Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии производства и методов контроля препаратов для культур клеток в сухой стерильной форме

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии производства и методов контроля препаратов для культур клеток в сухой стерильной форме"

На правах рукописи

Трошкова Галина Павловна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА И МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК В СУХОЙ СТЕРИЛЬНОЙ ФОРМЕ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Кольцове - 2004

Работа выполнена в НИИ клеточных культур Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор».

Научный консультант

доктор биологических наук, профессор Ночевный В.Т.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Офицеров В.И. доктор биологических наук Гуляева Л.Ф. заслуженный деятель науки РФ,

доктор биологических наук, профессор Дьяконов Л.П. Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности (п/о Кашинцево Щелковского района Московской области, 141142).

Защита диссертации состоится 27 августа, 2004 г. в 900 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ РФ по адресу: ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцове Новосибирской области, 630559. тел.(3832)367428

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ «Вектор». Автореферат разослан << О, "¡чССНХЛЛ 2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние два десятилетия стремительно развиваются не только научные исследования в области клеточной биотехнологии, но и практически осуществился переход к крупномасштабному культивированию клеточных культур, на которых базируется производство разнообразных по назначению биологически активных препаратов медицинского, пищевого и сельскохозяйственного назначения. Постоянно возрастающие масштабы производства клеток-продуцентов для создания новых биопрепаратов вызвали необходимость разработки экономичных и доступных питательных сред (ПС)*, белковых гидролизатов, солевых и диспергирующих растворов

Обеспечение потребности в синтетических и гидролизатных ПС до недавнею времени осуществлялось за счет производства жидких стерильных сред или их 10-кратных концентратов, имеющих срок годности, как правило, не более 6 или 12 мес. Широко используемые в вирусологической практике растворы трипсина имеют регламентированный срок хранения при температуре (6±2) °С - 6 мес , а при температуре минус (15±5) °С - 12 мес. При этом многократные процессы замораживания и оттаивания фермента недоп>стимы, так как существенно снижают его активность

Недостатками жидкой формы препаратов для культур клеток являются нестабильность при положительных температурах, ограниченный срок годности, значительные затраты при транспортировке и хранении

Альтернативой жидкой формы ПС может стать их сухая стерильная форма Сухая стерильная форма ПС имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с жидкой продолжительный срок годности, возможность производства больших объемов препарата одной серии, возможность быстрого приготовления жидкой стерильной среды без применения дорогостоящих оборудования и расходных материалов для .терилизующей фильтрации, значительное сокращение расходов на хранение и транспортировку. Поэтому разработка технологии производства ПС, солевых буферных систем, белковых гидролизатов, ферментов для культур клеток в сухой стерильной форме является актуальной и отвечает потребностям дальнейшего развития клеточной биотехнологии

Следует также отметить, что в России метод получения сухих стерильных ПС на основе индивидуальных компонентов, предложенный Сперанской ИД. (1977), а также исследования по изготовлению сухих стандартных образцов - референс-препаратов ПС на основе белковых гидролизатов (Башашкина Н А.. 1994) не вышли за рамки лабораторного изучения.

* Список сокращений приведен на с. 43.

Вопросы производства ПС представлены в трудах отечественных и зарубежных ученых: Сперанская ИД, 1979; Дьяконов Л.П., 1984, 2000; ЕрмишинаИГ, 1989, 1996; Коренева АИ., ПригодаАС, 1991, 1996; Камший Л.П., 1991; Башашкина НА., 1994; Eagle Н, 1959, 1962; Dulbecco R., 1954; Hayhlik L., 1964; Sato G., 1979; Patterson M.K., Ham R.G. 1982; Moore G.E., 1994; Hesse F., 2001 и др. Однако, несмотря на многочисленные имеющиеся публикации, практически отсутствуют данные по промышленному производству сухих стерильных вирусологических ПС.

Решение задач промышленного получения культур клеток потребовало научного

г

обоснования и разработки технологии промышленного производства препаратов для культур клеток в сухой стерильной форме. Важным направлением при разработке вирусологических питательных сред является конструирование ПС на основе белковых гидролизатов, а также конструирование бессывороточных и малосывороточньгх ПС. При этом особое значение приобретают вопросы стандартизации ПС, что требует комплексного подхода к оценке их качества и разработке эффективных методов контроля.

Цель и задачи исследований. Цель исследований - разработка технологии производства и методов контроля качества сухих стерильных форм синтетических и гидролизатных ПС, солевых буферных систем, трипсина квалификации "для культур клеток" и их апробация при получении первичных и перевиваемых культур клеток и культивировании вирусов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- определить общие требования к качеству исходных ингредиентов, пригодных для изготовления сухих стерильных препаратов квалификации "для культур клеток";

- разработать технологию изготовления сухой стерильной формы ПС на основе индивидуальных аминокислот и витаминов и на основе белковых гидролизатов, а также технологию получения трипсина сухого стерильного (ТСС) для культур клеток;

- подобрать оптимальные условия радиационной стерилизации сухих ПС, гидролизатов, трипсина, солевых буферных композиций;

- определить оптимальные условия и сроки хранения, а также возможные причины снижения качества сухих стерильных препаратов;

- апробировать сухие стерильные формы ПС и ТСС для производства первичных и перевиваемых культур клеток и наработки вирусов;

- конструировать и испытать сухие стерильные бессывороточные и малосывороточные ПС;

- разработать методы качественного и количественного контроля ПС;

содержащихся в ПС, на пролиферацию

- оценить экономическую целесообразность производства и применения сухих стерильных форм ПС и ТСС в вирусологической практике,

- разработать НТД на изготовление, контроль и применение сухих стерильных ПС и ТСС квалификации "для культур клеток".

Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые:

- получены научно обоснованные данные, положенные в основу разработки опытно-промышленной технологии производства сухих стерильных форм синтетических и гидролизатных ПС, а также протеолитического фермента трипсина, отвечающих требованиям квалификации "для культур клеток";

- экспериментально обоснованы условия электронно-лучевой стерилизации сухих форм препаратов для производства культур клеток;

- определены оптимальные условия и сроки хранения сухих стерильных форм ПС и трипсина;

- доказана пригодность и перспективность применения разработанных сухих форм препаратов для производства широкого спектра первичных и перевиваемых культур клеток и вирусов;

- сконструированы сухие стерильные бессывороточные и малосывороточные синтетические ПС и ПС на основе белковых гидролизатов;

показана возможность оценки стандартности гидролизатных ПС спектрофотометрическим методом; отработаны методы контроля и определены предельно допустимые показатели качества сухих стерильных препаратов;

- продемонстрирована применимость разработанных автором химико-атомно-эмиссионных методов для серийного анализа промышленных образцов сыворотки крови (СК) животных, используемых в биотехнологии;

Приоритет и новизна научных разработок диссертации защищены 5 патентами РФ (№2084523, №2107724, №2142503, №2161549, №2201958).

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены в производство следующие технологии:

- технология производства в сухой стерильной форме ПС на основе индивидуальных аминокислот и витаминов;

- технология производства в сухой стерильной форме ПС на основе белковых гидролизатов;

- технология производства ТСС для культур клеток.

Разработаны экспресс-метод оценки качества гидролизатных ПС и унифицированные методики химико-атомно-эмиссионного определения микроэлементов вСК.

Обоснована экономическая и практическая перспективность применения сухих стерильных форм препаратов для вирусологической практики. По результатам работы подготовлены и утверждены в >становленном порядке 18 нормативно-технических документов. Для вирусологической практики предложено 10 видов коммерческих препаратов в сухой стерильной форме:

питательная среда Игла сухая стерильная; питательная среда 199М сухая стерильная; питательная среда RPMI-1640 сухая стерильная; питательная среда МЕМ-4 сухая стерильная;

питательная среда для культивирования лимфоцитов крови сухая стерильная; среда питательная на основе ферментативного гидролизата мышечных белков сухая стерильная;

среда питательная на основе ферментативного гидролизата белков сыворотки молока сухая стерильная;

среда питательная на основе ферментативного гидролизата белков крови сухая стерильная;

среда питательная на основе ферментативного гидролизата лактальбумина сухая стерильная;

трипсин сухой стерильный для культур клеток.

Апробация работы. Основные результаты доложены и получили положительную оценку на Всесоюзной конференции по актуальным вопросам разработки препаратов медицинской биотехнологии (Махачкала, 1990 г.); III Всесоюзном совещании по культивированию клеток животных и человека (Пущино, 1990 г.); VII Европейской конференции по аналитической химии (Вена, Австрия, 1990 г.); XI Международной конференции по аналитической атомной спектроскопии (Москва, 1990 г.); Всесоюзной конференции по питательным средам и сывороткам для культивирования клеток (Новосибирск, 1991 г.); Международной конференции по медицинской биотехнологии (Ленинград, 1991 г.); II, V, VII Симпозиумах «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 1995 г., 1998 г., 2000 г.); конференции «Перспективы развития производства биопрепаратов для медицины и сельского хозяйства» (Степногорск, 1995 г.); Всероссийской конференции «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 1996 г., 2000 г.); конференции «Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротестсистем» (Махачкала, 1998 г., 2001 г.); VII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2000 г.); VII, VIII, IX, X, XI международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Гурзуф,

1999 г., 2000 г., 2001 г., 2002 г., 2003 г.), I и II Международных конгрессах "Биотехнология - состояние и перспективы развития" (Москва, 2002 г., 2003 г.); Международной конференции "Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине" (Москва, 2003 г.).

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту. По результатам выполненных исследований на защиту выносятся следующие положения:

промышленная технология производства сухих стерильных форм ПС и трипсина квалификации «для культур клеток»;

результаты изучения электронно-лучевой стерилизации сухих ПС, белковых гидролизатов, трипсина, солевых буферных композиций;

технология изготовления сухих стерильных бессывороточных и малосывороточных ПС для культур клеток;

спектрофотометрический экспресс-метод оценки качества ПС на основе белковых гидролизатов;

методические разработки по химико-атомно-эмиссионному определению МЭ в СК; результаты изучения концентрационных зависимостей влияния МЭ на пролиферацию клеточных культур;

экспериментальное обоснование целесообразности и перспективности применения сухих стерильных форм ПС и ТСС для производства широкого спектра первичных и перевиваемых культур клеток и вирусов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 57 печатных работ, в том числе 5 патентов.

Основная часть результатов получена автором самостоятельно, а также при участии аспирантов Величко А.В. и Богрянцевой М П. Вклад в работу других авторов отражен в публикациях по теме диссертации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 257 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы, включающий 346 наименований, приложения. Данные экспериментов представлены в 54 таблицах и 24 рисунках. Приложения к диссертации в объеме 48 с. содержат титульные листы документации, подтверждающие диссертационный материал.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В исследованиях применялись следующие вирусологические питательные среды

производства ГНЦ ВБ "Вектор":

ПС жидкие стерильные: RPMM640 по ФС 42-3628-98. Игла по ФС 42-3503-98, Игла MEM по ФС 42-3540-98, 199М по ФС 42-3500-98, Грейса (ICN), питательные среды ПС-1 и ПС-4 для культивирования клеток ВНК-21, ПС-3 для клеток ЛЭЧ.

Для приготовления i идролизатных ПС использовали следующие ферментативные гидролизаты: гидролизат белков сыворотки молока (ГСБМ) по ТУ 10.07.44-90, гидролизат мышечных белков (ФГМ-С) по ТУ 461220-80, гидролизат белков крови (ГБК-С) по ТУ 10.09-137-91 и гидролизат лактальбумина(ГЛА) фирмы «Difco».

Сыворотки крови

Сыворотка крови КРС по ФС 42-3410-97, сыворотка крови плодов коровы по ФС 42-3368-97, сыворотка крови КРС, обработанная полиэтиленгликолем (Методические рекомендации по очистке сыворотки КРС, 1982).

Культуры клеток

Перевиваемые линии клеток.

В работе использовали паспортизованные клеточные культуры, полученные из музея клеточных культур ГНЦ ВБ «Вектор»: перевиваемые линии клеток эпидермоидной карциномы гортани человека (Нер-2), почки африканской зеленой мартышки (Vero, 4647), почки сирийского хомячка (ВНК-21), лимфомы Беркитта (Namalwa), карциномы шейки матки (Hela), эпидермоидной карциномы ротовой полости (KB), почки собаки (MDCK), яичников непарного шелкопряда Limantria dispar L. (SCLD-135), почки теленка (MDBK), почки эмбриона свиньи (СПЭВ), диплоидная культура легкого эмбриона человека (ДК-58).

Культивирование клеток проводили в течение 5-ти последовательных пассажей с 3-4 дневным циклом при посевной дозе в каждом пассаже 100 - 200 тыс.кл./мл. После 5-го пассажа осуществляли оценку морфологических характеристик, подсчет среднего значения индекса пролиферации (ИП) и количество жизнеспособных клеток.

Получение первичных культур клеток

Первичные культуры клеток (ФЭК, ПЭК, ПЭС, ТБ, ПК, ПЩ) получали по общепринятым методикам обработкой 0,25 %-ным раствором препарата ТСС животной ткани до полного ее «истощения».

Эффективность дезагрегации ткани оценивали по выходу клеток из 1 г ткани. Ростовые свойства клеток оценивали по их адгезионной способности, сроку формирования монослоя, урожаю клеток (УК), ИП и морфологии монослойной культуры.

Доноры ткани

Донорами ткани служили 3-9 месячные эмбрионы коров, 2-3 месячные эмбрионы свиней, бычки 4-6 месячного возраста, 1 - 4 недельные крольчата, 1 - 2 месячные щенки, а также 7-12 дневные куриные эмбрионы.

Микроорганизмы

Toxoplasma eondii

Toxoplasma gondii (штамм Rh) поддерживали путем пассажей на беспородных мышах (питомник ГНЦ ВБ "Вектор") при внутрибрюшинном введении. Для выращивания препаративных количеств тахизоитов токсоплазм использовали монослой культуры клеток Vero.

Вирусы

В работе использовали вирусы простого герпеса 1-го типа (ВПГ-1), (штамм Ленинград 3\248\88), краснухи (штамм П-1965), болезни Ауески (штамм БУК-628), инфекционного ринотрахеита (штамм Оренбург), парагриппа-3 (штамм MBA 1/77) и трансмиссивного гастроэнтерита свиней (штамм ВГНКИ). Штаммы поддерживали и титровали на наиболее чувствительных к вирусам тест-культурах клеток. Доза и способ заражения, сроки культивирования были общепринятыми.

Ростстнмулирующие белки (РБ)

Образцы РБ сыворотки крови свиней и КРС получены в лаборатории клеточных культур Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН. Фракционный состав РБ сыворотки крови свиней и КРС: альбумина - 80,8 и 60,0 %; а- глобулина - 6,2 и 17,0 %; ß-глобулина - 13,0 и 20,0 %; у-глобулина - 0 и 3,0 % соответственно (Р.Я. Подчерняева, 1994).

Трипсин

В работе использовали сухие нестерильные препараты трипсина производства фирм «Ferak», «Serva» (Германия), «Difco» (США), а также производства ВНИиТИБП по ТУ 10.07.194-91, Ленинградского химико-фармацевтического института и Рижского мясоконсервного комбината по ТУ ОКП 921.828.1500 РСТ, Латвия.

Контроль трипсина сухого для вирусологических целей. Оценку внешнего вида, цвета и запаха проводили органолептически по ГОСТ 202641-89. Определение массовой доли влаги проводили в соответствии с требованиями ГОСТ 24061-89. Растворимость сухого трипсина определяли по ТУ 10.07.194-91. Определение протеолитической активности трипсина проводили по методу Шоу-Петиколас (В.Т. Ночевный, 1991, Н.А. Башашкина, 1994).

Приготовление сухих стерильных питательных сред

Для изготовления синтетических ПС использовали аминокислоты и витамины, производимые фирмами «ICN», «Sigma», «Gibco», «Difco» (США), «Serva» (Германия).

Дня приготовления сухой буферной основы раствора Хенкса, содержащей неорганические соли, глюкозу, феноловый красный,- использовали реактивы квалификации «хч».

Для изучения процессов дегидратации неорганических солей и определения оптимальных температур высушивания использовали метод термогравиметрии.

Термогравиметрические исследования проводили на дериватографе Q-1500D (Венгрия) в следующих условиях: навеска вещества - 100 мг, температура нагрева образца от 20 до 500 °С, скорость нагрева - 5 °С/мин.

Высушивание неорганических солей проводили в сушильно-стерилизационных шкафах типа ШСС-80п.

Измельчение и смешение сухих компонентов ПС проводили в шаровых мельницах барабанного типа, материал мельниц - фарфор. Использовали шаровые мельницы типа КМ фирмы "ERWEKA" (Германия), ЛЕ фирмы "Labor" (Венгрия) с объемом барабана 5 л, а также мельницы типа МШК-50М (Россия) с объемом барабана 50 л. Скорость вращения барабана и продолжительность измельчения определяли экспериментальным путем.

Стерилизацию СУХИХ ПС и трипсина проводили на промышленном ускорителе электронов ИЛУ-6 в Институте ядерной физики СО РАН со следующими параметрами пучка электронов: энергия пучка электронов - 2,15 - 2,20 МэВ, ток пучка импульсный -(0Д2±0,01) А, частота следования импульсов - 6 Гц, длительность импульсов - 500 мкс.

Физико-химический контроль сухих стерильных питательных' сред

осуществляли в соответствии с требованиями «Методических рекомендаций по контролю качества вирусологических питательных сред».

Контроль биологических свойств вирусологических ПС предусматривает определение их ростовой активности и токсического действия на клетки.

Оценку ростовой активности ПС проводили по индексам пролиферации клеточной культуры и скорости формирования монослоя путем пассирования тест-культуры клеток на испытуемой и контрольной средах в течение пяти последовательных пассажей.

Токсическое действие ПС оценивали по состоянию клеточного монослоя клеточной линии и структуре образующих ее клеток на протяжении всего срока культивирования.

Определение стерильности препаратов

Стерильность ПС и трипсина определяли в соответствии с ГФ XI вып. 2, с. 187 методом прямого посева на тиогликолевую среду.

, Контроль на отсутствие микоплазм

Контроль на отсутствие микоплазм осуществляли в соответствии с методическими указаниями МУК 4.1 У4.2.588-96.

Электронные спектры поглощения. (ЭСП) вирусологических ПС регистрировали на спектрофотометре «Спекорд М40» фирмы «Карл Цейс» (Германия) в

диапазоне длин волн от 200 до 900 нм. Использовали кварцевые УФ-микрокюветы: для синтетических ПС - типа ES-10, для гидролизатных сред - типа ES-2.

Спектры электронного парамагнитного резонанса ПС записывали на ЭПР-спектрометре Е-109 фирмы «Varian» (США) в Институте Неорганической химии СО РАН. В качестве стандартного образца использовали дифенилпикрилгидразил (1,53-10J1 неспаренных электронов на 1 г вещества). Количество свободных радикалов в образцах ТСС определяли на том же спектрометре относительно навески CuSCVSHjO (1017 ионов Си3')

Аминокислотный состав • исследуемых ПС определяли на аминокислотном анализаторе LC 5001 фирмы "Biotronic" (Германия). Пики аминокислот регистрировали в области 570 нм (для L-пролина в области 440 нм)

Для определения сроков годности сухих стерильных ПС и ТСС был применен метод «ускоренного старения» при повышенных температурах (Инструкция И-42-2-82, М, 1983).

При разработке атомно-эмиссионных спектральных методов анализа СК использовали реактивы квалификации не ниже «хч».

Для проведения спектрального анализа использовали кварцевый спектрограф ИСП-28 и спектрограф PGS-2 с фотографической и электронной регистрацией спектра, микрофотометр МФ-2, атомно-абсорбционный спектрофотометр фирмы «Perkin-Elmen>, модель 603 (США)

Статистическая обработка результатов - исследований проведена общепринятыми методами (ГОСТ 8.207-76, МалетаЮС, 1981).

3 РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Разработка технологии приготовления сухой формы синтетических питательных сред

Производство ПС в сухой стерильной форме представляет собой сложную многооперационную технологию, включающую последовательные процессы предварительного отбора и подготовки исходных компонентов, дальнейшего их измельчения и смешивания, фасовки и радиационной стерилизации, контроля пригодности готового препарата для культивирования клеток и вирусов. Изучение и оптимизация этих процессов были необходимы при разработке технологии изготовления сухих стерильных ПС как на основе индивидуальных аминокислот и витаминов, так и на основе белковых гидролизатов, а также трипсина сухого стерильного квалификации «для культур клеток».

Сушка исходных компонентов. Сухая ПС должна представлять собой однородный порошок с определенной влажностью и насыпной плотностью, растворяться в воде без проявления опалесценции или образования осадка, иметь длительные сроки хранения при оптимальных условиях. Успех получения однородных порошковых смесей зависит от влажности исходных компонентов. Поэтому перед измельчением-смешиванием -необходимо удалить излишнюю влагу.

Для обоснования температурных режимов высушивания, позволяющих удалить как кристаллизованную влагу, так и свободную, и вместе с тем избежать нежелательного ухудшения качества компонентов, нами проведено их термогравиметрическое изучение, определена температура, при которой начинается потеря массы образца.

В результате исследований выбраны температурные и временные режимы, позволяющие проводить предварительную сушку неорганических солен, основных источников влаги в ПС, в достаточно короткое время (не более 2 сут 1. Высушенные соли практически не содержат кристаллогидратной воды и могут быть использованы для изготовления сухих форм ПС, а также буферных солевых порошков. При этом, учитывая наличие операции обезвоживания готовой порошковой композиции ПС, исключается необходимость тщательного высушивания других компонентов среды (аминокислоты, витамины, феноловый красный).

Приготовление порошковых композиций питательных сред. Для приготовления сухой порошковой композиции ПС исследован процесс измельчения-смешивания многокомпонентных смесей (до 100 наименований компонентов), входящих в состав ПС в количествах от нескольких миллиграммов (витамины, факторы роста) до нескольких десятков килограммов (неорганические соли, глюкоза). Измельчение компонентов (промышленная партия, рассчитанная на 2 - 5 тонн жидкой питательной среды) проводили в шаровой мельнице барабанного типа, получая сухую композицию среды в виде тонкодисперсного порошка (размер частиц до 0,075 мм).

