Технология изготовления и свойства питательной среды сухой стерильной на основе гидролизатов

Богрянцева, Марина Поликарповна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Технология изготовления и свойства питательной среды сухой стерильной на основе гидролизатов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Технология изготовления и свойства питательной среды сухой стерильной на основе гидролизатов"

РГ6 од

)

и I РУ} -На правах рукописи*

Богрянцева Марина Поликарповна

УДК: 577.21:576.34:578.088

ТЕХНОЛОГИЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ И СВОЙСТВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ СУХОЙ СТЕРИЛЬНОЙ НА ОСНОВЕ ГИДРОЛИЗАТОВ

03.00.23 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 1999

Работа выполнена в лаборатории питательных сред ГНЦ ВБ «Вектор» и в лаборатории культур тканей, питательных сред и растворов ВГНКИ ветеринарных препаратов в 1988-1999 гг.

Научные руководители:

Доктор биологических наук, профессор В.Т. Ночевный Кандидат химических наук, с.н.с. Г.П. Трошкова

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук,

профессор (ВНИТИБП) Э.Ф. Токарик Кандидат ветеринарных наук

(ВНИИЭВ им. Я.Р. Коваленко РАСХН) И.А. Яблонская

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии.

Защита диссертации состоится « » ¿¿лЛа^С-^ 1999 г. часов на заседании Диссертационного совета К 120.17.01 по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности по адресу:

141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, ВНИТИБП

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП.

Автореферат разослан « £ » фех^оЛ^ли 1999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Ю.Д. Фролов

В L(t не, ь

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы. Культуры клеток животных и человека получили широкое применение в вирусологической практике, а также в производстве диагностических, лечебных и профилактических препаратов. Для получения и поддержания клеточных культур необходимы различные виды питательных сред, солевые и диспергирующие растворы. В настоящее время ферментативные белковые гидролизаты, благодаря своим питательным свойствам, доступности, простоте изготовления, относительно невысокой стоимости и перспективности для получения разнообразных клеточных культур, находят все более широкое применение в качестве аминокислотно-пептидной основы вирусологических питательных сред. Применение ферментативных гидролизатов позволяет не только заменять дорогостоящие импортные аминокислоты, но и за счет низкомолекулярных пептидов интенсифицировать обменные процессы в клетках, а также использовать их для частичной или полной замены сыворотки крови животных в составе ростовых питательных сред.

Традиционно ВПС* для культур клеток в промышленных масштабах готовят в жидкой форме методом стерилизующей фильтрации. Существенными недостатками жидкой формы ВПС является нестабильность при длительном хранении, потребность в больших объемах посуды , холодильного оборудования, а также затрат, связанных с транспортировкой. В последние годы все большую популярность приобретают сухие формы ВПС и растворов для культур клеток. Они стабильны, сохраняют высокие ростстимулирующие свойства на протяжении всего срока хранения, не требуют существенных затрат на транспортировку и хранение. Следует также отметить, что сухие стерильные ВПС за рубежом не выпускают, а предлагают для использования лишь сухие коммерческие нестерильные композиции, предполагающие наличие у потребителя специального оборудования и материалов для стерилизующей фильтрации.

* Список сокращений приведен на с.28.

В России в сухой стерильной форме в промышленном масштабе выпускают следующие ВПС на основе индивидуальных компонентов: Игла, 199, RPMI-1640, 199 М, МЕМ-4, а также диспергент — трипсин. Аналогичная форма ВПС на основе гидролизатов в промышленных объемах не выпускается, а исследования по изготовлению сухих стандартных образцов — референс-препаратов гидролизатных ВПС не вышли за рамки лабораторных исследований. Поэтому задача разработки технологии изготовления сухой стерильной формы гидролизатных ВПС квалификации «для культур клеток» является актуальной и экономически обоснованной.

Крупный вклад в решение вышеуказанных проблем внесли отечественные (Е.Ф. Калинина, 1963; Д.Ф.Осидзе, 1974; В.А. Сергеев, 1976; И.Д. Сперанская, 1979; Л.П. Дьяконов,1984, 1994; Н.Д. Скичко, 1983; И.Г. Ермишина, 1989, 1996; А.И. Коренева, A.C. Пригода, 1991, 1996; H.A. Башашкина, 1994 и др.) и зарубежные исследователи (J. Morgan, 1950; I. Melnik, Riordan, 1952; A. Freeman, 1973; С. Waymouth, R. Ham, 1979; К. Lambert, J. Birch, 1989; R. Heidemann, 1999). Многие вопросы данного направления не решены и нуждаются в теоретическом обосновании, дальнейшей разработке и внедрении в практику.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью исследований была разработка технологии изготовления, методов оценки качества сухих стерильных питательных сред на основе гидролизатов и их апробация при получении широкого спектра культур клеток и вирусов.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

• определить общие требования к качеству исходных ингредиентов: ферментативных гидролизатов и неорганических солей, пригодных для изготовления сухой стерильной формы гидролизатных ПС;

• разработать технологию изготовления, подобрать оптимальные условия стерилизации сухих стерильных форм гидролизатных ПС;

• разработать экспресс метод оценки качества ПС;

• оценить пригодность сухих стерильных Г1С на основе ферментативных гидролизатов для производства ряда первичных и перевиваемых культур клеток;

• испытать сухие стерильные ПС на основе ферментативных гидролизатов в производстве противовирусных препаратов;

• определить условия и сроки хранения сухих стерильных ПС на основе ферментативных гидролизатов;

• разработать НТД на изготовление, контроль и применение сухих стерильных ПС на основе ферментативных гидролизатов.

1.3. Научная новизна. Впервые получены научно обоснованные данные, положенные в основу разработки опытно-промышленной технологии производства «Среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной», отвечающей требованиям квалификации «для культур клеток».

Впервые экспериментально обоснованы условия стерилизации многокомпонентного препарата «Среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной» ускоренными электронами и показана возможность оценки стандартности препарата спектрофотометрическим методом. Отработаны методы контроля и определены предельно допустимые показатели качества «Среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной».

Научно обоснована трехкомпонентная форма выпуска препарата. Показано, что при длительном хранении происходит снижение качества вирусологических питательных сред за счет химического взаимодействия реакционно-активных аминокислот и глюкозы с образованием токсических продуктов. Определены оптимальные условия и сроки хранения препарата. Показана возможность применения метода «ускоренного старения» для прогнозирования длительности хранения препарата.

Доказана пригодность и перспективность применения препарата для получения широкого спектра первичных, перевиваемых культур клеток и противовирусных препаратов.

Приоритет и новизна научных разработок диссертации защищены авторским свидетельством (а. с. № 1566723 от 22.01.1990 г.) и патентом РФ (приоритетная справка № 99105439 от 15.03.1999 г.).

1.4. Практическая значимость работы. В ГНЦ ВБ «Вектор» разработана и внедрена в производство технология изготовления «Среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной». Экономически и практически обосновано применение препарата в биотехнологии. По материалам диссертации разработана и утверждена нормативная документация на препарат. Для вирусологической практики предложены 4 новых коммерческих препарата:

• среда питательная на основе ферментативного гидролизата мышечных белков сухая стерильная;

• среда питательная на основе ферментативного гидролизата белков сыворотки молока сухая стерильная;

• среда питательная на основе ферментативного гидролизата белков крови сухая стерильная;

• среда питательная на основе ферментативного гидролизата лактальбумина сухая стерильная.

1.5. Апробация работы. Основные результаты доложены и получили положительную оценку на Всесоюзной конференции по актуальным вопросам разработки препаратов медицинской биотехнологии (Махачкала, 1989г.); Всесоюзной конференции по питательным средам и сывороткам для культивирования клеток (Новосибирск, 1991г.); симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 1995г.); конференции «Перспективы развития производства биопрепаратов для медицины и сельского хозяйства« (Степногорск, 1995г.); V симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 1998г.); 7 международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Гурзуф, 1999 г.).

1.6. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, получено а.с. № 1566723, подано заявление о выдаче патента РФ (приоритетная справка № 99105439 от 15.03.1999 г.).

1.7. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту.

По результатам выполненных исследований на защиту выносятся следующие положения:

• технология изготовления и контроль сухих стерильных форм ВПС на основе ферментативных гидролизатов;

• экспресс метод оценки стандартности состава ВПС;

• целесообразность и перспективность применения сухих стерильных ВПС на основе ферментативных гидролизатов для культивирования широкого спектра первичных и Перевиваемых культур клеток и получения противовирусных препаратов.

1.8. Обьем и структура диссертации. Диссертация изложена на 190 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, материалы и методы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы, включающий 185 источников, приложения. Работа иллюстрирована 25 таблицами,11 рисунками.

Основные разделы работы выполнены автором самостоятельно под руководством доктора биологических наук, профессора Ночевного В.Т. и кандидата химических наук,с.н.сТрошковой Г.П. При выполнении отдельных этапов работы принимали участие:

Децина А.Н., Камший Л.П., Мазуркова H.A., Кондрахин Ю.В.,

Мартынец Л.Д., Сорокина Е.А., Величко A.B.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

Работа выполнена в лаборатории питательных сред ГНЦ ВБ «Вектор» и в лаборатории культур тканей, питательных сред и растворов ВГНКИ ветпрепаратов в 1988-1999 гг.

В работе использовали следующие ферментативные гидролизаты: гидролизат белков сыворотки молока (ГСБМ) по ТУ 10.07.44-90, гидролизат мышечных белков ферментативный сухой (ФГМ-С) по ТУ 46 12 20 -80, гидролизат белков крови ферментативный сухой (ГБК-С) по ТУ 10.09-137-91 и гидролизат лактальбумина (ГЛА) фирмы «Дифко».

Изготовление сухих стерильных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов. Для приготовления смеси, содержащей неорганические соли, глюкозу, феноловый красный использовали реактивы квалификации «хч». Соли, содержащие кристаллизационную воду, высушивали по разработанной схеме с учетом данных термогравиметрических исследований. Из высушенных солей путем измельчения в шаровой мельнице барабанного типа готовили вышеуказанную смесь. Режим измельчения устанавливали экспериментально.

Стерилизацию сухих питательных сред на основе ферментативных гидролизатов проводили ускоренными электронами дозой 20-30 кГр на промышленном ускорителе электронов ИЛУ-6 в Институте ядерной физики СО РАН.

В качестве методов контроля использовали: спектрофотомет-рический экспресс метод оценки стандартности ВПС, метод ВЭЖХ для анализа содержания аминокислот в ВПС до и после облучения, метод ЭПР и традиционный метод биологического контроля.

Электронные спектры поглощения (ЭСП) питательных сред регистрировали на спектрофотометре «Спекорд М40» (фирмы «Карл Цейс», Германия). Использовали стеклянные УФ-микрокюветы: для синтетических питательных сред—типа ЕБ-Ю (с толщиной поглощающего света 10 мм); для гидролизатных сред—типа Е8-2 (с толщиной поглощающего света 2 мм). Статистическую обработку результатов измерения оптичес-

кой плотности поглощения (ОП) проводили в соответствии с требованиями ГОСТ 8.207-76 и СТ СЭВ 1190-78.

Спектры электронного парамагнитного резонанса ВПС записывали на ЭПР-спектрометре Е-109 относительно стандартного образца (дифенилпнкрилгидразила) при температуре 20'С на воздухе непосредственно после облучения сухих ВПС, а затем после растворения сухих облученных образцов ВПС в очищенной воде.

Аминокислотный состав исследуемых ВПС определяли на аминокислотном анализаторе LC 5001 фирмы «Biotronic». Пики аминокислот регистрировали в области 570 нм (для L-пролина в области 440 нм).

Для определения сроков годности сухих стерильных ВПС был применен метод ускоренного старения при повышенных температурах (инструкция И-42-2-82).

Контроль сухих питательных сред на основе ферментативных гид-ролизатов осуществляли в соответствии с требованиями «Методических рекомендаций по контролю качества вирусологических питательных сред» по следующим физико-химическим и биологическим показателям: внешний вид, цвет, запах, растворимость, концентрация ионов водорода, буферная емкость, прозрачность, массовая доля влаги, содержание хлоридов, содержание глюкозы, содержание аминного азота, ростстиму-лирующая активность, токсичность. Стерильность сухих питательных сред на основе ферментативных гидролизатов определяли в соответствии с ГФ XI изд. вып.2, с. 187 методом прямого посева на тиогликолевую среду. Контроль на отсутствие микоплазм осуществляли в соответствии с методическими указаниями МУК 4.1./4.2.588-96.

Оценку ростстимулирующей активности сухих стерильных питательных сред на основе гидролизатов проводили на первичных и перевиваемых культурах клеток. В работе использовали первичные культуры клеток ФЭК, ПЭК, ПЭС, ТБ и ПЩ, получаемые по общепринятым методикам, а также перевиваемые паспортизованные клеточные культуры, полученные из музея клеточных культур ГНЦ ВБ «Вектор»: культуры клеток карциномы гортани человека (Нер-2), почки зеленой мартышки (Vero), почки сирийского хомячка (ВНК-21) и клетки лим-фомы Беркитта (Namalva). Культивирование клеток проводили в те-

чение 5-ти последовательных пассажей с 3-4 дневным циклом при посевной дозе 100-200 тыс.кл./мл в каждом пассаже. После 5-го пассажа осуществляли подсчет среднего значения индекса пролиферации (ИП) и количество жизнеспособных клеток.

В работе использовали вирусы: болезни Ауески (штамм БУК-628), инфекционного ринотрахеита (штамм Оренбург), парагриппа — 3 (штамм МВА 1/77) и трансмиссивного гастроэнтерита свиней (штамм ВГНКИ). Штаммы выдерживали и титровали на наиболее чувствительных к вирусам культурах клеток. Доза и способ заражения, сроки культивирования были общепринятыми.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Разработка технологии изготовления сухой формы питательной среды на основе гидролизатов

Как известно, жидкие формы ПС имеют довольно ограниченные сроки хранения (6-12 месяцев при температуре 6-10°С).

Для предотвращения протекания в жидких ПС неблагоприятных химических процессов и увеличения срока их годности в состав ПС вводили стабилизирующие добавки: АО класса ПЗФ, успешно применяемые в пищевой, химической, медицинской, фармацевтической промышленности. Были получены данные о благоприятном воздействии на клеточную пролиферацию АО в концентрации 10'7-10" моль/л. Однако, данная концентрация АО, а также повышение концентрации до 1 О М О'7 моль/л не дало ожидаемого результата стабилизации свойств ВПС. Дальнейшее повышение концентрации АО до 104 моль/л оказывало уже токсическое действие на культуру клеток. Таким образом, наличие концентрационного барьера не позволило использовать АО для стабилизации качества жидких форм ВПС при хранении и для увеличения сроков их годности.

Другим направлением увеличения сроков годности термолабильных растворов является выпуск их в сухой форме. Проведенные рядом авторов исследования (И.Д. Сперанская, 1979; H.A. Башашкина, 1994), в том числе и наш опыт работы по выпуску сухих стерильных форм ВПС

на основе индивидуальных компонентов: среды Игла, 199 М, ИРМЫ640, а также трипсина, показали принципиальную возможность и перспективность разработки и выпуска сухих стерильных препаратов.

Технологическая схема изготовления экспериментальных серий ПССГ предусматривала входной контроль образцов гидролизатов и неорганических солей на соответствие требованиям квалификации «для культур клеток», высушивание, измельчение, смешивание солей, глюкозы и фенолового красного, фасовку, стерилизацию, этикетировку и контроль конечного продукта.

Для изготовления ПССГ были выбраны ферментативные гидро-лизаты, выпускаемые отечественной промышленностью в соответствии с требованиями ТУ: ФГМ-С, ГБК-С, ГСБМ, а также ГЛА — производства фирмы «Дифко», США. В сравнительном аспекте исследованы образцы 17 серий сухих ферментативных гидролизатов: ГСБМ — 3 серии (производство НПО «Молоко», г. Углич), ФГМ-С — 4 серии (производство Щелковского биокомбината), ГБК-С — 5 серий (производство ВНИИЗЖ, г. Владимир) и 5 контрольных серий ГЛА фирмы «Дифко».

Было выявлено, что из всех исследуемых серий гидролизатов по физико-химическим и ростстимулирующим свойствам требованиям ТУ соответствовали 2 серии ГСБМ, 2 серии ФГМ-С и 2 серии ГБК-С. При оценке аминокислотного состава ферментативных гидролизатов установлено, что они содержат в составе 18 аминокислот, в том числе все незаменимые, за исключением глутамина, который является дефицитным для всех видов гидролизатов. Суммарное содержание аминокислот, по данным аминокислотного анализа, составляло, соответственно, 322 и 320 мг на 1 г гидролизата ГЛА и ГСБМ, в гидролизатах ФГМ-С и ГБК-С — 568 и 513 мг, соответственно.

При отборе ферментативных гидролизатов для изготовления ПССГ особое внимание было уделено также таким показателям качества, как растворимость, массовая доля влаги, рН среды, прозрачность и цветность. Их важность обусловлена тем, что при изготовлении ПССГ отсутствует стадия стерилизующей фильтрации, которая позволяет получить не только стерильный, но и прозрачный раствор без помутнения и опалесценции. Нами экспериментально установлено, что массовая доля

влаги используемых гидролизатов не должна превышать 3 %; коэффициент яркости нефильтрованных, визуально прозрачных ПС на основе ферментативных гидролизатов не должен быть более 5,35x104 1/см; показатель концентрации ионов водорода (рН) при растворении образца гидролизата в растворе Хенкса должен быть не более 7,4 ед. рН.

Для приготовления ПССГ были использованы неорганические соли по прописи Хенкса или Эрла квалификации «хч» или «осч». Учитывая тот факт, что неорганические соли, такие как, ]^С12, СаС12, Ыа2НР04 гигроскопичны и содержат в своем составе кристаллизационную воду, дополнительно было проведено термогравиметрическое изучение процессов их дегидратации, которое позволило предложить оптимальные как по температуре, так и по продолжительности режимы высушивания солей. На основе высушенных солей путем измельчения-смешения в шаровой мельнице готовили солевую основу ПССГ, включающую в состав глюкозу и феноловый красный. Для предупреждения образования конгломератов оказалось более оптимальным измельчать ингредиенты в две стадии: вначале измельчать крупнокристаллические компоненты (неорганические соли) в течение 2 ч, а затем добавлять аморфные и мелкокристаллические (глюкозу, феноловый красный) и продолжать далее процесс измельчения-смешения еще в течение 1,5 ч. Таким образом, суммарное время измельчения составило (3,5±0,2) ч при частоте вращения барабана (85±0,2) об/мин. Разработанный режим позволил получить однородную смесь со стандартными физико-химическими показателями: массовая доля влаги составляла 1,5- 2 %, растворимость — не более 10 мин., рН — 7,2-7,4 ед.рН.

ПССГ комплектовали из трех флаконов: в одном флаконе—смесь специально подготовленных солей, глюкозы и фенолового красного — (3,92±0,12) г, в другом — ферментативный гидролизат (ГСБМ или ГЛА по (2,00±0,06) г; ГБК-С или ФГМ-С по (1,0010,03) г ), в третьем — бикарбонат натрия по (0,15±0,04) г. Комплект рассчитан на приготовление 400 мл жидкой ПС.

Стерилизацию ПССГ осуществляли ускоренными электронами в дозе 20-35 кГр. Для увеличения производительности процесса стерилизации было разработано оригинальное устройство, обеспечивающее за счет вращения флаконов более эффективную стерилизацию ВПС.

При отработке режимов стерилизации ускоренными электронами установлено, что доза 25 кГр была оптимальной и обеспечивала полную стерильность образцов, при этом их внешний вид, физико-химические свойства, в том числе и содержание аминокислот, а также ростовые свойства существенно не отличались от контрольных образцов ВПС. В то время доза облучения 20 кГр не обеспечивала надежной стерилизации питательных сред (один из 12 образцов ПССГ на основе ГБК-С оказался нестерильным, при микроскопировании было выявлено наличие споровых микроорганизмов). Доза 30 кГр приводила к снижению содержания аминокислот в ферментативных гидролизататах и ухудшению ростовых свойств сред.

Известно, что содержание массовой доли влаги в сухих препаратах влияет на их стабильность в процессе хранения и облучения. Было показано, что при стерилизации ускоренными электронами образцов с повышенной влажностью (9,9 %), имеет место радиолиз воды и наблюдается изменение цвета образца от светло-желтого до темно-коричневого. При этом в спектрах ЭПР было обнаружено усиление сигнала, вызванное увеличением концентрации свободных радикалов. Оценка ростовой активности этих образцов свидетельствовала о ее снижении с появлением уже на первых пассажах изменений в морфологии клеток. Таким образом, содержание массовой доли влаги в облучаемых образцах сухих питательных сред на основе ферментативных гидролизатов должно быть минимальным и составлять не более 3 %.

В состав питательных сред наряду с аминокислотами входит глюкоза. Результаты исследований показали, что совместное присутствие в ПС данных реакционно-способных компонентов при стерилизации ухудшало качество конечного продукта. В то же время разделение вышеуказанных компонентов по отдельным флаконам привело к сохранению исходных, высоких ростовых свойств питательных сред (рис. 1).

Рис. 1. Электронные спектры поглощения ПС на основе ГБК-С, приготовленных различными способами

1 - методом стерилизующей фильтрации;

2 - растворением комплекта ПССГ (вариант разделения фермента-

тивного гидролизата и глюкозы по отдельным флаконам);

3 - растворением комплекта ПССГ (вариант совместного присутст-

вия ферментативного гидролизата и глюкозы в одном флаконе).

Таким образом, нами была разработана технология изготовления ПССГ, которая включала в себя стадии входного контроля ферментативных гидролизатов на соответствие требованиям ТУ, сушки неорганических солей, приготовления сухой смеси высушенных неорганических солей, глюкозы и фенолового красного, раздельной фасовки, стерилизации ускоренными электронами и растворения стерильных компонентов непосредственно перед использованием в стерильной очищенной воде. На данный способ получения ПССГ подано заявление о выдаче патента и получена приоритетная справка № 99105439 от 15.03.1999 г.

2.2.2. Совершенствование методов контроля ПССГ

Для определения общих требований к качеству ПССГ и отработки методов контроля в ГНЦ ВБ «Вектор» были изготовлены 6 серий препарата на основе ФГМ-С, ГБК-С, ГСБМ, ГЛА. Для оценки качества вариантов ПССГ были рассмотрены различные физические, физико-химические, химические и биологические методы контроля.

2.2.2.1. Физические, физико-химические и химические методы

анализа

Установлено, что жидкие ПС, приготовленные на основе ПССГ, представляли собой прозрачные жидкости красно-оранжевого цвета, без запаха, опалесценции и осадка. Так как приготовленная таким способом ПС не подвергалась стерилизующей фильтрации, субъективность такой визуальной оценки не приемлема. В связи с этим, был предложен дополнительный показатель: коэффициент яркости (на нефелометре). Показано, что данный показатель визуально прозрачных растворов ПССГ составлял (3,59-5,35х10'4)1/см.

Значение рН составляло 7,0-7,4 ед. рН, буферная ёмкость — не ниже 1,25 мл.

По значению осмоляльности все исследуемые питательные среды имели незначительный разброс (290-300) мОсм/кг, что свидетельствовало о стандартности исследуемых ПС по данному показателю.

Массовая доля влаги содержимого комплекта ПССГ составляла не более 3 % (от 1,5 % для смеси солей, глюкозы и фенолового красного до 3 % для ферментативных гидролизатов).

Содержание хлор ионов в исследуемых питательных средах составляло от 0,59 до 0,61 мг%, что также свидетельствовало о стандартности данных ПС по этому показателю.

Содержание аминного азота в питательных средах варьировало от 19 мг% (ГБК-С) до 36 мг% (ГСБМ).

2.2.2.2. Биологические методы контроля

Контроль биологических свойств ВПС предусматривал определение их росстимулирующей активности и токсического действия на клетки. Для определения ростстимулирующей активности ПС, приготовленных на основе ферментативных гидролизатов, использовали первичную культуру клеток ФЭК, а также перевиваемую монослойную культуру клеток Нер-2. При проведении контроля в каждый флакон со средой добавляли 300 мг/л Ь-глутамина и 5 % сыворотки КРС. Условия получения первичной культуры клеток ФЭК были общепринятыми.

Клетки ФЭК, выращенные на исследуемых ПС, образовывали сплошной монослой без признаков дегенерации в аналогичные с контролем сроки (на 3-4 сут культивирования). Культуры клеток ФЭК, выращенные на опытных и контрольной средах, имели сопоставимые индексы пролиферации (ИП составил для ПС на основе ГСБМ — 1,5; на основе ФГМ-С — 1,4; на основе ГБК-С — 1,2; на основе ГЛА — 1,1). В качестве контроля была использована жидкая питательная среда 199М (ИП . = 1,8).

4 после 5 пассажа '

Культивирование перевиваемых клеток Нер-2 проводили в течение 5-ти последовательных пассажей с 3-4 суточным циклом культивирования при посевной дозе 0,1 млн./мл среды. Температура культивирования (37,0±0,5) °С. Анализ полученных данных свидетельствовал о том, что ПС на основе ферментативных гидролизатов пригодны для культивирования клеток Нер-2. Клетки прикреплялись к стеклу и образовывали островки размножившихся клеток на первые сутки после засева и на 3-4 сут культивирования формировали сплошной монослой

без признаков дегенерации. ИП после 5 пассажа составил: для ПС на основе ГСБМ — 5,8-6,2; на основе ФГМ-С — 6,8-7,2; на основе ГБК-С — 4,6-5,3; на основе ГЛА — 4,0. В качестве контроля была использована жидкая питательная среда 199М (ИП , = 5,8).

1 4 после 5 пассата ' '

Следует отметить, что данный метод позволяет оценить пригодность ПС для культивирования клеток, но при этом не способствует выявлению причин, приводящих к ухудшению их качества.

В состав вирусологических питательных сред входит до 40-50 различных компонентов, поэтому актуальным становится разработка методов оценки стандартности ПС. Все вышеперечисленные физические, физико-химические, химические и биологические методы анализа не в состоянии оценить в полной мере стандартность состава ВПС. Наиболее лучшим в этом отношении критерием является осмоляльность, однако, она характеризует, в основном, стандартность суммарного ионного состава ПС. Таким образом, разработка новых, более эффективных физико-химических методов анализа, способных предварительно оценивать стандартность состава приготовленных ПС, весьма актуальна.

2.2.2.3. Разработка спектрофотометрического экспресс метода анализа питательных сред

Ранее было установлено, что некоторые компоненты ВПС имеют характерные спектры поглощения в видимой и ультрафиолетовой области (например, цистин, рибофлавин, пиридоксаль, пиридоксин, фени-лаланин, триптофан, феноловый красный и др.).

Была проведена запись ЭСП различных ВПС, приготовленных как на основе индивидуальных аминокислот, так и на основе ферментативных гидролизатов, в ультрафиолетовой и видимой областях (диапазон волн 200-600 нм). Было установлено, что каждая из вышеперечисленных ВПС имеет свой, отличный от других, спектр поглощения, обусловленный индивидуальными особенностями состава (рис.2, 3).

Учитывая наличие в спектрах поглощения характерных полос, а также изобестических точек, независящих от значения рН, нами были выбраны следующие аналитические длины волн для синтетических питательных сред: X =245 нм, А, =275 нм, Я =311 нм и для ПС на

г 1Л111 ' щах ' нзоб

ОП, ел ОП

Рис. 2. Электронные спектры поглощения жидких питательных сред

1 - ПС для культивирования клеток ВНК-21; 2-ПС RPMI-1640; 3 - ПС Игла MEM.

основе ферментативных гидролизатов: Ят.п=245 нм, ^т>х=265 нм, Я,„о6=311 нм. Проведенная статистическая обработка спектральных характеристик коммерческих серий ВПС позволила с вероятностью 99 % определить величины доверительных интервалов изменений оптических плотностей поглощения (ОП) при выбранных аналитических длинах волн.

Фактически величины этих интервалов определяются вариабельностью составов ПС и зависят от стандартности проведения таких операций, как взвешивание компонентов и их растворение. Полученные результаты позволили рекомендовать величины доверительных интервалов изменений ОП при указанных длинах волн в качестве дополнитель-

ОП.едОП

Рис. 3. Электронные спектры поглощения ПС на основе ферментативных гидролизатов

1 - ПС на основе ГКБ-С;

2 - ПС на основе ГЛА;

3 - ПС на основе ФГМ-С;

4 - ПС на основе ГСБМ.

ного критерия оценки стандартности состава и метода приготовления

впс.

Сравнивая значение ОП приготовленной среды со значениями доверительных интервалов, можно судить о стандартности приготовленной среды. Кроме этого, с помощью данного метода можно выявить нарушения, допущенные при хранении или транспортировке питательных сред, сравнивая величины оптической плотности поглощения контрольной, хранящейся в стандартных условиях, и опытной питательной среды со значениями доверительных интервалов, установленных для данного вида среды при аналитических длинах волн.

Данный способ оценки качества синтетической питательной среды, используемой для культивирования клеток млекопитающих, защи-щенен авторским свидетельством №1566723 от 22.01.1990 г.

Таким образом, в результате исследований предложен перечень методов физико-химического и биологического контроля, определены предельно допустимые значения показателей качества ПССГ. Разработан способ оценки стандартности питательных сред методом спектрофо-тометрии.

2.2.3. Эффективность применения сухих стерильных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов в вирусологической

практике

Была проведена оценка ростовых свойств и перспективность использования коммерческих серий ПССГ на основе различных видов гидролизатов с 5 % сыворотки крови КРС для культивирования первичных культур клеток ФЭК, ПЭК, ПЭС, ТБ, и ПЩ и перевиваемых линий СПЭВ, Vero, Namalva, Нер-2. Проведенные исследования показали пригодность и перспективность применения сухих стерильных питательных сред на основе отечественных гидролизатов как для получения первичных культур клеток, так и серийного пассирования перевиваемых линий без изменения их исходных биологических свойств. Следует отметить, что клеточные культуры, выращенные на опытных (ПССГ) и контрольных жидких ВПС, обладали равноценной чувствительностью к эталонным и производственным штаммам вирусов болезни

Ауески, трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГЭ), инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и парагриппа-3 (ПГ-3) КРС. Сроки накопления и интенсивность проявления ЦПД вирусов в опытных и контрольных культурах были сходными. Результаты производственных испытаний на Омском биокомбинате и в СКЗНИВИ показали целесообразность и экономичность применения ПССГ на основе ГБК-С и ГЛА для изготовления промышленных серий вакцин против болезни Марека, чумы плотоядных и трансмиссивного гастроэнтерита свиней.

В настоящее время существенное значение придается разработке бессывороточных и малосывороточных питательных сред. Учитывая тот факт, что в состав ферментативных гидролизатов входят низкомолекулярные пептиды (1200-2000 Д), усиливающие обменные процессы в клетках, были проведены эксперименты по выявлению возможности использования ПССГ для конструирования малосывороточных и бессывороточных питательных сред. Были получены данные, на основании которых можно сделать вывод о том, что из всех 4-х испытанных ПССГ в бессывороточном и малосывороточном варианте (2 % сыворотки КРС) наиболее выраженными ростовыми свойствами в отношении культуры клеток Нер-2 и Namalva обладали только ПССГ на основе ФГМ-С и ГСБМ. ПССГ на основе ГБК-С и ГЛА могут быть рекомендованы для получения культур клеток млекопитающих только в малосывороточном варианте в комплекте с РБ, полученными из сыворотки крови.

2.2.4. Опытно-промышленное производство ПССГ

С учетом полученных данных в ГНЦ ВБ «Вектор» была разработана и апробирована опытно-промышленная технология по производству ПССГ. По разработанной технологии было изготовлено по 4 опытно- промышленных серий ПССГ, в количестве 1600 комплектов. Результаты контроля показали, что серии ПССГ по физико-химическим и ростовым свойствам соответствуют установленным требованиям (таблица 1).

Таблица I

Характеристика опытно-промышлеиных серий ПССГ

Наименование показа тело) Требования ТУ 9384-073-0000806 4-58 ПССГ ФГМ-С ПССГ ГСЕМ ПССГ ГЕК-С ПССГ ГЛА

Массовая доля влаги,% не более 3 3 3 3 3

Раствори ьюсть, мин не более 20 12 10 14 10

рН, ед.рН 7,0-7,4 7,1 7,2 7,05 7,0

Буферная емкость мине менее 1,2 1,6 1,55 1.6 1,65

Осмлляльность, мОсм/кг 294+6 298 299 299 300

Содержание глюкозы, мг% 10 0±2 98 98 100 100

Содержание хлорида натрия, кг% 0,85±0,05 0,85 0,82 0,84 0,82

Содержание амин-ного азота, мг% не менее 6,0 23,7 35.5 18,75 39,5

ип культуры клеток Нер-2 должна быть не токсичной и обеспечивать ростклеток сИПне менее 4 7,2+0,2 6,2±0,3 4,6+0,2 4,0+0,2

Стерильность должна быть стерильна стерильна стерильна стерильна стерильна

ОПпри Х-245 нм Я^265 нм 11 нм 0,80 (0,76-0,84 )* 0,90 (0,86-0,94 ) 0,16 (0,10-0,16) 0,72 (0,70-0,80) 0,98 (0,94- 1,02 ) 0,20 (0,15- 0,23 ) 0,34 (0,31-0,41) 0,55 (0,45-0,55 ) 0,10 (0,06-0,14) 0,61 (0,55-0,65 ) 0,83 (0,80-0,88 ) 0,16 (0,10-0,18)

* Рассчитанные значения доверительных интервалов изменений ОП при аналитических длинах волн

Установлено, что себестоимость изготовления 1 комплекта ПССГ значительно ниже, чем 1 флакона жидкой питательной среды. Это связано в первую очередь со снижением затрат на приобретение дорогостоящих материалов и оборудования для стерилизующей фильтрации и системы очистки воды. Существенно снижаются затраты на хранение и транспортировку. Снижение затрат на транспортировку обусловлено в 6 раз меньшим объемом, и в 30 раз меньшим весом но сравнению с эквивалентным ему количеством жидкой ПС. Кроме этого, увеличивается срок годности питательных сред с 6 месяцев до 2 лет.

Обобщая результаты исследований, представляется возможным заключить, что выполненная работа позволила:

• определить общие требования к исходным компонентам для приготовления ПССГ;

• разработать технологию изготовления ПССГ;

• предложить методы контроля качества ПССГ, в том числе эффективный спектрофотометрический экспресс метод оценки стандартности среды;

• показать пригодность и эффективность применения ПССГ для выращивания ряда первичных и перевиваемых клеточных культур;

• предложить коммерческий препарат «Среду питательную на основе ферментативных гидролизатов сухую стерильную» для проведения научных исследований, а также производства профилактических и диагностических препаратов.

3. выводы

1. Разработана технология изготовления «Среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной (ПССГ)», включающая:

• отбор и входной контроль компонентов питательной среды на соответствие требованиям нормативной документации;

• высушивание и изготовление смеси солей, глюкозы и фенолового красного;

• раздельную фасовку, укупорку и этикетировку ферментативного гидролизата; смеси солей, глюкозы и фенолового красного; бикарбоната натрия;

• стерилизацию ускоренными электронами.

2. Определены условия стерилизации ПССГ ускоренными электронами. Доза облучения 25 кГр не оказывает существенного влияния на физико-химические и ростовые свойства питательных сред и гарантирует стерильность.

3. Показано, что существенный вклад в снижение качества ВПС при хранении вносят реакции, протекающие между аминокислотами и глюкозой. Достигнуто увеличение срока годности препарата с 0,5 до 2 лет хранения при температуре 6-10 °С за счет разделения реакционно-активных компонентов.

4. Научно обоснована форма выпуска препарата в виде комплекта из трех флаконов, содержащих ферментативный гидролизат; смесь солей, глюкозу и феноловый красный; бикарбонат натрия. Комплект рассчитан на приготовление 400 мл питательной среды. Препарат полностью растворим в стерильной очищенной (деминерализованной) воде без признаков опалесценции в проходящем свете.

5. Определены предельно допустимые значения показателей качества ПССГ, включающие определение: внешнего вида, массовой доли влаги, растворимости, прозрачности нефильтрованных растворов, рН, буферной емкости, осмоляльности, содержания глюкозы, хлор иона, аминного азота, стерильности, токсичности и ростстимулирующей активности.

6. Разработан способ оценки стандартности вирусологических питательных сред методом спектрофотометрии. Для различных видов питательных сред квалификации «для культур клеток» определены доверительные интервалы изменений оптической плотности поглощения при аналитических длинах волн.

7. Показана пригодность ПССГ для получения широкого спектра первичных (ФЭК, ПЭК, ПЭС, ТБ, ПЩ) и перевиваемых (СПЭВ, Vero, Нер-2, Namalva) культур клеток. ПССГ не оказывали токсического влияния на ростовые свойства клеток, сроки образования монослоя и морфологию клеток в культуре.

8. Первичные и перевиваемые культуры клеток, полученные с использованием ПССГ и традиционным способом, характеризовались равноценной чувствительностью и обеспечивали накопление вирусов болезни Ауески, трансмиссивного гастроэнтерита свиней, инфекционного ринотрахеита и парагриппа-3 крупного рогатого скота в высоких титрах.

9. Показана принципиальная возможность использования ростовых питательных сред на основе ФГМ-С и ГСБМ в бессывороточном и малосывороточном (2% сыворотки крови КРС) вариантах, а на основе ГБК-С и ГЛА только в малосывороточном варианте в присутствии сывороточных ростовых факторов.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На примере ферментативных гидролизатов ФГМ-С, ГСБМ, ГБК-С и ГЛА предложена технология изготовления ПССГ. Данная технология является универсальной и может быть использована для получения в сухой стерильной форме различных гидролизатных питательных сред.

Для оценки стандартности как синтетических, так и гидролизатных питательных сред разработан спектрофотометрический экспресс метод (а. с. № 1566723). Рассчитаны доверительные интервалы изменения оптической плотности питательных сред.

Показана перспективность применения ПССГ для выращивания различных клеточных культур и вирусов.

По результатам экспериментальных исследований разработана и утверждена следующая НТД:

• Технические условия. ТУ 9384-073-0000806 4-98 «Среда питательная на основе гидролизатов сухая стерильная».

• Инструкция по изготовлению и контролю среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной.

• Временное наставление по применению среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной.

Предложено 4 новых коммерческих препарата для культур клеток:

• ПССГ ФГМ-С — питательная среда на основе ферментативного гидролизата мышечных белков сухая стерильная;

• ПССГ ГСБМ — питательная среда на основе ферментативного гидролизата белков сыворотки молока сухая стерильная;

• ПССГ ГБК-С — питательная среда на основе ферментативного гидролизата белков крови сухая стерильная;

• ПССГ ГЛА — питательная среда на основе ферментативного гидролизата лактальбумина сухая стерильная.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Богрянцева М.П., Мартынец Л.Д., Пахольчук Т.И., Полехина О.В. Изучение процессов «старения» питательных сред. Поиск модельных реакций для подбора антиоксидантов, предотвращающих снижение ростовых свойств питательных сред. //Тезисы докл. X конф. молодых ученых ВНИИ МБ, 1986. — с.47-49.

2. Децина А.Н., Богрянцева М.П. Перспективы применения антиоксидантов в биотехнологии тканевых культур: Обзорн. информ. ВНИИСЭНТИ Минмедбиопрома СССР,1988. — вып.7. — с.1-28.

3. Богрянцева М.П., Мартынец Л.Д., Бураев В.И., Кондрахин Ю.В., Децина А.Н. Исследование электронных спектров поглощения для оценки стандартности и качества хранения питательных сред. // Тезисы. Всесоюз. конф. по актуальным вопросам разработки препаратов медицинской биотехнологии. Махачкала.-1989.-с.35.

4. Богрянцева М.П., Кондрахин Ю.В. Использование спектров поглощения для оценки стандартности и качества хранения питательных сред. // В сб.: Материалы I отраслевой конференции-конкурса молодых ученых 19-21 апреля 1988 г, Новосибирск. - М.: 1989.-с.36.

5. А. с №1566723 СССР, МКИ5С 12 N 5/00. Способ оценки качества питательной среды, используемой для культивирования клеток млекопитающих. — Богрянцева М.П., Бураев В.И., Мартынец Л.Д., Кондрахин Ю.В., Децина А.Н. - 1990.

6. Богрянцева М.П., Децина А.Н. Использование спектрофотометри-ческого метода для оценки качества питательных сред при их стерилизации и хранении. //Тезисы. Всесоюз. конф. по питательным средам и сывороткам для культивирования клеток. Новосибирск.-1991.-c.42.

7. Трошкова Т.П., Фролова И.В., Распопина Г.И., Сорокина Е.В., Богрянцева М.П., Камший Л.П. Сухие стерильные питательные среды для культивирования клеток. //Тез. Всесоюз.конф. по питатательным

средам и сывороткам для культивирования клеток. Новосибирск,-1991.-с. 10.

8. ТрошковаГ.П., Бакиров Т.С., Фролова И.В., БогрянцеваМ.П., Конд-рушин Е.В., Шапров В.В., Камший JI.П. Использование ускорителей электронов ИЛУ-6 для стерилизации сухих питательных сред. //Тез. Всесоюз.конф. по питатательным средам и сывороткам для культивирования клеток. Новосибирск,-1991.-С.41.

9. Трошкова Г.П., Фролова И.В., Богрянцева М.П., Сорокина Е.В., Камший Л.П. Сухие стерильные препараты для культур клеток. // Тез. конф. Перспективы развития производства биопрепаратов для медицины и сельского хозяйства. Степногорск.-1995.-ч.1.-с.59.

10. Богрянцева М.П., Фролова И.В., Трошкова Г.П., Мазуркова H.A., Камший Л.П. Питательные среды и другие препараты для культур клеток млекопитающих. Цитология.-1996. — т.38, №2. — с.182-183.

11. Мазуркова Н.А, Богрянцева М.П., Трошкова Т.П. Сухие стерильные малосывороточные питательные среды на основе гидролизатов для культивирования клеток млекопитающих. //Тезисыконф. «Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микро-тестсистем». — Махачкала.-1998.-е. 16.

12. БогрянцеваМ.П., Мазуркова Н.А, Трошкова Г.П. Увеличение сроков хранения сухих стерильных питательных сред на основе белковых гидролизатов с использованием антиоксидантов // Тезисы конф. «Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротестсистем». -— Махачкала. — 1998. — с.69.

13. Мазуркова Н.А, Трошкова Т.П., Мартынец Л.Д, Богрянцева М.П. Бессывороточные и малосывороточные сухие стерильные питательные среды на основе ферментативных гидролизатов для культивирования клеток - продуцентов вирусных антигенов. // Труды 7 международной конф. «Новые информационные технологии в медицине и экологии». — Гурзуф,-1999.-С.220-221.

14. Мазуркова Н.А, Богрянцева М.П., Мартынец Л.Д, Сироткина Т.Б., Трошкова Г.П. Разработка сухих стерильных препаратов для клеточной биотехнологии. // Цитология.-1999. — т.41, №3/4. — с.289.

15. Мартынец Л.Д., Сорокина Е.В., Сироткина Т.Б., Мазуркова Н.А, Богрянцева М.П., Трошкова Г.П.. Культивирование клеток млекопитающих с применением сухих стерильных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов. // Цитология,-1999. — т.41, №3/4. — с.290.

16. Богрянцева М.П., Трошкова Г.П., Мазуркова H.A., Ночевный В.Т. Изучение сроков годности и причин снижения качества сухих стерильных питательных сред. // Биотехнология. - 1999. - №4. - с.49-54.

17. Богрянцева М.П., Трошкова Г.П., Мазуркова H.A., Децина А.Н., Ночевный В.Т. Экспресс метод контроля качества питательных сред для культур клеток млекопитающих. // Биотехнология. - 1999.—№5. - с.87-95.

18. Заявление о выдаче патента РФ на изобретение. Приоритетная справка № 991-54439 от 15.03.1999. Способ получения жидких стерильных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов. — Богрянцева М.П., Трошкова Г.П., Мазуркова H.A., Ночевный В.Т, Мартынец Л.Д., Сироткина Т.Б.

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

АО ПЗФ -

ПС ВПС

оп

вэжх -

ПССГ -

пэс

ПЩ РБ

СПЭВ -

ТБ

ФЭК

ЦПД

ЭПР

антиоксиданты класса пространственно-затрудненных фенолов

питательная среда

вирусологические питательные среды оптическая плотность поглощения питательных сред высокоэффективная жидкостная хроматография питательные среды сухие стерильные на основе ферментативных гидролизатов почка эмбриона свиньи почка щенка

росгстимулирующие белки перевиваемая линия клеток почки свиньи тестикулы быка фибробласты эмбрионов кур цигопатогенное действие вируса электронный парамагнитный резонанс

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Богрянцева, Марина Поликарповна

Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Питательные среды в клеточной биотехнологии.

2.1.1. Назначение, классификация и общие требования к вирусологическим питательным средам

2.1.2. Применение гидролизатных питательных сред в вирусологической практике.

2.2. Особенности технологии изготовления и стерилизации сухих форм вирусологических питательных сред.

2.3. Методы контроля качеству вирусологических питательных » . • сред.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Технология изготовления и свойства питательной среды сухой стерильной на основе гидролизатов"

Культуры клеток животных и человека получили широкое применение в вирусологической практике, а также в производстве диагностических, лечебных и профилактических препаратов. Для получения и поддержания клеточных культур необходимы различные виды питательных сред, солевые и диспергирующие растворы. В настоящее время ферментативные белковые гидролизаты, благодаря своим питательным свойствам, доступности, простоте изготовления, относительно невысокой стоимости и перспективности для получения разнообразных клеточных культур, находят все более широкое применение в качестве аминокислотно-пептидной основы вирусологических питательных сред [2, 29, 38,46]. По мнению ряда авторов, применение ферментативных гидролизатов позволит не только заменить дорогостоящие импортные аминокислоты, но и за счет низкомолекулярных пептидов, интенсифицировать обменные процессы в клетках, а также использовать их для частичной или полной замены сыворотки крови животных в ростовых питательных средах [99-103, 122].

Традиционно ВПС для культур клеток в промышленных масштабах готовят в жидкой форме методом стерилизующей фильтрации. Существенным недостатком жидкой формы ВПС является нестабильность при длительном хранении, потребность в холодильном оборудовании, а также большие затраты, связанные с транспортировкой. В последние годы все большую популярность приобретают сухие формы ВПС и растворов для культур клеток. Они стабильны, сохраняют высокие ростстимулирующие свойства на протяжении всего срока хранения, не требуют значительных затрат на транспортировку и хранение.

Кроме этого следует отметить, что сухие стерильные ВПС за рубежом не 7 выпускают, а предлагают для использования лишь сухие коммерческие нестерильные композиции, требующие наличие у потребителя специфического оборудования и материалов для стерилизующей фильтрации.

В России в сухой стерильной форме в промышленном масштабе выпускают следующие ВПС на основе индивидуальных компонентов: Игла, 199 [113], КРМ1 - 1640, 199 М, МЕМ-4 [93, 121], а также дезагрегирующий агент - трипсин [14, 21]. Аналогичная форма ВПС на основе гидролизатов не выпускается, а исследования по изготовлению сухих стандартных образцов - референс-препаратов гидролизатных ВПС не вышли за рамки лабораторных исследований [12]. Поэтому задача разработки технологии изготовления сухой стерильной формы гидролизатных ВПС квалификации "для культур клеток" является актуальной и экономически обоснованной.

Цель и задачи исследований. Целью исследований была разработка технологии изготовления, методов оценки качества сухих стерильных питательных сред на основе гидролизатов и их апробация при получении широкого спектра культур клеток и вирусов.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

• разработать экспресс метод оценки качества ПС;

• оценить пригодность сухих стерильных ПС на основе ферментативных гидролизатов для производства первичных и перевиваемых культур клеток; 8

• определить условия и сроки хранения сухих стерильных ПС на основе ферментативных гидролизатов;

Научная новизна. Впервые получены научно обоснованные данные, положенные в основу разработки опытно-промышленной технологии производства «Среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной», отвечающей требованиям квалификации «для культур клеток».

Впервые экспериментально обоснованы условия стерилизации многокомпонентного препарата, «Среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной», ускоренными электронами и показана возможность оценки стандартности препарата спектрофотометрическим методом. Отработаны методы контроля и определены предельно допустимые показатели качества «Среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной».

Доказана пригодность и перспективность применения препарата для получения широкого спектра первичных, перевиваемых культур клеток и противовирусных препаратов. 9

Практическая значимость работы. В ГНЦ ВБ «Вектор» разработана и внедрена в производство технология изготовления «Среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной». Экономически и практически обосновано применение препарата в биотехнологии. По материалам диссертации разработана и утверждена нормативная документация (НД) на препарат. Для вирусологической практики предложены 4 новых коммерческих препарата: среда питательная на основе ферментативного гидролизата мышечных белков сухая стерильная; среда питательная на основе ферментативного гидролизата белков сыворотки молока сухая стерильная; среда питательная на основе ферментативного гидролизата белков крови сухая стерильная; среда питательная на основе ферментативного гидролизата лактальбумина сухая стерильная.

Апробация работы. Основные результаты доложены и получили положительную оценку на I отраслевой конференции - конкурсе молодых ученых ГУ «Биопрепарат» (Новосибирск, 1988г.); Всесоюзной конференции по актуальным вопросам разработки препаратов медицинской биотехнологии (Махачкала, 1989г.); Всесоюзной конференции по питательным средам и сывороткам для культивирования клеток (Новосибирск, 1991г.); симпозиуме "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 1995г.); конференции "Перспективы развития производства биопрепаратов для медицины и сельского хозяйства" (Степногорск, 1995г.); V симпозиуме "Биология клетки в культуре" (Санкт

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Богрянцева, Марина Поликарповна

6. Выводы

1. Разработана технология изготовления «среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной (ПССГ)», включающая:

• высушивание и изготовление смеси солей, глюкозы и фенолового красного;

• стерилизацию ускоренными электронами.

3. Показано, что существенный вклад в снижение качества ВПС при хранении вносят реакции, протекающие между аминокислотами и глюкозой. Достигнуто увеличение срока годности препарата с 0,5 до 2 лет хранения при температуре 6-10°С за счет разделения реакционно-активных компонентов.

4. -Научно обоснована форма выпуска препарата в виде комплекта из трех флаконов, содержащих ферментативный гидролизат; смесь солей, глюкозу и феноловый красный; бикарбонат натрия. Комплект рассчитан на приготовление 400 мл питательной

149 среды. Препарат полностью растворим в стерильной очищенной (деминерализованной) воде без признаков опалесценции в проходящем свете.

5. Определены предельно допустимые значения показателей качества ПССГ, включающие определение: внешнего вида, массовой доли влаги, растворимости, прозрачности нефильтрованных растворов, рН среды, буферной емкости, осмоляльности, содержания глюкозы, хлор иона, аминного азота, стерильности, токсичности и ростстимулирующей активности.

7. Показана пригодность ПССГ для получения широкого спектра первичных (ФЭК, ПЭК, ПЭС, ТБ, ПЩ) и перевиваемых линий (СПЭВ, Vero, Нер-2, Namalva) культур клеток. ПССГ не оказывали токсического влияния на ростовые свойства клеток, сроки образования монослоя и морфологию клеток в культуре.

150

7. Практические предложения

Для оценки стандартности как синтетических, так и гидролизатных питательных сред разработан спектрофотометрический экспресс-метод (а. с. № №1566723). Рассчитаны доверительные интервалы изменения оптической плотности питательных сред, позволяющие с вероятностью 99% судить не только о стандартности приготовленных питательных сред, но выявлять изменения, связанные с нарушением технологии приготовления, условий хранения и транспортировки.

Показана перспективность применения ПССГ для выращивания различных клеточных культур и вирусов.

По результатам экспериментальных исследований разработана и утверждена следующая НТД:

• Технические условия. ТУ 9384-073-0000806 4-98 "Среда питательная на основе гидролизатов сухая стерильная".

• Инструкция по изготовлению и контролю среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной.

• Временное наставление по применению среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной.

Предложено 4 новых коммерческих препарата для культур клеток:

• ПССГ ФГМ-С - питательная среда на основе ферментативного гидролизата мышечных белков сухая стерильная;

152

2.4. Заключение

Обзор литературы не оставляет сомнений в том, что для увеличения сроков годности жидких питательных сред, а также для предупреждения протекания в жидких питательных средах различных термо - и фотоокислительных процессов, имеющих место при тепловой стерилизации, хранении и в результате снижающих качество питательных сред, необходимо найти рациональное решение с целью предотвратить протекание выше указанных процессов путем введения стабилизирующих добавок. Другим направлением увеличения сроков годности питательных сред может явиться разработка технологии изготовления ВПС в сухой стерильной форме. При этом наиболее перспективно создание относительно недорогих ПС на основе ферментативных гидролизатов. Приведенные данные свидетельствуют о том, что использование белковых гидролизатов возможно не

38 только для замены аминокислот, как компонентов ПС, но и при конструировании бессывороточных и малосывороточных ПС. Многокомпонентность состава, сложность технологии изготовления ПС требует комплексного подхода к оценке качества ПС. Основным показателем качества в настоящий момент является ростстимулирующая активность и токсичность. Усилия многих авторов направлены на поиск более эффективных экспресс-методов оценки качества ПС. Однако стоит отметить, что большинство предложенных эффективных экспрессных биологических методов оценки качества ПС трудоемки, требуют специального оборудования, наличия асептических условий труда и биологического материала. Поэтому поиск физико-химических экспрессных методов оценки качества ПС приобретает особое значение.

Таким образом, анализ литературных данных позволил сформулировать следующие основные направления исследований: оценить возможность использования антиоксидантов для стабилизации жидких форм питательных сред; определить общие требования к качеству и подготовке исходных компонентов для изготовления сухой стерильной формы гидролизатных ВПС; разработать технологию изготовления, подобрать оптимальные условия стерилизации сухих стерильных форм гидролизатных ВПС; разработать экспресс метод физико-химической оценки стандартности

ВПС; оценить пригодность сухих стерильных ВПС на основе ферментативных гидролизатов квалификации "для культур клеток" для производства первичных и перевиваемых культур клеток и вирусов.

3. Материалы и методы В исследованиях были использованы следующие питательные среды производства ГНЦ ВБ "Вектор":

Питательные среды жидкие стерильные: RPMI-1640 по ФС 42-3628-98, Игла MEM по ФС 42-3540-98, 199М по ФС 42-3500-98, питательная среда для культивирования клеток ВНК-21, ЛЭЧ [29].

Питательные среды сухие стерильные: RPMI-1640 по ФС 42-350 ВС-90. Для приготовления гидролизатных питательных сред использовали следующие ферментативные гидролизаты: гидролизат белков сыворотки молока (ГСБМ) по ТУ 10.07.44-90, гидролизат мышечных белков ферментативный сухой (ФГМ-С) по ТУ 46 12 20 -80, гидролизат белков крови ферментативный сухой (ГБК-С) по ТУ 10.09-137-91 и гидролизат лактальбумина (ГЛА) фирмы "Дифко".

Культуры клеток

В работе использовали паспортизованные клеточные культуры, полученные из музея клеточных культур ГНЦ ВБ " Вектор": перевиваемые линии клеток карциномы гортани человека (Нер-2), почки зеленой мартышки (Vero), почки сирийского хомячка (ВНК-21) и клетки лимфомы Беркитта (Namalva). Культивирование клеток проводили в течение 5-ти последовательных пассажей с 3-4 дневным циклом при посевной дозе в каждом пассаже 100-200 тыс.кл./мл. После 5-го пассажа осуществляли подсчет среднего значения индекса пролиферации (ИП) и количество жизнеспособных клеток [69].

Ростстимулирующие белки (РБ)

Образцы РБ сыворотки крови свиней и КРС получены в лаборатории клеточных культур Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН. Фракционный состав РБ сыворотки крови свиней и КРС: альбумина - 80,8 и 60,0%; а- глобулина - 6,2 и 17,0%; р-глобулина - 13,0 и 20,0%; у-глобулина - 0 и 3,0% соответственно [27, 94, 95].

Вирусы

В работе использовали вирус болезни Ауески (штамм БУК-628), вирус инфекционного ринотрахеита (штамм Оренбург), вирус парагриппа-3 (штамм MB А 1/77) и вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней (штамм ВГНКИ). Штаммы поддерживали и титровали на наиболее чувствительных к вирусам тест-культурах клеток. Доза и способ заражения, сроки культивирования были общепринятыми.

Приготовление сухих стерильных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов Приготовление сухой смеси по прописи раствора Хэнкса (ФС 42-71ВС-93)

Для приготовления смеси, содержащей неорганические соли, глюкозу, феноловый красный использовали реактивы следующей квалификации:

Натрий хлористый - "хч", ГОСТ 4233-77;

Калий хлористый -"хч", ГОСТ 4568-83;

Кальций хлористый 6-водный -"хч", ГОСТ 4460-77;

Магний хлористый 6-водный -"хч", ГОСТ 4209-77;

Магний сернокислый 7 - водный - "хч", ГОСТ4523-77;

Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - "хч", ГОСТ4172-76;

Калий фосфорно-кислый однозамещенный - "хч", ГОСТ4198-75;

Бикарбонат натрия - "хч", ГОСТ4201-79;

Глюкоза кристаллическая безводная - "чда", ГОСТ 6038-79;

Феноловый красный - ТУ 6-09-07-1451-85 Для изучения процессов дегидратации неорганических солей и определения оптимальных температур высушивания использовали метод термогравиметрии. Термогравиметрические исследования проводили в следующих условиях: навеска вещества-100 мг, температура 20-500°С, скорость нагрева - 5 °С/мин.

41 .»оссийяда

Высушивание неорганических солей осуществляли по разработанной схеме. Контроль степени высушивания неорганических солей

Для определения степени высушивания неорганических солей определяли плотность раствора исследуемой соли с помощью ареометра (ГФ XI изд., вып 1, с.25). Используя справочные данные зависимости плотности раствора неорганической соли от ее концентрации, рассчитывали молекулярную массу кристаллогидрата и количество молекул воды в нем в соответствии с технологической инструкцией, разработанной в ГНЦ ВБ "Вектор". Изготовление смеси солей, глюкозы и фенолового красного

Измельчение и смешение сухих компонентов ПС проводили в шаровой мельнице барабанного типа, материал мельницы - фарфор. Скорость вращения барабана и продолжительность измельчения определяли экспериментальным путем. Фасовка ферментативных гидролизатов, бикарбоната натрия и смеси, содержащей неорганические соли, глюкозу и феноловый красный

Фасовку осуществляли во флаконы ФО-Ю по ТУ 64-2-10-87, которые укупоривали резиновыми пробками по ТУ 38.106618-95 и обжимали алюминиевыми колпачками по ОСТ 64-009-89.

Стерилизацию сухих ПС проводили на промышленном ускорителе электронов ИЛУ-6 в Институте ядерной физики СО РАН со следующими параметрами пучка электронов: энергия пучка электронов - 2,15-2,20 Мэв; ток пучка импульсный - 0,22+0,01 А; частота следования импульсов - 6 Гц; длительность импульсов - 500 мкс.

Физико-химический контроль сухих стерильных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов

Контроль осуществляли в соответствии с требованиями "Методических рекомендаций по контролю качества вирусологических питательных сред" [69] по следующим показателям: внешний вид, цвет, запах; растворимость, концентрация ионов водорода, буферная емкость, прозрачность, массовая доля влаги, содержание хлоридов, содержание глюкозы, содержание аминного азота. Определение внешнего вида, цвета и запаха

Внешний вид, цвет и запах оценивали органолептически. Определение растворимости

Растворимость сухих стерильных питательных сред определяли в соответствии с требованием ГФ XI изд., вып.1, с. 177.

Для этого содержимое комплекта препарата вносили в бутылку вместимостью 450 мл и доводили объем среды водой очищенной до 400 мл, герметично закрывали резиновой пробкой и энергично встряхивали в течение 20 мин при температуре (20±2)°С. Растворимость препарата определяли визуально в проходящем свете. Определение показателя концентрации ионов водорода (рН)

Определение показателя концентрации ионов водорода (рН) проводили в соответствии с требованием ГФ XI изд., вып.1, с. 113 на рН-метре типа рН-121, диапазон измерения рН 4-9 ед. рН, погрешность измерения рН ±0,05 ед. рН. Определение буферной емкости

К 40 мл питательной среды добавляли 0,1 моль/л раствор гидроокиси натрия до изменения рН на 1 ед. рН.

Осмоляльность исследуемых ПС определяли по точке эвтектики с помощью осмометра ' "ОэтокЬ ", согласно инструкции по эксплуатации прибора.

Определения прозрачности

Прозрачность определяли на нефелометре типа НФР ( фильтр №4 ), согласно инструкции по эксплуатации прибора. Определение массовой доли влаги

Определение массовой доли влаги осуществляли методом высушивания в соответствии с требованиями ГФ XI изд., вып.1, с. 176 и ГОСТ 24061-89. Определение содержания хлор - иона

0,2 мл питательной среды помещали в колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 5 мл раствора нитрата серебра концентрации 0,01 моль/л и 1 мл концентрированной азотной кислоты, осторожно нагревали с использованием асбестовой сетки до кипения. К испытуемому раствору добавляли по капле насыщенный раствор калия перманганата до бледно-розового окрашивания, не исчезающего в течение 5 мин. Далее прибавляли глюкозу (около 10 мг) до исчезновения окраски. После охлаждения раствора, избыток ионов серебра титровали раствором аммония роданида концентрации 0,01 моль/л до образования розового окрашивания (индикатор - железо-аммонийные квасцы). Параллельно проводили контрольный опыт, используя очищенную воду. Содержание хлор - иона в исследуемом растворе (X) в процентах вычисляли по формуле:

Х= (А - В ) -К • 0,000355 • 100 /С, (3.1) где А- количество раствора роданида аммония, пошедшее на титрование контрольной пробы, мл;

В- количество раствора роданида аммония, пошедшее на титрование исследуемой пробы, мл;

К- поправка к титру раствора роданида аммония;

0,000355 - количество хлор - иона, соответствующее 1 мл раствора аммония роданида концентрации 0,01 моль/л, г;

С- объем анализируемого образца, мл;

100- коэффициент пересчета г в %.

Определение аминного азота формольным титрованием

В стакан, вместимостью 50 мл, вносили 10 мл анализируемого раствора среды, добавляли 15-20 мл очищенной воды и доводили рН смеси до 7,0 ед. рН раствором натрия гидроксида или серной кислоты. К нейтрализованному раствору добавляли 2 мл формольной смеси, перемешивали и при постоянном перемешивании потенциометрически титровали раствором натрию гидроксида концентрации 0, 1 моль/л до рН 8,5 ед. рН. Содержание аминного азота в исследуемом образце (X]) вычисляли по формуле:

XI = У • К • 0,0014 • 100/С, (3.2) где V- количество раствора натрия гидроксида, израсходованного на титрование исследуемого образца, мл;

К- поправочный коэффициент к титру раствора натрия гидроксида; 0,0014- количество азота, эквивалентное 1 мл 0,1 мол/л раствора натрия гидроксида, мг; С- объем анализируемого образца, мл. Определение содержания глюкозы

3,0 г трихлоруксусной кислоты количественно переносили в мерную колбу и доводили объем очищенной водой до 100 мл. В пробирку наливали 0,9 мл 3%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и выливали в нее 0,1 мл исследуемой среды. Центрифугировали с частотой вращения 1000 мин*1. К 0,5 мл центрифугата добавляли 4,5 мл о-толуидинового реактива. Пробирку помещали в кипящую водяную баню на 3 мин, далее охлаждали при комнатной температуре (18-20)°С. Оптическую плотность определяли на спектрофотометре при длине волны 625 нм в кювете с толщиной поглощающего света 10 мм. По калибровочному графику находили содержание глюкозы в

45 исследуемом образце. (Калиброванный график строили, используя данные оптической плотности стандартного раствора глюкозы с концентрацией 100 мг%). Содержание глюкозы ( Сопыт, мг% ) определяли по формуле:

Сопыт ~~ Сст • Доп /д ст, (3.3) где Сст- концентрация глюкозы в калибровочном растворе, мг%; Допыт - оптическая плотность исследуемого образца; Дет - оптическая плотность стандартной пробы.

Контроль биологических свойств ВПС Определение ростовой активности ВПС на перевиваемой культуре клеток

Оценку ростовой активности питательной среды проводили путем пассирования тест-культуры клеток на испытуемой и контрольной сериях среды в течение пяти последовательных пассажей с учетом индекса пролиферации культуры, морфологии клеточной популяции и сроков образования монослоя. В качестве контрольной серии использовали питательную среду, ранее прошедшую испытания и отвечающую требованиям соответствующей документации - фармакопейной статьи. Контроль проводили на паспортизованных клеточных линиях Нер-2, Vero, Namalva и СПЭВ. От каждой серии питательной среды независимо от объема отбирали по две случайные фасовки по 0,5 л. Пересев клеточного материала проводили на 3-4 сутки роста, когда формировывался сплошной монослой. Ежедневно с помощью инвертированного микроскопа проводили анализ монослоя, оценивали состояние клеточного пласта и морфологию клеток в культуре. Жизнеспособные клетки должны иметь четкие границы и четкую структуру. Клеточный монослой должен быть представлен клетками, сохраняющими типичные морфологические черты используемой линии, без дегенеративных изменений, симпластов и т.д.

Клетки культивировали в среде с добавлением сухого стерильного глутамина (300 мг/л) и 10 % или 5 % сыворотки крови КРС. Пересев клеток осуществляли после формирования сплошного монослоя. Для снятия клеток со стекла использовали смесь 0,25 % раствора трипсина по ВФС 42 -3117-98 и раствора Версена по ФС 42-65ВС-93 в соотношении 1:10. Снятые клетки пипетировали в 5 мл среды до получения гомогенной суспензии. Каплю клеточной суспензии из пипетки помещали на край покровного стекла камеры Горяева так, чтобы суспензия под действием капилярных сил проникла в камеру подсчета. Подсчет клеток в камере Горяева проводили при 70-кратном увеличении микроскопа.

Концентрацию клеток в 1 мл (С) определяли по формуле:

С= а-2-1111-В, (3.4) где С- общее количество клеток ; а - количество клеток в камере Горяева; В- объем суспензии, мл; 1111- коэффициент пересчета; 2- степень разведения. Индекс пролиферации (ИП) определяли по формуле:

ИП=Х/У, (3.5) где X - конечная концентрация клеток, кл/мл, У - концентрация клеток при посеве.

За результат испытания принимали среднее арифметическое значение ИП трех параллельных измерений. Определение ростовой активности ВПС на первичной культуре клеток

Первичные культуры клеток ФЭК получали по общепринятой методике, используя 9-10 дневные куриные эмбрионы [29]. Подсчет клеток производили по методике, приведенной в п. 3.7.1. В качестве контрольной среды использовали 0,5% раствор гидролизата ГЛА, (фирмы "Дифко"), приготовленный методом стерилизующей фильтрации. Исследуемую среду считали пригодной, если она обеспечивала образование

47 сплошного монослоя клеток на 3-4 сутки от начала культивирования, не вызывая в клетках изменений дегенеративного характера, и ИП не менее 1,0. Определение чувствительности культур клеток к вирусам

Образцы культур клеток заражали общепринятым методом и инкубировали в стандартных условиях при температуре 36°С до момента появления цитопатических изменений. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в ^ ТЦД 5о/Мл-Определение стерильности ВПС

Стерильность готовых питательных сред определяли в соответствии с ГФ XI вып.2, с. 187 методом прямого посева на тиогликолевую среду. Инкубирование проводили при температуре 20-25°С и 30-35°С. Учет результатов проводили в течение 14 суток инкубирования. Через каждые сутки и по окончании инкубации визуально просматривали посевы на выявление признаков роста микроорганизмов (появление мутности, осадка, хлопьев и др. изменений). При обнаружении роста хотя бы в одной Пробирке его подтверждали микроскопированием мазков по Граму. Контроль на отсутствие микоплазм

Контроль на отсутствие микоплазм осуществляли в соответствии с методическими указаниями МУК 4.1./4.2.588-96.

Испытуемую питательную среду вносили по 0,5 мл в каждую пробирку со специфической средой, предварительно аттестованной на чувствительность к микоплазмам. Посев производили пипеткой, вместимостью 1 мл, столбиком от дна пробирки. Пробирки выдерживали 14 суток при температуре (37±1)°С. Просмотр производили на 7, 10 и 14 сутки, с целью выявления признаков наличия микоплазм (появление в первичном посеве опалесценции, слабого помутнения среды). Электронные спектры поглощения (ЭСП) вирусологических питательных сред регистрировали на спектрофотометре "Спекорд М40", фирмы "Карл Цейс",

Германия. Использовали стеклянные УФ-микрокюветы: для синтетических питательных сред-типа ЕБ-Ю; для гидролизатных сред- типа Е8-2. Параметры измерения: диапазон регистрации 200-900 нм; время интегрирования 1 с; скорость записи 2 мм/с; растяжение ординаты 1,00; масштаб регистрации 1 мм/1,795 нм;

Статистическую обработку результатов измерения оптической плотности поглощения (ОП) проводили в соответствии с требованиями ГОСТ 8.207-76 и СТ СЭВ 1190-78. Проверку нормальности распределения исследуемых величин ОП проводили двумя способами: статистическим критерием - омега - квадрат и составным критерием с исследованием таких исходных выборок, как коэффициент асимметрии и коэффициент эксцесса. Распределение результатов измерения подчинялось нормальному закону. Исходя из этого, обработку результатов и определение доверительных интервалов изменений ОП проводили следующим образом: определяли среднее арифметическое значение ОП - (ОП):

ОП=1/п Е ОПмб,где п-количество исследуемых серий; (3.6.) проводили оценку среднеквадратичного отклонения единичного измерения- Б и среднеквадратичного отклонения средней арифметической Б]; вычисляли границы доверительного интервала для отдельного измерения (I) с где 1:0,995(11-1)- 0,995- квантиль распределения Стьюдента с (п-1 ) степенями свободы.

Спектры электронного парамагнитного резонанса ВПС записывали на ЭПР-спектрометре Е-109 относительно стандартного образца (дифенилпикрилгидразила.

3.7) вероятностью 99%: (I) = ( ОП -1:0,995(^1) ^ ; ОП + %95(п-1)8ь),

3.8.)

91 который состоит из 1,53-10 неспаренных электронов на 1 г вещества) при 20°С на воздухе непосредственно после облучения сухих ВПС, а затем после растворения сухих облученных образцов ВПС в очищенной воде.

Аминокислотный состав исследуемых ВПС определяли на аминокислотном анализаторе ЬС 5001 фирмы "Вю^ошс". Пики аминокислот регистрировали в области 570 нм (для Ь-пролина в области 440 нм).

Для определения сроков годности сухих стерильных ВПС был применен метод ускоренного старения при повышенных температурах [48].

Сухие стерильные ВПС выдерживали при температуре (80±5)°С в течение 0-17 сут, через каждые сутки отбирали пробы. Далее на основе отобранных термообработанных сухих питательных сред готовили жидкие ПС путем растворения их в стерильной очищенной воде и оценивали их качество.

Статистическая обработка результатов

Среднее арифметическое значение результатов - (X) определяли по формуле 3.7.

Сравнение средних значений результатов, полученных в опыте и контроле, для определения существенности их различия проводили по формуле: ХГХ21 > ^^ 1/П1 + 1/П2, (3.9.) где 5?-Л||Шх - Х\]2 +Е( х - X)?2 (3.10)

П1 +П2-2

П1 и П2 обозначают число опытов, из которых получены средние X, и Х2;

2 2

2(х - X)] и Ц х - Х)2 - суммы квадратов отклонений величин, найденных в отдельных опытах от соответствующей средней.

Значение 1Р находили в таблице Стьюдента в зависимости от числа степеней свободы п=(п] + П2 - 2) и уровню значимости 0,01.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Богрянцева, Марина Поликарповна, Кольцово

1. Андреевская Н.М., Михайлова В.А., Каретникова Э.С. Влияние антиоксидантов на стабильность диагностических сывороток в процессе их хранения. // Биотехнология. -1998.-№4.- с. 68-71.

2. Артюхин В.И., Шепелин А.П, Киселева Н.В. Белковые гидролизаты в производстве питательных сред. Производство и применение продуктов микробиологических производств: Обзорн. информ. М.: ВНИИСЭНТИ Минмедпрома СССР, 1990. - вып. 9-10. - с. 31-38.

3. А. с. 1337410 СССР, МКИ3 А 61 L 2/08. Способ стерилизации продуктов / М.А.Туманян, И.И. Самойленко, М.П.Калошин. Опубл. 1972, Бюл. № 12.

4. А. с. 1025722. СССР, МКИ3 С 12 N 1/00. Питательная среда для выращивания культур клеток животных / Г.Е. Панкова, В.А. Сергеев, Л.П. Дьяконов, Д.Ф.Осидзе, А.П. Простяков, Н.Д. Скичко Опубл. 1983, Бюл. № 24.

5. А. с. 1331891 СССР, МКИ3 С 12 N 5/00. Способ определения пролиферативной способности клеток / O.A. Бочарова, Г.Н. Зацепина, Д.В. Зыбин. Опубл. 1987, Бюл. № 31.

6. А. с. 1337410 СССР, МКИ3 С 12 Q 1/04. Способ определения токсичности питательной среды, используемой для выращивания культур животных клеток / Л.Д. Мартынец. Опубл. 1987, Бюл. № 34.

7. А. с. 1507790 СССР, МКИ3 С 12 N 5/00. Способ культивирования клеток человека и животных / В.М. Бородина, Л.И. Федорова, Зеленин A.B. Опубл. 1989, Бюл. № 34.

8. А. с. 1673596 СССР, МКИ3 С 12 N 5/04. Способ стерилизации ферментных препаратов, используемых для получения протопластов / Н.М. Нафталиев, Л.А. Дубовицкая. Опубл. 1991, Бюл. № 32.

9. А. с. 1735360. СССР, МКИ3 С 12 N 1/00. Питательная среда для перевиваемых клеток млекопитающих / А.И.Коренева, А.С.Пригода Опубл. 1992, Бюл. № 19.

10. Байбаков В.И. Использование митохондрий из культур клеток в токсикологическом контроле исходного сырья при производстве питательных сред // Биотехнология. 1990. - № 2. - с. 72-75.

11. Балаж А., Блажек И. Эндогенные ингибиторы клеточной пролиферации. М., 1982. - 113 с.

12. Башашкина H.A. Стандартизация методов контроля культуральных питательных сред и их компонентов: Автореферат дис.канд. биол. наук. М., 1994. -24 с.

13. Беликов В.Г., Дубровкин И.М., Лозовский A.C. Использование автоматизированного спектрофотометрического анализа для контроля качества лекарственных препаратов: Обзорн. информ. М: ВНИИСЭНТИ, 1989. - вып.7. - 27 с.

14. Богрянцева М.П. и др. Разработка препарата сухого стерильного трипсина, используемого для культур клеток // Цитология .- 1992. т.34. - № 9. - с. 55.

15. Богрянцева М.П. и др. Готовая форма трипсина для культур клеток // Цитология. 1994. - т.36. - № 6. - с.547.

16. Блинкова Л.П. и др. Применение ферментативного гидролизата боимассы хлореллы в средах для выращивания клеток эукариот // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1995 - №6. - с. 16

17. Булатова Р.Ф., Шепелин А.П., Волков В Л. Новые подходы к разработке критериев оценки качества сухих питательных сред // Клиническая лабораторная диагностика. 1997. - № 1. - с. 23-24.

18. Буряк В.П Основные характеристики электронных спектров поглощения и количественного определения лекарственных средств, содержащих гетероатом кислорода в молекуле Автореф. дис.канд. фарм .наук.-М, 1978. 23 с.154

19. Валева Е.Б. и др. Приготовление и использование питательной среды с яичным гидролизатом для монослойного размножения клеток ВНК-21. // Ветеринарно-медицинская наука.-1980. №10. - с. 55-62.

20. Вашков В.И. Средства и методы стерилизации, применяемые в медицине. М.: Медицина, 1973. с. 124-152.

21. Величко A.B. Сухой трипсин диспергент для получения культур клеток // Цитология. - 1994. - т.36. - № 6. - с. 548-54.

22. Вильянович Л.И. и др. Использование безбелковых сред для культивирования доимплантационных эмбрионов млекопитающих // Консервация генет. ресурсов: Материалы 14 Рабочего совещ., Пущино 28-30 мая. 1996. Пущино, 1996. - с. 67-69.

23. Витакер.А. Среды для культивирования клеток млекопитающих. / Новые методы культуры животных тканей. Под ред. Фридлянского ,-М: Мир, 1976. с. 18.

24. Вишняков И.В., Жестеров В.И., Башаев и др. Использование перевиваемой культуры клеток почки сайгака в вирусологической практике. // Цитология. 1994. - т.36. - №6. - с. 549.

25. Гасанова Б.С. Культивирование клеток млекопитающих с различными видами сывороток и заменителями сывороток. Автореф. дис. канд. биол.наук.-М, 1993. с. 8-10.

26. Гасанова Б.С и др. Протеины различных видов сывороток как факторы роста клеток млекопитающих // Цитология. 1994. - т.36. - №6. - с. 61.

27. Гизитдинов H.H. и др. Питательные среды для выращивания культур клеток и вирусов // Достижения науки и техники. 1992. - № 6. -с. 22-23.

28. Голубев Д.Б., Сомина А.А, Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. JL: Медицина, 1976. - с. 10-36.

29. Гончаров A.A., Манина И.Н., Ионова Н.Д. О возможности радиационной стерилизации гепарина // Хим. фарм. журнал. - 1986. - №5. - с. 619-623.

30. Гризодуб А.И., Георгиевский В.П. Спектрофотометрический анализ в контроле качества многокомпонентных лекарственных средств: Обзорн. информ. М: ВНИИСЭНТИ, 1988. - вып. 9. - 28 с.

31. Громов В.А. и др. Физико-химические исследования облученных лекарственных препаратов // Тез.докладов Всесоюз. конф. по радиационной стерилизации медицинской промышленности. М., 1978. - с. 62-63.

32. Гудимо О.С., Колесникова H.A., Шошиев J1.H. Культивирование клеток Hela на питательных средах с гидролизатами альбумина сыворотки крови человека и животных // Вопросы вирусологии. 1961. №3. - с. 375119.

33. Гудрниеце Э.Ю., Королькова B.C. Стабилизация солянокислого цистеина. // В сб.: Методы получения и анализа биохимических препаратов. Рига, 1982. - 4.1. - 14 с.

34. Давиденко Т. И. и др. Физико-химические исследования полипропиленов после стерилизации // Хим. фарм. журнал. - 1994. -№.8. - с. 51-56.

35. Дамберг Б.Э. Реакция меланоидинообразования и ее биологическое значение // Известия АН Латвийской ССР.-1976.- № 1.-е. 97-105.

36. Демина Н.Г., Полажуер Б.М., Румянцева Н.Ф. Изучение стабильности глутамина в процессе его выделения из ферментационных процессов // Биотехнология. -1992.-№ 2.-с. 63-67.

37. Децина А.Н., Бачинский А.Г., Байбаков В.И. Белковые гидролизаты в качестве основы питательных сред. М.: ВНИИСЭНТИ Минмедпрома СССР, 1985. 66 с.

38. Джарылгасов С.А., Борисова С.М., Пухова Н.М. Качество материалов для культур клеток, применяемых в биотехнологии: Обзорн. информ. М: ВНИИСЭНТИ,1561987.-ВЫП.З.-28С.

39. Дьяконов Л.П. Культуры клеток животных: современные аспекты биотехнологии и взаимодействия клеток с инъекционными патогенами // Цитология. -1994,-т.Зб.-№6.-с. 503-504.

40. Дьяконов Л.П., Строкина Г.М., Конюхов А.Ф. Гидролизаты молочных, мышечных и растительных белков как основы питательных сред для культивирования клеток и вирусов. // Цитология. 1994. - т.36, - №6. - с. 522.

41. Зенькевич В.Б., Балатов В.П., Соколов С.Е. Мембранное оборудование для питательных сред и сывороток // Тез. докл. Всесоюз. конф.' "Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток." Кольцово, 14-17 окт. 1991. Новосибирск, 1991.-с. 43.

42. Зубцов В.А. и др. Способ получения и изучение биологических свойств некоторых компонентов питательных сред. // Тез. докл. Всесоюз. конф. "Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток." Кольцово, 14-17 окт. 1991. -Новосибирск, 1991.-с. 11.

43. Иванюшенкова И.В. и др. Культивирование вакцинных штаммов вируса африканской чумы лошадей в суспензии клеток с использованием гидролизата белков крови. // Вирусные и микробные болезни животных. ВНИИ защиты животных. -Владимир, 1995. с. 179-181.

44. Игудин Л.И., Кацнельсон Н.В., Блоха В.В. Принципы и методы стандартизации вирусологических питательных сред // Тез. докл. Всесоюзн. конф."Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии".-Махачкала, 1988. Ч. 2. - с. 221.

45. Карышева А.Ф. Сухой белковый концентрат и использование его при изготовлении питательных сред для микроорганизмов: Автореф. дис. докт. биол. наук Одесса, 1972.-32 с.

46. Каулен Д.Р. Труды Ташкентской конференции по мирному использованию атомной энергии. Ташкент 1966 - с. 88.

47. Каушинский А.Г., Ракитская Г.А., Самойленко И.И. Использование ускорителей электронов для стерилизации шприцев однократного применения // Тез. докл Радиобиологического съезда, Киев, 20-25 сент., 1993. Пущино, 1993. - с. 255.

48. Кизюн С.М., АфанасенГ.А. Бессывороточная синтетическая среда на основе факторов роста для высокоэффективного культивирования клеток- продуцентов урокиназы линии RH-RA. // Биотехнология. 1993. - №10. - с.22 - 25.

49. Клесова И.И., Пахальчук Т.И., Бураев В.И./ Масштабирование производства питательных сред для культур клеток // Тез. докл. Всесоюз. конф. "Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток." Кольцово, 14-17 окт. 1991. Новосибирск, 1991. - с. 22.

50. Козлов Э.И., Иванова P.A., Цибульская М.И. Витамины отечественного производства для питательных сред // Тез. докл. Всесоюзн. конф."Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии".-Махачкала, 1988. Ч. 1. - с 28.158

51. Коновалова Е.Ю. и др. Конструирование бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих. Сообщение III. // Биотехнология. 1991. -№5. - с. 72-76.

52. Коренева А.И. и др. Конструирование бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих. Сообщение V. // Биотехнология. 1991. - №6. -с. 64-66.

53. Корнеева А.И. Разработка питательной среды для культур клеток млекопитающих на основе ферментативного гидролизата казеина: Автореф. дис. канд биол. наук.-Москва, 1995. с. 8-10.

54. Крылов И.А., Красноштанова A.A., Манаков М.Н. Ферментативный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Ш.Использование ферментативных систем поджелудочной железы. // Биотехнология. 1998. - №6. - с. 8489.

55. Кузин A.M., Каушанский Д.А. Прикладная радиобиология.-М.: Энергоиздат. -1981.-с. 5-17.

56. Куликова И.Л., Дьяконов Л.П., Жидков С.А. Культура клеток сосудов теленка и чувствительность клеток этой культуры к вирусу диареи крупного рогатого скота // Цитология. 1992. - т.34. - №9. - с. 75.

57. И-42-2-82. Инструкция по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода "ускоренного старения" при повышенной температуре. М, 1983. - 13 с.

58. Ламберт К.Дж., Берч Дж.Р. Среды для выращивания клеток. // В кн.: Биотехнология клеток животных. Под ред. Спиера P.E. М: Мир, 1989. - с. 98-125.

59. Львова М.Ш., Озерина Т.В., Эрман С.Я., Козлов Э.И. Действие облучения на растворы гомопантотеновой кислоты // Хим. фарм. журнал. - 1986. - № 5. - с. 617-619.

60. Мартынец Л.Д. и др. Определение ростовой активности суспензионных питательных сред в микроферментерах // Биотехнология. 1991. - № 2. - с. 91-93.

61. Матвеев А.Е. и др. Влияние режимов стерилизации на качество питательных сред при переменных значениях pH среды // Хим. фарм. журнал. - 1985. - № 3. - с. 228231.

62. Матвеев В.Е., Скворцов Т.Е., Куян Н.В. Разрушение аминокислот в растворах при нагревании. //Биотехнология.-1986.-№1.-с. 53-62.

63. Методические рекомендации по контролю качества вирусологических питательных сред. — М, 1985. 14 с.

64. Миронова Л.Л. и др. Отечественные линии перевиваемых клеток почек теленка субстрат для биотехнологии. // Биотехнология. - 1998. - №5. - с. 25-31.

65. Молодкина Л.М. и др. Стерилизующая фильтрация модельных питательных сред на кассетных модулях с трековыми мембранами // Цитология. 1994. - т.36. - № 6. -с. 595.

66. Нариманов A.A. Бессывороточная среда для культивирования лимфоидных клеток человека и миеломных клеток мышей // Биотехнология. 1991. - № 1. - с. 49-51.

67. Новохатский A.C. Ростовые факторы сыворотки и крови. Новые возможности получения и применения // Цитология. 1994. - т.36. - №6. - с. 506.

68. Ночевный В.Т. Биологический контроль ростовой активности питательных сред и сыворотки крови животных // Тез. докл. Всесоюз. конф. "Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток." Кольцово, 14-17 окт. 1991. Новосибирск,1991.-с. 46.

69. Овечко H.H., Жердева В.В., Раевская Н.К. Биоантиоксидант феназан- К изменяет уровень синтетических процессов в культивируемых клетках // Цитология.1992.-т.34.-№9.-с. 88-89.

70. Павлов Е.П. и др. Использование у-излучения для микробной деконтаминации лекарственных средств // Хим. фарм. журнал. - 1992. - №2. - с. 76-79.

71. Патент 1830080 Россия, МКИ3 С 12 N 5/00. Бессывороточная питательная среда для культуры ткани / В.Ф. Проути Опубл. 1993, Бюл. № 27

72. Патент 2059417 Россия , МКИ" С 12 N 5/04. Способ стерилизации питательных сред / В.Н. Данелевич, В.А. Лившиц. Опубл. 1996, Бюл. № 13.

73. Патент 2001628, Россия. МКИ3 А 61 L 2/00. Способ стерилизации лидазы / Л.И. Стекольников, И.И. Самойленко, В.В.Рыльцев, Р.Б.Вирник. Опубл. 1993, Бюл. № 39-40.

74. Патент 2036233. Россия, МКИ6 С 12 N 5/00. Питательная среда для выращивания первичных и перевиваемых культур клеток / A.B. Слободенюк, F.F. Колесникова. Опубл. 1995, Бюл. № 15.161

75. Патент 2043587, Россия МКИ6 F 26 В 5/6 Способ сушки биологических материалов / А.И. Григоренко, Н.В. Крамской, A.B. Колосков. Опубл. 1995, Бюл. №.25.

76. Патент 1566532. Россия, МКИ0 С 12 N 5/00. Способ изготовления вакцины против сибирской язвы животных / Г.Н. Романов, Ю.П. Чернецкий. Опубл. 1995, Бюл. №'35.

77. Патент 2055482 Россия, МКИ6 С 12 N 5/00. Способ получения белковонуклеинового гидролизата / Ю.М.Гафуров, Э.Л. Козловская. Опубл. 1996,1. Бюл. № 1.

78. Патент 2057176. Россия, МКИ0 С 12 N 5/00. Питательная среда для выращивания культур клеток человека и животных / К.И. Спыну, П.К.Кинтя, Т.П.Грушко. Опубл. 1996, Бюл. № 1.

79. Патент 2053297. Россия, МКИ6 С 12 N 5/00. Способ культивирования вируса кори / A.A. Смородинцев. Опубл. 1996, Бюл. № 3.

80. Патент 2035877 Россия , МКИ6 А 23 К 1/00. Антиоксиданты для стабилизации витаминов в кормосмесях / Р.И. Лыс, Т.К. Билозор. Опубл. 1996, Бюл. № 13.

81. Патент 2068879 Россия, МКИ6 С 12 N 1/00. Способ получения ферментативного гидролизата и питательная среда "Эпидермат-2" для культивирования клеток эукариотов / И.Г. Ермишина, А.Г. Майнерт, Т.Ф.Власова. Опубл. 1996, Бюл. № 31.

82. Патент 2074004. Россия, МКИ6 А 61 L 2/08. Комплекс радиционной стерилизации / Э.А. Мирочник, A.B. Мищенко, В.М. Пироженко Опубл. 1997, Бюл. №6.

83. Патент 2074249 Россия, МКИ С 12 N 1/00. Способполучения ферментативногогидролизата из мышечной ткани ластоногих и питательная среда "Целат "для культивирования клеток эукариотов / И.Г. Ермишина, А.Г. Майнерт, Т.Ф.Власова. -Опубл. 1997, Бюл. № 6.

84. Патент № 2084523 Россия, МКИ3 С 12 N 5/08. Способ получения питательной среды для культивирования лимфоцитов крови / И.В. Фролова, Г.П. Трошкова, H.A. Мазуркова, Л.П. Камший, И.А. Гинзбург Опубл. 1997, Бюл. № 27.

85. Патент 2107724, Россия, МКИ3 С 12 N 5/00.Способ получения сухих стерильных питательных сред для культур клеток / Л.П. Камший, Г.П. Трошкова, А.И. Леляк, И.В.Фролова, Е.А. Сорокина. Опубл. 1998, Бюл. № 9.

86. Подчерняева Р.Я., Хижнякова Т.М., Михайлова Г.Р., Шалунова Н.В. Анализ варианта линии клеток Vero, полученного с целью использования в вирусологии // Цитология. 1996. - т.38. - № 2. - с. 241.

87. Подчерняева Р.Я. и др. Изучение различных ростстимулирующих белков, используемых для культивирования клеток млекопитающих // Биотехнология. 1994. -№6. - с. 20-23.

88. Подчерняева Р.Я., Мельниченко Е.И., Конду Э.И. Использование ростстимулирующих белков для стандартизации условий культивирования клеток млекопитающих // Цитология. 1996. - т.38. - №2. - с. 240-241.

89. Полозков и др. Количественное определение асалина в лекарственных формах // Хим. фарм. журнал. - 1998. -№.2. - с. 43-44.

90. Пригода A.A. и др. Конструирование бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих. Сообщение I. // Биотехнология. 1990. - №2. -с. 35.

91. Пригода A.A. и др. Конструирование бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих. Сообщение П. // Биотехнология. 1991. - №4.с. 38-40.

92. Пригода A.C., Муратов B.C. Современное состояние, перспективы получения и использования питательных сред: Производство и применение продуктов микробиологических производств: Обзорн. информ. М: ВНИИСЭНТИ, 1989. - вып.8. -56 с.

93. Пригода A.A. и др. Конструирование бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих. Сообщение IV. // Биотехнология. 1991. - №5. -с. 55-59.

94. Пригода A.A. и др. Конструирование бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих. Сообщение VI. // Биотехнология. 1993. - №7. -с. 21-25.

95. Распопина Г.И., Мартынец Л.Д., Колокольцова Т.Д. Уровень карбонильных соединений в питательных средах при культивировании клеток млекопитающих // Биотехнология. 1991. - № 1.-е. 75-79.

96. Самойленко И.И., Федотов И.С., Туманян М.А. Снижение бактериальной обсемененности ферментных препаратов комбинированными радиационными способами // Прикладная биохимия и микробиология.-1984. вып.2 - том 20 - с. 2349-244.

97. Самуйленко А.Я., Ломакина Г.А., Авдеева Г.А. Современное состояние и перспективы развития промышленного производства ветеринарных препаратов. Биотехнологическое производство: Обзорн. информ. М.: ВНИИСЭНТИ, 1994. вып.З. -с. 8.164

98. Сандахчиев JI.C., Зиновьев B.B, Подчерняева Р.Я. Применение ферментного препарата " коллаза" в работе с клеточными культурами // Цитология. 1992. - т.34. - № 9.-с. 102-103.

99. Седых Н.В., Кристапсонс М.Ж. Контроль качества в биотехнологии. Рига: Зинатне, 1990. с. 22-25.

100. Сирица И.И., Лымарь В.Т., Лобанова Т.Н. Проточно-фильтрационный способ культивирования клеток млекопитающих // Цитология. 1996. - т.38. - № 2. - с. 247-248.

101. Ситьков В.И., Сурмилова А.П., Лепишко В.И. Отработка методов фильтрации сывороточных питательных сред // Вестник ветеринарии. 1996. - № 1. - с. 71-73.

102. Смирнова Т.Д., Литвинчук Л.Ф., Сизова Л.С. Новый способ контроля свойств сыворотки крови КРС // Цитология. 1996. - т.38. - № 2. - с. 249-250.

103. Сперанская И. Д. Современные методы изготовления культуральных питательных сред. : Автореферат дис.канд.биол.наук. М., 1981. - 20 с.

104. Телишевская Л.Я. и др. Изучение ростстимулирующих компонентов гель -фильтрационных фракций панкреатических белковых гидролизатов // Биотехнология. -1993. -№11-12.-с. 33-38 .

105. Телишевская Л.Я., Максимюк H.H., Богаутдинов З.Ф. Значение пептидов в составе питательных сред для суспензионного культивирования // Цитология. 1994. -т.36. №6 .- с. 538.

106. Технические условия ТУ 46 12 20 -80. Ферментативный гидролизат мышечных белков сухой.165

107. Технические условия ТУЮ.07.44-90. Ферментативный гидролизат белков сыворотки молока.

108. Технические условия ТУ 10.09.-137-91. Ферментативный гидролизат белков крови сухой.

109. Трофимов В.И. Радиационные технологии стерилизации для трансфузиологии // Новое в трансфузиологии 1994. - №9. - с. 63-65.

110. Трошкова Т.П., Камший Л.П., Фролова И.В., Богрянцева М.П. и др. Научный отчет «Разработка экспериментально-промышленной технологии производства сухих питательных сред Игла, 199 М, МЕМ-4, RPMI-1640. НПО "Вектор"». Новосибирск, 1990.-64 с.

111. Федотова А.В и др. Выращивание клеток щитовидной железы при пониженных концентрациях сыворотки крови // Цитология. 1994. - т.36. - №6.с. 537-538.

112. Фролова И.В. и др. Готовая форма питательной среды для культивирования лимфоцитов крови человека // Цитология. 1994. - т.36 .- № 6. - с. 583.

113. Фролова И.В. и др. Готовая форма питательной среды для культивирования лимфоцитов переферической крови человека // Биотехнология. 1994. - № 9-10.с. 22-25.

114. Хижнякова Т.М., Подчерняева Р.Я., Мельниченко Е.И. Культивирование клеток на пористом микроносителе. // Биотехнология. 1998. - №5. - с. 38-41.

115. Bargess С., Knowles A. Standards in Absortion Spectrometry Ultraviolet Spectrometry Group.-New York: Chapman and Hall, 1981. 142 p.

116. Barman H.K., Rajpur Y.S. Serum-free and serum-containing media for hubridoma culture // J. Sei and Ind. Res. 1993. - 52, V. 12. - P. 803-807.

117. Bertheussen Kjell. Growth of cells in a new defined protein-free medium. // Cytotechnology. 1993. - 11, V.3. - P. 219-231.

118. Bertolero F., Kaighn M.E., Camalier R.F., Saffoiotti U. Effects of serum and serum-derived factors on growth and differentiation of mouse keratinocytes // In Vitro. 1986. - V.22. - P. 423-428.

119. Benjakul S., Morrissey M. Protein hydrolysates from pacific whiting solid wastes // Arg. and Food Chem. 1997. - 45, V.9. - P. 3425-3430.

120. Brandli J. Influence of HFST-Sterilization for Growth of Serum-Free Cell Cultures // Abstract 16th Int. Meet. Products from Cells Cells as Products., Switzerland, 25-29 April, 1999.-1999.-P. 217.

121. Briand P. et al. // J. Cell. Biol. Suppl. 1986. - V.42. - P. 22-30.

122. Brim L.,Kiefer K., Hanson G. Are media just media ? // Amer. Bioteclinol. Lab. -1991.-V.8.-P. 33-35.

123. Buchaila R., Schuttler C., Bogl K.W. Effects of ionizing radiation on ultra-high molecular-weight poluethylene: Pap. 9th Int. Meet.Radiat. Process., Istanbul, 11-16 Sept., 1994. Pt 1 // Radiat.Phys.and Chem. 1995. - 46, V.4-6. - P. 579-585

124. Chan H.M., Muramoto H. Antioxidant activity of disigned peptides based on the antioxidative peptide isolated from degists of a soybean protein. // Arg. and Food Chem. -1996. 44, V.9. - P. 2619 - 2623.

125. Cinalt Jun J., Rabenau Y., Cinalt Sen J., Daerr H.W. Die Serum- und Protein- freie Zuchtung von Zellkulturen // Z. Forum Mikrobiologie. 1989. - V.2. - P. 205-211.

126. Chen Zhaolie, Xiao Chengzy. A novel serum- free medium for the cultivation of Vero cells on microcarriers // Biotechnol. Techn. 1996. - V.6. - P. 449-452.

127. Chouaib A., Kallel H. Adaptation of Vero cells to a serum free medium for the production of rabies virus. // Abstract 16th Int. Meet. Products from Cells Cells as Products., Switzerland, 25-29 April, 1999. -1999. P. 224.167

128. Dam A.M.,Gazco L.G., Kaewpila S. Radiation treatment of pharmaceuticals // Radiat. Phys. and Chem. 1996. - V.3. - P. 515-517.

129. Domart Coulon Isabelle, Doumene Dominique, Auzoux Bondenave Stephanik. Identification of media supplements that improve the viability of primarily cell cultures of Crassostrea gigas oysters // Cytotechnology. 1994. - V.2 - P. 109-120.

130. Deblock Stephane, Istas Jacqueline Que penser des aliments irradies? // Combat nature. 1993. -V.l00. -P .42-43.

131. Dewelle J., Pirotton S., Raes M. Develpment of a serum free medium for a human diploid fibroblast cell line. // Abstract 16th Int. Meet. Products from Cells Cells as Products., Switzerland, 25-29 April, 1999. -1999. P. 216.

132. Gonze M., Maggeto C. Development of a serum free medium for MRC-5 culture. // Abstract 16th Int. Meet. Products from Cells Cells as Products., Switzerland, 25-29 April, 1999. -1999.-P. 223.

133. Heidemann R., Zhang C. et al. The Use of Peptones as Medium Additives for High-Density Perfusion Cultures of Animal Cells // Abstract 16th Int. Meet. Products from Cells Cells as Products., Switzerland, 25-29 April, 1999. -1999. P. 220.

134. Ham R.G. Impotance of the basal nutrient medium in the desing of hormonally defined media // Growth of cells in hormonally defined media. Cold Spring -1982. P. 39-60.

135. Hang N.D., Canh T.T., Thuy T.T. Radiation sterilisation of traditional medicine drugs in Vietnam: Pap. 9th Int. Meet.Radiat. Process., Istanbul, 11-16 Sept., 1994. Pt 1 // Radiat.Phys.and Chem. 1995. - 46, V.4-6. - P. 623-627.

136. Hayashi Т., Manou P. et al // J. Agr. Biol. Chem. 1981. - V. 45. - P. 111-117.

137. HyClone L., Kern D. Blended bovine sera cellular growth media and ther methods of production and use / Патент 5409827 США, МКИ6 C12 N 5/00, A 61 К 35/14. Опубл. 1995; НКИ 435 /2403.

138. Inlow D., Lowe D., Howarth В., Mac H. Improvements in hybridoma culture and bispecific antibody production // J. Cell. Biochem. 1994. -V.18. - P. 65

139. Jeon I., Fung D. Esherichia coli growth in Laboratory media as affected by phenolic antioxidants // J. Food Sci. 1996. - 61.V.5. - P. 1017-1020.

140. Jayme D., Price P. et al. Serum and Serum-free Cultivation of Mammalian Cells Used for Virus Production Applications. // Abstract 16th Int. Meet. Products from Cells Cells as Products. Switzerland, 25-29 April, 1999. -1999. P. 161.

141. Joshida D. et al. // Arg. Biol. Chem. 1980. - V.44. - P. 2521-2522.

142. Kalyazin E.P. Comparison of the radiation and conventional processing: Pap. 9th Int. Meet.Radiat. Process., Istanbul, 11-16 Sept., 1994. Pt 1 // Radiat. Phys. and Chem.-1995. -46, V.4-6.-P. 453-456.

143. Kole K., Lechner J., Reddel R. Human liver epithelian cell line and culture media there for. / Патент 5529920 США, МПК6 C12 N 5/06. Опубл. 1996; НКИ 435/240.2.

144. Lee Keun-Ho, Chu Chin-Chang. Gamma irradiation sterlizing of biomaterial medical devices or products, with improved degradation and mechanical propenties / Патент 5485496 США, МКИ4 G21 К 5/08. Опубл. 1996; НКИ 387 / 64.

145. Legrand С., Capiaumont J., Belleville F. Comparison of metabolism of hybridoma cells cultured in media supplemented with whey or fetal calf serum // Biotechnol. Progr. 1993. - V.6. - P. 573-579.

146. Lin Shin-Bin, Chaing Wen-Dtt, Cordle Chistopher Functional and immunological properties of casein hudrolysate produced from two stage membrane systen // J. Food Sci. -1997.- 62, V.3-P. 480-483.

147. Mac M. The adverse effects of UV and short-wavelength visible radiation on tissue culture. //Amer. Biotechnol. Lab. 1986. -4,V.4. - P. 30-31.

148. Mader Karsten, Domb Abraham / Gamma sterilization induced radicals in biodegradable drug delivery systems // 4 th Int. Symp. ESR Dosim. and Appl., Munich, May 1519, 1995: Final Programme and Book Abstr. Neuherberg, 1995. - P. 186-187.

149. Melnik I.L., Riordan. Polymelitis viryses in tissue culture iv Protein free nutrient media in stationary and roller tube cultures. // Proc. for Exp. Biol. Med. 1952.1. P. 208-213.

150. Mohler William. Effekt of Water Purity and addition of Common Water Contaminants on the growth of Cell in serum free media // Biotechnigues. - 1996. - V.2.1. P. 260-266.

151. Nakama Akihiko, Yamada Akio. Serum-free culture of human hepatome Hep-2 cells with egg yolk low densiry lipoprotein // Biosci., Biotechnol. and Biochem. 1993. - 57, V.3. - P. 410-413.

152. Neigen H., Poulsen A., Bertheussen K. Degradation of cell culture media by light // Cytotechnology. 1989. - V.2. - P. 79.

153. Ojioto E., Fernandez M., Chico E. Low-protein, serum-free medium for the cultivation of CHO cells in suspension culture. // Abstract 16th Int. Meet. Products from Cells Cells as Products. Switzerland, 25-29 April, 1999. -1999. P. 220.

154. Prise P., Gregory E. Relationship between in vitro growth promotion and biophysical and biochemical properties of the serum supplement // In vitro. 1982. - V.18.1. P. 576-577.

155. Sedmak J., Gameson P., Grossberg S. Procedurs for stabilization of interferons. // Meth. Enzym.- 1981.-V.78.-P. 591 -595.

156. Shidhaye Supriya, Damle Avanti. Decontaminationof veegum by gamma radiation // Indian J. Pharm. Sci. 1995. - 57, V.4. - P. 187-188.170

157. Sterilization and longterm aging of medical-grade UHMWPE: Pap. 9th Int. Meet.Radiat. Process., Istanbul, 11-16 Sept., 1994. Pt 1// Radiat.Phys.and Chem. 1995. - 46, V.4-6. - P. 893-896.

158. Southern I. A., Katz W. // J. Biol. Stand. 1984. - V. 12. - P. 231-232.

159. Tackzono Т., Sakato K. Agent for stimulating growth of animal cells and serum-free medium containing same. Патент 5318906 США, МКИ5 C12 N 5/00, A 61 К 35/14. Опубл. 1994; НКИ 435 /2402.

160. Takehisa М. Sterilisation with electron accelerators: Pap. Workshops Util Electron Bangkok and Jakarta, July 9 andl3,1992 // JAERI-M. 1993. - V.93-160. - P. 132-142.

161. Talrose V.L.,Trofimov V.I. Cryoradiation sterililization: Contemporary state and outlook: Pap. 9th Int. Meet.Radiat. Process., Istanbul, 11-16 Sept., 1994. Pt 1 // Radiat. Phys. and Chem. 1995. - 46, V.4 - 6. - P. 633-637.

162. Terzic-Vidojevic A., Todorovic M., Popov-Raljic J. Possibility of barley decontamination by ionizing radiation // Zb. rad./ Technol. fak., Novi sad.-1993. V.24-25. - P. 93-106.

163. Verwej. H., Dubellman T. Photodynamic protein cross linking // Biochem. Biophys. Acta. - 1981. - V.647. - P. 212 - 218.

164. Waymouth C., Ham R.G. and Chappie P. The Growth Requirements of Vertebrate Cells in Vitro. Cambridge Univ. Press. London and New York, 1981 P. 343-352.

165. Waymouth C., Ham R.G. Major ions, buffer systems, pH, osmolarity and water quality. Cambridge Univ. Press. London and New York, 1981 P. 105-107.

166. Welzenbach K., Al-Rubeai M. A rapid method for evaluation cell number and viability by flow cytometry. // Cetotechnology. 1997. - 24, V.2. - P.161-168.

167. Wayner D.D., Burton G.W., Ingold K.U // Biochim. Biophys. Asta. 1986. - VI. -P. 119-123.171

168. Weiss M. Stability data prove critical for assung biopharmaceutical shelf life. // Genet. Eng. News. 1994. - 14, V.2. - P. 10 - 27.

169. Whitby James L. Microbiological aspects relating to the choice of radiation sterilisation dose: Pap. 8th Int. Meet.Radiat. Process., Beijing, 13-18 Sept., 1992. Pt.2 // Radiat.Phys.and Chem. 1993. - 42, V.4-6.- P. 577-580.

170. Whitby James L. Radiation resistance of Acinetobacter spp: Pap. 9th Int. Meet.Radiat. Process., Istanbul, 11-16 Sept., 1994. Pt 1 // Radiat.Phys.and Chem. 1995. - 46, V.4-6. - P. 639-642.

171. Woolston J. Radiation sterilisation: A contract steriliser's view: Pap. 9th Int. Meet.Radiat. Process., Istanbul, 11-16 Sept., 1994. Pt 1// Radiat. Phys. and Chem.-1995. 46, V.4-6. - P. 587-590.

172. Wolfe R., Yeifetz A. Basal nutrient medium for cell culture. / Патент 5232848 CUIAJ, МКИ5 С 12 N 5/00. Опубл. 1993; НКИ 435 / 240.

173. Zegota H. et al // Effect of gamma irradiation on cefofaxime in the solid state // Radiat. Phys. and Chem. 1995. - 45, V.2. - P. 222-229.174122! Дата поступление ВХОДЯТ Я/т0р ||N гос.регистрац. 99105439

174. Приоритет 1 Ь ШЗ 4Ш, .Пи ¡51} МПК ?П ■ эо 2 5 МДР ¡5:

175. ЗАЯВЛЕНИЕ о выдаче патента Российской Федерации на изобретение

176. Представляя указанные ниже документы, прошу Спросим) выдать патент Российской Федерации на имя

177. В государственное патентное-ведомство Российской" Федерации, 121853,Москва, Береж ковская наб., 30, к,10 91. ФИПС

178. Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор"171! Заявитель:

179. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИДКИХ СТЕРИЛЬНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД НА ОСНОВЕ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ ГИДРОЛИЗАТОВдд| Адрес для переписки (полный почтовый "адрес633159, Новосибирская обл., Новосибирский р-н, пгт.Кольцово, ГНДВБ "Вектор", патентный отделу Мстюрину Ю.Н.

180. Телефон: (383-2)-366634 Твлвйс." 133106 'МРО 30 Факс: (383-2) 328831174

181. Патентный поверенный (полное имя, регистрационный номер)1. Телефон:1. Телекс:1. Факс:

182. Продолжение на следующем листеV

183. МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (Минсельхозпрод России)1. ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ107139,Москва,Орликов пер.,1/11 Для телеграмм:Москва 84 Минсельхоз Телетайп: 417738 ЛЕН23.QI.98r. ц 13-7-2Д156на N

184. ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ по применению среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной (в порядке широкого производственного испытания в 19931999 гг.)1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

185. Препарат представляет собой тонкодисперсный гигроскопичный порошок от белого до светло-кремового (ФГМС, ГБКС)} или белого цвета с желтоватым или розоватым оттенком (ГСБМ, ГЛА), со слабым специфическим запахом, с массовой долей влаги не более 3%177

186. УТВЕРЖДАЮ Заместитель начальника178и полностью растворим в деминерализованной (дистиллированной) воде в течение не более 20 минут. Препарат рассчитан на изготовление 400 см3 жидкой формы среды питательной на основе гидролизатов

187. Препарат пригоден к применению в течение двух лет со дня изготвления при условии хранения в сухом темном месте при температуре (4-10)°С и относительной влажности не более 85%.

188. При отсутствии маркировки (этикеток), нарушении целостности флаконов, изменении цвета и консистенции содержимого, наличии хлопьев и посторонних примесей препарат бракуют.2.БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

189. Жидкая форма среды питательной стерильной на основе гидролизатов нетоксична и обладает выраженными ростостимулирующи-ми свойствами в отношении широкого спектра первичных и перевиваемых культур клеток.3. ПРИМЕНЕНИЕ ПРЕПАРАТА

190. Комплект среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной растворяют в 0,4 л стерильной деминерализованной воды с электропроводностью не более 0,5 мксим во флаконе вместимостью 0,5 л и герметически укупоривают резиновой пробкой.

191. Одобрено Советом по ветеринарным препаратам 9 октября 1997 года (протокол N0 4).1. N 000539-ОП)лоусов1. УТВЕРЖДАЮпроизводственного ис ой средысухой стерильной на основе гидролизата (ПССГ)

192. У КК)П. Шкабура '/-<-Р 199 '7—биокомбинатаг.

193. Контроль серий вакцины проведен в ОБТК Омского биокомбината. Результаты проведенных испытаний суммированны в таблицах 1, 2 и 3.

194. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ СУХОЙ СТЕРИЛЬНОЙ НА ОСНОВЕ ГИДР0ЛИЗАТ0В ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ПЕРВИЧНЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК

195. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПЕРВИЧНЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК, ВЫРАЩЕННЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД СУХИХ СТЕРИЛЬНЫХ НА ОСНОВЕ ГИДР0ЛИЗАТ0В К ПРОИЗВОДСТВЕННЫМ ШТАММАМ ВИРУСОВ1. УТВЕРЖДАЮ

196. Заместитель директора СКЗНИВИ по^/научной работе-4иРский1997 г.иЩущШШ Иt '=;^ ivCii-W ;;>'' i1. АКТуиспытания "Среды питательной сухой стерильной на основегидролизатов (ПССГ)"п

197. Изготовление жидкой формы ПССГ, получение и выращивание культуры клеток ПЭК и культивирования вирусов проводили в соответствии с требованиями НТД. Результаты испытаний суммированы в таблицах 1 и 2.

Информация о работе

Богрянцева, Марина Поликарповна
кандидата биологических наук
Кольцово, 1999
ВАК 03.00.23

Диссертация

Технология изготовления и свойства питательной среды сухой стерильной на основе гидролизатов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы