Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характерные особенности химерных белков RecAX21 и RecAX53(Pseudomonas aeruginosa/Escherichia coli), обладающих повышенной рекомбиногенностью
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Характерные особенности химерных белков RecAX21 и RecAX53(Pseudomonas aeruginosa/Escherichia coli), обладающих повышенной рекомбиногенностью"
На правах рукописи
ЧЕРВЯКОВА Дарья Борисовна
ХАРАКТЕРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ХИМЕРНЫХ БЕЛКОВ RecAX21 И КесАХ53 (Pseudomonas aeruginosa/Escherichia coli), ОБЛАДАЮЩИХ ПОВЫШЕННОЙ РЕКОМБИНОГЕННОСТЫО
03.00.03 - молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург 2009
003481463
Работа выполнена в Отделении молекулярной и радиационной биофизики Учреждения Российской академии наук «Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова РАН».
Научные руководители
доктор биологических наук,
профессор Владислав Александрович Ланцов
Петербургский институт ядерной физики РАН,
доктор биологических наук,
профессор Владимир Геннадьевич Королев,
Петербургский институт ядерной физики РАН.
Официальные оппоненты:
член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор Георгий Борисович Смирнов, НИИ эпидемиологии и микробиологии РАМН им. Н. Ф. Гамалея,
доктор биологических наук,
профессор Валерий Анатольевич Поспелов,
Институт цитологии РАН.
Ведущее учреждение: Биолого-почвенный факультет Санкт-Петербургского
государственного университета.
Защита состоится «20» ноября 2009 года в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.
Сайт института: vvww.cvtspb.rssi.ru Электронный адрес: cellbio@maiI.cytspb.rssi.ru Факс:+7 (812)297-03-41.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН. Автореферат разослан «-/£?> октября 2009 года.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук
Е. В. Каминская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Данная работа посвящена актуальной теме - выявлению молекулярных основ гиперрекомбинации.
Гомологическая рекомбинация (ГР) представляет собой один из фундаментальных биологических процессов, происходящих в живой клетке. Она необходима для репарации повреждений ДНК, репликации генома, правильной сегрегации хромосом в мейозе, а также является основным механизмом поддержания генетической изменчивости популяций. Фундаментальную роль белка RecA в регуляции метаболизма ДНК отражает его высокая консервативность в эволюции: его структурные и функциональные гомологи были обнаружены во всех трех царствах живого - у бактерий, архей и эукариот (Ланцов, 2007).
Образуя активный филамент на ДНК, белок RecA выполняет несколько функций в бактериальной клетке. Он осуществляет основной процесс ГР - трансферазную реакцию; участвует в репарации ДНК; обладает копротеазной активностью: катализирует саморасщепление белка LexA и ряда других репрессоров, приводящее к индукции SOS-ответа; белок RecA также задействован в SOS-мутагенезе (Ланцов, 2007; Сох, 2007).
В свете важной биологической роли белка RecA особого внимания заслуживают такие белки RecA, которые обладают усиленными рекомбинационными характеристиками. Изучение свойств таких белков позволит детальнее понять осуществляемую этим белком трансферазную . реакцию <и выделить наиболее важные для осуществления обмена гомологичными нитями ДНК его характеристики.
В настоящее время известны два механизма, приводящие к повышению частоты рекомбинационных обменов (ЧРО) в клетке: SOS-зависимый и SOS-независимый (Lanzov, 2002). В первом случае ЧРО увеличивается преимущественно за счет накопления белка RecA в клетке при RecA-опосредованкой дерепрессии SOS-регулона, а во втором случае к высоким значениям ЧРО приводит повышенная активность самого белка RecA, вызванная его структурными особенностями.
Белок RecA из Pseudomonas aeruginosa (RecAPa) вызывает повышение ЧРО в 6,5 раза по сравнению с белком RecA из Escherichia coli (RecAEc) и не приводит к индукции SOS-функций клетки (Namsaraev et al., 1998). С гиперрекомбиногенностью белка RecAPa коррелируют повышенная, по сравнению с белком RecAEc, стабильность его нуклеопротеиновых филаментов, более активное вытеснение белком RecAPa белка SSB с однонитевой ДНК (онДНК) и связывание с двунитевой ДНК (днДНК), а также повышенная активность белка RecAPa в инициации реакции переноса нити ДНК (Namsaraev et al., 1998).
Для более детального исследования рекомбинационных свойств белка RecA были созданы 54 химерных гена гесА, состоящих из фрагментов генов гесА из Pseudomonas
aeruginosa и Escherichia coü (Ogawa et al, 1992). Генетический анализ выявил среди них 31
рекомбинационно полноценный ген recAX(Bakhlanova era/., 2001). Наше внимание привлекли 3 химерных гена: пара гесЛХ20 и гесАХ21, а также ген гесАХ53.
Химерные белки RecAX21 и RecAX20 представляют собой белки RecAEc, N-концевые домены которых заменены соответствующими фрагментами белка RecAPa (рис. 1) (Ogawa et а!., 1992). По сравнению с белком RecAEc, белок RecAX20 содержит 5 аминокислотных замен (а. з.): Q7K, K8R, K19R, S25A и I26V, причем 2 последние из перечисленных аминокислот (а. к.) предположительно участвуют в мономер-мономерных контактах (Story et al., 1992, 1992а). Химерный белок RecAX21 отличается от белка RecAX20 единственной а. з. L29M, задействованной в межмономерных взаимодействиях (Story et al., 1992, 1992а). При этом рекомбиногенность белков RecAX21 и RecAX20 различается значительно: величины ЧРО, характеризующие химерные белки RecAX21 и RecAX20 и контрольные белки RecAEc и RecAPa, соотносятся следующим образом: RecAEc: RecAX20: RecAX21 : RecAPa = = 1:1 : 3 : 6.5 (Bakhlanova et al, 2001).
1 SO 100 200 300 I_I_I_1_I_I_I—
RecAEc RecAPa • RecAX20 RecAX21
v
I 10 20 30
-АГГ(Я«ХОХЛ1ЛАЛ1-бОТ.ККОПЗХй$1МЙЬЗ к—,., .та..........r.....m/,.h.
И—..,.TtR..........R.....AVT.L.
к--____та,...,.....я.....w.M.
Рис. 1. Структура химерных белков RecAX20 u RecAX21. Показано выравнивание аминокислотных последовательностей белков RecAX20 и RecAX21 относительно белков RecAEc и RecAPa
Химерный белок RecAX53 представляет собой белок RecAEc, у которого участок центрального домена с 170 до 250 а. к. заменен соответствующим фрагментом белка RecAPa (Ogawa et а!., 1992). По сравнению с белком RecAEc, химерный белок RecAX53 содержит 12 а. з. из белка RecAPa: M170L, M175L, L178I, А179Т, L182I, Q184N, S185A, Т187С, L189V, I228T, E236D, N237E (рис. 2). Перечисленные а. з. присутствуют в а-спирали F, ¡5-слое 5 и в участке, следующем сразу за р-слоем б (с 228 по 241 а. к.), - в структурных элементах белка, принимающих участие почти во всех функциях белка RecA: в создании межмономерных контактов, в связывании и гидролизе АТФ, а также в связывании с ДНК (Chen et al., 2008). Согласно структуре неактивного белка RecA (Story et al., 1992, 1992a), ни одна из
присутствующих в белке RecAX53 а. з. (по сравнению с белком RecAEc) не участвует в каких-либо взаимодействиях напрямую (Story et al, 1992,1992а).
N_170_250_С
I ...........„,,,.,„,)...........р»
. ......-..—£5—, ^ „о Ju
ш m ut im m m Ht
оыишм ksqxmrkiaci нысазютАХ f»a------vrldxkrxi» viœïEHwas rawiw
..1____ь..it. .l.m.c.v..................г......de......
Рис. 2. Структура химерного белка RecAX53. Внизу показан фрагмент выравнивания последовательностей белков RecAEc (верхний ряд) и белка RecAPa (нижний ряд) с указанными в участке белка RecAPa а. к., отличающимися от а. к. белка RecAEc (идентичные белку RecAEc а. к. в белке RecAPa обозначены точками)
Химерный белок RecAX53 продемонстрировал наибольшую рекомбинационную активность среди всех химерных белков RecAX, охарактеризованных генетически (Bakhlanova et al., 2001): ЧРО белков RecAEc, RecAPa и RecAX53 в клетках Е. coli соотносятся следующим образом: 1 :6,5 : 8,9.
Химерные белки RecAX20, RecAX21 и RecAX53, так же как белки RecAEc и RecAPa, не вызывают конститутивной индукции SOS-функций клетки, т. е. для белков RecAX21 и RecAX53 характерен SOS-независимый путь гиперрекомбинации (Bakhlanova etal., 2001).
Нас заинтересовало, какие же рекомбинационно значимые биохимические характеристики лежат в основе повышенной рекомбиногенности химерных белков RecAX21 и RecAX53.
Поскольку химерные белки RecAX20 и RecAX21 различаются одной а. з., мы изучали свойства этих белков преимущественно друг относительно друга. Исследование биохимических характеристик химерного белка RecAX53 проводили в сравнении с белками-предшественниками RecAEc и RecAPa.
Цель работы. Целью работы было выявление тех биохимических особенностей белков RecAX21 и RecAX53, которые лежат в основе их повышенной рекомбиногенности.
Задачи исследования.'
1) Создание экспрессионной системы для выделения и очистки белков RecAX20, RecAX21 и RecAX53.
2) Сравнение биохимических свойств белков RecAX20 и RecAX21 и изучение биохимических характеристик белка RecAX53 относительно белков-предшественников RecAEc и RecAPa по следующей схеме:
• выявление особенностей пресинаптических комплексов, формируемых химерными белками RecA;
• изучение характера взаимодействия химерных белков RecA с днДНК;
• исследование трансфертной активности в реакции переноса нити, катализируемой химерными белками ЯесА. 3) Анализ полученных результатов и определение биохимических свойств белков 11есАХ21 и ЯесАХ53, являющихся для них общими. Основные положения, выносимые на защиту:
1) Белок ЛесАХ20, отличающийся от белка ЯесАЕс пятью а. з., по биохимическим характеристикам практически не отличается от белка ЯесАЕс.
2) По сравнению с белками ЯесАХ20 и ЯесАЕс, белок ЯесАХ21:
а) обладает пониженной скоростью гидролиза АТФ,
б) эффективнее конкурирует с белком ББВ за связывание с онДНК,
в) эффективнее связывается с короткими онДНК,
г) медленнее диссоциирует с 5'-конца онДНК,
д) более эффективен в инициации переноса нити,
е) обладает неизмененной стабильностью пресинаптических комплексов, е) активнее связывается с днДНК.
3) По сравнению с белками ЯссАЕс и ЯесАРа, гиперрекомбиногенный белок ЯесАХ53:
а) обладает повышенной скоростью гидролиза АТФ,
б) эффективнее вытесняет белок ЭЭВ с онДНК,
в) активнее белка ЯесАЕс, но менее эффективно, чем белок ЛесАРа, связывается с короткими онДНК,
г) характеризуется ускоренной диссоциацией с онДНК,
д) более активен в инициации реакции переноса нити,
е) обладает меньшей стабильностью пресинаптических комплексов,
ж) активнее связывается с днДНК.
4) Сравнительный анализ свойств белков ЯесАХ21 и ЯесАХ53 позволяет заключить, что их высокая рекомбиногенность обеспечивается:
а) эффективной конкуренцией с белком ББВ за связывание с онДНК,
б) способностью к быстрой инициации реакции переноса нити.
5) Активное связывание химерных белков ЯесАХ21 и ЯесАХ53 с днДНК объясняет свойственный этим белкам БОБ-независимый механизм гиперрекомбинации.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые выявлены характерные свойства химерных белков ЯесАХ21 и ЯесАХ53, лежащие в основе их рекомбиногенности. Выявлена корреляция между высокой рекомбиногенностью мутантных белков КесАХ21 и ЯесАХ53 и их повышенной агрессивностью в инициации реакции обмена гомологичными нитями ДНК, подтверждающая гипотезу о повышенной активности гиперрекомбиногенных белков именно на стадии инициации рекомбинационного обмена (Ьапгоу, 2002). Обнаружена связь между гиперрекомбиногенностью белков ЯесАХ21 и ЯесАХ53 и их повышенной
кинетической активностью. Предложена гипотеза о связи гиперрекомбиногенности белков RecA с изменениями в межмономерных взаимодействиях их нуклеопротеиновых филаментов. Найдена взаимосвязь между SOS-независимым механизмом гиперрекомбинации, свойственным белкам RecAX21 и RecAX53, и активным формированием этими белками нуклеопротеиновых филаментов на днДНК.
Теоретическое и практическое значение работы. Проведенное исследование относится к числу фундаментальных. Оно позволило уточнить молекулярные механизмы, лежащие в основе гиперрекомбинации. Кроме фундаментальной роли, данное исследование может иметь и прикладной характер.
• В перспективе гнперрекомбиногенные белки можно было бы использовать для повышения эффективности процедуры генетического модифицирования или даже генотерапии: создав конструкцию для временной экспрессии гиперрекомбиногенного белка RecA и введя ее в соматические клетки высших эукариот, можно было бы повысить (в норме низкую) частоту гомологической рекомбинации в клетке, увеличив тем самым эффективность адресной доставки генетического материала.
Точное знание структурно-функциональных взаимосвязей в белке RecA является необходимым условием для разработки новых антибиотиков, действие которых будет основываться на повышении эффективности известных антибактериальных препаратов путем ингибирования каких-либо функций белка RecA. Поскольку большинство антибиотиков вызывают повреждения ДНК, а репарация серьезных структурных повреждений ДНК (таких как однонитевые бреши и двунитевые разрывы ДНК) и восстановление репликации строго зависят от RecA, ингибиторы белка RecA могли бы усиливать эффективность антибиотиков (Wigle et al, 2007). Белок RecA выполняет также основную роль в поддержании генетического разнообразия популяций и, в частности, в развитии устойчивости к антибиотикам. Одновременное применение ингибиторов белка RecA с антибиотиками смогло бы приостановить или даже воспрепятствовать развитию устойчивости бактерий к применяемым лекарствам.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на ежегодных конференциях молодых ученых Петербургского института ядерной физики (Гатчина, 1999-2001 гг.) и на XII Международной школе-конференции молодых ученых "Биология -наука XXI века" (Пущино, 2008 г.).
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 92 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов, заключения и списка литературы, содержащего 118 источников. Работа проиллюстрирована 23 рисунками.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования: химерные белки 1?есАХ20, ЯесАХ21 и ЯесАХ53. Для наработки перечисленных химерных белков использовали бактериальную экспрессионную систему на основе рЕТ-векторов (Novogene) США). Химерные гены гесЛХ20, гесАХ21 и гесАХ53 были перенесены из оригинальных плазмид рАК651-Х20, рАК651-Х21 и риС19-Х53 (Ogawa е( а!., 1992) в экспрессионные векторы на основе рЕТ-21Ь путем замещения фрагментов генов гесАРа в векторе рЕТ-21Ь-гесАРа (Ыагг^агаеу «г а/., 1998) (для гесЛХ20 и гесАХ21) и гесАЕс в векторе рЕТ-21Ь-гесАЕс (Иатзагаеу ег а/., 1998). Экспрессию химерных белков ЯесАХ20, КесАХ21 и ЯесАХ53, а также контрольных белков ИесАЕс и ИесАРа проводили в штамме ВЬ21 (ОЕЗ) рЬувЭ: ^ отрТИ5с1Ь'в (гв~ тв*) с1ст ёа\ (ВЕЗ) АгесАЗОб, несущем плазмиду рЬузЭ. Штамм В1Л1 (ОЕЗ) входит в рЕТ-экспрессионную систему (Novogene, США).
Выделение и очистку белков осуществляли по одной схеме, поскольку гены гесАЕс, гесАРа, гесАХ20, гесАХ21 и гесАХ53 клонированы в вектор рЕТ-21Ь. Белки ЯесА выделяли и очищали в три этапа. Обработанные лизаты клеток, содержащие экспрессированные белки ЛесА, осаждали полимином Р, проводили ионообменную хроматографию на предварительно подготовленном носителе - фосфоцеллюлозе Р11 с последующей аффинной очисткой на колонке с онДНК целлюлозой (Сох е< а/., 1981).
КесА-зависимый гидролиз АТФ регистрировали по падению поглощения при 340 (или 380) нм с помощью спектрофотометрического метода, связывающего гидролиз АТФ с окислением ЫАЭН (Коууакгукоюткч е( ей., 1987). Реакции проводили при 37 °С в 90 мкл буфера ТМД (25мМ Трис-НС1 (рН7.5), МёС12 (1 или 10 мМ), 0,1 мМ ДТТ), содержащего 1 мМ АТФ и АТФ-регенерирующую систему (2 мМ фосфоенолпирувата, 30 единиц/мл пируват киназы, 0,56 мМ МАОН (2,7 мМ ИАОН в реакциях с днДНК) и 30 единиц/мл Ь-лактат дегидрогеназы), а также ДНК, определенный белок ЯесА и (или) белок БЭВ в указанных концентрациях. ДНК-независимый гидролиз АТФ в высокосолевых условиях проводили с 1 мкМ белка КесА в буфере ТАМД (25 мМ Трис-ацетата (рН7.5), 17,5 мМ ацетата магния и 1 мМ ДТТ), содержащем 2 мМ АТФ, 1,8 М ацетата натрия и АТФ-регенерирующую систему, как указано выше.
Реакцию переноса нити, катализируемую белками ЯесАХ20 и ИесАХ21, проводили при 37 °С в буфере ТМД, содержащем 4 мМ 2 мМ АТФ, АТФ-регенерирующую
систему, 10 мкМ кольцевой онДНК фага М13шр18 и 6 мкМ соответствующего белка ЯесА. Перед добавлением 1 мкм белка БЭВ смесь инкубировали в течение трех минут при 37 °С. Для расплавления вторичных структур на онДНК реакционную смесь инкубировали еще 2 минуты в присутствии белка ЭЭВ. Реакцию переноса нити инициировали добавлением 70 мкМ линеаризованной с помощью рестриктазы £соШ днДНК М13шр18. В указанные промежутки времени из реакционной смеси отбирали аликвоты и реакцию останавливали добавлением
5 мМ EDTA, 0,5 % SDS, 0,1 мг/мл протеиназы К с последующим инкубированием в течение получаса при 37 "С. Затем проводили электрофорез в 1%-ом агарозном геле, с последующим окрашиванием раствором 0,5 мкг/мл бромида этидия. Положение ДНК в геле анализировали с помощью системы Kodak DC 120 и программного обеспечения KDSID 2.0 (Amersham).
Флуоресцентный метод анализа скорости инициации реакции переноса нити ДНК. Реакцию проводили при 37 °С в буфере ТМД, содержащем 10 мМ MgCl2, 2 мМ АТФ, АТФ-регенерирующую систему, 21 мкМ онДНК М13шр8 и 2 мкМ соответствующего белка RecA. Смесь (100 мкл) прогревали при указанной температуре 3 минуты с указанным белком RecA, добавляли 2 мкМ SSB, инкубировали еще 5 минут и реакцию инициировали добавлением 0,3 мкМ двунитевого олигонуклеотида, меченного FAM (фосфорамидитом флуоресцина). В указанные времена из реакционной смеси отбирали аликвоты объемом 16 мкл, реакции в которых останавливали добавлением 1,6 мкл 0,9 % раствора SDS и охлаждением на льду. От белков в образцах избавлялись обработкой 0,1 мг/мл протеиназой К с последующим инкубированием в течение получаса при 37 "С. Образцы наносили в лунки 1 %-ном агарозного геля и проводили электрофорез. Положение ДНК-и интенсивность флуоресценции определяли с помощью Typhoon 9410 Variable Mode Imager и программного обеспечения TotalLab vi. 10 (Phoretix).
Точность результатов. Все приведенные результаты являются усредненными, по меньшей мере, из трех независимых экспериментов. Статистическую обработку результатов проводили с помощью метода наименьших квадратов, с учетом коэффициентов Стьюдента для заданной надежности Р = 0,9. Относительная погрешность результатов не превышала 10 %.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Скорости гидролиза АТФ, характерные для химерных белков RecAX21, RecAX20 и RecAX53. Как видно из табл. 1, значения параметра отражающего число гидролизованных белком молекул АТФ в единицу времени на единицу фермента (т. е. скорость гидролиза АТФ), для белков RecAEc, RecAX20 и RecA Ра практически одинаковы, как в присутствии онДНК, так и в условиях, имитирующих наличие онДНК - при 1,8 М ацетата натрия. Значение параметра км, полученное для химерного белка RecAX21, оказалось на треть меньше, чем у остальных белков; а величина км, определенная для белка RecAX53, почти в 1,5 раза превышала соответствующие величины, измеренные для белков RecAEc, RecAX20 и RecAPa (табл. 1).
Химерный белок RecAX53 оказался первым мутантным белком RecA, обладающим значительно повышенной гидролитической активностью.
Пониженные значения параметра км, характерные для белка RecAX21, свидетельствуют о влиянии а. з. L29M на функционирование АТФ-гидролизующего участка (Chen et al., 2008).
Несмотря на отсутствие в белке RecAX53 а. з. в АТФ-связывающем и гидролизующем доменах, в соответствии с последними данными о взаимосвязи RecA-RecA, RecA-оиДНК и RecA-ЛТФ (Chen et а!., 2008), повышенная гидролитическая активность белка RecAX53 может быть обусловлена влиянием а. з., находящихся в а-спирали F и в р-слое 5.
Таблица 1. Гидролиз АТФ, катализируемый белками RecAX20, RecAX21, RecAX53, RecAEc и RecAPa, в присутствии полн(дТ)и без ДНК, в 1,8 М ацетата натрия
RecA k„t на поли(дТ)збоо * kc„ в 1,8 M NaAc6
RecAEc 29,2 ±2,2 30 ±1,2
RecAX20 29,5 ±1,8 30 ±2,1
RecAX21 20 ±1,5 18,5 ±1,7
RecAX53 45,2 ±2,2 43,0 ±2,1
RecAPa 31,5 ±2,9 31,2 ±0,7
* Реакции проводили в буфере ТМД, содержащем 10 мМ MgCb, 1мМ АТФ, АТФ-регенирирующую систсму, 10 мкМ лолн(дТ)3600 и 1 мкМ указшшого белка RecA.
Реакционные смеси содержали ТАМД, 2 мМ АТФ, АТФ-регенирирующую систему, 1,8 ^Л ацетата натри« и 1 мкМ указанного белка RecA.
Аффинность химерных белков RecAX20, RecAX21 и RecAX53 к онДНК. Отличия в скоростях гидролиза АТФ, выявленные для белков RecAX21 и RecAX53, могут быть связаны с их измененной аффинностью к онДШС. белок RecAPa обладает повышенной аффинностью к онДНК, по сравнению с белком RecAEc (Namsaraev et al., 1998).
Наиболее точно сродство белка RecA к онДНК характеризует параметр STMP (Salt Titration Mid Point) - та концентрация соли (например, NaCl), которая необходима для диссоциации половины пресинаптических комплексов, образованных белком RecA, чему соответствует падение первоначальной скорости гидролиза АТФ в два раза (Menetski et al, 1988).
Таблица 2. Стабильность комплексов ЯесА::АТФ::оиДНК: устойчивость к воздействию сол н NaCl
RecAEc RecAX20 RecAX21 RecAX53 RecAPa
STMP (мМ HaCl) 375 ±25 400 ±30 345 ±30 300 ±30 600 ±40
Реакции проводили в буфере ТМД, содержащем 1 мМ АТФ, АТФ-регенерирующую систему, 5 мкМ поли(дО1ь00 и 0,5 икМ 11есА. По достижении максимальной для данного белка ЁесА скорости гидролиза АТФ в реакцию порционно титровали распор 5М №С1 до хонечной концентрации 50 мМ и регистрировали падение скорости гидролиза АТФ после каждого добавления раствора соли. Значения БТМР определяли по концентрациям КаС1, соответствующим половинам начальных скоростей гидролиза АТФ.
Как видно из табл. 2, 'концентрация КаС1, необходимая для разрушения половины пресинаптических комплексов, образованных белком КесАХ21, практически совпадает со значениями ЙТМР, полученными для белков КесАЕс и ЯесАХ20, и почти вдвое ниже, чем соответствующая белку КесАРа величина. Комплекс КесАХ53::АТР::поли(дТ) оказался несколько менее устойчивым к действию ионов хлора, чем такой же комплекс, образованный белком ЯесАЕс, и тем более чем нуклеопротеиновые филаменты, образованные белком ЯесАРа.
Из полученных результатов следует, что по стабильности пресинаптических комплексов, образованных белком ЯесАХ21, и его аффинности к онДНК этот химерный белок скорее ближе к белкам КесАЕс и ЯесАХ20, чем к белку КесАРа. Химерный белок ЯесАХ53 обладает пониженной стабильностью нуклеопротеиновых филаментов к воздействию ЫаС1, по сравнению с белками КесАЕс и КесАРа.
Вытеснение химерными белками 11есАХ21, йесАХ20 н 1?есАХ53 белка ББВ с кольцевой онДНК. С появляющимися в клетке однонитевыми участками ДНК связывается белок БЙВ, защищающий их от действия нуклеаз и дальнейшего процессинга. Инициация рекомбинационного обмена возможна только при условии создания белком КесА активного нуклеопротеинового филамента на онДНК (пресинаптического комплекса), т. е. белок ЭБВ должен быть вытеснен с онДНК. Белок КесАЕс осуществляет эту реакцию с помощью вспомогательных белков. Белки КесА, обладающие повышенной рекомбиногенностью (такие как ЯесАРа и КесА441), активнее белка КесАЕс вытесняют белок ББВ с онДНК (Иагшагаеу е! а!., 1998; Ьауегу е1 ей., 1990; МадЩи еI ей., 1992). Скорость формирования пресинаптического комплекса определяется, в значительной степени, скоростью вытеснения белка БЭВ белком ЯесА с онДНК. При этом быстрота вытеснения белка ББВ с онДНК коррелирует со скоростью ассоциации белка КесА с онДНК (Ьауегу ег а!., 1992).
На основании приведенных данных мы предположили, что химерные белки КесАХ21 и ЯесАХ53 будут отличаться от остальных белков по эффективности вытеснения белка ББВ с онДНК и скорости ассоциации с онДНК.
Наиболее яркий результат для химерных белков ИесАХ20 и ИесАХ21 мы получили при концентрации ионов магния 1 мМ в реакционной смеси. Как показано на рис. ЗА, белок КесАХ21 даже более активно вытесняет белок 5БВ с онДНК, чем белок КесАРа. В данных условиях белки КесАЕс и КесАХ20 оказались не способными вытеснять белок ЭЭВ с онДНК. Белок 11есАХ53 также оказался более эффективным, чем белок КесАРа, в конкуренции с белком ББВ за связывание с онДНК при концентрации ионов магния в реакционной смеси 10 мМ (рис. ЗБ). При 1 мМ магния белок КесАХ53 демонстрирует сходную с ЯесАЕс активность в этом эксперименте.
Рис. 3. Кинетика вытеснения белка SSB с онДНК различными белками RecA: сравнение скоростей гидролиза АТФ: А. Реакции проводили в буфере ТМД, содержащем 1 мМ MgCl2,lMM АТФ, АТФ-регенерирующую систему, 2 мкМ данного белка RecA, 3 мкМ кольцевой оцДНК М13 и 0,6 мкМ SSB. Кольцевую онШЗ ДНК преинкубировали в реакционной смеси с белком SSB в течение двух минут, после чего реакцию инициировали добавлением указанного белка RecA. Б. Реакции проводили в тех же условиях, что и в А, за исключением того, что вместо I мМ MgClj реакционные смеси содержали 10 мМ
Таким образом, химерные белки RecAX21 и RecAX53 быстрее вытесняют белок SSB с онДНК, чем белки RecAX20, RecAEc и даже RecAPa, и активнее образуют пресинаптические комплексы.
Формирование химерными белками RecAX20, RecAX21 и RccAX53 пресинаптнческих комплексов на коротких олигонуклеотидах. На способность белка RecA к полимеризации на онДНК влияет ее длина. Белок RecA становится полностью активной АТФазой только в том случае, когда он является частью кластера мономеров, связанных последовательно вдоль остова ДНК, превышающего по длине определенный размер - 10 мономеров (Bianco etal., 1998).
Формирование белками RecA активных фияаментов на коротких онДНК изучали с использованием коротких линейных онДНК - олиго(дТ). Наличие короткого однонитевого субстрата в реакционной смеси создает такие условия, при которых аффинность к онДНК и сила межмономерных взаимодействий, характерные для конкретного белка RecA, оказываются решающими факторами, влияющими на создание пресинаптнческих комплексов.
Как видно на рис. 4А, по эффективности образования нуклеопротеиновых филаментов на коротких олигонуклеотидах химерные белки RecAX20, RecAX21 и контрольные белки можно расположить следующим образом: RecAPa > RecAX21 > RecAX20 = RecAEc. Учитывая установленную ранее неизмененную аффинность белка RecAX21 к онДНК, по сравнению с белками RecAX20 и RecAEc, лучшая способность белка RecAX21 к ассоциации с короткими олигонуклеотидами, по сравнению с теми же белками, свидетельствует об измененных межмономерных взаимодействиях. Полученный результат подтверждает предположение о влиянии а. з. L29M на межмономерные контакты в филаменте RecAX21.
Белок RecAX53 ведет себя сходным образом с RecAEc при использовании олиго(дТ) до 30 нуклеотидов длиной при 10 мМ MgCl2 (рис. 4Б). Только начиная с 40-нуклеотидного олигонуклеотида, скорость гидролиза АТФ белка RecAX53 начинает превышать соответствующее значение белка RecAPa примерно в 1,2 раза. Поскольку белка RecAX53 в этих условиях примерно в 1,3 раза больше ical белков RecAEc и RecAPa, можно заключить, что на олигонуклеотидах до 30 нуклеотидов длиной включительно белок RecAX53 не способен создавать активный филамент. При I мМ MgCI2 (рис. 4В) даже на 40-нуклеотидном субстрате белок RecAX53 не способен создавать активный филамент: его скорость гидролиза АТФ такая же, как и у белка RecAEc. А скорость гидролиза АТФ белка RecAPa на этом олигонуклеотиде превышает соответствующие значения белков RecAEc и RecAX53 в 2,6 раза.
аг^наопиго^яшжйв.муктемт«^ Brwwa ол^чуктеоткда, н*кп©отвды
Дш«13 <Я1ИП5«у*йеОТКДй, КУКЛвОТИДЫ
Рис. 4. Связывание белков К14'Л с короткими олигонуклеотидами: А. Реакции проводили в буфере ТМД, содержащем 1 мМ К^С12, 1 мМ АТФ, АТФ-регенерирующую систему, 1мхМ анализируемого КесА и 100 мкМ олиго(дТ)„, где п = 20, 25, 30, 40. Каждый столбец диаграммы показывает отношение средней максимальной скорости гидролиза АТФ данного белка ЯесА в комплексе с нуклеотидами указанной длины к максимальной скорости гидролиза АТФ с поли(дТ)эбоо. Б. Реакции проводили так же, как и в А, за исключением того, что вместо 1 мМ М£С1: реакционная смесь содержала 10 мМ. В. Реакции проводили так же, как и в А. По оси ординат указаны абсолютные максимальные скорости гидролиза АТФ, полученные для белков ЯесА на олигонуклеотидах указанных длин
Из полученных результатов следует, что, во-первых, при 10 мМ 1\^С12 характер связывания белка RecAX53 с короткими олигонуклеотидами такой же, как у белка RecAEc, а не у белка RecAPa, и, во-вторых, при 1 мМ 1У^С12 белок RecAX53 хуже, чем белок RecAEc,
формирует нуклеопротеиновые комплексы на коротких олигонуклеотидах. Эти данные свидетельствуют как о пониженной аффинности белка RecAX53 к онДНК (что находится в соответствии с результатами по STMP), так и об измененных (по сравнению с белком RecAEc) межмономерных взаимодействиях в филаментах этого белка.
Диссоциация химерных белков RecAX20, RecAX21 н RecAX53 с конца лииейной онДНК. Филаменты RecA, сформированные на замкнутой онДНК, стабильны до тех пор, пока регенерируется АТФ. А филаменты RecA, образованные на линейной онДНК, подвергаются 5-концевой разборке (Shan et al., 1997). Диссоциация мономеров с 5'-конца онДНК строго АТФ-зависима: для осуществления реакции необходим гидролиз АТФ (Shan et al., 1997). В присутствии белка SSB процессы диссоциации преобладают над процессами ассоциации мономеров RecA с онДНК, поскольку со свободными участками ДНК связывается белок SSB.
В эксперименте по конкуренции с белком SSB за связывание с онДНК химерные белки RecAX21 и RecAX53, наряду с активным вытеснением белка SSB с замкнутой онДНК, продемонстрировали ускоренную ассоциацию с онДНК. Мы предположили, что скорости диссоциации этих белков с конца онДНК также будут отличаться от соответствующих значений, определенных для белков RecAX20, RecAEc и RecAPa.
Диссоциацию мономеров RecA с конца онДНК (или разборку филаментов RecA) измеряли в эксперименте, в котором белок RecA вытесняется белком SSB с поли(дТ) (Lavery et al., 1990). Этот опыт основан на том факте, что белок SSB характеризуется большим сродством к поли(дТ), чем белок RecA (Kowalczykowski et ai, 1987). В присутствии АТФ белок RecA создает активный филамент на онДНК. Добавление к уже сформированному комплексу RecA : : ATP : : поли(дТ) белка SSB приводит к вытеснению мономеров RecA с онДНК, т. е. к разборке филамента RecA, что можно видеть, например, по падению скорости гидролиза АТФ. Кинетику разборки филаментов характеризуют параметром т - периодом полураспада комплексов RecA :: ATP :: поли(дТ).
Как видно в табл. 3, комплексы, образованные белками RecAEc и RecAX20, обладают одинаковой устойчивостью к вытеснению белком SSB с поли(дТ). Как и ожидалось, ввиду высокой аффинности белка RecAPa к онДНК (Namsaraev etal., 1998; Baitin et ai, 2003), белок RecAPa не вытеснялся белком SSB с поли(дТ) ни при 1, ни при 10 мМ ионов магния в реакционной смеси. Филаменты, образованные химерным белком RecAX21 на поли(дТ) при I мМ MgC!2, оказались более устойчивыми к вытеснению белком SSB, чем белки RecAEc и RecAX20, но менее, чем белок RecAPa (табл. 3). При 10 мМ MgCl2 пресинаптические филаменты RecAX21 обладают такой же устойчивостью к вытеснению белком SSB с поли(дТ), как и нуклеопротеиновые филаменты белка RecAPa. В этом эксперименте белок RecAX21 оказался ближе к белку RecAPa.
Сравнивая полученные для химерного белка RecAX53 и его белков-предшественников RecAEc и RecAPa периоды полураспада комплексов RecA :: ATP :: поли(дТ) т (табл. 3), легко
видеть, что комплексы RecAX53 : : ATP : : поли(дТ), при добавлении к ним белка SSB, распадаются даже быстрее, чем комплексы, образованные белком RecAEc.
Таблица 3. Устойчивость белков RecA к вытеснению белком SSB с полн(дТ)
х*, минуты
1 мМ MgCl2 10 мМ MgCb
RecAEc < 1 4,5
RecAX20 < 1 4,5
RecAX21 5,5" >30
RecAX53 < 1 3
RecAPa >30 >30
* Реакции проводили в буфере ТМД содержащем указанные концентрации MgC]:, 1мМ АТФ, АТФ-регенерируюгцую систему, 3 мхМ поли(дТ) , 0,75 мхМ белка RecA и 0,6 мкМ белка SSB. После того, как скорость гидролюа Д.ТФ белка RecA в комплексе с поли(дТ) и АТФ становилась постоянной, в реакцию добавляли белок SSB и регистрировали падение скорости гидролиза АТФ. Значения т рассчитывали по аппроксимации данных методом наименьших квадратов к экспоненциальному распаду.
На скорость разборки нуклеопротеиновых филаментов в данной системе влияют как аффинность к онДНК, так и прочность самого филамента RecA, т. е. сила межмономерных взаимодействий. Это означает, что либо аффинность к поли(дТ) у белка RecAX53 даже ниже, чем у RecAEc, либо сила межмономерных контактов меньше, либо и то, и другое вместе. Этот эксперимент согласуется с экспериментом по определению величины STMP, в том смысле, что в них проверяется стабильность комплексов RecA::ATP::пoли(дT). В первом случае конкуренция с более аффинным к поли(дТ) белком SSB приводит к разборке филамента, а во втором - действие ионов NaCl приводит к ослаблению взаимодействий внутри нуклеопротеинового комплекса, но в обоих случаях результатом этих воздействий является диссоциация мономеров RecA с 5'-конца поли(дТ), необратимая в первом случае (Shan et al, 1997). Таким образом, этот эксперимент еще раз подтверждает, что белок RecAX53 обладает низкой аффинностью к онДНК (в этом свойстве он подобен белку RecAEc) и, возможно, ослабленными межмономерными взаимодействиями.
Химерный белок RecAX21 обладает сходной с белками RecAX20 и RecAEc аффинностью к онДНК и содержит а. з. в интерфейсе межмономерных взаимодействий. Следовательно, именно изменения в межсубьединичных взаимодействиях RecAX21 лежат в основе замедленной, по сравнению с белками RecAX20 и RecAEc, разборки его филаментов.
Возможно, замедленная скорость диссоциации с онДНК, выявленная для химерного белка RecAX21, предопределяет характерные для него более низкие значения ЧРО, по сравнению с химерным белком RecAX53. А высокая кинетическая активность химерного
белка RecAX53 (он активно создает пресинаптические комплексы на онДНК и быстро покидает онДНК), по сравнению с белком RecAX21, позволяет ему чаще инициировать рекомбинационные обмены.
Эффективность химерных белков RecAX21 и RecAX20 в реакции переноса нити ДНК. Белки RecA441 и RecAPa, характеризующиеся SOS-независимым способом повышения ЧРО, проводят реакцию переноса нити сходным образом (Namsaraev et al., 1998; Lavery et al., 1990). По сравнению с белком RecAEc, оба эти белка являются более активными в формировании сцепленных молекул (см), но менее эффективными в завершении реакции переноса нити между линейной днДНК фага М13 и кольцевой онДНК того же фага (образовании конечного продукта реакции (кп) - никированной кольцевой днДНК) (Namsaraev et al., 1998; Lavery etal., 1990). .
MgCI2
В
ДНДНК
онДНК
ДНДНК
онДНК
-e-mRecAX20 • «Л RecAX21 -:i-cu RecAX2C -c-cu RecAX21
20 30 40 60 Бремя. HHHyipt
Рис. 5. Реакция переноса нити: разделение в агарозном геле исходных компонентов реакции (кольцевой онДНК М13 и линейной днДНК М13) и продуктов реакции (сцепленных молекул (см) и конечных продуктов (кп) - кольцевых пикированных днДНК М13): А. Доля спиши зависимости от концентрации ионов магния в реакции. Реакции проводили в буфере 'ГМД, содержащем указанные концентрации MgCl2, 1 мМ АТФ, АТФ-регенерирующую систему, 10 мкМ онДНК МН mpl8, 1 мкМ SSB, 6 мкМ RecAEc и 18 мкМ днДНК М13. Б. Кинетика реакции переноса нити, катализируемой белком Ree АХ20 (нечетные дорожки) и белком RecAX21 (четные дорожки) при 4 мМ MgCl2. Реакции проводились в тех же условиях, что и в А, только концентрация днДНК М13 была 70 мкМ, а белков ReeA - по 6 мкМ. В. Относительные количества см и кп при анализе фотографии геля, представленного в Б, были рассчитаны, как описано в разделе «Материалы и методы»
Проведение реакции переноса нити с химерными белками RecAX20 и RecAX21 предварили подбором условий реакции, при которых сцепленные молекулы и конечные продукты были бы наиболее хорошо различимы. Реакции проводили на примере белка
ЯесАЕс, а условия подбирали, варьируя концентрацию ионов магния в реакционной смеси (рис. 5А). На рисунке 5А видно, что в реакции переноса нити, осуществляемой белком ЯесАЕс, преобразование сцепленных молекул в конечные продукты происходит медленно и наиболее хорошо различимо при 4 мМ М£С12.
На рисунке 5Б показана кинетика реакции переноса нити, проводимой белками КесАХ20 и 1?есАХ21 в выбранных условиях - при 4 мМ К^СЬ. Оценку эффективности образования сцепленных молекул и конечных продуктов реакции проводили посредством сканирования агарозных гелей и анализа полученных фотографий с помощью программного обеспечения КВБГО 2.0 (рис. 5В). Как и ожидалось, белок ЛесАХ21 оказался более эффективным в формировании сцепленных молекул, по сравнению с белком ЯесАХ20, но менее активным в образовании конечных продуктов реакции - никированных кольцевых днДНК (рис.5Б, В).
В реакции переноса нити, осуществляемой химерным белком ЯесАХ53, не удалось обнаружить преимуществ этого химерного белка, даже по сравнению с белком ЛесАЕс.
Белок 11есЛХ53 активнее белков ИесАЕс и ЛесАРа инициирует реакцию переноса нити. В предыдущем эксперименте не удалось выявить преимуществ химерного белка ЯесАХ53 перед гиперрекомбиногенным белком ЯесАРа. Мы провели другой эксперимент, направленный на выявление разницы в осуществлении гомологичного обмена нитей ДНК между химерным белком ЯесАХ53 и белками ИесАЕс и КесАРа.
Как известно, основными этапами реакции переноса нити между филаментом ЯесА и гомологичной днДНК являются спаривание и процесс обмена гомологичными нитями ДНК. Обе фазы реакции можно зарегистрировать с помощью флуоресцентного метода с использованием онДНК и флуоресцентно-меченного двунитевого олигонуклеотида, комплементарного онДНК.
При взаимодействии пресинаптического комплекса, образованного белком ГСесА на кольцевой онДНК М13тр18, с комплементарным 34-мерным двунитевым олигонуклеотидом с тупыми концами, ИАМ-меченным по одному из 5'-концов, происходит спаривание и перенос флуоресцентно-меченной нити олигонуклеотида на кольцевую онДНК М13шр18 (рис. 6А).
Как показано на рис. 6Б, в присутствии в реакционной смеси избытка онДНК М13 (21 мкМ), по сравнению с концентрацией белка ЛесА (2 мкМ), белок КесАХ53 оказался намного эффективнее (почти в 1,5 раза) белков ЯесАЕс и КесАРа в катализе реакции переноса нити между коротким двунитевым и замкнутым однонитевым ДНК-субстратами. В условиях избытка онДНК значительная ее фракция может быть не связана белком ЯесА в участке, комплементарном двунитевому олигонуклеотиду. И реакция обмена между гомологичными нитями ДНК не наступит до тех пор, пока белок ЯесА не сформирует нуклеопротеиновый филамент в участке онДНК, гомологичном двунитевому олигонуклеотиду, что требует этапов сборки и разборки филамента. Полученный результат означает, что химерный мутант 11есАХ53 осуществляет необходимое перераспределение филамента быстрее белков ЯесАЕс и
КесАРа С другой стороны, в условиях избытка белка ЛесА (14 мкМ) по сравнению с концентрацией онДНК (21 мкМ), все исследуемые белки ЯесА осуществляют перенос нити с практически одинаковой эффективностью (рис. 6В).
Полученные результаты подтверждают предположение о том, что химерный белок ЯесАХ53 более агрессивен в инициации реакции переноса нити, чем белки КесАЕс и ЯесАРа. А
онМ13тре + ,
FAM Vf
' RecAX53 т ,
л lf^RecAPe
(У RecAEc
2мкМЯесА .....
8 10 12 Вр«МЯ.М№уТЫ
8 10 12 Время, минуты
Рис. б. Агрессивность белка RecAX53 в инициации реакции переноса нити: А. Схема электрофорез-флуоресцентного метода. Б и В - кинетики реакций переноса нити белков RecAX53, RecAEc и RecAPa. Все реакции проводили при 37 °С в буфере ТМД, содержаще« 1Q иМ хлорида магния, 2 мМ АТФ, АТФ-регенерирующую систему, 2 мкМ белка RecA (Б) или 14 шсМ (В) белка RecA и 21 мкМ оиДНК М13 шр18. Пресинаптяческие комплексы RecA::ATP::M13mp8 онДНК формировались в присутствии 2 мкМ белка SSB. В момент времени 0, 0,3 мкМ 34-меркых дн-олигонуклеотвдов (Глава 2) добавляли в реакционную смесь и отбирали в указанные моменты времени аликвоты, анализируемые впоследствии по интенсивности флуоресценции ДНК в агарозном геле (описано в Главе 2). Флуоресценцию завершенных реакций переноса (плато на графиках) принимали за 100 условных единиц. Флуоресценцию образцов нормировали к этой величине
Связывание химерных белков RecAX20, RecAX21 и RecAX53 с днДНК. Известно, что сайты связывания репрессора LexA и днДНК в белке RecA перекрываются (Chen et al, 2008). Как упоминалось выше, для белка RecAPa характерен SOS-независимый путь гиперрекомбинации. В то же время белок RecAPa активнее образует нуклеопротеиновые филаменты на днДНК, чем белок RecAEc (Namsaraev et al, 1998). На основании этих данных мы предположили, что химерные белки RecAX21, RecAX20 и ДесАХЗЗ могут отличаться от белков RecAEc и RecAPa по характеру связывания с днДНК.
При наличии однонитевых участков в днДНК, белок RecA в первую очередь связывается с ними, а затем медленно распространяется на двунитевые участки (Pugh et al., 1987), Реакция связывания белка RecA с днДНК рН-зависима: при рН = 6,3 реакция происходит заметно быстрее, чем при физиологических значениях рН (7,5) (Kowalczykowski et al., 1987, Pugh et al., 1987). Наиболее ярко различия между белками RecAEc и RecAPa в образовании нуклеопротеиновых филаментов на днДНК были обнаружены при субоптимальных условиях: рН = 7,5 (Namsaraev et al., 1998), поэтому сравнение химерных белков RecAX21 с RecAX20 и
химерного белка ЯесАХ53 с белками-предшественниками по связыванию с днДНК проводили при указанном рН. В предыдущих экспериментах наибольшую разницу между химерным белком ЯесАХ21 и белками ЯесАХ20, ЯесАЕс и ЯесАРа обнаруживали при содержании хлорида магния 1 мМ в реакционных смесях, поэтому ассоциацию этих белков с днДНК проверяли в этих же условиях. Химерный белок КесАХ53, напротив, демонстрировал низкую активность при 1 мМ в предыдущих экспериментах. Обнаружить преимущества этого
белка, в сравнении с белком ЯесАРа, удавалось только при 10 мМ МяСЬ, поэтому эксперимент по изучению связывания белка ЯесАХ53 с днДНК проводили при 10 мМ М{£)Ь.
А Б
Рис. 7. Связывание белков RecA е линейной днДНК: А. Реакции проводили в ТМД, содержащем 1 мМ NlgCl-, 1,5 мМ АТФ, АТФ-регенериругощую систему, 8,4 мхМ днДНК М13тр18, линеаризованной по Eco RI, и 3 мкМ белка RecA. Б. Реакции проводили, как в А, только при 10 (вместо 1) мМ MgCIj. На графиках представлены зависимости числа гидролизованных молекул АТФ от времени для каждого RecA белка
Как видно в рис. 7А, химерный белок RecAX21 является наиболее активным в ассоциации с днДНК: он быстрее других белков преодолевает фазу медленной нуклеации и обладает практически такой же максимальной скоростью гидролиза АТФ, как и у белка RecAPa. При этом максимальные скорости гидролиза АТФ, характеризующие связывание белка RecA с днДНК, оказались у белков RecAX20 и RecAEc практически одинаковыми. Таким образом, по характеру связывания с днДНК белок RecAX21 похож на белок RecAPa, а химерный белок RecAX20 - на белок RecAEc.
Химерный белок RecAX53 также быстрее связывается с днДНК, чем белок RecAPa, и тем более, чем белок RecAEc (рис. 7Б). Таким образом, химерный белок RecAX53 превосходит белок RecAPa по эффективности ассоциации с днДНК.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Химерный белок RecAX21, отличающийся от химерного белка RecAX20 всего одной а. к. L29M и характеризующийся повышенной почти в 3 разасрекомбиногенностью, обладает свойствами, способными объяснить характерную для него повышенную рекомбинационную активность: он эффективно вытесняет белок SSB с онДНК, быстро формируя пресинаптические комплексы, и активно образует интермедиаты в реакции переноса нити, т. е, белок RecAX21 более активен на стадии инициации рекомбинационного обмена. При этом химерный белок RecAX21 эффективнее белка RecAX20 образует пресинаптические комплексы на коротких однонитевых ДНК-субстратах и медленнее диссоциирует с онДНК, что указывает на измененные межмономерные контакты в филаменте этого белка.
Активность химерного белка RecAX20 во всех проведенных исследованиях была практически такой же, как и у белка RecAEc, несмотря на различия в 5 а. к. Совокупность перечисленных фактов позволяет утверждать, что именно а. з. L29M в сайте межмономерных взаимодействий приводит к повышению рекомбиногенности белка RecAX21.
Наиболее гиперрекомбиногенный белок RecA, известный к настоящему времени, -химерный белок RecAX53, обладает следующими характеристиками, позволяющими обосновать свойственную ему гиперрекомбиногенность: он эффективно вытесняет белок SSB с онДНК и является очень активным на стадии инициации рекомбинационного обмена. Кроме этого, химерный белок RecAX53 оказался более динамически активным, чем белки-предшественники RecAEc и RecAPa: он быстрее ассоциирует с онДНК, чем белок RecAPa, и быстрее белка RecAEc диссоциирует с онДНК. Поскольку химерный белок RecAX21 медленнее диссоциирует с онДНК (при высокой скорости ассоциации с онДНК), чем белок RecAEc (но быстрее, чем белок RecAPa), мы предполагаем, что именно высокая динамичность белка RecAX53 позволяет ему чаще инициировать рекомбинационные обмены, по сравнению с химерным белком RecAX21.
Химерный белок RecAX53 содержит 12 а. з. в центральном домене, по сравнению с белком RecAEc: M170L, M175L, L178I, А179Т, L182I, Q184N, S185A, Т187С, L189V, I228T, E236D, N237E (Ogawa et al., 1992). Среди перечисленных аминокислотных позиций есть одна, непосредственно задействованная в межмономерных контактах (Chen et al., 2008): M170L,'a а. з. M175L и L178I соседствуют с а. к., участвующими в межпротомерных взаимодействиях (174, 176 и 177).
На основании анализа рекомбинационных свойств химерных белков RecAX21 и RecAX53, а также ввиду установленного факта, свидетельствующего о том, что гиперрекомбиногенность химерного белка RecAX21 тоже обусловлена измененными межмономерными взаимодействиями, мы предполагаем, что именно измененные межпротомерные контакты, характерные для этих химерных белков, являются структурной основой их повышенной рекомбиногенности.
выводы
1) Химерный белок RecAX20, отличающийся от белка RecAEc пятью а. з., по биохимическим характеристикам практически не отличается от белка RecAEc.
2) Химерный белок RecAX21, отличающийся от белка RecAX20 единственной а. з. L29M, по сравнению с белками RecAX20 и RecAEc:
а) эффективнее конкурирует с белком SSB за связывание с онДНК;
б) активнее формирует интермедиа™ в реакции переноса нити;
в) наиболее эффективен во взаимодействии с днДНК;
г) обладает измененными межмономерными взаимодействиями.
3) Химерный белок RecAX53, по сравнению с белками RecAEc и RecAPa, обладает:
а) повышенной скоростью гидролиза АТФ;
б) более активной ассоциацией и диссоциацией с онДНК;
в) более эффективной конкуренцией с белком SSB за связывание с онДНК;
г) более активным связыванием с днДНК;
д) меньшей стабильностью пресинаптических комплексов;
е) наиболее активен в инициации реакции обмена гомологичными нитями ДНК,
4) Высокая рекомбиногенность химерных белков RecAX21 и RecAX53 обеспечивается:
а) эффективной конкуренцией с белком SSB за связывание с онДНК и
б) способностью к быстрой инициации реакции переноса нити.
5) Активное связывание белков RecAX21 и RecAX53 с днДНК объясняет свойственный им SOS-независимый механизм гиперрекомбинации.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Chervyakova D., Kagansky A., Petukhov М. and Lanzov V. 2001. [L29MJ substitution in the interface of subunit-subunit interactions enhances Escherichia coli RecA protein properties important for its recombinogenic activity. J. Mol. Biol. 314: 923-3S.
2. Baitin D„ Bakhlanova I., Chervyakova D., Kil Y., Lanzov V. and Cox M. 2008. Two RecA protein types that mediate different modes of hyperrecombination. J. Bacterio!. 190(8): 30363045.
3. Червякова Д. и Ланцов В. 2008. «Гиперрекомбиногенность химерного белка RecAX53
(Esherichia coli!Pseudomonas aeruginosa) определяется его повышенной динамичностью». Экологическая генетика VI (4): 47-54.
4. Червякова Д. и Ланцов В. 2008. «Функциональные особенности химерного белка RecAX53 (Escherichia coli/Pseudomonas aeruginosa), лежащие в основе его гиперрекомбиногенности». Сборник тезисов 12-й конференции «Биология - наука XXI века». С. 113.
5. Червякова Д., Каганский А. 2000. Биохимические свойства химерного белка RtcAX2\(E.coli/P.aeruginosa), определяющие его повышенную рекомбиногенность. Сборник работ конференции молодых ученых ПИЯФ.
6. Червякова Д. 2002. Биохимические свойства химерного белка RecAXS3, определяющие его гиперрекомбиногенность. Сборник работ конференции молодых ученых ПИЯФ,
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ланцов В. 2007. Гомологическая ДНК-трансфераза RecA: функциональные активности и поиск гомологии рекомбинирующими ДНК. Молекулярная биология 41(3): 1-12.
2. Baitin D., Zaitsev Е. and Lanzov V. 2003. Hyper-recombinogenic RecA protein from Pseudomonas aeruginosa with enhanced activity of its primary DNA binding site. J. Mol. Biol 328: 1-7.
3. Bakhlanova I., Ogawa Т., Lanzov V. 2001. Recombinogenic activity of chimeric recA genes СPseudomonas aeruginosa/Escherichia coli): a search for RecA protein regions responsible for this activity. Genetics 159(1): 7-15.
4. Bianco P. and Weinstock G. 1998. Characterization of RecA1332 in vivo and in vitro. A role for alpha-helix E as a liaison between the subunit-subunit interface and the DNA and ATP binding domains of RecA protein. Genes to Cells 3; 79-97.
5. Chen Z., Yang H., Pavletich N. 2008. Mechanism of homologous recombination from the RecA-ssDNA/dsDNA structures. Nature May 22; 453:489-4.
6. Cox M., McEntee K. and Lehman I. 1981. A simple and rapid procedure for the large scale purification of the RecA protein of Escherichia coli. JBC. 256(9): 4676.
7. Cox M. 2007. Regulation of Bacterial RecA Protein Function. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 42: 41-63.
8. Lanzov, V. 2002. Hyper-recombination in Escherichia coli with and without SOS response. In Recent Research Development in DNA repair and Mutagenesis. P.: 21-38. (M. Ruiz-Rubio, E. Alejandre-Duran, and T. Roldan-Arjona, Eds). India: Kerala, Research Signpost.
9. Kowalczykowski S„ Clow J., Somani R., 1987. Varghese A. Effects of the Escherichia coli SSB protein on the binding of Escherichia coli RecA protein to single-stranded DNA. Demonstration of competitive binding and the lack of a specific protein-protein interaction. J Mol Biol. Jan 5; 193(1): 81-95.
10. Lavery P., and Kowalczykowski S. 1990. Properties of RecA441 protein-catalyzed DNA strand exchange can be attributed to an enhanced ability to compete with SSB protein. J. Biol Chem. 265: 4004-10.
11. Lavery P., Kowalczykowski S. 1992. Biochemical basis of the constitutive repressor cleavage activity of recA730 protein. A comparison to recA441 and recA803 proteins. J Biol Chem. Oct 15; 267(29): 20648-58.
12. Madiraju M., Lavery P., Kowalczykowski S. and Clark A. 1992. Enzymatic properties of the RecA803 protein, a partial suppressor of recF mutations. Biochemistry 31: 10529-10535.
13. Menetski J., Varghese A. and Kowalczykowski S. 1988. Properties of the high affinity single-stranded DNA binding state of the Escherichia coli RecA protein. Biochemistry. P.: 1205-1212.
14. Namsaraev E., Baitin D., Bakhlanova I., Alexseyev A., Ogawa H. and Lanzov V. 1998. Biochemical basis of hyper-recombinogenic activity of fseudomonas aeruginosa RecA protein in Escherichia coli cells. Mot. Microbiol. 27: 727-38.
15. Ogawa T., Shinohara A., Ogawa H., Tomizawa J. 1992. Functional structures of the recA protein found by chimera analysis. J. Mol. Biol. 226(3): 651-60.
16. Shan Q., Bork J., Webb B., Inman R. and Cox M. 1997. RecA protein filaments: end-dependent dissociation from ssDNA and stabilization by RecO and RecR proteins. J. Mol. Biol. 265: 519-40.
17. Story R., Weber I., Steitz T. 1992. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature 355:3 i 8-325.
18. Story R. and Steitz T. 1992a. Structure of the recA protein-ADP complex. Nature 355: 374.
19. Wigle T., Singleton S. 2007. Directed molecular screening for RecA ATPase inhibitors. Bioorg Med Chem. Lett. 17(12): 3249-53.
Отпечатано в типографии ПИЯФ РАН
188300, Гатчина Ленинградской обл., Орлова роща Зак. 332, тир. 100, уч.-изд. л. 1; 11.09.2009 г.
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Червякова, Дарья Борисовна
Список сокращений.
Введение.
Глава 1. Обзор литературы.
1.1. Введение.
1. 2. Функции гомологической рекомбинации.
1. 3.Функции белка RecA.
1. 4. Структурно-функциональные особенности белка RecA.
1.4. 1. Первая кристаллическая структура белка RecA.
1. 4. 2. Структуры активных филаментов RecA.
1.5. Биохимические свойства белка RecA.
1.5. 1. Реакция переноса нити.
1. 5. 2. Взаимодействие белка RecA с он ДНК.
1. 5. 3. Гидролиз АТФ.
1.5.4. Связывание белка RecA с двунитевой ДНК.
1.5.5. Роль белка SSB в реакции переноса нити.:.
1. 6. Гиперрекомбинация: SOS-зависимая и SOS-независимая.
1. 7. Гиперрекомбиногенный белок RecAPa.
1.8. Химерные белки RecAX (Pseudomonas aeruginosa/Escherichia coli).
Глава 2. Материалы и методы.
2. 1. Конструирование векторов для экспрессии химерных белков.
2. 2. Бактериальные штаммы.
2. 3. Ферменты и реактивы.
2. 4. ДНК.
2. 5. Среды.
2. 6. Подготовка хроматографических носителей для выделения белков.
2. 7. Выделение и очистка белков.
2. 8. Реакции, катализируемые белками RecA.
2. 8. 1. Гидролиз АТФ.
2. 8. 2. Реакция переноса нити.
2. 8. 3. Флюоресцентный метод анализа скорости инициации реакции переноса нити.
2. 8. 4. Точность результатов.
Глава 3. Результаты и обсуждение.:.
Исследование рекомбинационных свойств химерных белков ЫесАХ21 относительно Н.есАХ20 и химерного белка 1*есАХ53, по сравнению с белками ЯесАЕс и КесАРа.
3.1. Скорости гидролиза АТФ, характерные химерным белкам
КесАХ21, ЯесАХ20 и ЯесАХ53.
3. 2. Стехиометрия связывания химерных белков.
3.3. Аффинность химерных белков КесАХ20, ЫесАХ21 и 11есАХ53 к онДНК.
3. 4. Формирование химерными белками ЯесАХ20,11есАХ21 и ЯесАХ пресинаптических комплексов на коротких олигонуклеотидах.
3.5. Вытеснение химерными белками КесАХ21,11есАХ20 и 11есАХ53 белка ББВ с кольцевой онДНК.
3. 6. Диссоциация химерных белков КесАХ20, ЯесАХ21 и ЯесАХ с конца линейной онДНК.
3. 7. Связывание химерных белков ЯесАХ20, ЯесАХ21 и 11есАХ53 с днДНК.
3. 8. Эффективность химерных белков НесАХ21. ЯесАХ20 и ЯесАХ53 в реакции переноса нити ДНК.
3. 9. Белок ЯесАХ53 активнее белков Ясс А Ее и ЯесАРа инициирует реакцию переноса нити.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Характерные особенности химерных белков RecAX21 и RecAX53(Pseudomonas aeruginosa/Escherichia coli), обладающих повышенной рекомбиногенностью"
Актуальность проблемы Гомологическая рекомбинация (ГР) представляет собой один из фундаментальных биологических механизмов, происходящих в живой клетке. Она необходима для репарации повреждений ДНК, репликации генома и правильной сегрегации хромосом в мейозе. ГР является основным механизмом поддержания генетической изменчивости популяций (Ланцов, 2007; Roca et al., 1997).
Открытие гена г ее А, выполняющего основные функции процесса ГР у Escherichia coli, сделанное в 1965 году Кларком и Маргулисом, ознаменовало начало эры изучения молекулярных механизмов рекомбинации (Clark et al., 1965). Фундаментальную роль белка RecA в регуляции метаболизма ДНК отражает его высокая консервативность в эволюции: его структурные и функциональные гомологи были обнаружены во всех трех царствах живого - у бактерий, архей и эукариот (Amundsen et al., 2003; Kuzminov, 1999).
Образуя активный филамент на ДНК, белок RecA выполняет несколько функций в бактериальной клетке (Ланцов, 2007; Galletto et al., 2007; Roca et al., 1997). Он осуществляет основной процесс ГР — трансферазную реакцию, участвует в репарации ДНК, обладает копротеазной активностью, катализируя автокаталитическое расщепление белка LexA, ряда других репрессоров и индуцируя тем самым SOS-ответ, а также задействован в SOS-мутагенезе (Сох, 2007).
В свете важной биологической роли белка RecA, особого внимания заслуживают такие белки RecA, которые обладают усиленными рекомбинационными свойствами. Изучение свойств гиперрекомбиногенных белков RecA позволит детальнее понять осуществляемую белком RecA трансферазную реакцию и выделить наиболее важные для осуществления обмена гомологичными нитями ДНК характеристики белка RecA.
Исследование белков RecA, обладающих повышенной рекомбиногенностью, позволило выявить два механизма, приводящих к повышению частоты рекомбинационных обменов (ЧРО) в клетке: SOS-зависимый и SOS-независимый (Lanzov, 2002). В первом случае ЧРО преимущественно увеличивается в результате накопления белка RecA в клетке при RecA-опосредованной дерепрессии SOS-оперона, а во втором случае к высоким значениям ЧРО приводит повышенная активность самого белка RecA, вызванная его структурными особенностями. Известные мутантные формы белка RecA из Escherichia coli (RecAEc): белки RecA441 и RecA730 повышают ЧРО по SOS-зависимому пути (Lavery et al., 1990; Lavery et al., 1992), а белок RecA из Pseudomonas aeruginosa (RecAPa) вызывает увеличение ЧРО по SOS-независимому механизму (Namsaraev et al., 1998).
Одним из первых изученных гиперрекомбиногенных белков RecA, вызывающих повышение ЧРО по SOS-независимому пути, можно по праву считать белок RecAPa, вызывающий увеличение частоты рекомбинации в 6,5 раз по сравнению с белком RecAEc, при отсутствии индукции SOS-функций клетки (Namsaraev et al., 1998). По сравнению с белком RecAEc, с гиперрекомбиногенностыо белка RecAPa коррелирует повышенная стабильность его нуклеопротеиновых филаментов, более активное вытеснение белком RecAPa белка SSB с онДНК и связывание с днДНК, а также повышенная активность белка RecAPa в инициации реакции переноса нити ДНК (Namsaraev et al., 1998).
Для более детального исследования рекомбинационных свойств белка RecA создали 54 химерных гена г ее А, состоящих из фрагментов генов гесА из Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli (Ogawa et al., 1992). Генетический анализ выявил среди них 31 рекомбинационно полноценный ген recAX (Bakhlanova et al., 2001). Наше внимание привлекли 3 химерных гена: пара гесАХ20 и гесАХ21, и ген гесАХ53. Химерный белок RecAX21 отличается от белка RecAX20 одной аминокислотной заменой (а. з.) L29M, но при этом обладает почти втрое большей рекомбиногенностыо, чем белок RecAX20. Химерный белок RecAX20 отличается от белка RecAEc 5 а. з. и практически не отличается от него по ЧРО. Экспрессия гена гесАХ53 приводит к повышению ЧРО в бактериальных клетках почти в 9 раз, по сравнению с геном гесАЕс, и в 1,5 раза - по сравнению с recAPa (Bakhlanova et al., 2001). Все три химерные гены гесА не приводят к конститутивной индукции SOS-функций клетки, т.е. для белков RecAX21 и RecAX53 характерен SOS-независмый механизм гиперрекомбинации, как и для белка RecAPa (Bakhlanova et al., 2001). Перед нами возник вопрос: какие свойства лежат в основе повышенной рекомбиногенности белков RecAX21 и RecAX53? В представленной работе дается ответ на поставленный вопрос.
Цель работы. Целью работы было выявление тех биохимических особенностей белков RecAX21 и RecAX53, которые лежат в основе их повышенной рекомбиногенности.
Задачи исследования. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1) создание экспрессионной системы для выделения и очистки белков RecAX20, RecAX21 и RecAX53;
2) сравнение биохимических свойств белков RecAX20 и RecAX21 и изучение биохимических характеристик белка RecAX53 относительно белков-предшественников RecAEc и RecAPa по следующей схеме:
• выявление особенностей пресинаптических комплексов, формируемых химерными белками КесА;
• изучение характера взаимодействия химерных белков КесА с днДНК;
• исследование трансферазной активности в реакции переноса нити, катализируемой химерными белками КесА.
3) анализ полученных результатов и определение биохимических свойств белков ИесАХ21 и ЯесАХ53, являющихся для них общими.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Впервые выявлены характерные свойства гиперрекомбиногенных белков 11есАХ21 и ЯесАХ53, лежащие в основе их рекомбиногенности. Выявлена корреляция между высокой рекомбиногенностью мутантных белков ЯесАХ21 и ЛесАХЗЗ и их повышенной агрессивностью в инициации реакции обмена гомологичными нитями ДНК, подтверждающая гипотезу о повышенной активности гиперрекомбиногенных белков именно на стадии инициации рекомбинационного обмена (Ьапгоу, 2002). Обнаружена связь между гиперрекомбиногенностью белков КесАХ21 и ЯесАХ53 и их повышенной кинетической активностью. Предложена гипотеза о связи гиперрекомбиногенности белков ЯесА с изменениями в межмономерных взаимодействиях их нуклеопротеиновых филаментов. Найдена взаимосвязь между ЭОЗ-независимым механизмом гиперрекомбинации, свойственным белкам ЯесАХ21 и ЯесАХ53, и активным формированием этими белками нуклеопротеиновых филаментов на днДНК.
Проведенное исследование относится к числу фундаментальных. Оно позволило установить молекулярные механизмы, лежащие в основе гиперрекомбинации. Кроме фундаментальной роли, данное исследование может иметь и прикладной характер.
В перспективе гиперрекомбиногенные белки можно было бы использовать для повышения эффективности процедуры генетического модифицирования или даже генотерапии: создав конструкцию для временной экспрессии гиперрекомбиногенного белка ЯесА и введя ее в соматические клетки высших эукариот, можно было бы повысить (в норме низкую) частоту гомологической рекомбинации в клетке, увеличив тем самым эффективность адресной доставки генетического материала.
Точное знание структурно-функциональных взаимосвязей в белке КесА является необходимым условием для разработки новых антибиотиков, действие которых будет основываться на повышении эффективности известных антибактериальных препаратов путем ингибирования каких-либо функций белка КесА. Поскольку большинство антибиотиков вызывают повреждения ДНК, а репарация серьезных структурных повреждений ДНК (таких как однонитевые бреши и двунитевые разрвы ДНК) и восстановление репликации строго зависят от белка ЯесА, ингибиторы этого белка могли бы усиливать эффективность антибиотиков (\Vigle е1 а1., 2007). Белок ЫесА выполняет также основную роль в поддержании генетического разнообразия популяций и, в частности, в развитии устойчивости к антибиотикам. Одновременное применение ингибиторов белка ЯесА с антибиотиками смогло бы приостановить или даже воспрепятствовать развитию устойчивости бактерий к применяемым лекарствам.
Апробация работы.
Материалы диссертации докладывались на ежегодных конференциях молодых ученых Петербургского института ядерной физики (Гатчина, 1999—2001 гг.) и на XII Международной школе-конференции молодых ученых "Биология — наука XXI века" (Пущино, 2008 г.).
Основные положения, выносимые на защиту:
1) Белок 11есАХ20, отличающийся от белка КесАЕс пятью а. з., по биохимическим характеристикам практически не отличается от белка КесАЕс.
2) По сравнению с белками 11есАХ20 и КесАЕс, белок КесАХ21: а) обладает пониженной скоростью гидролиза АТФ; б) эффективнее конкурирует с белком ЭЗВ за связывание с однонитевой ДНК (он ДНК); в) эффективнее связывается с короткими онДНК; г) медленнее диссоциирует с 5'-конца онДНК; д) более эффективен в инициации реакции переноса нити; е) обладает неизмененной стабильностью пресинаптических комплексов; е) активнее связывается с двунитевой ДНК (днДНК).
3) По сравнению с белками КесАЕс и ЯесАРа, гиперрекомбиногенный белок ЯесАХ53: а) обладает повышенной скоростью гидролиза АТФ; б) эффективнее вытесняет белок ЯвВ с онДНК; в) активнее белка КесАЕс, но менее эффективно, чем белок ЯесАРа, связывается с короткими онДНК; г) характеризуется ускоренной диссоциацией с онДНК; д) более активен в инициации реакции переноса нити; е) обладает меньшей стабильностью пресинаптических комплексов; ж) активнее связывается с днДНК.
4) Сравнительный анализ свойств белков ЯесАХ21 и 11есАХ53 позволяет заключить, что их высокая рекомбиногенность обеспечивается: а) эффективной конкуренцией с белком ББВ за связывание с онДНК и б) способностью к быстрой инициации реакции переноса нити.
5) Активное связывание химерных белков ЯесАХ21 и ЯесАХ53 с днДНК объясняет свойственный этим белкам БОВ-независимый механизм гиперрекомбинации.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Червякова, Дарья Борисовна, Санкт-Петербург
1. Ланцов В. А. 2007. Гомологическая ДНК-трансфераза RecA: функциональные активности и поиск гомологии рекомбинирующими ДНК. Молекулярная биология. 41(3):1-12.
2. Остерман Л.Ф. 1986. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М: Наука.
3. Amundsen S.K. Smith G.R.2003. Interchangeable parts of the Escherichia coli recombination machinery. Cell. 21; 112(6): 741-744.
4. Arenson T.A. Tsodikov O.V. Cox M.M. 1999. Quantitative analysis of the kinetics of end-dependent disassembly of RecA filaments from ssDNA. J. Mol. Biol: May 7; 288(3): 391-401.
5. Baitin D.M. Zaitsev E.N. and Lanzov V.A. 2003. Hyper-recombinogenic RecA protein from Pseudomonas aeruginosa with enhanced activity of its primary DNA binding site. J. Mol. Biol. 328: 1-7.
6. Bakhlanova I.V. Lantsov V.A. 2000. Recombinational properties of the chimeric recA genes (Pseudomonas aeruginosa/Escherichia coli): gene regions responsible for the recombinational activity of the protein encoded. Dokl Biol Sei. Mar-Apr; 371: 168-171.
7. Bakhlanova I.V. Ogawa T. Lanzov V.A.2001. Recombinogenic activity of chimeric recA genes (Pseudomonas aeruginosa/Escherichia coli): a search for RecA protein regions responsible for this activity. Genetics. Sep; 159(1): 7-15.
8. Balcht A. Smith R. 1994. Pseudomonas Aeruginosa: Infections and Treatment. Informa Health Care. pp. 83-84. ISBN 0-8247-9210-6.
9. Bianco P. Weinstock G. 1998. Characterization of RecA1332 in vivo and in vitro. A role for alpha-helix E as a liaison between the subunit-subunit interface and the DNA and ATP binding domains of RecA protein. Genes to Cells. 3: 79-97.
10. Birnboim H.C. Doly J. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7(6): 1513-1523.
11. Blaho J.A. Wells R.D.I989. Left-handed Z-DNA and genetic recombination. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 37:107-126.
12. Bradford M.M.I976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.
13. Brenner S.L. Mitchell R.S. Morrical S.W. Neuendorf S.K. Schutte B.C. Cox M.M. 1987. RecA protein-promoted ATP hydrolysis occurs throughout RecA nucleoprotein filaments. J Biol Chem. 262:4011-4016.
14. Bresler S.E. and Lanzov Y.A. 1978. Inducible recombination in Escherichia coli K-12: recombinogenic effect of tifl mutation. Rep. Acad. Sci. USSR. 238: 715-717.
15. Bryant F.R. Riddles P.W. Lehman I.R.1984. Studies of the mechanism of DNA pairing by the RecA protein of Escherichia coli. Cold Spring Harbour Symp. Quant. Biol. 49: 513.
16. Campbell M. J. Davis R. W. 1999. Toxic mutations in the recA gene of E. coli prevent proper chromosome segregation. J. Mol. Biol. 286: 417-435.
17. Chen Z. Yang H. Pavletich N.P.2008. Mechanism of homologous recombination from the RecA-ssDNA/dsDNA structures. Nature. May 22; 453(7194): 489-454.
18. Clark A.J. and Margulies A.D. 1965. Isolation and characterization of recombination-deficient mutants of Escherichia Coli K12. Proc Natl Acad Sci USA. Feb; 53:451-459.
19. Clark A.J. 1996. RecA mutants of E. coli K12: a personal turning point. Bioessays . 18(9): 767-772.
20. Cox J.M. Li H. Wood E.A. Chitteni-Pattu S. Inman R.B. Cox M.M. 2008. Defective dissociation of a "slow" RecA mutant protein imparts an Escherichia coli growth defect. J Biol Chem. Sep 5; 283(36): 24909-24921.
21. Cox M.M. McEntee K. and Lehman I.R. 1981. A simple and rapid procedure for the large scale purification of the recA protein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. May 10; 256(9): 46764678.
22. Cox M.M. 1994. Why does RecA protein hydrolyze ATP? Trends Biochem. Sciences. 19: 217-222.
23. Cox M.M. Goodman M.F. Kreuzer K.N. Sherratt D.J. Sandler S.J. Marians K.J. 2000. The importance of repairing stalled replication forks. Nature. Mar 2; 404(6773): 37-41.
24. Cox J.M. Abbott S.N. Chitteni-Pattu S. Inman R.B. Cox M.M. 2006. Complementation of one RecA protein point mutation by another. Evidence for trans catalysis of ATP hydrolysis. J. Biol. Chem. 281: 12968-12975.
25. Cox M.M. 2007. Regulation of Bacterial RecA Protein Function. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 42: 41-63.
26. Craig N.L. Roberts J.W. 1981. Function of nucleoside triphosphate and polynucleotide in Escherichia coli recA protein-directed cleavage of phage lambda repressor. J. Biol. Chem. 256(15): 8039-8044.
27. DiCapua E. Cuillel M. Hewat E. Schnarr M. Timmins P. and Ruigrok R. 1992. Activation of recA protein. The open helix model for LexA cleavage. J. Mol. Biol. 226(3): 707-719.
28. Egelman E.H. Stasiak A. 1988. Structure of helical RecA-DNA complexes. II. Local conformational changes visualized in bundles of RecA-ATP gamma S filaments. J Mol Biol. Mar 20; 200(2): 329-349.
29. Eidin S. Forget A.L. Lindenmuth D.M. Logan K.M. Knight K.L.2000. Mutations in the N-terminal region of RecA that disrupt the stability of free protein oligomers but not RecA-DNA complexes. J Mol Biol. May 26; 299(1): 91-101.
30. Friedberg E.C. Walker G.C. Siede W. Wood R.D. Schultz R.A. and Ellenberger T. 1995. DNA Repair and Mutagenesis, 2nd ed. ASM Press, Washington, D.C.
31. Galletto R. Kowalczykowski S.C. 2007. RecA. Curr Biol. Jun 5;17(11): 395-397.
32. Goodman M.F. 2002. Error-prone repair DNA polymerases in prokaryotes and eukaryotes. Annu. Rev. Biochem. 71: 17—50.
33. Heuser J. Griffith J. 1989.Visualization of RecA protein and its complexes with DNA by quick-freeze/deep-etch electron microscopy. J Mol Biol. Dec 5; 210(3): 473-484.
34. Iglewski B. 1996. Pseudomonas. In: Baron's Medical Microbiology (Baron S et al., eds.) (4th ed.). Univ of Texas Medical Branch. ISBN 0-9631172-1-1.
35. Jwang B. Radding C.M. 1992. Torsional stress generated by RecA protein during DNA strand exchange separates strands of a heterologous insert. Proc Natl Acad Sei USA. Aug 15; 89(16): 7596-7600.
36. Kato R. Kuramitsu S. 1999. Characterization of thermostable RecA protein and analysis of its interaction with single-stranded DNA. Eur J Biochem. Feb; 259(3): 592-601.
37. Konforti B.B. Davis R.W. 1992. ATP hydrolysis and the displaced strand are two factors that determine the polarity of RecA-promoted DNA strand exchange. JMol Biol. Sep 5; 227(1): 3853.
38. Korolev V.G. 2007. Molecular mechanisms of double strand break repair in eukaryotes. Radiats Biol Radioecol. Jul-Aug; 47(4): 389-401.
39. Kowalczykowski S.C. 1991. Biochemistry of genetic recombination: energetics and mechanism of DNA strand exchange. Annu Rev Biophys Biophys Chem. 20: 539-75.
40. Kowalczykowski S.C. and Eggelston A.K. 1994. Homologous pairing and DNA strandexchange proteins. Annu Rev Biochem. 63: 991-1043.
41. Kurumizaka H. Ikawa S. Ikeya T. Ogawa T. Shibata T. 1994. A chimeric RecA protein exhibits altered double-stranded DNA binding. J Biol Chem. Jan 28; 269(4): 3068-3075.
42. Kurumizaka H. Aihara H. Ikawa S. Shibata T. 2000. Specific defects in double-stranded DNA unwinding and homologous pairing of a mutant RecA protein. FEBS Lett. Jul 14; 477(1-2): 129-134
43. Kuzminov A. 1999. Recombinational repair of DNA damage in Escherichia coli and bacteriophage lambda. Microbiol Mol Biol Rev. Dec; 63(4): 751-813.
44. Laemmly U.K. 1970. Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.
45. Lauder S.D. Kowalczykowski S.C. 1991. Asymmetry in the recA protein-DNA filament. J Biol Chem. Mar 25; 266(9): 5450-5458.
46. Lavery P.E. and Kowalczykowski S.C. 1990. Properties of RecA441 protein-catalyzed DNA strand exchange can be attributed to an enhanced ability to compete with SSB protein. J. Biol. Chem. 265: 4004-4010.
47. Lavery P.E. Kowalczykowski S.C. 1992. Biochemical basis of the constitutive repressor cleavage activity of recA730 protein. A comparison to recA441 and recA803 proteins. J Biol Chem. Oct 15; 267(29): 20648-20658.
48. Lee J.W. and Cox M.M. 1990. Inhibition of recA protein promoted ATP hydrolysis. 1. ATPgS and ADP are antagonistic inhibitors. Biochemistry 29: 7666-7676.
49. Lee J.W. and Cox M.M. 1990a. Inhibition of recA protein promoted ATP hydrolysis. 2. Longitudinal assembly and disassembly of recA protein filaments mediated by ATP and ADP. Biochemistry. 29: 7677-7683.
50. Lindsley J.E. and Cox M.M. 1989. Dissociation pathway for recA nucleoprotein filaments formed on linear duplex DNA. J. Mol. Biol. 205: 695-711.
51. Little J.W. Mount D.W. 1982. The SOS regulatory system of Escherichia coli. Cell. May; 29(1): 11-22.
52. Lloyd. R.G. 1978. Hyper-recombination in Escherichia coli K-12 mu C/ontants constitutive for protein X synthesis. J. Bacteriol. 134: 929-935.
53. Madiraju M.V. Lavery P.E., Kowalczykowski S.C., and Clark A.J. 1992. Enzymatic properties of the RecA803 protein, a partial suppressor of recF mutations. Biochemistry. 31: 10529-10535.
54. Malkov V.A. & Camerini-Otero R.D. 1995. Photocross-links between single-stranded DNA and Escherichia coli RecA protein map to loops LI (amino acid residues 157—164) and L2 (amino acid residues 195-209). J. Biol. Chem. 270: 30230-30233.
55. Marrione P.E. and Cox M.M. 1995. RuvB protein-mediated ATP hydrolysis: functional asymmetry in the RuvB hexamer. Biochemistry. 34: 99809.
56. McGrew D.A. & Knight K.L. 2003. Molecular design and functional organization of the RecA protein. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 38: 385-432.
57. Menetski J.P. and Kowalczykowski S.C. 1985. Interaction of recA protein with single-stranded DNA. Quantitative aspects of binding affinity modulation by nucleotide cofactors. J. Mol. Biol. 181: 281.
58. Menetski J.P. Varghese A. and Kowalczykowski S.C. 1988. Properties of the high affinity single-stranded DNA binding state of the Escherichia coli RecA protein. Biochemistry. Feb 23; 27(4): 1205-1212.
59. Menetski J.P. Varghese A. Kowalczykowski S.C. 1992 The physical and enzymatic properties of Escherichia coli recA protein display anion-specific inhibition. J Biol Chem. May 25; 267(15): 10400-10404.
60. Mikawa T. Masui R. Ogawa T. Ogawa H. Kuramitsu S. 1995. N-terminal 33 amino acid residues of Escherichia coli RecA protein contribute to its self-assembly. J Mol Biol. Jul 21; 250(4): 471-483.
61. Mikawa T. Masui R. Kuramitsu S. 1998. RecA Protein Has Extremely High Cooperativity for Substrate in Its ATPase Activity. J. Biochem. 123: 450-457.
62. Mitchell A.H. and West S.C. 1994. Hexameric rings of Escherichia coli RuvB protein. Cooperative assembly, processivity and ATPase activity. J.Mol. Biol. Oct 21; 243(2): 208-215.
63. Morimatsu K. Horii T. and Takahishi M. 1995. Interaction of Tyrl03 and Tyr264 of the RecA protein with DNA and nucleotide cofactors. Fluorescence study of engineered proteins. Eur J Biochem. Mar 15; 228(3): 779-785.
64. Morimatsu K. and Horii T. 1995a. Analysis of the DNA binding site of Escherichia coli RecA protein. Adv. Biophys. 31: 23-48.
65. Muniyappa K. Williams K. Chase J.W. Radding C.M. 1990. Active nucleoprotein filaments of single-stranded binding protein and recA protein on single-stranded DNA have a regular repeating structure. Nucleic Acids Res. Jul 11; 18(13): 3967-3973.
66. Namsaraev E.A. Baitin D. Bakhlanova I.V. Alexseyev A.A. Ogawa H. and Lanzov V.A. 1998. Biochemical basis of hyper-recombinogenic activity of Pseudomonas aeruginosa RecA protein in Escherichia coli cells. Mol. Microbiol. 27: 727-738.
67. Nayak S. Bryant F.R. 1999. Differential rates of NTP hydrolysis by the mutant S69G.RecA protein. Evidence for a coupling of NTP turnover to DNA strand exchange. J Biol Chem. Sep 10; 274(37): 25979-25982.
68. Neuendorf S.K. and Cox M.M. 1986. Exchange of recA protein between adjacent recA protein-single-stranded DNA complexes. J. Biol. Chem. 261: 8276-8282.
69. Nguyen T.T. Muench K.A. & Bryant F.R. 1993. Inactivation of the RecA protein by mutation of histidine 97 or lysine 248 at the subunit interface. J. Biol. Chem. 268: 3107-3113.
70. Ogawa T. Wabiko H. Tsurimoto T. Horii T. Masukata H. Ogawa H. 1979. Characteristics of purified recA protein and the regulation of its synthesis in vivo. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 2(909): 909-915.
71. Ogawa T. Shinohara A. Ogawa H. Tomizawa J. 1992. Functional structures of the recA protein found by chimera analysis. J. Mol. Biol. Aug 5; 226(3): 651-660.
72. Petukhov M. Kil Y. Kuramitsu S. Lanzov V. 1997. Insights into thermal resistance of proteins from the intrinsic stability of their alpha-helices. Proteins. Nov; 29(3): 309-320.
73. Pinsince J.M. Griffith J.D. 1992. Early stages in RecA protein-catalyzed pairing. Analysis of coaggregate formation and non-homologous DNA contacts. J. Mol. Biol. Nov 20 ;228(2): 409420.
74. Pugh B.F. and Cox M.M. 1987. Stable binding of recA protein to duplex DNA. Unraveling a paradox. J. Biol. Chem. 262: 1326-1336.
75. Pugh B.F. and Cox M.M. 1988. High salt activation of RecA protein ATPase in the absence of DNA. J. Biol Chem. Jan 5; 263(1): 76-83.
76. Pugh B.F. Schutte B.C. and Cox M.M. 1989. Extent of duplex DNA underwinding induced by recA protein binding in the presence of ATP. J. Mol. Biol. Feb 5; 205(3): 487-492.
77. Rao B.J. Radding C.M. 1993. Homologous recognition promoted by RecA protein via non-Watson-Crick bonds between identical DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Jul 15; 90(14): 6646-6650.
78. Rice K.P. and Cox M.M. 2001. Recombinational DNARepair in Bacteria: Postreplication. ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES. Nature Publishing Group, pp.1-8.
79. Riddles P.W. and Lehman I.R. 1985. The formation of paranemic and plectonemic joints between DNA molecules by the recA and single-stranded DNA-binding proteins of Escherichia coli. J. Biol. Chem. Jan 10; 260(1): 170-173.
80. Roberts J.W. Roberts C.W. Craig N.L. Phizicky E.M. 1979. Activity of the Escherichia coli recA-gene product. Cold Spring Harbor Symp Quant Biol. 43: 917-920.
81. Robu M.E. Inman R.B. Cox M.M. 2001. RecA protein promotes the regression of stalled replication forks in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. Jul 17; 98(15): 8211-8218.
82. Roca A.I. Cox M.M. 1990. The RecA protein: structure and function. CRC Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 25(6): 415-456.
83. Roca A.I. Cox M.M 1997. RecA protein: structure, function, and role in recombinational DNA repair. Progress in Nucleic Acid Research & Molecular Biology 56(129): 129-223.
84. Roman L.J. and Kowalczykowski S.C. 1986. Relationship of the physical and enzymatic properties of Escherichia coli recA protein to its strand exchange activity. Biochemistry. Nov 18; 25(23): 7375-7385.
85. Sano Y. and Kageyama M. 1987. The sequence and function of the recA gene and its protein in Pseudomonas aeruginosa PAO. Mol. Gen. Genet. 208: 412-419.
86. Sambrook J. Fritsch E.F. Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor, NY.
87. Saraste M. Shibbald P.R. and Wittinghofer A. 1990. The P-loop~a common motif in ATP-and GTP-binding proteins. Trends Biochem. Sci. Nov; 15(11): 430-434.
88. Scherbakova O.G. Lanzov V.A. Filatov M.V. 2000. Overexpression of bacterial RecA protein in somatic mammalian cells increases the frequency of gene targeting. Dokl Biochem. Mar-Apr; 371(1-6): 69-72.
89. Schlacher K. Cox M.M. Woodgate R. Goodman M.F. 2006. RecA acts in trans to allow replication of damaged DNA by DNA polymerase V. Nature. Aug 24; 442(7105): 883-887.
90. Schutte B.C. and Cox M.M. 1988. Homology-dependent changes in adenosine 5'-triphosphate hydrolysis during recA protein promoted DNA strand exchange: evidence for long paranemic complexes. Biochemistry. Oct 4; 27(20): 7886-7894.
91. Shan Q. and Cox M.M. 1996. RecA protein dynamics in the interior of RecA nucleoprotein filaments. J. Mol. Biol. 257: 756-774.
92. Shan Q. Bork J.M. Webb B.L. Inman R.B. and Cox M.M. 1997. RecA protein filaments: end-dependent dissociation from ssDNA and stabilization by RecO and RecR proteins. J. Mol. Biol. 265: 519-540.
93. Shevelev I.V. Kravetskaya T.P. Legina O.K. Krutyakov V.M. 1996. 'External' proofreading of DNA replication errors and mammalian autonomous 3'~>5'exonucleases. Mutat Res. Jun 10; 352(1-2): 51-55.
94. Stasiak A. & Di Capua E. 1982. The helicity of DNA in complexes with RecA protein. Nature. 299: 185-186.
95. Story R.M., Weber I.T. Steitz T.A. 1992. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature. Jan 23; 355(6358): 318-325.
96. Story R.M. and Steitz T.A. 1992a. Structure of the recA protein-ADP complex. Nature. Jan 23; 355(6358): 374-376.
97. Symington L.S. 2002. Role of RAD52 epistasis group genes in homologous recombination and double-strand break repair. Microbiol Mol Biol Rev. 66(4): 630-670.
98. Takahashi M. and Norden B. 1994. Structure of RecA-DNA complex and mechanism of DNA strand exchange reaction in homologous recombination. Adv. Biophysics. 30: 1-35.
99. Tessman E.S. Peterson P. 1985. Plaque color method for rapid isolation of novel recA mutants of Escherichia coli K-12: new classes of protease-constitutive recA mutants. J Bacteriol. Aug; 163(2): 677-687.
100. Ullsperger C.J. Cox M.M. 1995. Quantitative RecA protein binding to the hybrid duplex product of DNA strand exchange. Biochemistry. Aug 29; 34(34): 10859-10866.
101. Wang Y. & Adzuma K. 1996. Differential proximity probing of two DNA binding sites in the Escherichia coli RecA protein using photo-cross-linking methods. Biochemistry. 35: 35633571.
102. Wang W.B. Tessman E.S. 1986. Location of functional regions of the Escherichia coli RecA protein by DNA sequence analysis of RecA protease-constitutive mutants. J Bacteriol. Nov; 168(2): 901-910.
103. Weinstock G.M. McEntee K. Lehman I.R. 1981. Hydrolysis of nucleoside triphosphates catalyzed by the recA protein of Escherichia coli. Hydrolysis of UTP. J Biol Chem. Aug 25; 256(16): 8856-8858.
104. Wigle T.J. Singleton S.F. 2007. Directed molecular screening for RecA ATPase inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. Jun 15; 17(12): 3249-3253.
105. Wittung P. Funk M. Jernstrom B. Norden B. Takahashi M. 1995. Fluorescence-detected interactions of oligonucleotides in RecA complexes. FEBS Lett. Jul 10; 368(1): 64-68.
106. Yu X. and Egelman E.H. 1992. Structural data suggest that the active and inactive forms of the RecA filament are not simply interconvertible. J. Mol. Biol. Sep 5; 227(1): 334-346.
107. Yu X. and Egelman E.H. 1993. The LexA repressor binds within the deep helical groove of the activated RecA filament. J Mol Biol. May 5; 231(1): 29-40.
108. Yu X, Jacobs S.A. West S.C. Ogawa T. Egelman E.H. 2001. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98(15): 8419-8424.
-
Червякова, Дарья Борисовна
-
кандидата биологических наук
-
Санкт-Петербург, 2009
-
ВАК 03.00.03
- Микробиология нозокомиальной синегнойной инфекции: мониторинг распространенности, биологические особенности возбудителя и новые подходы к диагностике
- Частота обменов при конъюгационной рекомбинации у escherichia coli К-12 и структура белка reca
- Молекулярно-генетические механизмы повышенной устойчивости бактерий к потенциально-летальным повреждениям ДНК
- Влияние уровня антиинфекционной защиты организма и условий внешней среды на структуру популяций Pseudomonas aeruginosa по биологическим признакам
- Контроль экспрессии генов в процессе подвижности грамотрицательных бактерий