Определены последовательность смешивания - компонентов и режим их измельчения, позволяющие в итоге получить однородную смесь со стандартными физико-химическими - показателями качества Суммарная продолжительность измельчения составила (4,0±0,2) ч при скорости вращения барабана шаровой мельницы -(85+10) об /мин. Массовая доля влаги порошковой композиции питательной среды после стадии помола-смешивания исходных компонентов не превышала 3,0 - 3,5 %

Контактно-адсорбционное обезвоживание. С целью снижения остаточной влажности порошковой смеси ПС и доведения ее значений до 1 - 2 % был использован метод контактно-сорбционного обезвоживания.

При использовании данного метода удаление влаги происходит за счет контактно-сорбционного массообмена с превалирующим влиянием поверхностной сорбции (адсорбции) и определяется поглотительной способностью сорбента, оптимальным временем контакта обезвоживаемого материала с сорбентом, поверхностью сорбции. Принципиально важно, что при этом не требуется нагрев высушиваемого материала для испарения влаги, что в результате предотвращает разрушение термолабильных компонентов ПС. Метод позволяет производить обезвоживание порошковой композиции ПС при комнатной температуре.

На основе анализа изотерм сорбции водяного пара по величине относительной влагоемкости проведена сравнительная оценка поглотительной способности ряда веществ гпСЬ, СиЭО.!, СаСЬ, цеолиты, силикагель), которые могли бы быть рекомендованы в качестве сорбентов при контактно-адсорбционном обезвоживании ПС. При выборе оптимального варианта сорбента помимо сорбционной активности учитывали его физико-химические свойства, характеризующие соответствие сорбента рецептуре высушиваемой ПС. Поэтому в качестве сорбента остаточной влаги порошковой композиции ПС был выбран гранулированный кальций хлористый. Использование многослойной структуры «обезвоживаемая ПС - сорбент» позволило обеспечить непосредственный контакт ПС с сорбентом, чередование слоев ПС и сорбента, а также значительно увеличить поверхность контакта. Контроль содержания кальция в ПС до и после стадии контактно-адсорбционного обезвоживания проводили атомно-абсорбционным методом, при этом достоверного различия в содержании кальция обнаружено не было.

Использование контактно-адсорбционного обезвоживания позволило получить порошковую композицию ПС с остаточной влажностью от 1,5 до 1,0 % в течение (48±2) ч. За счет периодического обновления сорбента можно повысить скорость сорбционного обезвоживания с учетом кинетики сорбции примерно в 2 - 3 раза.

Таким образом, разделение процесса сушки на 2 стадии (предварительная сушка солей и контактно-адсорбционное обезвоживание порошковой композиции ПС) позволило сократить время сушки суммарно для двух стадий с 45 до 4,5 сут. При этом массовая доля влаги порошковой композиции ПС после, стадии контактно-адсорбционного обезвоживания не превышала 1,5 %.

Фасовка сухой питательной среды. После контактно-адсорбционного обезвоживания сухую ПС фасовали (использовали весовой метод дозирования) в стеклянные флаконы ФО-1-10 (из расчета приготовления 0,5 л жидкой. среды) и герметично укупоривали. Бикарбонат натрия фасовали в отдельные флаконы, поскольку его присутствие в составе ПС и последующая радиационная стерилизация приводят к увеличению рН раствора сухой стерильной среды до 7,8 ед. рН, что недопустимо для

ростовых сред Для достижения необходимого значения рН можно уменьшить концентрацию бикарбоната натрия в среде, однако при этом заметно снижается буферная емкость ПС. Предложенное нами разделение- порошковой композиции среды и бикарбоната натрия по отдельным флаконам позволило оставить оптимальное содержание бикарбоната натрия в ПС без изменения ее буферной емкости.

ПС сухая стерильная выпускается в комплекте, состоящем из двух флаконов: 1 флакон ФО-1-10, содержащий питательную среду, и 1 флакон ФО-1-10 с бикарбонатом натрия. Комплект рассчитан на приготовление 0,5 л жидкой среды.

Наработка опытных партий сухих стерильных питательных сред. С целью оптимизации условий и отработки технологии получения сухих стерильных ПС были изготовлены 14 серий среды Игла, 18 серий - 199М, 6 серий - МЕМ-4, 6 серий -RPMI-1640. Каждая серия состояла из 400 флаконов среды. Все серии ПС в сухой стерильной форме, произведенные по разработанной технологии, имели массовую долю влаги не более 1,5 %, растворялись в очищенной воде в течение 4-15 мин, показатели рН, буферной емкости, а также биологические показатели (стерильность и специфическая активность) отвечали требованиям соответствующих ФС (табл. 1).

Изучение сроков годности сухих стерильных синтетических ПС. Одним из важнейших для вирусологической практики является вопрос о сроках и условиях хранения препаратов. Разработка ПС и растворов в сухой стерильной форме обусловлена, прежде всего, термолабильностью и ограниченными сроками хранения их жидких форм.

Для определения сроков годности сухих стерильных ПС был применен метод «ускоренного старения» при повышенных температурах.

Разработанные нами сухие стерильные ПС выдерживали при температуре (80±2) °С в течение от 0 до 30 сут., отбирая пробы через каждые сутки хранения. Далее на основе отобранных термообработанных и контрольных (хранящихся при температуре 20 °С) образцов сухих ПС путем растворения их в стерильной очищенной воде готовили жидкие среды.

Возможные изменения качества ПС в процессе термообработки контролировали, используя спектрофотометрический экспресс-метод оценки качества ПС. Регистрацию электронных спектров поглощения" термообработанных и контрольных' образцов, сопоставление величин их оптической плотности проводили для сред Игла, Игла MEM, МЕМ-4, 199М. Полученные результаты показали, что достоверные изменения качества ПС наблюдались через 30 сут. термоинактивации среды при температуре (80±2) °С, что соответствует 5 г. 3 мес. хранения при температуре 20 °С.

Известно, что хранение микробиологических ПС с влажностью выше критических точек приводит к необратимым изменениям входящих 'в их состав ингредиентов и

Таблица 1

Физико-химические и биологические показатели качества партий сухих питательных сред

Наименование Номер Физико-химические характеристики Биоюгичсские показатели

среды серии Растворимость, рн. Б) ферная емкость. Массовая доли Тип клеток Индекс Стерильность

ыкн едрН мл влага, % пролиферации

клеток на 5-ом

пассаже *

Игла б 3-8 7,2 2,0 1,4 ДК-58 2,2 Стерильна

8 8-10 7,4 2.1 1.1 Тоже 2,2 Тоже

10 5-8 7,4 2,0 1,5 2,3

Требование ФС Не более 15 7,3±0,2 Не ниже 1,7 Не более 1,5 Не ниже 2 Должна быть

42-347ВС-90 стерильна

МЕМ-4 1 4-5 7,5 3,2 м Катала 5,8 Стерильна

2 5-8 7.9 3,1 1.4 Тоже 5,2 Тоже

5 5-8 7.4 3.6 1.5 3.3

Требование ФС Не более 15 7,7±0,3 Не ниже 3,0 Не более 1,5 Не ниже 2,0 Должна быть

42-Э51ВС-90 стерильна

ЯРМ1-1640 1 4-5 8,0 3,3 1,5 №та1»а 7,2 Стерильна

3 5-8 7,9 3,0 1,4 Тоже 7,4 Тоже

4 5-8 7,7 3,5 1,5 7,3

Требование ФС Не более 15 7,8±0,2 Не ниже 2,0 Не более 1,5 Не ниже 2,0 Должна быть

42-350ВС-90 стерильна

199М 7 10-15 7.3 1,9 1.5 Нер-2 4,2 Стерильна

13 10-15 7.1 2,2 1.5 Тоже 4,0 Тоже

18 10-15 7,5 2,5 1.5 4,5

Требование ФС Не более 15 ?,3±0,2 Не ниже 1,7 Не более 1,5 Не ниже 4,0 Должна бить

42-346ВС-90 стерильна

Примечание

Приведено среднее арифметическое значение (п=3)

Среднее квадратическое отклонение средней арифметической во всех экспериментах не превышало 0,2

ухудшению качества ПС. Поэтому нами проведено изучение влияния остаточной влажности сухих форм вирусологических ПС на их стабильность при хранении.

В этих экспериментах образцы сухой стерильной ПС RPMI-1640 с остаточной влажностью 1.5 %; 3 %; 5 % подвергались термообработке при температуре (80 ± 2) °С в течение 30 сут. Спектрофотометрическим экспресс-методом показано, что для ПС RPMI-1640 с остаточной влажностью 1,5 % рассчитанный срок годности составляет 5 лет и 3 мес. При повышении остаточной влажности до 3 % срок годности снижается до 2 лет 10 мес, а при остаточной влажности 5 % - до 2 лет 1 мес. Результаты традиционного биологического метода контроля качества ПС подтверждают данные, полученные спектрофотометрическим методом (табл.2).

Таблица 2

Ростовая активность сухих питательных сред различной влажности в зависимости _от сроков хранения_

Наименование питательной среды Влажность среды, % Индекс пролиферации (ИП) клеточных культур после 5 пассажа (M±SM)

Время термообработки, т^ (соответствующий срок хранения при t=20 °С)

V (1, 5же) 12^, (2г 1«Л 16^, (2,10^ 30 с (5^3««)

RPMI-1640 1,5 4,4±0,2 4.2±0,2 4,2±0,2 4,2±0,2 4,0±0,2 2,4±0,2

3,0 4,4±0,2 4,0±0,2 4.0±0,2 4,0±0,2 1,6±0,2 и.о.".

5,0 4,4±0,2 4,0±0,2 4,0±0,2 2,2±0,2 • - н 0.

199М 4,3+0,2 4,2±0,2 4,3 ±0,2 4,2±0,2 4,2±0,2 3,6±0,2

3,0 4,2+0,2 4,2±0,2 4.2±0,2 4,1 ±0,2 2,4±0,2 —

5,0 4,1 ±0,2 4,1 ±0,2 4,0±0,2 2,3 ±0,2 — но.

Игла MEM 14 2,3±0,2Ч 2,310,2 2,2±0,2 2,1 ±0,2 2,1+0,2 1,7±0,2

3,0 2,2±0,2 2,1 ±0,2 2,1 ±0,2 2,0±0,2 1,3 ±0,2 н о.

5,0 2,2±0,2 212±0,2 2,0±0,2 1.2±0,3 — и.о.

Примечание.

* • отсутствие пролиферации или гибель культуры ** - не определяли

Для оценки ростовой активности сред RPMI-1640, 199M, Игла MEM использовали клеточные культуры Namalwa, Нер-2, ДК-58 соответственно.

Таким образом, полученные- данные свидетельствуют о существенном влиянии • влажности на стабильность сухих стерильных ПС при хранении. Оптимальные показатели остаточной влажности для синтетических ПС не должны превышать 1,5 %.

Для подтверждения прогнозируемых сроков хранения образцы сухих стерильных ПС Игла, МЕМ-4, RPMI-1640,199M были заложены на хранение на 5 лет при температуре 20 °С Качество ПС через 5 лет хранения оценивали по всем физико-химическим и биологическим показателям, предусмотренным ФС. Анализ результатов контроля исследуемых сред через 5 лет хранения подтвердил соответствие их качества всем требованиям соответствующих ФС.

Таким образом, в результате исследования разработана технология изготовления сухих стерильных форм синтетических ПС, включающая:

• отбор и входной контроль исходных компонентов препаратов на соответствие требованиям нормативной документации;

• высушивание и изготовление смеси компонентов;

• раздельную фасовку, укупорку и этикетирование сухой порошковой композиции синтетической ПС и бикарбоната натрия;

• стерилизацию облучением ускоренными электронами.

Разработанная технология производства сухих стерильных ПС защищена патентом РФ № 208444523 "Способ получения сухих стерильных питательных сред для культур клеток". Отличительными признаками предложенного способа являются: режимы высушивания солей до остаточной влажности не более 3 %, оптимизированные на основе их термогравиметрических характеристик; разделение процесса сушки на 2 стадии (предварительная сушка солей и контактно-адсорбционное обезвоживание порошковой композиции питательной среды), позволяющее сократить время сушки суммарно для двух стадий до 4,5 сут. (массовая доля влаги порошковой композиции ПС после стадии контактно-адсорбционного обезвоживания не более 1,5 %); использование метода электронно-лучевой стерилизации.

Разработанная технология обеспечивает удешевление и упрощение способа, сокращает потери дорогостоящих компонентов, увеличивает производительность и безопасность стерилизации, позволяет получать большие количества стандартных ПС одной серии.

На основании проведенных исследований разработан и утвержден в установленном порядке производственный регламент ПР № 279-90 «Питательная среда Ипа стерильная сухая. Питательная среда 199М стерильная сухая. Питательная среда МЬМ-4 стерильная сухая. Питательная среда ИРМ1-1640 стерильная сухая». По предложенной технологии наработаны опытные партии сухих стерильных ПС: Игла, МЕМ-4, 199М, ЯРМ1-1640. С учетом полученных результатов разработаны 4 Фармакопейные статьи и Инструкции по применению сухих стерильных ПС.

3.2 Некоторые особенности технологии изготовления сухой формы питательных сред на основе ферментативных гидролизатов

В настоящее время ферментативные белковые гидролизаты, благодаря своим питательным свойствам, доступности, простоте изготовления, относительно невысокой стоимости и перспективности для получения разнообразных клеточных культур, находят все более широкое применение в качестве аминокислотно-пептидной основы

вирусологических питательных сред. В связи с этим рассмотрена возможность применения разработанной нами технологии изготовления синтетических ПС в сухой стерильной форме для получения наиболее экономичных ПС на основе ферментативных гидролизатов.

Для изготовления ПС на основе ферментативных гидролизатов в сухой стерильной форме были выбраны ферментативные гидролизаты, выпускаемые отечественной промышленностью в соответствии с требованиями ТУ и нашедшие применение для выращивания как первичных, так и перевиваемых культур клеток.

Исследованы образцы 17 серий сухих ферментативных гидролизатов: белков сыворотки молока (ГСБМ, 3 серии) производства НПО «Молоко» (г. Углич), мышечных белков КРС (ФГМ-С, 4 серии) производства Щелковского биокомбината, белков крови КРС (ГБК-С, 5 серий) производства ВНИИ защиты животных (г. Владимир), и 5 контрольных серий ГЛА фирмы «Difco».

При отборе ферментативных гидролизатов для изготовления ПС в сухой стерильной форме особое внимание было уделено также таким показателям качества, как растворимость, массовая доля влаги, рН среды, прозрачность и цветность.

Нами экспериментально установлено, что массовая доля влаги используемых гидролизатов не должна превышать 3 %, допустимые значения прозрачности нефильтрованных 0,25 % растворов ФГМС и ГБК-С и 0,5 % растворов ГЛА и ГСБМ должны находиться в пределах от 1/см, показатель концентрации

ионов водорода при растворении образца гидролизата в растворе Хенкса не должен быть более 7,4 ед. рН.

С учетом тестирования образцов по физико-химическим и биологическим показателям были отобраны 2 серии ГСБМ, 2 серии ФГМ-С и 2 серии ГБК-С, отвечающие требованиям НТД. Суммарное содержание аминокислот в гидролизатах, по данным аминокислотного анализа, составляло соответственно 322 и 320 мг на 1 г гидролизата ГЛА и ГСБМ, в гидролизатах ФГМ-С и ГБК-С - 568 и 513 мг соответственно. Все исследуемые гидролизаты содержат в своем составе 18 аминокислот, в том числе все незаменимые, за исключением L-глутамина, который является дефицитным для всех видов гидролизатов.

Технология изготовления гидролизатных ПС включала в себя стадии входного контроля ферментативных гидролизатов на соответствие требованиям ТУ, сушки неорганических солей, приготовления сухой смеси высушенных неорганических солей, глюкозы и фенолового красного, фасовки, стерилизации ускоренными электронами и контроля качества готового препарата.

Соли высушивали по схеме. и температурным режимам, разработанным для синтетических ПС. На основе высушенных солей путем измельчения в шаровой мельнице

готовили сухую солевую композицию раствора Хенкса (из расчета на 100 л жидкого раствора) в соответствии с ФС 42-71ВС-93.

Снижение массовой доли влаги в ферментативных гидролизатах до 2 % при температуре (40±2) °С достигалось за 6 - 8 сут. Повышение температуры с целью сокращения времени сушки отрицательно влияло на внешний вид и ростовые свойства сухих гидролизатных ПС. Поэтому было предложено исключить из технологической схемы стадию высушивания гидролизатов и использовать в производстве сухих стерильных форм ПС гидролизаты с исходной влажностью.

Однако высокая влажность исходных гидролизатов заметно влияет на качество сухих сред в процессе хранения, при этом значительный вклад в снижение качества ПС вносит химический процесс взаимодействия аминокислот с глюкозой. Поэтому одним из вариантов увеличения сроков хранения гидролизатных ПС могло стать разделение реакционно-способных компонентов В связи с этим было рассмотрено 2 варианта выпуска сухих сред на основе гидролизатов: первый вариант, более удобный для потребителя, предполагал наличие в одном флаконе гидролизата и солевой композиции Хенкса с глюкозой; во втором варианте данные компоненты разделяли по отдельным флаконам.

Было изготовлено по 3 серии сухих ПС на основе гидролизатов в обоих вариантах. Для определения прогнозируемого срока хранения образцы каждого из вариантов выдерживали при температуре (80±2) °С в течение 10 сут. (метод «ускоренного старения»). Контроль за возможным изменением качества среды проводили, используя разработанный нами экспресс-метод оценки качества гидролизатных ПС.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что более устойчивой в процессе хранения является ПС, где гидролизаты и глюкоза разделены по отдельным флаконам (второй вариант), что подтверждают электронные спектры поглощения ПС на основе ГБК-С, приготовленной различными способами (рис. I).

Результаты биологического контроля сред подтвердили данные спектрофотометрического метода: ростовая активность ПС на основе ГЛА, приготовленной по первому варианту, уже через 1 г. и 5 мес. хранения при температуре 10 °С была в 2 раза ниже, чем у ПС, приготовленной по второму варианту, в которой аналогичное снижение ростовой активности зафиксировано только через 2 г. 10 мес. хранения (ИП клеточной культуры Нер-2 составили 2,2 и 4,2 соответственно).

Для подтверждения влияния остаточной влажности на срок хранения сухих стерильных ПС, образцы ПС ФГМ-С с остаточной влажностью 3 % и 5 % подвергались термообработке при температуре (80±2) °С в течение 15 сут. Прогнозируемый срок

ЭЭО М НО МО ЭТО 260 ЭОО »0 Э40

Рис 1

Электронные спектры поглощения ПС на основе ГБК-С, приготовленной различными способами

1 - методом стерилизующей фильтрации,

2 - растворением комплекта ПС на основе ГБК-С (вариант разделения гидролизата и глюкозы по отдельным флаконам),

3 - растворением комплекта ПС на основе ГБК-С (вариант совместного присутствия гидролизата и глюкозы в одном флаконе)

хранения при температуре 10 °С среды на основе ФГМ-С с остаточной влажностью 3 % составил 2 г 1 мес, в то время как при остаточной влажности 5 % прогнозируемый срок хранения - 1 г 5 мес Таким образом, снижение массовой доли влаги в ферментативных гидролизатах до 3 % позволяет увеличить срок годности среды до 2 лет

В результате проведенных исследований (изучения стабильности сухих гидролизатных ПС в процессе хранения, влияния влажности на сроки годности среды, оценки Возможности совместного присутствия реакционно-активных компонентов) определена форма выпуска готового препарата. Рекомендуемый комплект состоит из 3 флаконов ФО-1-10 или ФО-1-20 и содержит смесь специально подготовленных солей, глюкозы и фенолового красного в одном, ферментативный гидролизат ФГМ-С или ГБК-С, или ГСБМ, или ГЛА в другом и бикарбонат натрия в третьем

Опытно-промышленное производство сухих стерильных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов

С учетом полученных данных была разработана опытно-промышленная технология производства гидролизатных ПС в сухой стерильной форме на базе ГНЦ ВБ «Вектор»

По разработанной технологии изготовлены по 4 серии ПС на основе изученных ферментативных гидролизатов (по 150 комплектов в серии). Результаты контроля показали, что серии сухих стерильных гидролизатных ПС по физико-химическим и ростовым свойствам соответствовали требованиям ТУ (табл. 3).

Таким образом, в результате исследований определены требования к исходным ингредиентам, отработана технология изготовления и показана возможность серийного производства гидролизатных ПС в сухой стерильной форме со стандартными физико-химическими и биологическими свойствами.

Способ получения ПС на основе ферментативных гидролизатов защищен патентом РФ №2161649.

На основании проведенных исследований разработаны и утверждены:

• Инструкция по изготовлению и контролю среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной,

• Технические условия. ТУ 9384-073-0000806 4-98. Питательная среда на основе гидролизатов сухая стерильная.

3.3 Разработка технологии изготовления сухой стерильной питательной среды -для культивирования лимфоцитов крови

В настоящем разделе рассмотрен способ получения сухих ПС для культур клеток с помощью процесса сублимационного высушивания. С использованием сублимационного высушивания нами получена готовая форма сухой стерильной ПС для культивирования лимфоцитов периферической крови человека (ПС ЛКЧ).

Необходимость разработки такой среды была обусловлена тем, что при медико-биологическом обследовании пациентов для выявления аномалий кариотипа и исследований в области локализации генов применяют метод кратковременного культивирования лимфоцитов периферической крови человека с последующим выделением хромосом. Выполнение такого рода исследований требует наличия специфических диагностических наборов, необходимых для хромосомного анализа. Такие наборы производят ряд зарубежных фирм: Gibco, Difco (США), Serva (Германия) и др, но из-за высокой стоимости их не используют в повседневной практике отечественного здравоохранения.

В результате исследований разработана технология изготовления готовой формы сухой стерильной ПС на основе отечественных компонентов, пригодной для суспензионного культивирования лимфоцитов периферической крови человека, обеспечивающей митотический индекс культуры не менее 30 и высокое качество

Таблица 3

XapjK'ivpiiciiiKj имышо-иромыш шшы\ серии сх\м\ cicpii.ibiibiv i пдролиы! иы\ ПС, iiiioroB.iciiiikix в ГПЦ ВБ "Вектор"

Наименование показателей Требования ТУ ПС ФГМ-С серия 01 ПСГСБМ серия 01 ПС ГБК-С серия 01 ПСГЛА серия 01

Массовая доля влаги, не более 3 3 3 3 3

Растворимость, мни 20 12 10 14 10

рН, ед рН 7 0 - 7,4 7,1 7,2 7,05 7,0

Буферная емкость, мл, не менее 1.2 1.6 1.55 1.6 1.65

Осмоляльность, ммоль/кг 294+6 298 299 299 300

Содержание глюкозы, мг% !00±2 98 98 100 100

Содержание ионов хлора, мг % 0 59±0,02 0,59 0,60 0,60 0 60

Содержание амннного азота, мг %, не менее 6,0 23,7 35,5 18.7 39.5

ИП жм> ««..». культуры клеток Нер-2 (М±8м) должна быть не токсичной и обеспечивать рост клеток СИП не менее 4 7,2±0,2 6,2±0,3 4,6±0,2 4,0М,2

Стерильность должна быть стерильна стерильна стерильна стерильна стерильна

ОП при Х-245 им Х«265 им Х=ЗП им 0,80 (0.76-0,84)« 0,90 (0,86-0,94) 0,16 (0,10-0,16) 0,72 (0,70-0,80) 0,98 (0,94-1,02) 0.20 (0.15-0,23) 0,34 (0.31-0.41) 0,55 (0,45-0,55) 0,10 (0,06-0,14) 0,61 (0,55-0,65) 0.83 (0,80-0,88) 0,16 (0,10-0,18)

Примечание.

* • Рассчитанные значения доверительных интервалов изменений ОП поглощения среды при аналитических длинах волн ^=0,99)

выделенных хромосом для цитогенетического анализа. Для оптимизации состава среды ЛКЧ необходимо было выбрать стандартную ПС и сыворотку крови - животных, определить требования к качеству митогена и его концентрацию в среде, отработать условия лиофильной сушки среды и подобрать оптимальный объем растворителя, обеспечивающий сбалансированный состав среды в одной дозе для оптимального -культивирования лимфоцитов.

Предложенный способ получения. питательной среды для культивирования лимфоцитов крови человека включает смешивание стандартной среды, сыворотки крови, антибиотиков и фитогемагглютинина. Полученную смесь стерилизуют методом фильтрации, дозируют и высушивают методом сублимации при следующем соотношении исходных компонентов: ПС RPMI-1640 (3,0 - 3,5 мл), Hepes-буфер (14 - 18 мг), раствор 3 %-ной массовой доли L-глутамина с антибиотиками (0,06 - 0,08 мл), фитогемагглютинин (0,04 - 0,15 мг), сыворотка крови КРС (0,3 - 0,9 мл).

В отличие от импортных аналогов, разработанная нами среда ПС ЛКЧ содержит из стандартных сред - RPMI-1640 на Hepes - буфере, из сывороток - сыворотку крови КРС, а кроме того, не содержит гепарина. Полученные образцы готовой формы ПС ЛКЧ характеризовались капиллярно-пористой структурой, хорошо • растворялись в воде и сохраняли ростстимулирующие свойства в течение 1 года.

При отработке технологии изготовлено 40 экспериментальных серий готовой формы сухой стерильной ПС ЛКЧ. Опытные серии апробированы в практике цитогенетических лабораторий Свердловской, Новосибирской и других областей. Результаты диагностики наследственных заболеваний были достоверны и воспроизводимы. Предлагаемая среда удобна для использования в любых условиях, в том числе и полевых.

Экспериментальные серии готовой сухой стерильной формы ПС ЛКЧ аттестованы« в ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Утверждены в установленном порядке экспериментально -производственный регламент ЭПР № 446-93 (ЭПР № 969-00) и ВФС 42-400ВС-93 (ФС 42-3911-00) "Питательная среда для культивирования лимфоцитов крови человека' стерильная сухая". Получено разрешение на использование ПС ЛКЧ в практике медико-генетических центров России с целью диагностики наследственных заболеваний (приказ МЗ РФ от 17.11.93).

Разработанная технология защищена патентом РФ № 2084523 «Способ получения питательной среды для культивирования лимфоцитов крови человека».

3.4 Разработка способа получения трипсина сухого стерильного для культур клеток

Существенное значение при производстве культур клеток, особенно первичных, имеет качество протеолитических ферментов. Несмотря на многообразие ферментов, в вирусологической практике наиболее распространенным остается трипсин, а трипсинизация - стандартным методом для получения широкого спектра первичных культур клеток.

Препараты трипсина как импортные, так и отечественные, существенно отличаются степенью очистки, что отражается на их активности, токсичности, растворимости и других показателях, характеризующих препарат. С целью выявления наиболее существенных показателей качества трипсина, определяющих его пригодность для изготовления готовой формы трипсина сухого стерильного (ТСС), нами исследованы образцы фермента, изготовленные различными фирмами: «Difco», «Ferak», «Serva», ВНИиТИБП, Рижским мясоконсервным комбинатом и Ленинградским химико-фармацевтическим институтом

Для изготовления ТСС были отобраны образцы трипсина, соответствующие следующим, требованиям: протеолитическая активность не ниже 150 ЕД по Шоу-Петиколас, массовая доля влаги не более 3 %, рН буферного раствора не более 7,4 ед рН при растворении образца фермента, допустимые значения мутности нефильтрованного 0,25 %-ного раствора не более 6,5-Ю*3 1/см или 0,05 ед оптической плотности (ОП), выход клеток из 1 г ткани КЭ в пределах 150 - 215 млн клеток при 90 - 96 % жизнеспособности

Технология изготовления экспериментальных серий ТСС предусматривала входной контроль образцов трипсина на соответствие квалификации «для культур клеток», контроль и подготовку неорганических солей, приготовление сухой буферной композиции, фасовку, стерилизацию, а затем комплектование готовой формы ТСС.

Для изготовления растворов трипсина используются различные буферные системы' фосфатно-солевой буферный раствор А (ФСБ-А), буферный раствор Дульбекко и др В нашей работе использована стандартная, наиболее универсальная, пропись раствора Хенкса (без солей Са) по ФС 42-131ВС-88.

Полученная при смешивании солей в шаровой мельнице буферная смесь представляла собой однородную массу дисперсного порошка белого цвета, который полностью растворялся в очищенной воде в течение не более 15 мин. Влажность сухой солевой основы буферного раствора не превышала 3 %, а приготовленный 1 %-ный прозрачный раствор (ОП поглощения не выше 0,05 ед. ОП) характеризовался

следующими показателями: рН - 7,25 - 7,45 ед. рН, буферная емкость - 0,50 • 0,65 мл; электропроводность - 16,2 - 18,0 мксим.

Комплект ТСС состоял из двух флаконов, один из которых содержал смесь специально подготовленных неорганических солей, сухую солевую основу буферного раствора Хенкса, (5,03±0,15) г, другой - порошок трипсина (1,25±0,03) г. Один комплект ТСС рассчитан на приготовление 0,5 л рабочего (0,25 %) раствора трипсина, пригодного для диспергирования тканей животных. Допустимая погрешность в навеске исходных компонентов не превышала 3 %. Флаконы с солями и ферментом укупоривали и стерилизовали облучением ускоренными электронами или

Влияние условий и сроков хранения на свойства трипсина сухого стерильного для

культур клеток

Одной из задач при разработке стабильной формы ТСС для культур клеток являлось изучение термостабильности протеолитических свойств сухого препарата в процессе длительного хранения и установление возможности прогнозирования сроков хранения ТСС при различных температурах.

Для оценки стабильности ТСС и прогнозирования длительности его хранения был применен метод «ускоренного старения». С этой целью образцы.ТСС с различной исходной протеолитической активностью хранили при температуре +37 0С в течение 180 сут. и при температуре +60 °С в течение 60 сут.

Установлено, что время потери половины активности ТСС составило 180 сут. при температуре 37 °С и 60 сут. при температуре 60 °С (что соответствует 4,1 и 5,7 годам хранения при температуре (6±2) °С). Установлена также общая закономерность в изменении протеолитической активности ТСС при температурах 37 и 60 °С. Наблюдаемая на первом этапе активация. фермента (как для 37 °С, так и для 60 °С) сменялась устойчивой' его инактивацией. Время • максимального сохранения протеолитических свойств ТСС составило 90 сут. при температуре 37 °С (соответствует 2,04 года хранения температуре (6±2) °С) и 25 сут. при температуре 60 °С (соответствует 2,37 года хранения температуре (6±2) °С).

Для подтверждения прогнозируемых сроков хранения серия ТСС была заложена на хранение при температуре (6±2) °С. Через каждые 180 суток отбирали по 4 комплекта ТСС и определяли его протеолитическую активность и диспергирующие свойства, а также жизнеспособность и ростовые свойства изолированных клеток почек кролика (ПК).

Установлено, что через 2 года хранения ТСС его рабочие растворы обеспечивали выход изолированных клеток ПК на уровне 120 - 130 млн.кл/г с жизнеспособностью 92 - 96 %. Полученные клетки обладали удовлетворительными адгезивными и ростовыми

свойствами и формировали в стандартных условиях монослойные культуры клеток ПК на 5-6 сутки выращивания. Морфологическая характеристика опытных и контрольных культур клеток ПК не отличалась. Через 2 года хранения достоверные отличия (р<0,05) потери активности не превышали 11,2 - 19,6 ЕД, что составляло около 3 % от исходного уровня.

Таким образом, в результате исследований установлена стабильность препаратов ТСС в течение 2-х лет хранения при температуре (6±2) °С, изучена динамика изменения протеолитической активности, определены сроки активации фермента и период потери 50 % активности при повышенных температурах (37 °С и 60 °С).

Совершенствование методов контроля готовой формы ТСС.

Весьма важными при получении культур клеток являются вопросы дифференциальной оценки качества трипсина и совершенствования методов его контроля.

Для отработки методов контроля и определения общих требований к готовой форме ТСС были изготовлены экспериментальные (на основе трипсина различных фирм) серии ТСС. Полученные образцы контролировали по физико-химическим и биологическим показателям в соответствии с требованиями ТУ 10.07.194-91 и ФС 42-131ВС-88 В качестве контроля использовали раствор трипсина, изготовленный традиционным способом с помощью стерилизующей фильтрации.

В результате проведенных исследований предложен перечень основных (внешний вид, цвет, запах, массовая доля влаги, растворимость, рН среды, буферная емкость, протеолитическая активность) и дополнительных (коэффициент яркости, оптическая плотность и осмолял'-ность растворов) методов контроля. Определены предельно-допустимые значения физико-химических показателей, соблюдение которых позволяет получить качественный препарат ТСС, готовый для практического использования.

Полученный препарат ТСС представляет собой стерильный тонкодисперсный порошок белого цвета, со специфическим запахом, без посторонних примесей, с массовой долей влаги, не превышающей 3 %, полностью растворимый в очищенной воде в течение не более 20 мин и характеризующийся буферной емкостью не ниже 1,5 мл, значением рН среды (7,3±0,2) ед. рН, осмоляльностью (315+25) ммоль/кг и протеолитической активностью не менее 120 ЕД по Шоу-Петиколас_ По требованиям дополнительных показателей качества раствор ТСС должен быть прозрачным без признаков опалесценции, а количественные показатели прозрачности и оптической плотности ТСС не должны превышать ОП соответственно.

Кроме того, готовая, форма ТСС должна быть стерильна, не содержать контаминантов бактериального, грибкового, микоплазменного и вирусного происхождения.

Основным показателем' качества ТСС является способность дезагрегировать различные виды тканей животных. Эффективность диспергирования определяется выходом клеток из 1 г ткани и их жизнеспособностью. В соответствии с требованиями ФС 42-131ВС-88, контроль диспергирующих свойств раствора.трипсина проводят на культуре клеток ФЭК. Однако эта культуральная модель не позволяет объективно оценить качество ТСС, так как ткани КЭ относительно легко дезагрегируются, в том числе ФБР без ионов Са и Mg. Поэтому при выборе тест-культуры для оценки диспергирующих свойств и токсичности готовой формы ТСС квалификации «для культур клеток» проведено сравнительное испытание тканей КЭ, ПЭК, ПК.

Анализ полученных данных свидетельствует о том, что ткани ПЭК и ПК являются приемлемым субстратом для контроля ТСС. Клетки ПЭК и ПК обладали равноценными адгезивными и ростовыми свойствами и формировали монослойные культуры- в общепринятые сроки. Однако дефицит эмбрионов коров не позволяет рекомендовать ткань ПЭК для контроля диспергирующих свойств ТСС. При одинаковой трудоемкости диспергирования ткани ПК более доступны, чем ткани ПЭК. Поэтому в качестве культуральной модели для оценки активности ТСС нами предложено использовать ткань ПК в возрасте 2-4 недели.

Для эффективного контроля диспергирующих свойств ТСС на культуре клеток ПК рекомендованы следующие условия:

• активность фермента должна составлять не менее 120 ЕД,

• температура диспергирующего раствора -

• диспергирование ткани ПК необходимо проводить 5-7 раз при непрерывном перемешивании;

• время диспергирования не должно превышать 5-7 мин;

• добавлять в суспензии клеток 10 - 15 % СК животных, осаждать клетки центрифугированием при 1000 об./мин в течение 10 мин;

• использовать ПС ГЛА или смесь сред ГЛА (50 %), Игла (25 %), 199М (25 %) с добавлением 10 % СК КРС.

Сравнительная характеристика образцов промышленных серий ТСС, изготовленных на основе ферментов различных фирм-изготовителей.

Проведена оценка возможности использования • коммерческих серий трипсина производства фирм «Difco», «Serva» и ВНИиТИБП. По физико-химическим показателям, в том числе растворимости и прозрачности препаратов, диспергирующим свойствам, исследуемые серии ферментов были практически равноценными и соответствовали требованиям ТУ 10.07.194-91 и ФС 42-131ВС-88.

На основе отобранных серий фермента по разработанной нами технологии были изготовлены 3 серии по 500 комплектов ТСС, характеристика которых представлена в табл.4.

Анализ полученных данных свидетельствует о том, что серии ТСС, изготовленные из отечественного и импортных серий трипсина, не отличались по физико-химическим, диспергирующим свойствам и были пригодны для получения качественных культур клеток.

Таким образом, в результате исследований для практического использования' предложен активный и стабильный препарат - трипсин сухой стерильный для культур клеток, обладающий выраженными диспергирующими свойствами в отношении тканей животных. При этом определены общие требования к исходным компонентам, разработаны технология производства ТСС и методы его контроля.

Показана равноценность коммерческого препарата трипсина отечественного и импортного производства для изготовления ТСС, сохраняющего высокую дезагрегирующую способность на протяжении всего срока хранения (2 г.) при температуре (6±4) °С.

Разработанная технология производства трипсина сухого стерильного для культур клеток защищена патентом РФ № 2142503.

Полученные данные послужили основанием для разработки следующей НТД:

• Экспериментально-производственный регламент ЭПР №519-95;

• Производственный регламент ПР №1037-00 «Трипсин сухой стерильный для культур клеток»;

• Технические условия ТУ 10.07.074-91 «Трипсин сухой стерильный для культур клеток»;

• Инструкция по применению трипсина сухого стерильного для культур клеток;

• Временная Фармакопейная статья ВФС 42/Д 021ВС-95; Временная Фармакопейная статья ВФС 42-3117-98 «Трипсин сухой стерильный для культур клеток».

На базе ГНЦ ВБ «Вектор» с использованием разработанной нами технологии производства и отечественного оборудования организован серийный выпуск препарата ТСС.

3.5 Разработка метода электронно-лучевой стерилизации сухих препаратов В данном разделе представлены полученные нами результаты по разработке метода электронно-лучевой стерилизации различных ПС сред, белковых гидролизатов и протеолитического фермента трипсина, используемых в вирусологической практике.

Стерилизацию сухих ПС, белковых гидролизатов, трипсина проводили на импульсном высокочастотном ускорителе электронов типа ИЛУ-6 в Институте ядерной

Таблица 4

Сравнительная характеристика образцов ТСС, изготовленных на основе препаратов импортного и отечественного производства

Производитель трипсина ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ

Внешний вид, цвет, залах Массовая доля влаги, % Растворимость, мин. Прозрачность рн, ед. рН Буферная емкость, мл Активность, ЕД (М±5„) Стерильность Выход клеток из 1 г ткани ПК, млн кл/г (М±8„) Урожай клеток, тыс клУмл (М18„)

1/см едОП

«0|1сО» Тоыкодиспер-сный порошок, белого цвета, со специфическим запахом 3,0 12-20 6,2 - 6,5 0,020 - 0,026 7,20 1.6 389±29 Стерилен 99±17 237*19

«вегуа» 1,3 13-18 6,1-6,3 0,010-0,015 7,15 1.6 315±35 Стерилен 112±03 203±04

ВНИнТИБП 3,0 15-17 6,1-6,2 0,015-0,018 7,25 2,3 414140 Стерилен 115±03 212±10

физики СО РАН

Одной их основных задач при разработке радиационного способа стерилизации является выбор минимальной эффективной стерилизующей дозы. В соответствии с современными требованиями, стерилизующая доза ионизирующего излучения должна определяться с учетом начальной контаминации препаратов микроорганизмами

Проведенные испытания показали, что в сухих синтетических ПС до стерилизации содержание общего количества бактерий составляет 70 - 80 КОЕ/г (преимущественно грамположительные и споровые палочки), количество плесневых грибов 2-6 КОЕ/г. В исследуемых белковых гидролизатах (ГСБМ,- ФГМ-С, ГБК-С, ГЛА) содержание общего количества бактерий находится в пределах 80 - 90 КОЕ/г, количество плесневых грибов -6-9 КОЕ/г. В трипсине общее количество бактерий 12 - 14 КОЕ/г, количество плесневых грибов - 4 - 7 КОЕ/г. При этом бактерии семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus не были обнаружены ни в одном из образцов

Минимальную стерилизующую дозу определяли экспериментально. Было приготовлено по 3 серии синтетических ПС Игла, МЕМ-4, 199М и RPMI-1640 и по 3 серии сред на основе гидролизатов ФГМ-С, ГБК-С, ГСБМ, ГЛА (по 400 комплектов среды в каждой серии) Затем флаконы со средой облучали ускоренными электронами, варьируя дозу от 15 до 35 кГр. Результаты контроля стерильности всех образцов ПС, показали отсутствие контаминации микроорганизмами при - облучении сред ускоренными электронами дозой 25 кГр и выше. Снижение дозы приводило к появлению случаев нестерильности, при этом микроскопирование мазков показало наличие споровых микроорганизмов Проверка качества стерилизации свыше 600- естественно контаминированных образцов препаратов подтвердила, что выбранная доза (25 кГр) облучения ускоренными электронами оптимальна для стерилизации ПС, гидролизатов, солевых буферных композиций.

Кроме того, изучено влияние дозы облучения ускоренными электронами от 15 до 35 кГр на физико-химические и биологические свойства препаратов. Принципиально это влияние возможно, поскольку нами методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) показано появление в облученных ПС и трипсине свободных радикалов, которые могут инициировать протекание различных химических процессов.

Определена максимальная влажность образцов ПС и ТСС, при которой степень радиационного разрушения препарата при оптимальной дозе наименьшая. Показано, что снижение влажности синтетических ПС до 1 - 2 % позволяет получить при облучении ускоренными электронами в дозе 25 кГр стерильные среды без изменения их физико-химических и биологических свойств

Облучение ускоренными электронами в дозе 25 кГр обеспечивало стерилизацию образцов ТСС с влажностью не более 3 %, при этом их внешний вид, физико-химические свойства и протеолитическая активность существенно не отличались от контрольных препаратов, полученных методом стерилизующей фильтрации Потери активности ферментов не превышали 5 % При более жестком облучении (30 кГр), потери активности ТСС возрастали до 15 % В образцах ТСС с повышенной влажностью (4,5 - 6,0 %) наблюдалось изменение цвета препарата от белого до желтого и серого, потеря активности фермента превышала 25 %

Для увеличения производительности процесса стерилизации ускоренными электронами нами совместно с сотрудниками Института ядерной физики СО РАН был разработан специальный транспортер, перемещающий флаконы с одновременным их вращением под электронным пучком (при этом происходит перемешивание содержимого флакона) Это позволило увеличить производительность процесса стерилизации ПС до 2000 флаконов/ч

Таким образом, в нашей работе впервые в России был использован метод электронно-лучевой стерилизации вирусологических ПС, белковых гидролизатов, трипсина В результате исследований выбрана оптимальная стерилизующая доза облучения ускоренными электронами - 25 кГр, определены условия и отработаны режимы стерилизации, позволяющие получать стерильные препараты без изменения их физико-химических и биологических свойств, пригодные для получения культур клеток

3.6 Эффективность применения сухих стерильных препаратов . в вирусологической практике

Проведена оценка ростовых свойств и перспективность использования приготовленных по разработанной нами технологии синтетических и гидролизатных ПС с 5 - 10 % сыворотки крови КРС для культивирования первичных культур клеток ФЭК, ПЭК, ПЭС, ТБ, и ПЩ и перевиваемых линий СПЭВ, Namalwa, Hep-2, L-929, Vero, 4647, ДК-58

Полученные данные свидетельствуют, что все ПС, приготовленные из сред в сухой стерильной форме, обеспечивают высокую пролиферативную активность клеток, не уступая по этому показателю жидким ПС, использованным в качестве контроля Различий в морфологической характеристике опытных и контрольных образцов линий клеток отмечено не было Изменений в кариологической характеристике клеток также не выявлено

Следует отметить, что клеточные культуры, выращенные с использованием сухих стерильных и контрольных жидких ПС, обладали равноценной чувствительностью к

эталонным и производственным штаммам вирусов болезни Ауески, трансмиссивного гастроэнтерита свиней, инфекционного ринотрахеита и парагриппа-3 КРС Сроки накопления и интенсивность проявления ЦПД вирусов в опытных и контрольных культурах были сходными Результаты производственных испытаний на Омском биокомбинате и в Северо-Кавказском зональном научно-исследовательском ветеринарном институте (г Новочеркасск) показали целесообразность и экономичность применения сухих стерильных ПС на основе ГБК-С и ГЛА для изготовления промышленных серий вакцин против болезни Марека, чумы плотоядных и трансмиссивного гастроэнтерита свиней

Среда Игла MEM в сухой стерильной форме не уступала по своим ростовым свойствам контрольной жидкой среде и обеспечивала накопление вирусов простого герпеса и краснухи на том же уровне, что и в контроле Кроме того, показано, что эта среда пригодна как для получения тест-культуры клеток Vero, так и для культивирования токсоплазм, что может быть использовано для получения антигенов тахизоитов Т gondu при производстве диагностических тест-систем

Таким образом, в результате исследовании показано, что ПС в сухой стерильной форме нетоксичны, характеризуются высокими ростовыми свойствами, пригодны для получения широкого спектра первичных и перевиваемых культур клеток и накопления вирусов

Проведенные исследования также показали пригодность и эффективность использования растворов ТСС для получения широкого спектра первичных культур клеток (ФЭК, ПЭК, ПЭС, ТБ, ПК, ПЩ), а также для серийного пассирования перевиваемых линий (MDBK, MDCK, СПЭВ) без изменения их исходных биологических свойств

Поскольку в состав ферментативных гидролизатов входят низкомолекулярные пептиды, микроэлементы и другие биологически активные соединения, усиливающие обменные процессы в клетках, нами была рассмотрена возможность использования сухих гидролизатных ПС в малосывороточном и бессывороточном вариантах

Показано, что ростовые свойства малосывороточных (2 % сыворотки крови КРС) сухих ПС на основе гидролизатов ФГМ-С и ГСБМ удовлетворяют требованиям, предъявляемым к средам для культивирования как перевиваемых монослойных клеток Нер-2, так и суспензионных клеток Namalwa Малосывороточные сухие ПС на основе гидролизатов ГБК-С и ГЛА могут быть рекомендованы для получения культур клеток млекопитающих только в комплекте с ростстимулирующими белками Заслуживает внимания и тот факт, что ПС на основе ФГМ-С и ГСБМ могут быть использованы не

только с пониженным (2 %) содержанием сыворотки крови КРС, но и в бессывороточном варианте в комплекте с РБ.

