Влияние точечной мутации D112R на рекомбинационную активность белка RecA из Escherichia coli

Дудкина, Александра Валентиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние точечной мутации D112R на рекомбинационную активность белка RecA из Escherichia coli
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние точечной мутации D112R на рекомбинационную активность белка RecA из Escherichia coli"

4857265

На правах рукописи

fr-

ДУДКИНЛ АЛЕКСАНДРА ВАЛЕНТИНОВНА

ВЛИЯНИЕ ТОЧЕЧНОЙ МУТАЦИИ D112R IIA РЕКОМБИНАЦИОННУЮ АКТИВНОСТЬ БЕЛКА RccA ИЗ Escherichia coli

03.01.03 -—л, J

1ГИЯ '

молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 3 ОКТ 2011

Санкт-Петербург 2011

J> JL

4857265

Работа выполнена на Кафедре биофизики Физико-механического факультета федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный политехнический университет».

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

[Лапцов Владислав Александрович!

ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный политехнический университет»

кандидат биологических наук

Байтип Дмитрий Михайлович

ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный

политехнический университет»

доктор биологических наук, профессор Смирнов Георгий Борисович НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН,

доктор физико-математических наук, Тимковский Андрей Леонидович Федеральное государственное бюджетное учреждение «Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова»

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН,

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский государственный университет, Биолого-почвенный факультет

Защита диссертации состоится «28» октября 2011 года в/Учасов па заседании Диссертациотгого совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

Адрес электрошюй почты Института: cellbio@mail.cvtspb rssi.iu Сайт: http://www.cytspb.rssi.ru Факс: 8(812)297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Автореферат разослан «Ж"» сентября 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Данная работа посвящена изучению механизмов, регулирующих процесс рекомбинации в клетке. ■

С тех пор, как Кларк и Маргулис в 1965 г. выявили абсолютную зависимость гомологичной рекомбинации от целостности гена recA (Clark and Margulies, 1965), его продукт - белок RecA -является наиболее интенсивно изучаемым ферментом гомологической рекомбинации у прокариот. Белок RecA также участвует в процессах репарации, мутагенеза, клеточного деления, регуляции экспрессии ряда репарационных генов и в других процессах жизнеобеспечения клетки (Ланцов, 2007; Gallelto et al., 2007).

Несмотря на небольшой размер белка RecA (его молекулярная масса составляет -40 кДа), он обладает поразительной многосторонней функциональностью: гидролизует АТФ, взаимодействует с однонитевой ДНК (онДНК) и двунитевой ДНК (днДНК), является копротеазой при авторасщеплении репрессора SOS регулона клетки (белка LexA) и катализирует ренатурацию двунитевой ДНК (Ланцов, 2007; Сох, 2007).

Структурно-функциональный анализ белка RecA, проводимый во многих лабораториях мира, приобрел новые возможности после описания в 1992 г. его трехмерной кристаллической структуры в неактивном состоянии (Story et al., 1992) и после исследования кристаллов активных филаментов RecA (Chen et al., 2008). Эти структуры совместно с генетическими и биохимическими данными позволили авторам определить области белка, связывающиеся с ДНК и нуклеотидными кофакторами, участвующие в межпротомерном взаимодействии и связывании с репрессорами. Кроме того, полученные кристаллические структуры легли в основу интерпретации данных о биохимических свойствах мутаптных белков RecA.

Несмотря на очевидные успехи в изучении механизмов функционирования белка RecA, до сих пор актуальным остается исследование его структурно-функциональной организации. Бактериальный белок RecA несет в себе огромный рекомбинационный потенциал, который клетка вынуждена ограничивать по причине его возможного вреда для стабильности генома. Во многом эти ограничения определяются оптимизированным составом аминокислотных остатков самого белка.

Исследование аминокислотных замен в области протомер-протомерного взаимодействия белка RecA in vivo и in vitro выявило, что такие замены влияют на его рекомбинационные свойства (Bakhlanova et al., 2001; Chervyakova et al., 2001). Чтобы определить значение ионных и полярных взаимодействий остатков 3-30 и 111-140 для олигомерпой структуры RecA и его ферментативных функций, Найт (Knight) с сотрудниками ввели семь аминокислотных замен в положениях 6, 28, 112, 113 и 139 (Eldin et al., 2000). Ими было изучено влияния этих замен на стабильность олигомеров свободного белка RecA, однако влияние замен, нарушающих ионные или полярные

взаимодействия в области контакта протомеров RecA, на рекомбинационные характеристики белка RecA исследовано не было.

Цель работы. Целью работы является изучение механизмов, регулирующих процесс рекомбинации в клетке, а также выявление тех биохимических особенностей белка RecA D112R, которые лежат в основе его повышенной рекомбиногенности.

Задачи исследования:

1) Проанализировать аминокислотные замены в области взаимодействия RecA-RecA, влияющие на частоту рекомбинационных обменов (ЧРО).

2) Исследовать пути нормализации или ограничения гиперрекомбипационной активности в клетках £ coli, несущих гиперактивный белок RecA Dl 12R.

3) Выделить и очистить белок RecA Dl 12R, сравнить его биохимические свойства с белком

RecA дикого типа.

4) Исследовать особенности регуляции филамента RecA Dl 12R вспомогательными белками -

такими, как белки SSB, F'SSB, PsiB, LexA, RecX. Провести сравнение с другими

гиперактивными мутантными белками RecA.

5) Изучить связи между ДНК-синаптазиой активностью белков RecAEc, RecA D112R, RecA Е38К и RecA АС17 in vitro и рекомбинационной активностью клеток, экспрсссирующих эти белки.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Белок RecA D112R увеличивает частоту рекомбинационных обменов на единицу длины ДНК in vivo в 52 раза, являясь наиболее рекомбинационно активным из изученных на сегодняшний день мутантных белков RecA.

2) В популяции клеток Е. coli с аномально высокой RecADl 12R--!aiiiicimoñ рекомбинацией наблюдается постепенный отбор клеток со сниженной гиперрекомбинацией. Селекция приводит к снижению рекомбинационной активности до нормального уровня.

3) Мутантный белок RecA Dl 12R по сравнению с белком RecAEc обладает:

а) повышенной способностью расплавлять вторичные структуры на онДНК;

б) повышенной способностью смещать белок SSB с онДНК, в том числе при снижении

концентрации ионов магния в реакционной смеси;

в) повышенной способностью смещать белок F'SSB с онДНК;

г) повышенной устойчивостью к ингибирующему воздействию белков PsiB и RecX;

д) повышенной скоростью проведения реакции обмена нитей ДНК при снижении

концентрации ионов магния в реакционной смеси.

4) Устойчивость филамента RecA к ингибирующему действию белка RecX определяется не только силой межбелковых RecA-RecX взаимодействий, но и динамикой филаментации RecA на онДНК.

5) Высокая рскомбиногешюсть мутантного белка RecA D112R обеспечивается повышенной скоростью инициирования синаптазной реакции.

Научная новизна и практическая ценность работы. Выявлено влияние точечных аминокислотных замен в области мономер-мономерного взаимодействия белка RecA на его рекомбинационные свойства. Исследованы пути нормализации рекомбинационной активности белка RecA D112R в клетках К coli. Впервые охарактеризованы биохимические свойства белка RecA D112R, как наиболее рекомбиногешгаго из всех белков RecA, изученных к настоящему времени. Обнаружена повышенная активность белка RecA D112R в процессе вытеснения белков SSB и F'SSB с онДНК, а также в реакции расплетания вторичных структур на онДНК. Обнаружена устойчивость онДНК-зависимой АТФазной активности белка RecA D112R к действию таких негативных регуляторов рекомбинации, как белки PsiB и RecX. Предложена усовершенствованная модель регуляции филамента RecA белком RecX, в рамках которой элонгация филамента RecA вдоль онДНК блокируется белком RecX на участке онДНК, расположенном за пределами филамента. Обнаружен новый путь повышения рекомбиногенности белка RecA за счет увеличения его синаптазиой активности.

Теоретическое и практическое значение работы. Проведенное исследование относится к числу фундаментальных, оно расширяет наши представления о молекулярном механизме гомологической рекомбинации. Вместе с тем, подобные исследования имеют и прикладное значение: белок RecA D112R может быть использован в роли гомологичной рекомбиназы, введение которой в клетки млекопитающих может существенно активировать рекомбинацию в клетках высших и обеспечить замену участка гена при мишенной рекомбинации.

Белок RecA из Е. coli использовался в биотехнологии, однако широкое применение нашли только несколько технологий, использующих RecA, в то время как многочисленные попытки использования RecA в области генетической инженерии имели ограниченный успех. Рекомбинационная активность RecA в клетках Е. coli дикого типа может зависеть от функций множества регуляторпых белков, присутствие которых, по-видимому, не слишком легко обеспечить в экспериментах, направленных на модификацию генома эукариот. Использование в биотехнологии мутантиых белков RecA с точечными заменами, усиливающими одну или более функций RecA, может привести к продуктивному использованию рекомбинационного потенциала этого белка.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на XI, XII и XIV Международных школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2007, 2008 и 2010 гг.), на семинарах политехнического симпозиума «Молодые ученые — промышленности Северо-Западного региона» (Санкт-Петербург, 2005, 2006 и 2010 гг.), на II научной конференции «Молекулярная генетика, биофизика и медицина» (Бреслеровские чтения-

II) (Санкт-Петербург, 2006), на Всероссийском форуме студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и инновации в технических университетах» (Санкт-Петербург, 2008) и «Russian-Swiss Workshop on Regulation of genome stability by DNA replication and repair» (Санкт-Петербург, 2010).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов, заключения и списка литературы, содержащего 228 источников. Иллюстративный материал содержит 28 рисунков и 6 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследования: мутантный белок RecA D112R. Экспрессию белка RecA D112R и контрольного белка RecAEc проводили в штамме BL21 (DE3) pLysS: F otnpT hsdSB (гВ' mB+) dem gal (DE3) ЛгесАЗОб, несущем плазмиду pLysS. Штамм BL21 (DE3) входит в рЕТ-экспрессионную систему (Novogene, США).

Определение частоты рекомбинационных обменов. Частота рекомбинационных обменов на единицу длины ДНК может быть выражена через среднестатистическое расстояние между двумя соседними рекомбинационными обменами - параметр X, который вычисляется по модифицированной формуле Холдейна ц = 0.5[1 + ехр(2/А.)], где ц - сцепленность между селектируемым и неселектируемым маркерами, а / - физическое расстояние между маркерами, выраженное в минутах карты или числе нуклеотидов (Бреслер и Ланцов, 1978). Сцепленность между селектируемыми (Ihr* или ara) и неселектируемым (hu) маркерами определяли методом перепечаток, анализируя число клонов, имеющих соответственно генотип Th/Lci/ или Ara+Leu+ среди клонов Thr+ или Ага+, полученных в результате постконъюгационной рекомбинации.

SOS-зфомотест проводили согласно методике, описанной ранее (Миллер, 1976). Эффективность SOS-ответа, контролируемого геном гесА, регистрировалась по синтезу ß-галактозидазы, продуцируемой геном lacZ, находящимся под контролем SOS-индуцируемого гена sfiA в штамме GY7109. ß-Галактозидазную активность измеряли при помощи хромогенного субстрата о-нитрофенил-р-П-галактозида (ОНФГ). В присутствии ß-галактозидазы это бесцветное вещество превращается в галактозу и о-нитрофенол, который окрашен в желтый цвет, так что его количество можно измерить по поглощению при 420 нм. Количество образовавшегося о-нитрофенола пропорционально количеству фермента и времени взаимодействия фермента с ОНФГ.

Выделение и очистку белков осуществляли по одной схеме, поскольку гены гесАЕс и recAD112R клонированы в вектор рЕТ-21Ь. Белки RecA выделяли и очищали в три этапа. Обработанные лизаты клеток, содержащие экспрессированные белки RecA, осаждали полимином

Р, проводили ионообменную хроматографию на предварительно подготовленном носителе -фосфоцеллюлозе Pile последующей аффинной очисткой на колонке с онДНК-целлюлозой (Сох el ai, 1981).

Измерение гидролиза АТФ, катализируемого белками RecA, проводили с помощью спектрофотометрического метода, связывающего гидролиз АТФ с окислением NADH. Появление одного эквивалента АДФ (гидролиз 1 молекулы АТФ) ферментативно сопряжено с окислением одного эквивалента молекулы NADH до NAD+, регистрируемого спектрофотометрически при 380 им. Коэффициент молярной экстинкции NADH Ез8о = 1.21 мМ"1 см"1.

Реакции проводили при 37°С в 90 мкл буфера ТМД (25мМ Трис-HCl, pH 7.5; MgCl2 (от 2 до 10 мМ, точная концентрация указана в конкретных экспериментах); 0.1 мМ DTT), содержащего 1 мМ АТФ и АТФ-регеиерирующую систему (3 мМ фосфоенолпирувата, 30 единиц/мл пируват киназы, 4.5 мМ NADH и 30 единиц/мл L-лактат дегидрогеназы), ДНК, определенный белок RecA и/или белки SSB, F'SSB, RecX, PsiB в концентрации, указанной в конкретных экспериментах. Скорость гидролиза АТФ регистрировали в кюветах с оптическим путем 1 см с помощью спектрофотометра Shimadzu UV-1800.

Сииаптазная реакции обмена гомологичными нитями ДНК in vitro с использованием метода FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Линейный двунитевой олигонуклеотид длиной 34 п.н., для получения которого использовали олигонуклеотиды FAM-TCACCAATGAAACCATCGATAGCAGCACCGTAAT и ATTACGGTGCTGCTATCGATGGTTTC-ATTGGTGA-Dabsyl, был помечен по противоположным концам нитей флуоресцеином и дабсилом. Он реагировал с линейной немеченой онДНК длиной 102 нуклеотида с последовательностью, эквивалентной трем повторам на меченой дабсилом нити двунитевого олигонуклеотида. Реакцию проводили при 27°С в кювете объемом 0.3 мл. Реакционная смесь содержала 25 мМ Tris HCl (pH 7.5), указанную концентрацию MgCk, 3 мкМ однонитевого олигонуклеотида, 1.2 мкМ белка RecA, 0.3 мкМ SSB, 0.7 мМ АТФ/S и 1.5 мкМ меченого двунитевого олигонуклеотида. Филаменты белка RecA формировались на онДНК в течение 5 минут в присутствии AT®yS и белка S SB. Реакцию инициировали добавлением меченой днДНК. В ходе RecA-зависимого переноса одной из нитей днДНК на онДНК, содержащуюся внутри филамента, происходило пространственное разделение флуоресцеина и дабсила и, как следствие, увеличение флуоресцентного сигнала. Интенсивность флуоресценции определяли с помощью флуориметра Hitachi F-4Û00.

