Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии получения биопрепаратов с использованием клеточных культур in vitro на структурированных носителях

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии получения биопрепаратов с использованием клеточных культур in vitro на структурированных носителях"

На пра^^^кориси

Буянова Алена Сергеевна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР IN VITRO НА СТРУКТУРИРОВАННЫХ НОСИТЕЛЯХ

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

11 MAP 2015

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Бийского технологического института (филиала) ФГБОУ ВПО «Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползунова»

Научный руководитель: кандидат химических наук,

доцент кафедры биотехнологии Ламберова Марина Эдуардовна

Официальные оппоненты:

Канарский Альберт Владимирович, доктор технических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет», кафедра пищевой биотехнологии, профессор

Зобова Наталья Васильевна, доктор сельскохозяйственный наук, старший научный сотрудник, ФГБНУ "Красноярский научно-исследовательский институт сельского хозяйства", заведующая отделом оценки селекционного материала

Ведущая организация: ФГБОУ ВО "Российский государственный аграрный университет-МСХА им. К.А. Тимирязева"

Защита диссертации состоится «10» апреля 2015 г. в 10.00 ч на заседании диссертационного совета Д 212.253.01 при ФГБОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет» по адресу: 660049, Красноярск, пр. Мира, 82, аудитория Ц-110 (зал заседаний).

Отзывы на автореферат в двух экземплярах с подписями, заверенными печатью, просим направлять по адресу: 66WK9, г. Красноярск, пр. Мира 82, Сибирский государственный технологический университет, учёному секретарю. E-mail: dissovetsibgiu01@mail.nj

В отзыве указывается фамилия, имя. отчество, почтовый адрес, телефон и адрес электронной почты (при наличии), наименование организации и должность лица, представившего отзыв (п. 28 Положения о присуждении ученых степеней)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского государственного технологического университета.

Автореферат разослан «/7 » фИШаЛ 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор технических наук, профессор

Исаева Елена Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Аютальность работы. В условиях перепроизводства синтетических препара-ов для повышения плодородия почвы и урожайности сельскохозяйственной про-'кции в России и за рубежом, а также при реализации комплексной всесторонней рограммы по производству безопасной, экологически чистой пищевой продукции, ффективным считается применение натуральных биопрепаратов стимулирующего, ормонального и азотфиксирующего действия. Поэтому вопросы, связанные с раз-аботкой новых биотехнологических подходов к технологии их получения являются ктуальными.

В настоящее время для сельского хозяйства на полях и в теплицах, а также для адоводов и огородников выпускается большой ассортимент удобрений химических инерапьных и органических) и препаратов, ускоряющих рост растений, с гормо-ами и другими стимуляторами. Важнейшая роль принадлежит азотсодержащим и ефицитным минеральным элементам, которые выносятся из почвы с каждым уро-аем и требуют восполнения. На рынке существуют такие товарные формы препа-атов, как жидкие, жидко-концентрированные, сухие (порошкообразные, гранули-ованные, таблетированные). Под каждую форму имеются способы применения и грегаты для предпосевной обработки семян, внесения в почву вместе с семенами, олива и опрыскивания растений авиационным или наземным способами.

В последнее время более пристальное внимание уделяется также вопросам эко-опш, нарушаемой химическими препаратами, возрастает актуальность много-омпонентных высокоэффективных органических биопрепаратов, сбалансирован-ых по основным биогенным компонентам, макро-, олиго-соединениям и набору икроэлементов под физиологические потребности конкретного растения. К орга-ическим экологически чистым удобрениям относятся препараты азотфиксирующих актерий - клубеньковых и свободноживущих на почве, торфе и других носителях, акие как ризоторфин, нитрагин и другие, выпускаемые во всех странах. Почвы, авозы и компосты как носитель для бактерий имеют нестандартный состав микро-рганизмов, которые инфицируют растения, поэтому в промышленности отдается редпочтение стерильному торфу с большой удельной поверхностью и собственны-и питательными компонентами. К проблемам относится то, что азотфиксирующие актерии в этих препаратах проявляют свою активность в строго анаэробных усло-иях, трудно сохраняют жизнеспособность. Некоторые виды торфа изначально со-ержат компоненты, токсичные для бактерий почвы и растений, накапливают их ри термической обработке и поэтому стерилизуются только радиационным излу-ением, в связи с чем предпринимаются попытки заменить их на более технологич-ые и стандартизованные носители (бентонит, цеолиты и др.). При изготовлении их препаратов питательные среды для азотфиксаторов обычно готовят на отваре з тех растений, для которых предназначен препарат. Конечная влажность препара-на стерильном торфе, инокулированном бактериями, должна составлять 50 - 60 о, чтобы обеспечить жизнеспособность бактерий в количестве 5 млрд клеток на амм, но в этом случае срок хранения препарата составляет от месяца до полугода.

Все эти проблемы возможно решить при замене анаэробных азотфиксирующих актерий на аэробные метилотрофы МеХку1оЪа&егтт техорЫНсит, которые спо-бны к созданию симбиоза с растениями, осуществляя для них азотфиксацию и нтез фитогормонов. При этом они используют С|-соединения в качестве един-

ственного источника углерода и энергии (например, метанол), который вырабатывают растения, что важно для производства.

В данной работе при разработке эффективной производственной технологии вместо полевых растений предложено использовать их клеточные культуры in vitro, к преимуществам которых относится то, что их биомассу можно производить в необходимых количествах независимо от времени года, посевных площадей, климатических условий и других агрофакторов. В случае производства всех товарных форм биопрепаратов на их основе требуется оптимизировать и интенсифицировать каждую технологическую стадию и заменить носитель агар на более технологичные, менее дорогостоящие и дефицитные.

Значительный теоретический и практический вклад в разработку и усовершенствование технологии получения растительных клеточных культур, в том числе симбиотических с метилотрофными бактериями, внесли отечественные ученые Ю.А. Троценко, Н.А. Величко, A.M. Носов, И.А. Тарчевский, Е.А. Калашникова, И.Е. Каухова, Н.И. Румянцева.

Цель работы: разработка технологии получения биопрепаратов стимулирующего, гормонального и азотфиксирующего действия за счет использования растительных клеточных культур и метилобактерий in vitro в симбиозе и без него на структурированных носителях микрокристаллической целлюлозе (МКЦ), целофор-ме (МХПЦ) и алюмоадсорбенте (F-24) с применением ультразвука (УЗ).

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1. Оценить антимикробные и технологические свойства выбранных структурированных сорбентов и условия их применения в качестве носителей для получения и размножения культур клеток и тканей in vitro из разного растительного сырья.

2. Разработать методику применения структурированных сорбентов в качестве носителей для иммобилизации клеток метилотрофных бактерий Methylobacterium meso-philicunt в симбиозе с растительными клеточными культурами in vitro.

3. Определить условия и оптимальные режимы УЗ-обработки для получения биомассы in vitro растительных и симбиотических биопрепаратов стимулирующего, гормонального и азотфиксирующего действия на выбранных носителях.

4. Отработать технологические режимы получения разных товарных форм биопрепаратов на выбранных структурированных носителях.