Сухая стерильная ПС RPM1-1640 с добавлением РБ, выделенных из сыворотки крови свиней, способствует активной пролиферации клеток Namalwa. Добавление РБ, выделенных из сыворотки крови КРС, к сухой стерильной ПС Игла или ПС на основе гидролизата сои делает зги среды пригодными для культивирования клеток Vero без добавления СК животных.

Таким образом, использование сухих стерильных ПС на основе гидролизатов, а также их комплектов с ростстимулирующими белками открывает возможность для стандартизации условий культивирования клеток млекопитающих при производстве, лечебных, профилактических и диагностических препаратов.

3.7 Разработка качественных и количественных методов контроля исходных компонентов и готовых форм питательных сред

Разработка спектрофотометрического экспресс-метода анализа питательных сред на основе белковых гидролизатов

При серийном производстве ПС и отработке технологических режимов является актуальной задача разработки более простых по технике исполнения физико-химических экспресс-методов контроля качества ПС, которые позволяли бы в короткие сроки оценить качество и стандартность среды, выявить нарушения в технологии производства и хранении ПС.

Впервые возможность использования электронных, спектров поглощения для оценки стандартности синтетических ПС для культур клеток предложена Дециной А Ни Богрянцевой М П. Спектрофотометрический метод достаточно прост в исполнении, имеет малую продолжительность анализа и экономически выгоден. Поэтому нами предложено использовать метод спектрофотометрии для оценки качества ПС на основе ферментативных гидролизатов.

Проведенные нами • исследования и статистическая обработка результатов спектрофотометрического анализа гидролизатных ПС при < выбранных аналитических длинах волн позволила предложить для оценки

стандартности питательных сред доверительные интервалы изменений их ОП поглощения Сравнивая - ОП поглощения исследуемой . среды с соответствующими доверительными интервалами изменений "ОП, можно судить о стандартности исследуемой ПС. Если значение ОП исследуемой ПС совпадает с установленным доверительным интервалом, то данную среду считают

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ I БИБЛИОТЕКА | СПекрбург I

оа ах ю

Достоверность полученных результатов была подтверждена наличием корреляции данных спектрофотометрического анализа с результатами биологического контроля гидролизатных ПС Полученные результаты свидетельствовали о том, что ростстимулирующая активность ПС на основе ферментативных гидролизатов, спектрофотометрические характеристики которых входили в рассчитанные доверительные интервалы изменений оптических плотностей, находилась на уровне контроля

Таким образом, предложен простой экономичный спектрофотометрический экспресс-метод контроля стандартности гидролизатных ПС Его применение обеспечило изготовление стандартных по ростовым свойствам ПС

Разработка химико-атомно-эмиссионных методов анализа питательной среды и ее компонентов

Известно, что избыточное или недостаточное содержание микроэлементов в питательной среде может приводить к нарушению функционирования клеточных популяций, поэтому при конструировании ростовых ПС необходимо иметь более точные сведения о количественном содержании МЭ, особенно в СК животных - основном источнике МЭ Так как МЭ проявляют взаимозависимое влияние на клеточные системы, когда эффект влияния одного элемента зависит от концентрации другого, то возникает настоятельная необходимость одновременного контроля содержания МЭ в СК Поскольку совершенствование технологии изготовления ПС тесно связано с унификацией и модернизацией методов определения показателей их качества, а действующие "Методические указания по применению физико-химических методов контроля питательных сред" не предполагают определение содержания МЭ в ПС и ее компонентах, то разработка многоэлементных методов анализа ПС и СК является актуальной задачей

Нами разработаны унифицированные сорбционно-атомно-эмиссионный и экстракционно-атомно-эмиссионный спектральные методы анализа СК, позволяющие оценить влияние микроэлементов на качество ПС

Преимущества разработанного нами сорбционно-атомно-эмиссионного метода анализа СК по сравнению с аналогичными химико-атомно-эмиссионными методиками обусловлены использованием эффективного способа концентрирования МЭ сорбцией хелатообразующим сорбентом полиарсеназо Определены условия количественного извлечения микроэлементов из минерализованной сыворотки крови Процедура сорбционного концентрирования элементов выполняется в статических условиях, технически проста, требует небольших количеств сорбента

Разработан да £ р^щ^о нн^ато мно-э \1иссион н ы й метод, позволяющий определять в сыворотке кррви 1Г 4Л1фо$лемек!гов с пределами обнаружения 0,8 - 5,0 мкг/л и

V -с *

относительным стандартным отклонением 0,15 - 0,23, может быть использован и для других биологических жидкостей после проведения, предварительной подготовки образцов к анализу (минерализации).

С целью увеличения числа одновременно определяемых элементов в сыворотке крови, нами разработан атомно-эмиссионный спектральный метод анализа СК с отделением основных компонентов экстракцией. Предложена новая эффективная экстракционная схема отделения К и Ке дибензо-18-краун-6в Р,Р'-дихлордиэтиловом эфире из хлоридно-перхлоратных сред. Полученные метрологические характеристики разработанного метода (число определяемых элементов 21, пределы обнаружения 0,2 - 100 мкг/л; относительное стандартное отклонение 0,14 - 0,24) удовлетворяют основным требованиям, предъявляемым к методам анализа биологических образцов. По своим метрологическим характеристикам разработанный экстракционно-атомно-эмиссионный спектральный метод сопоставим с нейтронно-активационным методом, но превосходит последний по доступности и простоте выполнения. Важно отметить, что в число определяемых элементов входят как жизненно необходимые, так и потенциально токсичные элементы.

Разработанные методики химико-атомно-эмиссионного определения микроэлементов в сыворотке крови - использовались для анализа - различных видов -сыворотки крови в ГНЦ ВБ «Вектор».

В результате исследований впервые установлено, что в процессе обработки сыворотки крови КРС полиэтиленгликолем наряду с удалением в ней -высокомолекулярных белков происходит одновременное снижение функционально важных микроэлементов. Показано, что модификация' сыворотки крови КРС, обработанной ПЭГ, путем добавления в нее МЭ в количествах, необходимых для приближения их конечных концентраций до уровня их содержания в СК плодов коровы, повышает ростстимулирующие свойства сыворотки. Такой подход к модификации СК может быть использован при разработке биотехнологических процессов, основанных на культивировании клеток животных я насекомых.

Изучено влияние концентрации жизненно необходимых элементов (железа, меди, цинка, никеля и кобальта) в ПС на пролиферацию клеток ВНК-21 (С. 13) и ЛЭЧ. Показана возможность использования пробит преобразования для количественного описания экспериментальных данных. Обнаружено наличие корреляционной зависимости

позволяющей проводить, статистически достоверно сопоставление чувствительности клеточных культур к ионам металлов, механизмы действия которых на клеточные системы аналогичные.

4 ВЫВОДЫ

1. Разработана и внедрена в производство универсальная технология и$готовления синтетических и гидролизатных питательных сред и трипсина квалификации «для культур клеток» в сухой стерильной форме.

Экспериментально обоснованы температурные и временные режимы сушки и условия смешивания исходных компонентов, форма выпуска и комплектность сухих стерильных питательных сред, препарата трипсина. Достигнуто увеличение сроков годности гндролизатных питательных сред и трипсина с 6 мес. до 2 лет, синтетических питательных сред с 1 года до 5 лет.

2. Впервые разработан метод электронно-лучевой стерилизации сухих форм питательных сред и трипсина для культур клеток, позволяющий получать стерильные препараты без изменения их физико-химических и биологических свойств.

3. Разработана технология получения и оптимизирован состав сухой стерильной питательной среды для суспензионного культивирования лимфоцитов крови человека, обеспечивающей высокое качество выделенных хромосом для цитогенетического анализа.

4. Показана эффективность сухих стерильных питательных сред и трипсина для производства широкого спектра первичных и перевиваемых линий культур клеток. Культуры клеток, полученные с использованием сухих стерильных препаратов, характеризовались равноценной с контролем чувствительностью к вирусам простого герпеса 1 типа, краснухи, болезни Ауески, трансмиссивного гастроэнтерита свиней, инфекционного ринотрахеита и парагриппа-3 крупного рогатого скота.

5. Разработаны рецептуры и обоснована форма выпуска бессывороточных и малосывороточных сухих стерильных питательных сред на основе ферментативных белковых гидролизатов, показана принципиальная возможность их использования для культивирования перевиваемых линий клеток Нер-2, Vero, Namalwa, СПЭВ.

6. Разработан спектрофотометрический экспресс-метод оценки качества гидролизатных ПС, позволяющий с вероятностью 99 % оценивать стандартность приготовленных сред и выявлять изменения, связанные с нарушением технологии приготовления, условий хранения и транспортировки.

7. Разработаны новые химико-атомно-эмиссионные методы определения микроэлементов в одном из компонентов питательной среды (сыворотке крови) с пределами обнаружения 0,2 - 100 мкг/л и относительным стандартным отклонением 0,14 - 0,24. Изучено влияние содержания микроэлементов в питательной среде на пролиферативную активность клеточных культур ВНК-21 (С. 13) и ЛЭЧ. Впервые показано, что обработка сыворотки крови КРС полиэтиленгликолем приводит к снижению в ней концентрации функционально важных микроэлементов.

8. Разработаны и утверждены в установленном порядке 18 нормативчо-тгхнических документов, организовано серийное производство • питательных сред и трипсина квалификации «для культур клеток» в сухой стерильной форме.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработана универсальная технология производства синтетических и гидролизатных ПС, а также трипсина в сухой стерильной форме квалификации «для культур клеток».

Разработаны и утверждены исходные данные на разработку технико-экономического обоснования реконструкции корпуса 104/1 ГНЦ ВБ «Вектор» в п. Кольцове Новосибирской области для создания производства сухих питательных сред для вирусологических исследований. На основе подготовленных нами исходных данных ОАО КИПФ «Бином» разработан Проект (№ 042-01) реконструкции корпуса 104/1 в соответствии с требованиями СП 3.3.2.1288-03 «Надлежащая практика производства медицинских иммунобиологических препаратов» (ОМР).

Разработанная технология защищена 5 патентами РФ:

№ 2107724 «Способ получения сухих стерильных питательных сред для культур клеток»;

№ 2084523 «Способ получения питательной среды дня культивирования лимфоцитов крови человека»;

№ 2142503 «Способ получения стерильного раствора трипсина для культур клеток»;

№ 2161649 «Способ получения жидкой стерильной питательной среды на основе • ферментативного гидролизата»;

№ 2201958 «Сухая- стерильная • малосывороточная питательная среда для культивирования клеток млекопитающих».

Показана перспективность применения ПС и трипсина в сухой стерильной форме для выращивания различных клеточных культур и вирусов.

Для оценки, стандартности гидролизатных питательных сред разработан спектрофотометрический экспресс-метод. Рассчитаны доверительные интервалы изменения оптической плотности питательных сред, позволяющие с вероятностью 99 % судить не только о стандартности приготовленных питательных сред, но выявлять изменения, связанные с нарушением технологии приготовления, условий хранения и транспортировки.

Разработаны методики химико-атомно-эмиссионного анализа сыворотки крови, позволяющие определять в ней до 21 микроэлемента. В число определяемых элементов входят как жизненно необходимые, так и токсичные.

По результатам экспериментальных исследований разработана и утверждена следующая НТД:.

- Производственный регламент ПР № 279-90." Питательная среда Игла стерильная сухая; Питательная среда 199М стерильная сухая; Питательная среда МЕМ-4 стерильная сухая; Питательная среда КРМ1-1640 стерильная сухая;

- Экспериментальных-произвсдственный регламент. ЭПР № 446-93; ЭПР № 969-00. «Питательная среда для культивирования лимфоцитов крови человека стерильная сухая»;

- Экспериментально-производственный регламент ЭПР № 519-95. Трипсин сухой стерильный для культур клеток;

- Производственный регламент ПР № 1037-00. Трипсин сухой стерильный для культур клеток;

- Фармакопейная статья ФС 42-347-ВС-90. Питательная среда Игла стерильная -

сухая;

- Фармакопейная • статья ФС 42-351-ВС-90. Питательная среда МЕМ-4 стерильная сухая;

- Фармакопейная статья ФС 42-350-ВС-90. Питательная среда КРМ1-1640 стерильная сухая;

- Фармакопейная статья ФС 42-346-ВС-90. Питательная среда 199М стерильная

сухая;

- Временная фармакопейная статья ВФС 42-400 ВС-93. Фармакопейная статья ФС 42-3911-00. «Питательная среда для культивирования лимфоцитов крови человека стерильная сухая»;

- Временная фармакопейная статья ВФС42/Д-021 ВС-95. Фармакопейная статья ФС 42-3117-98. Трипсин сухой стерильный для культур клеток;

-Технические условия ТУ 10.07.074-93. Трипсин сухой стерильный для культур

клеток;

- Технические условия. ТУ9384-073-0000806 4-98. Питательная среда на основе гидролизатов сухая стерильная;

- Инструкция по изготовлению и контролю среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной;

- Инструкция по применению Трипсина сухого стерильного для культур клеток;

- Инструкция по применению питательной среды Игла стерильной сухой;

- Инструкция по применению питательной среды МЕМ-4 стерильной сухой;

- Инструкция по применению питательной среды ЯРМ1-1640 стерильной сухой;

- Инструкция по применению питательной среды 199М стерильной сухой.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Трошкова Г.П., Юделевич И.Г. Методы определения ртути и ряда тяжелых металлов в биологических объектах // В сб. Поведение ртути и других тяжелых металлов в экосистемах. Новосибирск. - 1988. - С 121-134.

2. Трошкова Г.П., Юделевич И.Г. Химико-атомно-эмиссионный метод определения микроэлементов в сыворотке крови // В сб. Новое в практике химического анализа веществ. М. - 1989. - С. 82-86.

3. Трошкова Г.П., Юделевич И.Г. Химико-атомно-эмиссионный метод определения микроэлементов в сыворотке крови // XIV Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. - М. - 1989. - С. 499.

4. Трошкова Г.П., Юделевич И.Г. Химико-атомно-эмиссионное определение микроэлементов в биологических жидкостях // Журн. аналит. химии. - 1990. - т.45, №6. -С. 1234-1237.

5. Трошкова Г.П., Юделевич И.Г. Экстракционное концентрирование для химико-спектрального анализа сыворотки крови // III Всесоюз. конф. по методам концентрирования в аналит. химии. Черноголовка. -1990. - С. 33.

6. Децина А.Н., Трошкова Г.П., Мартынец Л.Д., Андреева МА. Повышение ростстимулирующей активности сыворотки крови крупного рогатого скота, обработанной полиэтиленгликолем // III Всесоюз. совещ. по культивированию клеток животных и человека. Пущино -1990. - С. 21-22.

7. Troshkova G.P., Yudelevich I.G. Atomic-emission methods for the determination of microelements in biological liquids with preliminary chemical concentration //XI Conf. of analytical atomic spectroscopy. - Moscow. -1990. - P. 278.

8. Трошкова Г.П., Юделевич И.Г. Методы контроля содержания микроэлементов; в сыворотке крови // Тез. Всесоюз. конф. по разработке и производству препаратов медицинской биотехнологии. - Махачкала. -1990. - С. 69-70.

9. Yudelevich I.G., Troshkova G.P. Atomic-emission methods for the determination of microelements in blood serum with preliminary chemica concentration // Eur.conf. on analytical chemistry. EuranalysisVII, Vienna, Austria. - 1990. - vol. l-A.2.2-P-Fr-23.

10. Трошкова Г.П., Юделевич И.Г. Экстракционно-атомно-эмиссионный метод определения микроэлементов в сыворотке крови. I. Выбор экстрагента // Сибирский химич. журнал. - 1991. - №4. - С. 55-57.

11. Трошкова Г.П., Юделевич И.Г. Экстракционно-атомно-эмиссионный метод определения микроэлементов в сыворотке крови. II. Методика анализа // Сибирский химич. журнал. - 1991. - №4. - С. 58-60.

12. Трошкова Г.П., Децина А.Н., Мартынец Л.Д., Кондрахин Ю.А. Концентрационные зависимости влияния микроэлементов на клеточную пролиферацию // Тез. Всесоюз. конф. по питатательным средам и сывороткам для культивирования клеток. Новосибирск. - 1991. - С. 19.

13. Трошкова Г.П., Мартынец Л.Д., Кондрахин Ю.А., Децина А.Н. Концентрационные зависимости влияния солей железа, меди, цинка, кобальта и никеля на клеточную пролиферацию // Тез. Ш Всесоюз. совещ. по культивированию клеток животных и человека. Пущино - 1990. - С. 57-58.

14. Распопина Г.И., Гинзбург ИА., Трошкова Г.П., Быков ВА., Камший Л.П. Разработка технологии получения питательной среды для культивирования лимфоцитов крови' человека // Тез. Всесоюз. конф. по питатательным средам и сывороткам для культивирования клегок. Новосибирск. - 1991. - С. 21.

15 Gracheva S F, Kamshii L P , Kostina G A, Troshkova G P, Frolova I V Production process features of culture media and sera for manufacturing those medicinal and diagnostic reagents // International conf on medical biotechnology, Immunization and AIDS Leningrad -1991 -P 86

16 Raspopina GI, Ginsburg I A, Troshkova G P, Bykov V A, Kamshii L P Culture medium for lymphocytes of human peripheral blood in the diagnosis of chromosomal anomalies // International conf on medical biotechnology, Immunization and AIDS Leningrad -1991 - P 128

17 Трошкова Г П, Фролова И В, Распопина Г И, Сорокина Е А, Богрянцева М П, Камший Л П Сухие стерильные питательные среды для культивирования клеток // Тез Всесоюз конф по питатательным средам и сывороткам для культивирования клеток Новосибирск -1991 -С 10

18 Трошкова Г П, Бакиров Т С, Фролова И В, Богрянцева М П, Кондрушин Е В , Шапров В В, Камший Л П Использование ускорителей электронов ИЛУ-6 для стерилизации сухих питательных сред // Тез Всесоюз конф по питатательным средам и сывороткам для культивирования клеток Новосибирск -1991 -С 41

19 Yudelevich I G, Troshkova GP Determination of microelements in blood serum using an extraction-atomic-emission method // Analusis - 1992-vol20 -P 341-343 (Elsevier, Pans)

20 Богрянцева М П, Трошкова Г П, Ночевный В Т, Камший Л П., Спиридонова И В Разработка препарата сухого стерильного трипсина, используемого при культивировании клеток//Цитология -1992 -т34, №9 -С 55

21 Богрянцева МП, Селедцов В И., Трошкова ГП, Камший ЛП Опыт использования среды Пскова для культивирования клеток костного мозга // Цитология -1994 -т36,№6 -С 546

22 Богрянцева М П, Трошкова Г П, Мартынец Л Д, Камший Л П, Ночевный В Т Готовая форма трипсина для культур клеток//Цитология -1994 -тЗб, №6 -С 547

23 Фролова И В , Мазуркова Н А, Трошкова Г П, Гинзбург И А, Камший Л П. Готовая форма питательной среды для культивирования лимфоцитов крови человека // Цитология -1994 -т36,№6 -С 583

24 Фролова И В , Мазуркова Н А, Трошкова Г П, Гинзбург И А, Камший Л П. Готовая форма питательной среды для культивирования лимфоцитов периферической крови человека//Биотехнология - 1994 -№9-10 -С 22-25

25 Мартынец Л Д, Мазуркова Н А, Подчерняева Р Я, Трошкова Г П, Камший Л П Культивирование клеток лимфомы Беркитта в бессывороточной среде // Тез конф «Перспективы развития производства биопрепаратов для медицины и сельского хозяйства» Степногорск -1995 -ч 1 -С 61

26 Трошкова Г П, Камший Л П, Фролова И В , Богрянцева М П., Сорокина Е А Сухие стерильные препараты для культур клеток // Тез конф «Перспективы развития производства биопрепаратов для медицины и сельского хозяйства» Степногорск - 1995 -ч 1 - С 59

27 Величко А В, Трошкова Г П Динамика инактивации трипсина сухого стерильного при различных температурах // Тез 5 Всерос конф «Научные основы технологии пром производства ветеринарных биологических препаратов» Щелково • 1996 -С 319-320

28 Богрянцева М П, Фролова И В, Трошкова Г П, Мазуркова Н А, Камший Л П Питательные среды и другие препараты для культур клеток млекопитающих // Цитология -1996 -т38,№2 -С 182-183

29 Фролова И В , Мазуркова Н А, Трошкова Г П, Камший Л П, Гинзбург И А Способ получения питательной среды для культивирования лимфоцитов крови человека // Патент РФ №2084523, 1997

30 Камший Л П, Трошкова Г П, Леляк А И, Фролова И В, Сорокина Е А Способ получения сухих стерильных питательных сред для культур клеток // Патент РФ №2107724, 1998

31 Сорокина Е А, Мартынец Л.Д, Ночевный В Т, Подчерняева Р Я, Мазуркова НА, Трошкова ГП Конструирование сухих стерильных бессывороточных и малосывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих // Биотехнология - 1998 -№1 - С 67-72

32 Мазуркова Н А, Богрянцева М П, Трошкова Г П. Сухие стерильные малосывороточкые питательные среды на основе гидролизатов для культивирования клеток млекопитающих // Тез конф «Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротестсистем» Махачкала -1998 -С 16

33 Богрянцева М П., Мазуркова Н А, Трошкова Г П Увеличение сроков хранения сухих стерильных питательных сред на основе белковых гидролизатов с использованием антиоксидантов // Тез конф «Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест систем» Махачкала -1998 -С 69

34 Мазуркова Н А, Богрянцева М П, Мартынец Л Д, Сироткина Т Б, Трошкова Г П Разработка сухих стерильных препаратов для клеточной биотехнологии // Цитология • -1999 -т41, №3/4 -С 289

35 Мартынец Л Д, Сорокина Е А, Сироткина Т Б, Мазуркова Н А., Богрянцева М П, Трошкова Г П Культивирование клеток млекопитающих с применением сухих стерильных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов // Цитология -1999 -т 41, №3/4 С 290

36 Могилевкина М Ф, Шипачев В А, Трошкова Г П, Мазуркова Н А., Богрянцева М П Синтез и изучение цитотоксической активности Ы-(2-тетрагидрофуранил)-5-фторурацилатных комплексов платины//Хим -фарм журнал -1999 -№2 -С 12-14

37 Фролова ИВ, Трошкова ГП, Камший Л П. Разработка технологии изготовления сухих стерильных питательных сред для культур клеток млекопитающих // Биотехнология -1999 -№4 -С 38-44

38 Богрянцева МП, Трошкова ГП, Мазуркова НА, Ночевный ВТ Изучение сроков годности и причин снижения качества сухих стерильных питательных сред // Биотехнология - 1999 -№4 -с 49-54

39 Богрянцева М П, Трошкова Г П., Мазуркова Н А, Децина А Н, Ночевный В Т Экспресс-метод контроля качества питательных сред для культур клеток млекопитающих //Биотехнология - 1999 -№5 -С 87-95

40 Богрянцева М П, Трошкова Г П, Камший Л.П, Мартынец Л Д, Величко А В, Ночевный В Т Способ получения стерильного раствора трипсина для культур клеток // Патент РФ № 2142503, 1999

41 Богрянцева МП, Трошкова ГП, Ночевный ВТ Особенности технологии изготовления вирусологических питательных сред на основе белковых гидролизатов // Тез конф «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» Щелково -2000 -С 110-111

42 Мазуркова Н А, Мартынец Л Д, Богрянцева М П, Кирова Е В, Трошкова Г П Ростстимулирующие белки как компонент питательных сред для культивирования клеточных культур // Труды 8 международн конф «Новые информационные технологии в медицине и экологии» Гурзуф - 2000 - С 95-96

43 Мазуркова Н А, Мартынец Л Д, Богрянцева М П, Каримова О Г, Трошкова Г П Определение хромосомных аномалий человека с использованием сухой стерильной формы питательной среды для культивирования лимфоцитов крови // Tej докл VII Российский национальный конгр «Человек и лекарство» М -2000 -С 414

44 Трошкова ГП Технологические основы электронно-лучевой стерилизации питательных сред//Биотехнология -2000 - №6 -С 54-60

45 Troshkova G P Technological Basis of the Electron-Beam Sterilization of Nutrient Media//Russian Journal ofBiotechnology-2001 -voll, №1 -P 62-66

46 Богрянцева М П, Трошкова Г П., Мазуркова Н А, Ночевный В Т, Мартынец Л Д, Сироткина Т Б Способ получения жидкой стерильной питательной среды на основе ферментативного гидролизата // Патент РФ № 2161649,2001

47. Трошкова Г.П., Богрянцева М П., Юдин А.В., Мазуркова Н.А., Мартынец Л.Д. Некоторые аспекты производства и применения бессывороточной питательной среды на основе ферментативного гидролизата сои // Труды 9 международн. конф. «Новые информационные технологии в медицине и экологии». Гурзуф. - 2001. - С. 211.

48. Трошкова Г.П., Богрянцева М.П. Проблемы оптимизации бессывороточной питательной среды на основе ферментативного гидролизата сои // Тез. конф. "Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротестсистем." Махачкала. 2001.-С. 8-9.

49. Трошкова Г.П., Богрянцева М.П., Величко А.В., Ночевный В.Т. Конструирование и использование в вирусологической практике сухих стерильных питательных сред на основе белковых гидролизатов // Цитология. - 2001. - т.43, №9. - С. 896-897.

50. Трошкова Г.П., Богрянцева М.П., Юдин А.В., Мартынец Л.Д. Проблемы и перспективы производства бессывороточных питательных сред для культур клеток // Труды X международн. конф. «Новые информационные технологии в медицине и экологии». Гурзуф. - 2002. - С. 30-31.

51. Могилевкина М.Ф., Шипачев ВА, Ткачев СВ., Трошкова Г.П., Мартынец Л.Д. Моно- М1-|2'-тетрагидрофуранил)-5-фторурацилатные комплексы платины (II) с аммиаком // Координационная химия. - 2002. - т.28, №6. - С. 449-453.

52. Трошкова Г.П., Богрянцева М.П., Мартынец Л.Д. Разработка сухих стерильных питательных сред и их использование в вирусологической практике. // Тез. I Международн. конгр. "Биотехнология - состояние и перспективы развития". М. - 2002. -С. 97.

53. Трошкова Г.П., Богрянцева М.П., Мартынец Л.Д., Величко А.В., Ночевный В.Т. Некоторые аспекты производства и применения трипсина сухого стерильного для культур клеток // Тез. I Международн. конгр. "Биотехнология - состояние и перспективы развития". М. - 2002. - С. 98.

54. Трошкова Г.П., Богрянцева М.П., Беланов Е.Ф., Бормотов Н.И. Использование сухой питательной среды, простерилизованной ускоренными электронами, для получения toxoplasma gondii в культуре клеток Vero // Труды XI международн. конф. «Новые информационные технологии в медицине и экологии». Гурзуф. - 2003. - С. 243-244.

55. Трошкова Г.П., Богрянцева М.П., Бакулина Л.Ф. Оценка возможности использования сухих стерильных питательных сред для получения вируса простого герпеса в культуре клеток Vero // Труды XI международн. конф. «Новые информационные технологии в медицине и экологии». Гурзуф. - 2003. - С. 242-243.

56. Трошкова Г.П., Богрянцева МП., Величко А.В., Ночевный В.Т. Изучение чувствительности культур клеток, выращенных с использованием сухих стерильных питательных сред, простерилизованных ускоренными электронами, к некоторым вирусам // Ветеринарная патология. - 2003. - №1(5). - С. 48-50.

57. Трошкова Г.П., Богрянцева М.П., Мазуркова Н.А., Мартынец Л.Д., Кирова Е.В., Юдин А.В. Сухая стерильная малосывороточная питательная среда для культивирования клеток млекопитающих // Патент РФ №2201958,2001.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВГНКИ - Всероссийский государственный научно-исследовательский институт

контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов

ВНИиТИБП - Всероссийский научно-исследовательский и технологический

институт биологической промышленности

ВФС - временная фармакопейная статья

ГБК-С - гидролизат белков крови сухой

ГЛА - гидролизат лактальбумина

ГСБМ - гидролизат белков сыворотки молока

ЕД - единица активности

ИП - индекс пролиферации

КОЕ - колониеобразующая единица

КРС - крупный рогатый скот

КЭ - куриный эмбрион

МЭ - микроэлемент

ОП - оптическая плотность

ПК • почка кролика

ПС - питательная среда

ПЭК - почка эмбриона коровы

ПЭС - почка эмбриона свиньи

ПЩ - почка щенка

РБ - ростстимулирующие белки

СК - сыворотка крови

СПЭВ - перевиваемая линия клеток почки эмбриона свиньи

ТБ -тестикулы быка

ТСС - трипсин сухой стерильный

ТУ - технические условия

УК - урожай клеток

ФБР - фосфатно-буферный раствор

ФГМ-С - ферментативный гидролизат мышечных белков сухой

ФС - фармакопейная статья

ФЭК - фибробласты эмбрионов курицы

ЦПД - цитопатогенное действие

ЭСП - электронные спектры поглощения

ВНК-21 клетки почки сирийского хомячка

Hela - клетки карциномы шейки матки

Нер-2 - клетки эпидермоидной карциномы гортани человека

Hepcs - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтан сульфоновая кислота

KB - клетки эпидермоидной карциномы ротовой полости

MDBK - перевиваемая линия клеток почки теленка

MDCK - перевиваемая линия клеток почки собаки

Namalwa - клетки лимфомы Беркитга

Vero - клетки почки зеленой мартышки

ГНЦ ВБ « ВЕКТОР» 3.16. т. 100,2004г.

- 1 44 4 2

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Трошкова, Галина Павловна

1 ВВЕДЕНИЕ.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Получение сухих стерильных препаратов для культур клеток.

2.2 Бессывороточные и малосывороточные питательные среды для культур клеток.

2.3 Влияние микроэлементов на специфическую активность питательных сред. Многоэлементные методы анализа биологических образцов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка технологии производства и методов контроля препаратов для культур клеток в сухой стерильной форме"

Актуальность темы. В последние два десятилетия стремительно развиваются не только научные исследования в области клеточной биотехнологии, но и практически осуществился переход к крупномасштабному культивированию клеточных культур, на которых базируется производство разнообразных по назначению биологически активных препаратов медицинского, пищевого и сельскохозяйственного назначения. Постоянно возрастающие масштабы производства клеток-продуцентов для создания новых биопрепаратов вызвали необходимость разработки экономичных и доступных питательных сред (ПС), белковых гидролизатов, солевых и диспергирующих растворов.

Обеспечение потребности в синтетических и гидролизатных ПС до недавнего времени осуществлялось за счет производства жидких стерильных сред или их 10-кратных концентратов, имеющих срок годности, как правило, не более 6 или 12 мес. Широко используемые в вирусологической практике растворы трипсина имеют регламентированный срок хранения при температуре (6±2) °С - 6 мес, а при температуре минус (15±5) °С - 12 мес. При этом многократные процессы замораживания и оттаивания фермента недопустимы, так как существенно снижают его активность [88, 89].

Недостатками жидкой формы препаратов для культур клеток являются нестабильность при положительных температурах, ограниченный срок годности, значительные затраты при транспортировке и хранении.

Альтернативой жидкой формы ПС может стать их сухая стерильная форма. Сухая стерильная форма ПС имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с жидкой: продолжительный срок годности с сохранением физико-химических и биологических свойств, возможность производства больших объемов препарата одной серии, возможность быстрого приготовления жидкой стерильной среды без применения дорогостоящего оборудования для стерилизующей фильтрации, значительное сокращение расходов на хранение и транспортировку. Поэтому разработка технологии производства

ПС, солевых буферных систем, белковых гидролизатов, ферментов для культур клеток в сухой стерильной форме является актуальной и отвечает потребностям дальнейшего развития клеточной биотехнологии.

Следует также отметить, что в России метод получения сухих стерильных ПС на основе индивидуальных компонентов, предложенный Сперанской И.Д [157], а также исследования по изготовлению сухих стандартных образцов - референс-препаратов ПС на основе белковых гидролизатов [12] не вышли за рамки лабораторного изучения, промышленный выпуск этих препаратов не был организован.

Вопросы производства ПС представлены в трудах отечественных и зарубежных ученых: Сперанская И.Д., 1979; Дьяконов Л.П., 1984, 2000; Ермишина И.Г. 1989, 1996; Коренева А.И., Пригода А.С., 1991, 1996; Камший Л.П., 1991; Башашкина Н.А., 1994; Eagle Н., 1959, 1962; Dulbecco R., 1954; Hayhlik L., 1964; Sato G., 1979; Patterson M.K., Ham R.G. 1982; Moore G.E., 1994; Hesse F., 2001 и др. Однако, несмотря на многочисленные имеющиеся публикации, практически отсутствуют данные по промышленному производству сухих стерильных вирусологических ПС.

Решение задач промышленного получения культур клеток потребовало научного обоснования и разработки технологии промышленного производства препаратов для культур клеток в сухой стерильной форме. Важным направлением при разработке экономичных сред является конструирование вирусологических ПС на основе белковых гидролизатов, конструирование бессывороточных и малосывороточных ПС. При этом особое значение приобретают вопросы стандартизации ПС, что требует комплексного подхода к оценке их качества и разработке эффективных методов контроля.

Цель и задачи исследований. Цель исследований - разработка технологии производства и методов контроля качества сухих стерильных форм синтетических и гидролизатных ПС, солевых буферных систем, трипсина квалификации "для культур клеток" и их апробация при получении первичных и перевиваемых культур клеток и культивировании вирусов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- определить общие требования к качеству исходных ингредиентов, пригодных для изготовления сухих стерильных препаратов квалификации "для культур клеток";

- разработать технологию изготовления сухой стерильной формы ПС на основе индивидуальных аминокислот и витаминов и на основе белковых гидролизатов, а также технологию получения трипсина сухого стерильного (ТСС) для культур клеток;

- подобрать оптимальные условия радиационной стерилизации сухих ПС, гидролизатов, трипсина, солевых буферных композиций;

- определить оптимальные условия и сроки хранения, а также возможные причины снижения качества сухих стерильных препаратов;

- апробировать сухие стерильные формы ПС и ТСС для производства первичных и перевиваемых культур клеток и наработки вирусов; сконструировать и испытать сухие стерильные бессывороточные и малосывороточные ПС;

- разработать методы качественного и количественного контроля ПС;

- оценить влияние микроэлементов, содержащихся в ПС, на пролиферацию клеточных культур;

- оценить экономическую целесообразность производства и применения сухих стерильных форм ПС и ТСС в вирусологической практике;

- разработать НТД на изготовление, контроль и применение сухих стерильных ПС и ТСС квалификации "для культур клеток".

Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые:

- получены научно обоснованные данные, положенные в основу разработки опытно-промышленной технологии производства сухих стерильных форм синтетических и гидролизатных ПС, а также протеолитического фермента трипсина, отвечающих требованиям квалификации "для культур клеток";

- экспериментально обоснованы условия электронно-лучевой стерилизации сухих форм препаратов для производства культур клеток;

- определены оптимальные условия и сроки хранения сухих стерильных форм ПС и трипсина;

- доказана пригодность и перспективность применения разработанных сухих форм препаратов для производства широкого спектра первичных и перевиваемых культур клеток и вирусов;

- сконструированы сухие стерильные бессывороточные и малосывороточные синтетические ПС и ПС на основе белковых гидролизатов; показана возможность оценки стандартности гидролизатных ПС спектрофотометрическим методом; отработаны методы контроля и определены предельно допустимые показатели качества сухих стерильных препаратов;

- продемонстрирована применимость разработанных автором химико-атомно-эмиссионных методов для серийного анализа промышленных образцов сыворотки крови (СК) животных, используемых в биотехнологии;

Приоритет и новизна научных разработок диссертации защищены 5 патентами РФ (№2084523, №2107724, №2142503, №2161549, №2201958).

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены в производство следующие технологии:

- технология производства в сухой стерильной форме ПС на основе индивидуальных аминокислот и витаминов;

- технология производства в сухой стерильной форме ПС на основе белковых гидролизатов;

- технология производства ТСС для культур клеток.

Разработаны экспресс-метод оценки качества гидролизатных ПС и унифицированные методики химико-атомно-эмиссионного определения микроэлементов вСК.

Обоснована экономическая и практическая перспективность применения сухих стерильных форм препаратов для вирусологической практики. По результатам работы подготовлены и утверждены в установленном порядке 18 нормативно-технических документов. Для вирусологической практики предложено 10 видов коммерческих препаратов в сухой стерильной форме: питательная среда Игла сухая стерильная; питательная среда 199М сухая стерильная; питательная среда RPMI-1640 сухая стерильная; питательная среда МЕМ-4 сухая стерильная; питательная среда для культивирования лимфоцитов крови сухая стерильная; среда питательная на основе ферментативного гидролизата мышечных белков сухая стерильная; среда питательная на основе ферментативного гидролизата белков сыворотки молока сухая стерильная; среда питательная на основе ферментативного гидролизата белков крови сухая стерильная; среда питательная на основе ферментативного гидролизата лактальбумина сухая стерильная; трипсин сухой стерильный для культур клеток.

Апробация работы. Основные результаты доложены и получили положительную оценку на Всесоюзной конференции по актуальным вопросам разработки препаратов медицинской биотехнологии (Махачкала, 1990 г.); III Всесоюзном совещании по культивированию клеток животных и человека (Пущино, 1990 г.); VII Европейской конференции по аналитической химии (Вена, Австрия, 1990 г.); XI Международной конференции по аналитической атомной спектроскопии (Москва, 1990 г.); Всесоюзной конференции по питательным средам и сывороткам для культивирования клеток (Новосибирск, 1991 г.); Международной конференции по медицинской биотехнологии (Ленинград, 1991 г.); II, V, VII Симпозиумах «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 1995 г., 1998 г., 2000 г.); конференции «Перспективы развития производства биопрепаратов для медицины и сельского хозяйства» (Степногорск, 1995 г.); Всероссийской конференции «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 1996 г., 2000 г.); конференции «Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест систем» (Махачкала, 1998 г., 2001 г.); VII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2000 г.); VII, VIII, IX, X, XI международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Гурзуф, 1999 г., 2000 г., 2001 г., 2002 г., 2003 г.); I и II Международных конгрессах "Биотехнология - состояние и перспективы развития" (Москва, 2002 г., 2003 г.); Международной конференции "Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине" (Москва, 2003 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 57 печатных работ, в том числе 5 патентов.

Основная часть результатов получена автором самостоятельно, а также при участии аспирантов Величко А.В. и Богрянцевой М.П. Вклад в работу других авторов отражен в публикациях по теме диссертации.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту.

По результатам выполненных исследований на защиту выносятся следующие положения: промышленная технология производства сухих стерильных форм ПС и трипсина квалификации «для культур клеток»; результаты изучения электронно-лучевой стерилизации сухих ПС, белковых гидролизатов, трипсина, солевых буферных композиций; технология изготовления сухих стерильных бессывороточных и малосывороточных ПС для культур клеток; спектрофотометрический экспресс-метод оценки качества ПС на основе белковых гидролизатов; методические разработки по химико-атомно-эмиссионному определению МЭ в СК; результаты изучения концентрационных зависимостей влияния МЭ на пролиферацию клеточных культур; экспериментальное обоснование целесообразности и перспективности применения сухих стерильных форм ПС и ТСС для производства широкого спектра первичных и перевиваемых культур клеток и вирусов.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Трошкова, Галина Павловна

5 ВЫВОДЫ

1. Разработана и внедрена в производство универсальная технология изготовления синтетических и гидролизатных питательных сред и трипсина квалификации «для культур клеток» в сухой стерильной форме.

Экспериментально обоснованы температурные и временные режимы сушки и условия смешивания исходных компонентов, форма выпуска и комплектность сухих стерильных питательных сред, препарата трипсина. Достигнуто увеличение сроков годности гидролизатных питательных сред и трипсина с 6 мес. до 2 лет, синтетических питательных сред с 1 года до 5 лет.

2. Впервые разработан метод электронно-лучевой стерилизации сухих форм питательных сред и трипсина для культур клеток, позволяющий получать стерильные препараты без изменения их физико-химических и биологических свойств.

3. Разработана технология получения и оптимизирован состав сухой стерильной питательной среды для суспензионного культивирования лимфоцитов крови человека, обеспечивающей высокое качество выделенных хромосом для цитогенетического анализа.

4. Показана эффективность сухих стерильных питательных сред и трипсина для производства широкого спектра первичных и перевиваемых линий культур клеток. Культуры клеток, полученные с использованием сухих стерильных препаратов, характеризовались равноценной с контролем чувствительностью к вирусам простого герпеса 1 типа, краснухи, болезни Ауески, трансмиссивного гастроэнтерита свиней, инфекционного ринотрахеита и парагриппа-3 крупного рогатого скота.

5. Разработаны рецептуры и обоснована форма выпуска бессывороточных и малосывороточных сухих стерильных питательных сред на основе ферментативных белковых гидролизатов, показана принципиальная возможность их использования для культивирования перевиваемых линий клеток Нер-2, Vero, Namalwa, СПЭВ.

6. Разработан спектрофотометрический экспресс-метод оценки качества гидролизатных ПС, позволяющий с вероятностью 99 % оценивать стандартность приготовленных сред и выявлять изменения, связанные с нарушением технологии приготовления, условий хранения и транспортировки.

7. Разработаны новые химико-атомно-эмиссионные методы определения микроэлементов в одном из компонентов питательной среды (сыворотке крови) с пределами обнаружения 0,2 - 100 мкг/л и относительным стандартным отклонением 0,14 - 0,24. Изучено влияние содержания микроэлементов в питательной среде на пролиферативную активность клеточных культур ВНК-21 (С. 13) и ЛЭЧ. Впервые показано, что обработка сыворотки крови КРС полиэтиленгликолем приводит к снижению в ней концентрации функционально важных микроэлементов.

8. Разработаны и утверждены в установленном порядке 18 нормативно-технических документов, организовано серийное производство питательных сред и трипсина квалификации «для культур клеток» в сухой стерильной форме.

6 Практические предложения

Разработана универсальная технология производства синтетических и гидролизатных ПС, а также трипсина в сухой стерильной форме квалификации «для культур клеток».

Разработаны и утверждены исходные данные на разработку технико-экономического обоснования реконструкции корпуса 104/1 ГНЦ ВБ «Вектор» в п. Кольцово Новосибирской области для создания производства сухих стерильных питательных сред для вирусологических исследований. На основе подготовленных нами исходных данных в соответствии с постановлением правительства РФ от 2 июля 1991 г. № 737 о Федеральной целевой программе «Создание методов и средств защиты населения и среды обитания от опасных и особых опасных патогенов в чрезвычайных ситуациях, природных и техногенного характера в 1999-2001 г.» ОАО КИПФ «Бином» разработан Проект (№ 042-01) реконструкции корпуса 104/1 в соответствии с требованиями СП 3.3.2.1288-03 «Надлежащая практика производства медицинских иммунобиологических препаратов» (GMP).

Разработанная технология защищена 5 патентами РФ: 2107724 «Способ получения сухих стерильных питательных сред для культур клеток»; 2084523 «Способ получения питательной среды для культивирования лимфоцитов крови человека»; 2142503 «Способ получения стерильного раствора трипсина для культур клеток»; 2161649 «Способ получения жидкой стерильной питательной среды на основе ферментативного гидролизата»; 2201958 «Сухая стерильная малосывороточная питательная среда для культивирования клеток млекопитающих».

Показана перспективность применения ПС и трипсина в сухой стерильной форме для выращивания различных клеточных культур и вирусов.

Для оценки стандартности гидролизатных питательных сред разработан спектрофотометрический экспресс-метод. Рассчитаны доверительные интервалы изменения оптической плотности питательных сред, позволяющие с вероятностью 99 % судить не только о стандартности приготовленных питательных сред, но выявлять изменения, связанные с нарушением технологии приготовления, условий хранения и транспортировки.

Разработаны методики химико-атомно-эмиссионного анализа сыворотки крови, позволяющие определять в ней до 21 микроэлемента. В число определяемых элементов входят как жизненно необходимые, так и токсичные.

По результатам экспериментальных исследований разработана и утверждена следующая НТД:

- Производственный регламент ПР № 279-90. Питательная среда Игла стерильная сухая; Питательная среда 199 М стерильная сухая; Питательная среда МЕМ-4 стерильная сухая; Питательная среда RPMI-1640 стерильная сухая;

- Экспериментально-производственный регламент ЭПР № 446-93; ЭПР № 969-00. «Питательная среда для культивирования лимфоцитов крови человека стерильная сухая»;

- Экспериментально-производственный регламент ЭПР № 519-95. Трипсин сухой стерильный для культур клеток;

- Производственный регламент ПР № 1037-00. Трипсин сухой стерильный для культур клеток;

- Фармакопейная статья ФС 42-347-ВС-90. Питательная среда Игла стерильная сухая;

- Фармакопейная статья ФС 42-351-ВС-90. Питательная среда МЕМ-4 стерильная сухая;

- Фармакопейная статья ФС 42-350-ВС-90. Питательная среда RPMI-1640 стерильная сухая;

- Фармакопейная статья ФС 42-346-ВС-90. Питательная среда 199М стерильная сухая;

- Временная фармакопейная статья ВФС 42-400 ВС-93. Фармакопейная статья ФС 42-3911-00. «Питательная среда для культивирования лимфоцитов крови человека стерильная сухая»;

- Временная фармакопейная статья ВФС42/Д-021 ВС-95. Фармакопейная статья ФС 42-3117-98. Трипсин сухой стерильный для культур клеток;

- Технические условия ТУ 10.07.074-93. Трипсин сухой стерильный для культур клеток;

- Технические условия. ТУ 9384-073-0000806 4-98. Питательная среда на основе гидролизатов сухая стерильная;

- Инструкция по изготовлению и контролю среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной;

- Инструкция по применению Трипсина сухого стерильного для культур клеток;

- Инструкция по применению питательной среды Игла стерильной сухой;

- Инструкция по применению питательной среды МЕМ-4 стерильной сухой;

- Инструкция по применению питательной среды RPMI-1640 стерильной сухой;

- Инструкция по применению питательной среды 199 М стерильной сухой.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Трошкова, Галина Павловна, Кольцово

1. Абашкин В.М., Якшин В.В., Ласкорин Б.Н. Экстракция солей щелочных металлов из кислых растворов краун-эфирами // Докл. АН СССР. 1981. - т.257, №6. -С. 1374-1377.

2. Авцын А. П., Строчкова Л. С., Жаворонков А. А. Клеточный гомеостаз и микроэлементы // Арх. патол. 1988. - т.50, № 9. - С. 6-11.

3. Адаме Р. Методы культуры клеток для биотехнологии. М.:Мир, 1983. - 243 с.

4. Анализ следов элементов. М.: Иностр. лит., 1981. - 624 с.

5. Артюхин В.И., Шепелин А.П., Киселева Н.В. Белковые гидролизаты в производстве питательных сред. Производство и применение продуктов микробиологических производств. М.: ВНИИСЭНТИ Минмедпрома СССР, 1990. - вып. 9-10. - С. 31-38.

6. А. с. 1025722 СССР, МКИ3 С 12 N 1/00. Питательная среда для выращивания культур клеток животных // Панкова Г.Е., Сергеев В.А., Дьяконов Л.П. и др. Опубл. 1983, Бюл. №24.

7. А. с. 1673596 СССР, МКИ3 С 12 N 5/04. Способ стерилизации ферментных препаратов, используемых для получения протопластов // Нафтапиев Н.М., Дубовицкая Л.А. Опубл. 1991, Бюл. №32.

8. А. с. 16930422 СССР, МКИ5 С 12 N 1/20. Способ получения белкового гидролизата // Ефремова Л.В., Яблонская С.Ф., Аболиня И.Я., и др. Опубл. 1991, Бюл. №43.

9. А. с. 1735360 СССР, МКИ5 С 12 N 5/00. Питательная среда для перевиваемых клеток млекопитающих // Коренева А.И., Пригода А.С. Опубл. 1992, Бюл. №19.

10. Ауслендер В.Л., Брязгин А.А., Коробейников М.В др. Использование электронно-лучевой обработки для стерилизации медицинских изделий и для другихмедицинских и биологических применений // Вестник «Радтех-Евразия». 1999. - №1(9). -С. 159-168.

11. Ауслендер B.J1. Ускорители электронов типа ИЛУ для промышленных технологий // Вестник РадТех-Евразия. 1999. - №1(9). - С. 32-45.

12. Башашкина Н.А. Стандартизация методов контроля культуральных питательных сред и их компонентов // Автореферат дис. канд. биол. наук. М., 1994. -24 с.

13. Белоусова М.В., Маклаков А.И., Скирда В.Ф. и др. Определение толщины поврежденного слоя в у-облученном полиэтилене методом ЯМР // Высокомолекулярные соединения. 1986. - т.А28, №3. - С. 663-667.

14. Бенюмович М.С. Суспензии клеток человека и животных. ч.1. // Итоги науки и техн. ВИНИТИ. Сер. Цитология. М., 1990. - т.21. - 300 с.

15. Богоявленская А.Н., Молоствова Н.И., Переверзева Е.Ф., Полякова В.В. Усовершенствование методик спектрального анализа особочистых материалов // Труды Гинцветмета. М., 1974. - №53. - С. 32-38.

16. Богрянцева М.П. Технология изготовления и свойства питательной среды сухой стерильной на основе гидролизатов // Автореферат дис. канд. биол. наук. М., 2000. -28 с.

17. Бочкарев В.В., Харламов В.Т., Пикаев А.К. и др. Радиационная стерилизация радиофармацевтических препаратов в замороженном состоянии // Хим.-фарм. журнал. -1980. -т.14,№10. С. 82.

18. Брицке М. Э. Атомно-абсорбционный электрохимический анализ. М.: Химия, 1982.-223 с.

19. Булатова Р.Ф., Шепелин А.П., Волков В.Я. Новые подходы к разработке критериев оценки качества сухих питательных сред // Клиническая лабораторная диагностика. 1997. - № 1. - С. 23-24.

20. Варнек А.А., Глебов А.С., Петрухин О.М. Селективность реакций комплексообразования 18-краун-6 с щелочными металлами II Координационная химия. -1989. т. 15, №5. - С. 600-606.

21. Вашков В.И. Средства и методы стерилизации, применяемые в медицине. М.: Медицина, 1973. - С. 124-152.

22. Величко А.В. Сухой трипсин диспергент для получения культур клеток // Цитология. - 1994. - т.36, № 6. - С. 548-549.

23. Веремьев И.В., Борцова Э.И., Киселев А.П. и др. Изучение стабильности растворов аминокислот изотермическим методом // Хим.-фарм. журнал. 1978. - №10. -С. 125-128.

24. Вирник Р.Б., Рыльцев В.В., Власов Л.Г. и др. Действие у-облучения на трипсин, иммобилизованный на диальдегидцеллюлозе // Прикл. биол. и микробиол. 1983. - т. 19, №4. - С. 552-556.

25. Витакер.А. Среды для культивирования клеток млекопитающих // Новые методы культуры животных тканей. Под ред. Фридлянского. М: Мир, 1976. - С. 18.

26. Власов Л.Г., Рыльцев В.В., Филатов В.Н., Татаринцев В.В. Исследование влияния ионизирующего излучения на свойства иммобилизованных протеолитиков //

27. Прогрессивные технологические процессы создания текстильно-галантерийных изделий: Сб. науч. трудов. М., 1987. - С. 69-71.

28. Гасанова Б.С. Протеины различных видов сывороток как факторы роста клеток млекопитающих // Цитология. 1994. - т.36. - №6. - С. 61.

29. Гизитдинов Н.Н., Бахтахунов Ю.Х., Велямов М.Т. и др. Питательные среды для выращивания культур клеток и вирусов // Достижения науки и техники. 1992. - № 6. -С. 22-23.

30. Гизитдинов Н.Н., Вовк В.И., Миловидова Ф.А. Применение питательной среды, приготовленной из белков пшеничной муки, для выращивания культур клеток // Вестник с.-х. науки. 1969. - №4. - С. 48-52.

31. Гизитдинов Н.Н., Куликова К.С., Вовк В.И. Результаты получения вируса ящура, выращенного в культуре клеток с использованием среды, приготовленной из белкового гидролизата сои // Вест. с.-х. наук Казахстана. 1970.- №7. - С. 64.

32. Гладкова С.Е., Бормотов Н.И., Дедкова J1.M. и др. Иммунохимическое изучение антигенов тахизоитов toxoplasma gondii, полученных в различных системах культивирования // Мед. паразитология и паразитарные болезни. 1998. - №1. - С. 20-23.

33. Гмошинский И.В., Козловская Э.П., Зорин С.Н., и др. Иммунохимическая и физико-химическая характеристика ферментативных гидролизатов белков сои // Тез. докл. Всерос. конф. "Современные достижения биотехнологии". Ставрополь, 1996. - С. 102103.

34. Голубев Л.Г., Сажин Б.С., Валашек Е.Р. Сушка в химико-фармацевтической промышленности. М.: Медицина, 1978. - 272 с.

35. Голубев Д.Б., Сомина А.А, Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. Л.: Медицина, 1976. - С. 10-36.

36. Гончаров А.А., Манина И.Н., Ионова Н.Д. О возможности радиационной стерилизации гепарина // Хим.-фарм. журнал. 1986. - №5. - С. 619-623.

37. Горелюк Б.А., Сромнов И.В. Вопросы снижения радиационных повреждений при стерилизации полимерной продукции на ускорителе электронов // Мат. Всесоюз. науч. конф. «Дезинфекция и стерилизация, перспективы развития». Волгоград, 1983. -С. 31-32.

38. Горшков В. В., Орлова JI. П. Концентрирование микроэлементов при анализе биологических объектов // В кн. Биологическая роль микроэлементов. М.: Наука, 1983. -С. 217-224.

39. ГОСТ 8.207-76. Прямые измерения с многократными наблюдениями. Методы обработки результатов наблюдений. М.: Госкомитет СССР по стандартам, 1976. - 10 с.

40. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. М.: Элевар, 2000.-512 с.

41. Гробова М.Е. Внутриклеточный рН и регуляция пролиферации клеток ВНК-21 в суспензии // Ш Всессоюз. совещ. по культивированию клеток животных и человека. М., 1990.-С. 19-20.

42. Громов В.А. Физико-химические исследования облученных лекарственных препаратов // Тез. докл. Всесоюз. конф. по радиационной стерилизации медицинской промышленности. М., 1978. - С. 62-63.

43. Гудимо О.С., Колесникова Н.А., Шошиев JI.H. Культивирование клеток Hela на питательных средах с гидролизатами альбумина сыворотки крови человека и животных // Вопросы вирусологии. -1961. №3. - С. 375-380.

44. Гудрниеце Э.Ю., Королькова B.C. Стабилизация солянокислого цистеина // В сб. Методы получения и анализа биохимических препаратов. Рига, 1982. - 4.1. - С.14.

45. Давиденко Т.Н., Бондаренко Г.И., Севастьянова Е.В. и др. Физико-химические исследования полипропиленов после стерилизации // Хим.-фарм. журнал. 1994. - т.28, №8.-С. 51-56.

46. Дамберг Б.Э. Реакция меланоидинообразования и ее биологическое значение // Известия АН Латвийской ССР. 1976. - № 1. - С. 97-105.

47. Демин С.В., Михайлов В.Н., Князев Д.А., Жилов В.И. Стехиометрия и устойчивость комплекса иона кальция с дибензо-18-краун-6 // Журн. неорганич. химии. -1989. -т.34,№1. С. 252-254.

48. Демина Н.Г., Полажуер Б.М., Румянцева Н.Ф. Изучение стабильности глутамина в процессе его выделения из ферментационных процессов // Биотехнология. -1992.-№2.-С. 63-67.

49. Децина А.Н., Бачинский А.Г., Байбаков В.И. Белковые гидролизаты в качестве основы питательных сред. М.: ВНИИСЭНТИ Минмедпрома СССР, 1985. - вып.б. - 66 с.

50. Децина А.Н., Богрянцева М.П. Перспективы применения антиоксидантов в биотехнологии тканевых культур. М.: ВНИИСЭНТИ Минмедпрома СССР, 1988. - вып.7. - С. 1-28.

51. Джарылгасов С.А., Борисова С.М., Пухова Н.М. Качество материалов для культур клеток, применяемых в биотехнологии. М.: ВНИИСЭНТИ Минмедпрома СССР, 1987. -вып.З. -28 с.

52. Дидоренко Т.О., Зелюкова Ю.В., Волкова Е.А., Полуэктов Н.С. и др. Влияние селена и теллура при атомно-абсорбционном определении ртути методом холодного пара // Журн. аналит. химии. 1984. - т.39, №11. - С. 2023-2026.

53. Дьяконов Л.П., Глухов В.Ф., Поздняков А.А. и др. Культивирование клеток тканей и животных. Учебно-методическое пособие. Ставрополь, 1986. - 96 с.

54. Дьяконов Л.П., Строкнна Г.М., Конюхов А.Ф. Гидролизаты молочных, мышечных и растительных белков как основы питательных сред для культивирования клеток и вирусов // Цитология. 1994. - т.36, №6. - С. 522.

55. Ермишина Е.Г., Ермолин Г.А., Мейнерт А.Г., Дудкин С.М. Универсальная основа питательных сред "Автофизат-О" // В сб. Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротестсистем. Махачкала, 1998. - С.21.

56. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии) // Под ^ ред. Дьяконова Л.П., Ситькова В.И. М.:Компания Спутник+, 2000. - 400 с.

57. Залетаев Д.В. Хромосомная патология у детей с олигофренией и множественными признаками дисморфогенеза // Автореферат дис. канд. биол. наук. -М., 1985.-24 с.

58. Зенькевич В.Б., Балатов В.П., Соколов С.Е. Мембранное оборудование для питательных сред и сывороток // Тез. докл. Всесоюз. конф. «Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток». Новосибирск, 1991. - С. 43.

59. Золотов Ю.А., Кузьмин Н.М. Концентрирование микроэлементов. М.: Химия, 1982. - 288 с.

60. Золотов Ю.А., Кузьмин Н.М. Экстракционное концентрирование. М.: Химия, 1971.-272 с.

61. Игудин Л.И., Кацнельсон Н.В., Блоха В.В. Принципы и методы стандартизации вирусологических питательных сред // Тез. докл. Всесоюзн. конф. «Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии». Махачкала, 1988. - ч.2. - С. 221.

62. Игудин Л.И. Требования к качеству сывороток крови животных компонентов культуральных питательных сред // Тез. докл. Всесоюз. конф. «Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток». - Новосибирск, 1991. - С. 45.

63. Игудин Л.И., Орлов С.Д., Шалунова Н.В. и др. Способ очистки сыворотки крови КРС И Вопросы вирусологии. 1980. - № 5. - С. 640-642.

64. И-42-2-82. Инструкция по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода «ускоренного старения» при повышенной температуре. М, 1983. - 13 с.

65. Камший Л.П. Проблемы и перспективы обеспечения клеточной биотехнологии питательными средами и сыворотками // Тез. докл. Всесоюз. конф. «Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток». Новосибирск, 1991. - С.9.

66. Каплан Б.Я., Карпов Ю.А., Филимонов М.Н. Особенности метрологии анализа веществ высокой чистоты // В кн. методы анализа высокочистых веществ. Под ред. Карпова Ю.А. М.: Наука, 1987. - С. 41-54.

67. Каулен Д.Р. Радиационная стерилизация // Труды Ташкентской конф. по мирному использованию атомной энергии. Ташкент, 1966. - С. 88.

68. Киселев О. И., Виноградова Е.Н., Рахманов А.Г. Прионы новые инфекционные агенты. Вакцинопрофилактика. - С.-П., 1996. - С. 63-69.

69. Коваленко О.А., Тарасова Н.И., Иванникова А. Г. и др. О влиянии внутриклеточного содержания свободного железа на пролиферацию клеток в культуре // Биофизика. 1986. - т.31, № 2. - С. 278-282.

70. Коновалова Е.Ю.Андреева И.В., Пригода А.С. Конструирование бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих. Сообщение III // Биотехнология. -1991. №5. - С. 72-76.

71. Коренева А.И., Пригода А.С., Верещагин В.В., Покровский А.Г. Конструирование бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих. Сообщение V // Биотехнология. -1991. №6. - с. 64-66.

72. Коренева А.И., Амбросова С.М., Фаустов B.C. Получение питательной среды для клеток животных на основе ферментативного гидролизата казеина // В сб. Совершенствование технологии микробиологических производств. М., 1983. - С.45.

73. Корнеева А.И. Разработка питательной среды для культур клеток млекопитающих на основе ферментативного гидролизата казеина // Автореферат дис. канд. биол. наук. Москва, 1995. - С. 8-10.

74. Костина Г.А., Радаева И.Ф. Ростовые протеины как компоненты питательной среды // В сб. Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротестсистем. Махачкала, 1998. - С. 26-27.

75. Костина Г.А., Радаева И.Ф. Ростовые протеины для культивирования клеток // Биотехнология. Теория и практика. 1998. - №4(8). - С. 49-51.

76. Кочиш Т.Ю., Рубан Е.А., Самуйленко А.Я. Стерилизующая фильтрация питательных сред // В сб. Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Щелково, 2000. - С. 293-295.

77. Кузьмин Н.М. Концентрирование микроэлементов: тенденция развития // Зав. Лаб. 1987. - т.53, №3. - С. 5-11.

78. Кулешов Н.П. Частота возникновения и судьба хромосомных аномалий у человека // Автореферат дис. д-ра мед. наук. М., 1979. - 45 с.

79. Культура животных клеток. Методы. М.: Мир, 1989 - 333 с.

80. Ламберт К.Дж., Берч Дж.Р. Среды для выращивания клеток // В кн.: Биотехнология клеток животных. Под ред. Спиера Р.Е. М: Мир, 1989. - С. 98-125.

81. Ласкорин Б.Н., Якшин В.В. Применение краун-эфиров и криптандов для концентрирования и разделения ионов металлов // Журн. Всесоюз. хим. общества им. Д. И. Менделеева. 1985. - №5. - С. 579-584.

82. Лебедев Н.Н., Назаренко С.А., Современные технологии молекулярной цитогенетики в диагностике хромосомных болезней человека // В сб. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. Вып. 2. Новосибирск, 2002. - С. 7488.

83. Лимфоциты. Методы. // Под ред. Клауса Дж. М.: Мир, 1990. - С. 24.

84. Луговой В.И. Первичные механизмы криоповреждения ферментов // Тез. докл. 2 Всесоюз. конф. по теоретическим и прикладным вопросам криобиологии. Харьков, 1984. - т. 1.- С. 49.

85. Луговой В.И., Карева Л.В. Влияние замораживания и оттаивания на протеолитическую активность растворимого и иммобилизованного трипсина // Укр. BioxiM. журн. т.51, №>6. - С. 620-623.

86. Луцик А.Д., Детюк Е.С., Луцик М.Д. Лектины в гистохимии. Львов.: Львовский Гос. Университет, 1989. - С. 15.

87. Львова М.Ш., Озерина Т.В., Эрман С.Я., Козлов Э.И. Действие облучения на растворы гомопантотеновой кислоты // Хим.-фарм. журнал. 1986. - № 5. - С. 617-619.

88. Люк Ю. Специальные математические функции и их аппроксимации. М.: Мир, 1980. - 608 с.

89. Малета Ю.С., Тарасов В.В. Математические методы статистического анализа в биологии и медицине. М.: Московский Гос. Университет, 1981. - 176 с.

90. Мархол М. Ионообменники в аналитической химии. ч.1. М.: Мир, 1985.264 с.

91. Матвеев В.Е., Петросян J1.E., Аксеновская В.Е. и др. Влияние режимов стерилизации на качество питательных сред при переменных значениях рН среды // Хим.-фарм. журнал. 1985. - т. 19, № з. с. 228-231.

92. Матвеев В.Е., Скворцов Г.Е., Куян Н.В. Разрушение аминокислот в растворах при нагревании // Биотехнология. 1986. - №1. - С. 53-62.

93. Махмудова Э.М., Лим Т.М., Хафизов А.Г. и др. Роль ионов Fe в структуре глутаматных рецепторов // Докл. АН УзССР. 1989. - № 3. - С. 55-57.

94. Меджидов М., Султанов 3. Использование непищевого сырья в производстве микробиологических питательных сред. Махачкала, 1986. - 72 с.

95. Медуницын Н.В. Вакцинология. М.: Триада-Х, 1999. - 272 с.

96. Методические рекомендации по контролю качества вирусологических питательных сред. М.: МЗ СССР, 1985. - 14 с.

97. Методические рекомендации по очистке сыворотки крови крупного рогатого скота, используемой для культивирования клеточных культур. М.: МЗ СССР, 1982. -26 с.

98. Методы и достижения бионеорганической химии // Под ред. Марова И.Н. М.: Мир, 1978.-416 с.

99. Методы определения микроэлементов в природных объектах // Под ред. Бусева А.И. М.: Наука, 1976. - 200 с.

100. Мещанов А. Ю., Романова М.Ж., Кольцова Г.Н. и др. Хелаты для выведения железа из организма // Гематол. и транфузиол. 1989. - т.34, №3. - С. 40-45.

101. Мицуике А. Методы концентрирования микроэлементов в неорганическом анализе. М.: Химия, 1986. - 152 с.

102. Молодкина J1.M., Власова O.JL, Коликов В.М. и др. Стерилизующая фильтрация модельных питательных сред на кассетных модулях с трековыми мембранами // Цитология. 1994. - т.36, № 6. - С. 595-596.

103. Мясоедова Г.В. Саввин С.Б. Новые хелатные сорбенты и применение их в аналитической химии // Журн. аналит. химии. 1982. - т.37, №3. - С. 499-519.

104. Назаренко А.Ю., Гуриненко Н.И. Влияние ионного фона на экстракцию 18-краун-6 и его комплексов с калием и свинцом // Укр. хим. журн. 1986. - т.52, №1. - С. 5256.

105. Норов Ш.К. Комплексообразующие и мембраноактивные свойства краун-эфиров. Ташкент: Фан, 1991. - 104 с.

106. Норов Ш.К. Взаимосвязь комплексообразующих, экстракционных и мембраноактивных свойств краун-эфиров // Журн. аналит. химии. 1987. - т.42, №3 -С. 429-434.

107. Ночевный В.Т. Биологический контроль ростовой активности питательных сред и сыворотки крови животных Л Тез. докл. Всесоюз. конф. «Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток». Новосибирск, 1991. - С. 46.

108. Овечко Н.Н., Жердева В.В., Раевская Н.К. Биоантиоксидант феназан-К изменяет уровень синтетических процессов в культивируемых клетках II Цитология. -1992.-т.34,№9.-С. 88-89.

109. Органические реагенты и хелатные сорбенты в анализе минеральных объектов // Под ред. Харламова И.П. М.: Наука, 1980. - 270 с.

110. Основы жидкостной экстракции // Под ред. Ягодина Г.А. М.: Химия, 1981.400 с.

111. Павлов Е.П., Тутов Э.Г., Самойленко И.И. и др. Использование у-излучения для микробной деконтаминации лекарственных средств // Хим.-фарм. журнал. 1992. -т.26, №2. - С. 76-79.

112. Патент 2059417 РФ, МКИ3 С 12 N 5/04. Способстерилизации питательныхсред // Данелевич В.Н., Лившиц В.А. Опубл. 1996, Бюл. №13.

113. Патент 2001628 РФ, МКИ3 А 61 L 2/00. Способ стерилизации лидазы // Стекольников Л.И., Самойленко И.И., Рыльцев В.В., Вирник Р.Б. Опубл. 1993, Бюл. № 39-40.

114. Патент 2020153 РФ, МКИ5 С 12 N 5/00. Способполучения ферментативногогидролизата и питательная среда для культивирования клеток эукариотов // Искандеров

115. Р.И., Егоров Б.Б., Ермишина И.Г. и др. Опубл. 1994, Бюл. № 18.

116. Патент 2039460 РФ, МКИ6 А 23 J 3/00. Способ получения белкового гидролизата // Арпоков А.А., Козловская Э.П., Козловский А.С. и др. Опубл. 1995, Бюл. №20.

117. Патент 2043587 РФ, МКИ6 F 26 В 5/6 Способ сушки биологическихматериалов // Григоренко А.И., Крамской Н.В., Колосков А.В. Опубл. 1995, Бюл. № 25.

118. Патент 2055482 РФ, МКИ6 С 12 N 5/00. Способ получения белковонуклеинового гидролизата // Гафуров Ю.М., Козловская Э.Л. Опубл. 1996, Бюл. №1.

119. Патент 2068879 РФ, МКИ6 С 12 N 1/00. Способ получения ферментативного гидролизата и питательная среда "Эпидермат-2" для культивирования клеток эукариотов

120. Ермишина И.Г., Майнерт А.Г., Власова Т.Ф. Опубл. 1996, Бюл. №31.

121. Патент 2074004 РФ, МКИ6 А 61 L 2/08. Комплекс радиционной стерилизации // Мирочник Э.А., Мищенко А.В., Пироженко В.М. Опубл. 1997, Бюл. №6.

122. Патент 2074249 РФ, МКИ3 С 12 N 1/00. Способ получения ферментативного гидролизата из мышечной ткани ластоногих и питательная среда "Целат" для культивирования клеток эукариотов // Ермишина И.Г., Майнерт А.Г., Власова Т.Ф. -Опубл. 1997, Бюл. №6.

123. Патент 2103360 РФ, МКИ6 С 12 N 5/00. Питательная среда для культивирования клеток эукариот и способ получения основы питательной среды -протеолитического гидролизата // Ермишина И.Г., Мейнерт А.Г., Ермолин Г.А., Дудкин С.М. Опубл. 1998, Бюл. №3.

124. Педерсен К.Д., Френсдорф Х.К. Макроциклические полиэфиры и их комплексы // Усп. химии. 1973. - т.42, №3. - С. 492-509.

125. Пивцаева М.М. Получение соевых ферментативных гидролизатов и их применение в пищевых продуктах // Автореферат дис. канд. технич. наук. М., 1991. - 24 с.

126. Пикаев А.К. Современная радиационная химия. Твердое тело и полимеры. Прикладные аспекты. М.: Наука, 1987. - 447 с.

127. Пикаев А.К. Современное состояние радиационной технологии // Успехи химии. 1995. - т.64, №6. - С. 609-639.

128. Подчерняева Р.Я., Конду Э.И., Шалунова Н.В. и др. Изучение различных ростстимулирующих белков, используемых для культивирования клеток млекопитающих // Биотехнология. -1994. №6. - С. 20-23.

129. Подчерняева Р.Я., Мельниченко Е.И., Конду Э.И. Использование ростстимулирующих белков для стандартизации условий культивирования клеток млекопитающих // Цитология. 1996. - т.38, №2. - С. 240-241.

130. Попова В.М. Усовершенствование изготовления и изучения свойств трипсина сухого для вирусологических целей. // Автореферат дис. канд. биол. наук. М., 1999. -24 с.

131. Попова В.М., Гуславский А.И. Фильтрация питательных сред, растворов и сывороток // В сб. Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Щелково, 2000. - С. 312-313.

132. Попова В.М., Гуславский А.И. Технологические аспекты производства трипсина сухого для вирусологических целей. // В сб. Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Щелково, 2000,- С. 314-315.

133. Прайс В. Аналитическая атомно-абсорбционная спектрометрия. М.: Мир, 1976.- 356 с.

134. Пригода А.С., Коренева А.И., Коновалова Е.Ю. и др. Конструирование бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих. Сообщение I // Биотехнология. 1990. - №2. - С. 35.

135. Пригода А.С., Коренева А.И. Конструирование бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих. Сообщение II // Биотехнология. -1991. №4. - С. 38-40.

136. Пригода А.С., Муратов B.C. Современное состояние, перспективы получения и использования питательных сред. Производство и применение продуктов микробиологических производств. М: ВНИИСЭНТИ минмедпрома СССР, 1989. - вып.8. -56 с.

137. Пригода А.С., Коренева А.И., Коновалова Е.Ю. и др. Конструирование бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих. Сообщение IV // Биотехнология. -1991. №5. - С. 55-59.

138. Применение активационного анализа в биологии и медицине // Под ред. Мелисашвили И.С. Тбилиси.: Мецниереба, 1977. - 103 с.

139. Пятницкий И.В., Алексюк Н.П., Назаренко А.Ю. Влияние растворителей на экстракцию комплексов металлов с дибензо-18-краун-6 и сульфофталеиновыми красителями // Укр. хим. журн. 1983. - т.49, № 3. - С. 275-279.

140. Радаева И.Ф., Костина Г.А. Исследование свойств сыворотки крови различных животных // В сб. Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротестсистем. Махачкала, 1998. - С. 15-16.

141. Раствор трипсина, стерильный. Фармакопейная статья ФС 42-131ВС-88 . М.1988.

142. Росляков Н.П. Оценка возможностей нейтронно-активационного метода анализа почв, растений и биологических проб животного происхождения // В кн. Биологическая роль микроэлементов. М.: Наука, 1983. - 238 с.

143. Рыльцев В.В., Вирник Р.Б., Довбий Е.В., Филатов В.Н. Превращение свободных радикалов в гамма-облученных ферментах при длительном хранении // Радиобиология. 1988. - т.28, №5. - С. 584-587.

144. Рыльцев В.В., Власов Л.Г., Самойлова Т.И. и др. Влияние гамма-облучения на иммобилизованный трипсин // Прикл. биохим. и микробиол. 1984. - т.20, №5. - С. 694698.

145. Самойленко И.И., Федотов И.С., Туманян М.А., Королев Н.И. Снижение бактериальной обсемененности ферментных препаратов комбинированными радиационными способами // Прикл. биохим. и микробиол. -1984. т.20, №2. - С. 239-244.

146. Самуйленко А .Я., Ломакина Г. А., Авдеева Г. А. Современное состояние и перспективы развития промышленного производства ветеринарных препаратов. Биотехнологическое производство. М.: ВНИИСЭНТИ, 1994. вып.З. - С. 8.

147. Сандахчиев Л.С., Зиновьев В.В, Подчерняева Р.Я. Применение ферментного препарата «коллаза» в работе с клеточными культурами // Цитология. 1992. - т.34, № 9. -С. 102-103.

148. Седых Н.В., Кристапсонс М.Ж. Контроль качества в биотехнологии. Рига: Зинатне, 1990. - С. 22-25.

149. Синьков Н.А., Минаева Н.А. Об анионном и катионном эффекте в спектральном анализе золы биологических объектов // Журн. прикл. спектроскоп. 1979. -т.ЗО, № I. - С. 15-21.

150. Сирица И.И., Лымарь В.Т., Лобанова Т.Н. Проточно-фильтрационный способ культивирования клеток млекопитающих // Цитология. 1996. - т.38, № 2. - С. 247-248.

151. Ситьков В.И., Сурмилова А.П., Лепишко В.И. Отработка методов фильтрации сывороточных питательных сред// Вестник ветеринарии. 1996. - № 1. - С. 71-73.

152. Сперанская И. Д. Современные методы изготовления культуральных питательных сред // Автореферат дис. . канд. биол. наук. М., 1981. - 20 с.

153. Сперанская И.Д., Туманян М.А., Миронова Л.Л. Использование у-излучения для приготовления культуральных питательных сред // Радиобиология. 1977. - т. 17, №6. -С.881-885.

154. Тальрозе В.Л., Трофимов В.И. Криорадиационная стерилизация новый способ стерилизации инъекционных лекарственных препаратов // Тез. докл. I Всесоюз. конф. по прикладной радиобиологии. - Кишинев.; "Штиинца". -1981. - С. 111-112.

155. Тальрозе В.Л., Трофимов В.И. Проблемы радиационной стерилизации // Химия высоких энергий. 1983. - №17. - С. 233.

156. Ташмухамедов Б.А., Гагельганс А.И., Ташмухамедова А.К. и др. Синтез, мембраноактивные свойства и биологические эффекты краун-эфиров // Ташкент. :ФАН, 1987.-С. 83-121.

157. Терек Т., Мика И., Гегуш Э. Эмиссионный спектральный анализ. М.:Мир, 1982.-286 с.

158. Теория и практика экстракционных методов // Под ред. И.П.Алимарина и В.В.Багреева. М.: Наука, 1985. - 270 с.

159. Технические условия ТУ 46 12 20 -80. Ферментативный гидролизат мышечных белков сухой.

160. Технические условия ТУ 10.07.44-90. Ферментативный гидролизат белков сыворотки молока.

161. Технические условия ТУ 10.09.-137-91. Ферментативный гидролизат белков крови сухой.

162. Трофимов В.И. Радиационная стерилизация // Вестник "РадТех-Евразия". -1993.-№.1(5).-С. 43.

163. Трофимов В.И. Радиационные технологии стерилизации для трансфузиологии // Новое в трансфузиологии. 1994. - N29. - С. 63-65.

164. Туманян М.А., Каушанский Д.А. Радиационная стерилизация. М.:Медицина, 1974. - 304 с.

165. Туманян М.А. Микробиологические аспекты способа радиационной стерилизации // Тез. докл. I Всесоюз. н-т конф. по радиационной стерилизации медицинской продукции. М., 1978. - С. 5-6.

166. Туманян М.А., Самойленко И.И., Васильева Е.И. Разработка комбинированных способов стерилизации // Мат. Всес. науч. конф. «Дезинфекция и стерилизация, перспективы развития». Волгоград, 1983. - С. 53.

167. Тутова Э.Г., Куц П.С. Сушка продуктов микробиологического производства.-М.: Агропромиздат, 1987. 303 с.

168. Уильяме Д. Металлы жизни. М.: Мир, 1975. - 236 с.

169. Федотова А.В., Снежко А.Г., Федотов А.В. и др. Выращивание клеток щитовидной железы при пониженных концентрациях сыворотки крови // Цитология. -1994. т.36, №6. - С. 537-538.

170. ФС 42-76ВС-87. Сыворотка крови крупного рогатого скота для культур клеток, сухая. М.: МЗ СССР, 1987. - 5 с.

171. Фуголь О.А. Разработка технологии получения и применения соевых ферментативных гидролизатов // Автореферат дис. канд. технич. наук. М., 1997. -24 с.

172. Химия комплексов "гость-хозяин". Синтез структуры и применения // Под ред. Фегтле Ф. и Вебера Э. М.: Мир, 1988. - 511 с.

173. Хираока М. Краун-соединения. Свойства и применение. М.: Мир, 1986.363 с.

174. Хьюз М. Неорганическая химия биологических процессов. М.: Мир, 1983.416 с.

175. Царева А.А. Каталог перевиваемых культур клеток. Новосибирск, 1988. - т.2. Деп. в ВИНИТИ 29.01.88, № 866-888.

176. Цонева М.Т. Фитогемагглютинин из Phaseolus vulgaris. Свойства и аспекты применения // Автореферат дис. д-ра мед. наук. М.: Варна, 1967. - 24 с.

177. Чанышева Т. А., Шелпакова И.Р. Унифицированный метод атомно-эмиссионного спектрального анализа объектов разной природы // Аналитика и контроль. -2002. т.6, №3. - С. 298-306.

178. Шелпакова И.Р., Юделевич И.Г., Чанышева Т.А. и др. Метрологические аспекты химико-спектрального анализа материалов особой чистоты // В кн. Методы спектрального анализа минерального сырья. Новосибирск.: Наука, 1986. - С. 63-68.

179. Штерншис В.М. Принципы повышения эффективности вирусных препаратов. // В кн. Энтомопатогенные вирусы и их роль в защите растений. Новосибирск, 1988. -С. 14.

180. Юделевич И.Г. Исследования в области анализа веществ высокой чистоты и полупроводниковых материалов // Автореферат дис. д-ра хим. наук. Новосибирск, 1972.-420 с.

181. Ядерно-физические методы анализа в контроле окружающей среды // Труды Ш Всес. совещания. J1.: Гидрометеоиздат, 1987. - 172 с.

182. Ядерно-физические методы и установки. М.: Энергоатомиздат, 1986. -100 с.

183. Якшин В.В., Филиппов Е.А., Белов В.А., и др. "Короны" в процессах экстракции урана и актинидов из азотнокислых растворов // Докл. АН СССР. 1978 -т.241, №1. - С. 159-162.

184. Яцимирский К.Б., Лампека Я.Д. Физико-химия комплексов металлов с макроциклическими лигандами. Киев.: Наук, думка, 1985. - 256 с.

185. Aalto J., Pakkanen R., Samata L. Colostrum fraction, a process of preparing it and its use as a supplement in cell culture media // U.S. Patent 5,500,229. Intem'l Class: С12 N 005/00. Current U.S. Class: 424/535. 19.03.1996.

186. Alleu J.T., Calhoun R., Helm J. et al. A fully integrated 10 MeV electron beam sterilization system // Radiat. Phys. and Chem. 1995. - vol.46, N 4-6. - P. 457-460.

187. Arniaud Didier, Brenner I.B. A new attempt to improve detertion capabilities of ICP-AES for the determination of Al in biological and environmental materials // ICP. Inf.

188. Newslett. 1990. - vol.16, N 1. - P.657.

189. Auslender V.L., Polyakov V.A., Golnik A.G. et al. The installation for the single use medical devices sterilization based on the electron accelerator type ILU // Radiat. Phys. and Chem. 1993. - v.42, N1-3. - P.563-566.

190. Bare G., Charlier H., Verhoeye F. Effect of plant protein hydrolysates on culture of CHO cells in media with serum, without serum and without protein // 17th Meeting of ESACT

191. From target to market", Sweden. 2001. - P.160.

192. Barnes D., Sato G. Serum-free cell culture: A unifying approach // Cell. 1980. -vol.22. - P. 645-655.

193. Barnes D., Sato G. Methods for grows of cultured cells in serum-free medium // Analytical Biochemistry. 1980. - vol.102. - P. 255-269.

194. Benjakul S., Morrissey M. Protein hydrolysates from pacific whiting solid wastes //• Arg. and Food Chem. 1997. - vol.45, N 9. - P. 3425-3430.

195. Bertheussen К. Serum-free growth medium and use thereof // U.S. Patent 5,045,647. Intern'l Class C12 N 005/02. Current U.S. Class 435/404. 03.09.1991.

196. Beston David L., Bryles Tatty. Deferoxamine inhibition of human neuroblastoma viability and proliferation // Cancer Res. 1989. - vol.49, N 1. - P. 7189-7192.

197. Bettger W.J., McKeehan W.L. Mechanisms of cellular nutrition // Physiological Reviews. -1986. vol.66. - P. 1-35.

198. Blotcky A.J., Hahn N.K.J. Ogborn R.E. Neutron Activation analysis of manqanese in biological samples //J. Radioanal. Chem. 1969. - vol.2, N 5-6. - P. 345-352.

199. Brandli J. Influence of HTST-Sterilization for Growth of Serum-Free Cell Cultures // Abstract 16th Int. Meet. Products from Cells Cells as Products., Switzerland. -1999. P. 217.

200. Brown A.A. Applications of slotted quarts tube and flame atomic-absorption spectrometry to the analysis of biological samples // Analyst. 1985. - vol.110, N 6. - P. 579581.

201. Brown A.A., Milner B.A., Taylor A. Use of slotted quarts tube to enhance the sensitivity of conventional flame atomic-absorption spectrometry // Analyst. 1985. - vol.110, N5.-P. 501-505.

202. Byrne A.R., Versieck J. Vanadium determination at the ultratrace level in biological reference materials and serum by radiochemical neutron activation analysis // Biol. Trace. Elem. Res. 1990. - N 26-27. - P. 529-540.

203. Caple M. Devevopment of serum-free medium // 17th Meeting of ESACT "From target to market". 2001. - P. 213

204. Castle P., Robertson J. Animal sera, animal sera derivatives and substitutes used in the manufacture of pharmaceuticals: viral safety and regulatory aspects // Dev. Biol. Standard. -1999.-vol.99.-P. 191-196.

205. Chan H.M., Muramoto H. Antioxidant activity of disigned peptides based on the antioxidative peptide isolated from degists of a soybean protein // Arg. and Food Chem. 1996. -vol.44, N 9. - P. 2619-2623.

206. Charles R. Species specificity of iron delivery in hybridomas // In vitro Cell, and

207. Dev. biol. 1988. - vol.24, N 5. - P. 413-419.

208. Charlier G., Ptrole R., Van A. Procedure for PEG treatment of bovine sera used for cell culture in virus diagnosis // J. Сотр. Immunol., Microbiol. And Infect. Res. 1981. - vol.4, N 3-4. - P. 279-283.

209. Chatzisavido N., Fenge C., HaggstrOm L. Cell survival in CHO cell cultures grown in a defined protein free medium //15th Meeting of ESACT "New developments and applicationsin animal cell technology". 1998. - P. 227-229.

210. Chen Zhaolie, Xiao Chengzy. A novel serum- free medium for the cultivation of Vero cells on microcarriers // Biotechnol. Techn. 1996. - N 6. - P. 449-452.

211. Christensen M. A. Fluid bed dryer and a bed plate therefor // U.S. Patent 4,885,848. Intern'l Class: F26 В 017/00. Current U.S. Class: 34/582. 12.12.1989.

212. Christensen M., Madsen В., Bonde M. Bed plate for a fluidized bed apparatus and amethod for making the same // U.S. Patent 5,392,531. Intern'l Class: F26 В 017/00. Current U.S. Class: 34/583.-28.02.1995.

213. Cleghorn D.A., Nablo S.V. Electron sterilization validation techniques using the controlled depth of sterilization process // Radiat. Phys. and Chem. 1990. - vol.35, N 1-3. -P. 382.

214. Cleland M.R., Thompson C.C., Strelczyk M. Advances in X-ray processingtechnology // Radiat. Phys. and Chem. 1990. - vol.35, N 4-6. - P. 632-637.

215. Cleland M.R. X-ray processing a review of the status and prospects // Radiat. Phys. and Chem. 1993. - vol.42, N 1-3. - P. 499-503.

216. Coleman W.H., Roberts W.K. Inhibitors of Animal Cell-Free Protein Synthesis from Grains // Biochim. Biophys. Acta. 1982. - N 6. - P. 236-244.

217. Colldi P., Rawson C., Barnes D. Serum-free culture of carcinoma cell lines // Cytotecnology. 1991. - N 5. - P. 31-46.

218. Dalev P., Simeonova L. Enzyme hydrolysates for nutrition from slaughter blood and soya proteins // Biotechnol. and Biotechnol. Eng. 1994. - N 2. - P. 42-45.

219. Dam A.M.,Gazco L.G., Kaewpila S. Radiation treatment of pharmaceuticals // Radiat. Phys. and Chem. 1996. - vol.47, N 3. - P. 515-517.

220. DiSorbo D.M., Jaymed D.W. Media concentrate technology // U.S. Patent 5,474,931. Intem'l Class C12 N 005/00. Current U.S. Class: 435/407. 12.12.1995.

221. Donard O., Pedemay Ph. Improvements in. the determination of mercury by cold-vapour atomic absorption spectrometry // Anal. Chim. Acta. 1983. - vol.153, N 1. - P. 301-305.

222. Dulbecco R., Voght M. Plaque formation fnd isolation of pure lines with poliomyelitis virus // J. Exp. Med. 1954. - vol.99. - P. 107-182.

223. Dunkan L. Clinical analysis by atomic absorption spectroscopy. Varlan. Techron Pty Ltd., Australia, 1976. - P. 25-37.

224. Eagle H. Anima acid metabolism in mammalian cell cultures // Science. 1959. -vol.130.-P. 432-437.

225. Eagle H., Piez H. The population-dependent requirement by cultured mammalian cell for metabolites which they can synthesize // J. Exp. Med. 1962. - vol. 116, N 1. - P. 29-42.

226. Eriscon S.P., McHalaky M.L., Jaselskis B. Ultra trace molybdenum determination in biological samples by graphite furnace atomic-absorption spectrometry // Talanta. 1987. -vol.34, N 2. - P. 271-276.

227. Fagioli F. Determination of elements in biological materials by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry with sampling of carbonaceous slurry // J. Anal. Atom. Spectrom. -1990. vol.5, N 6. - P. 519-522.

228. Favier A., RufFieux D., Amaud J. Matrix effection serum trace elements analysis byflameless atomic absorption // Nutr. Res. 1985. - N 1. - P. 63-70.

229. Fernandez F.J., Giddings R. Elimination of spectral interferences using Zeeman effect background correction // Atom. Spect. 1982. - vol.35, N 3. - P. 61-65.

230. Gidrol X., Lin W.S., Degousee N. Accumulation of reactive oxygen species and oxidation of cytokinin in germinating soybean seeds // Eur. J. Biochem. 1994. - vol.224, N 1. -P. 21-28.

231. Gitelman H.J., Alderman F.R. Determination of silicon in biological samples using electrothermal atomic absorption spectrometry // J. Anal. Atom. Spectrom. 1990. - vol.5, N 8. -P. 687-689.

232. Gonze M.M., et al. Development of CHO cell serum free culture process for expression of recombinant viral glycoprotein // 14,h Meeting of ESACT "Animal cell technology from vaccines to genetic medicine", Portugal. 1996. - P. 455-459.

233. Griffits Bertia В. McClain Oza. The role of iron in the growth and hemolysin (streptolysins) production in streptococcus pyogenous // J. Basic microbiol. 1988. - vol.28, N 7. - P. 427-436.

234. Ham R.G. Surviral and growth requirements of nontransformed cells// In : Tissue growth factor // Ed. R. Baserga.- Berlin etc. -1981. P. 13-88.

235. Ham R.G. Impotance of the basal nutrient medium in the desing of hormonally defined media // Growth of cells in hormonally defined media. Cold Spring 1982. - P. 39-60.

236. Handlos V. Sterilization by electron beam // Radiat. Phys. Chem. 1981. - vol.18.1. P.175.

237. Hanff C., Fuhr В., Johnson Т., Caple M. Medium for Gene Therapy: Improved protein- free media, for growth and production of viral vectors for use in gene therapy // 17th Meeting of ESACT "From target to market", Sweden. 2001. - P. 213.

238. Hang N.D., Canh T.T., Thuy T.T. Radiation sterilisation of traditional medicine drugs in Vietnam // Radiat.Phys.and Chem. 1995. - vol.46, N 4-6. - P. 623-627.

239. Hassold Т., Chen N., Funkhouser J. et al. A cytogenetic study of 1000 spontaneous abortions // Ann. Hum. Genet. 1980. - vol.44. - P. 151-178.

240. Hayhlik L., Jacobs P., Percins N.F. A procedure for the standartization of tissue culture media // Nature. 1964. - vol.204, N 10. - P. 146-147.

241. Hegary E.L., Sayed A., Seguchi T. et al. Radiation-induced oxidative degradation of isotactic polypropylene // J. Appl. Polym. Sci. -1981. vol.26, N 1. - P. 1361-1372.

242. Heidemann R., Zhang C., Rule J. et al. The use of peptones as medium additives for high-density perfusion cultures of animal cells // 14th Meeting of ESACT "Animal cell technology from vaccines to genetic medicine", Portugal. 1996. - P. 195-197.

243. Hesse F. Application of protein- free cell culture media for the manufacturing of biopharmaceuticals // 17th Meeting of ESACT "From target to market", Sweden. 2001. - P. 184.

244. Hewlett G. Strategies for optimizing serum free media // Cytotecnology. 1991. -N5.- P. 3-14.

245. Hill A.D., Patterson K.J., Veillon C. Morris E.R. Digestion of biological materials for mineral analyses using a combination of wet and dry ashing // Anal. Chem. 1986. - vol.58, N 11.-P. 2340-2342.

246. Hiraoka M. Crown compounds, their characteristics and applications. Tokyo.: Kodansha-Elsevier, 1982. - 275 p.• 258. Hubelly H. // Progr. Colloid. Polym. Sci. 1977. - vol.52. - P. 56-70.

247. Huefeng J., Gerhard Schard Schlemmer, Welz B. Cadmium determination in biological materials using graphite furnace atomic absorption spectrometry with palladium nitrate ammonium nitrate modifier// Anal. Chem. - 1987. - vol.59, N 10. - P. 1462-1466.

248. Inlow D„ Maiorella B. Serum free media for the growth on insect cells and expression of products thereby // U.S. Patent 5,024,947. Intem'l Class CI2 N 005/00. Current• U.S. Class 435/404. 18.06.1991.

249. Jamge M., Perren S.M. Influences of metal salts on immune responses in vitro // Biomaterials and Biomechanics. 1983. - N 2. - P. 227-232.

250. Ш, 263. Jensen Jens P. Apparatus for crystallizing whey // U.S. Patent 5,006,204. Intem'l

251. Class: B01 D 001/18. Current U.S. Class: 159/3. 18.06.1991.

252. Kalyazin E.P. Comparison of the radiation and conventional processing // Radiat. Phys. and Chem. 1995. - vol.46, N. 4-6. - P. 453-456.

253. Kao K., Ross J., Fuhr В., Caple M. New advance protein-free, animal component-free medium for recombinant protein expression in adherent CHO cell cultures // 17th Meeting of ESACT "From target to market", Sweden. 2001. - P. 153.

254. Keay L. Autoclavable Low Cost Serum-Free Cell Culture Media. The Growth L-Cells and BHK Cells on Peptones // Biotechnol. Bioeng. 1975. - N 17. - P. 745-764.

255. Kilroe-Smith T.A., Rolin H.B. Some observations on the effect of assign temperature on the determination of aluminium in serum by furnace atomic absorption spectrophotometry // Microchem. J. 1990. - vol.42, N 3. - P. 349-354.

256. Kiriyama Т., Kuroda R. Determination of vanadium, cobalt, copper, zinc and cadmium in biological materials by a combined anion-exchange:-spectrophotometric method // J. Chromatogr. 1986. -vol.21, N 1.- P. 12-15.

257. Kiss Tomas, S. Zoltan. Studies on transition metal peptide complexes. Part 12. Copper (II) complexes of dipeptides containing phenylalanine and tyrosine // J. Chem. Soc. Dalton Trans. 1986. - N 11. - P. 2443-2447.

258. Kistner O., Barrott P., Mundt W. Development at a novel influenza vaccine derived from a continuos cell line // Altex. 2001. - N 18. - P. 50-54.

259. Kovar Jan, Franek Frantisek. Iron compounds at high concentrations enable hybridoma growth, in a protein-free medium // Biotechnol. Lett. 1987. - vol.9, N 4. - P. 259264.

260. Kowalska E. Influence of kinetin on human fibroblasts in the cell culture I J Folia Morphol. (Warsz). 1992. - vol. 51, N 2. - P. 109-118.

261. Kraft G. Heavy ion effects on cellular and subcellular systems: inactivation, chromosome aberrations and strand breaks induced by iron and nickel ions // Adv. space res.1986. vol.6, N 11.-P. 127-136.

262. Krezoski S.K. Kinetic lability of zinc bound to metallothionein in ehrlich cells // Biochem. J. 1988. - vol.255, N 2. - P. 483-491.

263. Kunwar Uttam K., Littlejohn D., Halls D.J. Hot injection procedures for the rapid analysis of biological samples by electrothermal atomic-absorption spectrometry // Talanta. -1990. vol.37, N 8. - P. 555-559.

264. Kwon Joong-Ho, Byun Myung-Wo. Gamma irradiation combined with improved packaging for preserving and improving the quality of drid fish // Radiat. Phys. and Chem.1995. vol.46, N 4-6. - P. 725-729.

265. Liborius Erik. Process and apparatus for drying and calcining sodium bicarbonate // U.S. Patent 5,325,606. Intern'l Class: F26 В 017/10. Current U.S. Class: 34/589. 05.07.1994.

266. Loon J.C. Selected methods of trace metal analysis biological and environmental samples. New York, 1985. - P. 123-136.

267. Mac M. The adverse effects of UV and short-wavelength visible radiation on tissue culture // Amer. Biotechnol. Lab. 1986. - vol.4, N 4. - P. 30-31.

268. Magetto C., Pirotten S., Knott I. et al. Development of a serum free medium for MRC-5 culture // 14th Meeting of ESACT "Animal cell technology from vaccines to geneticmedicine", Portugal. 1996. - P. 463-465.

269. Majoul S., Kharmachi H., Saadi M. et al. Adaptation of Vero cells to a serum free medium for the production of rabies virus. // 14th Meeting of ESACT "Animal cell technology from vaccines to genetic medicine", Portugal. 1996. - P. 467-469.

270. Marrella Mauro, Milanino Roberto. Simple and reproducible methods for acid extraction of copper from rat tissue for determination by flame atomic absorption spectroscopy.

271. Atom, spectrosc. 1986. - vol.7, N 1. - P. 40-42.

272. Mather J.P., Tsao M.C. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins // U.S. Patent 5,122,469. Intern'l Class: C12 NA005/00. Current U.S. Class: 435/383. 16.06.1992.

273. Mather I. Effect of water purity and addition of common water contaminants of the growth of cells in serum-free media// Biotechnigues. 1986. - vol.4, N 1. - P. 56-63.

274. Matthews D.C., McGahan M.C. Cyctein on effective matrix modifier for determination of gold in biological samples by electrotermal atomic absorptionspectrophotometry // Spectrochimica acta. 1987. - vol.42B, N 7. - P. 909-913.

275. McKown D.M., Morsis J.S. Rapid measurement of selenium in biological samples using instrumental neutron activation analysis // J. Radioanal. Chem. 1978. - vol.43, N 2. -P. 411-420.

276. Melnik I.L., Riordan. Polymelitis viryses in tissue culture iv Protein free nutrient media in stationary and roller tube cultures // Proc. for Exp. Biol. Med. 1952. - N 1. - P. 208* 213.

277. Merten O.W., Couve R., Wu R. Evalution of serum-free medium MDSS2 for the production of poliovirus on Vero cells in bioreactor // Cytotechnology. 1997. - vol.25. - P. 3541.

278. Merten O.W., Kierulff J.V., Castignolles N., Perrin P. Evalution of the new serum free media (MDSS2) for the production of different biological: use of various cell lines //m Cytotechnology. 1983. - vol.14, N 1. - P. 47-59.

279. Meshitsuka S., Ishizawa M., Nose T. Uptake and toxic effect of heavy metal ions. Interactions among cadmium, copper and zinc in cultured cells II Experiential. 1987. - N 43. -P. 151-156.

280. Mesyats G.A., Shpak V.G., Yalandin M.I., Shunailov S.A Compact RADAN electron accelerators for testing new radiation technologies and sterilization // Radiat. Phys. and• Chem. 1995. - vol.46, N 4-6. - P. 489-492.

281. Moore George E. Culture media for mammalian cells // U.S. Patent 5,328,844. Intern'l Class: C12 N 001/00; C12 N 005/00. Current U.S. Class: 435/405. -12.07.1994.

282. Nakama Akihiko, Yamada Akio. Serum-free culture of human hepatome Hep-2 cells with egg yolk low densiry lipoprotein // Biosci., Biotechnol. and Biochem. 1993. - vol.57, N 3. -P. 410-413.

283. Neigen H., Poulsen A., Bertheussen K. Degradation of cell culture media by light // Cytotechnology. 1989. - N 2. - P. 79.

284. Щ 297. Neuza M., Frazzati G., Padi R. Higher production of rabies virus in serum-freemedium cell cultures on microcarriers // J. Biotechnology. 2001. - vol.92. - P. 67-72.

285. Odera M., Nagakura K., Tanaka J. Radiosterilization of thermolabile materials

286. Radiat. Phys. Chem. 1990. - vol.35, N 1-3. - P. 393-395.

287. Olsen A., Siboska G.E., Clark B.F. N(6)-Furfuryladenin, kinetin, prospects against fenton reaction-mediated oxidative damage to DNA // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999.• -N19.-P. 265.

288. Palach A., Scheepers H. Safety, reactogenicity and immunogenecity of Madin Darby Canine kidney cell-derived inactivated influenza subunit vaccine // Dev. Biol. Stand. 1999. -vol.98. - P. 115-125.

289. Parr Robert M., Cortes-Toro Eduardo. Applications of nuclear analytical methods in the life sciences as exemplified by recent research programs of the IAEA // Biol. Trace. Elem.

290. Res. 1990. - N 26-27. - P. 671 -681.

291. Paschal D.C., Bailey G.G. Determination of vanadium in urine with graphite furnace AAS using Zeeman correction // Atom. Spectrosc. -1990. vol.11, N 2. - P. 65-69.

292. Pasternak C.A. A novel form of host defence: membrane by Ca2+ and Zn2+ // Biosci. Repts. 1987. - vol.7, N 2. - P. 81-91.

293. Peehl D.M., Stamey T.A. Serum-free growth of adult human prostatic epithelialm cells // In vitro Cell. Dev. Biol. 1986. - vol.22, N 2. - P. 82-90.

294. Petersen; Bjarne M. Method and apparatus for heat treating a particulate product // U.S. Patent 5,133,137. Intem'l Class: F26B 017/10. Current U.S. Class: 34/576. 28.07.1992.

295. Pirotton S., Dewelle J., Eliaer F. et al. Development of a serum free medium for a human diploid fibroblast cell line // 14th Meeting of ESACT "Animal cell technology from vaccines to genetic medicine", Portugal. 1996. - P. 191-193.

296. Price Paul J.; Gorfien S., Danner D. Animal cell culture media comprising derived from rice // U.S. Patent 6,103,529. Intem'l Class: C12 N 005/00. Current U.S. Class: 435/404.1508.2000.

297. Process Control Guideness for Gamma Radiation Sterilization of Medical Devices. Association for the Advancement of Medical Instrumentation, Arlington, VA (USA), 1984.

298. Rolf A. Lovstad. Copper catalyzed oxidation of ascorbate (vitamin C). Inhibitory effect of catalase, superoxide dismutase, serum proteins (ceruloplasmin, albumin, apotransferrin) and amino acids // Int. J. Biochem. 1987. - vol.19, N 4. - P. 309-313.

299. Ф 310. Rosen J.F., Pounds J.G. Lead perturbs calcium homeostasis in cultured osteoblasticbone cells // Toxicologist. 1986. - N 6. - P. 102-103.

300. Sandstrom Bj6rn E.R., Carlsson J6rgen, Marklund Stefan L. Variation among cultured cells in glutathione peroxidase activity in response to selenite supplementation // Biochem. et biophys. Acta: Mol. Cell. Res. 1987. - N 2. - P. 148-153.

301. Schmidt D. Untersuchungen uber den einflub von schwermetallionen auf das wachstum von ВНК-21-zellkulturen // Arch. Experim. veterinarmedizin. 1982. - N 6. - S. 845851.

302. Shidhaye Supriya, Damle Avanti. Decontamination of veegum by gamma radiation

303. II Indian J. Pharm. Sci. 1995. - vol.57, N 4. - P. 187-188.

304. Siemensma A., Huttinga H. Vegetable protein hydrolysates play a key role in non-animal media in replacing free amino acids and serum in mammalian cell culture // 17th Meeting of ESACT " From target to market", Sweden. 2001. - P. 152.

305. Simpson N.H., Hendrikus B.A., Wegkamp H.B.A., Bulthuis B.A. Metabolic shifts in hybridoma cells utilising wheat peptides // 17th Meeting of ESACT " From target to market", Sweden.-2001.-P. 151.

306. Sinacore M.S., Drapeau D., Adamson S.R. Adaptation of mammalian cells to growth in serum-free media // Moll.Biotechnol. 2000. - vol.15, N 3. - P. 249-257.

307. Streiher R.M. Sterilization and longterm aging of medical-grade UHMWPE // Radiat. Phys. and Chem. 1995. - vol.46, N 4-6. - P. 893-896.

308. Sunderman F. Determination of nickel in water, body fluids, tissues and excreta // Environ. Carcinogens Selec. Meth. .Anal. 1986. - N 8. - P. 319-334.

309. Takehisa M. Sterilisation with electron accelerators: Pap. Workshops Util Electron Bangkok and Jakarta, July 9 and 13,1992 // JAERI-M. 1993. - N 93-160. - P. 132-142.

310. Takehisa Masaaki. International standard of radiation sterilization current trend of dose setting and the issues // 6-th Jap.-China Bilateral Symp. Radiat. Chem., Tokio, N 6-11, 1994. // JAERI-Conf. 1995. - N 95-003. - P. 603-606.

311. Talka P.G., Mohamed H.A., Fahmy F. Determination of lead in sheep's blood by graphite-furnace atomic absorption spectrometry using a modified chelation and extraction procedure// Analyst. 1987. - vol.112, N 12. - P. 1697-1699.

312. Talrose V.L., Trofimov V.I. Cryoradiation sterililization: Contemporary state and outlook // Radiat. Phys. and Chem. 1995. - vol. 46, N 4-6. - P. 633-637.

313. Tcao Ming-Sound, Sanders George H.S., Grisham Joe W. Regulation of growth of cultured hepatic epithelial cells by transferrin // Exp. Cell Res. 1987. - vol.171, N 1. - P. 51-62.

314. Tinggi V., Mather W. Determination of trace elements in biological tissue by aluminium block digestion and spike-height flame atomic absorption spectrometry // Microchem. J. 1986. - vol.33, N 3. - P. 304-308.

315. Vasconcellos M.B. Radiochemical separation methods of the determination of some toxic elements in biological reference materials // J. Radioanal. and Nucl. Chem. Lett. -1991. -vol.153, N3.-P. 185-199.

316. Veillon Claude. Trace element analysis of biological samples // Anal. Chem. 1986. -vol.58, N8.-P. 851-852.

317. Verbeke P., Siboska G.E., Clark B.F. Kinetin inhibits protein oxidation and glycoxidation in vitro // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. - vol.276, N 3. - P. 12651270.

318. Verhoeyel F,, Burteaul C., Molse J. et al. Use of plant peptone-containing serum-free media for the cultivation of CHO cells in suspension and on fibra-cel microcarriers // 17lh Meeting of ESACT "From target to market", Sweden. 2001. - P. 183.

319. Versieck J., Vanballenberghe L. Determination of tin in human blood serum by radiochemical neutron activation analysis // Anal. Chem. -1991. vol.63, N 11. - P. 1143-1146.

320. Verwej H., Dubellman T. Photodynamic protein cross-linking // Biochem. Biophys. Acta. -1981.-N647.-P. 212-218.

321. Viellon C., Lewis S.A., Patterson K.J. et al. Characterization of bovine serum reference material for major, minor and trace elements // Anal. Chem. 1985. - vol.57, N 11. -P. 2106-2109.

322. Von Der Osten Glaus H., Gioannetti Catherine, Sinskey Anthony J. Design of a defined medium for growth of corynebacterium glutamicum in which citrate facilitates iron uptake//Biotechnol. Lett. 1989. -vol.11,N 1.-P. 11-16.

323. Wang X.W., Imbra R.J., Costa M. Characterization of mouse Cell lines resistant of nickel (II) ions // Cancer Research. 1988. - vol.48. - P. 6850-6854.

324. Ward N.I., Abou-Shakra F.R., Durrant S.F. Trace elemental contain of biological materials. A comparison of NAA and ICP-MS analysis // Biol. Trace. Elem. Res. 1990. - N 26-27.-P. 177-178.

325. Waymouth C., Ham R.G. Major ions, buffer systems, pH, osmolality and water quality. Cambridge Univ. Press. London and New York, 1981. P. 105-107.

326. Weiss M. Stability data prove critical for assung biopharmaceutical shelf life // Genet. Eng. News. 1994. - vol.2, N 14. - P. 10-27.

327. Whitby James L. Microbiological aspects relating to the choice of radiation sterilisation dose // Radiat.Phys.and Chem. 1993. - vol. 42, N 4-6. - P. 577-580.

328. Whitby James L. Radiation resistance of Acinetobacter spp // Radiat. Phys. and Chem. 1995. - vol.46, N 4-6. - P. 639-642.

329. Whiteside P.J., Dymott T.C., Kullmer G., Green P.M. Ein continuierlich arbeitendes guecksilber-hydrid-system fur die atomabsorption // Chem. Fttr lab. und Betr. 1985. - bd36, N l.-S. 21-24.

330. Wilski H. Radiation stability of polimers // Inter. J. Radiat. Applications and Instrumentation. -1990. vol.35, N 1-3. - P. 186-189.

331. Woolston J. Radiation sterilisation: A contract steriliser's view // Radiat. Phys. and Chem. 1995. - vol.46, N 4-6. - P. 587-590.

332. Yang J., Zhang J., Huang Z., Wang Z. Correlation of cytokinin levels in the endosperm and roots with cell number avd cell division activity during endosperm development in rice // Ann. Bot. 2002. - vol.90, N 3. - P. 369-377.

333. Yasuyki Т., Yasuyki 0., Sadatoshi A. Behavior of benzo-18-crown-6 complexes with alkali metal ions in various nonaqueous solvents // Bull. Chem. Soc. Jap. 1984. - vol.57, N12.-P. 3381-3387.

334. Yotsumoto K., Sunaga H., Tanaka S. et al. High power bremsstrahlung X-ray sourse radiation processing// Radiat. Phys. Chem. 1988. - vol.31. - P. 363-368.