Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональный анализ белка RecA у Escherichia coli. О роли С-концевого домена белка в рекомбинационной реакции

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональный анализ белка RecA у Escherichia coli. О роли С-концевого домена белка в рекомбинационной реакции"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

.АЛЕКСЕЕВ Андрей Алексеевич

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ БЕЛКА RecA У Escherichia coU. О РОЛИ С-КОНЦЕВОГО ДОМЕНА БЕЛКА В РЕКОМБИНАЦИОННОЙ РЕАКЦИИ

03.00.15 -"Генетика"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 1996

Работа выполнена в Отделении молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики им. Б. П. Константинова РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Рыбчин .В. Н.. кандидат химических наук Аленин В. В.

Ведущее учреждение: Институт цитологии РАН.

на заседании дассе1_. .... __ 33.57 . 21. по за-

щите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, г.Санкт-Петербург, Университетская набережная, д. 7/9, СПбГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

,Ланцов В. А.

Защита состоится

в "_ -часов

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

/ Л.А.Мамон

С

- з -

Актуальность проблемы. Современная модель гомологической рекомбинации у £.соU предусматривает такую цепь реакций. 1)Раскручивание и экзонуклеазная деградация двунитевой (дн) донорной ДНК с образованием молекулы с однонитевым (он) 3'-концом. 2)Мультиме-ризация мономеров RecA, "заряженных" молекулой АТФ и ионом MgZt, с образованием рекомбинационно-активного филамента RecA-ДНК. 3) Гомологическое узнавание филаментом реципиентной днДНК, вовлечение ее в структуру филамента и образование триплексной ДНК. ^Переключение спаривания в составе филамента тнДНК/RecA с образованием гетеродуплексной ДНК. состоящей из реципиентной и донорной нитей, и одновременное вытеснение онДНК реципиента из филамента. 5) Спаривание вытесняемой нити с комплементарной нитью донора -возникновение "структуры.Холидея". 6) Миграция-структуры Холидея вдоль взаимодействующих молекул, сопровождающаяся расширением гетеродуплексной ДНК. 7) Эндонуклеазное расщепление структуры Холидея, завершающее рекомбинацию на уровне либо вставки онДНК донора в днДНК реципиента, либо полного двунитевого обмена (кроссовера).

Для гомологической рекомбинации RecA важен тем, что контролирует реакции 2-6. Однако, до сих пор остается открытым вопрос о зго структурно-функциональной организации: каким образом осущест-зляется взаимодействие мономеров RecA и каков механизм взаимодействия в нуклеопротеиновом филаменте, образуемом белком RecA на IHK. Это особенно актуально в связи с последними данными об уни-зерсальности структуры нуклеопротеинового филамента Reeиденти-шость организации филаментов, образуемых на ДНК белками RecA, iad51 и UvsX (аналог белка RecA у Т4).

Наличие RecA-подобных филаментов у эукариот предполагает кон-:ервативность в эволюции этого нуклеопротеинового комплекса и мо-юкулярного механизма узнавания и обмена нитей между гомологичными :олекулами ДНК для про- и для эукариот. Таким образом, данные изу -ения белка RecA могут быть полезны для исследования механизмов ^комбинации и репарации у высших, включая и человека.

Цель работы. Структурно-функциональный анализ белка RecA. зучение функций карбоксил-концевого домена белка.

Задачи работы. Получение методом сайт-направленного мутаге-эза новых мутаций в предполагаемых функционально-значимых облап-чх белка RecA. Изучение генетических и биохимических свойств по-

лученных мутантов.

Научная новипна и практическая ценность работы. Предложен подход получения функционально-термочувствительных мутантов. Получено 3 новых термочувствительных и 4 нетермочувствительных мутанта в гене гесА. Локализована ранее описанная мутация гесА200. Показано, что молекула АТФ стабилизирует С-концевой домен"RecA и что С-концевой домен важен для его мультимеризации и взаимодействия с днДКК.

Апробация работы. Материалы диссертационный работы были доложены на 1 съезде ВОГиС в 1994 году, на семинарах лаборатории биофизики белка и лаборатории молекулярной генетики Университета Г.Осака (Япония), лаборатории энзимологии CNRS (Франция).

