Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Методы получения и свойства трипсина сухого стерильного квалификации "для культур клеток"

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Методы получения и свойства трипсина сухого стерильного квалификации "для культур клеток""

р Г Ь ин

1 3 ш

ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ КОНТРОЛЯ, СТАНДАРТИЗАЦИИ И СЕРТИФИКАЦИИ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ

( ВГНКИ )

На правах рукописи

Величко Александр Владимирович

УДК: 619:576.853.083.3

МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ И СВОЙСТВА ТРИПСИНА СУХОГО СТЕРИЛЬНОГО КВАЛИФИКАЦИИ "ДЛЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК"

03.00.06. - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в лаборатории культур тканей, питательных сред и растворов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) и на НПО "Вектор" в 1991-1995 гг.

Научные руководители:

Доктор биологических наук Ночевный В.Т.

Кандидат химических наук Трошкова Г.П.

Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук,

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Защита диссертации состоится " 30" мая 1996 г. в 15 часов на заседании Специализированного совета Д 120. 85. 01. при Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ.

Просим принять участие в работе совета или выслать Ваш отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенных печатью.

С диссертацией модно ознакомится в библиотеке ВГНКИ ветеринарных препаратов.

Автореферат разослан апреля 1996 г.

профессор - кандидат биологических наук

ПРОСТЯКОВ А. Д. (ВГНКИ) ГАЛЬНБЕК Т.В. (ВИЭВ)

Ученый секретарь специализированного совета, // кандидат ветеринарных наук ^ТТ/ьМЮ.А. Козырев

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ Производство первичных культур клеток (ПКК) и поддержание перевиваемых линий клеток (ПЖ) предполагает использование различных диспергирующих растворов, к качеству и методам контроля которых, предъявляют чрезвычайно высокие требования. Для диспергирования тканей животных используют, в основном, трипсин и реже другие протеазы импортного производства (В.А.Сергеев, Ю.А.Собко, 1990), а в последние годы и отечественные препараты трипсина по ТУ 10.07.194-91 и ТУ ОКП 921 328 1500 РСТ Латвии.

В вирусологической практике применяется жидкая форма трипсина (0,2-0,25%-ный раствор), нестабильная при положительных температурах ( при + 18-20°С срок хранения не более 10 суток; при +4-6°С - не более 2 месяцев; в замороженном состоянии - 6 месяцев), вследствие автолиза фермента при рН 7,0-11,0 (В.К.Антонов, 1933; К.Н.Веремеекко, 1971). Кроме того, метод фильтрования не гарантирует получения больших объёмов качественного препарата (И.Л.Сперанская, 1979).

С учетом изложенного, более предпочтительным было бы применение сухой стерильной формы трипсина, растворяемой на месте применения. За рубежом ("Моуо1еЬз", США) разработаны коммерческие препараты сухого стерильного трипсина, обладающие стандартными и стабильными свойствами, удобные в применении и транспортировке. В нашей стране возможность получения аналогичного препарата, пригодного для диспергирования тканей животных, показана Я.Д.Сперанской (1979). Однако, выполненная работа имеет фрагментарный характер и не завершена. В связи этим задача получения отечественного термостабильного и стандартного по активности препарата -сухой стерильной формы трипсина квалификации "для культур клеток"

является актуальной и экономически обоснованной, так как стоимость сухих стерильных форм питательных сред и растворов составляет 1/40 от стоимости производства и транспортировки жидких форм препаратов (НауШк еЪ а1., 1964).

Решение указанной задачи позволит существенно повысить сроки сохранения протеолитической активности препарата, эффективность диспергирования тканей животных и, в конечном итоге, стандартизовать производство культур клеток и вирусных препаратов.

1.2. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ

Целью исследований была разработка способа изготовления и методов контроля сухой стерильной формы трипсина (ТСС) квалификации "для культур клеток" и апробация препарата в вирусологической практике.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

- определить общие требования к качеству исходных образцов трипсина и неорганических солей, пригодных для изготовления сухой стерильной формы препарата;

- разработать технологию изготовления и методы контроля ТСС;

- изучить физико-химические и диспергирующие свойства ТСС в отношении различных видов тканей,а также возможность использования препарата для серийного пассирования перевиваемых линий клеток;

- изучить чувствительность и пригодность культур клеток, полученных с использованием ТСС, для репродукции вирусов;

- оценить экономическую целесообразность производства и применения "Трипсина сухого стерильного" квалификации "для культур клеток" в вирусологической практике;

- определить условия и сроки хранения препарата;

- разработать нормативно-техническую документацию на изго-

товление, контроль и применение ТСС.

1.3. НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые получены научно-обоснованные данные, положенные б основу опытно-промышленного производства трипсина сухого стерильного (ТСС), отвечающего требованиям квалификации "для культур клеток".

Впервые для стерилизации трипсина предложены ускоренные электроны в дозе 25 кГр.

Определены тест-система, методы контроля и предельно-допустимые показатели качества препарата.

Доказаны пригодность препарата для получения широкого спектра первичных и серийного пассирования перевиваемых культур клеток и целесообразность дифференцированного выбора оптимальной концентрации ТСС при диспергировании тканей различного происхождения.

Установлена равноценная чувствительность культур клеток , полученных с использованием ТСС и коммерческого препарата трипсина, к РНК- и ДНК-содержащим вирусам. Показана пригодность и перспективность ТСС для получения противовирусных препаратов.

Изучены оптимальные условия и сроки хранения ТСС. Показана возможность использования метода пошаговой регрессии для прогнозирования длительности хранения препарата при различных температурах.

1.4. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Для вирусологической практики предложен новый термостабильный, активный коммерческий препарат "Трипсин сухой стерильный для культур клеток".

Предложена культуральная модель - почка крольчонка месячного возраста для оценки диспергирующей активности ТСС и определены

оптимальные условия дезагрегации ткани.

Показана целесообразность и необходимость замены коммерческого раствора трипсина на ТСС для получения первичных, пассирования перевиваемых культур клеток и изготовления противовирусных препаратов .

Экономически обосновано применение препарата ТСС в вирусологической практике.

1.5. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные положения исследований доложены и получили положительную оценку на совещаниях "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 1992); IV-ом Пущинском совещании "Культивирование клеток животных и человека" (Пущино, 1994); Ученом совете ВГНКИ ветпрепаратов (Москва, 1992-1995); Межлабораторном совещании сотрудников ВГНКИ (Москва, 14.11.1995).

1.6. ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано и сдано в печать 8 статей.

1.7. ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы, приложения. Работа иллюстрирована 21 таблицей, 5-ю рисунками. Библиографический список включает 215 наименований.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Работа выполнена в лаборатории культур тканей, питательных сред и растворов ВГНКИ ветпрепаратов и на НПО "Вектор" в 1991-95гг.

В работе использовали сухие нестерильные препараты импортного и отечественного производства: трипсин фирм "Ferrak", "Dlfko" и "Serva"; трипсин ВШиТИБП по ТУ 10.07.194-91, ЛХФИ, РМКК по ТУ ОКП 921.828.1500 РОТ Латвии.

Контроль препаратов сухого трипсина и его растворов, питательных сред и сывороток крови осуществляли в соответствии с требованиями "Методических рекомендаций по контролю качества вирусологических питательных сред" (1985), и "Методических рекомендаций по контролю качества жидкой сыворотки крови крупного рогатого скота, применяемой в медицинских и биологических целях" (1982), протеолитическую активность растворов - по методу Шоу-Петиколас. Прозрачность растворов контролировали нефелометрически на нефелометре типа НФР или турбидиметрически на фотолектроколориметре ФЭК-56М, при длине волны 540 нм, в кюветах 10 мм; осмоляльность -на осмометре "Osmolab", согласно инструкции к прибору.

В качестве сухой солевой основы буфера использовали неорганические соли, квалификации "хч" и "осч" по прописи ФС 42-131ВС-88. Соли, содержащие кристаллизационную воду, высушивали по схеме, разработанной в НПО "Вектор". Степень гидратации солей определяли используя данные зависимости плотности раствора соли от концентрации (Справочник химии, 1964). Из высушенных солей путем постоянного перемешивания в шаровой мельнице готовили солевую основу ТСС. Скорость и длительность перемешивания устанавливали экспериментальным путем.

Стерилизацию препарата ускоренными электронами осуществляли совместно с Г.П. Трошковой (НП0"Вектор") на линейном ускорителе электронов ИЛУ-б в Институте ядерной физики СО РАН в дозе 20, 25 и 30 кГр, а гамма-лучами - в Институте эпидемиологии и микробио-

логии им. Н.Ф.Гамалеи в дозе 3,5 Мрад (35кГр).

Для оценки стабильности образцы ТСС хранили при +4°С в течение 730 суток с интервалом определения активности 180 суток, при +37°С в течение 180 суток, с интервалом 5, 15 и 30 суток и при +60°С в течение 60 суток с интервалом 2 и 10 суток. Результаты испытаний оценивали по уровню протеолитической активности в сравнении с контролем - 0,25Х-ным раствором трипсина, хранившимся при +4°С в течение 90 суток и при +37°С до полной инактивации. Для прогнозирования сроков хранения ТСС при различных температурах использовали кинетическое уравнение первого порядка.

Количество свободных радикалов определяли, совместно с Г.П.Трошковой, в Институте неорганической химии СО РАН на ЭПР-спектрометре Е-109 в диапазоне 95 Ггц при Т - 300°К

Донорами ткани служили 3-9 месячные эмбрионы коров, 2,5-3-х месячные эмбрионы свиней, бычки 4-6-ти месячного возраста, а также 1-4 недельные крольчата, 1-2-х месячные щенки и котята, 7-12-тидневные куриные эмбрионы.

Первичные культуры клеток (ФЭК, ПЭК, ПЭС, ТБ, ПК, ПЩ, 1ЖТ) получали по общепринятым методикам, до полного истощения ткани. В качестве контроля использовали 0,25%-ный раствор трипсина "Difko" по ФС 42-131ВС-88. Эффективность диспергирования тканей оценивали по выходу клеток из 1 г ткани (до центрифугирования), токсичность - по жизнеспособности клеток в суспензии и их ростовым свойствам.

Перевиваемые линии клеток (MDBK, MDCK, СПЭВ, CRFK и ВНК-21/13) культивировали стационарным методом при (37,0+0,5)°С согласно имеющихся паспортов. Монослой клеток снимали со стекла смесью 0,25%-ного раствора трипсина "Difko" или ТСС и 0,02%-ного раствора версена в соотношении 1:10.

В работе использовали вирусы пневмоэнтеритов КРС: штаммы

"Оренбург" и MBA 1/81 инфекционного ринотрахеита, штамм МВА 1/77 парагриппа-3, штамм "Орегон" С24У вируса диареи, штамм "В-10" аденовируса, а также штамм БУК-682 вируса болезни Ауески, штамм ВГНКИ вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней и штамм Д1 парвовируса собак. Образцы опытных и контрольных культур заражали общепринятым методом и инкубировали в стандартных условиях при температуре 37,0+0,5°С. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в lg ТЦД50/мл- Активность штамма Д1 парвовируса собак определяли микрометодом в реакции гемагглютинации и выражали в единицах гемагглютинации (ГАЕ). Работа проведена совместно с Н.Г.Осидзе, И.И.Скворцовой, В. Т.Ночевным, Н.П.Симбмрцевым.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Разработка способа получения трипсина сухого стерильного для культур клеток Технологическая схема изготовления экспериментальных серий ТСС предусматривала входной контроль образцов трипсина и неорганических солей на соответствие требованиям квалификации "для культур клеток", подготовку и смешивание солей, приготовление сухого буфера, фасовку и комплектование готовой формы ТСС, стерилизацию, этикетировку и контроль конечного продукта.

При определении предельно-допустимых показателей качества исходных образцов трипсина, были исследованы 12 образцов фермента фирм "Dlfko", "Ferrak", "Serva", ВНИИТИБП, РМКК и ЛХФИ. С учетом предварительного контроля для изготовления ТСС было отобранно 8 образцов трипсина со следующими показателями: протеолитическая активность не ниже 150 ЕД по Шоу-Петиколас; массовая доля влаги не более 3%; рН буфера не выше 7,4; выход клеток в пределах 150-215 млн из 1 г ткани КЗ при 94-9б£ жизнеспособности; допусти-

мые значения мутности нефильтрованного 0,25%-ного раствора не более 6,5х1СГ31/см или 0,05 ЕД оптической плотности (ОП).

Полученная при смешивании солей в шаровой мельнице (4,0+0,5 ч при частоте вращения 90+10 об/мин) сухая буферная смесь представляла собой однородную массу дисперсного порошка белого цвета, полностью растворимого в очищенной воде в течение не более 15 мин. Прозрачный раствор буфера (не выше 0,05 ЕД ОП) характеризовался следующими показателями: рН - 7,25-7,45; буферная ёмкость -0,5-0,65 мл; электропроводность - 16,2-18 мксим.

Препарат комплектовали из двух флаконов, один из которых содержал смесь неорганических солей - сухую форму буфера (5,03+0,15 г.), другой - порошок трипсина (1,25+0,03 г). Один комплект ТСС был расчитан на приготовление 0,5 л рабочего (0,25%) раствора трипсина, пригодного для диспергирования тканей животных.

При отработке режимов стерилизации установлено, что ускоренные электроны в дозе 25 кГр и гамма-лучи в дозе 35 кГр обеспечивали полную стерилизацию образцов без изменения исходных свойств препарата. Потери активности ферментов не превышали 5%. При более жестком облучении (30 кГр), потери активности трипсина возрастали до 15%, а в образцах с повышенной влажностью наблюдали изменение цвета препарата от белого или слегка сероватого до желтого или серого. Доза 20 кГр не обеспечивала полную стерилизацию образцов и в дальнейшей работе не применялась. Опытные и контрольные образцы характеризовались равноценными диспергирующими свойствами.Выход клеток из 1 г ткани КЭ был на уровне 186,9-206,9 млн/г с 94-96%-ной жизнеспособностью. Изолированные клетки обладали выраженными адгезивными и ростовыми свойствами и при посевной концентрации 0,6 млн/мл формировали монослойные тест-культуры

ФЗК через 36-48 часов.

Таким образом, в результате исследований нами были предложены критерии оценки и определены предельно-допустимые показатели качества исходного трипсина и набора солей, а также отработаны условия стерилизации сухой формы препарата трипсина, пригодного для изготовления культур клеток.

2.2.2. Совершенствование методов контроля ТСС Для отработки методов контроля и определения общих требований к готовой форме ТСС были испытаны 5 серий ТСС в соответствии с требованиями ТУ 10.07.194-91 и ФС 42-131ВС-88. Установлено, что 3 серии (2, 7, 8) из 5 соответствовали требованиям НТД по внешнему виду, содержанию влаги (1-ЗХ) и растворимости, рН раствора (7,1-7,25) и буферной емкости (1,6-2,4 мл). Серия 5 не растворялась в воде даже при интенсивном перемешивании в течение 30 мин, при этом рН раствора (6,9) не соответствовал нормативу. Раствор трипсина был мутным, нерастворимый осадок составлял 10Х от общей массы сухого препарата. Раствор серии 6 сильно опалесцировал, и при отстаивании в течение 60 мин выпадал аморфный, легко разбиваемый при встряхивании осадок, составляющий 30% от об'ёма раствора. Проведённые исследования показывают, что методы контроля, предусмотренные НТД, приемлемы и могут быть рекомендованы в качестве физико-химических тестов для оценки пригодности серий ТСС.

В связи с отсутствием стадии осветляющей фильтрации, дополнительно оценивали прозрачность нефильтрованных растворов ТСС (по коэффициенту яркости и оптической плотности). Визуально прозрачные растворы ТСС характеризовались следующими количественными показателями: коэффициент яркости до 6,Зх10~31/см; оптическая плотность до 0,05 ЕД ОП, тогда как сильно опалесцирующий раствор ТСС

серии б - 8,62хЮ~21/см и 0,08 ЕД 0П, а имеющий осадок, мутный раствор ТСС серии 5 - 4,85х10~2 и 0,23 ЕД ОП соответственно.

По значениям осмоляльности все растворы ТСС имели незначительный разброс (298-334 мОсм/кг), что свидетельствует о стандартности исследуемых растворов по данному показателю.

При стерилизации препарата серии 6, где массовая доля влаги составляла 6,4%, имело место изменение цвета трипсина и образование частиц, не растворяющихся при последующем встряхивании, по-видимому, за счет радиолиза воды. Поэтому контроль исходного сырья и ТСС на содержание массовой доли влаги является обязательным.

Определяющим фактором получения культур клеток и вирусных препаратов является стерильность. Все экспериментальные серии ТСС не содержали контаминантов бактериального, грибкового, микоплаз-менного и вирусного происхождения.

С учетом полученных данных, нами рекомендуются следующие требования к качеству трипсина, солей буфера и раствора препарата изготовленного на основе ТСС.

Для трипсина сухого стерильного:

- внешний вид, цвет, запах: тонкодисперсный, гигроскопичный порошок белого или слегка сероватого цвета без посторонних примесей; запах специфический, свойственный данному виду препарата-,

- массовая доля влаги - не более 3%;

- растворимость: 2-3 мин;

- стерильность: должен быть стерилен.

Для смеси сухих стерильных солей:

- внешний вид: порошок белого или слегка желтоватого цвета;

- массовая доля влаги - не более 3%;

- растворимость: не более 15 мин;

- стерильность: должна быть стерильна.

Для раствора ТСС:

- внешний вид: прозрачная жидкость без осадка;

- прозрачность: не более 6,Зх10"31/см (0,05 ЕД ОП);

- показатель концентрации водородных ионов (рН) - 7,3+0,2;

- буферная емкость - не менее 1,5 мл;

- осмоляльность - 315+25 мОсм/кг;

- протеолитическая активность - не менее 120 ЕД по UIoy-Пети-колас.

В качестве тест-системы были испытаны ткани почек эмбрионов коров (ПЭК), крольчат до месячного возраста (ПК), а в качестве контроля - ткань куриных эмбрионов (КЭ).

Предусмотренная ТУ 10.07.194-91 ткань КЭ была отвергнута как тест-система для оценки диспергирующих свойств готовой формы ТСС в связи с тем, что она относительно легко дезагрегируется даже фосфатно-буферным раствором без ионов Са и Mg (72,6+7,2 млн клеток/1 г ткани) и не позволяет объективно оценить качество препарата.

Ткань ПЭК является приемлемым субстратом для контроля ТСС. Выход клеток составлял 198+51 млн/г, с жизнеспособностью 80-87%. Однако, дефицит эмбрионов коров не позволяет рекомендовать её в качестве тест-культуры.

В качестве культуральной модели для оценки активности ТСС нами предлагается ткань почек крольчат месячного возраста. Это обусловлено доступностью и равноценной с тканью ПЭК трудоемкостью диспергирования. Исследовали условия дезагрегации ткани ПК в зависимости от протеолитической активности (120, 190, 256 и 512 ЕД) образцов фермента. Выход клеток из 1 г возрастал при увеличении

активности ТСС от 120 до 512 ЕД. Оптимальное время диспергирования ткани ПК составляло 5-7 мин.

Полученные результаты позволили рекомендовать следующие условия для контроля диспергирующих свойств ТСС на культуре клеток ПК:

- минимальная активность 120 ЕД;

- диспергирование ткани ПК осуществлять 5-9 раз при непрерывном перемешивании;

- температура диспергирующего раствора - 37°С;

- время экстрагирования не должно превышать 5-7 мин;

- добавлять в суспензию клеток 10-15% сыворотки крови животных, осаждать клетки центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин;

- посевная концентрация клеток должна быть 0,4 млн/мл;

- использовать питательную среду ГЛА или смесь сред ГЛА (50%), Игла (25%) и 199 (25%) с добавлением 10% сыворотки крови КРС

В предложенных условиях выход клеток из 1 г ткани ПК достигал 121,8-167,4 млн/г, при жизнеспособности 93-95%. Опытные и контрольные клетки ПК формировали монослойные культуры на 5-6 сутки выращивания.

Таким образом, в результате исследований предложен перечень . методов физико-химического контроля, определены предельно-допустимые значения показателей качества ТСС, предложена доступная тест-культура для об'ективной оценки диспергирующих свойств и токсичности препарата, а также определены оптимальные условия трипсинизации ткани и получения качественных культур клеток ПК.

2.2.3. Производство ТСС на основе ферментов различных фирм-изготовителей

Оценивали возможность использования коммерческих серий

трипсина фирм "Difko", "Serva" и ВНШТИБП для изготовления ТСС квалификации "для культур клеток". По физико-химическим показателям исследуемые серии ферментов были практически равноценными и соответствовали пред'являемым требованиям. Различия протеолити-ческой активности препаратов обусловлены разной исходной активностью серий фермента. На их основе были изготовлены 3 серии по 500 комплектов ТСС. Все серии препарата обеспечивали сравнимый выход клеток из 1 г ткани КЭ (199+17-215+03 млн/г) с жизнеспособностью 94-96%.

Таким образом показано, что для производства стандартных по качеству серий ТСС требуются исходные препараты трипсина со строго регламентированными показателями качества, не зависимо от изготовителя.

Одним из важнейших показателей качества препаратов трипсина является срок хранения. Установлено, что препараты сохраняли исходные свойства в течение 2-х лет хранения при 4°С. Достоверные потери активности не превышали 3% от исходного уровня. Рабочие растворы ТСС обеспечивали выход изолированных клеток из 1 г ткани ПК на уровне 120-130 млн/г с жизнеспособностью 92-96%. Количество свободных радикалов (К-СНзСНСООН).при неизменном содержании влаги (1,1%), в свежеприготовленном и хранившемся при 4°С в течение 2-х лет ТСС составляло соотвтственно 2,8 и 2,1*1018 рад/грамм.

При повышенных температурах 37 и 60°С активность препарата достоверно возрастала в течение 90 и 10 сут в среднем на 28-30%. При увеличении сроков хранения наблюдалась устойчивая инактивация. Время полураспада образцов ТСС при 37°С составило 180 суток, а при 60°С - 60 суток, тогда как раствор трипсина (153,6+2,1 ЕД) полностью инактивируется при температуре 37,0+0,5°С уже через 15 суток хранения. В то же время при температуре +4°С, активность

раствора трипсина практически не изменилась (148,5+1,43) в течение 3-х мес хранения.

Оценивали возможность прогнозирования сроков хранения ТСС при 4, 37 и 60 °С. Полученные, с использованием кинетического уравнения первого порядка константы скоростей термоинактивации препаратов при температурах 4° (Кт - -0,452х10_6(сек-1) и 37°, 60°С (Кт - -21,014х10~6(сек-1). Кт - -24,738х10""6(сек~1)) оказались несопоставимыми, так как зависимость протеолитической активности ТСС от факторов времени и температуры имела нелинейный характер и отсутствовала коррелятивная взаимосвязь между снижением величины протеолитической активности при 4, 37, 60°С (г* - 0,98, г* - 0,49, г* - 0,55 соответственно).

Для прогнозирования сроков хранения ТСС был использован метод пошаговой регрессии. Совместно с к.т.н. А.А.Маслак (БНИИТИБП) была использована модель представления экспериментальных данных второго порядка, обладающая высокой точностью апроксимации (И.-0,82) и построены двумерные графики, отражающие зависимость протеолитической активности (У) от времени (0-5 лет) и температуры (4-60°С). Анализ которых показал, что температура 4°С является оптимальной для длительного хранения ТСС. При комнатной (20+2°С) температуре сохранение максимальных значений У прогнозируется в течение 90 сут, а полностью препарат инактивируется через 730 сут хранения. При 37 и 60°С период максимального-сохранения протеоли-тических свойств равен 45 и 29 сут, полностью препарат, согласно прогнозу, инактивируется через 360 и 218 сут соответственно.

Необходимо отметить, что выбор сроков хранения каждой отдельно взятой серии ТСС следует осуществлять дифференцированно, с учетом культуральной модели, температуры хранения и исходной ак-

тивности препарата.

Таким образом, в результате исследований для практического использования предложен активный, термостабильный препарат ТСС , обладающий выраженными диспергирующими свойствами в отношении тканей животных. При этом определены общие требования к исходным компонентам, разработаны технология изготовления ТСС и физико-химические методы контроля. Для оценки диспергирующих свойств ТСС предложена культуральная модель, показана равноценность коммерческих препаратов трипсина отечественного и импортного производства, сохраняющих исходные свойства в течение 2 лет.

Результаты исследований послужили основанием для разработки следующей НТД, утвержденной Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 15 августа 1993 г. и Госкомитетом по санэпиднадзору 21 июля 1995 г.:

- Технические условия ТУ 10.07.074-93 "Трипсин сухой стерильный для культур клеток";

- Временное наставление по применению трипсина сухого стерильного для культур клеток;

- Временная инструкция по изготовлению и контролю трипсина сухого стерильного для культур клеток;

- Временная фармакопейная статья ВФС 42/Д 021ВС-95 "Трипсин сухой стерильный для культур клеток".

2.2.4. Применение ТСС для получения культур клеток и вирусов

При определении оптимальной протеолитической активности для дезагрегации тканей КЗ, ПЭК, ТБ и ПЭС были испытаны растворы ТСС на ФБР с активностью 5, 10, 20, 40, 120 и 400 ЕД по Шоу-Петиколас.

Оптимальной активностью растворов ТСС, обеспечивающей равный с контролем (120 ЕД) выход клеток явилась: для тканей КЭ - 10 ЕД:

163 млн/г (контроль - 139,8 млн/г), ФБР без трипсина - 72,6 млн/г; для тканей ПЭК и ТВ - 40 ЕД: 71,2 млн/г - ПЭК, (контроль - 69,2 млн/г) и 129,3 млн/г - ТВ (контроль - 114,9 млн/г); ПЭС - 120 ЕД: 72,0 млн/г, снижение концентрации фермента в три раза приводило к снижению выхода клеток (на 33%) и потере ими ростовых свойств.

С учетом полученных данных изучена пригодность ТСС для диспергирования различных видов тканей животных. В экспериментах было показано (табл. 1), что опытный диспергент на основе ТСС

Таблица 1

Эффективность ТСС для получения различных видов первичных культур клеток

Вид тши Хараиеристш Условен днс- Р £ 3 У 1 Ь Т Т 11 Урохав ueroi тнс/мл Досто-вер ЙОСТЬ шосода ueroi Р

дмспер Ваше-нованне гента Агав- вость пергир Крат- вость зияния Время юш Выход ЫСТ01 ■3 1 г тшн кш/г 1нзие CDO- соб-востъ X Срок форшг рошы m/cjoi CJT

♦ Э i ICC КОНТРОЛЬ 256 120 2 2 30 30 203,3+6,7 143,919,3 89-97 89-95 3-5 3-5 137,3+20,8 151,2+43,3 <0,01

031 ICC Контроль 256 120 7-8 S-9 10 10 8S,25+7,4 66,7551,5 80-98 90-92 6 6 205,2+39,6 188,43+46 >0,01

ВЭС ТСС Ковтроль 256 120 3-S 3-S МО £-10 64,18+3,6 64,SSÍ6,9 86-90 77-83 5 S 188,2+20,6 164,8+30,4 >0,01

ТБ ICC Ковтроль 256 120 6 6 S-10 10 200,33+22.6 173,8+15,2 85-92 80-90 4 4 219,3+57,7 169,6+31,8 >0,01

ПК ТСС КОНТРОЛЬ 256 120 5-9 5-8 5-7 7-10 135,$+10,6 93,51,2 85-95 80-91 5-7 5-6 242,0+ 6,4 232,0+20,0 <0,01

И* ГСС Контроль 256 120 3-7 3-8 7-10 7-10 72,96+19,9 92,17+46,5 87-95 76-91 4-6 4-6 234,1+35,4 208,8+52,2 >0,01

Шт ТСС Контроль 256 120 9-14 10-17 5-6 5-6 36,05+13.5 54,5+23,4 90-94 71-97 4-5 5 192,75+8,6 85,65+4,2 >0,01

(256 ЕД) обладал выраженными диспергирующими свойствами в отношении тканей ПЭК, ПЭС, ПЩ, ПК, ПК, КЗ и ТВ. При оптимальной посевной концентрации клетки характеризовались удовлетворительными адгезивными и ростовыми свойствами и формировали монослойные куль-

туры в одинаковые с контролем сроки.

В процессе 5-кратного пассирования перевиваемых линий клеток МДБК, МДСК и СПЭВ. установлено, что культуральные свойства опытных и контрольных тест-культур были аналогичны и находились в пределах: жизнеспособность клеток в суспензии - 96-100%; срок формирования монослоя - 4-5 суток; индекс пролиферации - MDBK -1,6-2,7 (ТСС), 1,7-2,5 (контроль); MDCK - 1,7-3,2 и 1,6-2,7; СПЭВ - 1,7-2,4 и 1,8-2,5 соответственно.

Эффективность ТСС для поддержания перевиваемых линий клеток подтверждена испытаниями в Институте экологии и генетики микроорганизмов УО РАН и на научно-производственной фирме "БиоКом лтд".

Время дезагрегации перевиваемых линий клеток СПЭВ, Vero, ВНК-21 и ТЗТ не отличалось от контроля и составляло 1-3 мин. Применение диспергента на основе ТСС и версена (в соотношении 1:3) увеличивало скорость отделения клеток 4647, MDCK, CRFK от субстрата в 2-3 раза. Жизнеспособность опытных и контрольных культур находилась на уровне 94-97%. При посевной концентрации 100 тыс/мл опытные и контрольные культуры формировали монослой в одинаковые сроки (4-5 суток) и не отличались морфологически.

В сравнительных опытах (п-4) оценивали чувствительность опытных и контрольных культур клеток к различным ДНК- и РНК-содержа-щим вирусам. Показано, что модельные тест-культуры, полученные с использованием ТСС и раствора трипсина (контроль), характеризовались равноценной чувствительностью и были пригодны для размножения эталонных и производственных штаммов вирусов (табл. 2).

Производственные испытания на Омском биокомбинате, при изготовлении культуры клеток ФЭП и вакцины против болезни Марека, показали, что диспергент на основе ТСС обладал равноценной с конт-

ролем диспергирующей активностью в отношении ткани ПЭ и обеспечивал выход 45,8-68,9 млн клеток из 1 г (контроль 42,8-62,3 млн/г) с жизнеспособностью 95-97%. Срок формирования монослоя в роллер-ных бутылях составлял 48 часов. В полученных культурах не наблю-

Таблица 2 Чувствительность культур клеток, полученных с использованием ТСС, к некоторым ДНК- и РНК-содерхащим вирусам

Вирус 1тамн ИРГ ИВА ¡/81 ЮТ Оренбург ПГ-З МВА ЦП АД БЧ0 БВД 0регшС24У ВБА БИ-628 ТГЭС ВГНИ пвэс Д-1

Ьеш ИМ 1/13 031 V Ш ПЭГ ТБ 4Х ПЭС см

Дясаергеит Ваюшенне вируса, 1еТЦД50/м, ГА

ТСС ¡онтрш 7,70+0,09 7,73+0,08 7,2310,15 7,29+0,23 5,56+0,056 5,50+0,093 5,23+0,15 5,3310,17 6,23+0,15 6,33+0,17 7,44+0,06 7,50+0,10 5,71+0,10 5,6310,04 1024-4096ГА 1024-4096ГА

дали признаков зернистости и дегенерации клеток.Активность вируса в опытных и контрольных культурах была практически одинаковой и составляла соответственно 1,0-5,0*10"5 и 2,5-6,0*10~5 ФОЭ/мл.

2.2.5. Производство и апробация ТСС при получении культур

клеток и вирусных препаратов С учетом полученных данных на НПО "Вектор" была разработана и апробирована опытно-промышленная технологическая линия по производству ТСС. Этапы изготовления препарата включали: отбор и контроль солей квалификации "хч" и "осч" и трипсина в соответствии с требованиями ТУ 10.07.194-91; высушивание и контроль влажности солей; приготовление навесок; получение смеси солей на шаровой мельнице ЛЕ-101; определение массовой доли влаги смеси; фасовка компонентов, укупорка и закатка флаконов ; стерилизация препарата на ускорителе электронов ИЛУ-6 ; зтикетировка флаконов; контроль ТСС на соответствие требованиям квалификации "для культур клеток".

По разработанной технологии было изготовлено 4 опытно-промышленных серий ТСС, в количестве 3300 комплектов. Образцы серий ТСС отвечали установленным требованиям. Протеолитическая активность образцов находилась на уровне 130-473 ЕЛ- Выход клеток из 1 г ткани ПК составлял 109-124 млн клеток с жизнеспособностью 94-96%. Изолированные клетки характеризовались удовлетворительными адгезивными и ростовыми свойствами (ИП 0,51-0,62) и формировали мо-нослойные культуры на 5 сутки инкубирования.

На НПО "Вектор" освоен способ производства и организован серийный выпуск ТСС из расчета 60-100 тыс. комплектов в год, что составляет 30-50 тыс л рабочего раствора трипсина.

Установлено, что при сопоставимой, на 1 квартал 1995 г., стоимости жидкой (15500 руб/л) и сухой (14949 руб/л) форм препарата экономический эффект от применения последней складывается за счет сокращения затрат на хранение и транспортировку препарата. Так, затраты на оплату электроэнергии снижаются в 4,6-12,5 раз, благодаря использованию для хранения препарата малолитражных бытовых (б+2°С) холодильников. Снижение транспортных расходов обусловлено в 14,5 раз меньшим объёмом и в 22 раза меньшим весом, по сравнению с эквивалентным количеством жидкого препарата. Кроме того, ТСС сохраняет исходную активность в течение 2-х лет хранения, раствор трипсина - в 4 раза меньше,в связи с чем, приобретается в 4-12 раз чаще,что приводит к увеличению производственных затрат.

Анализ вышеизложенного свидетельствует о том, что для вирусологической практики предложен новый, высокоактивный, стабильный и экономичный ферментный препарат квалификации "для культур клеток". Выполненная работа позволила:

- определить общие требования к исходным компонентам и разработать технологию изготовления и метод стерилизации ТСС;

- определить форму выпуска препарата, разработать методы контроля и значения показателей качества ТСС;

- показать целесообразность и необходимость замены коммерческого раствора трипсина на ТСС для производства первичных и перевиваемых культур клеток;

- определить условия и сроки хранения ТСС, показать возможность прогнозирования сроков хранения препарата при различных температурах;

- показать пригодность и эффективность культур клеток, полученных с использованием ТСС, для накопления ДНК и РНК-содержащих вирусов и производства противовирусных препаратов;

- предложить "Трипсин сухой стерильный для культур клеток" (ТСС) для производства профилактических и диагностических вирусных препаратов.

Проведенные исследования и анализ полученных результатов позволили сделать следующие выводы.

3. выводы

1. Разработана технология изготовления "Трипсина сухого стерильного для культур клеток" (ТСС), включающая:

- отбор образцов трипсина по внешнему виду, растворимости, влажности (не более 3%), протеолитической активности, диспергирующим свойствам и прозрачности (коэффициент яркости и оптическая плотность нефильтрованных растворов фермента не должна превышать более 6,5х10йБ0-ЗйТ1/см или 0,05 ЕД оптической плотности);

- отбор, высушивание и изготовление смеси солей;

- расфасовку солей и трипсина, укупорку и этикетировку препарата.

2. Впервые определены условия стерилизации ТСС ускоренными

элетронами. Использование ускоренных электронов в дозе 25 кГр обеспечивает сохранение 95% исходной протеолитической активности препарата. Метод стерилизации не оказывает влияния на диспергирующие свойства и не увеличивает токсичности препарата в отношении тканей животных и клеточных культур.

3. Определена форма выпуска ТСС в виде комплекта из двух флаконов, содержащих 1,25 г трипсина и 5,695 г смеси солей буфера. Комплект препарата расчитан на приготовление 500,0 мл рабочего раствора диспергента. Препарат представляет собой тонкодисперсный стерильный порошок белого или слегка сероватого цвета без посторонних механических примесей с остаточной влажностью не более 3,0%, протеолитической активностью 120-512 ЕД по Шоу-Петиколас и полностью растворимый в деминерализованной (дистиллированной) воде без признаков опалесценции раствора в проходящем свете.

4. Разработаны методы контроля и определены предельно допустимые значения показателей качества ТСС, включающие определение: стерильности, массовой доли влаги, растворимости, прозрачности (по оптической плотности и коэффициенту яркости нефильтрованных растворов), рН среды, буферной емкости и протеолитической активности препарата. Для оценки диспергирующих свойств и токсичности ТСС рекомендуется тест-система - почка месячных крольчат и оптимальные условия дезагрегации ткани, обеспечивающие выход 121,8-167,4 млн клеток из 1 г ткани с жизнеспособностью 93,3-95%.

5. Диспергирующие растворы на основе ТСС пригодны для получения первичных культур клеток ФЭК, ФЭП, ПЭК, ПЭС, ТБ, ПК, ПЩ, ПКт и серийного пассирования перевиваемых линий клеток MDBK, MDCK, СПЭВ, Vero, ВНК-21, ЗТЗ, 4647, CRFK. Препарат не оказывает влияния на адгезивные и ростовые свойства изолированных клеток, на

сроки образования монослоя и морфологию клеток в культуре.

6. Обоснована целесообразность дифференциального подхода к выбору концентрации ТСС в растворе при получении первичных культур клеток различного происхождения. Оптимальные условия для дезагрегации тканей ФЭК, ПЭК и ТБ, а также ПЭС, отмечаются при использовании раствора ТСС, содержащего соответственно не менее 10, 40 и 120 ЕД активности фермента.

7. Препарат сохраняет исходные физико-химические, и диспергирующие свойства в течение двух лет хранения при 6+2°С. Прогревание ТСС при температурах 37 и 60°С в течение 90 и 30 суток соответственно, ведет к активации фермента в среднем на 30%.

8. Показана возможность применения математических методов для определения сроков хранения препарата при положительных температурах. Метод пошаговой регрессии позволяюет прогнозировать, с точностью до 80%, сроки хранения ТСС в широком (4-60°С) диапазоне температур.

9. Применение ТСС в вирусологической практике позволяет, по сравнению с традиционным диспергентом (раствором трипсина), упростить технологию производства и сократить затраты на хранение (в 4,6-12,5 раз), транспортировку (в 22 раза) препарата и приобретение импортного оборудования и материалов.

10. Первичные и перевиваемые культуры клеток, изготовленные с использованием диспергента на основе ТСС и традиционным способом, характеризовались равноценной чувствительностью и обеспечивали максимальное накопление вирусов болезни Ауески (7,44+0,06 -7,50+0,101g ТЦД5о/мл). трансмиссивного гастроэнтерита свиней (5,63+0,04-5,71+0,101g ТЦД50/мл). инфекционного ринотрахеита КРС (7,28+0,15-7,73+0,081g ТЦД50/мл). парагриппа-3 (5,56+0,1-5,50+0,1 lg ТЦД5о/мл), Диареи (6,28+0,15-6,33+0,171g ТЦЦ50/мл).аденовироза

(5,28+0,15-5,33+0,17^ ТЦДбо/мл) и парвовиручного энтерита собак (1024-4096 ГА).

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложены технология изготовления, методы контроля и применения трипсина сухого стерильного для изготовления культур клеток и противовирусных препаратов.

2. По результатам исследований разработана и утверждена ГУВ Минсельхозпродом и Госкомитетом по санэпиднадзору РФ следующая научно-техническая документация:

- Технические условия, ТУ 10.07.074-93 "Трипсин сухой стерильный для культур клеток";

- Временная инструкция по изготовлению и контролю трипсина сухого стерильного для культур клеток;

- Временное наставление по применению трипсина сухого стерильного для культур клеток;

- Временная фармакопейная статья ВФС 42/Д 021ВС-95 "Трипсин сухой стерильный для культур клеток";

- Инструкция по применению Трипсина сухого стерильного для культур клеток.

5. СПИСОК

работ опубликованых по теме диссертации

1. В.Т.Ночевный, В.И.Солодилов, А.В.Величко. Влияние магнитно-динамического резонансного воздействия на свойства среды, сыворотки крови и трипсина, используемые для культивирования клеток. Цитология, т.34, N 9, 1992.

2. А.В.Величко. Сухой стерильный трипсин - диспергент для получения культур клеток. IV Путинское совещание "Культивирование клеток животных и человека(проблемы цитотехнологии)". Пущино,

1994.

3. А.В.Величко.Трипсин сухой стерильный для культур клеток. Депонировано во ВНИИТЭИ агропрома (справка о депонировании N 15950, 19.12.1994 Г.).

4. В.Т.Ночевный, А.В.Величко. Влияние активности трипсина на эффективность диспергирования тканей животных и получения первичных культур клеток. Труды ВГНКИ, Москва, 1995.

5. А.В.Величко, В.Т.Ночевный, Л.П.Камший. Трипсин сухой стерильный квалификации "для культур клеток".В кн.: "Успехи современной вирусологии". 1995. Екатеринбург (в печати).

6. А.В.Величко,А.А.Маелак. Использование математических методов для прогнозирования сроков хранения трипсина сухого стерильного для культур клеток (в печати).

7. А.В.Величко, Г.П.Трошкова. Динамика инактивации трипсина сухого стерильного при различных температурах (в печати).

8. А.В.Величко, П.А.Чулков, В.Т.Ночевный, Л.П.Камший. Экономическая эффективность применения трипсина сухого стерильного в вирусологической практике (в печати).

Размножено на ротапринте IUU экз., зак. 137. Типография "РОТЗКС", и!ясницкая, 35.