5. Разработать научно обоснованные рекомендации по оптимизации и интенсификации процесса получения биопрепаратов из разных растительных клеточных культур in vitro в симбиозе с метилотрофными бактериями и без него с применением структурированных носителей и УЗ, с освоением технологии в цехе опьггао-промышленного производства.

6. Разработать аппаратурно-технологическую схему по производству биопрепаратов в соответствии с современными требованиями энерго- и ресурсосбережения экологической безопасности.

Объект исследований: растительные клеточные культуры in vitro в симбиозе метилотрофными бактериями и без него, и технология выращивания их биомассы н структурированных сорбентах для получения биопрепаратов.

Предмет исследований: условия и закономерности выращивания клеточны культур гороха, гречихи, картофеля, пшеницы, сои in vitro в симбиозе с метило трофными бактериями Methylobacterium mesophilicum и без него на структурирован

ых носителях МКЦ, МХПЦ, F-24, с применением УЗ; технологические режимы и ехнология производства биопрепаратов стимулирующего, гормонального и азот-иксирующего действия с получением жидких и сухих (порошкообразных, грану-ированных, таблетированных) готовых форм.

Научная новизна: предложен научно обоснованный подход к разработке тех-ологии гибкого многопродукгового производства блочного типа для получения азных товарных форм биопрепаратов стимулирующего, гормонального и азотфик-ирующего действия из растительных клеточных культур in vitro в симбиозе с мети-отрофными бактериями Methylobacterium mesophilicum и без него на структуриро-анных сорбентах МКЦ, МХПЦ и F-24 с применением УЗ.

Установлено влияние УЗ, вида, состава и качества сырья, а также сгруктуриро-анных сорбентов МКЦ, МХПЦ и F-24 на показатели всех стадий получения расти-ельных клеточных культур in vitro в симбиозе с метилотрофными бактериями ethylobacterium mesophilicum и без него при замене традиционных носителей агара торфа.

Определены способы и оптимальные режимы УЗ-обработки для регуляции роста еток in vitro, накопления ими целевых биологически активных веществ и их излечения.

Впервые показана антимикробная активность МКЦ, МХПЦ и F-24, в отношении яда патогенных и условно-патогенных бактерий и дрожжей, что позволило вести ерилизацию разных растительных эксплантов in vitro с уменьшением расхода ан-исептиков, оптимизированы условия стерилизации с применением УЗ.

Разработана методика иммобилизации растительных клеточных культур in vitro симбиозе с метилотрофными бактериями Methylobacterium mesophilicum и без него а структурированных носителях МКЦ, МХПЦ и F-24 при замене агара и торфа, становлены оптимальные составы питательных сред, режимы культивирования и шки для разных препаративных форм.

Получен патент 2324338 РФ. Способ получения биомассы in vitro.

Практическая значимость работы.

Разработана аппаратурно-технологическая схема по производству разных товар-ых форм биопрепаратов для использования ее при получении растительной кле-чной биомассы in vitro в симбиозе с метилотрофными бактериями Methylobacte-'ит mesophilicum и без него, отвечающая современным требованиям энерго- и ре-рсосбережения, экологической безопасности.

В цехе опытно-промышленного производства ЗАО «Алтайвитамины», а также а предприятии ООО «Биоресурс», согласно разработанным рекомендациям по оп-мизации и интенсификации технологического процесса, получена опытная партия хих гранулированных и таблетированных товарных форм биопрепаратов из раз-ых растительных клеточных культур in vitro в симбиозе с метилотрофными бакте-иями Methylobacterium mesophilicum и без него на структурированных сорбентах КЦ, МХПЦ и F-24 с применением УЗ.

Замена агара и торфа на МКЦ, МХПЦ и F-24 на стадиях наращивания клеточной иомассы и получения разных товарных форм биопрепаратов (сухих порошкооб-азных, гранулированных и таблетированных) приводит к снижению сырьевых и ергетических расходов, а также увеличивает срок хранения готового продукта.

Использование симбиоза метилобактерий с растительными клеточными культу-

рами при их росте на МКЦ, МХПЦ и F-24 позволяет исключить из состава питательной среды МС синтетические гормоны роста, азотсодержащие компоненты, не добавлять метанол, и оптимизировать по содержанию Fe, Mg, К, Са.

Применение УЗ позволяет снизить расход антисептиков на стадии стерилизации эксплантов, регулировать рост растительных клеточных культур in vitro и накопление ими целевых БАВ (белка, аминокислот, пептидов, ауксинов, цитокининов).

Оценка активности полученных биопрепаратов азотфиксирующего, стимулирующего и гормонального действия показала увеличение энергии прорастания и способности прорастания семян, а также скорости роста корней и стеблей гречихи, гороха, картофеля, пшеницы и сои.

Получены акты внедрения.

Положения, выносимые на защиту: в рамках специальности 03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) по п.З. «Нз)>чение и разработка технологических режимов выращивания микроорганизмов - продуцентов, культу тканей и клеток растений и животных для получения биомассы, ее компонентов, продуктов метаболизма, направленного биосинтеза биологически активных соединений и других продуктов, изучение wc состава и методов анализа, технико-экономических критериев оценки, создание эффективных композиций биопрепаратов и разработка способов их применения» на защиту выносятся:

- экспериментально установленные закономерности и количественные характеристики выращивания растительных клеточных культур in vitro (гречихи, гороха, картофеля, пшеницы и сои) в симбиозе с метилотрофными бактериями Methylobac-terium mesophilicum и без него с применением УЗ на модифицированных питатель ных средах МС со структурированными носителями МКЦ, МХПЦ и F-24 (эффек тивность стерилизации эксплантов, эффективность инициации капусогенеза, эффек тивность капусогенеза, оценка биологической активности);

- результаты оценки антимикробных и других технологических свойств струк турированных сорбентов, а также условия и режимы их применения в качестве но сителей на каждой технологической стадии при замене агара и торфа;

- модифицированные питательные среды МС на всех стадиях технологии с уче том состава структурированных носителей МКЦ, МХПЦ, F-24 и свойств симбиоти ческих Methylobacterhun mesophilicum;

- экспериментально обоснованные режимы УЗ - обработки на всех стадиях куль тивирования растительных клеточных культур in vitro в симбиозе с Methylobacteriui mesophilicum и без него при их иммобилизации на структурированных носителя МКЦ, МХПЦ, F-24;

- результаты изучения стимулирующей, гормональной и азотфиксирующей ак тивности биомассы растительных клеточных культур in vitro в симбиозе с метило трофными бактериями и без него с применением УЗ, доказывающие возможность е использования для получения биопрепаратов;

- технологические режимы выращивания биомассы глубинным, поверхностны!» способом и в псевдоожиженном слое, технология гибкого многопродуктового про изводства жидких, порошкообразных, гранулированных и таблетированных биопрс паратов, обогащенных БАВ из растительного и микробного сырья, изменения к Т 0392-001-75141787 и Технологическому регламенту, оценка производственных сы рьевых и энергетических расходов.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертации доклады-ались и обсуждались на научно-технических конференциях и конгрессах: V Мос-овском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы раз-ития», (Москва, 2009); X и XII Международной конференции молодых ученых Пищевые технологии и биотехнология» (Казань, 2009, 2012); 9-й и 10-й Междуна-одных конференциях-семинарах по микро/нанотехнологиям и электронным прибо-ам (Новосибирск, 2008, 2009) и других всероссийских и региональных конференци-х Бийска, Барнаула, Казани, Уфы.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 29 печатных работ, в ом числе 7 статей в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, реко-ендованных ВАК, 1 патент.

