Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Стандартизация методов контроля культуральных питательных сред и их компонентов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Стандартизация методов контроля культуральных питательных сред и их компонентов"

ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ИАУЧИО-ИССДВДОВЯТЕДЬСКИЙ ННСТИТ/Т КОНТРОЛЯ, СТАНДАРТИЗАЦИИ В СЕРТИФИКАЦИИ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ (ВГНКИ)

РГ6 од

Яа правах рукописи Экз. В

П ;?р iqn¿

. бАШАШКИНА Надежда Алексеевна

УДК! 619sS7B.e09.33

СТАНДАРТИЗАЦИЯ МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КУЛЬТУРАДЬНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД Я ИХ КОМПОНЕНТОВ

03.00.06 - ВИРУСОЛОГИЯ

Автореферат диссертация ва соискание ученой степени кандидата апологических наук

Москва - 1994

РаОота выполнена » лаборатории культур клеток, аитагель-«ш сред а растворов всероссийского государственного науч-но-ясследовательского яястятута контроля, стандартизации н сертификации ветеринарных препаратов (ВГИКИ).

Научные руководителя:

кандидат биологических ялук НОЧКВНЫЙ в.Т.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор ОСИДЗВ Я.Г. (МВА)

кандидат Ояологяческях наук БОГЛУТДИНОВ я(ВГИКИ)

Ведущая организация - всероссийски* научно-ясследоватеяь-скиа институт экспермаентаяьной ветеринария (г. Москва).

Защита диссертации состоятся * /9 * еи^.1994 г. я /у часоа на заседания специализированного совета А.120.85.01 вря Всероссийской государствеяноя яаучяо-ясследо-вательскон институте контроля, .стандартизация я сертификации ветеринарных препаратов по адресуг 123022, г. Москва, Звенигородское массе, 5, ВГИК!I.

Оросяп принять участие в работе совета нля выслать Ваш отзыв на автореферат а двух экзеиалярлх, заверенных печатая.

С диссертацией можно оэиакоиятьсл в библиотеке ВГИКИ ветеринарных препаратов.

Автореферат разослан * /Ъ* 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совет, кандидат ветеринарных наук О.А. КОЗЫРЕВ

J. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность тему. Получение вирусных препаратов (ВП) и культур клеток предъявляет чрезвычайно высоки» требования к стандартности свойств я методам контроля диспергирующих растворов (ЯР), вирусологических питательных сред (ВИС) и сыворотки крови (CK) животных. Вариабельность свойств клеточных культур объясняется воздействие» многочисленных факторов, в тон числе нестандартностьв свойств протоолитнческих ферментов, вирусологических питательных сред я сыворотки крови животных.

Важное значение при получении первичных культур клеток играет уровень токсичности и активности диспергирующих растворов для изготовления которых используют, в основной, трипсин импортного производства. Выпускаемый отечественной прониялен-ностью трипсин малоактивен, плохо растворим в воде, недостаточно стабилен в растворе с. Поэтому, вопросы стандартизации свойств трипсина актуальны в настоящее время.

В вирусологической практике широкое применение получили полусиитетические (Игла, Игла МЭН, 199 я RPMI-1640) я гидролн-затнне (Г JA) питательные среды, изготовленные на основе импортных компонентов.

В последнее время предложены полусиитетические (199, Игла, RPMI-1640 и др.) и гидролизатиые (*ГМС, ГСВЯ я др.) среды на основе ингредиентов отечественного производства (Л.Д. Сперанская, 1981; Л.И. Игудин, 1991} Т.К. Яаяхова, Д.А. Цуверка-лов, 1964; Врмишина И.Г., Сергеева С.П., Простяков А.П., 1983; Т.Н. Строкнна, Я.П. Дьяконов, Д.П. Гальнбдк, 1991).

Однако, как показали исследования, ВПС изготовленные на основе импортных и отечественных компонентов нестандартны по свойствам и характеризуется различным уровнем токсичности и ростстнмулирувщей активности (H.H. Емельянова, И.Г. Байкиева,

Я. Рогожин и др., J9В5).

Существенный фактором нестабильности результатов при получения клеточных культур является СК животных, которая характеризуется сложным составом, выполняет роль физиологического буфера, является источником питательных веществ, не в то же время содержит большое количество ингибиторов пролиферации клеток (А.С. Новохатский, 1979; Л.И. Нгудян, 19BS-1990). Стандартизация СК по ростстинулирующнн свойствам и отсутствию ток-личности имеет очень важное значение.

Стандартизация ВВС и СК животных требует комплексного подхода к оценке качества их свойств и разработке более эффективных чувствительных методов контроля (Д.И. Игудин, 1991). Существующие методы контроля ВИС основаны на визуальных, качественных характеристиках (наличие монослоя, морфология) клеточных культур. Большинство предложенных количественных методов контроля (Karasek, Rohle, Auehamoer, 1974/ Л. Балаж, И. Блажек, 1982) достаточно трудоемки, требуют много времени и специального оборудования. Поэтому представляются актуальными задачи по разработке простых по технике исполнения, эффективных количественных методов биологического контроля ВИС и СК животных.

Применение количественного метода биологического контроля ВПС и СК животных предполагает сравнительную оценку качества коммерческих серий сред с рефереяс-препаратом (РП). До настоящего времени не разработан способ получения рефереис-препара-тов ВПС, обладающих стабильными свойствами. Перспективной представляется разработка способа изготовления РП в виде сухих стандартных образцов (ССО).

Таким образом, в настоящее время приобретают особое значение вопросы стандартизации качества диспергирующих раство-

ров, разработки эталонны* образцов питательных срод и воспроизводимых количественных методов биологического контроля ВПС и СК животных*

Цель работы: стандартизировать лротеолитические и диспергирующие свойства трипсина, разработать количественный метод биологического контроля гидролнзатных питательных сред (ГПС) и сыворотки крови (СК) животных с использованием референс-препа-paroв ГПС.

Задачи исследований :

- изучить в сравнительной аспекта биологические методы контроля ГПС и ск животных'

- разработать критерии оценки качества и количественнын метод биологического контроля ГПС и СК животных;

- разработать способ получения н методы контроля сухих стандартных образцов (ССО) гндролиаатных питательных сред;

- изучить свойства трипсина в зависимости от условий получения фермента.

Научная цовизна. Впервые изучена возможность оценивать качество ВПС к СК животных количественно, в баллах, с использованием для такого контроля тест-культур (ФЭК, ФЭП) в разведениях от 0,6 до 0,1 илн/мл и референс-препаратов в виде сухих стандартных образцов (ССО-ФГНС,ССО-ГЛА).

Изучены протеолитические я диспергирующие свойства трипсина в зависимости от степени очистки ч'ерез фильтрующие элементы нз нержавеющей сетки саржевой (НСС) и порошков титана (ВТ) с различным диаметром пор и режимов распылительного аысу-оивания фермента, fía "Способ получения трипсина" получено авторское свидетельство N 1628526.

Практическая ценность paOoru. Разработай количественный нетод биологического контроля ГВС и СК животных. Утверждены методические указания по количественному контроле качества [ВС и СК животных.

Разработан способ получения р&реренс-препарлтов ГВС в виде ССО-9ГНС я ССО-ГЛА. Утверждена научно-техническая докучен-таця: инструкция по изготовления и контроля, технические условия, наставления по применении, карта технического уровня а качества продукции, техническое задание.

Изучены свойства трипсина, полученного путем очистки грипсин-содержащих жидкостей от баластных веществ и распылительного высушивания. Результаты исследований были использованы при разработке научно-технической документации.

Апробация. Основные результаты работы доложены на:

- 11-ом Всесоюзной совещании "Культивирование клеток животных и человека• (Вущнно, 1985 г.);

- Всесоюзной научной конференции "Актуальные вопросы биотехнологии" (Ленинград, 1987 r.)f

- Всесоюзной научно-технической конференции 'Врыненение биотехнологии в животноводстве, растениеводства и ветеринарной медицине" (Ленинград, 1986 г.);

- Ученой совете ВСНКИ ветпренаратов (Москва, 1987-1991 г.

г.)/

- Нежлабораторнон совещании сотрудников ВСНКИ ветирвпара-тов (Москва, 11 ноября 1993 г.).

Публикации. Яо материалам диссертации опубликовано 4 научных статьи, подготовлены и утверждены ГУ В 6 нормативно-то*-

нических документов я получено авторское свидетельство ил способ получения трипсина.

Зарегистрирован отчет по научно-исследовательской работя;

УДК 576.809.33 N гос. регистрации 01860043378.

I

Объем и структура диссертации. Диссертация доложена на ¿¡*£ страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводи, практические предложения и список литературы. Работа иллюстрирована таблицами я ? рисуякаин. Список литературы включает /6!> источников, из них 55* иностранных.

Автор благодарит заведующего лаборатории, кандидата биологических наук В.Г. Иочевного за научно-методическую помощь в организации и проведении исследований.

2. СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в соответствия с задание* (Н 04.13.д) ГУ В ИСХ СССР во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизация п сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ).

Питательные среды, В работе использовали следующие питательные средыг раствор Хенкса (рЯ 7,2-7,4)! питательные среда с 0,25$ ферментативного гядродизата пншц сухого (*ГНС), производства Покровского завода биопрепаратов, ВИИНЯИ я Щелковского биоконбпяата! питательные среды с 0,54 гядродизата дактааьбу-мина (ГДА) фирмы "ДИфкоЧ среды 199, Игла и Г ДА, производства института полиомиелита и вирусных энцефалитов я Московского

- б -

предприятия ао производству бактерийных препаратов.

Сыворотки крови животных. В работе испытывали: сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС), плодов коровы (ПК), плодов овец (ПО), телят (ИТ), суягных овец (СО).

Вирусы. Испытывали штаммы ВУК-628 вируса Оолеэны Луески 1ВБА) я вирусы пиевиозитеритов КРС, штамм 'Оривнбург* вируса инфекционного ринотрахента (ИРГ), итаии Орегон С24У вируса диареи (ВД) и «гаки В-.10 аденовируса (АЛ).

Изготовление сухиу стандартны* образцов ХССШ Ис-

пользовал* соди, входящие в состав Хенкса квалификации "хч" и "осч", которые высушивали по специальной схеме. Контроль степени высушивания солей осуаествляли пикиометрическмм методом, разработанным в ннсгягуге полиомиелита и вирусных энцефалитов. