Новая ациламидаза из Rhodococcus erythropolis - свойства, гетерологичная экспрессия и практическое применение

Лавров, Константин Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новая ациламидаза из Rhodococcus erythropolis - свойства, гетерологичная экспрессия и практическое применение
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Новая ациламидаза из Rhodococcus erythropolis - свойства, гетерологичная экспрессия и практическое применение"

На правах рукописи

Лавров Константин Валерьевич

Новая ациламидаза из Шюйососсия егуШгороИъ - свойства, гетерологичная экспрессия и практическое применение.

03.02.07 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 7 Я Н В 2011

Москва, 2010 г.

4843456

Работа выполнена в лаборатории Генетики . биотрансформации и биодеградации ФГУП «ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов».

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Яненко Александр Степанович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Синеокий Сергей Павлович ФГУП ГосНИИ генетика

доктор биологических наук, профессор Ефременко Елена Николаевна МГУ им. Ломоносова

Ведущая организация: Институт молекулярной генетики РАН

Зашита состоится « \ » Л 2011 года в 1Ц часов на заседании

диссертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, Москва, 1-ый Дорожный пр., д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Автореферат разослан « » декабря 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат химических наук

Т.Л. Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Использование микроорганизмов и их ферментов для устойчивого и экологически безопасного получения разнообразных химических соединений является одним из приоритетных направлений развития биотехнологии. По оценкам экспертов в течение текущего десятилетия доля биотехнологических продуктов в общем объеме химической продукции возрастет в 10 раз. Особенно быстрыми темпами (более чем в 15 раз) будет увеличиваться производство полимеров из мономеров, получаемых с помощью биотехнологий. Сегодня в промышленных масштабах с помощью биотехнологий уже производится 3 мономера: акриламид, молочная кислота и 1,3 - пропандиол. Реализованные проекты продемонстрировали значительные преимущества биотехнологий в сравнении с традиционными химическими технологиями: биокатализаторы позволяют осуществлять процессы при мягких условиях (низкие температуры, нейтральная водная среда) и с высокой селективностью. Однако главное преимущество биокаталитических процессов состоит в том, что они, в целом, экологически безопаснее традиционных химических процессов и приводят к снижению выбросов и отходов (ионов металлов, различных солей, растворителей и пр.). Несмотря на явные преимущества биокаталитических систем, масштабы их использования в современной химической индустрии и, в частности, для получения мономеров, все еще ограничены. Для расширения спектра получаемых мономеров требуются новые биокаталитические системы с уникальными свойствами, которые позволят разработать экономически эффективные технологии, способные составить конкуренцию существующим технологиям. Синтез акриловых мономеров с использованием биокаталитических систем микроорганизмов является одной из немногих областей промышленной биотехнологии, где у России имеются приоритетные достижения в практической области. Данная работа направлена на решение проблемы экологически-безопасного и конкурентоспособного получения новой группы мономеров полимерного качества - Ы-замещенных акриламидов,

продуктами сополимеризации которых с акриламидом являются катионные флокулянты для очистки воды, повышения нефтеотдачи, добычи полезных ископаемых, а также полимеры с температуро-зависимой растворимостью, т.н. «smart» полимеры. Решение этой проблемы связывается с обнаружением новых ферментов, способных синтезировать N-замещенные акриламиды путём ацилирования аминов ацильным остатком акриламида в водной среде.

Цель и задачи работы.

Целью данной работы являлось обнаружение и характеристика нового фермента, способного синтезировать N-замещенные акриламиды путём ацилирования аминов ацильным остатком акриламида в водной среде, изучение гена кодирующего этот фермент, а также оценка биокаталитического потенциала нового фермента в области органического синтеза. В процессе работы решались следующие задачи:

1. Скрининг микроорганизмов, способных гидролизовать амидную связь в N-изопропилакриламиде.

2. Выбор лучшего штамма, катализирующего синтез N-изопропилакриламида.

3. Изучение особенностей биосинтеза ациламидазы и оптимизация условий, обеспечивающих максимальную активность клеток выбранного штамма.

4. Выделение ациламидазы и изучение её каталитических свойств.

5. Клонирование гена, кодирующего ациламидазу, секвенирование и анализ последовательности.

6. Интегративная инактивация гена ациламидазы в выбранном штамме и проверка фенотипа мутантов.

7. Гетерологичная экспрессия гена, кодирующего ациламидазу, в Escherichia coli.

8. Разработка процесса биокаталитического синтеза N-замещённых акриламидов с использованием новой ациламидазы.

Научная новизна и практическая значимость.

Обнаружен новый бактериальный фермент ациламидаза в клетках Лйо^/ососсм5 егу1\\горо1Ь ТА37, способный гидролизовать Ы-замешённые амиды и осуществлять перенос ацильного остатка акриламида на алифатические амины в водной среде. Аминокислотная последовательность ациламидазы значительно отличается от последовательностей всех известных белков (уровень гомологии с известными белками не превышает 37%). Уникальные свойства обнаруженного фермента и созданного на его основе катализатора позволили впервые в мировой практике использовать биокаталитические системы для синтеза Ы-замещенных акриламидов путем непосредственного взаимодействия акриламида и аминов в водной среде при температуре 20-30°С.

Апробация работы.

Диссертационная работа была апробирована на семинаре секции «Генетика микроорганизмов» Учёного Совета ФГУП «ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов» в ноябре 2010 года. Материалы диссертации докладывались на Международной конференции «Биология - наука XXI века», Пущино 19 апреля - 23 апреля 2010 г. Публикации.

По теме диссертации опубликовано три печатных работы, из них одна статья в журнале, входящем в список, рекомендованный ВАК, один патент и одно тезисное сообщение в материалах научной конференции, а также зарегистрирована заявка на патент. Структура работы.

Диссертация состоит из 6 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Список цитируемой литературы». Работа изложена на страницах, включая

рисунков и 1_ таблиц.. Список цитируемой литературы содержит

источников, в том числе Уд на русском языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Скрининг микроорганизмов, способных гидролизовать амидную связь в ]Ч-изопропилакриламиде.

Особенности каталитического механизма гидролаз давали основание предполагать, что среди ферментов, способных гидролизовать амидную связь в М-замещенных акриламидах, могут быть обнаружены ферменты, способные синтезировать 1Ч-замещенные акриламида непосредственно из акриламида и соответствующего амина.

Стратегия поиска подобных ферментов включала следующие этапы:

1) скрининг штаммов, способных расти на Ы-замещенном акриламиде - Ы-изопропилакриламиде (ИПАА).

2) Доказательство гидролиза нерастущими клетками штаммов амидной связи в ИПАА путем идентификации продуктов гидролиза.

3) Проверка способности ИПАА-гидролизующих штаммов синтезировать ИПАА.

Для нахождения штаммов, гидролизующих ИПАА до изопропиламина и акриловой кислоты выделялись штаммы, способные усваивать ИПАА для роста как единственный источник углерода. Для поиска использовалась лабораторная коллекция из 120 нитрилутилизирующих штаммов, и 72 почвенных образца из разных регионов России. С помощью проверки роста на ИПАА коллекционных штаммов и обогатительных культур было изолировано 52 штамма, способных расти в жидкой среде на ИПАА как единственном источнике углерода. Все штаммы были способны гидролизовать ИПАА до изопропиламина и акриловой кислоты при смешивании нерастущих клеток и субстрата ИПАА (биотрансформация) (рис. 1).

Рис. 1. Схема гидролиза Ы-изопропилакриламида до изопропиламина и акриловой кислоты.

Присутствие в продуктах биотрансформации только изопропиламина и акриловой кислоты было подтверждено с помощью газовой хроматографии.

2. Выбор лучшего штамма, катализирующего синтез 14-изопропплакриламида.

Штаммы 19, 20, 38, 43, 44, ТА37, клетки которых обладали наибольшей удельной активностью гидролиза ИПАА (1-2 мкМ ИПАА/мг с.в. клеток*час), были проверены на способность синтезировать ИПАА из акриламида и изопропиламина в ходе биотрансформации. Все они были способны синтезировать до 3 г/л ИПАА из акриламида и изопропиламина. Исследование динамики биокаталитического синтеза (рис. 2) показало, что штамм ТА37 обладает максимальной активностью синтеза ИПАА. Он и был отобран для дальнейших исследований.

Концентрация ИПАА, г/л

Время синтеза, ч

Рис. 2. Динамика синтеза Ы-изопропилакриламида из акриламида и изопропиламина шестью штаммами - лучшими гидролитиками ИПАА.

На основании морфологии колоний, физиолого-биохимических тестов, морфологии клеток, наличия характерного цикла развития, и последовательности гена 16Б рибосомальной РНК штамм ТА37 был отнесен к роду Шюс1ососси$ и виду егуЛгоро/и. Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером ВКПМ Ас-1793.

Было предположено, что способность клеток штамма К егуМгороШ ТА37 гидролизовать и синтезировать ИПАА обусловлена присутствием в клетках нового фермента - ациламидазы, проявляющей эти две активности.

3. Изучение особенностей биосинтеза ациламидазы и оптимизация условий, обеспечивающих максимальную активность клеток Я. етуОггороШ ТА37

Индукторы ациламидазы.

Синтез ациламидазы в штамме К егуЛгороИз ТА37 оказался индуцибельным. Ациламидазная (ИПАА гидролизующая) активность наблюдалось только в том случае, когда клетки росли на ИПАА и других Ы-замещённых амидах - ацетанилиде, метилен-бис-акриламиде (МБАА) (табл. 1). Выращивание штамма на сахарах, спиртах, кислотах, амидах, нитрилах, мочевине не приводило к её появлению.

Табл. 1 Рост и ациламидазная активность штамма ТА37 при выращивании на М-замещёниых амидах.

Источник «С» для роста Накапливаемая биомасса, г/л Активность*, мкМ/мг с.в.*час

ИПАА 0,3-0,4 1,5-2

Ацетанилид 0,2-0,3 0,8-1

МБАА 0,2-0,3 0,8-1

Глюкоза 2-2,5 0

^активность измерялась по скорости гидролиза ИПАА

Наибольший уровень ациламидазной активности индуцировался при выращивании на ИПАА.

Локализация ациламидазы в клетке.

Для выяснения локализации исследуемой ациламидазы в клетке культуры Л. егу1кгороИ$ ТА37 выращивали с индуктором (ИПАА) и проводили измерение гидролитической активности культуральной жидкости и клеток. В культуральной жидкости обнаруживалось не более 10% от общего урожая активности, из чего было сделано заключение, что исследуемый фермент не является секретируемым. Для выяснения внутриклеточной локализации ациламидазы клетки были подвергнуты ультразвуковому разрушению, и активность ациламидазы была измерена раздельно в бесклеточном экстракте и клеточном дебрисе. Оказалось, что при разрушении клеток и отделении дебриса большая часть активности оказывается в бесклеточном экстракте.

Анализ растворимых клеточных белков с помощью электрофореза в ПААГ показал, что выращивание на ИПАА приводит к появлению заметного количества белка с молекулярным весом около 55 кДа (рис. 2).

кЦа ^^ 12 3

■ Рис. 2. Электрофорез в 10% Вэ-ЫаПААГ

Ш - ~ - растворимых белков штамма ТА37,

12)..... выращенного в разных условиях. М -

85 - ' ■ маркер молекулярного веса белков; 1 -

60 -40 -

30 -25 20 -

клетки выращены на минимальном среде МЗ с глицерином, 2 - на минимальной среде МЗ с ацетамидом, 3 - на минимальной среде МЗ с ИПАА.

Таким образом, новая ациламидаза оказалась внутриклеточным растворённым белком с молекулярной массой субъединицы около 55кДа. Условия, обеспечивающие максимальную активность клеток Я. егуШгороИх ТА37.

Исследовалось влияние концентрации индуктора ИПАА в среде, температуры и времени выращивания культуры на удельную ациламидазную активность

клеток. Подобраны оптимальные условия выращивания для достижения максимальной удельной активности клеток (3-4 мкМ/мг с.в.*час) - 60-70 часов выращивания на минимальной среде с 0,2% ИПАА при 30°С (рис. 3).

20 40

Время выращивания, ч

Рис. 3. Динамика роста и удельной ациламидазной активности штамма Я. егугкгороНя ТАЗ 7. Выращивание производилось на минимальной среде МЗ с ИПАА и МН41ЧОз. а измерение активности - по скорости гидролиза ИПАА.

Было выяснено также, что штамм не растёт при концентрациях ИПАА 0,5% и выше.

4. Выделение новой ациламидазы и изучение её каталитических свойств.

Для выделения ациламидазы использовался бесклеточный экстракт клеток К. егу^гороШ ТА37, выращенных в условиях максимальной индукции ациламидазы. Выделение ациламидазы проводилось с помощью ионообменной хроматографии на хроматографе среднего давления в градиенте концентрации

был выделен в хроматографически и электрофоретически

4).

2 Рис. 4. Оз-Ыа электрофорез в 10% ПААГ, демонстрирующий экспрессию амидазы и её очистку в ходе выделения: М - маркер молекулярного веса белков; 1 -бесклеточный экстракт из клеток Я

........ еппИгороИх ТА37, 2 - ациламидаза,

хроматографически выделенная из бесклеточного экстракта на ШТгар Мопо(^.

30 ~ — ■ 25 -

Препарат чистого фермента был использован для изучения субстратной специфичности ациламидазы. Оказалось, что спектр субстратов ациламидазы включает как К-замещённые, так и незамещённые амиды. Активности гидролиза п-нитроанилидов кислот, ]ч|-замещённых акриламидов, Ы-ацетилированных аминокислот превышают активности гидролиза незамещённых амидов (табл. 2).

Таблица 2. Субстратная специфичность ациламидазы

Субстрат Активность* Субстрат Активность*

4' -нитро-ацетанилид 72,5 TV-изопропилакриламид 3,70

Иу-рЫА 104,5 УЧЛ^-диметил-аминопропилакриламид 1,67

А1а-рМА 35,5 Метилен-бис-акриламид 0,65

Ьеи-рЫА 17,0 Ацетамид 0,26

А'-ацетил глицин 0,49 Акриламид 0,35

уУ-ацетил аланин 1,13 изо-бутирамид 0,66

А'-ацетил лейцин 0,10 н-бутирамид 0,91

Валерамид 0,29

* Активность гидролиза субстратов приведена в единицах, соответствующих мкм/мг белка*мин.

NaCl, и фермент чистом виде. (рис.

кДа М 1

200 _ 150 -120 -100 - — -85 - -70 - —. 60 -

50 - —~ * 40 -

Это принципиально отличает ациламидазу от других амидаз, для которых продемонстрировано либо отсутствие гидролиза N-замещённых амидов, либо следовые уровни такой активности.

5. Клонирование гена, кодирующего ациламидазу, секвенирование и анализ последовательности.

Определение частичной аминокислотной последовательности ациламидазы.

Для клонирования гена ациламидазы была определена частичная аминокислотная последовательность ациламидазы. Для N-концевого секвенирования по Эдману использовали раствор белка, полученный после хроматографии, а для определения внутренних последовательностей белок был подвергнут трипсинолизу, и пептиды, очищенные с помощью ВЭЖХ, также были использованы для N-концевого секвенирования. Определены аминокислотные последовательности N-конца ациламидазы

TEQNLHWLSATE и двух внутренних пептидов - TNTPESGYYGGT и TAANFEAVRPWA. Поиск в белковых базах данных не выявил известных белков, содержащих пептиды, сходные с ациламидазой. Клонирование гена, кодирующего ациламидазу.

Поиск в базах данных транслированных нуклеотидных последовательностей выявил высокое сходство фрагментов ациламидазы с продуктом открытой рамки считывания (ОРС) из полного генома штамма R. erythropolis PR4 размером 1431 п.н. (477 аминокислотных остатков). Фрагмент ДНК с предполагаемым геном ациламидазы был ПЦР-амплифицирован с хромосомы R. erythropolis ТА37 с помощью праймеров, созданных на основе последовательностей ДНК, фланкирующей ОРС из R. erythropolis PR4. Фрагмент ДНК, содержащий предполагаемый ген, был Клонирован по олиго-Т липким концам в вектор pTZ57R/T и секвенирован. Полученная конструкция pTZ-Aam (рис. 5) была введена в клетки Е. coli XL 1-Blue.

160 п. н.

1Ш п.н,

36 п.н,

-4Ы

Полный ген ациламидазы

РЬс

\ /

МСБ

Сайты клонирования

рТХ-Аат 4,03 т.п.н

Рис. 5. Структура плазмиды рТ2-Аат, содержащей ген ациламидазы с флангами.

Оказалось, что клетки приобретают специфическую активность гидролиза Т\1-

замещённого амида - 4'-нитроацетанилида. Активность появлялась только в

клонах, содержащих плазмиду со вставкой, ориентированной по направлению

транскрипции с лактозного промотора, а в клонах с противоположной

ориентацией отсутствовала. ;

Анализ последовательности ациламидазы.

Общая гомология с известными белками.

Сравнение аминокислотной последовательности ациламидазы с последовательностями белков в базах данных не выявило известных белков, обладающих высоким уровнем гомологии с ациламидазой. Уровень гомологии наиболее близких из известных белков с ациламидазой оказалось ниже 40% (табл. 3). .-I;'"''' •">

Таблица 3. Степень сходства ациламидазы из Я. егуШгороИз ТАЗ 7 с ближайшими изученными гомологами.

Организм Идентичные аминокислоты, %

Я. егуМгороШ МР50 37%

Я. егуМггороНя К312 31%

Л. егу1кгороИ$ А.1270 31%

Я. гкоёоскгоиз Л 29%

Все ближайшие гомологи ациламидазы по гомологии аминокислотной последовательности и наличию консервативных мотивов относятся к семейству стереоселективных амидаз (Агшёазе РР01425 в базе белковых семейств РРАМ). Множественное выравнивание с известными белками.

Для более детального анализа последовательности ациламидазы и уточнения её принадлежности к семейству стереоселективных амидаз было построено множественное выравнивание ациламидазы и четырёх её экспериментально исследованных гомологов (рис. 6).

консенсус —АПГП/1-ГЕЕАЪА2АЕА1-ПКАЯАЯСКХКаР1-АеУР131

ТАЗ 7 —

13 7 74 Т51!ЕНАУРаВЗЕгГ РЬЗАИГУТТЗ1 РЕТЗБСЗУЬТЭЕКУД!

Алю тзкглАУРаазЕЯРьзшууттзхрргзБО'та.тЕгшум

кр50 БЕ01езжР1соЕОр™гш1пгсктазугЕСРХзоьтйа1

* *

ЖТАУКОЪРТТАвЗКАШКГ 7б

к л.тАОТХзьрттгемкис1БН юг

ш/туасурммнегктУЕОг 11.6 »ПГТУЙСТРМШбЗГСГУЕСГ 116 ШУАУЙОТРММЯВЗШ'УЕОГ НЕ ¿сиидсмргтыезнмьрту 120

консенсус УАТК0АТУУЕЕ1КААСЯ¥1ЪеКТтРЕГАМв5ГТЕКЗАГвРТЕМРтКЗКТеи;. ТАЗ 7

Л 7 7 4 ТР5КВАГУУТВХЬАД.еАТУАСКАУСЕЮЬСГ5С55 ГХРЛЗСРУКЛРИШСКЕАБС

АЛ 70 ТРЗЕПаГЭТТНЬЬйй.ЕаТУАЗКАУСЕОЬСГЗСЗЗРТРЛЭСРУКНРИПЕ2аЕЙ6С

Л ТРЕГПАГтеВЬЬЪОАОаПТОКАУСЕОЪСГЗОАЗЕ-ГЗНРСРУКНРИОЕЗКХГОС

МР50 1АТЕтУУУБШ,ЪААБА.Т1УСКТЯЬЕВМЛМН-ХвЕОЗУУЗРАЬЯРЗЧ11РАНе,Г6С

; ;£?С5А 136 } ЮОА3 162

; >С-СЗА 176 ■ "л 176 3 53630 176 ; >ЗОЗС 179

консенсус ТАЗ 7 N774 А,Т270 Л

ЫР50

ЛAVAЛSLVPJ,AIGTDTG' АЛУииСЬСИЛЕСЗОСаС

ДЬУАЯВОУВРА1 йб ода АЪ VА!; С V и Ь'Л IССПОРС

т&УАЗБогтмтгзвповс

ДАУААЕМТОРАЬЗТОЕМ

ГР.1РгА1ССиУСЬКРТа?ЕУ1РОТ11ЛСЕГУН5ШГНеР1ТЕТ 222

!'.! РЛЛЕССУУСНКРТБХЛ.УРУТСАГР1ЕЯ710НЬСР1ТЙТ 236 1ирлА1иетуанкргнзьур1геАЕР1ЕИ21вньвР1тк? 236 ш РАй.Еса1Уанкргвзьчв^таА.ЕТ1Е11?1пн1.арктЕТ 236 га 1*ААж;оьусмкАгнаьурзу0ьгхмпнтьвн1вР1тна 239

Рис. 6. Множественное выравнивание ациламидазы и четырёх её экспериментально исследованных гомологов. Консенсус - консенсусная последовательность семейства, содержащая аминокислоты, наиболее часто встречающиеся в данной позиции; ТА37 - ациламидаза из Я. егу1кгороИз ТА37; N774 - амидаза из К. егуШгороИз N774; А.1270 - амидаза из Я. егуМгороИз

AJ270; J1 - амидаза из R. rhodochrous Jl; МР50 амидаза из R. erythropolis МР50. Рамками выделены инвариантные аминокислотные остатки, составляющие каталитическую триаду.

Наиболее консервативные участки, характерные для семейства стереоселективных амидаз, присутствуют в последовательности исследуемой ациламидзы. Это, в частности, аминокислотные остатки каталитической триады - лизина (К82 по ациламидазе из ТА37) и двух серинов (S157 и S181 ). Рядом с лизином К82 в последовательности находится абсолютно консервативный остаток аспарагиновой кислоты D83, а серин S181 находится внутри участка из семи высококонсервативных аминокислот. Серин S157 находится в середине высококонсервативного глицин-серин богатого участка, и заключён в «оправу» из абсолютно консервативных глицинов G155, G156, и серина S158. Также позиции ещё 56 аминокислотных остатков (не образующих непрерывной последовательности) совпадают в описываемой ациламидазе, консенсусной последовательности, и четырёх гомологах ациламидазы.

Таким образом, анализ множественного выравнивания позволяет утверждать, что описываемая в настоящей работе ациламидаза принадлежит к семейству стереоселективных амидаз.

6. Интегративная инактивация гена ациламидазы в R. erythropolis ТА37 и проверка фенотипа мутантов.

Чтобы доказать, что ациламидаза - единственный фермент, проявляющий активности гидролиза и синтеза N-замещённых амидов, была проведена инактивация гена ациламидазы. Для этого была использована гомологичная рекомбинация между хромосомной копией гена ациламидазы и плазмидной копией внутреннего фрагмента гена. Внутренний фрагмента гена ациламидазы (702 п.н.) был клонирован в мобилизуемую плазмиду pRYl, способную поддерживаться автономно в Е. coli и неспособную автономно поддерживаться в родококках. Полученную плазмиду передали в R. erythropolis ТАЗ 7 из Е. coli S17-1 с помощью конъюгационных скрещиваний, и трансконъюгантов

отбирали по устойчивости к тиострептону. Факт интеграции подтверждали ПЦР амплификацией с помощью праймеров на плазмидную и хромосомную ДНК (рис. 7).

Фрагмент качала гена ациламидазы

ОПТ Тзг'

Фрагиен? конца гена ацмчгглдазы

Полный ген ацмлвмизазы

Хромосома

Рис. 7. Схема интеграции плазмиды рЯУ1 с фрагментом гена ациламидазы в хромосому Я. егу1кгоро115 ТА37. Стрелками показаны места посадки праймеров для ПЦР проверки факта интеграции. В качестве отрицательного контроля для ПЦР использовали исходный штамм К егу1НгороИ$ ТА37 (амплификации нет).

В результате были получены мутанты, содержащие в хромосоме две дефектные копии гена ациламидазы - один без 374 проксимальных нуклеотидов, другой без 353 дистальных нуклеотидов (рис. 7). Мутантные штаммы, в отличие от родительского штамма, не были способны расти на ИПАА. Клетки мутантных штаммов, выращенные на различных источниках углерода (сахарах, спиртах, кислотах, амидах, нитрилах, мочевине) в присутствии ИПАА не обладали способностью гидролизовать ИПАА, а также синтезировать ИПАА.

Таким образом, инактивация гена ациламидазы показала, что обе активности - гидролитическая в отношении N-замещенных амидов и ацилтрансферазная (синтез ИПАА) обусловлены экспрессией одного гена ациламидазы.

7. Гетерологичная экспрессия гена, кодирующего ациламидазу, в Е. coli

Ациламидазная активность клеток Е. coli XLl-Blue с плазмидой pTZ-Aam, полученной при первоначальном клонировании гена ациламидазы (рис. 5), оказалась слишком низкой, и не позволяла полноценно изучать каталитические свойства ациламидазы.

Экспрессия под промотором фага Т7 с помощью Т7 РНК полимеразы.

Для повышения активности клеток Е. coli синтезирующих ациламидазу, экспрессия гена ациламидазы была проведена с использованием высокопродуктивной системы рЕТ векторов и DE3 штаммов Е. coli. Транскрипция целевого гена в такой системе происходит с помощью РНК-полимеразы фага Т7, ген которой находится в хромосоме под контролем 1ас-промотора. Трансляция клонированного в плазмиде гена в этой системе происходит с помощью RBS сайта фага Т7. Фрагмент ДНК, содержащий структурный ген ациламидазы и 34 нуклеотида после гена был амплифицирован с использованием праймеров с введёнными сайтами Ndel и BamHI, и клонирован по тем же сайтам в рЕТ16Ь. Созданная конструкция была обозначена pET16b-Aam. Ациламидаза, транслируемая с такой конструкции, содержит также слитый с N-концом 6-гистидиновый пептид, дающий возможность аффинного выделения белка (рис. 7).

1431 п.и. 34 o.a.

Рис. 7. Структура рекомбинантной плазмиды pET16b-Aam, содержащей ген ациламидазы.

Экспрессия гена ациламидазы исследовалась в штамме Е. coli BLR(DE3) pET16b-Aam при разных температурах и на разных стадиях роста. При оптимальных условиях активность клеток достигала 0,02-0,03 мкМ/мг с.в.*час, что на два порядка превышает активность при экспрессии с pTZ-Aam в Е. coli XLl-Blue. Для дальнейшего повышения активности клеток плазмида рЕТ16Ь-Ааш была введена в штамм Е. coli Tuner (DE3), отличающийся от Е. coli BLR(DE3) возможностью более точной регулировки уровня транскрипции с промотора Т7. Это свойство штамма обеспечивается мутацией, инактивирующей ген LacY, кодирующий пермеазу лактозы. В отсутствие функциональной пермеазы концентрация индуктора - лактозы или ИПТГ - в клетке становится линейно зависимой от его концентрации в среде. Снижение концентрации ИПТГ с 1000 мкМ до 100 мкМ приводило к значительному повышению активности клеток. При оптимальных условиях активность клеток достигала 0,8-1 мкМ/мг с.в.*час, что в 30 раз превышает активность при экспрессии в Е. coli BLR(DE3).

Спектр гидролитической активности рекомбичантной ациламидазы Рекомбинантная адиламидаза, полученная в клетках Е. coli Tuner (DE3) pET16b-Aam, была также проверена по активности гидролиза N-замещённых амидов и незамещённых амидов. Была проверена активность гидролиза ИПАА и двух простых (незамещённых) амидов - ацетамида и акриламида (табл. 6).

Таблица 6. Сравнение субстратных специфичностей нативной и рекомбинантной ациламидазы.

Субстрат Активность ациламидазы *, %

Нативная из R. erythropolis ТА37 Рекомбинантная из Е. coli Tuner (DE3) pETl 6b-Aam

Л'-изопропил-акриламид 100 100

Ацетамид 7 8

Акриламид 9 10

*активность приведена в процентах от активности по отношению к ИПАА, принятой за 100%.

N-замещённые амиды являются предпочтительными субстратами и для нативной, и для рекомбинантной ациламидазы. Клетки Е. coli Tuner (DE3) pET16b-Aam также были способны синтезировать до 1 г/л ИПАА из акриламида и изопропиламина.

Для оценки биокаталитического потенциала новой ациламидазы процесс биокаталитического синтеза был оптимизирован. В качестве биокатализатора использовались клетки R. erythropolis ТА37, выращенные в условиях индукции ациламидазы. Оптимизация проводилась по следующим параметрам: температура реакционной среды, длительности процесса, значению pH,

концентрации клеток в реакции, молярного соотношения акриламида и изопропиламина, и абсолютных концентраций акриламида и изопропиламина.

При всех исследованных концентрациях клеток оптимальными условиями для синтеза были температура 35-40°С и рН 10-11. При соотношении акриламид:изопропиламин 1.66:1 и концентрации клеток 4 г/л по сухому весу максимальный достигнутый выход ИПАА составил 10-11 г/л за 16 часов. На следующем этапе проверялось влияние абсолютных концентраций акриламида и изопропиламина на выход ИПАА. При концентрациях акриламида и изопропиламина 10% и 5% соответственно, и концентрациях клеток 6-8 г/л был достигнут выход продукта ИПАА 18-20 г/л за 16 часов.

Для получения кристаллического образца ИПАА, синтезированного биокаталитически, и характеристики его физико-химических свойств, полученный ИПАА был выделен из смеси экстракцией. Полученный кристаллический осадок обладал характерным для ИПАА запахом и цветом. Температура плавления полученных кристаллов - 62-64°С - соответствовала известной для Ы-изопропилакриламида. Содержания элементов в полученном образце вещества, определённые с помощью элементного анализа, совпали с рассчитанными для Ы-изопропилакриламида (%): С - 63.77; Н - 9.68 и N-11.52.

Таким образом, была продемонстрирована возможность биокаталитического получения Ы-изопропилакриламида высокой степени очистки с помощью новой ациламидазы из К егуШгороИя ТА37.

выводы

1. Обнаружен новый бактериальный фермент ациламидаза в клетках Rhodococcus erythropolis ТА37, обладающий двумя активностями: гидролитической активностью в отношении N-замещенных амидов и ацилтрансферазной активностью переноса ацильного остатка акриламида на алифатические амины в водной среде.

2. Получен хроматографически и электрофоретически гомогенный препарат фермента ациламидазы с помощью жидкостной хроматографии на сорбенте MonoQ Hitrap.

3. Клонирован ген, кодирующий ациламидазу и определена его нуклеотидная последовательность. На основании компьютерного анализа гена и кодируемого им продукта установлено, что ациламидаза принадлежит к семейству стереоселективных амидаз, обладающих каталитической триадой Ser-Ser-Lys. Уровень гомологии амиламидазы с другими амидазами этого семейства не превышает 37%.

4. Инактивация гена ациламидазы в штамме Rhodococcus erythropolis ТА37 приводит к одновременной утрате клетками гидролитической ацилтрансферазной активностей, характерных для ациламидазы.

5. Ген ациламидазы из R. erythropolis ТА37 экспрессирован в клетках Е. coli, под промотором фага Т7. Клетки E.coli, продуцирующие ациламидазу, приобретают гидролитическую и ацилтрансферазную активности.

6. Впервые разработан биокаталитический способ синтеза N-замещенных акриламидов путем непосредственного взаимодействия акриламида и аминов в водной среде при 20-30°С с помощью катализатора - клеток R. erythropolis ТА37, содержащих ациламидазу.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. К. В. Лавров, И.А. Залунин, Е. К. Котлова, A.C. Яненко. "Новая ациламидаза из Rhodococcus erylhropolis ТАЗ 7, способная гидролизовать N-замещённые амиды". Биохимия, 2010, том 75, вып. 8, с. 1111-1119.

2. Лавров К.В., Ларикова Г.А., Яненко A.C. "Биокаталитический способ синтеза N-замещенных алифатических акриламидов и штамм бактерий Rhodococcus erylhropolis для его осуществления". Патент РФ 2399672 от 04.05.2010. Приоритет от 29.04.2009.

3. К. В. Лавров, И. А. Залунин, Е. К. Котлова, A.C. Яненко "Новая ациламидаза из Rhodococcus erythropolis, способная гидролизовать N-замещённые амиды". Материалы Международной конференции «Биология -наука XXI века», Пущино 2010.

4. Лавров К.В., Ларикова Г.А., Яненко A.C. "Фермент ациламидаза, фрагмент ДНК, кодирующий её, и биокаталитический способ синтеза N-замещенных акриламидов с использованием ациламидазы". Заявка на Патент РФ N2010 149454 от 03.12.10.

Подписано в печать:

28.12.2010

Заказ № 4785 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш„ 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лавров, Константин Валерьевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Амидазы: распространённость и свойства

2.1.1. Субстратная специфичность амидаз

2.1.1.1. Алифатические амидазы

2.1.1.2. Стереоселективные амидазы

2.1.2. Гидролиз амидазами Ы-замещённых амидов

2.1.3. Аминокислотные последовательности амидаз

2.1.3.1. Алифатические амидазы

2.1.3.2. Стереоселективные амидазы

2.1.4. Особенности биосинтеза амидаз микроорганизмов

2.2. Гидролитические ферменты, катализирующие ацилирование аминов

2.2.1. Амидазы

2.2.2. Пенициллин-ацилазы

2.2.3. Протеиназы

2.2.4. Липазы 30 2.3.1Ч-замещённые акриламиды: применение и способы получения

2.3.1. Свойства и применение К-изопропилакридамида

2.3.2. Химические методы получения М-замещённых акриламидов

2.3.3. Перспективы биокаталитических способов получения ]М-замещённых акриламидов

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Материалы

3.2. Коллекция природных микроорганизмов

3.3. Почвенные образцы, использованные для выделения штаммов

3.4. Среды для культивирования

3.5. Штаммы, плазмиды

3.6. Спектрофотометрические измерения

3.7. Выделение культур бактерий из образцов почвы

3.8. Трансформация ИПАА нерастущими клетками бактерий

3.9. Определение ИПАА и продуктов его трансформации

3.10. Синтез ИПАА из акриламида и изопропиламина нерастущими клетками бактерий

3.11. Измерение ациламидазной активности клеток с 4'-нитроацетанилидом

3.12. Измерение активности бесклеточных экстрактов и очищенной ациламидазы с 4-нитроацетанилидом

3.13. Определение субстратной специфичности ациламидазы

3.14. Определение аминокислотной последовательности

3.15. Анализ последовательностей

3.16. Коныогационное скрещивание Rhodococcus erythropolis ТА37 и Е. coli S17

3.17. Методики работы с ДНК

3.18. Методики работы с белками

3.19. Гетерологичная экспрессия в Е. coli 48 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 49 .4.1. Скрининг микроорганизмов, способных гидролизовать амидную связь в N-изопропилакриламиде.

4.1.1. Скрининг микроорганизмов по росту на изопропилакриламиде.

4.1.2. Способность штаммов, растущих на ИПАА, трансформировать изопропилакриламид до и-пропиламина и акриловой кислоты.

4.2. Выбор лучшего штамма, катализирующего синтез N-изопропилакриламида.

4.2.1. Динамика синтеза ИПАА лучшими штаммами — гидролитиками ИПАА

4.2.2. Идентификация штамма ТА37, проявляющего максимальную активность ациламидазы

4.3. Изучение особенностей биосинтеза ациламидазы и оптимизация условий, обеспечивающих максимальную активность клеток R. erythropolis ТА37.

4.3.1. Индукторы ациламидазы

4.3.2. Локализация ациламидазы в клетке.

4.3.3. Электрофоретическое исследование белков штамма R. erythropolis ТА

4.3.4. Условия, обеспечивающие максимальную активность клеток R. erythropolis ТА37.

4.4. Выделение новой ациламидазы и изучение её каталитических свойств.

4.4.1. Методика контроля активности ациламидазы по гидролизу 4"нитроацетанилида.

4.4.2. Выделение и очистка ациламидазы.

4.4.3. Влияние температуры на активность и стабильность ациламидазы.

4.4.4. Влияние рН на активность и стабильность ациламидазы.

4.4.5. Влияние реагентов и ионов металлов на активность ациламидазы.

4.4.6. Субстратная специфичность ациламидазы.

4.5. Клонирование гена, кодирующего ацил амид азу, секвенирование и анализ последовательности.

4.5.1. Определение частичной аминокислотной последовательности.

4.5.2. Клонирование ациламидазы и характеристика последовательности

4.5.2.1. Клонирование ациламидазы на векторе рТЕ57Ы/Т

4.5.2.2. Анализ последовательности ациламидазы. 72 Общая гомология аминокислотной последовательности 72 Общая гомология нуклеотидной последовательности 73 Множественное выравнивание аминокислотной последовательности

4.6. Интегративная инактивация гена ациламидазы в Я. егуЛгороИз ТА37 и проверка фенотипа мутантов.

4.6.1. Интегративная инактивация

4.6.2. Рост штамма с инактивированной ациламидазой на И-замещённых и незамещённых амидах

4.7. Гетерологичная экспрессия гена, кодирующего ациламидазу, в Е. соИ

4.7.1. Экспрессия под лактозным промотором

4.7.2. Экспрессия под промотором фага Т

4.7.3. Спектр гидролитической активности рекомбинантной ациламидазы

4.8. Разработка процесса биокаталитического синтеза ]Ч-замещённых акриламидов с использованием новой ациламидазы.

4.8.1. Оптимизация условий биокаталитического синтеза

4.8.2. Получение кристаллически чистого М-изопропилакриламида

5. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новая ациламидаза из Rhodococcus erythropolis - свойства, гетерологичная экспрессия и практическое применение"

Цель и задачи работы.

В процессе работы решались следующие задачи:

1. Скрининг микроорганизмов, способных гидролизовать амидную связь в N-изопропилакриламиде.

2. Выбор лучшего штамма, катализирующего синтез N-изопропилакриламида.

4. Выделение ациламидазы и изучение её каталитических свойств.

5. Клонирование гена, кодирующего ациламидазу, секвенирование и анализ последовательности.

6. Интегративная инактивация гена ациламидазы в выбранном штамме и проверка фенотипа мутантов.

7. Гетерологичная экспрессия гена, кодирующего ациламидазу, в Escherichia coli.

Научная новизна и практическая значимость.

Обнаружен новый бактериальный фермент ациламидаза в клетках Rhodococcus erythropolis ТА37, способный гидролизовать N-замещённые амиды и осуществлять перенос ацильного остатка акриламида на алифатические амины в водной среде. Аминокислотная последовательность ациламидазы значительно отличается от последовательностей всех известных белков (уровень гомологии с известными белками не превышает 37%). Уникальные свойства обнаруженного фермента и созданного на его основе катализатора позволили впервые в мировой практике использовать биокаталитические системы для синтеза М-замещенных акриламидов путем непосредственного взаимодействия акриламида и аминов в водной среде при температуре 20-30°С.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Лавров, Константин Валерьевич

5. ВЫВОДЫ

4. Инактивация гена ациламидазы в штамме Rhodococcus erythropolis ТА37 приводит к одновременной утрате клетками гидролитической и ацилтрансферазной активностей, характерных для ациламидазы.

5. Ген ациламидазы из Rhodococcus erythropolis ТА37 экспрессирован в клетках Е. coli, под промотором фага Т7. Клетки E.coli, продуцирующие ациламидазу, приобретают гидролитическую и ацилтрансферазную активности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лавров, Константин Валерьевич, Москва

1. Гуранда Д. Т. (2000) Специфичность и стереоспецифичность пенициллинацилаз из Escherichia coli и Alcaligenes faecalis. Дисс. канд. хим. наук, Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова.

2. Семёнов А.Н., Мартинек К., Швядае В.-Ю.К., Марголин A.JL, Березин И.В. (1981) Ферментативный синтез антибиотика (бензилпенидиллина) в двухфазной водноорганической системе. ДАН. 258(5). 1124-1126.

3. Степанов В.М. Структура и функции белков. Молекулярная биология. (1996) Под ред. Спирина А.С. Москва. Высшая школа.

4. Филлипова И.Ю. (2002) Протеиназы как катализаторы реакций сегментной конденсации пептидов. Дисс. Д.б.н. МГУ, Москва.

5. Яненко А.С. (2001) Катаболизм нитрильных соединений у Rhodococcus rhodochrous: генетический контроль, механизмы регуляции и промышленное использование. Дисс. д.б.н. Москва.

6. Ambler, R. P., Auffret, A. D. and Clarke, P. Н. (1987) The amino acid sequence of the aliphatic anúdase from Pseudomonas aeruginosa. FEBS Lett. 215, 285±290.

7. Boosten W.H.J., Svedas V.K. (2004) Penicillin acylase-catalyzed synthesis of p-lactam antibiotics in highly condensed aqueous systems. Beneficial impact of kinetic substrate supersaturation. Biotechnol. Bioeng.,85 (3), 323-329.

8. Ciskanik LM, Wilczek JM, Fallon RD. (1995) Purification and Characterization of an Enantioselective Amidase from Pseudomonas chlororaphis B23. Appl Environ Microbiol. Mar;61(3):998-1003.

9. Clarke PH. (1972) Biochemical and immunological comparison of aliphatic amidases produced by Pseudomonas species. J Gen Microbiol. Jul;71(2):241-57.

10. Cole M. (1969) Deacylation of acylamino compounds other than penicillins by the cell-bound penicillin acylase of Escherichia coli. Biochem J. Dec;l 15(4):741-5.

11. Cole M. (1969) Hydrolysis of penicillins and related compounds by the cell-bound penicillin acylase of Escherichia coli. Biochem J. Dec;l 15(4):733-9.

12. Cole M. (1964) PROPERTIES OF THE PENICILLIN DEACYLASE ENZYME OF ESCHERICHIA COLI. Nature. Aug l;203:519-20.

13. Didziapetris R, Drabnig B, Schellenberger V, Jakubke HD, Svedas V. (1991) Penicillin acylase-catalyzed protection and deprotection of amino groups as a promising approach in enzymatic peptide synthesis. FEBS Lett. Aug 5;287(l-2):31-3.

14. Finn R., Mistry J., Tate J., Coggill P., et al. (2010) The Pfam protein families database. // Nucleic Acids Research. V. 38. P. D211-D222.

15. Fournand D, Arnaud A. Aliphatic and enantioselective amidases: from hydrolysis to acyl transfer activity. J Appl Microbiol. 2001 Sep;91(3):381-93.

16. Fournand D, Bigey F, Arnaud A. (1998 ) Acyl transfer activity of an amidase from Rhodococcus sp. strain R312: formation of a wide range of hydroxamic acids. Appl Environ Microbiol. Aug;64(8):2844-52.

17. Fuganti C., Rosella C., Servi S., Tagliani A. and Terreni M. (1992) Enantioselective recognition of the phenacetyl moiety in the Pen G acylase catalysed hydrolysis of phenylacetate esters Tetrahedron: Asymmetry Volume 3, Issue 3, Pages 383-386.

18. Gololobov M., Morozova IP., Vojushina TL., Timokhina EA., Stepanov VM. (1992) Subtilisin from Bacillus subtilis strain 72. The influence of substrate structure, temperature and pH on catalytic properties. Biochim Biophys Acta. Feb 1;1118(3):267-76.

19. Goossens B., Kuster E., Dahmen K., Barthell E. (1985). Polymers of.alpha.,.beta.-unsaturated N-substituted carboxylic acid amides. United States Patent 4,528,350.

20. Gopalakrishna KN, Stewart BH, Rneen MM, Andricopulo AD, Kenyon GL, McLeish MJ. (2004) Mandelamide hydrolase from Pseudomonas putida: characterization of a new member of the amidase signature family. Biochemistry. Jun 22;43(24):7725-35.

21. Guranda D.T., van Langen L.M., van Rantwijk F., Sheldon R.A., Svedas V.K. (2001) Highly efficient and enantioselective enzymatic acylation of amines in aqueous medium. Tetrahedron: Asymmetry. V. 12. P. 1645—1650.

22. Hacking, M.A.P.J., van Rantwijk, F., Sheldon, R.A. (2001) Lipase catalysed acylation of hydroxylamine and hydrazine derivatives Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 11 (4-6), p.315.

23. Hayatsu M, Mizutani A, Hashimoto M, Sato K, Hayano K. (2001) Purification and characterization of carbaryl hydrolase from Arthrobacter sp. RC100. FEMS Microbiol Lett. Jul 10;201(1):99-103.

24. Hirrlinger B, Stolz A, Knackmuss HJ. (1996) Purification and properties of an amidase from Rhodococcus erythropolis MP50 which enantioselectively hydrolyzes 2-arylpropionamides. J Bacteriol. 178(12):3501-7.

25. Holt J. G. ed. (1994) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 9th Edition Williams & Wilkins, Baltimore.

26. Hoshino K., Taniguchi M., Marumoto H., Fujii M. (1989) Repeated Batch Conversion of Raw Starch to Ethanol Using Amylase Immobilized on a Reversible Soluble-autoprecipitating Carrier and Flocculating Yeast Cells Agric. Biol. Chem., 53, 1961.

27. Huang H. T., Seto T. A., and Shull G. M. (1963) Distribution and Substrate Specificity of Benzylpenicillin Acylase Appl Microbiol. January; 11(1): 1-6.

28. Kazlauskas R.J., Bornscheuer. (1998) Biotransformations with lipases, in Biotechnology, ed. H.-J. Rehm and G.Reed. Wiley-VCH.

29. Kelly M, Clarke PH. (1962) An inducible amidase produced by a strain of Pseudomonas aeruginosa. J Gen Microbiol. Feb;27:305-16.

30. Kim M.G., Lee S.B., (1996) Penicillin acylase-catalyzed synthesis of B-lactam antibiotics in water-methanol system: effect of cosolvent content and chemical nature of substrate on reaction rates and yields. J. Mol. Catalysis B:enzymatic, 1, 201-211.

31. Kobayashi M, Goda M, Shimizu S. (1999) Hydrazide synthesis: novel substrate specificity of amidase. Biochem Biophys Res Commun. Mar 16;256(2):415-8.

32. Krieg L, Slusarczyk H, Verseck S, Kula MR. (2005) Identification and characterization of a novel D-amidase gene from Variovorax paradoxus and its expression in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 66(5):542-50.

33. Ma Y, Yu H, Pan W, Liu C, Zhang S, Shen Z. (2010) Identification of nitrile hydratase-producing Rhodococcus ruber TH and characterization of an amiE-negative mutant. Bioresour Technol. Jan;101(l):285-91.

34. MacWilliams D.S. (1973) Functional monomers. Their preparation, polymerization, and application. New York: M.Decker.

35. Martín L., Prieto M., Cortés E., García J. (1995) Cloning and sequencing of the pac gene encoding the penicillin G acylase of Bacillus megaterium ATCC 14945 FEMS Microbiology Letters Volume 125, Issue 2-3, pages 287-292.

36. Neu D, Lehmann T, Elleuche S, Pollmann S. (2007) Arabidopsis amidase 1, a member of the amidase signature family. FEBS J. Jul;274(13):3440-51.

37. Oh SJ, Kim YC, Park YW, Min SY, Kim IS, Kang HS. (1987) Complete nucleotide sequence of the penicillin G acylase gene and the flanking regions, and its expression in Escherichia coli. Gene. 56(l):87-97.

38. Patricelli MP, Cravatt BF. (2000) Clarifying the catalytic roles of conserved residues in the amidase signature family. J Biol Chem. Jun 23;275(25): 19177-84.

39. Rosenberg AH, Lade BN, Chui DS, Lin SW, Dunn JJ, Studier FW. (1987) Vectors for selectiveexpression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56(1): 125-35.

40. Sambrook J., Russell D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring1. Harbor.

41. Schmaljohann D. (2006) Thermo- and pH-responsive polymers in drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. Dec 30;58(15): 1655-70.

42. Shrestha R, Dixon RA, Chapman KD. (2003) Molecular identification of a functional homologue of the mammalian fatty acid amide hydrolase in Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 278(37):34990-7.

43. Siezen RJ., Leunissen JA. (1997) Subtilases: the superfamily of subtilisin-like serine proteases. Protein Science. Mar;6(3):501-23.

44. Sio Ch.F., Quax W.J. (2004) Improved ß-lactam acylases and their use as industrial biocatalysts / Curr. Opin. Biotechnol. V. 15. P. 349—355.

45. Skouloubris S, Labigne A, De Reuse H. (2001) The AmiE aliphatic amidase and AmiF formamidase of Helicobacter pylori: natural evolution of two enzyme paralogues. Mol Microbiol. 40(3):596-609.

46. Studier FW, Moffatt BA. (1986) Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189(1): 113-30.

47. Thiery A, Maestracci M., Arnaud A., Galzy P. (1986) Acyltransferase Activity of the Wide Spectrum Amidase of Brevibacterium sp. R312. Journal of General Microbiology, 132, 22052208.

48. Van der Mey M., and De Vroom E. (1994) Substrate specificity of immobilized penicillin-G acylase. Bioorg. Med. Chem. Lett. 4(2). 345-348.

49. Verhaert RM, Riemens AM, van der Laan JM, van Duin J, Quax WJ. (1997) Molecular cloning and analysis of the gene encoding the thermostable penicillin G acylase from Alcaligenes faecalis. Appl Environ Microbiol. 63(9):3412-8.

50. Vliet AH, Stoof J, Poppelaars SW, Bereswill S, Homuth G, Kist M, Kuipers EJ, Kusters JG. (2003) Differential regulation of amidase- and formamidase-mediated ammonia production by the Helicobacter pylori fur repressor. J Biol Chem. 278(11):9052-7.

51. Voeykova T. Tabakov T., Ryabchenko L., Mkrtumyan N. and Yanenko A. (1994) Conjugative transfer of plasmid pTOl from Escherichia coli to Rhodococcus spp. Biotechnology Letters Volume 16, Number 6, Pages 555-560.

52. Wei BQ, Mikkelsen TS, McKinney MK, Lander ES, Cravatt BF. (2006) A second fatty acid amide hydrolase with variable distribution among placental mammals. J Biol Chem. 281(48):36569-78.

Информация о работе

Лавров, Константин Валерьевич
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.07

Диссертация

Новая ациламидаза из Rhodococcus erythropolis - свойства, гетерологичная экспрессия и практическое применение - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы