Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка питательных сред для культур клеток млекопитающих на основе ферментативного гидролизата казеина

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка питательных сред для культур клеток млекопитающих на основе ферментативного гидролизата казеина"

'ОСУДАРСТВЕННЫЯ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦШ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ РОССИЙСКИЙ >ШКО-ТШШОгаЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. Д.И.МЕНДЕЛЕЕВА

На правах рукописи

КОРЕНЕВА АННА ИВАНОВНА

РАЗРАБОТКА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК МДЕКОПИ7АЮШ НА ОСНОВЕ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗАТА КАЗЕИНА

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук '

Мссква - 1995 г.

Работа^выполнена в Научно-исследовательском проектно-конструк тсрсксм институте прикладной биохимии (АО "Биохиммаш").

кандидат "медицинских наук Александр Сергеевич Пригода

» г

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор -Дев Семенович Джиндолн •кандидат биологических наук Светлана Петровна Сергеева

Ведущая организация; ' Государственный научно-исследовательский институт

прикладной микробиологии (г.' Оболенск Московской обл.)

* : • ■

по адресу: 125190, Москва, Миусская пл., д. 9, РХТУ им.' Д.И.Менде-

Научкые руководители:

доктор технических наук Семен Ефимович. Строгов,

"¿/¿щита диссертации состоится на заседании диссертационного сов

леева;

• С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Россикскбго мико-технологического университета им. -Д.И.Менделеева.

.Автореферат

Ученый секретарь

■ кандидат биологических нзун

диссертационного созеш

Ида Ивановна Гусев,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Метод клеточных культур находит широкое ркменэнпе во многих областях биологии, медицины, и ветерлнарии. . естущие масштабы производства диагностических, и лечебна-профидак-ичесюк препаратов требуют совершенствования технологии гс/лъ'пган' звания клеток и, в первуп очередь, создания более простых, н деше-аК питательных сред. Перспективным направлением ь данной области вдяется разработка питательных сред для культур клеток млекопитаю- 1 ах о использованием белковых гидролизатов взамен дорогих и дефи-лтных компонентов. сред, в первую очередь аминокислот. Проблему жрацения количества сыворотки крови в питательных средах также эжно решать за счет использования белковых гидролизатов.

Разработанным до сих пор отечественным гидролизным средам для теток млегапитающих присущи некоторые недостатки: использование ;фицитиого исходного белкового сырья (мясо, кровь, дрожжи), агрес-ганых гидролизующцх агентов; сложность процессов получения высоко-нлцечных гидролизатов (ионообменная очистка либо необходимость >едварительнсй подготовки субстрата); невозможность снижения1 }«эн->нтрации сыворотки крови; нестабильность роста клеток.

Таким образом, разработка недефицитных, недорогих, »ысокопро-

I'

■ктивных питательных сред для культур клеток млекопитающих ¡¡а 6о->ве гидролиаатов белков с заменой большей части гминокислот и сиротки крови, является актуальной и отвечает потребностям дальией-го развития клеточной биотехнологии. •

Цель и задачи исследований. Целью исследований является разра-тка отвечающих указанным требованиям питательных сред дли культур етск млекопитающих на основе ферментативных гидролиэпгсж казеина, лученных под действием ферментных препаратов от -«отвеиного про-

изводсТва..

" Достижение поставленной цели осуществлялось решением следующи 'основных задач I

1) отработка режимов гидролиза казеина с использованием оте чественных ферментных протеолитических препаратов для получени гидролиэатов о йчсокими ростовыми свойствами;

' 2) обоснол.-гие способа очистки ферментативных, гидролиэатов ка зеипа от токойчаых для клеток млекопитающих примесей;

, .3) ран работа питательной' среды для культур клеток млекопитаю щих' с ферментативным гидролизатом казеина в качестве источник большинства аминокислот;

4) получение малосывороточных питательных сред для культивиро вания клеток млекопитающих на основе ферментативного гидролизат казеина. '

Научная новизна результатов. Предложены новые питательные сре ды для культур'клеток млекопитающих с использованием в качестве ис точника питательных и ростовых факторов ферментативного гидролизат казенна. Отработаны режимы гидролиза казеина отечественными' фер

ментными препаратами протосубтилином и панкреатином таким образом «

чтобы гидролизаты ; обладали высокими ростовыми свойствами в отноше шш клеток млекопитающих. Обоснован способ очистки гидролиэата о цитдтоксических примесей при помощи активного угля. Показана воз

■ г

можность полноценной замены ферментативным гидролизатом казеин большей части высокоочгаденных индивидуальных аминокислот и сыворот ки йрови крупного рогатого скота в стандартных средах для культу клеток млекопитающих.

Практическое значение работы. Работа явилась научной основ" *

для разработки технологии производства питательных сред для культи вирования клеток млекопитающих. По результатам работы разработана

передана заказчикам следующая нсрм»хкгк2 -ч-гничес"?.-. д. кл^кт^;::^:

1) лабораторный регламент на приготовление питателто:: средь' для культур клеток ВНК-21 и ЛЭЧ о использованием ферментативного гвдролизата казеина как источнике болт,п;:кства аминГогас-лот;

2) лабораторный регламент культквиргваикя клеток ЕНК-21 г лооывороточной питательной среде с 1-2 % еьгеоратк;: крови крупного рогатого скота' на сонсве охачестве-нных ингредкептол;

3) опытно-промышленный регламент получения малосывороточной питательной среды, используемой при производстве противоящурной вакцины.

Результаты работы использованы при культиьировании клеток ВНК-21 для получения противоящурной вакцины на Покровском заводе биопрепаратов (Владимирская обл.) и лимфоидкых клеток - продуцентов вируса СПИД в НПО "Вектор" (Новосибирская обл.).

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались нз II Всесоюзном совещании "Культивирование клеток животных и человека" (Пущино, 1985 г.), на Всесоюзной конференции "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии" (Махачкала, 1990 г.), а также на восьми научно-технических конференциях НИИВХМП и пауч-

v '

но-техническом совещании в НПО "Вектор".

Публикация результатов. Основные результаты диссертационнра работы опубликованы в 9 научных работах в период о J.983 по 1991 f.,

I

получено положительное решение по заявке на изобретение.

'Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора данных литературы, главы "Материалы и методы исследований", трех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованных источников.

Работа изложена на 150 стр. машинописного текста и содержи"1 24 'таблицы и 12 рисунков. Список источников вклгча?" 251 наименование

в том' числе 148; на ¡ппстрзшшх языка:,' .

... -""'"нь'п .вклад автора. Все основные работы. были: ЕкпоЛнёйЫ -;знwho /V авторов под руководством доктора технических-наук С. 'jE. ' СтроЬова ti ■ кандидата медицинских наук А. С. ПригодЫ.

СОДЕРЖАНИИ РАБОТЫ ', ,

., Во введении к диссертационной работе .обоснована актуальность '.■Выбранной темы и. определены общие задачи и цели исследования Г '

ГЛАВА 1. ОБЗОР ДАННЫХ ЛИТЕРАТУРЫ

-■;; Глава посвящена обвору данных литературы, ив; анализа которых ' установлено, что наиболее целесообразным способом получения питательных'' сред , для крупномасштабного культивирования .клеточных культур .Млекопитающих является использование в 'качестве ; амягакислэт-но-йелтидной . основы этих сред гидролизатов белков. Это реальный и экояо!Л1ЧНый способ замены дорогих й дефицитам: компонентов' питательных сред для культур клеток животных. . ' ' ; " '■■"";>' ' ; (; '-; В рбзоре освещено современное состояние вопроса по * разработкб , гидролизных. сред; для.' клеточных культур, -дан анализ особенностей ферментативного гидролиза казенна, а также рассмотрена проблема га-мены сыворотки крови в ередах другими/компонентами. ■ ' ; , ' -'•/,> По экономическим и технологическим соображениям в качестве исходного ; сырья для приготовления белкового гидролизата как осковь . питательных сред' для, клеток млекопитающж выбран' технический казе-:: ш, а в качестве гидролизугопщХ' агентов выпускаемые'отечественно:' промышленностью технические ферментные препараты' микробного и ' жи-' вотного происхоадения." ■

-.'■•..• ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАН]®

' Исследования проводили на культурах клеток ниекстг'ающих НК-21, Л34, Vero, полученных ив музея клеточных культур НПО,"Век-ор". Все культуры выращивали мокосдойньм способом в матрасах, а летки ВНК-21 и ЛЭЧ также суспензионным способом й колбах на начален ферментаторах., Параметры культивирования: температура а дли-.." •ельность цикла культивирования, рН среды, посевная доза, объем ва-юлнеаия культивационных сосудов, интенсивность аэрации и перемети-1ания, - соответствовали принятым для данных линий клеток. Клетки ¡ультивировали путем длительного пассирования. Для'"оценки качества вдтательных сред .» соответствии о имеющимися рекомендациями прово-1или культивирование на протяжении не менее 6 пассажей. В качестве соктрольной использовали полусинтетическую среду'ПС, составленную ?з 14 аминокислот, 8 витаминов, 6 неорганических солей, глюкозы и ^енолрота и дополненную 10 X сыворотки крови крупного рогатого ска-га. В ряде случаев в качестве контрольных применяли " другие аналогичные с-реды.

Начальную и конечную концентрацию клеток в пассажах с одновременным подсчетом доли жизнеспособных определяли о помощью 'камеры Роряева, причем клеточную суспензию предварительно смешивали,с раствором трипанового синего. Коэффициент пролиферации клеток- рай-считывали как отношение конечной концентрации клеток к начальной.

Для гидролиза технического казеина (ГОСТ 17626-72) применяли трипсин фирмы "Serva" и технические ферментные препараты отечественного производства: нейтральный протооубтилин ГЗх и иг«;-щелочную протеазу,и панкреатин. Протеоллтическую активность Ферментных препаратов определяли по модифицированному методу Аксона согласно ГОСТ 20264.2-74.', Содержание аминного азота в гкдролиаагач осущеот-' ■

- -& -

влялн■методом формольного титрования. Гндролизаты очищали от цито-токспческих примесей активным углем.

Приготовление питательных сред проводили в соответствии с сб-

г

непринятыми методами. Основы питательных сред, их отдельные компоненты и ферментативные гидролизаты стерилизовали ультрафильтрацией черег? мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм.

. Все анализы и определения проведены как минимум в трех пов-торностях. При длительном стабильном культивировании клеток во многих случаях за параллельные определения принимали результаты п последовательных пассачей, если статистически доказывалось отсутствие существенных различий между ними. Экспериментальные данные обрабатывались Методами математической статистики на ЭВМ с использованием стандартного пакета прикладных программ.

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА!А КАЗЕИНА ДЛЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ

С I *

Экспериментально определяли режимы гидролиза казеина отечественными техническими ферментными препаратами различной природы и степенй очистки, обеспечивающие максимальное накопление аминного азота. Вначале было показано, что при действии импортного трипсина в концентрации 0,1 % на 5 7. -ный раствор казеина при температуре 50"С и рН 8,5 достигается выход аминного азота,' равный 350 мг X. При обработке казенна щелочной протеазой микробного происхождения при рН 8,0 и температуре. 55°С был получен такой же выход аминного азота, однако для этого потребовалось в 4 раза больше ферментного препапзта. Длительность гидролиза в обоих случаях составляла 1 ч. Использование препаратов нейтральных протеаз - протосубтклина ГЗх и Г10х в еще более высоких концентрациях также позволяет достигать

- g -

;осг&1счио высокого мисда ашанзгс азота. При этом оптимальная 'одясрзхурз процесса гидролиза про^осу^-шином Г?-. p«rin СО С, 'iO;:~v5*C, а дл^хс-льнсють гидролирн составляет S и 1 ч сосЬетст-

ithho.

Для получения панкреатического гидролиза!а казеина определены "тгду^е ¿¿¡»Шшштю у<!л..иия: те^торпг/р^ -Ю'С, ¿I 3,0, чли-н.чл-юсть гидролиза 2 ч при концентрации панкреатина 0,5 %.

Высокие ростовые свойства гидролизатов, определяемые по вы,;оду меток в питательных средах на их основе, подтверждает правильность шределения оптимальных условий гидролиза.

Из обобщенных данных по оптимальным режимам получения гидроли-*атов казеина для культур клеток мяогапитзоших следует,

rro гидрелизаты получают зз несколько часов в мягких услозилк.

Таблица 1

Оптимальны* рвд.шы гидролиза каееина ферментными препаратами

—_—-----_-------------г--------------------__---------1

l!;'.;r;,'.iHor.auv>¿ |Единица)Г.ехичнна показателя для отдельных препаратов|

1 показателя | 1 измерения 1 -- |трипсин 1 i i |щелочная| ¡протеаза| протооубтилин ГЗх | Г10х т——— 1 )пзнкреа-| | тин | i ' i

i Концентрация| % 1...... 1 0,1 1 " " 1 1 0,4 | 3 i...... 1 ' з 1 t 1 ! i 0,5' ¡

препарата ! 1 I ¡ 1 1 1

Температура | "С | , 50 I 55 | 50 | 45 I .40 I

Значение рН ¡ ед.рН i 8,5 1 8,0 | 1 ?,0 1 9,0 1

Длительность! ч 1 1 1 1,1 1. 1 5 1 2 1

гидролиза | 1 1 ) 1 1 , , 1

Аминный азот| ' мг % | 350 » | 250 | i ñ . i 220 | 320 [ ¡ 300 1 .1 .. — .. 1

Ферментативный гидролизат казеина содержит в большом количестве 12 из 14 аминокислот, необходимых для клеток животных (табл. 2).

/ Таблица 2

Аминокислотный состав триптического гидролизата казеина и среды ПС

1" ---------------- -........ | Наименование V * - 1—-:—---1 I . Концентрация аминокислот, мг/л |

| аминокислот. 1----г- --—

1 • > |Гидролиэат казеина| 1 1 Среда ПС |

( | Алания 1 1 I 39411 |

| Аргинин | 49011 | 77-105" |

| Асларагиновая кислота | 819±2 .■' ' | ■ / - 1

| ВаЬш I 88412 | 21-46. ; |

| Гиотидин | 381±1 | 8-31 . |

| Глицин 1 34011 | - |

| Глуг'змин | следы | 584 . |

Г Глутаминовая кислота I 59312 | " 1

а I Изолейцин | 66012 | 17-52 ' |

| Лейцин • ц - | 183016 | 22-52 Г

| Лизин . 1 356716 [ 44-58 |

I Метионин . | Прилин | 115413 . I 12-15 |

| 15911 . ) 1

I Серии , . | 33811 . | . 19-25 I

| Тирозин | 130314 | 19-36 \

I Требнин , . 1 • 1 73213 | 16-48 |

|.Триптофан • | следы I 10-12 |

| Фенилаланин ' | 129514 I 10-32 |

4 | Цистин, *. . I______,',. .. . _______—.' I 39511 1 1 , ... _______ ______1— '. 16-24 . ... Г • 1 '

- и -

При сравнении качественного и количественного состава ферментативного гидролизата кавеина -и контрольной среды ПО установлено, что в 40 мл жидкого гидролизата казеина содержится примерно такое «е количество большинства аминокислот, как в 1 л среды ПО. в связи з этим нами предложена новая среда, в которсл 0,25 % (по сухому весу) ферментативного гидролизата кавеина заменяет' 10 аминокислот с,рвды ПС, а именно: вагин, гиониин, ияолейцин, лейцин, лизин, ме-тионин, серии, тирозин, треонин, фенилаланин. Остальные комгонё^ты

этой среды соответствуют прописи среды ПС. ■ ;

*

В опытной среде на основе триптического гидролизата казеина успешно культивировали клетки ВНК-21 в монослое в течение 7 последовательных пассажей длительностью по 48 ч каждый. ' В опыте и контроле получили примерно одинаковый выход жизнеспособных клетс;:, соответственно: (2,20+0,13)-109кл/л и (2,26А0,10)•10экл/л. Доля жизнеспособных клеток в новой среде такте была высока:, не менее 95

Триптический гцдроливзт казеина применяли без какой-либо очистки непосредственно после завершения процесса гидролиза и инактивации ферментного препарата. Вместе с тем обнаружено, что при использовании технических ферментных, препаратов получаемые гидролиэа-ты нуждаются в очистке из-за наличия примесей, которые не позволяют осуществлять длительное культивирование клеток. ''

Из наиболее часто используемых в различных отраслях промышленности способов■очистки' биологических продуктов: сорбции активными углями и ионного обмена, - выбрали первый, как наиболее удобный и простой технологически и обеспечивающий меньшую потерю аминокислот. Применяя для очистки активный уголь марки "Норит А" фирмь "Серга", получили нетоксичные для клеток ферментативные гидрсливаты каэепна, Гидролизат, полученный под действием протосубтилина ГЗх, . обеспечивал мон'ослойное культпЕирозание клеток. Фврментсш'.эат, приготовлен-

нын о протосубтилином ГЮк, оказался пригодны.) как для монослойно-го, так и суспензионного культивирования клеток, что объясняется большей'Чистотой данного ферментного препарата. Очищенные активным углем гидролизаты обладали высокши ростовыми свойствами, и выход клеток в питательных средах на их основе находился на уровне контрольной среды ПС и выше.

' Для успешного использования отечественных активных углей, применяемых в промышленности, оказалось необходимым подвергать эти .угли предварительной очистке, заключающейся в обработке соляной кислотой о последующей промывкой обессоленной водой и прокаливанием при температуре 180"С в течение нескольких, часов. Наиболее эффективными для очистки, гидролизата, полученного под действием протосуб-тилина Г10х, оказались угли марок КАД-молотый и ОУ-А. Выход клеток . б питательной среде с ферментолизатом казеина, очищенным активным углем КАД-молотый, был выше, чем при использовании активного угля марки ОУ-А, и равнялся выходу клеток в средах с гидролизатом,.очи-щенным импортным углем "Норит А", и еыходу клеток в контрольной среде,•а именно (1,910,2)-109кл/л. Угли марок БАУ,- АГ-3, АДГ-84, СКТ-6А оказались значительно, менее эффективными. Для очистки панк-

о

реатического. гидролизата казенна нами были выбраны активные угли марок ОУ-А и ОУ-Б, которые обеспечивали необходимое качество гидролизата.

. При- очистке гидролизата, полученного под действием протосубти-лина ГЮх, ультрафильтрацией на полых волокнах средний выход клеток по пйти пассажам, равный (1,7+0,3)-103кл/л, оказался несколько ниже, чем. при использовании наиболее'.эффективных углей "Норит А" и КАД-молотый.

Эффективность'очистки ферментативных - гидролизагов кзгеина .П0Д1В5рлДена рядом опытов по длительному культивированию клеток

НК-Й1 в питательных средах на основе очищенных гидролизатов, в равнения с выращиванием клеток в контрольной среде ПС (тзбл.Е^. В, тих опытах для очистки протосубтшшновых гидролиаатов применяли ктивный уголь КАД-молотый, а для панкреатического гидролизата -голь ОУ-А. Доля жизнеспособных клеток ео всех пассажах как в опыт--ых средах, так я в контроле, составляла (99,0±0,1) %. -

Таблица 3

Выход клеток ВНК-21 при замене 10 аминокислот в среде ПС ■ , ферментативным гвдролизатом каэеика

Ферментативный препарат для гидролиза 1 |Количество |пассажей | шт. . 1 Выход клеток в средах, 109кл/л |

| с гвдролизатом 1 контрольной ПС 1

Трипсин 1 7 2,21-0,1 | 2,3+0,1 . |

Протосубтилин ГЗх 1 ^ 2,110,1 I 2,110,1 |

Протосубтилин Г10х 1 5 2,5+0,1 | 1,9+0,2 |

Панкреатин I 6 I.. .. .. 2,0+0,1 | | 1,8+0,2 | |

Как следует из представленных данных, питательные среди на

снове ферментативных гидролизатов казеина обладают., высокими ростш-ыми свойствами и обеспечивают выход клеток на уровне контрольной реды и выше.

Очистка рассмотренным способом ферментативных гидролизатов ка-еина, предназначенных для культивирования клеток млекопитающих, в итературе не описана Ранее игпольвовали предварительно очищенные :азеин и ферментные препараты, что удлиняет процесс получения фер-ентативного гидролизата, удорожает получаемый продукт и не превращает наличия в нем примесей, образуемых в хо^е гидролиза. Об-

работка белковых гидролизатов для культур клеток активным углем проще технологически и протекает быстрее, чем очистка на ионообменных сиалрх.

По предложенному нами способу разработана технология получения в

и очистки ферментативных гидролизатов каэеинз для клеточных культур в лабораторных*и крупномасштабных производственных условиях (на Покровском заводе биопрепаратов, Владимирская обл.) с использованием реакторов для гидролиза и очистки емкостью до 250 л. Технологическая- схема получения гидролизата (рис. 1) предусматривает закачивание; бтмывание казеина, последующее его растворение в 0,1 % растворе бикарбоната натрия и ферменгсшк? при 40'С в течение двух часоа в реакторе (поз. 1). По истечении срока гидролизз температуру в реакторе поднимали до 65-75 'С для инактивации действия ферментного препарата, а затем проводили осветляющую фильтрацию на фильтр-прессе (поз. . 2). Осветленный гидролизат обрабатывали активным углем в реактс'ре (поз. 3),, затем проводйли декантацию гидролизата отстаива-кием отделение • частичек угля осветляющей фильтрацией. Полученный прозрачный светло-желтый гидролизат подвергали стерилизующей1- фильтрации на'мембранном фильтре (поз. 4). '

о

' ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ С СЫВОРОТКОЙ КРбВИ

; НА ОСНОВЕ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗАТА КА301НА

л г ■ ■ . .

'Как показали результаты исследований (глава 3), очищенный фер* ментмивный гидролизат казеина в принципе может служить- основой питательных сред для культур клеток животных. Оптимальной дозой его в среде, 'по-видимому, является концентрация .0,25 X. (по сухому весу), что обеспечивает достаточное для успешного роста клеток содержание по крайней мере 10 аминокислот. Еще четыре аминокислоты: аргинин,'

сж. богоцх

Рис. 1. Аппаратурно-технологическая схема получения ферментативного гвдррлкзата казеина-к-малосывороточной питательной среды: 1, 3 - реакторы емкостью 250 л; 2 - фильтр-пресс; 4"~ установка стерилизующей фильтрации

глутамин, триптофан, цистин, - содержатся в гидролизате в значительно-меньшем количестве по сравнению о концентрацией их в сбалансированной по аминокислотам полусинтетической контрольной ■ средой.-

Необходимость корректировки состава среды на основе гидролиэата кае

веина но этим аминокислотам проверена в сйциальном опыте. Было составлено несколько ' вариантов питательной среды на основе гидролиза*

та, в каждом из которых добавлялось то или иное количество аминокислот в различных сочетаниях.

При культивировании на этих, вариантах среды клеток БНК-21 в суспензии на протяжении пяти пассажей оказалось, что бее добавления цнотина клеточная культура только сохраняется, но не растет. Без добавления глутамияа выход клеток постепенно снижается от пассажа к пассажу. При наличии этих двух аминокислот, но без аргинина и триптофана выход клеток резко снижается в первом пассаже, и эта тенденция наблюдается и .'в следующих пассажах. При выращивании . клеток только без аргинина выход клеток достаточно высок, начиная со второго Урссажа. В первом пассаже выход клеток несколько снижен, по-видшоыу, из-за необходимости адаптации клеток к такой среде. Без триптофана клетки хорошо растут первые три пассажа, ватем их выход постепенно снижается в пследующих пассажах. Сводные данные о влиянии добавления аминокислот на рост клеток ВНК-21 в суспензии представлены ниже. (табл. .4). ! ■

На основании проведенных исследований можно сделать заключение, что корректировка питательной среды на основе ферментативного гвдрсшизата казеина четырьмя дефицитными аминокислотами обеспечивает, выход клеток на уровне контрольной среды, оптимально сбалансированной по своему аминокислотному составу и наиболее продуктивной из известных псаусинтетических сред для этих клеток. Оптимальная концентрация дефицитных аминокислот принималась равной той, которая

отработана для контрольной среды, и в достаточной мере увязана с потребностями клеток, .'••''

Таблица 4

Выход меток ВНК-21 в суспензии при добавлении в среду на основе ферментолизата казеина различных аминокислот

1!К I

Добавляемые аминокислоты

опытов | аргинин | глутамин

триптофан| цистин

Еыход жизнеспособных клеток, 109кл/л

+ I + I

1

+ I I

0,49+0,17 1,43+0,45

0,78+0,23 1,70+0,59 1,72+0,20 • 1,82+0,16

I

Контроль - среда ПС

1,74+0,17

При массовом культивировашт клеток в течение не менее пяти пассажей в среде на основе ферментативного гидрсушзата казеина сО-наружено, что выход .клеток варьирует от пассажа к пассажу и от одной партии среды к другой, особенно если гидролизат, приготовлен иэ разных партии казеина. Эти различия могут быть существенными, как обнаружено для сред, приготовленных на основе шести различных партий казеина (табл. 5). Однако также оказались существенными различия в выходе, клеток в контрольной среде ПС, приготовленной иэ ингредиентов различных партий. Вариации выхода клеток по средам харзк-т.еризуются дисперсией, величина которой для гидролизной и контроль- .

}юй сре^ оказалась почти одирайовой (0,062 и 0,061 соответственно). Следовательно, по выходу клеток стандартность гидролизной среды не ниже, чем контрольной среды из индивидуальных аминокислот.

' Таблица 5

Еиход клеток ВНК-21 в средах различных партий

N11

партий

г-г-1

Средний выход клеток ВНК-21' (по пассажам), Ю9нл/л|

Н

| сред ' | рпыт | контроль |

1 1 ' 1 2,010,3 1 2,310,1 |

I 2- | l.SiQ.l Г 2,110,1 |

1 3 | 1,710,2 1 1,010,2 |

1 . * 1 , 1,810,1 1 1,3+0,2 |

1 5 . Г •1,9±0,3. 1 1,710,2 |

1 1 6 ) 1 ¡i' 1 1,9Ю",2 1 1,910,2 " |

|Средний выход | |кл. по партиям!' 1,9+0,2 1 1,910,3 |

Жизнеспособность клеток как в контрольных средах, так и во всех опытных cocтaвляia (99,0±0,1) %.

В среде на основе ферментативного гидролизати казеина проводили длительное культивирование нескольких линий меток: ВНК-21, ЛЭЧ, Vero, - различными способами: моносло^ным в сосудах Карреля или матрасах, суспензионным в колбах на качалке и лабораторном ферментаторе,-в сравнении с контрольной средой ПО. Пролиферативные свойства среды о ферментативным гвдролизатом казеина проверялись также в НПО "Вектор" при использовании в качестве контрольной среды GMEM. Нолу-

ценные данные свидетельствуют о то:;, что го всех случаях показатели роста тога, г, оптпи:: средач нэ шие, чем в коитрольящ (гаЗл. 6).

Таблица 6

Ростовые свойства среды с ферментативным гидролиаатом казенна

I

Способ

Пслгазахеди роста клеток

Линия

1 | гультп- ! Лвдеко пролиферации ¡Выход кл&ток, 109кл/л |

| клеток | "-1-)-1-'-1

| | вирования| опыт | контроль | опыт | контроль 1

1-

-Ь

+

---1

- . !

I

1 .ИО.З !

1.4+0.,! !

0.5^,2 I ".^¿О.П I п,5±С,1 !

¡ВНК-2115(Монослой | 9,9+1,Э | 6,7+0,9 ! -

1ВНК-211'|Суспензия | 8,9±1,2 | 8.3+1,0 | .

¡ПШ.-Й! ¡Сусясйсйя | 4,8±С,3 ! 4,5-0,5 ! 1,9*0,1

¡ж:-г: |пксрезкхзр| з;с±о.з 4,з±а,г |

¡Монослой 1 2,5±0,1 | 1,СЮ,3 | 1,0*0.6

¡Суспенеия ! 2,4+0,1 2,4+0,4 ! 0.540,1

¡•.'•гг.: !Мсксглзй ! 9,и0,0 : 4,4+0,4 | 1,1+0,1

_______1______I_1_I_

1'Данные НПО "Вектор"., . :

?иг!Т?сттсссЗкость клеток составляла для сосудов Карреля, матрасов л колб (99,0+0,1) *., а для Сисреактсра (9Б,1±0,1) 7..

В биореакторе (ферментаторе) при аналогичных кривых роста выход клеток существенно выше в опытной среде (рис. , что подт?«отдается ванными дигперсионного анализа. Рассчитан«: ■? значение дисперсионного отношения различий в- выходе клеток г спитной среде ¡^контрольной (Ррзсч.» 10,39) выше критического (Ртабл.= 5,12). Это свидетельствует о том, что среда на основе ферментолизата казеина по питательной ценности превосходит контрольную лолусингетяческую.

4,0

2,0 1.0

0,1

и ^ /

у 4 л ь

/ г / /

/—

/ ¥

1 J /

У /

/ 1 к"

-

О 9 4 6 8 10 0 2 4

Г

Рис.- 2. Зависимость выхода клеток ВНК-21 (С, 109кл/л) .от длительности (г, сут) культивирования: в среде на основе ферментолизата казеину (1 - 4) и контрольной ПС (5) в полулогарифмических координатах

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА МАЛОСЫВОРОТОЧНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ CF"~!

ДЛЯ КУЛЬТИЕИРОЕАНйЯ КЛЕТОК МЛЕКОПЙТАЩГ.

Зссенциальнкм фактором роста млекопитающих в культуре in vitro является сыворотка ярсв'п тшаоткых. Она поэтов представляет' собой один из обязательных компонентов практически всех современных сред для клеток млекопитающих и в то же время самый нотелзтст::;ый ;:з-йа сзс'й дороговизны, дефицитности, с—днос'ти хранения и транспортировки, нестандартности, трудности освобождения ~ -рт контамкнантов различной природы. Из двух основных исследуемых различны-/ путей замены сыворотки: набором соединений определенного химического состава или комплексом пептидов гидролизатов белков сложного, до конца не изученного состава, - в настоящеэ время наиболее реальным и экономичном является второй п\- \ъ, если к тому же ограничиться гадачей замещения большей части сыворотки, но не полностью всей.

Ha.ni проведены исследования по возможности замены сыворотки крови комплексом пептидов гидрслизата казеина, полученного ферментативным. путем. В качестве ферментного препарата выбран панкреатин, так как наличие в этом препарате смеси энзимов (трипсина, химстрип-сина, карбоксипептидаэ), атакующих различные участки белковой'молекулы, ведет к образованию гидролизатов ' разнообразного пептидного спектра. На основе полученного жидкого панкреатического гвдролигата-казеина, очищенного активным углем4, разработаны два варианта питательной среды с уменьшенным до 1-2 7. (против 10 7. в контроле) со-, держанием сыворотки крови крупного рогатого скота. В состав сред введен поливинилпирролидон в количестве Q,2 X для повышений вйзксю- ' ти среды до необходимого урсЕНЯ, обычно обеспечиваемого сывороткой крови. Креме того, в средах, повышено содержаний холинхлорида, регу- \ лкрутацего липидный обмен клеток, до 50 мг/л.

В одной из опытных сред присутствуют все незаменимые для клеток млекопитающих аминокислоты по прописи контрольной среды ПС, во второй - юлько 4 аминокислоты: аргинин, глутамин, триптофан, цио-ткн. Содержание солей, глюкозы и семи витаминов в опытных. средах , соответствовало значениям контрольной среды. Параметры роста и метаболизма клеток ВНК-21 в лабораторном ферментаторе для' опытных

г.

сред и контрольной практически не отличались (табл. 7).

. - Таблица 7

Параметры, кинетики роста и метаболизма клеток ВНК-21 в ферментаторе

1............. ' -------- | Наименование 1 -——г— Единица ' изме- ............... ■ 1 1 Величина показателя в средах |

1 |

| . показателя рения о 1 % сыв-ки, о 17. сыв-ки, ПС |

1 1 4 аминокисл. 14 аминокисл. (контроль). |

1 |Выход клеток 109кл/л 42,^±0,3 2,810,2 2,4±0,1 " |

|Доля живых клет. . X. 99,0+0,7 98,3±0,9 98,0+0,6 |

|Равнйвесная кон- -

центрация клеток 109кл/л 2,8+0,4 3,3±0,Б 2,3±0,2 |

(Относительная

(логарифмическая ч"1 0,07±0,02 0,08+0,02 0,09±0,02 |

|скорость роста'

|Запас субстрата 109л"1 3,3±0,5 3,8±0,5 2,9±0,3 |

|в среде 1................ . „•... : ' ......... ., 1

Можно отметит^, некоторое повышение выхода клеток в гидролизных средах, особенно с добавлением всех незаменимых аминокислот. Однако ' вполне можно ориентироваться, на выход клеток в контрольной среде, достаточный с точки зрения дальнейшего использования клеточной

культуры. Следовательно, можно ограничиться добавлааем в опытную среду всего четырех аминокислот, так как введение всех четырнадцати . аминокислот не оправдывает дополнительных затрат. , . Метаболизм аминокислот в средах нз основе ферментативного гидролизата казеина обладает рядом особенностей по сравнению с контрольной средой ПС. В последней на протяжении каждого пассажа снижается до.минимума концентрация всех аминокислот. , В среде с гидроли-затом казеина и 10 % сыворотки крови в ходе культивирования снижается концентрация только четырех вводимых аминокислот (арЛадина, • глутамина, триптофана, цистина), а в среде о.1 X сыворотки крови и всеми аминокислотами уменьшается концентрация еще четырех аминокислот: лейцина, лиэина, серина и тирозина. Возможно, достаточно высокий уровень содержания других аминоглслот сохраняется за счет гидролиза пептидов гидролизата ферментными системами клеток.

О высокой питательной ценности ферментативного гидролизата казеина свидетельствует тот факт, что в среде на его основе можно осуществлять успешное культивирование клеток при сокращении по сравнению с полусинтетической средой количества индивидуальных аминокислот с 14-ти до 4-х и уменьшения количества сыворотки крови в • 10 раз.

Для определения в гидролизате казеина соединений, выполняющих функции заменителей сыворотки крови, проводили ультрафильтрационное фракционирование гидролизата и готовили опытные среды на основе отдельных фракций, Результаты культивирования клеток ВНК-21 в полученных малосывороточных средах в течение 30-40 пассажей в суспензий' (табл. 3) дают основание утверждать, что ростстимулирующая активность гидролизата обусловлена, в основном, пептидами с-молекулярной ■ массой свыше 1000 D. Эти соединения образуются,по-видимому, при оп-тжшьшк условиях гидролиза казеина панкреатином (гл. 3)..i .

Таблица 8

Показатели роста клеток ВНК-21 в суспензии в малосшюро'т очной среде на основе различных фракций панкреатического гидролизата казеина i-1-1-1-1

Наименование пока-теля

Единица измерения

т

Величина показателя для фракций с мол.

-1—г--1-г

До I

500 | 1000

кассой, D

до 5000

до | цельный 10000 |гидрол.

-Н-1--i--

1,5+0,4|2,1+0,2|2,4+0,2|2,6+0/3|2,5+0,3

I . I ■ Ч ' I

77+Í4 | 90+6 J 97+1 | 96±1 | 97+1

I I I I.

3,7±0,7|4,8±0,4|5,3±0,5|6,1±0,8|5,9±0,7

среда ПС

Выход клеток Доля живых клет. Индекс пролифер.

109кд/л

2,0+0,2

97+1

4,4±0,6

Для выращивания клеток ВНК-21, используемых для производства *

протиЕоящурной вакцины, на Покровском заводе биопрепаратов, как и . на других преприятиях, используют производственную питательную среду типа среды Игла о 10 7. сыворотки крови и 0,125 % ферментативного

гидролизата мышц. Для снижения содержания сыворотки в этой среде в

1

10 раз наш предложено вводить в нее Б X жидкого панкреатического гидролизата казенна"и 0,2 X поливинилпирролидона, а содержание хо-линхлорида увеличить до 60 иг/л. Гидролизат казеина получали по' разработанной технологии непосредственно в цехе приготовления питательных 'сред (гл. 3), где и добавляли в опытные среды в реакторах емкостью 260 л (поз. 1, 2)..После стерилизующей фильтрации опытные среды использовали для.культивирования клеток ВНК-21 на всех стадиях технологического процесса получения вакцины.

С

-из -

В предложенной маяосывороточией питагэльвсй сред г длительное время (в течение полутора лет) из заводе биопрепаратов осуществляли успепзое культивирование клеток ВНК-21 на всех стадиях сг получения посевного материала до прокгводственного культивирования в биореак-тсрах емкость» 030 л (тгЛл. 9). ёыход кается а пзооглг?. Спя не ню« заданной заводским регламентом величины 1,7-109кл/л при доле жизнеспособных клеток не """С 35

Таблица 9

Показатели роста клеток ВНК-21 в малосывороточной питательной среде с ферментативным гйдролизатом казеина в заводских условиях

I-1-1—;-1

| Наименование (Единица | Величина показателя для аппаратов . !

í 1 изме-| показателя | рения 20 л Г ' "- "■- --------- 1 50 л -т-- 1 630 л I 1 1

t ...................i ...... (Выход клеток |109кл/л 2,4i0,1 | 3,3±0,6 ' ! i I 2,2+0,3 i

(Доля живых клеток| % 38,*3±0,2 | 98,7+0,5 I 96,8+0,8 |

[Количество опытов! i i ... 61 I 26 i ...... 1 И i i , . . .', .. i

Полученные клетки использовали для приготовления протиаояшур-

ной вакцины, причем антигенность вируса при инфйцировании клеток ВНК-21, выращенных в малосьшороючной среде, соответствовала требуемым показателям. .

При использовании ферментативного гидролизата кэгкптэ получены питательные среды с малым содержанием сыворотки крови для культивирования к,деток млекопитающих и других видов, кроме ВНК-21, а именно: ЛЭЧ, МТ-4, Nanalva. Малосыесроточная среда с'IX сыворотки крови, 0,25 % ферментативного гидролизата казеина," 0,2 X поливинилпир-ролидсна 'л содерйакием лиликхлоридз 50 мг/л, -разработанная на осно—

ве полусинтетической среды ПС, обладает высокими ростовыми свойствами при культивировании клеток млекопитающих всех вышеназванных видов. Проверка питательных свойств среды проведена в НПО "Вектор" с положительными результатами,

. вывода

1. Разработана технология получения ферментативных гидролизатов казеина для клеточных • культур, пригодных в качестве аминокиолот-но-пептидной основы питательных сред для культивирования различных линий клеток млекопитающих; Гидролизаты содержат в достаточном количестве 10 иэ 14 необходимых для клеток животных аминокислот, а также пептиды, выполняющие роль•сывороточных факторов при десятин-• ратном снижении содержания сыворотки крови в среде. .' 2, Исходным сырьем для получения гидролизатов служит технический 'казеин, ^ а гидролизующими агентами - выпускаемые отечественной прр-мышленностью технические ферментные препараты протосубтилин ГЮх и панкреатин. Очистка гидролизата от цитотоксических примесей осу-щеотвляется промышленными активными углями марок ОУ-А, ОУ-Б, КАД-молотый при условии их предварительной химико-термической обработки (промывки.соляной кислотой и обессоленной водой, прокалива-i ■ 1 . . - - ■

ния). ■

3. Питательная среда на основе ферментативного гидролизата казеина, составленная из 2,6 г/л сухого гидролизата (или 40 мл/л жидкого), а также аргинина, глутамина, триптофана, цистина, солей, глюкозы, витаминов "в' количествах, соответствующих прописи сбалансированной полусинтетической среды, .при наличии 10 % сыворотки крови, крупного рогатого скота, обеспечивает рост ряда наиболее часто используемых в биотехнологии клеток (ВНК-21, ЛЭЧ, Vero и др.) в монослое и сус-

пензии, в том числе в ферментаторах, на уровне не ниже наиболее 'продуктивны); контрольных сред.

4. Питательная среда на основе ферментативного гидролизата казенна» содержащая дополнительно поливинилпирролидон (0,2 %) я увеличенную концентрацию холвклореда . (0,05 v/z)- при снижении количества'сыворотки до 1-2 t обеспечивает , выход клеток ВНК-21, ЛЕ14, iJamalva, МТ-4 не ниже контрольных сред о 10-1Б % сыворотки крови.

5. Показана _способность ферментативного гидролизата казеина заменять одновременно 10 аминокислот и 90 % сыворотки крови-в питательных средах для клеток млекопитающих. , . w

S. Выращенные в малосывороточной питательной среде в ферментаторах объемом до БЗО л клетки ВНК-21 пригодны для репродукция вируса ящура в технологии промышленного производства противоящурисй вакцины. 7, разработаны лабораторный опытно-промышленный регламенты производства питательный сред на основе ферментативных гидролизатов казеина для культур клеток млекопитающих и лабораторный регламент культивирования клеток ВНК-21 в ьйлосывороточной питательной среде на основе отечественных ингредиентов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ксренеза А.И., Амбросэва G.M.Фаустов-В. С.» Получение .питательной среды для клеток животных на основе: ферментативных гидролизатов кзэеина // Совершенствование технологии.микробиологических ■ производств.- М.: Главмикробиопром, 1S83.- С. .45-52.,

2. Пригода A.C., Коренева А.И., Коновалов^ Е.Ю., Андреева И.В. Конструирование бессывороточных .питательных сред для культивирования клеток млекопитающихIСообщение I. //Биотехнология,- 1990.-N 2.-. С. 35-39. V , '- ' : ' >■;> .

3. Пригода А;С., Коренева А.И. Реэульта-гы биологических;испы-

таний укьтрафитьтрационных фракций панкреатического гидролиэата казеина // Тезисы докл. конф. "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии".- Махачкала, 1990.- С. 15.

4. Пригода A.C., Коренева А.И., Эыбин Д.В. Разработка малосывороточной питательной среды для культивирования клеток млекопитающих /"/ Тезисы докл. конф. "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии".- Махачкала, 1990.- С. 102.

5. Верещагин В.В., Покровский А.Г., Коренева А.И., Пригода A.C. Результаты изучения ростовых свойств малосывороточной питательной среды Ьри культивировании клеток-продуцентов вируса иммунодефицита человека // Тезисы докл. ковф. "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии".- Махачкала, 1990.- С. 103.

6. Пригода A.C., Коренева А.И. Конструирование бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих. Сообщение II. // Биотехнология.- 1991.- N 4.-. С. 38-40.

7. Пригода A.C., Коренева А.И., Коновалова Е.Ю., Сафонов Г.А., i '

Калинина Т.А., Булгакова Е.И. Конструирование бессывороточных питательнЫх сред для культивирования клеток млекопитающих. Сообщение IV. // Биотехнология.- 1991.N 5.- С. 55-58.

8. Коренева А.И., Пригода A.C., Верещагин В.В., Покровский А.Г. Конструирование бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих. Сообщение V. // Биотехнология,- 1991.- '-т6. -С. 64-66. '

9. Коренева А.И., Пригода A.C. Малосывороточная питательная среда для клеток млекопитающих // Приоритетная справка 4775 229/13 от 22.11.89.