Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культивирование клеток млекопитающих на пористых носителях с использованием ростстимулирующих белков

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Культивирование клеток млекопитающих на пористых носителях с использованием ростстимулирующих белков"

российская академия медишшсйих наук

нш.. вирусологии им. д. и. ивановского

Пг1 И11МКМХ 1^КТ1ПИ1ГИ

АДУЕВА Саят Магомаевла

пульткщрование клеток шеюго1тлкяшх

НА ПОРИСТЫХ НОСИТЕЛЯХ С ИСШОЛЬЗОВАНИЕМ

роагсгюлулкрудаих еелкв. . .

03.00.06 - Вирусология

Автореферат диссертации та соискание ученой степени кандидата. биологических наук

Москва — 1995

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вирусологии ш. Д. И. Ивановского РАМН

Научный руководитель^ доктор медицинских наук, профессор Р. Я. Подчерняева

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук П. Г. Дерябин

доктор биологических наук, профессор Л. П. Дьяконов

Ведущее учреждение: Российская медицинская академия последипломного образования.

Зашита диссертации состоится " ьИО^.р/^И^ > 1995г.

в час. на заседании спешашзированного совета

Л 001.20.02 в НИИ вирусологии им. Л- И. Ивановского РАМН (Москва, 123098, ул.Гамалеи, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИИ виру-солгии им. Ж И. Ивановского РАШ

Автооеаерат разослан " 1995г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

ЕЕ Косякова

Актуальность проблемы.

Проблема культивирования клеток в биотехнологии приобретает все большее значение, поскольку клетки являются необходимым субстратом для продукции биокомпонентов, широко используемых в производстве современных диагностикумов и вакцин. Получение большой биомассы клеток вависит от ряда факторов: выбора наибо-

Jicts ПШМКтИшЫл ЯКï X uilUÛ ivГМЛЗЛ fi Р ri j - ri ri ^il Vf fl » III ii»'tV-|H ■ mUww w>4 m »www

в энных питательных сред и сывороток и многих других причин. Одним из наиболее перспективных методов является культивирование клеток на микроносителях, который был предложи в 1967 году Ван ч Везезоя, и с 80-х годов широко применяется во многих лабораториях мира С Clark J., 1983; Ни W. S., Vang D. J. С., 1987; Groughan M. et al, ISSO; Portner ?.. et al, 1991).'

Этот метод позволяет применять современную технологию, повышает производительность труда и экономически более эффективен.

В нашей стогне разработка новых ыикроносшелей призела к созданию нескольких видов этих препаратов. Наиболее изученными из них оказались Дитолар-1, Дитолар-2. Питопол и Питогель (Грачев В. Н. , 19R5, Подчерняева Р. Я. и др., 1990; SacopimaîLR и ЯП.. ЮР П; Нагиева Ф. Г. и лр., 1991; Шубина ЕА. И Др.. 1992; Ткаченко A. R и др. , 1993).

В последние годы в биотехнологии находят применение пористые носители, которые открывают доступ к полу-юнга больших объемов биомассы клеток. Культивировние перевиваемых клеток на пористых микроносителях дает 30-50-кратвый прирост клеточной биомасса Кроме того, пористые микроносители имеют уникальные преимущества для культивирования клеток, так как они основываются

- г -

на субстратах губчатой структуры, позволяющих улучшать клеточный метаболизм (Hulser'D-F. et al. 1989; Cahn F., 1990; Griff its. J. R , 1990; Kirin B., 1991; Shiraearai N. et al, 1993).

"n

Ранее в лаборатории культур тканей был разработан зффектив-ный метод культивирования клеток на отечественном макропористом губчатом носителе из пенополиуретана (йшшкоеэ. Т.М. и др., 1992), который таете позволяет получать высокую концентрацию клеток в малых объемах.

Аналогичные работы ведутся и за рубежом (Кзтаяма С., Хидака X , 1987; Matsuchita et al, 1990). Культивирование клеток на носителях требует применения качественных питательных сред и сывороток. В нашей стране .питательные среды на основе отечественных ингредиентов выпускаются . Мэсковским Институтом полиомиелита и вирусных энцефалитов РАШ,ЕП0 "Вектор" (г.Новосибирск).

Обычно для. крупно-масштабного культивирования применяется только нативная сыворотка плодов коровы, которая в последние годы'является дорогим и нестандартным препаратом. Свойства сывороток других видов животных изучены сравнительно мало (Игудин Л И. ,1990; Костина Г. А. и др., 1991; Дьяконов JLE и др. 1991).

, В лаборатории культур тканей НШ вирусологии, начиная с 1990 года проводилось изучение сывороток различных видов животных (северных оленей, суягных овец, тшеней, морских котиков, телят) для культивирования диплоидных, перевиваемых и суспензионных клеточных линий (Михайлова Г. Р. .Шдчерняева Р. Я., 1990, Таланцева Е. В. и др. ,1991; ГасановаЕС., 1993). -

За рубежом, и в последнее время в нашей стране, ведутся активные исследования по использованию комплекса ростовых протеи-

нов, выделенных из сыворотки крупного рогатого скота и способных ее заменить в качестве компонента питательной среды (КИсЫ, 1965; Дроздова Т. И. , 1980; Игудия Л 31 ,1990; Литовченко В. Г. , Попова В. Д., 1990), а также ростстимулирующих белков, выделенных' из сывороток крови других животных (Подчерняева Р. Я и др. ,1991; Гаса нова Б.С. и др. ,1952; Гасанова ЕС. ,1993).

и* пъаотт г* читано ил*отп.п/ гтоттиоч истяпги. иячрии тгъоии ттпйопти

иследования по определению оптимальных условгй кульйвирсвакия клеток на пористых микро- и макроносителях с использованием на-тивных сывороток различных видов животных и ростстимулирующих белков, выделенных из них.