Реакции переноса нити проводили и визуализировали в агарозном геле согласно методике,

предложенной Коксом (Сох et al., 1981). Реакционная смесь содержала 25 мМ трис-HCl (pH 7.5),

10 или 4 мМ MgCh, 1 м M АТФ, АТФ-регенерирующую систему, а также указанные под рисунком

количества белков RecA и SSB, кольцевой онДНК фага М13тр18 (плюс-нить) и линейной формы

днДНК того же фага. Эксперимент проводили при температуре 37°С. Белок RecAEc или RecA D112R предварительно прогревали с онДНК в течение 3 минут, затем в реакционную смесь добавляли белок SSB и инкубировали еще 2 минуты. В указанные промежутки времени из реакционной смеси отбирали аликвоты, и реакции останавливали добавлением 5 мМ EDTA, 0.5% SDS, 0.1 мг/мл протеиназы К с последующим инкубированием в течение 30 минут при 37°С. Затем проводили электрофорез в 0.8% агарозном геле, с последующим окрашиванием раствором 0.5 мкг/мл бромистого этидия. Положение ДНК в геле анализировали с помощью системы Kodak DC120 и программного обеспечения KDSID 2.0 (Amersham).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью метода наименьших квадратов, используя коэффициент Стьюдента для заданной надежности а = 0.90 (Кассандрова и Лебедев, 1970). Относительная погрешность результатов не превышала 10%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Исследование рекомбинационных характеристик мутантных белков RecA с заменами в области мсжнротомсрпого взаимодействия /и vivo

Таблица 1. Влияние аминокислотных замен в области межпротомерного взапмодействия на рскомбинационпые свойства белков ¡n vivo

АК замена „ Я д +- S Я g ^ В J Ч ° В + 5 " а х 2 и и я m и д д н w о. ' Н < 5 S V й ¡ М 5-3 Сцеплен -ность (ц) thr*-leu* ЧРО ДЧРО SOS SOSV

w.t. 4.9 ±0.4 0.986 ± 0.013 0.924 ± 0.016 5.0 ±0.1 1 30.3 ±3.1 1

[К6А] 4.8 ±0.5 - 0.721 ± 0.055 23.8 ±2.1 4.8 65.0 ±7.1 2.1

[K6D] 5.2 ± 0.5 - 0.805 0.072 14.5 ± 1.3 2.9 84.5 ± 9.2 2.8

[R28A] 3.3 ±0.3 0.734 ± 0.063 - 135.1± 11.3 27.0 26.3 ± 2.8 0.9

[R28D] 0.8 ±0.1 0.673 ± 0.061 - 188.7 ± 17.4 37.8 66.6 ± 6.8 2.2

[R28N] 5.6 ±0.5 - 0.892 ± 0.077 7.1 ±0.6 1.4 34.8 ±3.5 1.1

[T89V] 2.0 ± 0.2 0.978 ± 0.012 - 8.2 ±0.3 1.6 35.0 ±3.4 1.2

[Т89А] 1.8 ±0.2 0.934 ± 0.083 - 25.0 ±2.3 5.0 34.6 ±3.3 1.1

[D112R] 2.4 ± 0.2 0.616 ± 0.054 - 263.1 ±27.3 52.6 71.0± 11.2 2.3

[N113A] 2.3 ±0.3 0.758 ± 0.076 - 117.6 ± 12.4 23.5 164.8 ± 20.1 5.4

[D139A] 5.3 ±0.6 - 0.878 ± 0.076 8.3 ±0.7 1.7 36.8 ±3.7 1.2

[D139K] 5.5 ±0.6 - 0.868 ± 0.070 9.0 ±0.8 1.8 45.3 ±3.9 1.5

[R28D /DI 12R] 1.8 ±0.1 0.661 ± 0.057 - 204.1 ± 18.5 40.8 38.5 ±3.6 1.3

Подавление пшеррекомбипазной активности популяции клеток в ходе их культивирования в жидкой ростовой среде

Мутаптпый белок ЯесА 12К продемонстрировал наибольшую рекомбиногенную активность среди всех изученных мутантных белков ЛесА, охарактеризованных генетически (ВакЫапоуа е1 а1., 2001), что не является естественным для клетки и подтверждается наблюдаемой нами гибелью части клеток. Нами была выдвинута гипотеза, что повышенный уровень рекомбиногенности может активировать механизмы, способные оказать влияние на ЧРО и привести к ее понижеиию. Для ее проверки был проведен эксперимент, в котором были

использованы 16 независимых популяций клеток Е. coli JC10289Arec/l, несущих плазмиду с мутантным геном fecvIDl 12R. Эти популяции в течение 14 суток культивировали в жидкой ростовой среде, поддерживая их в состоянии экспоненциального роста и периодически измеряя ЧРО. Значение ЧРО при этом в каждом случае стремится к контрольному, но не достигает его. Каждая из культур (исходно происходивших из одного клона) утрачивает гиперрекомбинационную активность по-своему, что свидетельствует о разнообразии путей снижения этой активности. Но в каждом случае клетка избавляется от гиперрекомбинации, и к 70-му поколению АЧРО для разных штаммов приобретает значение от 1 до 14. Следовательно, в самой аномалии, ее возможностях дестабилизировать геном, заложены перспективы отбора клеток, нормализовавших ГР.

Для определения локализации мутаций, приводящих к снижению ЧРО, плазмиды и хромосомы из модифицированных штаммов были разделены и подвергнуты генетическому анализу. Было показано, что снижение ЧРО может быть обусловлено изменениями, произошедшими как на плазмиде, так и на хромосоме.

Наибольший интерес вызвали модифицированные плазмиды, обеспечивающие максимальное снижение ЧРО (с ДЧРО = 52 до АЧРО = 1.3). Секвенирование трех из них выявило делецию участка длиной 633 п.н., захватывающего промоторную область гена recviD112R. Она возникла в результате гомологической рекомбинации по прямым повторам длиной 37 п.н. и приводила к снижению уровня белка RecA D112R в клетке. На плазмиде был обнаружен альтернативный промотор, обеспечивавший присутствие в клетке белка RecA D112R в значительно меньших количествах, чем при транскрипции гена с немодифицированной плазмиды.

Микрочиповый анализ генома модифицированного штамма JC-12 (снижавшего ЧРО за счет изменений, произошедших на хромосоме; ДЧРО = 4), с последующим секвенированием предположительно модифицированных генов выявил точечную нуклеотидиую замену в гене рспВ, кодирующем поли(А) полимеразу. Ген рспВ был идентифицирован по своей способности влиять на копийность плазмид с ColEl репликоном (Grunberg-Manago, 1999). Точечная мутация приводит к образованию стоп-кодона и инактивирует ген, при этом образуется сайт рестрикции для рестриктазы Alul, что делает эту мутацию удобной для анализа. Амплификация и рестрикция гена рспВ из других модифицированных штаммов, характеризующихся снижением ЧРО за счет изменений на хромосоме, мутаций не выявила.

Можно утверждать, что если умеренная (8-кратная) гиперрекомбипация еще переносима клеткой (Bakhlanova et al., 2001), то неумеренная (52-кратная) вынуждает клетку включать механизмы, направленные против дестабилизации ее генома. В случаях нормализации рекомбиназной активности в клетке наблюдалось уменьшение количества мутантного белка RecA Dl 12R, вызывающего аномально высокую рекомбинацию.

Изучение биохимических свойств белка RecA D112R

Поскольку среди всех изученных на сегодняшний день белков RecA мутантный белок RecA D112R демонстрирует наиболее высокое значение ЧРО, его биохимические свойства представляют значительный интерес для дальнейшего исследования. В части приведенных ниже экспериментов белок RecA D112R сравнивается с белком RecA дикого тапа (RecAEc), а также двумя ранее изученными мутантными белками: 1) RecA ДС17, у которого удалены 17 С-концевых остатков, выполняющих авгорегуляторную функцию (Lusetti et al., 2003), его введение в клетку вызывает увеличение ЧРО в 4 раза; 2) RecA Е38К (RecA730), обладающим повышенной способностью смещать SSB и связываться как с он-, так и с днДНК (Lavery and Kowalczykowski, 1992), его экспрессия в клетках Е. coli приводит к увеличению ЧРО в 7 раз (Bakhlanova et al., 2001).

При сравнении белков RecAEc и RecA D112R оба белка характеризовались одинаковой скорость гидролиза АТФ в случае использования онДНК фага М13, когда реакцию запускали добавлением в реакционную смесь белка SSB, расплетающего вторичные структуры на онДНК. При использовании поли(дТ) белки RecAEc и RecA D112R демонстрировали близкую но значению скорость гидролиза АТФ: для RecAEc = 29.5 мкМ/мин, а для RecA Dl 12R ка{ = 25.9 мкМ/мин.

Расплавление вторичной структуры на онДНК фага М13 белком RccA D112R. В

отсутствие SSB белок RecA D112R проявляет повышенную способность связывать участки вторичной структуры в онДНК по сравнению с белком дикого типа (Рисунок 1). На онДНК фага М13 уровень гидролюа АТФ белком RecAEc составляет порядка 40% от наблюдаемого в присутствии SSB. Дальнейшее добавление RecAEc почти не оказывает эффекта, в то время как увеличение концентраций белка RecA Dl 12R приводит к уровню гидролиза АТФ, сравнимому с тем, что наблюдается в присутствие SSB. Т.о., мутантный белок способен связываться с

регионами вторичной структуры и расплавлять их.

Рисунок 1. Гидролиз АТФ, катализируемый белками RecAEc н RecA DJ12R в присутствии онДНК М13 и в отсутствие белка SSB.

Реакционная смесь: 25 мМ трис-HCI (pH 7.5), 10 мМ MgCI2, 2 мМ АТФ, АТФ-регснсрирующая система, 5 мкМ онДНК М13 и указанное на рисунке количество RecAEc или RecA D112R.

RecA, мкМ

Вытеснение белком RecA D112R белка SSB с кольцевой онДНК. Помимо гена SSB, находящегося на хромосоме, в клетках Е. coli может содержаться дополнительный ген SSB, находящийся на F-плазмиде (Jones et al., 1992) и регулирующий доступ RecA к онДНК во время конъюгации. Белок F'SSB отличается повышенным сродством к онДНК. Белок RecA D112R продемонстрировал повышенную способность смещать EcSSB и F'SSB с онДНК (Рисунок 2).

В обоих случаях RecA Dl 12R способен связываться с онДНК быстрее, чем белок RecAEc и (когда это проверялось) RecA АС 17. В эксперименте с EcSSB, преимущество мутанта перед RecAEc увеличивалось при снижении концентрации ионов Mg2+ в реакционной смеси. Т.о., мутация D112R может стабилизировать структуру RecA, повышая способность белка связываться с онДНК. Белок RecA Е38К связывается с онДНК и смещает F'SSB быстрее, чем RecA D112R (Рисунок 2Б).

А Б

Время, мин Время, мин

Рисунок 2. Кинетики вытеснения белка NN11 с онДНК белками ИесАЕс и Г.ссА 01121*. А. Вытеснение белка ЗБВ с онДНК белками ЯесАЕс и КесА и 112К при 10 или 4 мМ \1gCl2. Реакционна" смесь: 25 мМ трис-НС1 (рН 7.5), 10 или 4 мМ МцС12, 2 мМ АТФ, АТФ-регенерирующая система, 5 мкМ онДНК М13, 3 мкМ ЯесАЕс или ЯесА П1 12Н и 0.5 мкМ белка БЗВ. Кольцевую онДНК М13 преинкубировали в реакционной смеси с белком ЯЯВ в течение 10 минут, реакцию инициировали добавлением указанного белка ЯесА. Б. Кинетики вытеснения белка ВБВ, кодируемого Р плазмидой, с онДНК белками КссА, Реакционная смесь: 25 мМ трис-1 ГС] (рН 7.5), 10 мМ 1^С12, 1 мМ АТФ, АТФ-регенерирующая система, 5 мкМ онДНК М13, 3 мкМ КесАЕс или ЯесА 01! 2К и 0.5 мкМ белка Г^В. Кольцевую онДНК М13 преинкубировали в реакционной смеси с белком в течение 10 минут, реакцию

инициировали добавлением указанного белка ЯесА.

Влияние негативных регуляторов и КесХ на АГФазную активность белка КесА

Р-плазмидный белок Рв1В ингнбирует все активности белка RecA, включая связывание с ДНК, реакцию обмена нити и расщепление белка ЬехА (Рекоуа е1 а1., 2009). Он связывается со свободным RecA в растворе, и образовавшийся комплекс RecA-PsiB приводит к уменьшению количества нуклеопротеиновых филаментов RecA на онДНК.

АТФазная активность мутантного белка RecA ВТ 12И меньше подвергалась ингибированию белком Рз1В, чем в случае RecAEc или RecA АС 17 (Рисунок ЗА).

Другой ингибирующий RecA белок, RecX, связывается с растущим концом филамента,

блокируя присоединение следующего мономера (Огеев е! а!., 2004Ь), либо вызывает диссоциацию

мономеров вдоль всего филамента в местах случайного связывания с RecA (Ragone et al., 2008).

Добавление RecX в реакционную смесь приводит к медленному снижению наблюдаемой АТФазной активности по мере диссоциации филамента. АТФазная активность белка RecA D112R вновь была менее подвержена ингибирующему действию RecX, чем в случае RecAEc или RecA ДС17 (Рисунок ЗБ). В обоих описанных случаях способность белка RecA D112R противостоять влиянию регуляторов была существенной, но все же меньшей, чем наблюдалось в случае RecA

Рисунок 3. Влияние негативных регуляторов РвШ и ИесХ на АТФазную активность белков ИесА. А.

ОнДНК-зависимый гидролиз АТФ белками Нес А в присутствии белка РякВ. Реакционная смесь: 25 мМ трис-1 [С1 (рН 7.5), 10 мМ МЁС12, 2 мМ АТФ, АТФ-регеиерирующая система, 3 мкМ онДНК М13, 2 мкМ ЯесАЕс, 11есА Е38К, ЯесА ДСП или КесД и112К, 0.5 мкМ белка и 10 мкМ белка Рк|'В. Кольцевую онДНК М13 преинкубировали 8 реакционной смеси с белком вЗВ в течение 5 минут, затем добавляли 10 мкМ белка Рэ^В и инкубировали в течение еще 10 минут. Реакцию инициировали добавлением 2 мкМ указанного белка К ее А (на графике это точка 0 по оси абсцисс). Б. Ингибирование онДНК-зависимого гидролиза АТФ белками КесА в присутствии белка ЯесХ. Реакционная смесь: 25 мМ трис-НС1 (рН 7.5), 10 мМ 1^С12, 2 мМ АТФ, АТФ-регенерирующая система, 4 мкМ онДНК М13, 2.4 мкМ ЯесАЕс, ИесА Е38К, ЯесА АС17 или ИесА 011211, 0.4 мкМ белка БвВ и 0.1 мкМ белка ЯесХ. Кольцевую онДНК преинкубировали с указанным белком КесЛ в течение 10 минут, затем добавляли 0.4 мкМ белка ЭЗВ и АТФ и инкубировали в течение еще 15 минут, после чего в реакционную смесь добавляли 0.1 мкМ белка КесХ

Влияние мутации 0112К на взаимодействие КесА с белками 88В и КесХ. Белок КесХ способен взаимодействовать как непосредственно с RecA, так и с онДНК, что усложняет интерпретацию результатов, полученных при изучении механизма регуляции филамента RecA. Было показано, что белок 88В способствует устойчивости белка ЯесА к действию КесХ (ВаШп а1., 2008). Это наблюдение позволяет предложить модель, в которой повышенная устойчивость мутанта RecA D112R к КесХ может определяться опосредованно, в ходе особых конкурентных отношений с белком 88В.

На рисунке 4 показана кинетика ингибирования ДНК-зависимой АТФазы белка RecA после добавления различных концентраций белка КесХ. В реакционную смесь добавлялась онДНК фага М13, затем белок КесА и через 3 минуты - белок 88В, делающий вторичные структуры на онДНК доступными для RecA. Когда скорость гидролиза АТФ достигала своего максимального значения, в реакционную смесь добавляли белок КесХ (в точке 0 по оси абсцисс). Скорость гидролиза АТФ

Е38К.

О 20 40 60' 80 100 120

Время, мин

белком ЛесА падает пропорционально используемой концентрации ЯесХ, достигая стационарного уровня. При концентрациях И.есХ, равных 100 и 125 нМ, скорость гидролиза АТФ белком ЯесАЕс падает до нуля, что свидетельствует о полной диссоциации ИесА из комплекса с ДНК. Мутантный белок К-СсЛ О] 12К более устойчив к ингибирующему действию Г<ссХ, чем КесА дикого типа в тех же условиях.

О 50 75 100

Рисунок 4. Ингибирование ДНК-зависимой АТФазы белка ИесЛ после добавления различных концентраций ИесХ. Реакционная смесь: 25 мМ трис-НС! (рН 7.5), 10 мМ MgCl2, 2 мМ АТФ, АТФ-регенерирующая система, 5 мкМ онДНК М13, 3 мкМ ИесАЕс или ИесА Ш 12К, 0.5 мкМ белка ЭЗВ и указанная на рисунке концентрация белка КесХ (нМ). Кольцевую онДНК преинкубировали с указанным белком ЯесА в течение 5 минут, после чего добавляли 0.5 мкМ белка и АТФ и инкубировали в течение еще 5 минут. В момент времени реакционную смесь добавляли белок ЯесХ.

0 10 20 30 40 50 0 Время, мин

10 20 30 40 50 Время, мин

Белок 88В, являясь естественным препятствием для инициации филамента ИссА на онДНК, в то же время снижает ингибирующее действие белка КссХ, то есть приобретает стимулирующую относительно Г^есА роль в присутствии ЯесХ. Тенденция к усилению АТФазной активности белка ЯесА дикого типа в ответ на увеличение концентрации 88В в смеси сохраняется

и для АТФазы ЯесА 0112]< (Рисунок 5А).

Время, мин

40 60 80

Время, мин

12005 1000. £

800

| еоо

| 400 ^ 200

Рисунок 5. Вытеснение белка 88В белком КесА. А. Вытеснение белка ББВ белком ЯесА в присутствии ЯссХ. Реакционная смесь: 25 мМ трис-НС1 (рН 7.5), 10 мМ М§С12, 2 мМ АТФ, АТФ-регенерирующая система, 5 мкМ онДНК М13, 3 мкМ ЯесАЕс или ИесА 011211, 75 нМ ЯесХ и указанная на рисунке концентрация белка 8БВ (мкМ). Кольцевую онДНК преинкубировали с белками ББВ и ЯесХ в течение 5 минут, после чего в момент времени I = 0 в реакционную смесь добавляли указанный белок ЯесА. Гидролиз АТФ белком ЯесАЕс отмечен сплошной линией, ЯесА 0112И. - пунктирной линией. Б. Вытеснение белка 88В белком ЯесА в отсутствие ЯесХ. Реакционная смесь: как в А, за исключением белка ЯесХ. Кольцевую онДНК преинкубировали с указанным белком Б8В в течение 5 минут, после чего в реакционную смесь добавляли указанный белок (начало реакции соответствует точке 0 по оси абсцисс). Гидролиз АТФ белком ЯесАЕс отмечен сплошной линией, ЯесА 0112Я - пунктирной линией.

Белок RecA D112R значительно быстрее преодолевает ингибирующий эффект белка RecX при любых концентрациях SSB. Чтобы разделить влияние каждого из белков на кинетику реакции, был проведен эксперимент по вытеснению белка SSR белком RecA в отсутствие RecX (Рисунок 5Б). RecA DI12R вытесняет SSB значительно быстрее, чем RecAEc, т.е. более активно конкурирует за сайты связывания на онДНК в сравнении с RecAEc и, следовательно, имеет повышенное сродство к онДНК либо к молекуле RecA, уже находящейся в контакте с ДНК.

Белок RecA активно взаимодействует с онДНК, лишенной сложной вторичной структуры и шпилек (например, поли(дТ)), без помощи SSB, при этом белок SSB вытесняет RecA с 5'-конца любой линейной молекулы онДНК, заметцая освободившиеся в ходе разборки филамента участки ДНК (Madiraju et al., 1992). Использование поли(дТ) позволило вовлечь в реакцию RecA и RecX в отсутствие SSB. Добавление RecX в реакционную смесь с поли(дТ) приводит к одномоментному резкому снижению скорости гидролиза до некоторого конечного значения, чего не наблюдается в экспериментах с онДНК фага М13. Длина кольцевой онДНК фага М13 составляет ~ 7000 оснований, а средняя дина поли(дТ) - 226 оснований, т.е. белок RecA, предположительно, образует на поли(дТ) более короткие филаменты, характеризующиеся меньшим временем разборки. Отсутствие в реакции белка SSB делает процесс разборки филамента менее сложным. Несмотря на то, что различие между RecAEc и RecA D112R оказалось не слишком большим, RecA D112R показал достоверно большую устойчивость к RecX (Рисунок 6А).

Время, мин

+RecX

Время, мин

Рисунок 6. Влияние белка ИесХ на стабильность филамента К(Ч'Л на поли(дТ). А. Влияние белка ЛесХ на АТФазную активность ЯесА на поли(дТ). Реакционная смесь: 25 мМ трис-НС1 (рИ 7.5), 10 мМ М®С12, 2 мМ АТФ, АТФ-регенерирующая система, 5 мкМ поли(дТ), 3 мкМ 11есАЕс или ЯесА I) 112К и указанная на рисунке концентрация белка ЯесХ (нМ). Реакцию инициировали добавлением белка указанного КссА в реакционную смесь, содержащую поли(дТ). В момент времени 1 = 7 в реакционную смесь добавляли указанное количество белка ЯесХ. Гидролиз АТФ белком ЯесАЕс отмечен сплошной линией, ЯесА Ш 12К - пунктирной линией. Б. Влияние белка Е<есХ на КесА-зависимый гидролиз дАТФ. Реакционная смесь: 25 мМ трис-НС1 (рН 7.5), 10 мМ 1^С12, 2 мМ АТФ или дАТФ, АТФ-регенерирующая система, 5 мкМ цоли(дТ), 3 мкМ ЯесАЕс и 100 нМ белка КесХ. Реакцию инициировали добавлением белка ЯесА в реакционную смесь, содержащую поли(дТ). В момент времени I = 7 в реакционную смесь добавляли 100 нМ белка ИесХ.

Белок ReeA может создавать филамент на онДНК в присутствии дАТФ вместо АТФ, при этом скорость гидролиза дАТФ превышает скорость гидролиза АТФ на 15-20%. Заряженный молекулой дАТФ вместо АТФ RecA активнее конкурирует с SSB за сайты связывания на онДНК, благодаря изменившемуся сродству к онДНК (Menetski and Kowalczykowski, 1989). В проведенной нами реакции вновь был задействован поли(дТ), благодаря чему белок SSB не использовался. На Рисунке 6Б видно, что при замене АТФ на дАТФ RecA значительно более устойчив к действию RecX. Это замещение приводит к усилению стабильности филамента как RecAEc, так и RecA DI 12R в реакции с RecX и, видимо, носит универсальный характер.

Сделанные наблюдения позволяют предложить модель, в которой повышенная устойчивость мутанта RecA D112R к RecX может определяться в ходе особых конкурентных отношений с белком SSB. Вместе с тем, в опыте с поли(дТ) и при полном отсутствии SSB показало, что филамент RecA DI 12R обладает устойчивостью к RecX.

Можно сделать вывод, что в основе повышенной устойчивости RecA D112R к RecX вероятнее всего лежит изменение динамики взаимодействия филамента с онДНК. Мы предложили модель ингибирования, в которой мономеры мутантного белка в ходе элонгации филамента эффективно опережают связывание RecX с растущим концом филамента. Возможно построение комплекса RecA::onflHK::AT®::RecX, в котором RecX одной частью связывается с филаментом, тогда как другая его часть вовлечена в непосредственное взаимодействие с ДНК перед филаментом. При этом доступ следующего мономера к растущему концу филамента заблокирован, так как RecX занимает пространство, необходимое для элонгации. Такая модель ингибирования объясняет преимущество RecA с повышенной динамикой филаментации, вызванной заменой DI 12R либо АТФ -> дАТФ и одновременно разъясняет природу антагонизма между белками SSB и RecX: занимая сайт онДНК перед филаментом, белок SSB, возможно, удерживает пространство на этом участке ДНК от взаимодействия с RecX, позволяя новым мономерам RecA достраивать филамент.

Реакция обмена нити, проводимая белком RecA D112R. Сравнение рекомбинационных свойств белков RecA D112R, RecAEc, RecA ДС17 и RecA Е38К показало, что гиперрекомбинационная активность белка RecA может быть связана не только с особенностями его филаментации на онДНК и регуляцией вспомогательньми белками. Возможно, ключевой вклад в наблюдаемую in vivo гиперрекомбинацию дают такие функции, как поиск гомологии и обмен гомологичных нитей.

Моделью рекомбинационного процесса in vitro является реакция переноса нити с линейной молекулы днДНК фага М13 на кольцевую онДНК того же фага, протекающая с активным участием белка SSB. На Рисунке 7А представлены данные по кинетике реакции переноса нити, катализируемой белками RecAEc или RecA D112R. По мере вытеснения белка SSB белками RecA

с участков онДНК и образования пресинаптического комплекса, в реакцию вовлекается гомологичная линеаризованная днДНК. Образующиеся при этом промежуточные продукты реакции — объединенные молекулы ДНК (ОМ) - мигрируют в агарозном геле гораздо медленнее, чем исходные субстраты. Скорость реакции оценивали по образованию продуктов реакции: ОМ и конечных продуктов (КГТ), при этом количество ДНК в ОМ и КП делилось на все количество днДНК в реакции.

Реакция, проводимая белком RecA D112R, почти не отличается от проводимой RecAEc, за исключением более раннего образования ОМ. Перенос нити завершается образованием конечного продукта реакции - релаксированной кольцевой днДНК. Оба белка завершают образование КП приблизительно одновременно.

Повышенный уровень (8-10 мМ) свободных ионов Mg2+ необходим для успешного проведения реакции обмена нити in vitro, проводимой белком RecA дикого типа (Сох and Lehman, 1981; Lusetti et al., 2003). Столь высокий уровень свободных ионов Mg2+ вряд ли можно встретить in vivo, поэтому предполагается, что активность RecA в клетках каким-то образом повышается при помощи регуляторных белков.

При снижении концентрации ионов Mg2+ до 4 мМ, скорость реакции, проводимой белком RecAEc, значительно замедлялась. Образование КП белком RecAEc завершалось через 90 минут

Рисунок: 7. Реакция переноса нити: разделение в агарозном геле исходных компонентов реакции (кольцевой онДПК М13 и линейной днДНК М13) и продуктов реакции (объединенных молекул (ОМ) и конечных продуктов (КП) — кольцевых никированных днДНК М13). А. Реакция переноса нити в присутствии 12 мМ МЁС12. Реакционная смесь: 25 мМ трис-НС1 (рН 7.5), 10 мМ 2 мМ АТФ, АТФ-регенерирукнцая система, 10

мкМ онДНК М13, 6 мкМ ЯесАЕс или ЯесА 011211, 1 мкМ ЭвВ и 18 мкМ днДНК. Б. Реакция переноса нити в присутствии 4 мМ МёС12. Реакционная смесь как в А, за исключением 4 мМ вместо 12 мМ М£С12.

Полученные результаты подтверждают преимущество белка RecA DI 12R перед RecAEc на стадии поиска гомологии и комплементарного спаривания молекул ДИК.

Повышенная синаптазная активность белка RccA D112R. Мы сравнили способность белка дикого типа и белка RecA DI 12R проводить синаптазную реакцию обмена гомологичными нитями ДНК in vitro. Кинетику реакции регистрировали с помощью апробированного ранее метода FRET (Gupta et al., 1998). Филаменты RecA были собраны на однонитевой ДНК (10 мкМ) длиной 102 основания в присутствии различных концентраций ионов Mg2+ (2 мМ и 10 мМ) и негидролизуемого аналога АТФ - АТФу8 (1 мМ). Однонаправленный характер реакции обеспечивается исходным избытком онДНК, содержащейся в филаменте, относительно двунитевого олигонуклеотида, либо присутствием белка SSB.

Рисунок 8. Кинетика синаптазной реакции, проводимой белком RecA в присутствие 2 мМ Mgz+.

Реакцию проводили при 27°С. Реакционная смесь: 25 мМ трис-HCl (рН 7.5), 2 мМ MgCl2, 0.7 мМ ATí>yS, 3 мкМ однонитевого олигонуклеотида, 1.2 мкМ указанного белка RecA, 0.3 мкМ SSB и 1.5 мкМ меченого двунитевого олигонуклеотида. Филаменты белка RecA были сформированы на онДНК в течение 5 минут преинкубации в присутствии АТФуБ и белка SSB. Спаривание олигонуклеотидов инициировалось при добавлении меченой днДНК в момеш времени, соответствующий точке 0 на оси абсцисс.

Скорость образования объединенных

молекул белком RecA D112R значительно

выше, чем в реакции, проводимой белком RecA

дикого типа. Эффект становится еще более выраженным при снижении концентрации ионов Mg2+

в реакционной смеси: скорость образования объединенных молекул белками RecAEc и RecA Е38К

значительно замедляется, в то время как реакции, проводимые белками RecA DI 12R и RecA AC 17,

не претерпевают заметных изменений (Рисунок 8).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Внесение точечных аминокислотных замен в белок RecA, особенно в область высоко консервативных аминокислотных остатков, может оказывать влияние на рекомбинационную активность бактериальной клетки и наблюдаемую in vivo ЧРО. Анализ ЧРО для 16 мутантных белков выявил белок RecA D112R - наиболее рекомбиногенный из известных на сегодняшний день белков RecA (его ЧРО в 52 раза выше, чем у белка RecA дикого типа). Повышенная рекомбиногенность RecA D112R проявляется на фоне почти полного отсутствия SOS-ответа, что обычно не характерно для белков RecA из Е. coli.

Время, мин

Анализ его активностей выявил, что скорость гидролиза АТФ белком RecA DI 12R при 37°С в присутствии онДНК фага М13 и белка SSB не отличается от скорости гидролиза АТФ белком RecAEc в тех же условиях. При этом белок RecA D112R характеризуется повышенной скоростью связывания с онДНК фага М13 в отсутствие SSB, а также способностью более эффективно смещать белки SSB и F'SSB с онДНК, чем RecAEc, особенно при снижении концентрации ионов Mg2+ с 10 мМ до 4 мМ. Кроме того, белок RecA D112R более устойчив к действию таких ингибирующих онДНК-зависимую АТФазу белков, как RecX и PsiB.

Устойчивость RecA DI 12R к действию RecX и более эффективное конкурирование с SSB за сайты связывания на онДНК, чем у RecAEc, делают его полезным инструментом для изучения механизма регуляции филамента RecA белком RecX. Филамент RecA D112R обладает устойчивостью к RecX и в эксперименте с поли(дТ) при полном отсутствии SSB. Нами предложена модель, в которой мономеры мутантного белка RecA в ходе элонгации филамента эффективно опережают связывание RecX с его растущим концом. Это объясняет преимущество RecA с повышенной динамикой филаментации, вызванной заменой D112R либо использованием дАТФ вместо АТФ, и разъясняет природу антагонизма между белками SSB и RecX: SSB занимает сайт онДНК перед филаментом и удерживает пространство на этом участке ДНК от взаимодействия с RecX, позволяя новым мономерам RecA достраивать филамент.

RecA D112R, превосходя RecAEc и RecA АС17, уступает белку RecA Е38К в способности смещать белки SSB и F'SSB с онДНК, а также сохранять онДНК-зависимую АТФазную активность в присутствии белков RecX или PsiB. При этом RecA Е38К увеличивает ЧРО в клетке в 7 раз, a RecA DI 12R - в 52.

Мы измерили скорость синаптазной реакции отдельно от процесса миграции ветви. Скорость образования объединенных молекул белком RecA D112R оказалась выше, чем белком RecA Е38К.. Это различие особенно заметно при снижении концентрации ионов Mg2+ в реакционной смеси с 12 до 2 мМ, что, возможно, больше соответствует условиям, наблюдаемым in vivo.

На сегодняшний день белок RecA D112R является единственным из исследованных мутантных белков RecA, характеризующихся повышенной рекомбиногенностью, чей путь усиления рекомбинационной активности связан с качественным изменением такой функции филамента, как поиск гомологичной нити ДНК для инициирования синаптазной реакции.

ВЫВОДЫ

2) В популяции клеток Е. coli с аномально высокой RecADl 1211-зависимой рекомбинацией наблюдается постепенный отбор клеток со сниженной гиперрекомбинацией. Селекция приводит к снижению рекомбинационной активности до нормального уровня.

3) Мутантный белок RecA D112R по сравнению с белком RecAEc обладает:

а) повышенной способностью расплавлять вторичные структуры на онДНК;

б) повышенной способностью смещать белок SSB с онДНК, в том числе при снижении концентрации ионов магния в реакционной смеси;

в) повышенной способностью смещать белок F'SSB с онДНК;

г) повышенной устойчивостью к ингибирующему воздействию белков PsiB и RecX;

д) повышенной скоростью проведения реакции обмена нитей ДНК при снижении концентрации ионов магния в реакционной смеси.

5) Высокая рекомбиногенность мутантного белка RecA D112R обеспечивается повышенной скоростью инициирования синаптазпой реакции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дудкина А.В., Швецов А.В., Бахланова И.В., Байтин Д.М. Изменение динамики филаментации белка RecA, вызванное аминокислотной заменой D112R либо замещением АТР на dATP, приводит к устойчивости филамента к действию белка RecX // Мол. Биол. - 2011. - Т.45. - С. 1-8.

2. Дудкина A.B., Бахланова И.В., Байтин Д.М. Новый механизм увеличения частоты рекомбинационных обменов путем повышения сипаптазной активности белка RecA из Escherichia coli II ДАН. - 2010. - Т.432. - С. 120-122.

3. Bakhlanova I.V., Dudkina A.V., Baitin D.M., Knight K.L., Сох M.M., Lanzov V.A., Modulating cellular recombination potential through alterations in RecA structure and regulation // Mol. Microbiol. -2010.-V. 78.-P. 1523-1538.

4. Ланцов B.A., Бахланова И.В., Дудкина A.B. и Киль Ю.В. Регулирование рекомбиназной активности у бактерий // Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня. Бреслеровские чтения 2 (2006): - ред. Ланцов В. - Издательство ПИЯФ РАН - 2007. - С. 110-123.

5. Dudkina A.V., Bakhlanova I.V. and Lanzov V.A. Normalization of recombination activity of RecA protein in Escherichia coli cells // «Russian-Swiss Workshop on Regulation of genome stability by DNA replication and repair (July 7-9,2010, St. Petersburg, Russia)». - 2010. - P. 41.

6. Дудкина A.B., Бахланова И.В., Ланцов B.A., Байтин Д.М., Кокс М.М. Влияние точечной мутации [D112R] на рскомбинационную активность белка RecA из Escherichia coli in vitro II

«Молодые ученые - промышленности Северо-Западного региона: материалы конференций политехнического симпозиума (20 мая 2010 года)». - 2010. - С. 202-203.

7. Дудкииа А.В., Байтин Д.М., Ланцов В.А. Влияние точечной мутации [D112R] на рекомбинационную активность белка RecA из Escherichia coli // «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА: 14-я Путинская международная школа-конференция молодых ученых», (Пущино, 19-23 апреля 2010 года)», сборник тезисов. -2010. - Т. 2. - С. 130-131.

8. Дудкииа А.В., Бахланова И.В., Ланцов В.А. Нормализация рекомбиназной активности белка RecA в клетках Escherichia coli //«Наука и инновации в технических университетах», материалы всероссийского форума студентов, аспирантов и молодых ученых. -2008. - С. 178-179.

9. Дудкииа А.В., Бахланова И.В., Ланцов В.А. Рекомбиназная активность белка RecA в клетках Escherichia coli: ее регуляция и влияние на систему биологической подвижности // «БИОЛОГИЯ -НАУКА XXI ВЕКА: 12-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых», (Пущино, 10-14 ноября 2008 года)», сборник тезисов. - 2008. - С. 21-22.

10. Дудкииа А.В., Ланцов В.А. Регуляция гиперрекомбиназной активности белка RecA в клетках Escherichia coli 11 «Биология - наука XXI века: 11ая конференция молодых ученых в Пущино», сборник тезисов. - 2007. - С. 77.

11. Дудкииа А.В., Ланцов В.А. Структурно-функциональные изменения в геноме Escherichia coli, связанные с гиперрекомбиназной активностью белка RecA // «Молодые ученые -промышленности Северо-Западного региона», материалы семинаров политехнического симпозиума. - 2006. - С. 186.

12. Дудкииа А.В., Ланцов В.А. Гиперрекомбинация: роль интерфейса межсубъединичного взаимодействия в активном филаменте белка // «Молодые ученые - промышленности СевероЗападного региона», материалы семинаров политехнического симпозиума. - 2005. - С. 37-38.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Baitin D.M., Gruenig М.С. and Сох М.М. SSB antagonizes RecX-RecA interaction // J. Biol. Chem. -2008.-V. 283.-P. 14198-14204.

2. Bakhlanova I.V., Ogawa T. and Lanzov V.A. Recombinogenic activity of chimeric recA genes (Pseudomonas aeruginosa/Escherichia coli): a search for RecA protein regions responsible for this activity // Genetics. - 2001. - V. 159. - P. 7-1S.

3. Chen Z., Yang H. and Pavletich N.P. Mechanism of homologous recombination from the RecA-ssDNA/dsDNA structures // Nature. - 2008. - V. 453. - P. 489-454.

4. Chervyakova D., Kagansky A., Petukhov M. and Lanzov V. [L29M] substitution in the interface of subunit-subunit interactions enhances Escherichia coli RecA protein properties important for its recombinogenic activity. // J. Mol. Biol. - 2001. - V. 314. - P. 923-935.

5. Clark A.J. and Margulies A.D. Isolation and characterisation of recombination-deficient mutants of Escherichia coli K12 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1965. - V. 53. - P. 451-459.

6. Cox M.M. and Lehman I.R. Directionality and polarity in RecA protein-promoted branch migration // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1981. - V. 78. - P. 6018-6022.

7. Сох М.М. Regulation of Bacterial RecA Protein Function // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. - 2007. -V. 42.-P. 41-63.

8. Drees J.C., Lusetti S.L., Chitteni-Pattu S., Inman R.B., and Cox M.M. A RecA filament capping mechanism for RecX protein. // Mol. Cell. - 2004b. - V. 15. - P. 789-798.

9. Eldin S., Forget A.L., Lindenmuth D.M., Logan K.M. and Knight K.L. Mutations in the N-termmal region of RecA that disrupt the stability of free protein oligomers but not RecA-DNA complexes // J. Mol. Biol. - 2000. - V. 299. - P. 91 -101.

10. Galletto R. and Kowalczykowski S.C. RecA // Curr. Biol.-2007.-V. 17. - P. 395-397.

11. Grunberg-Manago M. Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages // Annu. Rev. Genet. - 1999. - V. 33. - P. 193-227.

12. Gupta R.C., Golub E.I., Wold M.S. and Radding C.M. Polarity of DNA strand exchange promoted by recombination proteins of the RecA family // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 1998. - V. 95. - P. 98489848.

13. Jones A.L., Barth P.T. and Wilkins B.M. Zygotic induction of plasmid ssb and psiB genes following conjugative transfer of Incll plasmid CoIlb-P9 // Mol. Microbiol. - 1992. - V. 6. - P. 605-613.

14. Lusetti S.L, Shaw J.J. and Cox M.M. Magnesium ion-dependent activation of the RecA protein involves the С terminus // J. Biol. Chem. - 2003. - V. 278. - P. 16381-16388.

15. Madiraju M.V., Lavery P.E., Kowalczykowski S.C. and Clark A.J. Enzymatic properties of the RecA803 protein, a partial suppressor of recF mutations // Biochemistry. - 1992. - V. 31. - P. 1052910535.

16. Menetski J.P. and Kowalczykowski S.C. Enhancement of Escherichia coli RecA protein enzymatic fimction by dATP // Biochemistry. - 1989. - V. 28. - P. 5871-5881.

17. Petrova V., Chitteni-Pattu S„ Drees J.C., Inman R.B. and Cox M.M. An SOS Inhibitor that Binds to Free RecA Protein: The PsiB Protein // Mol. Cell. - 2009. - V. 36. - P. 121-130.

18. Ragone S., Maman J.D., Furnham N., Pellegrini L. Structural basis for inhibition of homologous recombination by the RecX protein // EMBO J. - 2008. - V. 27. - P. 2259-2269.

19. Story R.M., Weber I.T. and Steitz T.A. The structure of the Escherichia coli RecA protein monomer and polymer II Nature. - 1992. - V. 355. - P. 318-325.

20. Wigle T.J. and Singleton S.F. Directed molecular screening for RecA ATPase inhibitors // Bioorg. Med. Chem. Lett. - 2007. - V. 17. - P. 3249-3253.

21. Бреслер C.E. и Ланцов B.A. Индуцированная рекомбинация у Escherichia coli K-12: рекомбиногенный эффект tifl //Докл. Акад. Наук. - 1978. - Т. 238. - С. 715-717.

22. Кассандрова О.Н., Лебедев В.В. Обработка результатов измерений. // Москва: Наука. -1970.

23. Ланцов В.А. Гомологическая ДНК-трансфераза RecA: функциональные активности и поиск гомологии рекомбинирующими ДНК II Молекулярная биология. - 2007. - Т. 41. - С. 1-12.

24. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. // Москва: Мир. - 1976.

Подписано в печать 21.09.2011. Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 100 экз. Заказ 429

Отпечатано в типографии ООО «Адмирал»

199048, Санкт-Петербург, В. О., 6-я линия, д. 59 корп. 1, оф. 40Н

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дудкина, Александра Валентиновна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Бактериальная конъюгация.

1.2. Гомологическая рекомбинация у бактерий.

1.3. Центральная роль белка RecA в гомологической рекомбинации.

1.4. Частота рекомбинационных обменов на единицу длины ДНК.

1.5. Роль белка RecA в SOS-системе клетки.

1.6. Структурно-функциональные особенности белка RecA.

1.7. Взаимодействие белка RecA с онДНК.

1.8. Взаимодействие белка RecA с днДНК.

1.9. Гидролиз АТФ.

1.10. Реакция переноса нити ДНК.

1.11. Роль белка SSB в реакции переноса нити ДНК.

1.12. Белки, влияющие на функции RecA.

1.13. Единичные замены в области межпротомерного взаимодействия белка RecA из Е. coli.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.

2.2. Среды.

2.3. Манипуляции с ДНК.

2.4. Рекомбинационный тест.

2.5. Определение частоты рекомбинационных обменов.

2.6. SOS-хромотест.

2.7. Ферменты и реактивы.

2.8. ДНК.

2.9. Трансформация компетентных клеток пламидной ДНК.

2.10. Метод иммуноблоттинга.

2.11. Подготовка хроматографических носителей к выделению белков.

2.12. Выделение и очистка белков.

2.13. Реакции, катализируемые белком RecA.

2.14. Статистическая обработка результатов.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Исследование рекомбинационных свойств мутантных белков ЯесА с точечными аминокислотными заменами в области мономер-мономерного взаимодействия.

3.2. Определение конститутивной экспрессии БОБ-функции.

3.3. Подавление гиперрекомбиназной активности популяции клеток в ходе их культивирования в жидкой ростовой среде.

3.4. Изучение биохимических свойств белка ЯесА 12Я.

3.4.1 Очистка белка КесА 12Л и измерение его АТФазной активности.

3.4.2. Расплавление вторичных структур на онДНК фага М13 белком ЯесА 1)112Е1.

3.4.3. Вытеснение белком ЯесА 1211 белка ББВ с кольцевой онДНК.

3.4.4. Влияние белка КесА 12Я на автокаталитическое расщепление белка ЬехА.

3.4.5. Влияние негативных регуляторов и ЯесХ на АТФазную активность белка ЯесА 011211.

3.4.6. Влияние мутации Б112Я на взаимодействие ЛесА с белками вЭВ и ЯесХ.

3.4.7. Реакция переноса нити, проводимая белком ЯесА 12Я.

3.4.8. Повышенная синаптазная активность белка ЯесА Б112Л.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние точечной мутации D112R на рекомбинационную активность белка RecA из Escherichia coli"

Актуальность проблемы Началом молекулярно-генетического изучения рекомбинации у прокариот можно считать 1965 год, когда А. Кларк и А. Маргулис описали ген гесА у Escherichia coli (Clark and Margulies, 1965). Ими была показана абсолютная зависимость гомологичной рекомбинации от целостности этого гена. С тех пор его продукт — белок RecA — является наиболее интенсивно изучаемым ферментом гомологической рекомбинации у прокариот.

Белок RecA участвует не только в рекомбинации, но также в процессах репарации, мутагенеза, клеточного деления, регуляции экспрессии ряда репарационных генов и в других процессах жизнеобеспечения клетки (Ланцов, 2007; Galletto et al., 2007). RecA-подобные белки обнаружены во всех трех доменах живых организмов: Bacteria, Archaea и Еикагуа (см. Roca and Сох, 1997; Brendel et al., 1997). Такая консервативность белка в ходе эволюции объясняется его фундаментальной ролью в регуляции клеточных процессов.

Несмотря на небольшой размер белка RecA (его молекулярная масса составляет ~ 40 кДа), он обладает поразительной функциональностью: гидролизует АТФ, взаимодействует с однонитевой ДНК (онДНК) и двунитевой ДНК (днДНК), является копротеазой при авторасщеплении репрессора SOS-регулона клетки (белка LexA) и катализирует ренатурацию двунитевой ДНК (Ланцов, 2007; Сох, 2007).

Структурно-функциональный анализ белка RecA, проводимый во многих лабораториях мира, приобрел новые возможности после описания в 1992 г. его трехмерной кристаллической структуры в неактивном состоянии (Story et al., 1992; Story and Steitz, 1992) и после исследования кристалловактивных филаментов RecA (Chen et al., 2008). Эти структуры, совместно с генетическими и биохимическими данными, позволили авторам определить области белка, связывающиеся с ДНК и нуклеотидными кофакторами, участвующие в межпротомерном взаимодействии и связывании с репрессорами. Кроме того, полученные кристаллические структуры легли в основу интерпретации данных о биохимических свойствах мутантных белков RecA.

Несмотря на очевидные успехи в изучении механизмов функционирования белка RecA, до сих пор актуальным остается исследование его структурно-функциональной организации. Бактериальный белок RecA несет в себе огромный рекомбинационный потенциал, который клетка вынуждена ограничивать по причине его возможного вреда для стабильности генома, и эти ограничения во многом определяются оптимизированным составом аминокислотных остатков самого белка.

Особую актуальность изучение структурно-функциональной организации белка RecA приобрело в свете данных об универсальности структуры нуклеопротеинового филамента, образуемого RecA-подобными белками. Такие филаменты найдены и у оукариот, а природа такого нуклеопротеинового комплекса и молекулярный механизм обмена нитей между гомологичными молекулами ДНК аналогичен у про- и эукариот. Таким образом, данные, полученные при изучении бактериального белка RecA, могут быть полезны для исследования механизмов рекомбинации и репарации у высших, включая человека.

Вместе с тем, конечная цель подобных исследований носит и прикладной характер. Гиперрекомбинационно-активные белки RecA являются кандидатами на роль медиаторов в процессе так называемой "мишенной рекомбинации" при генотерапии в ее идеальном варианте (Ланцов, 1994).

Ранее было показано, что делеция С-концевого фрагмента и точечные аминокислотные замены в области белок-белкового взаимодействия протомеров RecA могут оказывать влияние на его рекомбинационную активность как in vitro, так и in vivo. Наше исследование посвящено изучению влияния ионных или полярных взаимодействий остатков 3-30 и 111-140 на генетические и биохимические характеристики»белка RecA.

Научная новизна и практическая ценность работы Выявлено влияние точечных аминокислотных замен в области мономер-мономерного взаимодействия белка RecA на его рекомбинационные свойства. Исследованы пути нормализации рекомбинационной активности белка RecA Dl 12R в клетках Е. coli. Впервые охарактеризованы биохмические свойства белка RecA D112R, как наиболее рекомбиногенного из всех белков RecA, изученных к настоящему времени. Обнаружена повышенная активность белка RecA D112R в процессе вытеснения белков SSB и F'SSB с онДНК, а также в реакции расплетания вторичных структур на онДНК. Обнаружена устойчивость нуклеопротеинового филамента белка RecA Dl 12R к действию таких негативных регуляторов рекомбинации, как белки PsiB и RecX. Предложена усовершенствованная модель регуляции филамента RecA белком RecX, в рамках которой элонгация филамента RecA вдоль онДНК блокируется белком RecX на участке онДНК, расположенном за пределами филамента. Обнаружен новый путь повышения рекомбиногенности белка RecA за счет увеличения его синаптазной активности.

Проведенное исследование относится к числу фундаментальных. Оно расширяет наши представления о молекулярном механизме гомологической рекомбинации. Вместе с тем, подобные исследования имеют и прикладное значение: белок RecA D112R может быть использован в роли гомологичной рекомбиназы, введение которой в клетки млекопитающих может существенно активировать гомологическую рекомбинацию в клетках высших и обеспечить замену участка гена при мишенной рекомбинации.

Белок RecA из Е. coli использовался в биотехнологии (Szybalski, 1997; Wang et al., 2006; Zhumabayeva et al., 2001; Ferrin and Camerini-Otero, 1998), однако широкое применение нашли только несколько технологий, использующих RecA, в то время как многочисленные попытки использования RecA в области генетической инженерии имели ограниченный успех. Рекомбинационная активность белка RecA в клетках Е. coli зависит от функций множества регуляторных белков, отсутствующих в экспериментах, направленных на модификацию генома эукариот. Использование в биотехнологиях мутантных белков RecA с точечными заменами, усиливающими одну или более функций RecA, может привести к продуктивному использованию рекомбинационного потенциала этого белка.

Точное знание структурно-функциональных взаимосвязей в белке RecA является необходимым условием для разработки новых антибиотиков, действие которых будет основываться на повышении эффективности известных антибактериальных препаратов путем ингибирования ! каких-либо функций белка RecA. Поскольку большинство антибиотиков вызывают повреждения ДНК, а репарация серьезных структурных повреждений ДНК (таких как однонитевые бреши и двунитевые разрывы ДНК) и восстановление репликации строго зависят от белка RecA, ингибиторы этого белка могли бы усиливать эффективность антибиотиков. (Wigle et al., 2007). Поскольку белок RecA выполняет основную роль в поддержании генетического разнообразия популяций и, в частности, в развитии устойчивости к антибиотикам, одновременное применение ингибиторов белка RecA с антибиотиками смогло бы приостановить или даже воспрепятствовать развитию устойчивости бактерий к применяемым лекарствам.

Цель работы Целью работы является изучение механизмов, регулирующих процесс рекомбинации в клетке, а также выявление тех биохимических особенностей белка RecA D112R, которые лежат в основе его повышенной рекомбиногенности.

Задачи исследования Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Проанализировать аминокислотные замены в области RecA-RecA взаимодействий, влияющие на частоту рекомбинационных обменов (ЧРО).

2) Исследовать пути нормализации или ограничения гиперрекомбинационной активности в клетках Е. coli, несущих гиперактивный белок Ree A Dl 12R.

3) Выделить и очистить белок Ree A D112R, сравнить его биохимические свойства с белком RecA дикого типа.

4) Исследовать особенности регуляции филамента RecAD112R вспомогательными белками, такими как белки SSB, F'SSB, PsiB, LexA, RecX. Провести сравнение с другими гиперактивными мутантными белками RecA.

5) Изучить связи между ДНК-синаптазной активностью белков RecAEc, RecA D112R, RecA Е38К и RecA АС17 in vitro и рекомбинационной активностью клеток, экспрессирующих эти белки.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на XI, XII и XIV Международных школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2007, 2008 и 2010 гг.), на семинарах Политехнического симпозиума «Молодые ученые — промышленности Северо-Западного региона» (Санкт-Петербург, 2005, 2006 и 2010 гг.), на II научной конференции «Молекулярная генетика, биофизика и медицина» (Бреслеровские чтения-Ii) (Санкт-Петербург, 2006), на Всероссийском форуме студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и инновации в технических университетах» (Санкт-Петербург, 2008) и «Russian-Swiss Workshop on Regulation of genome stability by DNA replication» and repair» (Санкт-Петербург, 2010).

Основные положения, выносимые на защиту:

2) В популяции клеток Е. coli с аномально высокой RecADl 12Я-зависимой рекомбинацией наблюдается постепенная селекция клеток со сниженной гиперрекомбинацией. Селекция приводит к снижению рекомбинационной активности до нормального уровня.

3) Мутантный белок RecA Dl 12R по сравнению с белком RecAEc обладает: а) повышенной способностью расплавлять вторичные структуры на онДНК; б) повышенной способностью смещать белок SSB с онДНК, в том числе при снижении концентрации ионов магния в реакционной смеси; в) повышенной способностью смещать белок F'SSB с онДНК; г) повышенной устойчивостью к ингибирующему воздействию белков PsiB и RecX; д) повышенной скоростью проведения реакции обмена нитей ДНК при снижении концентрации ионов магния в реакционной смеси.

5) Высокая рекомбиногенность мутантного белка RecA D112R обеспечивается повышенной скоростью инициирования синаптазной реакции.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Дудкина, Александра Валентиновна

ГЛАВА 4 ВЫВОДЫ

1) Белок Ree A D112R увеличивает частоту рекомбинационных обменов на единицу длины ДНК in vivo в 52 раза, являясь наиболее рекомбинационно активным из изученных на сегодняшний день мутантных белков RecA.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дудкина A.B., Швецов A.B., Бакланова И.В., Байтин Д.М. Изменение динамики филаментации белка RecA, вызванное аминокислотной заменой D112R либо замещением АТР на dATP, приводит к устойчивости филамента к действию белка RecX // Мол. Биол. - 2011. Т.45. - №3. - С. 546-553.

2. Дудкина A.B., Бахланова И.В., Байтин Д.М. Новый механизм увеличения частоты рекомбинационных обменов путем повышения синаптазной активности белка RecA из Escherichia coli //ДАН. - 2010. - Т.432. - С. 120-122.

3. Bakhlanova I.V., Dudkina A.V., Baitin D.M., Knight K.L., Сох М.М., Lanzov V.A., Modulating cellular recombination potential through alterations in RecA structure and regulation // Mol. Microbiol. - 2010. - V. 78. - P.1523-1538.

4. Dudkina A.V., Bakhlanova I.V. and Lanzov V.A. Normalization of recombination activity of RecA protein in Escherichia coli cells // «Russian-Swiss Workshop on Regulation of genome stability by DNA replication and repair (July 7-9, 2010, St. Petersburg, Russia)». - 2010. - P.41.

5. Дудкина A.B., Бахланова И.В., Ланцов B.A., Байтин Д.М:, Кокс М.М. Влияние точечной мутации [D112R] на рекомбинационную активность белка RecA из Escherichia coli in vitro // «Молодые ученые — промышленности Северо-Западного региона: материалы конференций политехнического симпозиума (20 мая 2010 года)». - 2010.- С.202-203.

6. Дудкина A.B., Байтин Д.М., Ланцов В.А. Влияние точечной мутации [D112R] на рекомбинационную активность белка RecA из Escherichia coli II «БИОЛОГИЯ -НАУКА XXI ВЕКА: 14-я Путинская международная школа-конференция молодых ученых», (Пущино, 19 - 23 апреля 2010 года)», сборник тезисов. - 2010. - Т. 2. - С. 130-131.

7. Дудкина A.B., Бахланова И.В., Ланцов В.А. Нормализация рекомбиназной активности белка RecA в клетках Escherichia coli //«Наука и инновации в технических университетах», материалы всероссийского форума студентов, аспирантов и молодых ученых. — 2008. - С.178-179.

8. Дудкина A.B., Бахланова И.В., Ланцов В.А. Рекомбиназная активность белка RecA в клетках Escherichia coli: ее регуляция и влияние на систему биологической подвижности // «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА: 12-я Путинская международная школа-конференция молодых ученых», (Пущино, 10-14 ноября 2008 года)», сборник тезисов. - 2008. - С.21-22.

9. Дудкина А.В., Ланцов В.А. Регуляция гиперрекомбиназной активности белка RecA в клетках Escherichia coli //«Биология — наука XXI века: Пая конференция молодых ученых в Пущино», сборник тезисов. - 2007. — С.77.

10. Ланцов В.А., Бахланова И.В., Дудкина А.В. и Киль Ю.В. Регулирование рекомбиназной активности у бактерий // Бреслеровские чтения 2 (2006): Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня. — ред. Ланцов В. — Издательство ПИЯФ РАН - 2007. - С. 110-123.

11. Дудкина А.В., Ланцов В.А. Структурно-функциональные изменения в геноме Escherichia coli, связанные с гиперрекомбиназной активностью белка RecA // «Молодые ученые - промышленности Северо-Западного региона», материалы семинаров политехнического симпозиума. — 2006. — С. 186.

12. Дудкина А.В., Ланцов В.А. Гиперрекомбинация: роль интерфейса межсубъединичного взаимодействия в активном филаменте белка // «Молодые ученые - промышленности Северо-Западного региона», материалы семинаров политехнического симпозиума. — 2005. — С. 37-38.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На общий рекомбиногенный потенциал бактериальных клеток воздействует множество факторов, среди которых наиболее важными являются рекомбинационные функции, присущие самому белку RecA. Точечные мутации в RecA, особенно в области высоко консервативных аминокислотных остатков, могут оказывать значительное влияние на наблюдаемую частоту рекомбинационных обменов in vivo, существенно большее, чем освобождение RecA от ограничений, налагаемых любым из известных на сегодняшний день регуляторных механизмов. Одна из групп таких остатков расположена в области мономер-мономерного взаимодействия- филамента RecA. Анализ частоты рекомбинационных обменов для 16 мутантных белков с точечными мутациями в этой области позволил выявить белок RecA D112R, демонстрирующий наиболее выраженную рекомбинационную активность in vivo среди всех исследованных на сегодняшний день белков RecA (увеличение ЧРО в 52 раза по сравнению с белком RecA дикого типа). При этом повышенная рекомбиногенность этого белка проявляется на фоне почти полного отсутствия SOS-ответа, что обычно не характерно для белков RecA из Е. coli. Нас заинтересовали биохимические характеристики, ответственные за аномально высокую рекомбиногенность белка RecA Dl 12R.

Скорость гидролиза АТФ белком RecA Dl 12R при 37°С в присутствии он ДНК фага М13 и белка SSB не отличается от скорости, характерной для белка RecAEc в тех же условиях и уступает ей при реакцишс использованием поли(дТ) и в отсутствии SSB. Белок RecA D112R отличается повышенной скоростью связывания с онДНК фага М13 в отсутствии белка SSB. Кроме того, белок RecA D112R характеризуется способностью более эффективно смещать белки SSB и F'SSB с онДНК, чем RecAEc, особенно при снижении концентрации ионов Mg в реакционной смеси с 10 мМ до 4 мМ. Точечная замена D112R не оказывает значительного влияния на скорость расщепления белка LexA белком RecA D112R по сравнению с белком дикого типа. Кроме того, было обнаружено, что RecA D112R более устойчив к действию таких ингибирующих АТФазную активность белков, как RecX и PsiB.

Перечисленные выше биохимические свойства белка RecA D112R, такие как устойчивость к действию белка RecX и более эффективное конкурирование с белком SSB за сайты связывания на онДНК, чем у белка RecAEc, делают его полезным инструментом для изучения механизма регуляции филамента RecA белком RecX. Сравнение биохимических активностей белков RecAEc и RecA D112R в присутствии белков SSB и/или RecX позволило предложить модель, в которой повышенная устойчивость мутанта

Ree A D112R к RecX может определяться в ходе особых конкурентных отношений с белком SSB. При этом филамент RecA D112R обладает устойчивостью к RecX и в эксперименте с поли(дТ) и при полном отсутствии SSB. В то же время модель, построенная методом молекулярного моделирования и докинга, показывает, что прямой контакт между аминокислотным остатком в 112 положении и белком RecX невозможен ни при каких конформационных изменениях, не нарушающих структуру филамента белка RecA.

Нами была предложена модель, в которой мономеры мутантного белка RecA в ходе элонгации филамента эффективно опережают связывание RecX с его растущим концом. Это объясняет преимущество RecA с повышенной динамикой филаментации, вызванной заменой D112R либо использованием дАТФ вместо АТФ, и одновременно разъясняет природу антагонизма между белками SSB и RecX: белок SSB занимает сайт онДНК перед филаментом и удерживает пространство на этом участке ДНК от взаимодействия с RecX, позволяя новым мономерам RecA достраивать филамент.

Сравнение этих биохимических характеристик белка RecA D112R с характеристиками изученных ранее белков RecA Е38К и RecA ДС17, также отличающихся повышенной рекомбиногенностью in vivo, показало, что RecA D112R, превосходя RecAEc и RecA ДС17, уступает белку RecA Е38К в способности смещать белки SSB и F'SSB с онДНК, а также противостоять ингибированию белками RecX и PsiB. При этом ранее было показано, что белок RecA Е38К демонстрируют менее выраженное увеличение ЧРО (в 7 раз), чем белок RecA D112R (АЧРО = 52). Таким, образом, перечисленные выше биохимические характеристики, приводящие к изменению стабильности пресинаптического комплекса, дают лишь относительный вклад в наблюдаемый повышенный рекомбинационный потенциал клетки.

Белок RecA D112R отличается от белка RecAEc в проведении биохимических реакций, проходящих не только на пресинаптической стадии с участием активного филамента RecA на онДНК, но и на синаптической стадии, включающей в себя поиск гомологичной молекулы днДНК и образование гетеродуплекса. Было показано, что белок RecA D112R быстрей, чем RecAEc производит образование объединенных молекул, особенно при снижении концентрации ионов Mg2+ в растворе с 12 до 4 мМ. Эксперимент, позволивший измерить скорость синаптазной реакции отдельно от процесса миграции ветви, показал, что скорость образования объединенных молекул белком RecA D112R выше, чем в реакции, проводимой белком RecA дикого типа, а также белком RecA Е38К. Эта тенденция усиливается при снижении концентрации ионов Mg2+ в реакционной смеси с 12 до 2 мМ. В течение нескольких десятилетий in vitro использовалось искусственное добавление 8-10 мМ свободных ионов Mg , которое позволяло создать более активную форму филамента, обеспечивающую эффективную реакцию обмена нити (Сох and Lehman, 1981; Lusetti et al.„ 2003). Это состояние, обеспечиваемое высоким содержанием ионов Mg2+, называют состоянием Ао или открытой формой состояния A (Haruta et al., 2003). Мы предполагаем, что остаток аргинина в положении 112 в центральном домене белка RecA D112R может стабилизировать форму филамента Ree А, которая ближе к Ао-или Р-подобным состояниям, чем это может быть достигнуто белком дикого типа в бактериальной клетке. Преимущества в образовании объединенных молекул ДНК, присущие этому мутантному белку, особенно заметны при низких концентрациях ионов магния, вероятно, более характерных для условий, встречающихся in vivo.

Остаток 112 находится в петле между a-спиралями D и Е в структуре RecA (Story and Steitz, 1992; Chen et al., 2008). Этот остаток не является высококонсервативным среди бактериальных белков RecA (Brendel et al., 1997), так что допустимы другие мутации в этом положении в белке RecAEc, и они не вызывают повреждения его рекомбинационных функций (McGrew and Knight, 2003). Эта короткая петля может быть одним из участков структуры белка, где эволюционная адаптация рекомбинационного потенциала возможна без ущерба для структуры центрального домена RecA.

На сегодняшний день белок RecA Dl 12R является единственным из исследованных мутантных белков RecA, характеризующихся повышенной рекомбиногенностью, чей путь усиления рекомбинационной активности связан с качественным изменением такой функции филамента, как поиск гомологичной нити ДНК для инициирования синаптазной реакции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дудкина, Александра Валентиновна, Санкт-Петербург

1. Adams D.E., West S.C. Unwinding of closed circular DNA by the Escherichia coli RuvA and RuvB recombination/repair proteins // J. Mol. Biol. 1995. - V.247. - N.3. - P.404-417.

2. Adelberg E.A., Burns S.M. Genetic variation in the sex factor of Escherichia coli. II J. Bacteriol. 1960. - V.79. - P.321-330.

3. Adzuma K. Stable synapsis of homologous DNA molecules mediated by the Escherichia coli RecA protein involves local exchange of DNA strands // Genes. And Develop.-1992. V.6.-N.9. -P.1679-1694.

4. Arenson T.A., Tsodikov O.V. and Cox M.M. Quantitative analysis of the kinetics of end-dependent disassembly of RecA filaments from ssDNA // J. Mol. Biol. 1999. - V.288. -P.391-401.

5. Asai T. and Kogoma T. The RecF pathway of homologous recombination can mediate the initiation of DNA damage-inducible replication of the Escherichia coli chromosome // J. Bacteriol. 1994. - V.176. - P.7113-7114.

6. Bagdasarian M., Bailone A., Angulo J.F., Scholz P., and Devoret R. PsiB, an anti-SOS protein, is transiently expressed by the F sex factor during its transmission to an Escherichia coli K-12 recipient // Mol. Microbiol. 1992. - V.6. - P.885-893.

7. Bagdasarian M., Bailone A., Bagdasarian M.M., Manning P.A., Lurz R., Timmis K.N. and Devoret R. An inhibitor of SOS induction, specified by a plasmid locus in Escherichia coli II Proc. Natl Acad. Sei. USA. 1986. - V.83. - P.5723-5726.

8. Bailone A., Backman A., Sommer S., Celerier J., Bagdasarian M.M., Bagdasarian M. and Devoret R. PsiB polypeptide prevents activation of RecA protein in Escherichia coli 11 Mol. Gen. Genet. 1988. - V.214. - P.389-395.

9. Baitin D.M., Bakhlanova I.V., Chervyakova D.V., Kil Y.V., Lanzov V.A. and Cox, M.M. Two RecA protein types that mediate different modes of hyperrecombination // J. Bacteriol. 2008. - V. 190. -P.3036-3045.

10. Baitin D.M., Bakhlanova I.V., Kil Y.V., Cox M.M. and Lanzov, V.A. Distinguishing characteristics of hyperrecombinogenic RecA protein from Pseudomonas aeruginosa acting in Escherichia coli II J. Bacteriol. 2006. - V.188. - P.5812-5820.

11. Bakhlanova I.V., Ogawa T. and Lanzov V.A. Recombinogenic activity of chimeric recA genes (.Pseudomonas aeruginosa/Escherichia coli): a search for RecA protein regions responsible for this activity // Genetics. 2001. - V.159. - P.7-15.

12. Beernink H.T.H. and Morrical S.W. RMPs: recombination/replication mediator proteins // TIBS. 1999. - V.24. - P.385-389.

13. Bianchi M.E. and Radding C.M. Insertions, deletions and mismatches in heteroduplex DNA made by RecA protein// Cell. 1983. - V.35. - P.511-520.

14. Bianco P. and Weinstock G. Characterization of RecA1332 in vivo and in vitro. A role for alpha-helix E as a liaison between the subunit-subunit interface and the DNA and ATP binding domains of RecA protein // Genes to Cells. 1998. - V.3. - P.79-97.

15. Bianco P.R. and Kowalczykowski S.C. RecA protein // London: Encyclopedia of Life Sciences. Nature Publishing Group. 2005. http://www.els.net.

16. Bidnenko V., Seigneur M., Penel-Colin M., Bouton M.F., Ehrlich S.D. and Michel B. sbcS sbcC null mutations allow RecF-mediated repair of arrested replication forks in rep recBC mutants // Mol. Microbiol. 1999. - V.33. - P.846-857.

17. Bishop A.J. and Schiestl R.H. Role of homologous recombination in carcinogenesis // Exp. Mol. Phatol. 2003. - V.74. - P.94-105.

18. Blaho J.A. and Wells R.D. Left-handed Z-DNA and genetic recombination // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1989. - V.37. - P. 107-126.

19. Blaho J.A. and Wells R.D. Left-handed Z-DNA binding by the RecA protein of Escherichia coli II J. Biol. Chem.-1987. V.262. - N.13. - P.6082-6088.

20. Bork J.M., Cox M.M. and Inman R.B. RecA protein filaments disassemble in the 5' to 3' direction of single-stranded DNA // J. Biol. Chem. 2001. - Y.276. - P.45740-45743.

21. Brendel V., Brocchieri L., Sandler S.J., Clark A.J. and Karlin S. Evolutionary comparisons of RecA-like proteins across all major kingdoms of living organisms // J. Mol. Evol. 1997. - V.44. - P.528-541.

22. Brenner S.L., Mitchell R.S., Morrical S.W., Neuendorf S.K., Schutte B.C., Cox M.M. RecA protein-promoted ATP hydrolysis occurs throughout RecA nucleoprotein filaments //J. Biol. Chem. 1987. - V.269. -N.9. - P.4011-4016.

23. Bresler S.E., Krivonogov S.V. and Lanzov V.A. Scale of the genetic map and genetic control of recombination after conjugation in Escherichia coli K-12 // Mol. Gen. Genet.-1978. V.166. - P.337-346.

24. Briggs G.S., McEwan P.A., Yu J., Moore T., Emsley J. and Lloyd R.G. Ring structure of the Escherichia coli DNA binding protein RdgC associated with recombination and replication fork repair// J. Biol. Chem. 2007. - V.282. - P. 12353-12357.

25. Britt R.L., Haruta N., Lusetti S.L., Chitteni-Pattu S., Inman R.B. and Cox M.M. Disassembly of Escherichia coli RecA E38K/AC17 nucleoprotein filaments is required to complete DNA strand exchange // J. Biol. Chem. 2010. - V.285. - P.3211-3226.

26. Bryant F.R., Riddles P.W., Lehman I.R. Studies of the mechanism of DNA pairing by the RecA protein of Escherichia coli // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1984. -V.49. - P.535-539.

27. Burnet B., Rao B.J., Jwang B., Reddy G., Radding C.M. Resolution of the three-stranded recombination intermediate made by RecA protein. An essential role of ATP hydrolysis // J. Mol. Biol. 1994. - V.238. - P.540-554.

28. Cazaux C., Mazard'A.M. and Defais M. Inducibility of the SOS response in a recA730 or recA441 strain is restored by transformation with a new recA allele // Mol. Gen. Genet. — 1993. — V.240. — P.296-301.

29. Cazenave C., Toulme J.J: and Helene C. Binding of RecA protein to single-stranded nucleic acids: spestroscopic studies using fluorescent polynucleotides // EMBO J. — 1983. V.2. P.2247-2251.

30. Chen Z., Yang H. and Pavletich N.P. Mechanism of homologous recombination from the RecA-ssDNA/dsDNA structures //Nature. 2008. - V.453! - P.489-454.

31. Chen Z., Yang H. and Pavletich N.P. Mechanism of homologous recombination from the RecA-ssDNA/dsDNA structures //Nature. 2008. - V.453. - P.489-454.

32. Chow S.A., Rao B.J. and Radding C.M. Reversibility of strand invasion promoted by RecA protein and its inhibition.by Escherichia coli single-stranded DNA-binding protein or phage T4 gene 32 protein // J. Biol. Chem. 1988. - V.263: - P.200-209.

33. Clark A.J. and Margulies A.D. Isolation and characterisation of recombination-deficient mutants of Escherichia coli K12 // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1965. - V.53. - P.451-459.

34. Clark AJ. and Sandler S.J. Homologous genetic recombination: the pieces begin to fall into place // Crit. Rev. Microbiol. 1994. - V.20. - P.125-142.

35. Courcelle J., Carswell-Crumpton C., and Hanawalt P. recF and recR are required for the resumption of replication at DNA replication forks in Escherichia coli II Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1997. - V.94. - P.3714-3719.

36. Courcelle J., Khodursky A., Peter B., Brown P.O. and Hanawalt P.C. Comparative gene expression profiles following UV exposure in wild-type and SOS-deficient Escherichia colill Genetics. 2001. - V.158. - P.41-64.

37. Cox J.M., Abbott S.N., Chitteni-Pattu S., Inman R.B. and Cox M.M. Complementation of one RecA protein point mutation by another. Evidence for trans catalysis of ATP hydrolysis // J. Biol. Chem. 2006. - V.281. - P.12968-12975.

38. Cox J.M., Li H., Wood E.A., Chitteni-Pattu S., Inman R.B. and Cox, M.M. Defective dissociation of a 'Slow' RecA mutant protein imparts an Escherichia coli growth defect // J. Biol. Chem. 2008. - V.283. - P.24909-24921'.

39. Cox M.M. and Lehman I.R. Directionality and polarity in RecA protein-promoted branch migration // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1981. - Y.78. - P.6018-6022.

40. Cox M.M. and Lehman I.R. Enzymes of general recombination // Annu. Rev. Biochem. -1987. V.56. - P.229-262.

41. Cox M.M. and Lehman I.R. RecA protein-promoted DNA strand exchange. Stable complexes of RecA protein and single-stranded DNA formed in the presence of ATP and single-stranded DNA binding protein // J. Biol. Chem. 1982. - V.257. - P.8523-8532.

42. Cox M.M. Recombinational DNA repair in bacteria and the RecA protein // Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 1999. -V.63. -P.311-366.

43. Cox M.M. Regulation of Bacterial RecA Protein Function // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2007. - V.42. - P.41-63.

44. Cox M.M. The bacterial RecA protein as a motor protein // Annu. Rev. Microbiol. -2003. V.57. -P.551-577.

45. Cox M.M. The RecA protein // In The Bacterial Chromosome. Higgins, N.P. (ed.). Washington, DC: American Society of Microbiology. 2004. - P.369-388.

46. Cox M.M. Why does RecA protein hydrolyze ATP? // Trends Biochem: Sciences. 1994. - V. 19.-P.217-222.

47. Cox M.M., Goodman M.F., Kreuzer K.N., Sherratt D.J., Sandler S.J., and Marians K.J. The importance of repairing stalled replication forks. // Nature. 2000. - V. 404. - P. 3741.

48. Cox M.M., McEntee K. and Lehman I.R. A simple and rapid procedure for the large scale purification of the RecA protein of Escherichia coli II J. Biol. Chem. 1981. -V.256.-P. 4676-4678.

49. Craig N.C., Roberts J.W. Function of nucleoside triphosphate and polynucleotide in Escherichia coli RecA protein-directed cleavage of phage X repressor // J. Biol. Chem.-1981.-V.256.-P.8039-8044.

50. De Mot R., Schoofs G. and Vanderleyden J. A putative regulatory gene downstream of recA is conserved in gram-negative and gram-positive bacteria // Nucleic Acids Research. 1994. - V.22. - P. 1313-1314.

51. Delver E.P. and Belogurov A.A. Organization of the leading region of incn plasmid pkmlOl (r46)—a regulon controlled by cup sequence elements // J. Mol. Biol. 1997. — V.271. — P.13-30.

52. DiCapua E., Schnarr M., Ruigrok R.W., Lindner P., Timmins P.A. Complexes of RecA protein in solution. A study by small angle neutron scattering // J. Mol. Biol. 1990. -V.214. - N.2. - P.557-570.

53. Dixon D.A., Kowalczykowski S.C. The recombination hotspot, Chi, is a regulatory sequence that acts by attenuating the nuclease activity of the Escherichia coli RecBCD enzyme // Cell. 1993. - V.73. - P.87-96.

54. Drees J.C., Chitteni-Pattu S., McCaslin D.R., Inman R.B. and Cox, M.M. Inhibition of RecA protein function by the RdgC protein from Escherichia coli II J. Biol. Chem. -2006. V.281. - P.4708-4717.

55. Drees J.C., Lusetti S.L. and Cox M.M. Inhibition of RecA protein by the Escherichia coli RecX protein—Modulation by the RecA C terminus and filament functional state // J. Biol. Chem. 2004a. - V.279. - P.52991-52997.

56. Drees J.C., Lusetti S.L., Chitteni-Pattu S., Inman R.B., and Cox M.M. A RecA filament capping mechanism for RecX protein. // Mol. Cell. 2004b. - V. 15. - P.789-798.

57. Dressier D. and Potter H. Molecular^ mechanism in genetic recombination // Ann. Rev. Biochem. 1982. - V.51. - P.727-761.

58. Egelman E.H. and Stasiak A. Structure of helical RecA-DNA complexes. II. Local conformational changes visualized in bundles of RecA-ATP gamma S filaments // J. Mol. Biol. 1988. - V.200. - P.329-349.

59. Eggler A.L., Lusetti S.L. and Cox M.M. The C terminus of the Escherichia coli RecA protein modulates the DNA binding competition with single-stranded DNA-binding protein 11 J. Biol. Chem. 2003. - V.278. - P.16389-16396.

60. Eldin S., Forget A.L., Lindenmuth D.M., Logan K.M. and Knight K.L. Mutations in the N-terminal region of RecA that disrupt the stability of free protein oligomers but not RecA-DNA complexes // J. Mol. Biol. 2000. - V.299. - P.91-101.

61. Ferrin L.J. and Camerini-Otero R.D. Sequencespecific ligation of DNA using RecA protein // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1998. - V.95. - P.2152-2157.

62. Foster P.L. Stress responses and genetic variation in bacteria // Mut. Res. 2005. -V.569. — P.3-11.

63. Frank E.G., Hauser J., Levine A.S., Woodgate R. Targeting of the UmuD, UmuD1, and MucA' mutagenesis proteins to DNA by RecA protein // Proc. Natl Acad. Sci. USA. -1993. V.90. - P.8169-8173.

64. Freifelder D. Studies with E. coli sex factors // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. -1968. V.33.-P.425-431.

65. Galletto R. and Kowalczykowski S.C. RecA//Curr. Biol.-2007.-V. 17(ll).-P.395-397.

66. Gonda D.K. and Radding C.M. The mechanism of the search for homology promoted by RecA protein // J. Biol. Chem. 1986. - V.261. - P.13087-13096.

67. Gonda D.K., Shibata T. and Radding C.M. Kinetics of homologous pairing promoted by RecA protein: effects of end and internal sites in DNA // Boichemistry.-1985.-V.24.-P.413-420.

68. Grunberg-Manago M. Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages // Annu. Rev. Genet. 1999. - V.33. - P. 193-227.

69. Gupta R.C., Golub E.I., Wold M.S. and Radding C.M. Polarity of DNA strand exchange promoted by recombination proteins of the RecA family // Proc. Natl Acad. Sci. USA. -1998. V.95. - P. 9848-9848.

70. Haldane J.B.S. The combination of lineage values and the calculation of distance between the loci of linked factors II J. Genet. 1919. - V.8. - P.299-309.

71. Haruta N., Yu X., Yang' S., Egelman E.H. and Cox M.M. A DNA pairing-enhanced conformation of bacterial RecA proteins // J. Biol. Chem. 2003. - V.278. - P.52710-52723.

72. Heuser J. and Griffith J. Visualization of RecA protein and its complexes with DNA by quick-freeze/deep-etch electron microscopy // J. Mol. Biol. 1989. - V.210. - P.473-484.

73. Holliday R. A mechanism for gene conversion in fungi // Genet. Res. Camb. 1964. -V.5. - P.282-304.

74. Horii T., Ogawa T., Nakatani T., Hase T., Matsubara H., Ogawa H. Regulation of SOS-functions: purification of E. coli Lex A protein and determination of its specific site cleaved by the RecA protein // Cell. 1981. - V.27. - P.515-522.

75. Ippen-Ihler K.A. and Minkley E.G.Jr. The conjugation system of F, the fertility factor of Escherichia coli I I Annu. Rev. Genet. 1986. - V.20. - P.593-624.

76. Jones A.L., Barth P.T. and Wilkins B.M. Zygotic induction of plasmid ssb and psiB genes following conjugative transfer of Incll plasmid Collb-P9 // Mol. Microbiol. 1992. — V.6.-P.605-613.

77. Jwang B. and Radding C.M. Torsional stress generated by RecA protein during DNA strand exchange separates strands of a heterologous insert // Proc. Natl Acad. Sci. USA. -1992. — V.89. P.7596-7600.

78. Kahn R., Radding C.M. Separation of the presynaptic and synaptic phases of homologous pairing promoted by RecA protein. // J. Biol. Chem. 1984. - V.259. - P.7495-7503.

79. Kato R. and Kuramitsu S. Characterization of thermostable RecA protein and analysis of its interaction with single-stranded DNA // Eur. J. Biochem. 1999. - V.259. - P.592-601.

80. Kenyon C.J. and Walker G.C. DNA-damaging agents stimulate gene expression at specific loci in Escherichia coli // Proc. Natl Acad: Sci. USA. 1980. - V.77. - P.2819-2823.

81. Kim J., Heuser J. and Cox M.M. Enhanced RecA protein binding to Z DNA represents a kinetic perturbation of a general duplex DNA binding Pathway // J. Biol. Chem. 1989. -V.164. - P.21848-21856.>

82. Kojima M., Suzuki M., Morita T., Ogawa T., Ogawa H. and Tada M. Interaction of RecA protein with pBR322 DNA modified by N-hydroxy-2-acetylaminofluorene and 4-hydroxyaminoquinoline 1-oxide //Nucl. Acids Res. 1990. - V.18. - N.9. - P.2707-2714.

83. Konforti B.B. and Davis R.W. ATP hydrolysis and the displaced strand are two factors that determine of RecA-promoted DNA strand exchange // J. Mol. Biol. 1992: - V.227. -P.38-53.

84. Konforti B.B. and Davis R.W. The preference for a 3' homologous end is intrinsic to RecA-promoted strand exchange // J. Biol. Chem. 1990. - V.265. - P.6916-6920.

85. Kowalczykowski S.C. and Eggleston A.K. Homologous pairing and DNA strandexchange proteins // Annu. Rev. Biochem. 1994. - V.63. - P.991-1043.

86. Kowalczykowski S.C. and Krupp R.A. Effects of Escherichia coli SSB protein on the single-stranded DNA-dependent ATPase activity of Escherichia coli RecA protein // J. Mol. Biol. 1987. - V.193. - P.97-113.

87. Kowalczykowski S.C. Biochemistry of genetic recombination: energetics and mechanism of DNA strand exchange // Annu. Rev. Biophys. Chem. 1991. - V.20. - P.539-575.

88. Kowalczykowski S.C., Dixon D.A., Eggleston A.K., Lauder S.D., Rehrauer W.M. Biochemistry of homologous recombination in Escherichia coli II Microbiol. Rev. -1994. V.58. - N.3. - P.401-465.

89. Kreuzer K.N. Interplay between DNA replication and recombination in prokaryotes // Ann. Rev. Microbiol. 2005. - V.59. - P.43-67.

90. Kurumizaka H., Aihara H., Ikawa S. and Shibata T. Specific defects in double-stranded DNA unwinding and homologous pairing of a mutant RecA protein // FEBS Lett. 2000. - V.477. - P.129-134.

91. Kuzminov A. Recombinational repair of DNA damage in Escherichia coli and bacteriophage lambda// Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. - V.63. - P.751-813.

92. Laemmly U.K. Cleavage of structural proreins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - V.227. - P.680-685.

93. Lanzov V., Stepanova I., Vinogradskaja G. Genetic control of recombination exchange frequency in Escherichia coli K-12 // Biochimie. 1991. - V.73. - P.305-312.

94. Lauder S.D. and Kowalczykowski S.C. Asymmetry in the recA protein-DNA filament // J. Biol: Chem. -1991. Y.266. - P.5450-5458.

95. Lavery P.E. and Kowalczykowski S.C. Biochemical-basis of the constitutive repressor cleavage activity of recA730 protein. A comparison to recA803 proteins // J. Biol. Chem. 1992. - V.267. - P:20648-20658.

96. Lavery P.E. and Kowalczykowski S.C. Properties of RecA441 protein-catalyzed DNA strand exchange can be attributed to an enhanced ability to compete with SSB protein II J. Biol. Chem. 1990. - V.265. - P.4004-4010.

97. Leahy M.C. and Radding C.M. Topography of the interaction of recA protein with single-stranded deoxyoligonucleotides // J. Biol. Chem. 1986. - V.261. - P.6954-6960.

98. Lee J.W. and Cox M.M. Inhibition of recA protein promoted ATP hydrolysis. 1. ATPgS and ADP are antagonistic inhibitors // Biochemistry. 1990. - V.29. - P.7666-7676.

99. Lindsley J.E., Cox M.M. Assembly and disassembly of RecA protein Filaments occur at opposite filament ends. Relationship to DNA strand exchange // J. Biol. Chem. — 1990. V.265. - P.9043-9054.

100. Lindsley J.E., Cox M.M. Dissociation pathway for recA nuclear protein filaments formed on linear duplex DNA // J. Mol. Biol.-1989.-V.205.-P.695-711.

101. Little J.W. and Mount D.W. The SOS regulatory system of Escherichia coli II Cell. 1982.-V.29.-P. 11-22.

102. Little J.W. Autodigestion of LexA and phage repressor // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1984. - V.81. - P.1375-1379.

103. Lloyd R.G. and Sharpies G.J. Genetic analysis of recombination in procaryotes // Curr. Opin. Genet. Dev. 1992. - V.2. - P.683-690.

104. Lloyd R.G. Hyper-recombination in Escherichia coli K-12 mutants constitutive for protein X synthesis // J. Bact. 1978. - V.134. - N.3. - P.929-935.

105. Logan K.M., Forget A.L., Verderese J.P. and Knight K.L. ATP-Mediated Changes in Cross-Subunit Interactions in the RecA Protein // Biochemistry. — 2001. — V. 40.-P.l 1382-11389.

106. Lohman T.M., Bujalowski W. and Overman L.B. Interactions of the E. coli single strand binding (SSB) protein with ss nucleic acids. Binding mode transitions and equilibrium binding studies // Biochem. Pharmacol. 1988. - V.37. - P.1781-1782.

107. Lusetti S.L, Shaw J.J. and Cox M.M. Magnesium ion-dependent activation of.the RecA protein involves the C terminus // J. Biol. Chem. 2003. - Y.278. - P. 16381-16388.

108. Lusetti S.L. and Cox M.M. The bacterial RecA protein and the recombinational DNA repair of stalled replication forks // Annu. Rev. Biochem. 2002. - V.71. - P.71-100.

109. Lusetti S.L., Drees J.C., Stohl E.A., Seifert H.S. and Cox M.M. The DinI and RecX proteins are competing modulators of RecA functions // J. Biol. Chem. 2004a. -V.279. - P.55073-55079.

110. Lusetti S.L., Hobbs M.D., Stohl E.A., Chitteni-Pattu S., Inman R.B., Seifert, H.S. and Cox, M.M. The RecF protein antagonizes RecX function via direct interaction // Mol. Cell. 2006. - V.21. - P.41-50.

111. Lusetti S.L., Voloshin O.N., Inman R.B., Camerini-Otero R.D. and Cox M.M. The DinI protein stabilizes RecA protein filaments // J. Biol. Chem. 2004b. - Y.279. -P.30037-30046.

112. Madiraju M.V., Lavery P.E., Kowalczykowski S.C. and Clark A.J. Enzymatic properties of the RecA803 protein, a partial suppressor of recF mutations // Biochemistry. 1992. -V.31. - P. 10529-10535.

113. Malkov V.A. and Camerini-Otero R.D. Photocross-links between single-stranded DNA and Escherichia coli RecA protein map to loops LI (amino acid residues 157-164) and L2 (amino acid residues 195-209) // J. Biol. Chem. 1995. - V.270. - P.30230-30233.

114. Marrione P.E. and Cox M.M. RuvB protein-mediated ATP hydrolysis: functional asymmetry in the RuvB hexamer // Biochemistry. 1995. - V.34. - P.9809-9818.

115. Masai H. and Arai K. Frpo: a novel single-stranded DNA promoter for transcription and for primer RNA synthesis of DNA replication // Cell. 1997. - V.89. -P.897-907.

116. Masui R., Mikawa T. and Kuramitsu S. Local folding of the N-terminal domain of Escherichia coli RecA controls protein-protein interaction // J. Biol. Chem. — 1997. — V.272. P.27707-27715.

117. Matic I., Rayssiguier C. and Radman M. Interspecies gene exchange in bacteria: the role of SOS and mismatch repair systems in evolution of species // Cell.-1995.-V.80.-P.507-515.

118. Mazin A.V. and Kowalczykowski S.C. The function of the secondary DNA-binding site of RecA protein during DNA strand exchange. // EMBO J.-1998.-V.17.-P.1161-1168.

119. McEntee K. Specialized transduction of recA by bacteriophage lambda // Virology. 1976. - V.70. - P.221-228.

120. McGrew D.A. and Knight K.L. Molecular design and functional organization of the RecA protein. // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2003. - V.38. - P.385-432.

121. Menetski J.P. and Kowalczykowski S.C. Enhancement of Escherichia coli RecA protein enzymatic function by dATP // Biochemistry. 1989. - V.28. - P.5871-5881.

122. Menetski J.P. and Kowalczykowski S.C. Interaction of RecA protein with single-stranded DNA. Quantitative aspects of binding affinity modulation by nucleotide cofactors//J. Mol. Biol. 1985,-V.181-P.281-295.

123. Menetski J.P. and Kowalczykowski S.K. Transfer of RecA protein from one polynucleotide to another. Effect of ATP and determination of the processivity of ATP hydrolysis during transfer // J. Biol. Chem. 1987. - V.262. - P.2093-2100.

124. Menetski J.P. and Kowalczykowski S.K. Transfer of RecA protein from one polynucleotide to another. Kinetic evidence for a ternary intermediate during the transfer reaction // J. Biol. Chem. 1987. - V.262. - P.2085-2092.

125. Menetski J.P., Bear D.G., Kowalczykowski S.C. Stable DNA heteroduplex formation catalyzed by the Escherichia coli. RecA protein in the absence of ATP hydrolysis // Proc. Natl Acad. Sei. USA. 1990. - V.87. - P.21-25.

126. Menetski J.P., Varghese A. and Kowalczykowski S.C. The physical and enzymatic properties of Escherichia coli RecA protein display anion-specific inhibition // J.Biol. Chem. 1992. - V.267. - P.10400-10404.

127. Menge K.L. and Bryant F.R. Effect ofi nucleotide cofactor structure on RecA protein-promoted DNA pairing. 1.Three strand exchange reaction // Biochemistry. — 1992. V.31.-P.5151-5157.

128. Meyer R.R., Laine P.S. The single-stranded DNA-binding protein in Escherichia coli II Molbiol. Rev. 1990. - V.54. - P.342-380;

129. Mikawa T., Masui R. and Kuramitsu S. RecA protein has extremely high cooperativity for substrate in its ATPase activity // J. Biochem. —' 1998. — V.123. P.450-457.

130. Mitchell A.H. and-West S.C. Hexameric rings of Escherichia coli RuvB protein. Cooperative assembly, processivity and ATPase activity // J. Mol. Biol. 1994. - V. 243. - P.208-215.

131. Moore T., McGlynn P., Ngo H.P., Sharpies G.J. and Lloyd R.G. The RdgC protein of Escherichia coli binds DNA and counters a toxic effect of RccFOR in strains lacking the replication restart protein PriA // EMBO J. 2003. - V.22. - P.735-745.

132. Morimatsu K. Horii T. and Takahishi M. Interaction of Tyrl03 and Tyr264 of the RecA protein with DNA and nucleotide cofactors. Fluorescence study of engineered proteins // Eur. J. Biochem. 1995. - V.228. - P.779-785.

133. Morrical S.W. and Cox M.M. Stabilization of RecA protein-ssDNA complexes by the single-stranded DNA binding protein of Escherichia coli // Biochemistry. 1990. -V.29. - P.837-43.

134. Namsaraev E.A., Baitin D., Bakhlanova I.V., Alexseyev A.A., Ogawa H. and Lanzov V.A. Biochemical basis of hyper-recombinogenic activity of Pseudomonasaeruginosa RecA protein in Escherichia coli cells // Mol. Microbiol. 1998. - V.27. — P.727-738.

135. Nayak S. and Bryant F.R. Differential rates of NTP hydrolysis by the mutant S69G.RecA protein. Evidence for a coupling of NTP turnover to DNA strand exchange // J. Biol. Chem. 1999. - V.274. - P.25979-25982.

136. Nguyen T.T., Muench K.A. and Bryant F.R. Inactivation of the RecA protein by mutation of histidine 97 or lysine 248 at the subunit interface // J. Biol. Chem. — 1993. -V.268. — P.3107-3113.

137. Ogawa T., Wabiko H., Tsurimoto T., Horii T., Masukata H. and Ogawa H. Characteristics of purified RecA protein and the regulation of its synthesis in vitro II Cold Spring I-Iarbor Symp. Quant. Biol. 1979. - V.43. - P.909-915.

138. Ogawa T., Yu X., Shinohara A. and Egelman E.N. Similarity of the yeast RAD51 filament to the bacterial RecA filament // Science. 1993. - V.259. - P.1896-1899.

139. Pages V., Koffel-Schwartz N. and Fuchs R.P. recX, a new SOS gene that is co-transcribed with the recA gene in Escherichia coli I I DNA Repair. 2003. - V.2. - P.273-284.

140. Pansegrau W. and Lanka E. Enzymology of DNA transfer by conjugative mechanisms // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1996. - Y.54. - P. 197-251.

141. Panyutin I.G., Hsieh P. The kinetics, of spontaneous DNA branch migration // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1994. - V.91. - P.2021-2025:

142. Papavinasasundaram K.G., Movahedzadeh F., Keer J.T., Stoker N.G., Colston M J. and Davis E.O. Mycobacterial recA is cotranscribed with a potential regulatory gene called recX // Mol. Microbiol. 1997. - Y.24. - P.141-153.

143. Petrova V., Chitteni-Pattu S., Drees J.C., Inman R.B. and Cox M.M. An SOS Inhibitor that Binds to Free RecA Protein: The PsiB Protein // Mol. Cell. 2009. - V.36. -P.121-130.

144. Pinsince J.M. and Griffith J.D. Early stages in RecA protein-catalyzed pairing. Analysis of coaggregate formation and non-homologous DNA contacts // J. Mol. Biol. -1992. V.228. - P.409-420.

145. Pugh B.F. and Cox M.M. High salt activation of RecA protein ATPase in the absence of DNA// J. Biol. Chem. 1988. - V.263. - P.76-83.

146. Pugh B.F. and Cox M.M. Stable binding of RecA protein to duplex DNA // J. Biol. Chem.-1987.-V.262.-N.3.-P. 1326-1336.

147. Pugh B.F., Schutte B.C. and Cox M.M. Extent of duplex DNA underwinding induced by recA protein binding in the presence of ATP // J. Mol. Biol. 1989. - V.205. -P.487-492.

148. Ragone S., Maman J.D., Furnham N., Pellegrini L. Structural basis for inhibition of homologous recombination by the RecX protein // EMBO J. 2008. - V.27. - P.2259-2269.

149. Rangarajan S., Woodgate R. and Goodman M.F. Replication restart in UV-irradiated Escherichia coli involving pols II, III, V, PriA, RecA and RecFOR proteins // Mol. Microbiol. 2002. - V.43. - P.617-628.

150. Rao B.J. and Radding C.M. Homologous recognition promoted by RecA protein via non-Watson-Crick bonds between identical DNA strands // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1993. - V.90. - P.6646-6650.

151. Register J.C. Ill and Griffith J. Direction of RecA protein assembly onto single strand DNA is the same as the direction of strand assimilation during strand exchange // J. Biol. Chem. 1985. - V.260. -N.22. - P.12308-12312.

152. Rehrauer W.M. and Kowalczykowski S.C. Alteration of the nucleoside triphosphate (NTP) catalytic domain within Escherichia coli recA protein attenuates NTP hydrolysis but not joint molecule formation // J. Biol. Chem. 1993. - V.268. - P. 12921297.

153. Robu M.E., Inman R.B. and Cox M.M. RecA protein promotes the regression of stalled replication forks in vitro II Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2001. 2001. - V. 98. - P. 8211-8218.

154. Roca A.I. and Cox M.M. RecA protein: structure, function and role in recombinational DNA repair // Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. 1997. - V.56. - P. 129223.

155. Roman L.J. and Kowalczykowski S.C. Relationship of the physical and enzymatic properties of Escherichia coli RecA protein to its strand exchange activity // Biochemistry. 1986. - V.25. - P.7375-7385.

156. Rould E.R., Muniyappa K. and Radding C.M. Unwinding of geterologous DNA by RecA protein during the search for homologous sequences // J. Mol. Biol. 1992. -V.226. — P.127-139.

157. Ryder L., Sharpies G.J. and Lloyd R.G. Recombination-dependent growth in exonuclease-depleted recBC sbcBC strains of Escherichia coli K-12 // Genetics. 1996. — V.143. — P.l 101-1114.

158. Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor. N.Y. 1989.

159. Sancar A. and Hearst J.E. Molecular matchmakers // Science. 1993. - V.259. -P.1415-1420.

160. Sandler S.J. Overlapping functions for recF and priA in cell viability and UV-inducible SOS expression are distinguished by dnaC809 in Escherichia coli K-12 // Mol. Microbiol. 1996. - V.19. - P.871-880.

161. Sano Y. Role of the recvi-related gene adjacent to the recA gene in Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriol. 1993. - V.175. - P.2451-2454.

162. Schlachter K., Phuong P., Cox M.M. and Goodman M.F. Roles of DNA polymerase V and RecA protein in SOS damage-induced mutation // Chem. Rev. — 2006. V.106. - P.406-419.

163. Schutte B.C. and Cox M.M. Homology-dependent changes-in adenosine 5'-triphosphate hydrolysis during RecA protein promoted DNA strand exchange: evidence for long paranemic complexes // Biochemistry. 1987. - Y.26. - P.5616-5625

164. Schütte B.C. and Cox M.M. Homology-dependent underwinding of duplex DNA in.recA protein generated paranemic complexes // Biochemistry. 1988. — V.27. -P.7886-7894.

165. Shah R., Cosstick R. and West S.C. The RuvC protein dimer resolves Holliday junctions by a dual incision mechanism that involves base-specific contacts // EMBO J. -1997.-V.16.-P.1464-1472.

166. Shan Q. and Cox M.M. RecA filament dynamics during DNA strand exchange reactions // J. Biol. Chem. 1997. - V.272. - P.l 1063-11073.

167. Shan Q. and Cox M.M. RecA protein dynamics in the interior of RecA nucleoprotein filaments // J. Mol. Biol. 1996. - V.257. - P.756-774.

168. Shan Q. Bork J.M. Webb B.L. Inman R.B. and Cox M.M. RecA protein filaments: end-dependent dissociation from ssDNA and stabilization by RecO and RecR proteins // J. Mol. Biol. 1997. - V.265. - P.519-540.

169. Shan Q., Cox M.M. and Inman R.B. DNA strand exchange promoted by RecA K72R. Two reaction phases with different'Mg2+ requirements // J. Biol. Chem. — 1996. — V.271. P.5712-5724.

170. Shevelev I.V., Kravetskaya T.P., Legina O.K. and Krutyakov V.M. 'External' proofreading of DNA replication errors and mammalian autonomous 3'—>5'exonucleases // Mutat. Res. 1996. - V.352. - P.51-55.

171. Shibata T., DasGaupta C., Cunningham R. and Rading C.M. Purified Escherichia coli RecA protein catalyzes homologous pairing of superhelical DNA and sigle-stranded fragments // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1979. - V.76. - N.4. - P. 1638-1642.

172. Silver M.S. and Fersht A.R. Investigation of binding between RecA protein and single-stranded polynucleotides with the aid of a fluorescent deoxyribonucleic acid derivative // Biochemistry. 1983. - V.22. - P.2860-2866.

173. Slilaty S.N., Rupley J.A., Little J.W. Intramolecular cleavage of LexA and phage lambda repressor: dependence of kinetic on repressor concentration, pH, temperature and solvent // Biochemistry. 1986. - V.25. - P.6866-6875.

174. Smith G.R. Homologous recombination in procaryotes // Microbiol. Rev. 1988. -V.5.-N.1.-P.1-28.

175. Stasiak A. Three-stranded DNA structure; is this the secret of DNA homologous recombination? // Mol. Microbiol. 1992. - V.6. - N.22. - P.3267-3276.

176. Stohl E.A. and Seifert H.S. The recXgene potentiates homologous recombination in Neisseria gonorrhoeae II Mol. Microbiol. 2001. - V.40. - P.1301-1310.

177. Stohl E.A., Brockman J.P., Burkle K.L., Morimatsu K., Kowalczykowski S.C. and Siefert H.S. Escherichia coli RecX inhibits RecA recombinase and coprotease activities in vitro and in vivo II J. Biol. Chem. 2003. - V.278. - P.2278.

178. Story R.M. and Steitz T.A. Structure of the RecA protein-ADP complex. // Nature. 1992. - V.355. - P.374-376.

179. Story R.M., Weber I.T. and Steitz T.A. The structure of the Escherichia coli RecA protein monomer and polymer // Nature. 1992. - Y.355. - P.318-325.

180. Sutton M.D., Smith B.T., Godoy V.G. and Walker G.C. The SOS response: recent insights into umuDC-dependent mutagenesis and DNA damage tolerance // Annu. Rev. Genet. 2000. - V.34. - P.479-497.

181. Szybalski W. Reca-mediated achilles heel cleavage // Curr. Opin. Biotechnol. — 1997. V.8. -P.75-81.

182. Takahashi M. and Norden B. Structure of Ree A-DNA complex and mechanism of DNA strand exchange reaction in homologous recombination // Adv. Biophysics. 1994. -V.30.-P.1-35.

183. Tateishi S., Horii T., Ogawa T. and Ogawa H. C-terminal truncated Escherichia coli RecA protein RecA5327 has enhanced binding affinities to single- and double-stranded DNAs // J. Mol. Biol. 1992. - V.223. - P. 115-129.

184. Tsang S.S., Chow S.A. and Radding C.M. Networks of DNA and RecA protein are intermediates in homologous pairing // Biochemistry. 1985. - V.24. - P.3226-3232.

185. Ullsperger C.J. and Cox M.M. Quantitative RecA protein binding to the hybrid duplex product of DNA strand exchange // Biochemistry. 1995. - V. 34. - P. 1085910866.

186. Umezu K. and Kolodner R.D. Protein interactions in genetic recombination in Escherichia coli. Interactions involving RecO and RecR overcome the inhibition of RecA by single-stranded DNA-binding protein // J. Biol. Chem. 1994. - V.269. - P.30005-30013.

187. Umezu K., Chi N.W. and Kolodner R.D. Biochemical interaction of the Escherichia coli RecF, RecO, and RecR proteins with RecA protein and single-stranded DNA binding protein // Proc. Natl Acad. Sei. USA. 1993. - V.90. - P.3875-3879.

188. Umlauf S.W., Cox M.M., Inman R.B. Triple-helical DNA pairing intermediates formed by RecA protein. //J. Biol. Chem. 1990. - V.265. - P.16898-16912.

189. Verhoef C. and de Haan P.G. Genetic recombination in Escherichia coli. I. Relation between linkage of unselected markers and map distance // Mutat. Res. 1966. -Y.3. - P.101-110.

190. Vierling S.,Weber T.,WohllebenW. and Muth G. Transcriptional and mutational analyses of the Streptomyces lividans recX gene and its interference with Ree A activity // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P.4005-4011.

191. Voloshin O.N., Ramirez B.E., Bax A. and Camerini-Otero R.D. A model for the abrogation of the SOS response by an SOS protein: a negatively charged helix in DinI mimics DNA in its interaction with RecA // Gene Develop. 2001. -V. 15. - P.415-427.

192. Walker G.C. Mutagenesis and inducible responses to deoxyribonucleic acid damage in Escherichia coli II Microbiol. Rev. 1984. - V.48. - P.60-93.

193. Wang J., Sarov M., Rientjes J., Hollak H., Kranz H. An improved recombineering approach by adding RecA to lambda Red recombination // Mol. Biotechnol. 2006. -V.32. — P.43-53.

194. Wang W.B., Tessman E.S. Location of functional regions of the Escherichia coli RecA protein by DNA sequence analysis of RecA protease-constitutive mutants // J. Bact. 1986. - V.168. - N.2. - P.901-910.

195. Weinstock G.M., McEntee K. and Lehman I.R. Hydrolysis of nucleoside triphosphates catalyzed by the recA protein of Escherichia coli. Hydrolysis of UTP // J. Biol. Chem. -1981. V.256. - P.8856-8858.

196. Wigle T.J. and Singleton S.F. Directed molecular screening for RecA ATPase inhibitors // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007. - V.17. - P.3249-3253.

197. Witkin E.M. RecA protein in the SOS response: milestones and mysteries // Biochimie. -1991. V.73. - P.133-141.

198. Wittung P., Funk M., Jernström B., Norden B. and Takahashi M. Fluorescence-detected interactions of oligonucleotides in RecA complexes // FEBS Lett. 1995. -V.368. - P.64-68.

199. Wood T.H. and Walmsley R.H. Conjugation in Escherichia coli K-12 and its modification by irradiation // Biophys. J. 1969. - V.9. - P.391-420.

200. Yasuda Т., Morimatsu К., Horii Т., Nagata Т. and Ohmori H. Inhibition of Escherichia coli RecA coprotease activities by DinI // EMBO J. 1998. — Y.17. -P.3207-3216.

201. Yasuda Т., Nagata T. and Ohmori H. Multicopy suppressors of the cold-sensitive phenotype of the pcsA68 (dinD68) mutation in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1996. — V.178. — P.3854-3859.

202. Yu X. and Egelman E.H. Structural data suggest that the active and inactive forms of the RecA filament are not simply interconvertible // J. Mol. Biol. 1992. - V.227. -P.334-346.

203. Yu X. and Egelman E.H. The LexA repressor binds within the deep helical groove of the activated RecA filament// J. Mol. Biol. 1993. - V.231. - P.29-40.

204. Yu X, Jacobs S.A., West S.C., Ogawa T. and Egelman E.H. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2001. - V.98. - P.8419-8424.

205. Zaitsev E. N. and Kowalczykowski S. C. Enhanced monomer-monomer interactions can suppress the recombination deficiency of the recA\A2 allele // Mol. Microbiol. 1999. - Y.34. - P. 1-9.

206. Zlotnic A., Mitchell R.S., Steed R.K. and Brenner S.L. Analysis of two distinct single-stranded DNA binding sites on the RecA nucleoprotein filament // J. Biol. Chem. -1993. V.268. - P.22525-22530.

207. Zlotnick A., Mitchell R.S. and Brenner S.L. RecA protein filaments bind two molecules of single-stranded DNA with off rates regulated by nucleotide cofactor // J. Biol. Chem. 1990. - V.265. - P. 17050-17054.

208. Zhumabaeva В., Chang C., McKinley J., Diatchenko L. and Siebert P.D. Generation of full-length cDNA libraries enriched for differentially expressed genes for functional genomics // Biotechniques. 2001. - V.30. - P.512-520.

209. Бреслер C.E. и Ланцов В.А. Индуцированная рекомбинация у Escherichia coli К-12: рекомбиногенный эффект tif 1 И Докл. Акад. Наук. 1978. - Т.238. -С.715-717.

210. Кассандрова О.Н., Лебедев В.В. Обработка результатов измерений. // Москва: Наука. 1970.

211. Ланцов В.А. Гомологическая ДНК-трансфераза RecA: функциональные активности и поиск гомологии рекомбинирующими ДНК // Молекулярная биология. 2007. - Т.41. - С.1-12.

212. Ланцов В.А. Идеальная генотерапия: подходы и перспективы // Молекулярная биология. 1994. - Т.28. - С.485-495.

213. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. // Мрсква: Мир.1976.

214. Остерман Л.Ф. Хроматография белков и нуклеиновых кислот // Москва: Наука. 1986.

Информация о работе

Дудкина, Александра Валентиновна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Влияние точечной мутации D112R на рекомбинационную активность белка RecA из Escherichia coli - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы