Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые методы иммобилизации клеток животных в композитные гидрогели

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Новые методы иммобилизации клеток животных в композитные гидрогели"

На правах рукописи

РГБ 04

" 3 ЯН8

ВИХРОВ АЛЕКСАНДР АНАТОЛЬЕВИЧ

НОВЫЕ МЕТОДЫ ИММОБИЛИЗАЦИИ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ В КОМПОЗИТНЫЕ ГИДРОГЕЛИ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискапие ученой степени кандидата химических паук

МОСКВА 2000г.

Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева и в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научные руководители; доктор химических наук, профессор,

Манаков Михаил Николаевич.

кандидат химических наук

Марквичева Елена Арнольдовна.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Штильман Михаил Исаакович, доктор химических наук, старший научный сотрудник Румш Лев Давыдович.

Ведущая организация - Институт "Биотехнология".

Защита состоится г. в^ час. на заседании

диссертационного Совета Д 053.34.13 в РХТУ им. Д.И. Менделеева по адресу: 125047, Москва, А-47, Миусская пл., 9.

С диссертацией можно ознакомиться в Научно-информационном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева.

Автореферат разослан

г-

2000г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

И.И. Гусева

<£, О

»

Актуальность проблемы. Развитие важнейших и наиболее перспективных овременных направлений фундаментальных и прикладных исследований в области 1едицины и биотехнологии невозможно без широкого использования культур клеток швотных.

В организме человека и животных ткани и органы сформированы из клеток, (заимодействующих между собой с помощью межклеточных контактов, а также с гомощью находящегося между ними внеклеточного матрикса из протеогликанов и ликопротеинов. Таким образом, чтобы создать in vitro наиболее адекватные условия щя оптимального проявления функциональной активности клеток животных, ¡еобходимо реконструировать пространственную модель трехмерного роста, источающую в себя элементы, имитирующие микросреду исходной ткани (органа), "оздание подобных моделей позволит разработать высокоэффективные технологии юлучения различных биологически-активных веществ (БАВ), а также использовать к в перспективных биомедицинских исследованиях, в частности при создании гскусственных органов, в генной терапии и трансплантологии. Очевидно, что клетки кивотных (человека), включенные в гидрогели, представляют собой систему in vitro, » которой можно создать условия, наиболее близкие к условиям существования слеток in vivo. В настоящее время для иммобилизации в основном используют «шокомпонентные гидрогели, как правило, сформированные из природных толисахаридов. Однако в таких гелях достаточно трудно создать оптимальные условия для роста и пролиферации иммобилизованных клеток животных. Поэтому ipüfSiftgfóFCo^^HUfi, мдагокрутонентных гидрогелей и изучение влияния их состава и ггруктуры на морфо-физиологические особенности иммобилизованных клеток кивотных остается важной и актуальной частью создания высокоэффективных 5иосистем для различных биотехнологических и биомедицинских процессов.

Цель работы. Целью работы являлось создание новых методов иммобилизации теток животных в композитные гидрогели на основе альгшгата натрия (NaAlg) и толи->1-виниламидов (в частности, поли-М-винилкапролактама (ПВК), поли-N-шнилпирролидона (ПВП)) для повышения эффективности биотехнологических троцессов на основе иммобилизованных клеток (в частности, гибридом, СНО и др.). Uflя достижения поставленной цели были решены следующие задачи: • разработаны способы получения композитных гидрогелей с последующим асследованием их физико-механических характеристик, а также изучением их внутренней структуры;

- на основе этих способов созданы новые методы иммобилизации клеток животных;

- изучены морфологические особенности иммобилизованных клеток животных;

- исследовано влияние структуры полимерных матриц на пролиферацию гибридом, иммобилизованных в различные композитные гидрогели;

- изучены возможности увеличения продукции моноклональных антител (высокоспецифичных иммуноглобулинов) иммобилизованными гибридомами (ИмГ);

- с целью получения чистых моноклональных антител (МА) разработаны методы длительного культивирования ИмГ в бессывороточных средах.

Научная новизна. Впервые проведен сопоставительный анализ методов и условий формирования монокомпонентных (СаА^) и композитных гидрогелей на основе СаА^ и поли-Ы-виниламидов. Исследованы физико-механические свойства и структура гидрогелей в зависимости от типа гранул, композиционного состава и времени их формирования. Впервые предложено использовать гранулы композитных гидрогелей на основе поли-Ы-вшшламидов и СаА^ для иммобилизации клеток животных. Методом проточной цитометрии (совместно с группой иммунохимии ИБХ РАН) исследованы морфологические особенности иммобилизованных в композитные гидрогели гибридом. Впервые разработан способ повышения продуктивности иммобилизованных гибридом, включенных в СаА^ гель, за счет структурирования носителя с помощью поли-Ы-вш шл амидов.

Практическая ценность работы. Разработанные методы иммобилизации в композитные гидрогели могут быть использованы для иммобилизации широкого класса клеток животных (человека) при создании новых технологий для получения различных БАВ. Системы на основе композитных гидрогелей могут найти практическое применение в новейших биомедицинских технологиях, в частности, генной терапии и заместительной трансплантологии. Результаты исследований влияния состава и структуры композитных гидрогелей на морфо-физиологические свойства иммобилизованных клеток животных открывают возможность разработки теоретических подходов к выбору носителей для иммобилизации. Разработанные подходы могут быть использованы для прогнозирования функциональных свойств биосистем на основе иммобилизованных клеток, что позволит повысить выход БАВ. Разработанные процессы длительного культивирования ИмГ в бессывороточных средах могут найти применение для создания новых технологий производства высокоочищенных иммуноглобулинов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на симпозиуме по микрокапсулированию (Санкт-Петербург, Россия 1996), на 3-й международной конференции "Новые информационные технологии в

медицине и экологии". (Ялта-Гурзуф, Украина, 1997), на международной конференции Bioencapsulation VI (Барселона, Испания 1997), на международной конференции "Biocatalysis-98: fundamentals & applications" (Пущино, Россия 1998), на международной конференции Bioencapsulation VII (Easton, Maryland, USA, 1998), на 9-м Европейском конгрессе по биотехнологии (Brussels, Belgium, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, заключения и выводов. Список литературы содержит источников.

Основные результаты и их обсуждение

Для получения композитных (в частности, макропористых) гидрогелей были выбраны NaAlg (природный полисахарид, наиболее часто используемый для иммобилизации клеток животных) и водорастворимые синтетические поли-N-виниламиды: ПВП с молекулярной массой (М.М.) 12500 и ПВК (М.М. 900000) (Рис. 1). ПВК, в отличие от ПВП, может образовывать при температуре выше 37°С (нижней критической температуре растворения, НКТР) термообратимые гидрогели.

Рис.1. Структурные формулы: а) альгииата натрия; б) поли-М-шшилпирролидона; в) поли-М-винилкапролактама.

1. Методы получения гранул композитных гидрогелей.

Получение композитных гранул, в частносга, на основе альгината кальция - поли-И-винилкапролактама (СаА^-ПВК) и альгината кальция - поли-М-винилпирролидона

(СаА1§-ПВП), осуществляли путем добавления по каплям раствора смеси полимеров ЫаА1§ и ПВК или ИаА^ и ПВП в раствор СаС12, предварительно нагретый до 37-40°С (рис. 2). Диспергирование полимерной смеси проводили под действием сжатого воздуха с помощью оригинального прибора, позволяющего получать гранулы с оптимальным для роста и пролиферации клеток животных диаметром (до 1 мм).

Рис. 2. Метод получение гранул композитных гидрогелей.

Показано, что производительность процесса формирования композитных гранул, а также их размер зависели от вязкости полимерной смеси, которая определялась ее составом и соотношением отдельных компонентов, входящих в нее. (Таб. 1).

Таблица 1

Зависимость размера композитных гранул и производительности процесса их получения от соотношения компонентов полимерной смеси.

Соотношение ЫаА1§/ПВК в полимерной смеси (масс.) Соотношение NaAlg/ПBП в полимерной смеси (масс.) Размер композитных гранул, мкм Производительность, мл гранул/мин

СаА^-ПВК СаА1§- пвп СаА^-ПВК СаА^-ПВП

1,0/1,1 1,0/1,1 650±50 500±50 1 1,6

1,0/2,1 1,0/2,1 950±75 450±50 0,4 2

1,0/2,6 1,0/2,6 агрегиру ют 400±40 н/о 2,5

1,0/3,1 1,0/3,1 не образуются н/о

Повышение вязкости полимерной смеси приводило к необходимости увеличения расхода воздуха для ее диспергирования. Эффективное формирование

гранул (400-800 мкм) продолжалось до того момента, пока содержание ПВК в полимерной смеси не превышало 12 мг ПВК/мл смеси (соотношение КаА1|*/ПВК -1,0/1,1 (масс.)).

При более высоком содержании ПВК формирование гранул по предлагаемой технологии с необходимыми характеристиками (размер, механическая стабильность и др.) невозможно. Это сопряжено со следующими моментами:

1. Повышение расхода воздуха для диспергирования полимерной смеси, содержащей более 12 мг ПВК/мл смеси, приводило к охлаждению поверхности раствора СаС12 (зоны формирования гранул) ниже НКТР для ПВК, что делало невозможным процесс гелеобразования. В противном случае (при снижении расхода воздуха) формировались гранулы с диаметром 1,5-3 мм.

2. Гранулы, полученные из полимерной смеси при соотношении ЫаЛ1£/ПВК -1,0/2,6 (масс.), агрегируют при перемешивании, что может быть объяснено отсутствием необходимого электростатического заряда на поверхности гранул из-за нсионогенной природы ПВК и усилением гидрофобных взаимодействий между полимерными молекулами ПВК отдельных гранул.

В случае использования ПВП (м.м. 12600), скорость образования гранул возрастала по мере повышения содержания ПВП в полимерной смеси, что связано с уменьшением вязкости смеси полимеров. Однако при соотношении НаА1£/ПВП -1,0/3,1 (масс.) формирование гранул не наблюдалось. Возможно, это связано с нарушением целостности жесткой конденсационной сетки СаА^ геля, обеспечивающей механическую прочность гранул.

1.1. Изучение механической прочности композитных гранул.

Изучена зависимость прочности композитных гранул от соотношения компонентов полимерной матрицы и времени контакта сформированных гранул с раствором СаС12 (Рис. 3). Механическую прочность гранул определяли по времени, необходимому для полного разрушения гранул при интенсивном их перемешивании в стакане с физиологическим раствором на магнитной мешалке (1500 об/мин) при 37°С.

Как видно из Рис. 3, механическая прочность композитных гранул уменьшается с повышением содержания поли-Ы-виниламидов в полимерной смеси. Вероятно, это связано с нарушением целостности жесткой конденсационной структуры СаА1д гидрогеля, формированием пористой внутренней структуры.

ЫаА^/ПВК (масс.) | КаА^/ПВП (масс.)

Рис. 3. Диаграммы механической прочности композитных гранул в зависимости от содержания ПВК (ПВП) в полимерной матрице и времени инкубации в растворе СаС12,: 1) СаА1§-ПВК гранулы; 2) СаА1§-ПВП гранулы.

Увеличение механической прочности СаА1§-ПВК гранул, получешых из полимерной смеси при соотношении NaAlg/ПBK - 1,0/0,3 (масс.), вероятно, связано с образование комплекса ПВК и ЫаА^. Также это может быть связано с вытеснением части воды из окружения ПВК в процессе образования геля, что приводит к сжатию гранул и формированию более плотного геля по сравнению с СаА^ гидрогелем.

Установлено, что инкубирование при 37°С СаА18-ПВК гранул в среде для культивирования клеток, содержащей 10 % фетальной сыворотки, в течение 3-х суток приводило к повышению времени их разрушения в 1,5-2 раза. По всей видимости, это связано с образованием комплексов ПВК с белками сыворотки. Известно, что ПВК образует нерастворимые (после снижения температуры ниже НКТР) комплексы с овальбумином и другими соединениями различной природы. В аналогичных условиях прочность СаА1§-ПВП гранул практически не изменялась.

1.2. Исследование структуры композитных гранул гидрогеля.

Спектрофотометрический анализ показал, что СаА1§-ПВП матрица теряет до 70% ПВП (от исходного количества, введенного в полимерную смесь): до 30% в ходе формирования гранул; еще до 40% при инкубировании в физиологическом растворе (37°С) в течение последующих 2-х часов. В аналогичных условиях СаА^-ПВК гранулы теряют не более 5% ПВК от исходного количества, введенного в полимерную смесь, что может соответствовать низкомолекулярной фракции ПВК, неспособной формировать гель в данных физико-химических условиях.

При охлаждении же до 25°С СаА^-ПВК гранулы теряют до 50% ПВК (от исходного количества, введенного в полимерную смесь), что объясняется термообратимостью геля ПВК при этой температуре и выходом полимера в раствор.

Исследование гранул с использованием метода световой микроскопии нолутонких срезов позволило обнаружить принципиально отличные друг от друга структуры гранул, в зависимости от состава полимерной матрицы (Рис. 4).

Если для СаА^ гранул характерна структура в виде гомогенной полисахаридной сетки с равномерно чередующимися полимерными волокнами по всему объему гранул (Рис. 4а, г), то введение в нее ПВК (ПВП) приводит к формированию гетерогенной структуры.

Сопоставление данных спектрофотометрического анализа и методов световой микроскопии позволило говорить о том, что нами были получены: макропористый СаА^-ПВП носитель (рис 4.в) и композитный СаА^-ПВК носитель с чередующимися зонами с "жесткой" СаЛ1§ сеткой и эластичными поперечно-несшитыми ионами Са2+ зонами ПВК (Рис. 46). Полученные данные позволили подтвердить ранее высказанные предположения о снижении механической прочности композитных гранул при изменении соотношения ее компонентов за счет нарушения целостности конденсационной структуры СаЛ^ геля.

Рис. 4. Структура гранул гидрогеля различного состава: а, г) СаА1§, б) СаА^-ПВК, в) СаА1«-ПВП. Соотношение МаА1£>/ПВК (ПВП) в композитных гранулах -1,0/1,1 (масс.). Масштабная линейка соответствует 10 мкм.

Таким образом, меняя композицию полимерной матрицы, соотношение ее компонентов и условия формирования гранул (Т, среда и др.), можно регулировать физико-химические свойства и структуру получаемых гидрогелей.

2. Методы иммобилизация гибридом в композитные гидрогели.

В качестве модельных клеток для иммобилизации были выбраны шбридомы. Эти клетки характеризуются способностью практически к неограниченному росту, а

таюке более высокой скоростью роста по сравнению с другими культурами клеток животных. Кроме того, МА, продуцируемые гибридомами, широко используются в научных и прикладных исследованиях. Следует отметить, что для МА разработаны высокоточные и надежные методы их определения.

В работе были использованы гибридомы Ь№СВ-2 и Е6/1.2, продуцирующие МА к рекомбинантному интерлейкину-2 человека и М-ацетилглгокозаминил-[}(1-4)-Ы-ацетилмурамоил-аланил-О-изоглутамину (ГМДП), соответственно. ГМДП и интерлейкин-2 человека являются перспективными веществами для создания лекарственных препаратов, используемых в клинической практике (для вакцинации, несиецифической защиты от инфекций, химиотерапии рака). Культивирование проводили на среде ОМЕМ, содержащей 10% фегальной сыворотки (ОМЕМ/РСЙ).

2.1. Оптимизация процесса иммобилизации гибридом.

Физиологическое состояние клеток оказывало существенное влияние на сохранение жизнеспособности гибридом в процессе иммобилизации. Было показано, что жизнеспособность иммобилизованных гибридом (ИмГ) зависела от того, в какой фазе роста находилась популяция клеток перед иммобилизацией. Жизнеспособность ИмГ была максимальной после иммобилизации в гель клеток, взятых в логарифмической фазе роста.

Кроме того, на сохранение жизнеспособности клеток существенное влияние оказывало время инкубации ИмГ в растворе СаСЬ в процессе проведения иммобилизации. Известно, что СаС12, необходимый для формирования СаА^ геля, в концентрациях выше 2% вызывает гибель клеток. С целью получения гранул, содержащих максимально возможное количество жизнеспособных клеток после иммобилизации и механически устойчивых в процессе длительного культивирования, варьировали время выдерживания гранул в растворе СаСЬ. Так, снижение этого времени с 20 до 5 мин позволило сохранить до 90% жизнеспособных клеток в гранулах непосредственно после иммобилизации и сократить время лаг-фазы для ИмГ в 3 раза.

2.2. Оптимизация композитных гранул для ИмГ.

Структура гранул и микроокружение ИмГ являлись важнейшими факторами, которые определяли интенсивность деления ИмГ, форму колоний клеток, их размер и локализацию внутри гранул. С помощью световой микроскопии полутонких срезов гранул установлено изменение особенностей роста ИмГ в композитных гранулах по

сравнению с СаА1« гидрогелем. Так, если в СаА1§ геле ИмГ растут в виде вытянутых колоний, состоящих из плотно упакованных клеток, то в композитных гелях они растут в виде колоний с менее плотной упаковкой клеток неправильной формы (рис.

5).

Очевидно, характер роста ИмГ зависел от плотности геля. Повышение пористости композитных гидрогелей за счет введения ПВК (ПВП), как и следовало ожидать, привело к повышению степени заполнения внутреннего объема гранул ИмГ (таб. 3).

Таблица 3.

Особенности роста ИмГ в зависимости от соотношения компонентов в полимерной матрице.

Характер роста ИмГ в композитных гранулах

СаА^-ПВК гранулы СаА^-Г1В11 гранулы

Соотношение №А^/ПВК (ПВП) (масс.) в полимерной смеси 1/0,3 Отмечался рост клеток только в виде "плотных" колоний, формировавшихся только в приповерхностном слое гранул. Отмечался рост колоний в радиальном направлении от поверхности к центру гранулы. Формировались 2 типа колоний: колонии из "плотно упакованных" клеток и колонии, в которых клетки росли более свободно (рис. 5/3). Колонии с "плотно упакованными" клетками составляли до 80% от общего числа сформировавшихся колоний. Степень заполнения внутреннего объема гранул не превышала 30%.

1/0,3 1/1,1 Формировались два типа колоний: веретенообразные колонии из "плотно упакованных" клеток, и колонии, в которых клетки росли более свободно. Количество и объем колоний, образуемых ИмГ, возрастало при увеличении концентрации вводимого синтетического полимера (ПВК, ПВП).

С ростом содержания ПВК количество колоний с "плотно упакованными" клетками резко уменьшалось. В гранулах, полученных из смеси с соотношением КаА1;^ПВК 1,0/1,1, они полностью отсутствовали. Степень заполнения внутреннего объема гранул возрастала до 90 % (рис. 7г). Количество колоний с "плотно упакованными" клетками уменьшалось по мере увеличения содержания ПВП в иммобилизационной смеси, однако оно не опускалось ниже 20 % от общего числа сформировавшихся колоний. Колонии ИмГ заполняли до 60-70 % объема гранул (рис. 7з).

ж

Рис. 5. Характер роста ИмГ: 1) в СаА^ гранулах (9 день культивирования); 2) в СаА1§-ПВК гранулах (3 день культивирования, соотношение NaAlg/ПBK - 1,0/0,9 (масс.)); 3) два типа колоний, формирующихся в композитных гидрогелях: а) колонии с плотно упакованными клетками, б) колонии с менее плотной упаковкой клеток. Масштабная линейка соответствует 25 мкм.

Для статистически достоверного изучения морфологических изменений, происходящих в популяции иммобилизованных гибридом на клеточном уровне, был проведен цитофлуориметрический анализ ИмГ. В процессе культивирования отбирали аликвоты гранул, освобождали клетки путем растворения гранул в 50 мМ нитратном буфере (рН 7,2) и далее подвергали клеточную суспензию анализу с использованием малоуглового светорассеяния, позволяющего судить о распределении клеток по размерам (рис. 6/1).

204) -(ПО ЯОО ШЛО

Малоугловое светорассеяние, оти. ед.

Светорассеяние под углом 90 С, отн. сд.

Рис 6. Гистограммы распределения клеток гибридомы ЫЧКВ-2: 1. по размерам, 2. по гранулярности. А - клетки, освобожденные из СаА^-ПВК гранул; В -клетки, освобожденные из СаА^ гранул; С - суспензионная культура клеток (контроль). ИмГ выделены после 6 дней культивирования в гранулах.

Из гистограмм распределения ИмГ и свободных клеток суспензионной культуры (СК) по размерам (Рис. 6/1.), видно, что максимум пика интенсивности светорассеяния для ИмГ, включенных в CaAlg гель, значительно сдвинут вправо, что свидетельствует об увеличении среднестатистического размера ИмГ в сравнении с СК. Увеличение среднестатистического размера ИмГ коррелировало с увеличением определяемой по светорассеянию под углом 90° гранулярности их цитоплазмы, отражающей внутреннюю структуру клеток (рис.6/2).

Изменение гранулярности ИмГ может быть связано как с изменением внутренней структуры клеток, так и с изменением соотношения размеров ядра и цитоплазмы. Следует отметить, что величина данных отклонений от контрольных значений уменьшалась по мере увеличения пористости композитных гидрогелей.

3. Культивирование иммобилизованных гибридом.

3.1. Культивирование иммобилизованных гибридом на средах, содержащих

сыворотку

Культивирование клеток гибридом осуществляли на двух коммерческих средах DMEM и RPMI-1640 (Flow Laboratories). Мы не обнаружили существенных различий ни в пролиферации, ни в продукции МА суспензионных культур гибридом LNKB-2 и Е6/1.2 при культивировании их на средах DMEM и RPMI-1640, содержащих 10% фетальной сыворотки.

. ■ ^жт ге^ Э -

/4ШМ '-Шш^

фкяащ штЩ

ъ'ЗюШш*-; ¿Ф^ш^

Рис. 7. Динамика роста иммобилизованных гибридом LNKB-2 в композитных гранулах. CaAlg-ПВК гранулы: а) после иммобилизации, б) 3 день, в) 6 день, г) 12 день культивирования; CaAlg-ПВП гранулы: д) после иммобилизации, е) - 3 день, ж] 6 день, з) 12 день культивирования. Соотношение NaAlg/ПВК (ПВП) - 1,0/0.5 (масс.). Масштабная линейка соответствует 100 мкм.

Однако использование среды 11РМ1-1640 для культивирования гибридом, иммобилизованных в композитные гранулы, оказалось невозможным, т.к. гранулы разрушались из-за высокого содержания фосфатов в этой среде.

Сравнительный анализ динамики роста ИмГ в СаА^-ПВК и СаА^-ПВП гранулах выявил некоторое отставание в развитии популяции ИмГ в СаА1§-ПВП гидрогеле (рис. 7). Более высокий индекс пролиферации клеток в СаА^-ПВК гранулах может быть связан с тем, что в СаА^-ПВК гранулах нет непосредственного контакта ИмГ с СаА^ полимерной сеткой. Известно, что высокая концентрация Са2+ останавливает рост клеток животных.

Рост ИмГ контролировали не только с помощью визуального наблюдения, но и с помощью определения уровня глюкозы и лактата в среде культивирования.

Резкое падение уровня глюкозы в среде, отмечаемое на 7-9 сутки культивирования, связано с выходом клеток из гранул и быстрым их размножением в среде культивирования. Увеличение количества свободных клеток вызывало гибель ИмГ, очевидно, вследствие конкуренции быстро растущей суспензионной культуры за питательные вещества среды культивирования. Надо отметить, что концентрация МА в среде культивирования не превышала уровень, характерный для стационарной культуры и составляла 40-45 мкг/мл. Для предотвращения выхода клеток в среду, повышения плотности ИмГ и продуктивности процесса культивирования гибридом, гранулы были покрыты дополнительной мембраной из поли-Ь-лизина. Это позволило в 3 раза увеличить время нахождения ИмГ внутри гранул. Таким образом, степень заполнения внутреннего объема гранул растущими клетками гибридом составила 80-95% (рис. 8).

Рис. 8. Микрофотография СаА^-ПВК гранулы, покрытой мембраной из поли-Ь-лизина, с иммобилизованными гибридомами ЫЧКВ-2 (15 день культивирования). Соотношение КаА1§/ТТВК - 1,0/0,9 (масс.). Масштабная линейка соответствует 100 мкм.

Также было показано, что иммобилизация гибридом в композитные гидрогели способствует значительному росту продукции МА по сравнению с продукцией гибридом, иммобилизованных в традиционный СаА^ гидрогель (рис. 9).

I 1

ю

Время (сутки)

- СаА1д-ПВК гранулы

-СаА1д-ПВП гранулы —*—СаА1д гранулы

Рис. 9. Кинетика накопления МА, продуцируемых гибридомами Ь>ЖВ-2, иммобилизованными в различные гранулы. Среда культивирования БМЕМ, 10 % фетальной сыворотки. NaAlg/ПBK (ПВП) - 1,0/0,9 (масс.). Смена среды обозначена стрелками.

По-видимому, это связано как с увеличением плотности ИмГ в композитных гидрогелях, так, возможно, и с физиологическими изменениями в ИмГ.

Из-за методических трудностей достоверно определить концентрацию гибридом, процентное содержание жизнеспособных клеток в популяции ИмГ на протяжении всего эксперимента не удаюсь.

50 45 40 "о 35

к 30 1 9 25 ,

120' >? 15 10 5 0

Г

ПСаА1д-ПВК

□ СаА1д-ПВП

□ СаА1д

6 9 12 15 18 Время культивирования (сутки)

21

Рис. 10. Зависимость экономического коэффициента Умд/глн, от времени культивирования.

О физиологических изменениях в гибридомах, иммобилизованных в композитные гидрогели по сравнению с гибридомами, иммобилизованными в CaAlg гидрогель, свидетельствует изменение величины экономического коэффициента "Умаслю (рис. 10). Кроме того, для гибридом, иммобилизованных в

композитные гидрогели, значительно выше Yma/глю Для гибридом, иммобилизованных в CaAlg гидрогель, что указывает на повышение эффективности культивирования ИмГ в композитных гидрогелях.

Сопоставив экспериментальные данные (механическую прочность гранул, рост и пролиферацию ИмГ, продукцию МА, УМА/глю), в качестве оптимальной матрицы для иммобилизации гибридом мы выбрали композитные CaAlg-ПВК (NaAlg/ПВК 1,0/0,9 (масс.)) гранулы, покрытые мембраной из поли-Ь-лизина.

После оптимизации процесса культивирования ИмГ эффективность предлагаемой методики культивирования клеток животных, иммобилизованных в композитные гранулы, была продемонстрирована: на поверхностно-зависимой клеточной линии СНО и на клетках карциномы легких человека.

3.2. Культивирование иммобилизованных габридом на бессывороточных средах.

Использование бессывороточных сред обеспечивает ряд преимуществ перед культивированием клеток животных на средах, содержащих сыворотку, в частности, упрощение очистки продуктов клеточного метаболизма, что ведет к значительному снижению стоимости их получения.

В работе была апробирована возможность наработки МА при культивировании п бессывороточной среде гибридом, иммобилизованных в CaAlg-ПВК гранулы.

Культивирование ИмГ проводили на двух коммерческих бессывороточных средах: DMEM (Flow Laboratories), содержащей 10% безбелковой среды PFH (DMEM-PFH), и DMEM в модификации Искова (IMDM, Flow Laboratories), содержащей бычий сывороточный альбумин, человеческий трансферрин и соевый лецитин.

Однако даже в самых мягких условиях иммобилизации в гранулы композитных гидрогелей наблюдали массовую гибель клеток, предварительно адаптированных в течение 5-6 пассажей в суспензии на любую бессывороточною среду. Поэтому в дальнейшем мы решили осуществлять переведение клеток на бессывороточные среды уже в иммобилизованном состоянии. Были исследованы различные схемы переведения ИмГ на бессывороточные среды. Было установлено, что оптимальными сроками переведения ИмГ на бессывороточную среду можно

считать 3-5 сутки культивирования в среде DMEM/FCS, после восстановления определенного уровня (40 - 45%) жизнеспособных клеток внутри гранул, а смену среды целесообразно проводить через каждые 3 дня культивирования.

Как и следовало ожидать, культивирование на бессывороточных средах оказалось менее продуктивным, чем культивирование ИмГ на DMEM/FCS. Так, если степень заполнения гранул ИмГ уменьшилась незначительно, то продукция МА была на достаточно низком уровне (20-40 мкг/мл).

В настоящее время нет универсальной бессывороточной среды для культивирования клеток животных, во многих случаях метод проб и ошибок является единственным методом подбора ингредиентов для создания оптимальной среды для конкретной клеточной линии.

Для культивирования клеток животных часто используют смесь коммерческих сред DMEM и F12 (DMEM/F-12).

Для повышения продукции МА было предложено использовать среду DMEM/F-12, обогащенную аминокислотами и витаминами (DMEM/SPITE), содержащую белково-минеральную добавку SPITE (Sigma), специально разработанную для культивирования гибридом и содержащую инсулин, трансферрин, селенит натрия.

Наработку препаративных количеств МА проводили при периодическом культивировании ИмГ в спиннере (V=500 мл). При этом посевная концентрация гибридом была 1x106 кл/мл полимерной смеси, степень загрузки спиннера составляла 0,5, соотношение гранулы/среда культивирования - 1/10 (v/v), скорость перемешивания была 80 об/мин.

Культивирование проводили в ССЬ-инкубаторе в газовой среде, содержащей 5% СО2. Первые три дня клетки культивировали на среде DMEM/FCS. Затем проводили полную замену среды DMEM/FCS на бессывороточную среду DMEM/SPITE. Далее полную замену бессывороточной среды осуществляли через каждые три дш культивирования. Применение данной технологии позволило значительно повысил продуктивность процесса культивирования ИмГ (рис. 11).

Максимальная концентрация МА для гибридом LNKB-2, иммобилизованных г CaAlg-ПВК гра1гулы, составила 150 мкг/мл. Это превышало продукцию М.А стационарной культуры клеток и продукцию ИмГ, культивируемых в средс DMEM/FCS, соответственно, в 5 и в 2 раза.

Время (сутки)

Рис. 11. Кинетика накопления моноклональных антител при культивировании в бессывороточной среде, (н) - СаА^-ПВК гранулы; (♦) - СаА^ гранулы. Гранулы покрыты оболочкой из поли-Ь-лизина. Среда БМЕМ/БРИЕ. Смена среды обозначена стрелками

Влияние среды культивирования на морфологию ИмГ было незначительным. Таким образом, при культивировании на ВМЕМ/БРГГЕ увеличение продукции МА, очевидно, происходит за счет введения дополнительных компонентов в среду (в частности, витаминов). Применение среды БМЕМ/8Р1ТЕ также позволило значительно повысить эффективность процесса культивирования, о чем свидетельствовал рост величины УМа/глю (рис. 12).

3 6 9 13 15

Время культивирования (сутки)

Рис. 12. Зависимость экономического коэффициента Умдуглю от времени культивирования.

Следует также отметить, что использование бессывороточной среды позволил! непосредственно из супернатанта получить препараты МА, содержащие только 5°/ белковых примесей, состоящих из единственного белка - трансферрина (входящего: состав SPITE) (рис. 13).

£¿4: —30

1 2 3

Рис. 13. Электрофорез моноклональных антител к интерлейкину-2 в ПААГ-ДСН: 1 из супернатанта ЫЧКВ-2; 2-из очищенной асцитной жидкости; 3 - стандарта молекулярной массы.

В дальнейшем полученные препараты МА были использованы сотрудникам! лаборатории иммунохимии ИБХ РАН для проведения рентгеноструктурного анализ! пространственной структуры РаЬ-фрагмента МА к интерлейкину-2 человека и ег( комплекса с пептидным фрагментом этого цитокина.

4. Длительное хранение клеток животных в иммобилизованном состоянии.

Разработанные композитные гидрогели использовались не только дш культивирования ИмГ, но и для длительного хранения иммобилизованных клето] животных.

Осуществлено длительное хранение (в течение 3 месяцев) иммобилизованные в СаА^-ПВК гели клеток СНО. Установлено, что определяющим моментом дш успешной сохранности клеток были сроки, в которые проводилось замораживали! иммобилизованных клеток (ИмК). При замораживании ИмК, взятых после 5-7 дне{ культивирования, процедуру хранения в жидком азоте успешно переносили 80-90°/ сформированных колоний ИмК.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны новые способы получения гранул композитных СаА^-ПВК I макропористых СаА^-ПВП гидрогелей.

2. Показано, что структура, физико-механические свойства полученных композитных гидрогелей зависят от типа и количества введенного в матрицу поли-N-виниламида.

3. Разработаны новые методы иммобилизации клеток животных в композитные гидрогели.

4. Методом проточной цитометрии исследованы морфологические особенности гибридом, иммобилизованных в композитные гидрогели. Показано, что их морфология зависит от типа и внутренней структуры композитных гранул.

5. Продемонстрирована возможность увеличения продукции моноклональных антител гибридомами, иммобилизованными в композитные гидрогели. При этом максимальная продукция достигается при использовании композитных CaAlg-ПВК гранул.

6. Для получения чистых моноклональных антител разработаны методы длительного культивирования гибридом, иммобилизованных в композитные гидрогели на бессывороточных средах.

7. Показана возможность длительного хранения клеток животных, иммобилизованных в композитные гидрогели.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. T. Yu. Mareeva, A. A. Vikhrov, Е. A. Markvicheva, V. P. Zubov, V. A. Nesmeyanov. А novel encapsulation technique for cultivation of hybridoma cells. Mini Symposium on Microencapsulation. (Saint-Peterburg, 1996). Abstract, p. 44.

2. E.A. Марквичева, C.B. Купцова, H.E. Ткачук, A.A. Вихров, Т.Ю. Мареева, Т.Н. Дугина, С.М. Струкова. Новые методы иммобилизации ферментов и животных клеток и их использование в биотехнологии и медицине. 3 Международная конференция и дискуссионный научный клуб "Новые информационные технологии в медицине и экологии" (Ялта-Гурзуф, 1997). Тезисы докладов, с. 157.

3. Е.А. Markvicheva, A.A. Vikhrov, T.Yu. Mareeva, S.V. Khaidukov, V.A. Nesmeyanov, V.P. Zubov. Encapsulation of animal cells and cultivation in serum free medium. Proceedings of the International Workshop on Bioencapsulation 6 (Barcelona, Spain, 1997). Talk 7.2.

4. A.A. Vikhrov, E.A. Markvicheva, T.Yu. Mareeva, S.V. Khaidukov, VA. Nesmeyanov, M.N. Manakov, J-L. Goergen, A. Marc, V.P. Zubov. Preparation of pure monoclonal

antibody to interleukin-2 by cultivation of hybridoma cells entrapped in novel composite hydrogel beads. Biotechnology Techniques, 1998, Vol. 12, №1, p. 11-14.

5. A. Vikhrov, E. Markvicheva, T. Mareeva, V. Nesmeyanov and V. Zubov. Immobilized animal cells as producers of proteins and enzymes. International conference "Biocatalysis-98: fiindamentals & applications" (Puschino, Russia, 1998). Abstract, p. 57-58.

6. E. Markvicheva, A. Vikhrov, T. Mareeva, S. Khaidukov , V. Nesmeyanov and V. Zubov. Cultivation of mammalian cells entrapped in composite hydrogel beads in serum free medium. 22. Annual Meeting of the Deutsche Gesellschaft fur Zellbiologie. (Saarbrucken. 1998), Abstract, Eur. J. Cell Biol. Vol. 75, Suppl. 48., p. 92.

7. E. Markvicheva, S. Kuptsova, T. Mareeva, A. Vikhrov, Yu. Belokon, K. Kochetkov, V, Zubov. Enzymes and animal cells entrapped in composite poly(N-vinil caproIactam)-based hydrogels: preparation, properties and application in biotechnology and medicine. Int. Workshop on Bioencapsulation VII and 1998 Mini-symposium on Microencapsulation (Easton, Maryland, USA, 1998). Abstract.

8. Markvicheva E.A., Mareeva T.Yu., Vikhrov A.A., Khaidukov S.V., Zubov V.P., Nesmeyanov V.A. Cultivation of hybridoma cells entrapped in hydrogel beads in serum free medium. 4th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology (Puschino, Russia, 1998). Abstract, p. 92.

9. И.Ю. Михайлова, Т.Ю. Мареева, И.Н. Цыгагаппс, И.И. Михалева, JI.B. Оноприенко, A.A. Вихров, Е.А. Марквичева, В. Пэнгборн, В. Дюэкс, В.А. Несмеянов. В.З. Плетнев. Получение, кристаллизация и предварительные рентгенострукгурные исследования Fab-фрагменга моноклоналыгаго антитела к интерлейкину-2 человекг и его комплекса с антигенным пептидом. Биоорган, хим. 1999, том 25, №4, с. 247252.

10. Е. Markvicheva, Т. Mareeva, A. Vikhrov, S. Khaidukov, V. Zubov. Масгорогош entrapment system for cultivation of animal cells. 9th European Congress or Biotechnology (Brussels, Belgium, 1999). Abstract, ECB9/2722.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Вихров, Александр Анатольевич, Москва

¿у ¿V

РОССИЙСКИЙ ХИМИКО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМ. Д.И. МЕНДЕЛЕЕВА

НОВЫЕ МЕТОДЫ ИММОБИЛИЗАЦИИ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ В КОМПОЗИТНЫЕ ГИДРОГЕЛИ

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор МАНАКОВ М.Н кандидат химических наук МАРКВИЧЕВА Е.А.

на правах рукописи

ВИХРОВ АЛЕКСАНДР АНАТОЛЬЕВИЧ

Специальность 03.00.23 - Биотехнология

МОСКВА 2000

4

1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БАВ - Биологически активные вещества ПВК - поли-1Ч-винилкапролактам ПВП - поли-И-винилпирролидон

- альгинат натрия CaAlg - альгинат кальция РСРР - полифосфазен ^О - иммуноглобулины класса О НКТР - нижняя критическая температура растворения ПЭГ - полиэтиленгликоль МА - моноклональные антитела ИмГ - иммобилизованные гибридомы СК - суспензионная культура

ГМДП - М-ацетилглюкозаминил-рП -4)-М-ацетилмурамоил-аланил-0 изоглутамину

Е6/1.2 - гибридома, продуцирующая антитела к ГМДП ОУА-ГМДП - конъюгат ГМДП с овальбумином ГЫКВ-2 - гибридома, продуцирующая антитела к интермейкину-2 человека

РРН - безбелковая среда для культивирования гибридом БМЕМ - минимальной среде Игла в модификации Дюльбекко 1МГ)М - среда БМЕМ в модификации Искова

5

FCS - фетальная телячья сыворотка

SPITE - белково-минеральная добавка для культивирования гибридом ТрилонБ - этилендиаминтетраацетат натрия ДСН - додецилсульфат натрия ФСБ - К+, Ыа+-фосфатный буфер

hCNTF - человеческий мерцательный нейротрофический фактор

hNGF - человеческий фактор роста нервов

ВНК - (baby hamster kidney ) клетки почек детеныша хомячка

СНО - (chínese hamster ovary) клетки яичников китайского хомячка

VERO - клетки почки зеленой африканской обезьяны

MDCK - клетки почки собаки

6

ВВЕДЕНИЕ

Данная работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова в соответствии с планом НИР и отражает одно из направлений использования полимерных носителей для биотехнологии, в частности, для иммобилизации клеток животных, осуществляющих биосинтез различных биологически активных веществ.

Список биологически активных веществ (БАВ) которые используются в медицине, пищевой и других областях промышленности ежегодно стремительно расширяется. Это ставит перед биотехнологией задачи по усовершенствованию и созданию новых методов их получения.

Следует отметить, что во всех случаях решающее значение имеет качество получаемых биологических продуктов, поэтому вопрос о выборе той или иной технологии необходимо решать с учетом конкретных условий. Так, относительно "небольшие" молекулы (например, пептиды или гормоны с полипептидной цепью до 20-30 аминокислот) наиболее экономично производить методом химического синтеза [1,2]. Биологические соединения, закодированные одним или несколькими генами, могут являться потенциальными кандидатами для технологии рекомбинантной ДНК [3-5], и их можно без больших затрат получать в системах, предназначенных для микробиологических производств. Продукты с более сложным строением молекул, требующих в ходе биосинтеза проведения трансляционных одновременных или последующих модификаций

7

(тиолация, гликосилация), таких, как в моноклональных антителах, целесообразно получать с использованием технологии культивирования клеток животных [6,7]. Кроме того, суммирование проблем качества БАВ, экспрессии и трансляции генов в микробиологических реципиентах, привело к ориентации клонирования ДНК в системах клеток животных [812].

Большинство клеток животных (до 95% всех клеточных линий) являются поверхностно-зависимыми, т. е. для своего роста in vitro требуют соответствующий субстрат, для прикрепления и распластывания. Указанное обстоятельство, первоначально, привело к разработке различных типов негомогенных систем стационарного культивирования крупного масштаба, воспроизводящих в своей основе общепринятое многоэлементное оборудование. Были созданы различные конструкции биореакторов: с большим числом статических и динамических дисков (пропагаторы); с набором трубок, удерживаемых в виде пучков; с пластиковыми лентами (пленками), заполняющими объем культуральных сосудов [13], а также роллерные системы [14].

Применялись также две дополнительные системы. Одна из них основана на конструкции, которая имитирует организацию клеток в организме животного и предполагает выращивание клеток на внешней или внутренней поверхности полых микроволокон (синтетические капилляры), имеющих наружный диаметр 300±50 мкм [15-18]. Другая система

8

заимствует принцип своего действия от контакторов твердое вещество/газ и твердое вещество/жидкость, применяемых в химической промышленности. Биореактор заполняется насадкой, размер, форма и конструкция насадочных элементов могут варьироваться в широких пределах. Эти элементы могут удерживаться в неподвижном слое или же они перемещаются под воздействием потоков окружающей среды [19]. В последнем варианте система приближается к гомогенному состоянию. При использовании частиц размером около 200 мкм (микроноситель) в концентрации примерно

10^/мл можно создать квазигомогенную систему, сходную с традиционными системами для глубинного культивирования микроорганизмов [20].

Параллельно развивалась технология культивирования клеток животных не на поверхности микроносителей [21], а внутри полимерных гранул (на основе гидрогелей [22]) или капсул с полупроницаемыми мембранами [23,24].

В настоящее время нет универсального метода культивирования клеток животных. Для получения БАВ в той или иной степени применяют суспензионные [25] и стационарные методы культивирования, культивирование клеток на микроносителях, а также методы на основе микроинкапсулирования и иммобилизации клеток животных в гели (таб.1).

9

Таблица 1

Методы культивирования клеток животных in vitro

Продукт клетки Метод культивирования Источник

IgG (против токсина столбняка) гибридома Суспензионная культура клеток [26]

Вирус (грипп В) MDCK Микроносители [27,28]

Ретровирусы (TIL, T3D, TCID), Vero Микроносители, Гранулы [29,30]

IgG (против хориального гонотропина человека) гибридома Микрокапсулы [31]

В настоящее время усиленно развиваются новые направления применения иммобилизованных клеток животных [32], в частности в области трансплантологии, генной терапии (таб.2).

Таблица 2

Методы культивирования клеток животных in vivo

Заболевание Клетки (продукт) Метод иммуноизоляции Источник

Первичные клетки

Диабет островки Лангерганса (инсулин) капсулы [33,34]

эндокринные нарушения клетки паращитовидной железы капсулы [35]

острые нарушения функций печени гепатоциты полые волокна [36]

остеоартрит хондроциты гель, гранулы [37,38]

регенерация зубов фибробласты волокна, гель [39]

Генетически модифицированные клетки

Амиотрофический склероз Болезнь Хунтингтона ВНК (hCNTF) гепатоциты (CNTF) капсулы капсулы [40] [41]

Болезнь Паркинсон ВНК (hNGF) капсулы [42]

Неврологические расстройства (острая и хроническая боль) хромаффинные клетки (катехоламины, опиоидные пептиды) капсулы [43,44]

10

В организме человека и животных ткани и органы сформированы из клеток, взаимодействующих, между собой с помощью межклеточных контактов, а также с помощью находящегося между ними внеклеточного матрикса из протеогликанов и гликопротеинов.

Таким образом, очевидно, реконструировать in vitro адекватные условия роста клеток можно на основе гелей, имитирующих микросреду исходной ткани (органа) [45].

Как правило, технологии по культивированию клеток животных, иммобилизованных в гидрогели, основаны на использовании гранул, состоящих из одного компонента (полимера). Внутренняя структура таких гранул представляет собой полимерную сетку, в которой происходит рост иммобилизованных клеток. При этом часто для роста клеток доступна лишь незначительная часть внутреннего объема гранул. Для улучшения структуры гранул с целью создания наиболее благоприятных условий для роста и пролиферации клеток потребовалась как модификация уже известных методов иммобилизации, так и разработка новых (создание композитных гидрогелей [46,47]).

Поэтому проблема создания многокомпонентной матрицы и изучение влияния компонентов полимерной модели на морфо-физиологические особенности иммобилизованных клеток животных (человека) остается

11

важной и актуальной частью создания высокоэффективных биосистем для различных биотехнологических и биомедицинских процессов.

В данной работе в качестве синтетических полимеров для получения композитных гранул, в которые включены клетки животных, предлагается использовать водорастворимые биосовместимые полимеры, принадлежащие к классу поли-М-виниламидов: поли-Ы-винилкапролактам (ПВК) и поли-Ы-винилпирролидон (ПВП) [48].

ПВП используется в медицинской практике как кровезаменитель (полиреоглюкин), также используется в ряде бессывороточных сред для повышения их вязкости [49].

ПВК относится к классу обратимо термоосаждаемых полимеров. Уникальное свойство ПВК образовывать гидрогели при температуре 35-40°С в сочетании с его способностью к включению различных веществ (белков, ферментов и т.п.) [50] определило выбор этого полимера для исследования процесса иммобилизации клеток в композитные гидрогели на его основе.

Целью настоящей работы является разработка новых методов иммобилизации и культивирования клеток (в частности, клеток гибридом) в композитных гидрогелях на основе полимеров класса поли-М-виниламидов для повышения эффективности биотехнологических процессов на основе иммобилизованных клеток. В работе представлены разработка метода получения композитных, в частности макропористых гидрогелей на основе

12

ПВК, ПВП и альгината натрия, исследование их структуры и физико-механических свойств. Разработаны методики иммобилизации нескольких линий гибридом, СНО и клеток опухоли легких человека в композитные гидрогели. Исследованы морфологические особенности иммобилизованных клеток методами микроскопии, а также изучено влияние иммобилизации в композитные гидрогели на такие характеристики иммобилизованных гибридом, как размер клеток, гранулярность их цитоплазмы и распределение в клетках ДНК по фазам клеточного цикла. Разработаны методики длительного культивирования иммобилизованных гибридом на бессывороточных средах.

2. МЕТОДЫ ИММОБИЛИЗАЦИИ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ (обзор литературы).

2.1. Введение

К настоящему времени из тканей человека и животных получен широкий спектр различных клеточных линий [51]. Многие из них выделены из нормальных тканей и обладают определенным ограниченным потенциалом удвоения. Другие линии клеток могут размножаться неограниченно долго либо потому, что они возникают благодаря изменениям в первичной клеточной линии, либо потому, что они исходно получены из опухолевых тканей.

Особо надо отметить гибридные клетки (гибридомы), которые получают путем слияния лимфоцитов и миеломных (опухолевых) клеток,

13

используя методы, разработанные Кехлером и Милыптейном [52]. Гибридомы, с одной стороны, обладают способностью к синтезу высоко специфических белков (моноклональных антител), с другой стороны, к неограниченному росту в процессе культивирования.

Клетки животных, переведенные в культуру, стремятся сохранить свою естественную органную архитектуру, что выражается в тесном спонтанном взаимодействии с подложкой, на которой они растут с образованием плотных монослоев. Такие культуры называются монослойными. Остальные относятся к суспензионным культурам, в которых клетки растут в питательной среде во взвешенном состоянии.

Глубинное культивирование суспензионных культур в крупномасштабном производстве не нашло широкого применения. Это обусловлено в первую очередь высокой чувствительностью этих культур к механическим и гидродинамическим воздействиям оказываемых на клетки при таком способе культивирования. Для подобных типов чувствительных клеток были разработаны новые подходы, предусматривающие использование существующих стандартных биореаторов, но при обязательной защите хрупких клеток полимерными оболочками

Крупномасштабное культивирование клеток с монослойным типом роста достигается с помощью увеличения площади поверхности, на которой растут клетки (гетерогенная система).

14

Однако почти нет оснований сомневаться в том, что гомогенные системы культивирования клеток лучше негомогенных. Клетки в этом случае во всей системе находятся в идентичных условиях (концентрации метаболитов, Т, рН и других параметров системы). Это означает, что если найдены наиболее благоприятные условия для роста и продуктивности клеток, то все клетки в системе могут функционировать на уровне потенциальных возможностей. Проба содержимого сосуда, представляющего гомогенную систему, является представительной для всего этого содержимого, а измерения, выполненные на данной пробе, отражают состояние всех компонентов системы.

Система культивирования поверхностно-зависимых клеток на микроносителях по своим показателям, наиболее приближена к гомогенной системе культивирования.

2.2 Культивирование клеток животных на микроносителях.

Принцип культивирования животных клеток на микроносителях весьма прост. Клетки прикрепляются, распластываются и растут на частицах - микроносителях, суспендированных в питательной среде с помощью, например, мешалки.

Метод выращивания клеток на микроносителях удачно сочетает положительные свойства монослойного и суспензионного способов культивирования, так как позволяет выращивать нормальные

15

поверхностнозависимые клетки и сохраняет такие важные преимущества суспензионных культур, как "высокая" концентрация клеток, равномерность условий по всему объему биореактора и возможность масштабирования процесса до промышленных объемов [53].

Прикрепление, распластывание и рост клеток на микроносителе зависят от взаимодействий между клетками и поддерживающими поверхностями. Считается, что для процесса иммобилизации клеток на микроносители имеют значение структура заряда, смачиваемость (адсорбция белков[54,55]) и макромолекулярная организация микроносителя.

В настоящее время для производства микроносителей применяются как положительно заряженные [56,57], так и отрицательно заряженные материалы [58].

Клетки животных несут на своей поверхности отрицательный суммарный заряд [59,60]. Однако механизм прикрепления клеток к носителям является сходным как при положительном, так и отрицательном зарядах субстрата [61]. В обоих случаях контакт будет происходить при образовании мостиков из амфотерных белков [62], таких, как фибронектин

2+ 2+

[63], или поливалентных катионов, таких, как Са или [61].

Белки (гликопротеины, протеогликаны и др.), вовлекаемые в процессы адгезии клеток, присутствуют в культуральной среде как компоненты

16

сыворотки [64], а также они могут синтезироваться некоторыми клетками, например, коллаген фибробластами [65], остеобластами [66].

Несмотря на то, что микроносители используются уже достаточно давно и являются коммерческим продуктом (например, Cytodex, (Pharmacia) [67]), поиск матриц, обеспечивающих наилучший рост, пролиферацию и дифференцировку иммобилизованных клеток, усиленно продолжается. Одним из перспективных подходов к решению поставленных задач является включение в состав микроносителей элементов внеклеточного матрикса (белки, аминокислоты и др. [68]) и/или соединений, способных имитировать его свойства. Так, если микроносители на основе CaAlg геля не способны специфически взаимодействовать, например, со скелетными миобластами, то при введении (ковалентная пришивка) пептидов лигандов взаимодействия клеток, миобласты хорошо прикрепляются к микроносителю и сохраняют специфическую дифференцировку [58]. Модификация хитозаном микроносителей из поливинилового спирта приводит к улучшению прикрепляемости и пролиферации фибробластов, причем эти показатели выше, аналогичных показателей, полученных для микроносителей, покрытых коллагеном [69] (белка внеклеточного матрикса), который широко используется как субстрат при культивировании клеток млекопитающих [70].

Также необходимо остановиться на некоторых технологических показателях микроносителей, таких, как плотность и пористость.

17

Установлено, что для поддержания микроносителей в культуральной среде в суспендированном состоянии при невысоких скоростях перемешивания и исключения их флотации, удельная плотность микроносителя должна составлять 1,02-1,04.

Первоначально считалось, что материал микроносителя не должен быть пористым, так как пористость затрудняет процедуры отмывки и снятия урожая поверхностно-зависимых клеток.

Однако практика показала, что большое число клеток либо невозможно культивировать в системах с монослойным (двухмерным) характером роста клеток, либо они теряют свою специфическую дифференцировку [71,72]. Для