Даль и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлся подбор оптимальных условий культивирования перевиваемых клеточных линий на отечественных пористых микроносителях ксллагешвой природы ъ макроносителях из пенополиуретана с использованием: - сывороток крови крупного рогатого скота, ллодоз коровы, северных оленеЯ и свиней;

- ростстимулирующих белков, выделенных из сывороток крови ЗИП. ВВДС2 животных;

— ГРЧУеСМЭТГИЧеСККХ ^гиюитпо

для диссоциации клеток с губчатого макроноситега.

Исходя из этого были поставлены следующие задачи Задачи исследования:

~ J

1. Провести сравнительное изучение ростовых свойств коммерческих питательных сред производства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН и НПО "Вектор" с целью отбора стандартных серий для проведения исследований по крупно-масштабному

культивированию клеток налористых носителях.

2. Определить возможность замены нестандартной эмбриональной телячьей сыворотки на другие виды сывороток, в частности, экологически чистой сыворотки северных оленей-и свиней.

3. Исследовать возможность замены нативных сывороток северных оленей и свиней на ростстимулиругацие белки, выделенные из этих видов сывороток, с целью стандартизации услоеий культивирования клеток.

4. Изучить возможность использования ростстимулирущих белков в качестве заменителей сыворотки при культивировании клеток на отечественных коллагенвых - микроносителях (Цитогель, Вито-лар-2).

5. Подобрать оптимальные условия культивирования клеток млекопитающих с использованием нативных сывороток северных оленей и свиней и ростстиыулирующих белков, выделенных из них, на "новой отечественной макропористом губчатом субстрате из' пенополиуретана.

6. Изучить 'возможность применения.нового протеолжгического фермента "Коллазы-3" для диссоциации клеток с губчатого субстрата

Иаучкаи названа работы.

1. Установлена активная адгезия клеток как на поверхности пористого микроносителя Дитогель, так и на макропористом губчатом субстрате при использовании нативных сывороток северных оленей и ростстимулирущах белков, выделенных из нее.

2. Высокая щшифзрация клеток отмечалась при использовании как нативной сыворотки крови северных оленей, и свиней, так и

ростстимулируших белков, выделенных из этой сшоротки, что дает возможность их применения для культивирования перевиваемых клеток на пористых носителях.

2. Впервые для снятия клеток с макроноситегзй применен новый протеолитический фермент из гепатопанкреаса камчатского крана клетки.

Практическая ценность.

1. Впервые показана возможность замены эмбриональной телячьей сыворотки крови на сыворотки северных оленей и свиней при культивировании перевиваемых культур на отечественных пористых •шкро- и макроносителях.

¿. Рекомендуется использование ростстимулирухшшх белков, выдегенных из сыворотки крови северных оленей и свиней для стандартизации условий культивирования клеток как на пористом колла-геновом микроносителе. Цктогель, так и на макропористом губчатом субстрате из пенополиуретана.

3. Для снятия клеток с макропористого носителя впервые при-мнкм новый отечественный ькологичеоки чистый протеолитический ч'зрмент "Кзллгза-3", обладающий более шдяеим и активным действием на клетки.

Основк^г положения, выноскгале на гзцгху.

1. Возможность замекы эмбриональной телячьей сыворотки сыворотка»® крови других видов животных (северных оленей и свиней) для культивирования перевиваемых культур на ?дафо- и макропористых носителях.

2. Помимо нативных сывороток других видов животных для

- б -

культивирования клеток на субстратах могут быть рекомендованы ростстимулирунцие белки, выделенные из сывороток крови этих животных.

3. Возможность использования нового отечественного протео-литического фермента "Коллазы-3" для диссоциации^клеток с макропористого губчатого носителя.

Апробация работа: Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на конференциях:

- "Разработка и производство медицинской биотехнологии", 1992г. (г.Махачкала);

- "Биология клетки в культуре", 1992г. (г. Санкт-Петербург).

- "Актуальные проблемы вирусологии", 1994г. (Казахстан). Публикации. Ib теме диссертации опубликовано 4 печатных работы и одна статья депонирована в ВИНИТИ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 200 работ, из которых 70 отечественных и 130 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 11 рисунками, 5 фотографиями и 13 таблицами.

Матершлы и методы исследования. Материалы.- . . ■

В работе было использовано 5 клеточных '-культур: диплоидные \ -линии - легкого эмбриона человека ($ДЭЧ, JÖ4-240) и фибробласты : легкого эмбриона человека М-22; перевиваемые клетки - почек зеленой мартышки - Vero, почек сирийского хомячка - ЕНК-21. Клеточные линии получены из коллекции лаборатории культур тканей

Института вирусологии иы. Д. И. Ивановского РАЖ Диплоидная линия М-22 получена из Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАЖ

Ростовые среды: Игла и Игла WEM производства ИПиВЗ РАМН,

Игла (f-'/уая и ждкая Форш) производства ШО "Вектор" (г.Новосибирск) .

»trenrwrtt-w- nnvTiwm-n ппрнтпгп гкгггм — Кг-л. t iiiKmrtrajmrrhci irkjü-

ковиюго мясокшбината), эмбриональная телячья сывортка -ЭГС (производства НММиЭ им. ЕФ. Гамалея РАМН и БелНИИЭиМ г. Минск), северных оленей (Курская биофабрика), свиней (г.Покров Владимирской области).

Ростстимулируюшие бедки (РБ). выделенные из сывороток крсви крупного рогатого скота, северных оленей и свиней путем осатае-ния н?тп?чых сывороток ПЭГом (>Л. М. 6 ООО Д ). Метод разработан йгушшш Л И. в ГИСКе им. Л А. Тарасовича, г. Москва.

ЬЬш-роносД'ЗлИ: Дитолар-2 (НПО "Биолар'Ч г. - Олайне), Цито-гель (НПЦ медицинской биотехнологии МЗР , г. Москва).

