация и предварительные рентгеноструктурные исследования НаЬ-фрагментов моноклональною анжтела к интерлейкину-2 человек и его комплекса с антигенным пептидом, Биоорган химия, 1999, т25, (4), стр. 247-252.

25 Зубов В П , Иванов А Е , Жигис Л С , Рапопорт Е М , Марквичева Е А , Лукин Ю.В., Зайцев С Ю, Молекулярное конструирование полимерных материалов для биотехнологии и медицины, Биоор! ан химия, 1999, т 25, (11), стр 868-880.

26 Tahrat, H; Chenu, S , Benslimane, С , Auge, С , Malleron, A , Cerutti, M, Markvicheva, E , Goergen, J L, Marc, A , Human fucosyltransferasc production m bioreactor for the synthesis of therapeutic oligosaccharides, Recents Prog Gemc Procedes 1999, v 13 (71), pp. 319-326 (in French) ~

27 Markvicheva b.A, Kuptsova S V., Mareeva 1 Yu, Vikhrov A A., Dugina T.N., Strukova S M , Belokon Yu N , Kochetkov К A , Baranova E N , Zubov V P , Poncelet D , Rumsh I.J), Immobilized enzymes and cells in poly(N-vinyl caprolactam)-based hydrogels' preparation, properties and applications in biotechnology and medicine, Appl Biochem Biotechnol, 2000, v. 88 (1-3), pp 145-157

28 Kuptsova S , Markvicheva E, Kochetkov К , Belokon' Yu ,Rumsh L, and 7ubov V , Proteases entrapped in hydrogels based on poly(N-vinyl caprolactam) as promising biocatalysts in water-organic systems, Biocatalysis and Biotransformations, 2000, v. 18, pp. 133-149.

29. Markvicheva E., Kuptsova S, Buryakov A., Dugina T, Strukova S , Varlamova

E., Babak V, and Rumsh L, Proteases entrapped in polymer composite hydrogels preparation methods and applications, Vestnik of Moscow State University, 2000, v 41 (6), pp 54-57 (in English)

30 Vilchez С , Garbayo T, Markvicheva E , Galvan F . Leon R , Studies on the suitability of alginate-entrapped Chlamydomonas reihardtu cells for sustaining nitrate consumption process, Bioresource Technology, 2001, v 78. pp 55-61

31 Strukova SM, Dugina TN., Chistov I V, Lange M.A, Markvicheva E.A , Kuptsova S V , Zubov V P Glusa E , Immobilized Thrombin Receptor Agonist Peptide Accelerates Wound Healing in Mice, Clin Appl Thrombosis/Hemostasis, 2001, v 7(4), pp. 325-329.

32 Марквичева E.A., Купцова С В., Яровинский Ф О., Суровой А Ю, Культивирование клеток-продуцентов эндостатина в микрокапсулах на основе природных полисахаридов, Цитология, т 43 (9), стр 876-877

33. Марквичева Е А., Купцова С В., Румш Л Д, Дугина Т Н , Ланге М А , Чистов И В , Струкова С.М, Зубов В П, Полимерные покрытия с инкапсули-рованными тромбином и пептидами' получение и использование для ранозаживления, Вопр Мед химии, 2002, т 48 (6), сзр. 570-576

34 Markvicheva Е , Bezdetnaya L, Bartkowiak А , Marc А, Goergen J-L. Guillemin F , Poncelet D , Encapsulated multicellular tumor spheroids a a novel model to study small size tumors, Chem Industry, 2003, v 57 (12), 585-588

35 Markvicheva E , Grandfils, Ch , Bezdetnaya L , Goergen J-L , Bartkowiak A, Guillemin

F, Poncelet D, Bioencapsulated peptides, proteins, animal cells preparation and applications in biomedical fields, Chem Industry, 2004, v 58 (6a), 75-78

36 Markvicheva E, Bioencapsulated mammalian cells, proteins, peptides' preparation and application for biomedical fields, European Journal of Cell Biology, 2004, v. 83, Suppl.54, pp. 96-97.

37 Дугина T H , Киселева E В , Ланге M A , Васильева T В , Грандфис К , Марквичева Е.А., Беспалова Е Д., Палькеева ME, Струкова С.М, Эффект синтетическою пептида-агониста тромбинового рецептора, инкапсулированного в микрочастицы на основе сополимера молочной и гликолевой кислот, на заживление ран у мышей, Бюлл. Экспер. Биол. Мед., 2004, т. 138 (11), стр 523-527.

38 Markvicheva Е , Lozinsky V , Plieva F , Kochetkov К , Rumsh L , Zubov V , Kumar R , Parmar V., Belokon Yu., Gel-immobilized enzymes as promising biocatalysts for enantioselective hydrolysis in water/organic media, Pure and Applied Chemistry. 2005 v 77 (l),pp 227-236

Тезисы докладов (избранные)

39 Markvicheva Е , Mareeva Т , Khaidukov S, Effect of cell entrapment in calcium alginate gel on a structure and functions of hybridoma, 41st International Congress of the European Tissue Culture Society (Verona, 9-12 October 1994), Abstracts, p 61

40 Markvicheva E, Mareeva T, Vikhrov A , Nesmeyanov V, Monoclonal antibodies against GMDP as a tool for investigation of some biological properties of GMDP, Eur J Cell Biol, 1995, Suppl volume, p 95

41 Markvicheva E A , Tkachuk N Ye, Kuptsova, S V , Dugina T N , Strukova S M , Zubov V P, Rumsh, L D , Stabilization of proteases by entrapment in a new composite hydrogel, The 23гй Meeting of FEBS (Basel, August 13-18, 1995), Abstracts, p 295

42 Ткачук HE, Марквичева EA, Купцова С В, Румш Л Д, Свойства трипсина и карбоксипептидази В, иммобилизованных в фанулы композитного геля на основе поли-М-винилкапролактама, IV симпозиум "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 21-23 апреля, 1997), Материалы конференции, стр 153 (устный доклад)

43 Markvicheva Е А , Vikhrov А А , Mareeva 'I Yu., Khaidukov S V , Zubov V P , Nesmeyanov V A , Encapsulation of animal cells and cultivation in serum free medium, International Workshop on Bioencapsulation VI From fundamentals to industrial applications, (Barcelona, Aug 30- Sept 1, 1997), (4 pages), talk 7 2

44 Markvicheva E., Vikhrov A , Mareeva T, Khaidukov S , Zubov V , Nesmeyanov V , Cultivation of animal cells entrapped in hydrogel beads in serum free medium. Annual Meeting of the Deutsche Gesellschaft fuer Zellbiologie (Saarbrucken March 15-20, 1998), Abstracts, p. 92

45 Markvicheva E, Kuptsova S , Maieeva T . Vikhrov A , Belokon Yu . Kochetkov К , Zubov V, Rumsh L, Enzymes and animal cells entrapped in composite po!y(N-vmyl caprolactam)-based hydrogels preparation properties and applications in biotechnology and medicine. International Workshop on Bioencapsulation VII and 1998-mmi-simposium on Microencapsulation (Easton, Maryland, USA, 20tll-23rd November, 1998), Abstracts, talk 8 1 p 32

46 Markvicheva E , Immobilized enzymes and cells in poly(N-vinyl caprolactam)-based hydrogels preparation, properties and applications in biotechnology and medicine, Internationa! Conference "Biocatalysis 98 Fundamentals & Applications" (Pushchino, Russia, June 13-18, 1998), Abstracts, p 23 (a talk)

47 Markvicheva E .Mammalian cells entrapped m novel macroporous hydrogel beads cultivation method and promising applications (Rome. 9-10 Ian 1999), Abstracts, p 56

48 Markvicheva E , Mareeva T , Vikhrov A , Khaidukov S , Zubov V , Macroporous bead

entrapment system for cultivation of animal cells //9^ Furopean Congress on Biotechnology (Brussels, Belgium, 11-15 July,1999), Abstracts, ECB9/2722

49 Kuptsova S Markvicheva t , Pavlov D , Kochetkov К , Belokon Yu , Rumsh I , 7ubov V., Proteases entrapped m hydrogels based on poly(N-vmyl caprolactam) as promising biocatalysts in water-organic systems, 8lh International Workshop on Bioencapsulation, (Trondheim, Norway, 13-15 September, 1999), Abstracts, (4 pages), talk 0-8

50 Tahrat FI, Chenu S , Benslimane С , Auge С., Malleron A , Cerutti M , Markvicheva E , Goergen JL , Marc A , Human fucosyltransferase (FUCTIII) production in bioreactor for the synthesis of therapeutic oligosaccharides The 2nd European Congress of Chemical Engineering (France, Montpellier 5-7 Oct 1999), Abstracts p 37

51 Markvicheva E, Kuptsova S., Buryakov A, Dugina T, Strukova S, Varlamova E, Babak V, Rumsh. L , Proteases entrapped m polymer composite hydrogels preparation, methods and applications, International Conference Biocatalysis-2000 Fundamentals and applications (Moscow, 10-15 June, 2000), Abstiacts, p 40, (a talk)

52 Markvicheva F , Fntrapment and cultivation of mammalian cells in novel polymer macroporous beads, The World Congress on Biotechnology "Biotechnology 2000" (Berlin, Germany, 3-8 Sept 2000), Abstracts, v 2. p 82

53 Kuptsova S , Mareeva T , Vikhrov A , Markvicheva"E„ Goergen J-L, Marc A , Poncelet D , Alginate-chitosan microcapsules for cultivation of animal cells, IX International BRG Workshop (Warsaw, Poland, 11-13 May 2001), Proceedings, P-17 (4 pages)

54. Markvicheva E , Mareeva Т., Kuptsova S., F Yarovinsky, A Surovoy, Mammalian cells cultivated in alginate-chitosan microcapsules as a tool for gene therapy, COST 840 and X International BRG Workshop on Bioencapsulation "Cell Physiology and Interactions of Biomaterials and Matrices" (Prague, Czech Republic, 26-28 April, 2002), Proceedings, pp.28-32, talk S-II-1.

55. Grandfils Ch., Markvicheva E, Barakat I., Dugina T, Lange M., Strukova S, Encapsulation of Thrombin Receptor Agonist Peptide in PLGA beads, COST 840 and X International BRG Workshop on Bioencapsulation " Cell Physiology and Interactions of Biomaterials and matrices" (Prague, Czech Republic, 26-28 April, 2002), Proceedings, talk S-IJ-2, pp. 33-36

56 Markvicheva E , Jourdain С , Barthelemy V, Bezdetnaya IMerlin. J-L, Guillemm F , Grandjean C., Marc A., Goergen J-L, Encapsulated cancer cells as a novel model to study the effect of antitumor therapy on small size tumors, International Congress "Advances in the use of multicellular spheroids in cancer biology and therapy" (Rome. 9-11 Oct 2002), Abstracts, 43-44, (an invited lecture).

57 Marc A , Markvicheva E , Jourdain С , Bezdetnaya L , Merlin J-L , Guillemin F , Zubov V , Goergen J-L , Spheroids formation by encapsulation of cancer cells to mimic small size tumors, ESACT 18 (Granada, Spain, 11-14 May, 2003), pp. 56-59, (a talk)

58 Markvicheva E , Bezdetnaya L, Bartkowiak A. Marc A, Goergen J-L, Guillemin F , Poncelet, D Encapsulated multicellular tumor spheroids as a novel in vitro model to study small size tumors, XI International Workshop on Bioencapsulation "State of Art of Bioencapsulation Science and Technology (Illkirch-Strasbourg, France, 25-27 May, 2003), Proceedings, pp 27-29, (a talk)

59 Марквичева E , Биомедицинские применения хитозана для биокапсулирования белков, пептидов и клеток животных, VII Международная конференция по исследованию хитина и хигозана (С-Петербург-Репино, 15-18 сент. 2003), Материалы конференции, стр 405-408 {устный доклад).

60 Marc А , Markvicheva Е , Jourdain С , Bezdetnaya L , Merlin J-L , Guillemm F , 7ubov V, Goergen J-L , Spheroids formation by encapsulation of cancer cells to mimic small size tumors Proceedings of ESACT 18 (Granada, Spain, 11-14 May, 2003), pp 56-58

61 Markvicheva E , Bezdetnaya L , Merlin J-L , Guillemin F , Grandjean C., Goergen, A Marc J L, Encapsulation de cellules cancereuses pour la generation de modnles cellulaires tridimensionnels, 9th Congress of Chemical Engineering French Society, (Saint-Nazaire, Sept 9-11, 2003), Proceedings, p 36, (a talk)

62 Markvicheva E, Application of bioencapsulated proteinases and peptides for wound healing, NATO Advanced Research Workshop Macromolecular Approaches to Advanced Biomaterials Engineering Systems (Sofia, 8-11 Nov, 2003) Abstracts, p 15 (an invited lecture) .

63 Markvicheva E , Bioencapsulated mammalian cells, proteins, peptides preparation and applications in biomedical fields. ICOB-4 and ISCNP-24 IUPAC International conference CNew Dehli, 26-29 Jan 2004), Proceedings, II -40 (an invited lecture)

64 Stachevskaya К Markvicheva E . Dugina T , Strukova S , Grandfils Ch , Optimization of the encapsulation of Thrombin Receptor Agonist Peptide in PLGA microbeads, XVIIth Aachen Colloquium on Biomaterials (Aachen, Germany, 4-5 March. 2004) Abstracts, p 26

65 Markvicheva E , Grandfils, Ch , Bezdetnaya L , Goergen J-L , Bartkowiak A, Guillemin F, Poncelct D, Bioencapsulated peptides, proteins, animal cells preparation and applications m biomedical fields, COST Expert's conference "Applications of lmmobilisation/Bioencapsulation in Medicine, Pharmacy, Food Technology and Biotechnology and COST Steering Committee Meeting (Belgrade, 25-27 June 2004), (an invited lecture).

66 Stashevskaya, Ch Grandfils, E Markvicheva S Struko\a, In vitro study of Thrombin Receptor Agonist Peptide release from PLGA microbeads, In . Proceedings of the XII International Workshop on Bioencapsulation (Vitoria, Spain, Sept 24-26, 2004), pp 295298.

67 Марквичева E A, Биокапсулированные животные клетки, белки, пептиды получение и применение для биочедипины, VII чтения, посвященные памяти академика Ю А Овчинникова (Москва, 4-7 октября 2004), стр 61

68 Сташевская К С , Марквичева Е А , Д> гина Т Н , Струкова С М , I рандфис К , Зубов В П, Биосовместимые биодеградируемые полимерные микрочастицы с иммобилизованным пептидом для терапии ран, VII чтения, посвященные памяти академика Ю А Овчинникова (Москва, 4-7 октября 2004). стр 43

69 Markvicheva F , Svirshchevskaya F , Grandfils Ch , Sukhorukov G , Bezdetnaya L , Poncelet D , Bioencapsulated animal cclls and biopolymers • preparation and applications in biomedical fields, 3rd International Symposium on Advanced Biomaterials/Biomechanics (Montreal. Canada, April 3-6. 2005), p 219 (a talk)

Список сокращений

БАВ -биологически активные вещества ПВК поли-Ы-винилкарполактам CaAlg - альгинат кальция NaAlg - альгинат натрия

ПВК- CaAlg композитный гель на основе ПВК и альгината PLGA - сополимер на основе молочной и миколевой кислот МА - моноклональные антитела ПВП -поли-М-винилпирролидон

ГМДП^-ацетилглюкозаминил-р(1-4)^-апстилмура\юиз-аланил-0-июглутамин

FCS- фетальная сыворотка теленка

ИмГ- иммобилизованные гибридомы

СК- суспензионная культура

ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ

ПААГ-ДСП - полиакриламид-додсцилсульфат натрия

СНО -Chinese hamster ovary

ФТ - фотодинамическая терапия

ФС - фотосенсибилизатор

ПП-IX- динатриевая соль протопорфирина-1Х

PAR - protease-activated receptor

TRAP-6 - thrombin receptor agonist peptide