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введеМя, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и обсуждения! выводов и списка цитируемой литературы (147 наименований). Работа изложена на 122, страницах машинописного текста и содержит 3 таблицы и 23 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Рекомбинапионный тест. Эффективность рекомбинации проверяли по выходу рекомбинантов после конъюгации донора HfrC с реципиентом JC10289 àrecA. Ген гесА дикого типа и мутантные гены вводили в реципиент на плазмиде риС19.Для выявления термочувствительности рекомбкчационных свойств мугантов гесА выход рекомбинантов сравнивали при 32° и 42°С.

Репарационный тест. Клетки JC10289 ДгесЛ. несущие плазмиду, после выращивания облучали УФ-светом, титровали на LB-агаре и инкубировали 16 ч. при 32° или 42°С.

SOS-хромотест. Эффективность SOS-ответа, контролируемого геном гесА, оценивали по синтезу Л-галактозидазы, контролируемому SOS-индуцируемым геном sflA (штамм GY7109).

Выделение и очистка белков RecA. Белки дикого и мутантного типа из экстракта клеток JC10289 осаждали полимином П и аффинно очищали на колонке с онДНК-целлюлозой.

Реакционные условия. Использовали стандартный буфер ТМД. содержащий 20 мМ Трис-HCl (рН 7,5), ЮмМ MgCl2, 1 мМ ДТТ. АТФ^реге-перирующая система содержала ФЕП и пируваткиназу, или креатин-ФснЧзт и креатинфосфокиназы (в случае реакции обмена нитей).

ReçA-зависимый гидродлиз АТФ регистрировали спектрофотомет-рически по уменьшению поглощения при,340 нм. Реакционная смесь содержала буфер ТМД. BSA. АТФ-регенерирующую систему. ДНК-субстрат или 1.5 M натрий ацетата, указанные количества АТФ. белка RecA. NADH и лактатдегидрогеназу для сопряжения гидролиза АТФ с окислением NADH в NAD*. ДНК-субстратом были или poly(dT). или линейная днДНК pBR322. Эксперименты проводили при 32° и 42°С. Перед запуском реакции смесь прогревали 10 мин при заданной температуре. При наличии АТФ реакцию запускали добавлением в смесь ДНК-субстрата или Na-ацетата: при прогреве без АТФ - добавлением АТФ и ДНК-суб-зтрата или АТФ и Na-ацетата.

Связывание белка RecA с ЕДНК оценивали по изменению флюоресценции еДНК (онДНК модифицированная хлороацетоальдегидом). Реак-даонная смесь содержала буфер ТМД. еДНК М. если требовалось. АТФ i АТФ-регенерируюшую систему. Измерения проводили при 305 и 410нм [возбуждение и эмиссия соответственно), при 32° или 42°С. Сигнал югистрировалк после достижения станционарного уровня.

Связывание белка RecA с 3Н-ДНК. Реакционная смесь содержала Н-меченную кольцевую онДНК фага М13шр19, буфер ТМД. АТФ. АТФ-ре-•енерирующую систему и указанное количество RecA. Смесь, не соде-жащую основных компонентов (ДНК или ДНК+АТФ), прогревали 10 мин ри 42°С и реакцию запускали добавлением ДНК или ДНК+АТФ. После 5 ин. инкубации реакцию останавливали добавлением холодного буфера МД с АТФ.Образцы наносили на предварительно обработанное щелочью ильтры, промывали буфером ТМД. содержащим АТФ. высушивали и из-эряли радиоактивность.

Реакция обмена нити ДНК. Перенос нити регистрировали двумя юсобами. 1) Образование Д-петель. Реакционная смесь содержала /фер ТМД, АТФ, АТФ-регенерирующую систему, кольцевую онДНК фага '.Зшр19 (плюс-нить), 3Н-меченную линейную днДНК того же фага, беж SSB и RecA. Эксперементы проводили при 42°С. Как и ранее RecA »огревали с и без АТФ. Через заданное время реакцию останавлива-. Образцы разбавляли холодным буфером SSCxlO, и смесь <Шьтро-ли через предварительно промытые тем же буфером нитроцеллю-зные фильтры. Фильтры промывали холодным SSCxlO. высушивали, и меряли связавшуюся с ними радиоактивность. 2) ригиьтрировалн лный перенос нити между гомологичными.молекулами ДНК. Реакшюн

пая смесь и условия полностью идентичны (1). Остановив реакцию, образцы наносили на 0.8% агарозный гель. После электрофореза гель окрашивали бромистым этидием и фотографировали.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Клонирование и секвенирование аллели recASOO. Ген гесА200 был клонирован путем вставки.BamHI - фрагмента ДНК (1360 н. п.) из штамма JC1101 гесА200 в полилинкер вектора pUC19. Рекомбинантные плазмиды трансформировали в штамм Z85:ÁrecA и отбирали клоны, устойчивые к нитрофурантоину при 32°С и чувствительные к яду при 42°С. Отобрано 15 клонов Z85: ДгесЛ/рШЛЭ- гесА200. Рекомбинантные плазмиды pUC19 -гесА200 проверяли рестрикционным анализом. Секвенирование плазмид выявило t-»c замену в 283 кодоне этих гесЛ, или [L283P] замена в мутантном белке ReeА. Мутантная аллель названа гесА2283, а гибридная плазмида - риС19-гесЛ200.

Сайтнаправленный мутагенез гена гесА и генетическая характеристика полученных мутантов. На основе анализа аминокислотных замен в известных термочувствительных мутантах гесА44. recA4.il и гесА200 предложена стратегия получения мутантов с Ree'3-фенотипом: замены аминокислот должны носить "мягкий" характер, т.е. замена консервативной аминокислоты на аминокислоту из той же функциональной группы, методом сайтнаправленного мутагенеза нами сконструировано 5 новых мутантов в области от 275 по 283 позиции белка RecA: несА2277 (L277DJ,.. RecA2278 (G278P), RecA2283E (L283E), RecA2284 (I284D) и RecA2278-5 (G278T+V275F), последний из которых оказался двойным.Предположительно, [G278T] и CG278P] замены носят мягкий характер, вызывая информационную нестабильность в структуре полипептида. У 3 остальных изменения носят принципиальный характер - внесение дополнительного отрицательного заряда. Ни одна из приведенных замен не встречается в известных структурах семейства белков RecA. Выбранная стратегия оказалась правильной тем, что эти мягкие замены привели к образованию фунционально термочувствительных мутаций.

Генетический анализ позволяет In vivo охарактеризовать три главные функции белка RecA: рекомбинационную, репарационную и SOS. В таблице 1 представлены сравнительные результаты выхода ре-комбинантов Leu+Strr, полученных в скрещивании донора HfrC с реципиентом JC10289 ЬгесА. Гомологическая рекомбинация в реципиенте

обеспечивалась геном гесА дикого или мутантного типа, находящимся в составе плазмиды pUC19. Конъюгацию проводили при температурах 32° и 42°С. Выход рекомбинантов рассчитывался в относительных единицах. За единицу принят выход рекомбинантов в контрольном скрещивании с геном гесА дикого типа, вычисленный как процент ис~. ходного числа доноров в конъюгации. Как видно, шесть анализируемых мутантов по Rec-фенотипу делятся на 4 подкласса: термочувствительные Rects, ([L283P], [G278P] и [G278T+V275F]). дефектные Ree" (I284D). рекомбинационно-ослабленные Rec± (L277D) и не изменившие фенотип Ree* (L283E).

Таблица 1. Анализируемые мутанты гесА и их свойства.

Мутантная А.К. Фенотип

аллель гесА замена _

Ree UV SOS

2283 [L283P] ts ts ts

2283Е [L283E] + + +

2284 [I284D] - ' - -

2277 [L277D] +/- +/- +/-

2278 [G278P] ts ts+/- ts

2278-5 IG278T] + [V275F] ts +/- ts+/-

2223 [L223M] ts+/- ts+/- ts

2183 [К183М] - - -

Символы "-, +/- и +" обозначают дефектный, умеренный и нормальный фенотип, а символ "ts" - термочувствительный фенотип.

Репарационные характеристики этих мутантов для двух разных температур приведены в таблице 1. Они согласуются с результатами рекомбинационного анализа по классификации мутантов. Так, мутация recA2283E (L283E) с фенотипам Ree* демонстрирует ожидаемый фенотип UV* - УФ-устойчивость. Мутация гесА2284 (фенотип Ree") вызывает у клетки сильную чувствительность к УФ-свету. как и при делении гена гесЛ. Мутация recA2277 (L277D) с умеренным Rec± фенотипом демонстрирует и умеренную чувствительность к УФ-облучению, не зависящую от температурных условий анализа. Наконец, терио чувствительные по рекомбинации мутации оказываются UV* при ?.?"(',

а при 42°С показывают или умеренную чувствительность к УФ (мутации гес.А2283 (L283P) и recA2278 (G278P)) или достаточно слабый репарационный дефект (лпойная мутация recA2278-5 (G278P+V275F)). Способность различных мутантов давать SOS-ответ при двух разных температурах представлена в таблице 1. SOS-ответ измеряли по способности данного мутанта индуцировать ген 1acZ, находящийся под контролем регуляторной области SOS-индуцируемого гена sflA при ингибировании репликации ДНК налидиксовой кислотой.

Рассмотрим последовательно поведение различных классов мутантов. Класс Rec*UV* (мутация гесА2283Е) показывает при 42°С нормальную способность к SOS-ответу. Класс Rec~UV(I284D) демонстрирует ожидаемую дефектность SOS-ответа. Класс Rec±UV± (ге-СА2211) показывает ослабленную способность к SOS-репарации, одинаковую для обеих температур (фенотип S0S+). Класс термочувствительных фенотипов Rects, как и в случае с репарационной характеристикой, показывает вариации SOS-фенотипа: строго термочувствительный, дефектный при 42°С для гесЛ2283 (фенотип S0Sts), такой же для гесА2278 и слабый ts-фенотип для двойного мутанта, который мы запишем как S0Sts±. Итак, фенотипы всех трех термочувствительных мутантов оказались немного различными. Фенотип двойного мутанта показался нам наиболее необычным, так как в нем проявляется термочувствительный рекомбинационный дефект в чистом виде без заметного влияния и на репарацию, и на SOS-ответ.

Аминокислота Leu223 была выбрана нами как объект мутагенеза по причине ее строгой консервативности в семействе генов гесА. Замена [L223M] оказалась необычной. Мутант гесА2223 оказался термочувствительным. но умеренно ослабленным в рекомбинации, термочувствительным, но умеренно ослабленным в репарации УФ-поврежде-ний ДНК и абсолютно термочувствительным в индукции SOS-ответа, т.е. эта замена имеет прямое отношение к регуляции SOS-функции, незначительно затрагивая и рекомбинацию, и репарацию. Эти генетические свойства предсказывают биохимический дефект для копротеаз-ной активности - ослабление узнавания белком RecA2223 репрессора LexA.

В полученном нами мутанте гесА2183 замена [К183М] приводила к следующим генетическим свойствам: мутант оказался полностью ре-комбинационно дефектным, сильно УФ-чувствительным, полностью

БОБ-дефектным.

Для дальнейших исследований мы выбрали двойной мутант ге-СА2278-5 . обладающий наиболее интересными, на наш взгляд, генетическими свойствами.

Сравнение биохимических активностей белков йесА^ и ИесА2278-5.

Связывание с онДНК. При титровании еДНК белком ИесА сигнал регистрировали после достижения им стационарного состояния: через 4 минуты после добавления белка КесАи1 и через 10 минут в случае ИесА2278-5 (см.рис.1). Изменения флюоресценции еДНК (1а) при 32°С без нуклеотидного кофактора одинаковы. Относительное увеличение сигнала (ЙП) при насыщении еДНК белком составило 1,7 раза для 1?есАж(1 и 1,8 раза для {?есА2278-5. В присутствии АТФ и АТФ-регене-рирующей системы происходит стимуляция связывания обоих белков с еДНК: ИП равно 2,7 и 2.8 раза, соответственно (1Ь), что означает, что мутантный белок способен образовывать высокоаффинный комплекс с онДНК при 32°С. Насыщение еДНК белком и для ЕесА„{ и для !?е-СА2278-5 наблрдали при концентрации около 1 мкМ.'Так как концентрация еДНК была 7 мкМ, это дает стехиометрию связывания 7 нуклео-тидов на 1 мономер ЯесА. Полученная величина хорошо согласуется с опубликованными данными и, вероятно, отражает связывание двух нитей ДНК филаментом ИесА.

Иную картину дали эксперименты 42°С. Без нуклеотидного кофактора (1с) ИРТ для ИесА2278-5 равно 1.5 раза, а равновесное состояние наступило при концентрации белка около 2.5 чкМ. Этот эффект усилился в присутствии КС1 (1е). В этих условиях мы не наблюдали образования комплекса мутантного белка с еДНК вплоть до свыше 3 мкМ. При наличии АТФ и АТФ-регенирирующей системы ДНК-связующий дефект ЕесА2278-5 полностью отсутствовал (см.16 и 1С). Как и при 32°С. присутствие АТФ приводило к образованию высокоаффинного комплекса белка ИесА с онДНК с нормальной стехиометрией связывания.

Так как белок ИесА быстро связывает АТФ. а мутантный белок на онДНК инактивирует сравнительно медленно, мы провели эксперименты с предварительной адаптацией белка к 42°С в присутствии и в отсутствие АТФ. Для сравнения ДНК-связующих активностей белков использовали метод осаждения комплексов НесА-онДНК ча ннтропе.чп1-лозных фильтрах. Предварительно белки прсгр<.н.ч.чл 1С мин.. Г- пмщп

1 1 32 С 1 Ь

¿58888 8 8

•

-8 -

» > 1 1

1 2 3

1 1 42 С d

в в 8

0 в > 1 1 1

3 1 2 3

0 12 3 Рис.1 Титрование еДНК (заполненные символы):

ReoA. Midi

белками RecAwt (открытые) и RecA2278-5 а - 32° С, Ь - 32°С + АТФ, с - 42° С, d - 42°С + АТФ, е - 42°С с KCl, f - 42°С.+ АТФ и KCl. запускали добавлением онДНК (прогрев с АТФ) или добавлением АТФ+онДНК (прогрев без АТФ). Результаты представлены на рис.2. Для RecA„tATip и RecAmutAT4 количество 3Н-онДНК, задержанной на фильтрах, пропорционально концентрации белка и выходит на плато около 1 мкИ. Принципиально иная картина в случае белка RecAmut, -кривая имеет ярко выраженный сигмоидальный характер с выходом на стационарный уровень при концентрации около 2.5 мкМ, что свидетельствует о пониженной способности связываться с пнДНК. Значения

50% насыщения ДНК показывают, что в наших условиях ЕесАти1. связывается с онДНК в три раза хуже, чем НесА„(. и. что предварительное связывание с молекулой АТФ стабилизирует структуру му-тантного белка и сохраняет у него способность связываться с онДНК с эффективностью белка дикого типа.

ОнДКК-зависимый гидролиз АТФ. На рис.3 представлены данные по гидролизу АТФ, как функции от концентрации белка. Видно, что белки {?есА„1АТФ и НесАти[АТФ имеют схожие зависимости скорости гидролиза АТФ от концентрации белка. Так как скорость гидролиза АТФ пропорциональна количеству белка ИесА, связанного с онДНК. представленные зависимости хорошо согласуются с предыдущими результатами онДНК (рис.2), что предполагает одинаковую способность гидролизовать АТФ и КесАи1АФТ. и ЕесАпи1АТФ.

Кривая скорости гидролиза АТФ белком БесА^. совпадает с кривой для белка ЕесАи1АТФ (данные не приводятся). Белок ЕесАт1П, хуже гидролизует АТФ при концентрациях ниже 1,25 мкМ, достигая уровня йесА„1А'ТФ при концентрациях выше 2,5 мкМ. Так как насыщение онДНК (7,5 мкМ) достигается при тех же концентрациях белка КесАгаи1, (рис.2), можно сказать, что изменения в мутантном белке, вызванные прогревом без АТФ, не затрагивают каталитический центр белка, ответственный за гидролиз АТФ.

Все кривые на рис.3 имеют сигмоидальный характер. Это отражает кооперативность в взаимодействии белка ИесА с онДНК (наиболее отчетливо. - у белка КесАти1<). Концентрации белка 0,75 мкМ для КесАпш(ДТФ и ЕесА„1АТФ и 1,75 мкМ для 1?есАт1П, были выбраны на линейных участках кривых гидролиза для экспериментов, по зависимости скорости гидролиза от концентрации АТФ. Сродство белков к АТФ оценивали по величине параметра 30>5 - концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна 1/2 Утах, и характеризующего реакции, не подпадающие под классические реакции Михаэле-са-Ментен.

Значения 30-5 для ЕесА„(АТФ и 1?есАти1АТФ (рис.4) равны 160 и 360 нкМ АТФ, соответственно. Таким образом, белок 1?есАти1 при 42°С обладает пониженным сродством к АТФ, ■ но кажущаяся кка1 (число оборотов) у него, как у белка дикого типа: 28 и 31 мин."1, соответственно. Эти значения кКа1 согласуются с данными литературы и наряду с результатами предыдущего эксперимента свидетельствуют о

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 RecA. МКЫ

Рис.2 Связывание с 3Н-онДНК.

Здесь и далее символы "wt" и "mut" обозначают белки RecA„t и RecAmul, прогретые с АТФ. "mut*" - прогретый без АТФ.

50 - —

40

Ô 30 20

10

"I 1 1 "I-1-1......... Г wt

-е-©

ш—--«

-V

дг mut*

/г 1 1 ■ ' « 1

0.0 .0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0RecA. МКЫ

Рис.3 ОнДНК-зависимый гидролиз АТФ белками RecA„t и RecAmut.

том. .что белок RecAmutAT4,. обладая пониженным сродством к АТФ. эффективно гидролизует АТФ.

S0>5 для белка RecAaut. близка к значению S0>5 для RecArou_ и составляет 400 мкМ АТФ. Значение kcst (по данным рис.3 и 4) для RecAmut. (24 мин."1) близко по величине kkst для RecAnu. tдтф и RecA„tATi. что свидетельствует о нормальной способности белка RecAmut. гидролизовать АТФ.

Связывание с днДНК. Связывание с двунитевой ДНК оценивали па

величине днДНК-зависимого гидролиза АТФ. При 32°С кинетика гидролиза одинакова у белков йесАи1 и 1?есАти1. Различия между 1}есАи, и

- 40

3 35

1 30 » 25

< 20

15

10

5

1 1 Г" Г ...... I-------1 ■ - тиЬ*

3?-V--V -

©-—о

" г л/ / ДШ1

*** тШ I 11111

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 Рис.4 ОнДНК-зависимый гидролиз

1.0. 1.2 1.4__ 1.6 АТФ, мМ

АТФ белками 1?есА„,, и КесАти1.

КесАти1 заметны при 42°С. КесАгаи1АТФ и ЕесАт<и. слабее гидролизу-ют АТФ. чем ИесАи1: скорость гидролиза АТФ составила 45% у НесА-гпшатф и 5% у 1?есАт1и.. Учитывая, что способность гидролизовать АТФ у белка КесАГО(П не нарушена, эти данные указывают на ослабление днДНК-связующей способности ЕесАтц1. Предварительное связывание мутантнсго белка с АТФ значительно супрессирует этот дефект. В аналогичных условиях белок ЕесАти6 формирует высокоаффинный комплекс с онДНК. Поэтому можно предположить, что в основе ослабленной днДНК-связующей способности белка КесАти1А1ф лежит пониженное сродство к днДНК.

Мультимйризация белка КесА в отсутствие ДНК. На рис.5 представлен гидролиз АТФ в присутствии 1,5 М ацетата натрия. Реакцию запускали добавлением Ш-ацетата в случае прогрева белка с АТФ. или добавлением На-ацетата и АТФ при прогреве без кофактора. Видно, что КесА„{ДТФ и НесАта1АТФ одинаково способны к мультимериза-ции, а ИесАти1. формирует активный филамент в 5 раз хуже. Следовательно, {?есАт1и обладает пониженной способностью к мультимери-зации при 42°С. но предварительное связчвание его с АТФ восстанавливает этот дефект до эффективности белка дикого типа. Предполагая схожесть сайтов КесА-ИесА взаимодействия в активном нукле-опротеиновом филаменте и филаменте белка КесА в "высокой соли", можно заключить, что низкая онДНК-связующая способность НесАгаи1.

является следствием нарушения его способности к мультимеризации. Следовательно. С-домен белка RecA важен для мультимеризации его на ДНК.

Реакция обмена нитей, катализируемая белком RecA2278-5, Из данных (рис.6) видно, что RecAmutATC, катализирует образование Д-петель в 1,3 раза менее эффективно, чем RecAwtATÍ,. То же наблюдали и в реакции полного переноса нитей. Эти данные показывают, что RecAmutAT® при пониженном сродстве к АТФ способен катализировать реакцию полного обмена нитей между гомологичными молекулами ДНК. Используя эти результаты и данные по связыванию с он- и днДНК, можно предположить небольшое снижение эффективности образования Д-петель и переноса нити у RecAmutATC, при сравнении с Re-cA*t*T«• У RecABUt. наблюдали полное отсутствие активности уже на стадии образования Д-петель (рис.6). Однако, при соотношении •онДНК/белок 1.5:1 достигается полное насыщение онДНК белком RecA-mut. (рис. 2). Отсюда следует, что наиболее вероятней причиной полной потери рекомбинационной активности у RecA„,ut. является отсутствие у него способности связываться с днДНК.

Анализ биохимических данных для RecA2278-5 выявил плейотроп-ный характер повреждения белка, проявляющийся при 42°С: 1) пониженное сродство к АТФ; 2) ослабленное связывание с онДНК; 3) пониженная способность к мультимеризации; 4) пониженное сродство у днДНК. Свойства 2 и 3 проявляются после инкубации белкэ при 42°С без АТФ. Так как связывание белка с ДНК связано с мультимеризаци-ей. то первичный дефект RecA2278-5 обусловлен его неспособности образовывать филаменты при 42°С. Предварительное связывание с АТС стабилизирует конформацию и сохраняет его способность к мультимеризации при 42°С. Вследствие этого RecA2278-5 способен образовывать в этих условиях высокоаффинный комплекс с онДНК, но егс сродство к днДНК в два раза ниже, чем у RecAwt. В комплексе эй свойства проявляются в реакции обмена нитей. Хотя, RecA2278-5. стабилизируемый АТФ, и способен проводить реакции образованш Д-петель к полный перенос нитей при 42°С, эффективность проведения этих реакций в 1.3 раза ниже, чем у RecAwt. Эти свойства Re-СА2278-5 позволяют нам приписать С-домену белка RecA две функции: участие в формировании сайта связывания с днДНК и участие в мультимеризации белка при образовании активного нуклеопротеиновоп

Филамента. Важной особенностью ЕесА2278-5 является способность АТФ стабилизировать его структуру.При предварительном прогреве с АТФ он сохраняет способность к мультимеризации и к связыванию с они днДНК. Так как АТФ является одним из необходимых лигандов доя

Ш 50

1?есА, мкМ

Рис.5 Гидролиз АТФ ¡?есА„,; и ЕесАти1 в присутствии высокой соли. 100

. . 1 1

¥

Л1 Зг 1 —V-V"—-V 1..... —-V ши1* >

10

20

30

40

50 Время, мин

Рис.6 Реакция образования Д-петель, катализируемая Яес.\¥1 и ЕесАт1П.

формирования активного нуклеопротеинового Филамента йесА. мы считаем, что ИесА2278-5 относится к новому классу мутантньх бе...ков ИесА, функциональная активность которых строго зависит от се-я'ы-вания с лигандом.

- 16 -выводы.

1. На основе предложенного подхода сконструированны новые функционально термочувствительные мутации в гене recA у Escherichia colt. Они затрагивают области а-спираль Н-петля - (J-нить.Э и р-нить 6 третичной структуры.белка RecA. предложенной Стори и др.

2. Генетический анализ функционально термочувствительной мутации гесА2223 ( аминокислотная замена [ Leu223Met]) предполагает участие р-нить 6 в образовании сайта взаимодействия белка RecA с репрессором LexA.

3. Биохимический анализ термочувствительного мутантного белка RecA2278-5 (Gly278Thr+Leu275Phe) показывает его принадлежность к новому классу, так называемых, лиганд-зависимых мутантов белка RecA. Связывание этого белка с АТФ предотвращает его. тепловую инактивацию при 42°С.

4. Биохимические свойства белка RecA2278-5 предполагают участие карбоксил-концевого домена белка RecA в мультимеризации белка и во взаимодействии белка с двунитевой ДНК, что является одним из необходимых условий рекомбинационной реакции переноса нити ДНК.

Список публикаций по теме диссертации ,

1. V.A. 'Lanzov. E.N. Zaltzev, V.M. Krjukov, N.P. Kuzmln. E.M. Zaltzeva, I.V. Bakhlanova and A.A. Alexeyev, Structural aid functional analysis of the family of recA bacterial genes.. In: A.A'. Bayev,et al (Eds.), Macromolecules. in the functioning cell.. Pushchlno, 1991, p. 81-91.

2. Алексеев A.A., Бахланова И. В., Новые мутации в гене recA Escherichia coii., 1 съезд ВОГиС. 1994.

3. Е. Zaltsev, A. Alexseyev, V. Lanzov, L. Satin and A. Clark. Nucleotide sequence between recA and ataS In E. coti K12 a:,3 the sequence change In four recA mutations.. Mutat. Res. Lett., 1994, v. 323, p. 173-177.

4. А. А. Алексеев, И. В. Бахланова, Д. М. Байтин, В. А. Ланцов, Белок RecA у Escherichia colt: выявление локуса, ответственного за мультимеризацию белка., Доклады Академии Наук, 1995, т. 345, N2, с. 268-272.