Личный вклад автора состоит в постановке цели и задач исследований, выборе бъекта, предмета и методов исследований, непосредственном участии в проведе-ии основных экспериментов, систематизации и интерпретации полученных резуль-атов, формулировании научных положений и выводов.

Автор выражает искреннюю признательность и благодарность за помощь в ор-тизации производства при выпуске опытной партии биопрепаратов ЗАО «Алтай-итамины» и ООО «Биоресурс».

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 124 страницах машино-исного текста, содержит 18 таблиц, 30 рисунков. Она включает: введение, 4 главы, ыводы, библиографический список, содержащий 137 наименований, приложения а 40 страницах.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обосновывается актуальность работы, цель и задачи исследования.

В первой главе дан анализ современного состояния проблемы производства атуральных сельскохозяйственных стимулирующих, гормональных, азотфиксиру-ших биопрепаратов; обозначены недостатки использования торфа и агара при роизводстве биопрепаратов; биохимические основы действия биопрепаратов; био-хнологические способы выращивания растительного сырья и симбиотических еточных культур in vitro для получения биопрепаратов; обзор и применение эуктурированных сорбентов в биотехнологических процессах; обозначены слож-ости масштабирования технологии получения клеточных культур in vitro в произ-дстве.

Основные положения предлагаемого нами подхода в следующем:

- разработка схемы гибкого многопродуктового производства блочного типа с спользованием растительных и микробных клеточных культур in vitro для получе-ия широкого спектра биопрепаратов в разных готовых формах на структурирован-ых носителях:

- оптимизация состава питательных сред и режимов каждой технологической стати при получении биопрепаратов для сельского хозяйства из разных растительных еточных культур in vitro в симбиозе с метилотрофными бактериями Methylobacte-

'unt mesophilictmi и без него на структурированных носителях;

- интенсификация производства биопрепаратов за счет использования симбио-ческих метилотрофных бактерий, структурированных носителей и УЗ.

Во второй главе дана характеристика объекта и методов исследования. Объек-м исследования являлись клеточные культуры гречихи сорта «Аромат», пшеницы

сорта «Алтайская», гороха сорта «Альфа», сои сорта «Алтом». Исследуемые экс планты получали из разных частей сельскохозяйственных растений, стерилизовал и затем культивировали, в том числе в симбиозе с метилотрофными бактериям Methylobacterium mesophilicum штамм В-3352, на модифицированной среде My расиге-Скуга (МС) с необходимыми ростовыми факторами. Варианты модификащ среды МС:

- для инициации качлусогенеза: 2,4-Д — 2 мл/г, кинетин - 0,5 мг/л;

- для каллусогенеза: а—НУК — 2 мг/л, кинетин - 0,5 мг/л;

-фитоэкстракт или метилобактерии.

Проводилась корректировка расхода ростовых факторов и основных минераль ных компонентов среды МС (Fe, Mg, К, Са). Выбор контролируемых элементо обусловлен тем, что они дополнительно вносились в питательную среду МС с фито экстрактами и структурированными сорбентами, используемыми для иммобилиза ции культивируемых клеток in vitro и приготовления готовых форм биопрепаратов Метилобактерии без растительных клеток культивировали на питательной сред Канеда.

В качестве носителей для иммобилизации клеток вместо традиционного агар использовали кристаллические структурированные носители, в том числе с порам и частицами наноразмеров - МКЦ, МХПЦ и F-24 (таблица 1).

Таблица 1 - Основные характеристики структурированных сорбентов

Наименование показателя МКЦ МХПЦ F-24

Картина рентгеновской дифракции кристал. кристал. кристал.

Степень полимеризации >150 300-600 -

Насыпная плотность, т/дм" 555,60 250,00 769,23

Сорбшюнная емкость по воде, г/г 3,50 2,00 1,00

Химический состав, об.%. в т.ч.:

Ыа20 - - 0,15

к2о - - 0,18

СаО - - 0,86

МцО - - 4.87

Ре2Оэ - - 1,35

Массовая доля железа, %. не более - 0,50 -

«-» - отсутствие показателя

МКЦ - микрокристаллическая целлюлоза (производитель - ФГУП ПО «Про гресс», г. Кемерово); МХПЦ - модифицированная хлопковая порошковая целлюлоз с длиной волокон 20-50 мкм в виде полупрозрачных игл с очень острыми косо сре занными краями (ООО «Целоформ», г. Казань); Р-24 - алюмоадсорбент со средни диаметром пор 75 А (ООО «Катализ», г. Казань).

В частях нативных растений, эксплантах из них, экстрактах из клеточной био массы до и после обработки УЗ и инокуляции суспензией метилобактерий исследо вались такие показатели как содержание общего белка, свободных аминокислот, фи тогормонов (ауксинов, цитокининов); для семян энергия прорастания и способное прорастания; для метилобактерий КОЕ/мл и окраска по Граму; эффективность сте рилизации эксплантов, эффективность инициации каллусогенеза, эффективност каллусогенеза — стандартными методами с применением титрования, измерения н колориметре фотоэлектрическом концентрационном КФК-2МП, количественног учета микроорганизмов и оценки структуры сорбентов, в том числе с порами и ча

стицами наноразмеров, а также клеток на них - путем микроскопирования на БИ

§

МАМ P-ll и др. Содержание фитогормонов в экстрактах определяли методом ВЭЖХ на хроматографе «Alliance» и «Agilent 1200», основных минеральных элементов - с помощью атомно-абсорбционного спектрометра «Shimadzu АА 6300». Для УЗ-обработки использовали аппарат «Волна УЗТА-0,4/22-0». Для статистической обработки результатов применяли компьютерную программу StatSoft Statistica 11 Multilingual. Оптимизацию условий стерилизации ультразвуком и культивирования проводили методом регрессионного анализа с составлением уравнения регрес-ии и определением его коэффициентов. Экспериментальная партия биопрепаратов получена с использованием лабораторного ферментера «BIOSTAT® В plus» произ-одства ЗАО «САРТОГОСМ».

В третьей главе приведены основные стадии получения биопрепаратов с спользованием клеточных культур in vitro при иммобилизации на структурирован-ых носителях и результаты исследований по отработке каждой отдельной стадии ромышленной технологии:

- получение культуры растительных клеток и тканей in vitro;

- выращивание культуры растительных клеток и тканей in vitro;

- каллусогенеза в симбиозе культуры растительных клеток и тканей in vitro с ме-илобактериями Methylobacterium mesophilicum;

- получение биопрепаратов стимулирующего, азотфиксирующего, гормонально-о действия из растительной клеточной культуры in vitro с метилобактериями Iiethylobacterium mesophilicum;

- получение препаративных форм (жидких, сухих порошкообразных, гранулиро-анных, таблетированных).

Эксперименты на структурированных сорбентах проводились по трем направле-иям:

- получение биопрепаратов на основе растительных клеточных культур;

- получение биопрепаратов на основе метилотрофных бактерий Methylobacte-■ium mesophilicum;

- получение симбиотических биопрепаратов из растительных клеточных культур метилобактериями.

Стадия получения культуры растительных клеток и тканей in vitro.

На первой стадии отрабатывали процесс приготовления эксплантов из различ-ых частей растений, их стерилизацию (физическими, химическими методами), заем инициацию каллусогенеза in vitro на агаре и выбранных структурированных но-ителях с УЗ-обработкой и без нее.

Оценивали антимикробные свойства МКЦ, МХПЦ и F-24 по их влиянию на шзнеспособность Pseudomonas aeruginosa. Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, scherichia coli, Candida albicans. Methylobacterium mesophilicum и установили, что 1ХПЦ и F-24 имели наиболее выраженное антимикробное действие. Это позволило гсключить целый ряд химических антисептиков, кроме 70 %-го этанола, но при том надо было подобрать такие условия, при которых не погибли бы иммобилизо-анные растительные клеточные культуры in vitro и Methylobacterium mesophilicum.

Для определения оптимальных условий стерилизации выживших эксплантов в их оценивали максимальное содержание общего белка. Варьировали факторы, вли-ющие на эффективность стерилизации: тип культуры, тип экспланта (гипокотиль орня, меристемы), УЗ (мощность от 80 до 400 Вт и продолжительность от 1 до

7 мин), а также гидромодуль и концентрацию этанола (от 10 до 90 %), которые важнь при извлечении общего белка из эксплантов.

Таблица 2 - Оптимальные режимы стерилизации эксплантов

Культура Концент- Режимы УЗ-обработки Содержазше общего белка, мкг/мл

Тип экспланта Гидромодуль рация этанола, % продолжительность, мин мощность, Вт

X, Хз Хз Х4 Х5 Х6 Y

<s Гипокотиль корня 1:20 10 1 320 74,2

g Y = 60,67 -0,35Хз + 0,37X4 + 9.45Х5 + 0,0183Хб

О Меристемы 1:60 60 1 320 81.1

С Y = 65,05 -0,35Хз + 0,37X4 + 9,45Х5 + 0,0183Ха

1 Гипокотиль корня 1:100 40 3 160 68,1

Y = 57,55 -0.35Хэ + 0,37Х. + 9,45Х5 + 0,0183Х*

(2 Меристемы 1:100 60 1 160 62,3

Y = 61,93 -0,35Хз + 0,37X4 + 9,45Х5 + 0,0183Х6

Гипокотиль корня 1:20 10 1 240 74,2

Сарто фель Y = 63,79 -0,35Хз + 0,37X4 + 9,45Х5 + 0,0183Х6

Меристемы 1:40 60 1 240 89,6

Y = 68,17 -0,35Хз + 0,37Xt + 9,45Х5 + 0,0183Xs

Гипокотиль корня 1:40 10 1 240 61,9

g Y = 59,11 -0,35Хз + 0,37X4 + 9,45Xj + 0,0183Хг,

и Я Меристемы 1:60 40 1 240 70,3

С Y = 63,49 -0,35Хз + 0,37X4 + 9,45Х5 + 0.0183X«

Гипокотиль корня 1:100 10 2 80 51,2

<Я Y = 62,23 -0,35Хз + 0,37X4 + 9.45Х? + 0,0183Хб

Ü Меристемы 1:100 60 з 80 84,1

Y = 66,61 -0,35Хз + 0.37X4 + 9,45X5 + 0,0183 X«

По величине коэффициентов в уравнениях регрессии в таблице 2 можно сказать, что наиболее значимым фактором для стерилизации является продолжительность УЗ-обработки, наименее значимым - мощность УЗ.

Выбранные экспланты (таблица 2) использовались в следующих опытах.

Далее в течение 7 - ми нед определяли эффективность стерилизации эксплантов, чтобы оценить наличие остаточной внешней и внутренней инфекции после оптимальной стерилизации (70 %-ным этанолом и УЗ в оптимальных режимах) на разных носителях (таблица 3).

Таблица 3 - Оценка эффективности стерилизации эксплантов из частей нативных рас-

тений на структурированных носителях

Эффективность стерилизации, %

Носитель Культура Продолжительность культивирования, нед

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7 S 9

Горох 100 100 100 99 99 98 98

Гречиха 100 99 99 98 97 96 96

Агар Картофель 100 99 98 96 96 94 94

Пшеница 100 99 99 98 97 97 96

Соя 100 99 99 98 98 97 96

Продолжение таблицы 3

I 2 3 4 5 6 7 8 9

МХПЦ Горох 100 100 100 100 98 98 98

Гречиха 100 100 100 99 99 98 98

Картофель 100 100 100 98 97 97 97

Пшеница 100 100 100 99 99 98 98

Соя 100 100 100 99 99 99 98

МКЦ Горох 100 100 100 99 97 97 97

Гречиха 100 100 100 99 98 98 97

Картофель 100 100 100 99 98 98 97

Пшеница 100 100 100 99 98 98 97

Соя 100 100 100 99 99 98 98

F-24 Горох 100 100 100 98 98 98 97

Гречиха 100 100 100 99 99 99 99

Картофель 100 100 100 98 97 97 96

Пшеница 100 100 100 99 99 99 99

Соя 100 100 100 99 99 99 98

По результатам в таблице 3 можно сказать, что МКЦ, МХПЦ и ¥-24 позволяли сохранять 100 %-ную стерильность эксплантов всех культур более длительно (до 3 недель), чем агар (1 неделя).

Затем, по эффективности инициации каллусогенеза определяли результативные типы эксплантов для всех культур, наибольшее количество которых на срезе образовали первичные каллусы желтовато-бежевого цвета в течение 7 — ми сут культивирования на питательной среде МС на всех носителях (агар, МКЦ, МХПЦ, Р-24) (рисунок 1).

и —— —---1--------- ---- ■

Агар (контроль) МКЦ МХПЦ Р-24

□ Горох а Гречиха ■ Картофель н Пшеница и Соя

Продолжительность культивирования - 7 сут, температура (25±2) °С, в темноте, влажность 70 %.

Питательная среда МС: 0,5 мг/л кинетина, 2 мг/л 2,4-Д Экспланты: гречиха, горох, соя - гипокотшть; картофель, пшеница - меристемы Рисунок 1 - Зависимость эффективности инициации каллусог енеза от типа носителя Из диаграммы на рисунке 1 видно, что эффективность инициации каллусогенеза на носителях МКЦ, МХПЦ, F-24 на 1-13 % ниже, чем на агаре. Однако, при культивировании на них достаточно долить новую жидкую питательную среду, состав которой соответствует стадии процесса. Замена носителя и пересев при этом не требуется. Рыночная стоимость агара в 4,2 раза превышает стоимость МХПЦ и F-24 и в 33,5 раза дороже МКЦ, поэтому замена агара на МКЦ, МХПЦ и F-24 позволит снизить стоимость готового продукта.

Стадия вырашнвання культуры растительных клеток и тканей in vitro. Оценку эффективности каллусогенеза в культуре растительных клеток и тканей in vitro в питательной среде МС на агаре и структурированных носителях с УЗ-обработкой и без нее проводили в течение 4 недель культивирования. Лучшие результаты в оптимальных режимах, представлены на рисунке 2.

Агар (контроль) □ Горох В Гречиха

МКЦ ■ Картофель

МХГ1Ц

В Пшеница

Продолжительность культивирования - 4 нед. Экспланты: гречиха, горох, соя - птокотиль; картофель, пшеница - меристемы. Температура (25±2) °С, в темноте, влажность 70 % Рисунок 2 - Зависимость эффективности каллусогенеза in vitro от типа носителя питательной среды МС Результаты на рисунке 2 показывают, что для всех культур клеток и тканей in vitro на выбранных носителях наблюдается рост биомассы каллуса, следовательно, возможна замена носителя агара среды МС на МХПЦ, МКЦ и F-24. При этом неорганический носитель F-24 уступает целлюлозосодержащим МХПЦ и МКЦ. Для гороха (70 %) и гречихи (45 %) был лучшим МХПЦ, для картофеля (55 %) и сои (40 %) - МКЦ, а для пшеницы одинаковые результаты (40 %) - на МКЦ и МХПЦ.

Стадия каллусогенеза в симбиозе культуры растительных клеток и тканей in vitro с метилобактериями Methylobacterium mesophilicum. Культивирование растительного каллуса проводили с использованием метилобактерий Methylobacterium mesophilicum В-3352. Учитывали их способность к азотфиксации и синтезу фи-тогормонов, а также синтез метанола растительными клетками для метилобактерий, не добавляя их в среду МС. {

На рисунке 3 в динамике показано влияние симбиоза с метилобактериями на эффективность каллусогенеза в клеточных культурах гороха in vitro на безгормональной среде МС без метанола, с азотом и без него.

2 3 4 5 6 7

Продолжительность культивирования, сутки —с азотом —♦-без азота контроль с азотом -О-контроль без азота

Питательная среда МС без гормонов. Температура (25±2) °С, в темноте, влажность 70 %.

Контроль - клеточная культура гороха без метилобактерий: на среде МС с азотом - 20 % и без азота с метилобактериями - 55 % Рисунок 3 - Зависимость эффективности каллусогенеза в клеточных культурах гороха in vitro в симбиозе с метилобактериями от наличия источников неорганического азота в

среде МС на агаре

Каллусогенез в симбиотических клеточных культурах гороха на безгормональной среде МС говорит о том, что метилобактерии синтезировали необходимые фи-тогормоны, а на среде МС без источников неорганического азота это подтверждает также проявление азотфиксируюшей способности метилобактерий в симбиозе с

культурой клеток гороха in vitro. Причем симбиотические культуры на среде без азота показали более высокую эффективность каллусогенеза, чем культуры на среде с неорганическим азотом.

С другой стороны, растительные клетки синтезировали метанол, обеспечивший в симбиозе рост метилобактерий.

Подобные результаты получены для всех растительных культур ш vitro.

Выявленные оптимальные режимы размножения симбиотической каллусной биомассы in vitro применяли при промышленном получении биопрепаратов разного действия.

Стадия получения биопрепаратов из растительной клеточной культуры с метилотрофными бактериями Methylobacterium mesophilicunt.

Получение биопрепаратов стимулирующего и азотфнксируюшего действия.

К неспецифическим стимуляторам относятся аминокислоты и олигопептиды, которые могут быть получены при депептонизации белков сырья под воздействием внешних факторов, таких как УЗ (таблица 4).

Поэтому сначала оценивали содержание общего белка в экстрактах из разных эксплантов всех культур с вариацией гидромодуля (1:20; 1:40; 1:60; 1:80; 1:100), концентрации этанола (10 % - 90 %) и режимов УЗ-обработки. Разрушение белков в экстракте оценивали по изменению содержания общего белка и массовой концентрации свободных аминокислот в тех же экстрактах. При этом установили, какие режимы УЗ-обработки приводят к максимальному извлечению общего белка (таблица 2), а какие - к разрушению белка до аминокислот или олигопептидов (таблица 4).

Таблица 4 - Режимы разрушения общего белка до аминокислот в экстрактах из эксплантов

Культура Тип экспланта Гидромодуль Концентрация этанола, % УЗ-обработка Массовая концентрация свободных аминокислот, (хЮ"') мкг/мл

мощность, Вт продолжительность, мин

Гречиха Гипокотиль корня 1:20 0 320 3 14,0

Меристемы 1:20 0 320 5 22,8

Горох Гипокотиль корня 1:100 10 320 2 1,4

Меристемы 1 60 60 240 3 1.0

Картофель Гипокотиль корня 1 20 70 240 1 8,8

Меристемы 1 60 60 400 1 1,4

Пшеница Гипокотиль корня 1 20 70 320 3 8,8

Меристемы 1 60 90 400 2 2.8

Соя Гипокотиль корня 1:100 60 320 1 4,9

Меристемы 1:60 60 320 2 4,6

Режимы, приведенные в таблице 2, использовались при получении и накоплении растительной клеточной биомассы в симбиозе с метилобактериями на структурированных носителях, а режимы из таблицы 4 - на стадии экстрагирования при получении из них биопрепаратов стимулирующего и азотфиксирующего действия.

Применяли оптимальные условия культивирования на структурированных носителях, при которых отмечалось наибольшее накопление общего белка в растительной

клеточной биомассе в симбиозе с метилобактериями на среде МС без азота (рисунок 3) с ежедневной УЗ-обработкой (режимы из таблицы 2).

Получение биопрепаратов гормонального действия. На первом этапе изучали возможность замены синтетических стимуляторов роста в среде МС на натуральные, полученные в виде экстрактов из различных частей растений. В них оценили содержание основных минеральных элементов (таблица 5).

Таблица 5 - Оценка основных минеральных элементов в экстрактах растений

Наименование элемента Содержание, мг/кг

гречиха горох картофель пшеница соя

Железо 83,00 ±2,50 94,00 ±2,82 90,00 ±2,70 51,00 ±1,53 96,70 ±2,90

Магний 258,00 + 7.74 107,00 ±3,21 23,00 + 0,69 590,00 ±17,70 226,00 ±6,78

Калий 325,00 ±9,75 873,00 ±26,90 568,00 ± 17,04 323.00 ±9,69 160,70 ±4,82

Кальций 700.00 + 21,00 115.00 + 3,45 100,00 ±3,00 500,00 ± 15,00 348,00 ± 10,44

По результатам из таблицы 5 корректировали расход солей для приготовления модифицированной оптимальной среды МС.

Учитывали также, что цитокинины синтезируются в корнях и способствуют росту надземных частей растения, а ауксины синтезируют стебли и листья для обеспечения роста корней. При этом определяли зависимость эффективности кагшусогенеза при иммобилизации на структурированных носителях от дозы гормонсодержащего экстракта, которую меняли от 5 % до 50 % в модифицированной питательной среде МС с УЗ. В качестве носителей использовали агар, МКЦ, МХПЦ, ¥-24 (рисунок 4). Изучалось влияние следующих факторов: содержание Ре, Mg, К, Са, ИУК, зеатин.

Анализ результатов на рисунке 4 показывает, что для натуральных фитогормонов при оптимальной дозе экстракта 10 % в среде МС замена агара на МХПЦ и МКЦ дала лучшие результаты, чем на Р-24, несмотря на содержащиеся в нем дополнительные минеральные компоненты Ыа, К, Са, Ре и др. (таблица 1).

□ Гречиха 0 Горох ■ Картофель И Пшеница 83 Соя

Температура (25±2) "С, в темноте, влажность 70 % Оптимальная доза цитокннинсодержащего экстракта - 10 % Оптимальная доза ауксинсодержащего экстракт а - 10 % Оптимальная УЗ-обработка: гречиха - 320 Вт 5 мин, горох - 240 Вт 3 мин, картофель - 400 Вт 1 мин, пшеница - 400 Вт 2 мин, соя - 320 Вт 2 мин Рисунок 4 - Эффективность кагшусогенеза на структурированных носителях с натуральными фитогормонами в среде МС с УЗ УЗ в указанном оптимальном режиме позволил повысить эффективность каллу-согенеза для всех культур на агаре - от 3,4 % до 16,7 %; на МКЦ - от 4,4 % до 10 %; на МХПЦ - от 2,6 % до 11,1 %; на Р-24 - от 10 % до 26 %.

Стадия получения препаративных форм. При исследовании свойств структурированных носителей были оценены технологические свойства сорбентов МКЦ,

МХПЦ и F-24 (влажность, насыпная плотность, сорбционная емкость гю воде, структура и набухаемость до и после автоклавирования). Показана возможность многократного использования выбранных сорбентов, так как при автоклавировании (0,1.5 МПа в течение 1 ч) сохранялись структура частиц и их поверхности. Антимикробную активность показали: МКЦ- в отношении Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Methylobacterium mesophilicum; МХПЦ и F-24 - в отношении всех микроорганизмов, кроме Candida albicans.

Затем оптимизировали режимы получения разных товарных форм (сухих гранулированных и таблетированных) биопрепаратов стимулирующего, гормонального и азотфиксирующего действия на МКЦ, МХПЦ и F-24, обогащенные биомассой растительных клеток и Methylobacterium mesophilicum.

При этом определили остаточную влажность (таблица 6) и количество жизнеспособных клеток метилобактерий в сухом биопрепарате (рисунок 5).

Таблица 6 - Оценка количества жизнеспособных клеток МеМуЬЬаЫепит тейорЫНсит после сушки биопрепаратов на основе симбиотической растительной биомассы на структурированных сорбентах _

Культура Сорбент Продолжительность сушки, мин Количество жизнеспособных клеток после сушки при (45±1) "С, КОЕ/мл (хЮ10)

МКЦ 390 6,7

Гречаха МХПЦ 405 9,5

F-24 315 2,0

МКЦ 320 6,4

Горох МХПЦ 350 7,4

F-24 270 3,9

МКЦ 300 7,8

Картофель МХПЦ 350 8,2

F-24 240 5,8

МКЦ 300 7,5

Пшеница МХПЦ 300 7.1

F-24 240 4.3

МКЦ 360 7,4

Соя МХПЦ 380 7,3

F-24 300 8,2

£ 4 ■I. - Шщй

с -2 2 ш „ __ : HL

Щ гНШЙЁИИ УШШЛ

: | 1

контроль □ МКЦ 1 а МХПЦ 2 ■ F - 24 3 варианты

Варианты: 1 - температура сушки (35 ± 1) °С; 2 - температура сушки (45 ± 1) °С; 3 -температура сушки (55 ± 1) °С. Контроль - количество клеток в препарате до сушки: МКЦ-2,3 хЮ10 КОЕ/мл; МХПЦ - 2,2 х Ю10 КОЕ/мл; Р-24-2,1 *Ю10 КОЕ/мл Рисунок 5 - Зависимость количества жизнеспособных клеток МеЛху1оЬааегшт МеяорШИсит в сухом биопрепарате от типа носителя и режима сушки Судя по количеству жизнеспособных клеток, лучшим режимом сушки для всех

типов носителей можно считать температуру 45 °С в течение 300 мин.

Оценка активности полученных биопрепаратов азотфиксирующего, стимулирующего и гормонального действия показала увеличение энергии прорастания и способности прорастания семян, а также скорости роста корней и стеблей гречихи, гороха, картофеля, пшеницы и сои.

Содержание фитогормонов в препаратах оценили путем биотестов по длине корней и стеблей проростков, а также по результатам ВЭЖХ. При сравнении с эталоном на хроматограмме время удержания ауксина составляет 34 мин, а цитокинина (зеатин) -14 мин.

Азотфиксирующую активность оценили по содержанию общего белка и свободных аминокислот в стеблях, листьях и корнях проростков из семян после их обработки биопрепаратами.

Гранулирование и таблетирование проводили в сушилке-грануляторе СГ-30. Режимы, отработанные на этой стадии, приведены в рекомендациях и зарегистрированных изменениях к нормативной документации для ЗАО «Алтайвитамины» и ООО «Биоресурс».

Для получения таблетированной товарной формы гранулированную форму обычно подвергают дроблению и перемешиванию с тальком и другими скользящими материалами. В случае применения предлагаемых в работе структурированных носителей, стадия дробления и тальк не требуются из-за свойств самих носителей. Таблетирование сухих препаратов на выбранных носителях целесообразно осуществлять на таблеточном прессе РТМ-41. Активность полученных биопрепаратов оценена на прорастающих семенах, использованных в работе сельскохозяйственных культур.

В четвертой главе приводятся практические приложения результатов исследования и рассматриваются экологические и экономические перспективы внедрения разработки. Сравнительный анализ показывает, что предлагаемая технология с применением структурированных сорбентов позволяет перерабатывать различное сырье на 100 %, круглогодично нарабатывать его биомассу с регулируемым биосинтезом в ней БАВ, не используя посевных площадей.

Что касается применения в технологии опасных веществ, то, судя по литературным данным, МКЦ применяется в качестве наполнителя в таблетированных фармацевтических препаратах, МХПЦ используется в медицине как антимикробное средство, алюмоадсорбенты разрешены к применению в качестве сорбентов в вакцинах, а также для осветления в пищевой и бродильной промышленности. Паспортные данные показывают, что они не содержат в своем составе вредных компонентов, нормируемых в показателях химической безопасности в СанПиН 2.1.4.1074. Кроме того, МКЦ - побочный продукт производства хлопковой ваты; МХПЦ - продукт, полученный из линта - отхода при переработке хлопка в медицинскую марлю, либо отхода от производства хлопковой ваты. МКЦ, МХПЦ и Р-24 являются биоразлагаемыми.

Экономические расчеты на ЗАО «Алтайвитамины» показали, что от реализации предложенного подхода и использования в технологии структурированных сорбентов уменьшаются производственные расходы: сырьевые на 14,7 % и энергетические на 19,3 %, а также транспортные расходы по доставке потребителю, требования к

кладским помещениям, условиям хранения, и увеличивается срок хранения с одно-о месяца до одного года.

По предлагаемой в данной работе аппаратурно-технологической схеме (рису-окб) можно реализовать различные способы получения биопрепаратов: поверх-остный твердофазный, глубинный, в псевдоожиженном слое.

Каиеда; 6 - ферментер, емкость № 1 для выращивания метил обактерий; 7,15 - фильтры тонкой очистки; 8 - шлюзовые питатели; 9 - ультразвуковая установка; 10 - гомогенизатор; 11 - стерилизатор

средьг, 12 - ферментер, емкость № 2 для выращивания растительной клеточной культуры; 13 - газодувки; 14 - фильтры грубой очистки; 16 - калориферы; 17 - увлажнители воздуха; 19 - аппарат

для приготовления раствора питательных солей; 20 - сборник культуры; 21 - транспортирующее устройство; 22 - аппарат для сушки и измельчения; 23 - фильтр рукавный; 24 - вакуум-насос; 25 - бункер для сухой культуры; 26 - бункер-накопитель; 27 - смеситель-измельчитель; 28 - таблеточная машина;

29 - фасовочный автомат

Рисунок б - Аппаратурно-технологическая схема получения разных форм биопрепаратов из растительных клеточных культур in vitro с метилотрофными бактериями и без них на структурированных носителях с применением УЗ Для получения, жидких и иммобилизованных на структурированных носителях иопрепаратов на основе растительной клеточной биомассы используются аппараты лока 1 (аппараты 1-3,7-19).

Наращивание биомассы метилотрофных бактерий ведут в аппаратах блока 2 (аппа-аты 2-7,13-17). Биопрепараты на основе растительной клеточной биомассы с метило-актериями получают в аппаратах блока 1 и блока 2.

Для получения сухих порошкообразных, гранулированных и таблетированных форм иопрепаратов используют аппараты блока 3 (аппараты 3,13,16,20-29).

В доказательство хороших технико-экономических перспектив приводятся следую-

щие аргументы, отраженные в актах внедрения:

- разработанная аппаратурно-технологическая схема позволяет варьировать виды перерабатываемого растительного и микробного сырья, форму и назначение выпускаемого биопрепарата, а также его активность;

- предложенная технология решает экологические проблемы, так как позволяет выпускать натуральные биопрепараты, является безотходной и предусматривает круглогодичную наработку стандартизованного растительного и микробного сырья, не требующую посевных площадей, с использованием отходов других производств в рамках приоритетного направления рациональной переработки растительного сырья.

ВЫВОДЫ

1. Проведена оценка технологических свойств структурированных сорбентов МКЦ, МХГТЦ и F-24, определены условия и оптимальные режимы их применения на каждой технологической стадии при замене агара и торфа, в том числе способы иммобилизации на них растительных клеточных культур и метилобактерий in vitro в симбиозе и без него, их культивирования и сушки.

2. Впервые показана антимикробная активность МКЦ, МХПЦ и F-24 по их влиянию на жизнеспособность Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Candida albicans, Methylobacterium mesophilictim и установили, что МХПЦ и F-24 имели наиболее выраженное антимикробное действие. Это позволило на стадии получения клеточных культур in vitro ограничиться при стерилизации разных эксплангов из нативных растений 70 %-ным этанолом и УЗ в оптимальных режимах: для меристем и гипокотиля гречихи - 320 Вт, 1 мин; меристем и гипокотиля гороха-160 Вт, 1 и 3 мин; меристем и гипокотиля картофеля и пшеницы - 240 Вт, 1 мин; меристем и гипокотиля сои—80 Вт, 3 и 2 мин).

3. Определены методика применения УЗ в стерильных условиях и оптимальные режимы на всех стадиях технологии получения биомассы in vitro растительных и симбио-тических биопрепаратов стимулирующего, гормонального и азотфиксирующего действия на выбранных носителях. Впервые показано, что УЗ в щадящих режимах (80 - 320 Вт от 1 до 3 мин) стимулирует рост клеточной биомассы и накопление в ней белка, а в более жестких (240 - 400 Вт от 1 до 5 мин) - регулирует в ее составе содержание стимуляторов и гормонов.

4. Оптимизированы питательные среды на всех стадиях технологии. Использование симбиоза метил обактерий Methylobacterium mesophilictim с растительными клеточными культурами in vitro при их росте на МКЦ, МХПЦ и F-24 с добавлением экстрактов из разных частей нативных растений (оптимальная доза в среде MC цигокининсодержаще-го и ауксинсодержащего экстрактов - 10 %) позволяет исключить из состава питательной среды MC синтетические гормоны роста, азотсодержащие компоненты, не добавлять метанол, и уменьшить содержание Fe, Mg, К, Ca

5. Отработаны оптимальные режимы применения структурированных сорбентов МКЦ, МХПЦ и F-24 на стадиях сушки (45 °С 300 мин), гранулирования и таблетирова-ния биопрепаратов, обогащенных БАВ из растительного и микробного сырья. Экономическими расчетами подтверждено, что это уменьшило производственные расходы: сырьевые - на 14,7 %, энергетические - на 19,3 %, а также увеличило срок хранения продукции с 1 мес до 1 года за счет уменьшения влажности товарной формы с 50 до 5 %. Оценка активности полученных биопрепаратов азотфиксирующего, стимулирующего и гормонального действия показала увеличение энергии прорастания и способности про-

1ния семян, а также скорости роста корней и стеблей гречихи, гороха, картофеля, еницы и сои.

6. Предложен научно обоснованный подход к разработке технологии гибкого мно-родуктового производства блочного типа для получения разных товарных форм биопаратов (жидких и сухих порошкообразных, гранулированных, таблетированных) мулирующего, гормонального и азотфиксирующего действия из растительных кле-ных культур (гречихи, пшеницы, гороха, сои, картофеля) in vitro в симбиозе с thylobacterium mesophilicum и без него на структурированных сорбентах МКЦ, ШЦ и F-24 с применением УЗ; разработана аппаратурно-технологическая схема по изводству биопрепаратов в соответствии с современными требованиями энерго- и урсосбережения, экологической безопасности, а также рекомендации по оптимиза-1 и интенсификации каждой стадии процесса с освоением технологии в цехе опытно-мышленного производства, позволяющего получать биопрепаратов до 320 т/г.

Основное содержание диссертационной работы изложено в публикациях: В рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Косолапова, A.C. Исследование влияния ультразвука на эффективность стерилизации lairroB сои, скорость роста и содержание общего белка и лигнина в культуре клеток и тка-

in vitro / A.C. Косолапова, М.Э. Ламберова, Е.П. Маркина, A.A. Ламберова // Ползуновский [ик. - 2006. - № 2-2. - С. 71 - 73, автора - 0,05 п.л.

2. Косолапова, A.C. Разработка технологии иммобилизации культуры растительных клеи тканей на целлюлозосодержащих наноструктурированных носителях in vitro / A.C. Косо-ова, М.Э. Ламберова // Ползуновский вестник. - 2009. - № 3. - С. 315 - 318, автора-0,125

3. Буянова, A.C. Исследование влияния ультразвука на отдельные стадии в технологии ьтуры растительных клеток и тканей in vitro. I. Стерилизация эксплантов / A.C. Буянова,

. Ламберова // Химия растительного сырья. - 2010. - № 2. - С. 179-180, автора - 0,06 п.л.

4. Буянова, A.C. Исследование влияния ультразвука на отдельные стадии в технологии ьтуры растительных клеток и тканей in vitro. II. Образование каллуса и его размножение / .. Буянова, М.Э. Ламберова // Химия растительного сырья. - 2010. - № 3. - С. 189-190, автора 06 п.л.

5. Буянова, A.C. Исследование влияния ультразвука на отдельные стадии в технологии ьтуры растительных клеток и тканей in vitro. III. Биосинтез белков сои / A.C. Буянова, М.Э. берова//Химия растительного сырья. - 2012.-№3.- С. 163-166, автора-0,125 п.л.

6. Буянова, A.C. Исследование влияния ультразвука на отдельные стадии в технологии ьтуры растительных клеток и тканей in vitro. IV. Биосинтез липидов сои / A.C. Буянова, . Ламберова, М.Э. Ламберова // Химия растительного сырья. - 2012. - № 3. - С.167-171, ав-а —0,1 п.л.

7. Буянова, A.C. Исследование антимикробных свойств структурированного целоформа / .. Буянова, A.A. Ламберова, М.Э. Ламберова, С.С. Ксембаев, В.К. Половняк // Научно-нический Вестник Поволжья. - 2012. - № 3. - С. 13-17, автора - 0,06 п.л.

Патенты и заявки на выдачу патентов РФ:

8. Пат. 2324338 Российская Федерация, МПК А01Н4/00 C12N5/04. Способ получения биосы in vitro / A.C. Косолапова, М.Э. Ламберова, В.Н. Хмелев, A.A. Ламберова, А.Н. Хмелева; итель и патентообладатель Алтайский государственный технический университет им. И.И. зунова. - № 2007103055/13; заявл. 25.01.2007; опубл. 20.05.2008, Бюл. № 14 - 7 е.: ил, авто-0,0875 п.л.

Прочие публикации и материалы конференций:

11. Kosolapova, A.S. Ultrasonic application during reception of biostimulators from vegetative material for cells and tissue culture in vitro / A.S. Kosolapova, M.E. Lamberova // International rkshops and Tutorials on Electron Devices and Materials EDM'2009: Workshops Proceedings. -osibirsk: NSTU, 2009. - P.212 - 218, автора - 0,22 п.л.

12. Косолапова, A.C. Получение с помощью ультразвука стимуляторов роста из картофеля сорта «Луговской» и применение их в культуре клеток и тканей in vitro, иммобилизованной на МКЦ / A.C. Косолапова, М.Э. Ламберова, Е.С. Карташова // Технология и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности: сб. материалов II Всерос. науч.-практ. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых. -Бийск: БТИ АГТУ, 2009. - С.160-164, автора-0.10 п.л.

13. Косолапова, A.C. Пути интенсификации процесса культивирования клеток и тканей гречихи сорта «сибирячка» in vitro при иммобилизации на целоформе / A.C. Косолапова, М.Э. Ламберова, А.И. Давыдова // Технология и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности: сб. материалов II Всерос. науч.-практ. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых. - Бийск: БТИ АГТУ, 2009. - С.145-149, автора-0,10 п.л.

14. Косолапова, A.C. Применение алюмоадсорбентов для иммобилизации культуры клеток и тканей сои сорта «Алтом» in vitro / A.C. Косолапова, М.Э. Ламберова, И.В. Денисова // Технология и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности: сб. материалов II Всерос. науч.-практ. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых. — Бийск: БТИ АГТУ, 2009. - С. 150-154, автора - 0,10 п.л.

15. Косолапова, A.C. Исследование влияния ультразвука на накопление общего белка в культуре клеток и тканей в гречихе in vitro / A.C. Косолапова, М.Э. Ламберова // Пищевые технологии и биотехнология: материалы докл. X Междунар. конф. молодых ученых. - Казань: КГТУ, 2009. - С. 263-265, автора - 0,09 пл.

16. Косолапова, A.C. Применение ультразвука в процессе получения биостимуляторов из сои для культуры клеток и тканей in vitro / A.C. Косолапова, М.Э. Ламберова // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: сб. материалов IV Всерос. конф. - Барнаул: АГУ, 2009. - Кн.П. - Ч. IV. - С. 126-128, автора - 0,09 п.л.

17. Косолапова, A.C. Применение ультразвука в биотехнологии культуры растительных клеток и тканей in vitro / A.C. Косолапова, М.Э. Ламберова // Биотехнология: состояние и перспективы развития: сб. материалов V Московского междунар. конгресса. - М.: РХТУ. 2009. -Кн. 1. - С.325-326, автора - 0,063 п.л.

18. Косолапова, A.C. Применение наносгруктурированных целлюлозосо держащих носителей в технологии культуры клеток и тканей in vitro / A.C. Косолапова, М.Э. Ламберова // Юбилейная конференция БТИ АлтГТУ: сб. материалов науч.-практ. конф. - Бийск: БТИ АГТУ. 2009. - С.349-351, автора-0,09 п.л.

19. Буянова, A.C. Исследование антибактериального действия целоформа / A.C. Буянова, М.Э. Ламберова // Научное и экологическое обеспечение современных технологий: сб. материалов VII республ. студенческой науч.-практ. конф. - Уфа: УГАЭС, 2010. - С.93-94, автора -0,063 п.л.

20. Буянова, A.C. Бактерии рода Methylobacterium в симбиозе с культурой клеток и тканей гороха in vitro / A.C. Буянова, М.Э. Ламберова, Т.А. Кочнева // Пищевые технологии и биотехнологии: сб. материалов XII Междунар. конф. молодых ученых. — Казань: КНИГУ, 2012. - С. 156, автора - 0,021 п.л.

21. Буянова, A.C. Получение сухих стимулирующих биопрепаратов из метилотрофных бактерий в симбиозе с растительными клеточными культурами на наносгруктурированных сорбентах / A.C. Буянова, М.Э. Ламберова, A.A. Ламберова, Т.А. Кочнева // Биоматериалы и нанобиоматериалы: актуальные проблемы и вопросы безопасности: сб. материалов Всерос. молодежной науч. школы. - Казань: Отечество, 2012. — С. 18, автора—0,016 п.л.

Подписано в печать 09.02.2015 г. Формат 60x84 1/16. Печать - ризография. Усл.п.л. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ 0902.

Отпечатано в ООО «Издательский дом «Бия» 659333, Россия, Алтайский кр., г. Бийск. пер. Муромцевский. 2.