}.'акри";ссите.д>:: Рубчатый субстрат (ГС) из пенополиуретана (йютех-К, Москва).

а^пхант». П-пя отделения ¡слеток п субстратов использовала С.02Z. раствор вэрсе:та, содержаний ферменты отечественного производства: хш-опсин (г. С-Петербург), трипсин и коллазу-3 производства ЕЛО "Вектор" (г. Новосибирск). Методы.

Клетки пассировали в стандартно-монослойных условиях с посевной концентрацией 80-100 тыс. кл/мл. через 3-4 суток и применяли псевдосусдензиошшй метод культивирования на микро-и макро-

носителях в сосудах "Ве1ко" или "Тес1тпе".

Посевная доза клеток при культивировании на микроносителях составляла 200 тыс. кл/мл. ,на губчатом субстрате - 1 млн кл/мл. Клетки с поверхности стекла или носитетелей снимали раствором

версена с химопсином или кодлазой-3. Подсчет клеток проводили в

>

камере Горяева.

Псевдосуспензионное культивирование клеток на микроносителях проводили при 37°С в силиконированных сосудах фирм "ВеХко" или "ТесЬпе". Для прикрепления клеток на микроносителях на начальном этапе культивирования использовали среду Игла, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки или- ростстимулирувдие белки, выделенные из сывороток крови северных оленей, свиней и крупного рогатого скота. После засева клеток проводили периодическое помешивание, в течение 1-2 мин. с интервалом 30 мин. в течение 3-6 часов.

По завершениЦ процесса прикрепления клеток на микроносителях устаналивади постоянный режим перемешивания - для Питолара-2 - 28-34 об/мин. > для Цитогеля - 18-20 об/мин. Пробы отбирали ежедневно для изучения в световом микроскопе и подсчета клеток.

Адгезию на губчатом макроносителе проводили в 50 мл флако-

г

нах, содержащих 35 фрагментов субстрата (размером 3x3x3 мм) с посевной концентрацией 1 млн кл/мл в течение 5 часов при периодическом, перемешивании через 20-30 мин в среде Игла с добавлением 157. нативной сывортки плодов коровы, крупного рогатого скота, взрослых животных северных оленей и свиней или ростстиыудшрувдих белков, выделенных из этих сывороток. Затем среду с неприкрепив-шимися клетками сливали и проводили подсчет клеток не прикрепив-

шкхся к субстрату. Субстрат промывали средой после чего, с 3-4 фрагментов брали пробу для подсчета клеток.

Далее культивирование проводили в ростовой среде, содержа-шей 102 натквной сыворотки или ростсгимулиругаие белки с кон-аентрагогей 0,3-0.5 мг/мл. Степень адгезии (в %) на микро- и макроносителях определяли путем подсчета клеток, снятых с

ЧЛЛ1ММ1ЯЛЯ V пптв|пт тгапшг пппоаннмт >г>мтк.

Подготовку ростстимулирующих белков (РБ) в качестве компонента питательной среды осуществляли по методу, подробно изложенному Гасаксвой Б. С. и Подчерняевой Р. Я в Методических рекомендациях "Использование ростовых протеинов для культивирования различного типа клеток" (Москва, 1993).

Подгсгсеку макропористого губчатого субстрата (ГС) к работе проворили образом: 35 фрагментов ГС помешали в 50 мл

¿закон с Зизрасавором и автоклавирэвали при режиме 1 атмЛ121 С) в течение 1 мг.сз. Перед работой Физраствор сливали и ГС заливали 'срезой Кгла.

Опрв.чь.тание ростстимулируюцей активности сывороток и РБ оеу^сяиыли ла уровне 5 постедовэтельннх пассатей в мочослойных услпзжпг кузьтивяроваяия с полсч«тпм индекса пролиЛерании. а тегсгс процента гьизнеспособности по стандартной методике.

Культивирование клеток на носителях проводили после предварительной адаптгаии клеток в стандартных условиях с применением сывороток к РБ разных видов животных.

Определение ¿акоплазмы осуществляли оливомициновым экспресс -методом (А. е. 1044630 от 01. 06. 83. ).

Наркологическое и морфологическое исследование культуры

проводили по методу Мэarched (1960) с окрашиванием аурозозином по Романовскому, и с исподьзоанием смеси Буэна с последукшиы ок-• рашиванием гематоксилинэозином.

При статистической обработке результатов определяли средние показатели и квадратичные отклонения по методу Рида и Ыенча (1959). Достоверность различий в величинах показателей оценивали с помощью критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение.

1. Отбор отечественных питательных сред, пригодных для культивирования клеток на микро- макроносителях.

До недавнего времени все коммерческие питательные среды , используемые в нашей стране для культивирования клеток человека и животных, производились на основе импортных аминокислот и витаминов. поставляемых фирмами Flow.- Serva'

В последние годы назрела необходимость производства питательных сред на основе отечественных инградиентов. Проблема получения стандартных питательных сред, используемых для выращивания клеточных культур, остается актуальной до настоящего времени.

• С начала 1987 года широкомасштабное производство' питательных сред для культивирования клеток осуществлялось в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН на основе отечественных компонентов, поставляемых ЕГО "Биолар" и НПО "Витамины", и позже в ЕГО "Вектор".

Вашей задачей являлось изучение ростовых свойств различных серий питательных сред,, выпускаемых этими предприятиями и отбо-

-li-

pa стандартных партий для проведения исследований по культивированию клеток на пористых носителях. Для работы использовали две питательные среда- Игла и Игла МЕЖ

В связи с тем. что линии диплоидных клеток более чувстви-w л™ if vp пппиям культивирования, нами были выбраны две линии дйнлоилных rwi^-iu.» - гггксго згйргкг. *»дэвеян .bsu-í^u и кца но-мышечной ткани эмбриона человека М-22. Изучение пролифератив-ной активности диплоидных клеток проводилось ка протяжении 5 последовательных пассажей с 3-4 дневным циклом культивирования.

В результате изучения 5 серий среды Игла НЕМ как для клеток

v

ЛЭЧ-240, так и для клеток М-22. пригодными для культивирования

ростовыми свойствами обладали 3 серии среды с индексом пролиферации (ИГО 2.1-2.2 при контроле 2.5-3.0.

Более чувствительной культурой оказались диплоидные клетки легкого эмбриона человека -ЛЭЧ-240 по сравнению с диплоидной культурой М-?2.

Лалге, изучение питательных сред Игла и Игла МЕМ проводили с использованием линии перевиваемых клеток почек зеленой маотыш-ки Vero с двумя вгдами эмбриональной телячьей сыворотки (производства БелНййЭиМ и НИИЭиМ им. К & Tai,¡злея РДМЩ. В результате исследований было выявлено преимущество культивирования клеток с ' эмбриональной телячьей сывороткой производства БИКЭиМ им. Н. & Гамалея (Ж! составил 5.0), а в случае использования ЗТС БелНИИЭиМ ИЗ был 3.8.

Изучение питательных сред (в жидком и сухом вкда), выпускаемых в НТО "Вектор" при культивировании клеток Vero показало, что среды Игла этого, предприятия незначительно уступают средам

производства ШаВЭ РАМЕ Культивирование клеток с использованием сухих форм среды Игла показали лучшие результаты (ИП 3.0-3,6) по сравнению с жидкими формами (ИП 2,8-3.2). Пролиферативная активность клеток Vero с использованием сухих форм среды Игла к 5 пассажу с применением эмбриональной телячьей сыворотки НИИЭиМ им. Е Ф. Гамалея составляла -3,6 тогда, как с сывороткой БелНИИЭиМ ИП достигал 3,2.

Таким образом, испытанные образцы среды Игла производства НПО "Вектор" незначительно уступают средам производства ИПиЕЭ РАМЕ При 'этом, южно рекомендовать для культивирования клеток млекопитающих наряду с жидкой формой сухие формы среды Игла НПО "Вектор".

2. Применение сывороток крови различных животных для культивирования перевиваемых плёточных линий.

. Как известно, сыворотка крови является необходимым компонентом питательных сред для культивирования различных клеточных культур. В практике культивирования клеток наиболее часто используется сыворотка плодов коровы - эмбриональная телячья (ЭТС) применение, которой в биотехнологии весьма ограничено из-за дефицита доброкачественного исходного сырья и высокой его стоимости. ,

В связи с этим в последние годы проводились работы по изучению возможности использования более доступных, возможно дешевых и экологически чистых видов сывороток (Михайлова Г. Р., Шд-червяева Р. Я. .1990; Костина Г. А. ,1990: Таданцева Е. Е и др. ,1991; Гасанова Б. С. ,1993).

Применение сыворотки крови взрослых северных оленей имеет -

целый ряд преимуществ перед сывороткой крупного рогатого скота; постоянный состав, отсутсзие антител к ретровнрусам, к возбудителям вирусных пневмоэнтеритов крупного рогатого скота и других . животных, отсутствие неспешфических ингибиторов. Кроме того, эта сыворотка не контаминирована вирусами других яивотных и ми-

шп ля'^ияии i д i: i s г i _

Другим источником для получения сыворотки ыожэт служить кровь свиней, которая по биохимическому составу близка к крови человека -Успешные результаты получены с использованием сыворотки крови свиней при культивировании ряда перевиваемых клеток. ч лимфоидной линии, человека Raj i и миелошой линии мышей Sp-2 (1£нпкгип Ю.А. и лр., 1986; Костила Г. А., 1990).

Нами проводилось изучение ростстимулирующей активности на-тивных сыЕорото;: взрослых животных северных оленей и свиней на двух наиболее перспективных для производства перевиваемых клеточных линиях Ышт21 и Vero при традиционном- монослойном и псев-досуспензнонном культивировании. Пролиоеративная активность клеток ЕНГ.-21 при культивировании в монослое с использованием оывппптпл- neBppwwx оленей (ИП 4.3) и свиней (ИП 4.0) после 5 пассата уступала контрольному значению с сывороткой крупного рогатого скота (ИП 6.3). Ростовая активность клеток Vero, которые обычно КУЛЬПЕЯРУСТ с 57. сыворотки ЭТС и 5% сыворотки крупного рогатого скота была такой же, как при использовании сыворотки северных оленей (ИП 4.7). а при применении сыворотки свиней она превышай контрольное значение до ИП 5.7.

Высокая ростовая активность клеток с использованием сывороток свиней и северных оленей объясняется тем. что сыворотка

крови свиней имеет более высокое содержание белка, по сравнению с сывороткой крови других животных, а содержание ^-глобулинов в сыворотке крови свиней и северных оленей значительно ниже, чем в сыворотке крупного рогатого скота. Кроме того,'сыворотка свиней, наряду с сывороткой плодов коровы, наиболее богата по содержанию аминокислот (622,87 мг/л), тогда как уровень аминокислот в сыворотке крови северных оленей в 1,5 - 2 раза ниже (488,35 - 440,89 мг/л).

Таким образом, исходя из этого, для культивирования клеток БНК-21 и Vero можно использовать нативные сыеоротки северных оленей и свиней.

ч

3. Замена катимых сывороток ростстимулирушими белками при монослойном культивировании клеток.

Как было указано ранее (Костина Г. А.. 1990; Дьяконов JL П. и др., 1991; ТаланпеваЕ.К и др., 1991; Михайлова Г. Р., Подчерня-ева Р. Я., 1990; Шдчерняева Р. а и др.. 1992-, Гасанова Б. С., 1993), а также подтверждено выше приведенными данными возможно использование сывороток различных видов животных, в частности, северных оленей и свиней для культивирования клеток млекопитающих.

Однако учитывая, нестандартность нативных сывороток, токсичность отдельных серий, наличие ингибиторов и возможную контаминацию. особенно сыворотки крупного рогатого скота, различными агентами (вирусами, микошазмами) нами применены ростстимулирую-шие белки, выделенные по методу Игудина JL П. (1984) путем фракционирования водным раствором полиэтиленгдиколя (ПЭГа). который способствует осаждению J-глобулиновой Фракции сыворотки, содержа-

сей микоплазмы. антитела и другие контаминирушие агента Применение ростстимулируюших белков дает возможность стандарткзиовать процесс культивирования клеток, и как было выявлено Гасановой Е С. (1993) и Подчерняевой ?. Е с соавт. (1994) - снижать содержание микоплазмы в культурах при использовании ростстимулируюших úzuuivo ~zrz~~r~ ° ■«"АПФВО илиппнйнта ensüíl ПО

сравнений с кативноа c.'scpcTKOJi.

Выделенные из. сывороток крови ростстиыулирушке белки представляют собой сложную белковую фракцию, разделяющуюся электрофоретически на альбуминовую (наибольшее процентное содер- , жание) HJt JS-глобулиновые Фракции, j-глобулиновая Фракция в выделенных белках практически отсутствует или содержится в незначительном количестве (3-5%) в то время, как в кативной сыворотке отмечается значительное содержание этой Фракции (25- 35%). которая. как известно, ингибирует рост клеток в процессе культивирования.

Исходя из этого, нами была изучена пролиФеративная актив-кость перевиваемых клеточных линий ВНК-21 и Vero при культивировании с использованием ростстимулирующих белков, выделенных из сывороток крупного рогатого скота, северны/ оленей и евшей. Было показано, что активность пролиферации клеток BHK-2Í при культивировании на протяжении 5 последовательных пассажей с заменой cuBopoTJíH крупного рогатого скота на 50% объема ростетимулирую-еими белками. выделенными из сывороток северных оленей достигала индекса пролиферации 6,2 и свиней -6.5, т.е. не отличались от контрольных значений (КП 6,3). Замена сыворотки ¡трупного рогатого скота на 50Х ее ростстимулирухшми бедками вызывала незначитель-

ное снижение пролиФеративной активности до ИП 5.8 в то время, как при полной замене - в 2 раза (ИП - 3.0).

В условиях культивирования клеток ЕНК-21 с использованием 102 сыворотки северных оленей (контроль) и при ее замене па 50 % объема ростстимулируташи бедками, .выделенными из этой сыворотки, пролиФеративная активность клеток ЕНК-21 не имела существенной разницы тогда, как полная замена приводила к снижению пролиферации до ИП 3,5.

Далее была установлена, возможность культивирования клеток Vero при замене нативных сывороток северных оленей и свиней на 50% ростстимулирующими- белками, выделешшми из них на протяжении 2-3 пассаже^. при сохранении высокой пролиферативной активности клеток.

' Таким образом, можно рекомендовать культивирование перевиваемых клеток Yero и ВНК-21 при частичной замене (на 50% объема) нативных сывороток северных оленей и свиней на их. ростстимулиру-шие белки.

4. Культивирование клеток на микроносителях с применением ростстимулируюших белков.

Следующим этапом навих исследований было определение возможности использования ростстимулируюших белков, выделенных из сывороток крови крупного рогатого скота, северных оленей и свиней в качестве компонента питательной среды взамен эмбриональной телячьей сыворотки при культивировании клеток Vero на двух типах микроносителей , один из которых представляет собой поперечно-сшитый ЕЕАЕ-сеФадекс (Питолар-2), другой - пористый, коллаге-нозой природы (Питогель).

Ранее Шубиной Н.А. с соавт. С1992) было показано преимущество использования нового вила отечественного пористого микроносителя Дитогелъ при культивировании с использованием, сыворотки плодов коровы, что было подтверждено в исследованиях Подчерняе-вой Р. Я с соавт. (1994) при применении ростстимулируюших белков.

мммм* V«* <мм«(^4 V«»« ММ4 \/1 ищи УМ О -»ч* Л. W4ЛЛ«n иуипьхииш

обеспечивает большую по сравнению с другими микроносителями удельную плотность (количество клеток на 1 ед. поверхности), что приводит к повышению эйэктивности процесса культивирования и получению большой биомассы клеток. Кроме того, низкая скорость седиментации микроносителя вследствие высокой пористости и низкой плотности (1.01 г/см ) существенно уменьшает механическое повреждение ¡слеток пои перемешивании, так как по.янсс перемешивание достигается при низкой скорости сражения мешалки (18-20 об/мин).- Полное и быстрое растворение микроносителя под воздейс-твем протеолитических Ферментов упрощает и ускоряет процесс снятия клеток, повышая их жизнеспособность.

Как известно, при псевдосуспензионном культивировнии вакко определить степень адгезии клеток на поверхности носителей, а затем их пролкфератизную активность в процессе культивирования. Результаты изучения адгезивной способности клеток представлены в таблице 1, ' из гсэторой видно, что наибольший процент адгезии отмечается через б часов на пористом мшфоносителе Дитогель по сравнению с Дитоларом-2 при применении ростстимулируюших белков, выделенных из сывороток крови северных оленей (70.0+1,1%) и крупного рогатого скота (72,5+0.82), а наименьший - при исполь-

Таблица 1. Адгезия клеток Vero на микроносителях; Цитогель и Цитолар-2 при использовании РБ в качестве заменителя сыворотки.

Наименование МН Вариант среды Адгезия (%)

3 час. 4 час. 5 час. 6 час.

Цитогель Цитолар-2 контроль, 10% ЭТО 32,3±1,2 ' 53,0+2,3 71,0±1,1 76,0±1,2 26,9+0,4 44,3+2,1 63,0+1,4 72,1±1,1

Цитогель Цитолар-2 0,5% РБ КРС 36,0±1,3 49,1±1,3 63,1+1,2 72,5±0,8 34,1+0,4 45,1+1,2 6.1,1+0,9 68,2+1,1

Цитогель Цитолар-2 0,5% РБ оленей 31,2+0,5 48,3±1,3 62,1±1,8 70,0+1,1 26,0+0,8 45,С±1,2 56,6+0,9 65,0+1,1

Цитогель Цитолар-2 0,5.% РБ свиней 29,3+1,1 45,8+1,0 57,1±2,0 63,3±1,2 23,0+0,7 41,3+1,3 49,1+1,5 56,0+1,1

Примечание: даны средние значения и квадратичные отклонения на основании Зх опытов;

0,5%.- концентрация РБ в среде по сухой навеске 5 г/л.

Таблица 2. Цролиферативная активность клеток Vero с различными РБ на микроносителях Цитогель и дитолар-2.

Еаимено-зание ЫН Вариант среды Индекс пролиферации (ИЩ

сроки культивирования (сутки)

.1 2.3 4 5

Цитогель Цитолар-2 контроль, 10% ЭТО 1,6+0,1 3,1±0,1 3,8+0,1 4,5+0,2 5.1Ю.1 1,4+0,1 2,3+0,2 2,7+0,2 3,2+0,1 4,3+0,1

Цитогель Цитолар-2 0,5% РБ свиней 1,9+0,1 3,8¿0,1 4,3+0,1 5,1+0,1 5,5+0,1 1,6+0,1 2,4±0,1 .3,2¿0,1 3,8+0,2 4,5+0,1

Цитогель Цитолар-2 0,5% РБ оленей 1,5+0,1 2,9+0,1 3,6+0;2 4,2+0,1 4,7±0,1 1,4±0,2 2,3+0,1 2,5±D,2 3,3±0,1 4,0+0,1

Цитогель Цитолар-2 0,5% РБ КРС 1,6+0,1 2,5±0,1 3,0+0,1 3,9±0,1 4,5+0,1 1,3+0,1 1,6+0,2 2,3+0,2 2,9+0,1 3,6+0,1

Примечание: посевная доза -200 тыс. кл/ыл; концентрация ЫН -3 г/мл.

зо£Ш'"и ростстимулирузсямх белков, выделенных из сыворотки свиней (63.3+1,2%). Как было отмечено ранее (Тарасов RE, 1975; Манш-гин Я А. и др., 1986), присутствие сыворотки свиней приводит к . значительному сюшгнию адгезивных свойств клеток. В данном случае имеет место корреляция между адгезивными свойствами ростсти-

- —-4W Лп nlími TI СТОПЧЛИЗЛЛ Г»иПППГ»Ф1ГПЛ РТШН^Й

VXRCKB, какйолйеаи ирдоаздчй-явная актнппиегь i».-««» VOÍ-U наблюдалась на 5 сутки при использовании в ростовой среде рост-стимулирутоиях белков, выделенных из сыворотки свиней (табл.2).

При этом, более высокие показатели ростовой активности от- v мечались на пористом микроносителе Цитогель (ИП 5,5) по сравнению с мжоокссителем Дитоларом-2 (Ш равен 4,5). При использовании ростстимулируших белкоз. выделенных из сыворотки оленей. прслисератиБная актизность ¡c.ei'OK Vero составляла 4,7 и 4,0 ео-отстзенно.

Результаты наших исследований совпадают с данными, полненными ранее Шубиной RA. с соавт. (1992), которые подтверждают преимущество использования пористого микроносителя Дитогеля по сравнению с микроносителем Цитоларом-2, не имеющим пористой структуры. Поэтому, предпочтительнее применять пористый микроноситель Питогель. как обеспечивающий получение большей биомассы клеток.

Тагам образом, ростстимулирукне белки, выделенные из сывороток крови северных оленей и свиней могут быть успешно использованы взамен эмбриональной телячьей сыворотки при крупно-масп-табном культивировании с использованием отечественных микроносителей, преимущественно пористой структуры.

5. Изучение условий культивирования клеток на макропористом губчатом субстрате с применением нативных сывороток разных видов животных и ростстимулируюших белков, выделенных из них.

Ранее в лаборатории культур тканей Института вирусологии РАМН была показана перспективная возможность культивирования большого числа клеток млекопитающих с использованием нового губ- -чатого макроносителя (Хшкнякова Т. Е и др.. 1983). Пространственная трехмерная структура волокон этого губчатого субстрата напоминает стромальную основу естественных клеточных органных образований. Субстрат имеет ряд преимуществ: наличие пор способствует интенсивному обмену питательных вешеств и метаболитов в околоячеистом пространстве, что приводит к активному росту

клеток с высокой ^неспособностью. Плошадь поверхности 1 г cibe-

а

рического макроносителя составляет 1200-3000 см , которая позволяет получать 20-30 кратный "прирост г-ьеток на' 1 культуральный" сосуд по сравнению с культивированием в матрасах и в 4-5 раз более. чем при культивировании с микроносителями, фактически 1 г носителя заменяет по плошали 10 культуральных (1,5 л) матрасов. Надо отметить, что такие результаты были nt'лучены при культивировании с использованием эмбриональной телячьей сыворткой.

Нами впервые была сделана попытка подбора оптимальных условий культивирования клеток ка губчатом субстрате с применением нативных сывороток других видов швотных (северных оленей и свиней), а также ростстимулируюших белков, выделенных из них. Изучали те же параметры (адгезивную способность клеток к позерхнос-

ти субстрата и пролиферативную активность), как и при культивировании на микроносителях.

Ш губчатом субстрате оптимальная адгезивная способность клеток ВНК-21 достигалась .при использовании всех трех видов сывороток (крупного рогатого скота, северных оленей и плодов коровы) - 63,4+5,5% ; 75,0±8,0% и 48,8+7,1% соответственно.

' l.llít ríjiciwri Vo¿ w .,■■■^'.,77 ~ --**-*"*" "*alw1,r япп пппнляя: n li un

использовании оленьей сыворотки и сыворотки плодов коровы (39,5+ 3.6% и 44.0i2,7%)'

Отмеченные различия по степени адгезии клеток ВНК-21 и Vero в пределах 40-75% объясняются условиями стационарного засева клеток, примененных в эксперименте, когда не наблюдается эфек-тивного прикрепления к субстрату в отличие от разлзрлого засеза, пси котором обеспечивается равномерное прикрепление 35-90% ¡слеток.

.. При культивировании клеток ЕНК-21 более высокую степень адгезии отмечали при использовании ростстимлируших белков (64.1+4,5%) по сравнения с .нативной сывороткой северных оленей (48,8+7,1%). Важно, что степень адгезии метек ВНК-21 приближалась к результатам, которьтс пс&кяалк при использовании сыворотки плолов коровы (75.0+8,0% ,р <0.05).

Аналогичные результаты получены в случае замены сыворотки крупного рогатого скота (63.4t5.5Z) на ростстамулирукпие белки, выделенные из этой сыворотки (75,0±3,1%).

- При замене сыворотки северных оленей на ее ростстимулиружу-жие белки не выявлено разницы влияния на прикрепление клеток Vero к субстрату. Использование т сыворотки свиней, как и рост-

стимулирующих белков из этой сыворотки обеспечивало низкую адгезивную способность клеток Vero к губчатому субстрату, что наблюдалось наш и яри культивировании, клеток на микроносителях.

Наряду с адгезивной способность», нами шучэна пролифера-тивная активность клеток БНК-21 и Vero в условиях культивирования их на губчатом субстрате.

При культивировании клеток ВНК-21 на макропористом субстрате с использованием нативной сыворотки северных оленей наблюдалось снижение пролиферативной активности клеток (Ш 3,6) почти в 2,5 раза по сравнению с контролем СИП 8,2) в то время, как при замене сыворотки северных оленей на ее ростстимулирухдие белки прослеживалось стимулирование пролиферативной активности клеток БНК-21 до ИП 5,7.

При замене сыворотки крупного рогатого скота на ростстиму-лируюше белки, выделенные из этого вида сывороток, наблюдалось снижение пролиферации клеток, несмотря на высокую их адгезию к субстрату. Ростстимулирушше белки, выделенные из сыворотки крупного рогатсго скота не поддерживали достаточно высокой плотности клеток ВНК-21 в условиях культивирования на макропористом губчатом субстрате.

Иная картина наблюдалась ври культивировании клеток Vero с использованием сывороток северных оленей и евшей с последующей их заменой на ростстимулируюше белки, выделенные из этих сывороток.

Применение сывороток северных оленей к свиней обеспечивает высокую пролиферацию клеток Vero (ИП - 10.5 и 12,9 соответственно) по сравнению с сывороткой плодов коровы - MI 9,0 (рис.1)

14 12 -in -

а ^ б

420

Рис. 1

Влияние сывороток разных видов животных на пролисреративную активность клеток Vero на ГС

ип

4. чт чи:. к

ios этс'

10% сыв.ол.

10% СЫ8.С8.

—1 10

дни

Пролкфератявная активность клеток Vero на ГС с применением сыворотки и ростстимулирующих белков свиней

10% cus. свиней, 2С 5% сыа.св.+5% РБ са. 10% РБ св.

Дни

10

1

6

Далее.замена нативной сыворотки свиней на 50% объема рост-стимулирухиими белками, выделенных из этой сыворотки, также обеспечивала высокую пролиферацию клеток Vero - ИП 12.3 (рис. 2). фи полной замене нативной сыворотки свиней на еэ ростстиму-лирушие белки наблюдалось снижение индекса пролкфзрашк до 10,5. •

Аналогичная картина наблюдается при культивировании этих клеток с использованием сыворотки северных оленей, а таете рост-стимулируших белков, выделенные из нее.

Таким образом, использование сывороток северных оленей к свиней, а также ростстимулирушщх белков, выделенных из этих сывороток. обеспечивает высокую пролиферацию клеток, что дает возможность рекомендовать их для культивирования клеток на новом типе носителя.

6. Диссоциация клеток с губчатого__субстрата Ферментами отечественного производства. .......

При пассировании клеток важным является процесс снятия клеток с субстрата. Обычно, для отделения клеток от субстрата используют препараты трипсина и химолсина, полученных из поджелудочной лелезы животных , которые могут быть конталшировакы микоплазыаъй (Бенюмович U.c., 1990; Сергеев RA., Собко Kl А., 1990). Сотрудниками ШЮ "Бектор" (Сандахчиев JL С? и др., 1992) получек новый препарат "Коллаза", который представляет собой комплекс протеолитических ферментов, выделенных из гепатопаккре-аса камчатского краба. Преимущество этого йермента состоит в том. что он свободен от микоплазм, поскольку источником коллазы являются свободные от микодлазмы морские животные, живущие е от- >

зной от человека экологической нишэ.

Предварительные исследования по применению коллазы для тьтивчрования клеток в моносдойньк условиях культивирования сазали, что применение коллазы позволяет увеличить выход жиз-:яособньк клеток в 2-2.5 раза по сравнению с трипсином и зкьгоает дозреждадаее действие Фермента на клетки. При этом

...с; "^«wwiimtiibíítiu ,"u'quo(i ипыщп-

!L

Результата исследований воздействия Ферментов отечественно-производстЕа (трипсина, химопсина и коллазы-3) при диссопиа-и ¡слеток с губчатого субстрата подтвердили эти данные абл.3).

Табл. 3. Еиссош;ацил клеток с губчатого субстрата Ферментами отечественного производства.

серменты Клеточная культура Кони-я Фермента ( мг/мл) Время действия (мин.) Кол-во снятых клеток (тыс. гсл/Фр.) £йзнеспособность (%)

Химоясин. ;сол.:аза-3 трипсин ЙШ 0.1 0.1 0.25 4 3 1 233Х105 • 209x10* 88x103 90.0 92.0 75,0

Хиыопсин.К. кодлаза -3 трипсин Vero 0.1 0.1 0.25 10-12 8 о 268x10* 305x103 looxio3 94.5-100 94.4 61.4

лимопсин.К. колдаза-3 EHR-21 0.1 0.2 10 10 333x10^ 533x10 98.0 ' 100.0

- 26 -

При применении трипсина количество снятых клеток Vero и БНК-21 с субстрата в 3-3,5 раза меньше по сравнению с ферментами химопсином и коллазой-3. клеток ФЛЭЧ - в 1,5 раза меньше контроля.

„Изучение действия ферментов отечественного производства - при диссоциации двух перевиваемых клеточных культур выявило преимущество. ферментов - химопсина и коллазы-3. При этом, кол-лаза-3 обладает более щадящим действием па клетки. £:ссоциацкя клеток при воздействии коллазы-3 происходит быстрее по сравнению с химопсином без изменения своей шрфологш. \

Полученные нами данные совпадают с дашшми авторов (Сандахчиев Л.Д и др., 1992).

Таким образом, подобраны оптимальные условия культивирования перевиваемых клеток на новых пористых носителях с применением отечественных сред, протеолитических ферментов, сывороток крови северных оленей и свиней, а также ростстимулируюших белков, выделенных из них.

ВЫВОДИ

1. Показана возможность использования ростстимулируюших белков, полученных из сывороток крови разных видов животных, с добавлением нативной сыворотки для культивирования наиболее переспективных производственных клеточных линий BSK-21 и Vero.

2. Впервые установлено, что сыворотки северных оленей и свиней и ростстимулируюшие белки, выделенные из них, -могут применяться взамен эмбриональной телячьей сыворотки при культивировании перевиваемых клеток на отечественных микро- и макроносителях.

3. Достигнута высокая продуктивность клеток Vero, вырашен-

на микроносителях, при применении ростстимулируюизгх белков.

выделенных из сыворотки свиней, что позволяет рекомендовать их для культивирования клеток почек, зеленой мартышки на микроносителях.

4. Ростстимулируталие белки, выделенные кз сыворотки север-•«-» oro»»» ---"-»o-rnir яя пввеох-

НОСТИ пористого микроносителя ШГГОГОЛЬ г.о С^апсппм с на непористом микроносителе Питолар-2.

5. Впервые выявлено, что на губчатом субстрате также, как и на пористом микроносителе Питогель наблюдается высокая адгезия клеток при использовании как ростстимулируших белков , так и натинноЯ стшсротки северных оленей.

6. Показано, что при культивировании клеток на губчатом субстрате отмечается более высокая их пролийерашя (в 4-5 и более раз ) по сравнен™ с культивированием на микроностелях. Активный рост меток наблюдается при применении не только сывороток крови северных оленей и свиней (до Ш 10.5-12.9). но и при использовании ростстимулиоукших белков . полученных из этих видов сыноротпк.

7. Впервкэ л ля отделения клеток с поверхности макронссите-лей применен новый протголитический фермент из гепатонвикреаеа камчатского краба - "Коллаза-3", обеспечивающий более активное и гадящее действие на метки по сравнению с трипсином.1

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Т. М. Хижнякова. Р. Я. Подчерняева. Е. 0. Дариенко. С. М. Адуева Комбинированный метод культивирования клеток млекопитающих. Ж. Цитология. 1992. т. 34. Н 9. с. - 114-115.

2. С. М. Адуева. Р. Я. Подчервяева. Коммерческие питательные среды отечественного производства. Тезисы научной конференции "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии", Махачкала. 1992. с. 129. .

3. С. Е Адуева. Р. Я. Шдчерняева Биотехнологические методы культивирования клеток. Тез. конф. "Актуальные проблемы вирусологии", Казахстан, 1994. с. 11-12.

4. Т. М. Вянякова, С. М. Адуева. Р. Я Шдчерняева Использование клеточных кульур в биотехнологии. Тез. конф. "Актуальные проблемы вирусологии". Казахстан, 1994. с. 12-13.'

5. С. М. Адуева, Т. М. Хижнякова. Р. Я Шдчерняева Оптимизация условий адгезии клеток на губчатом субстрате с применением сыво-

. роток и ростстимулируюших белков разных видов животных. 8 с.

Лен. В ВИНИТИ 08.09.94. N 2170 - ВЭ4, *****

Считаю своим приятным долгом выразить глубокую благодаро-ность директору Института вирусологии им. 2L И. Ивановского РАЖ. академику РАШ £ К Львову, директору НПО "Питательные среды", доктору медицинских наук, профессору Мзджидову М. Ы. за предоставленную прекрасную возможность получить образование в Институте вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМЕ

Выражаю огромную благодарность моему научному руководителю - доктору медицинских наук, профессору Шдчерняевой Р. Я. за постоянное внимание и всестороннюю помощь при проведении исследований и при оформлении работы. Выражаю сердечную признательность старшему научному сотруднику, кандидату биологических наук Хих-няковой Т. Ü за большую помощь при выполнении настояшей-работы, ценные советы и постоянную поддержку.

Приношу благодарность за оказание всесторонней методической и консультативной помоши в выполнении научных исследований и продуктивное . сотрудничество старшим научным сотрудникам лабора-.гссш г;—В. А. иэтайяттй г.?.. Мельниченко

Е.И.

, • Искреннюю признательность выражаю лаборанту лаборатории культур тканей Пимакиной ЕЕ за постоянное содействие в работе. . Вышемирскому О. И. за оказанную техническую помошь при оформлении диссертационной работы.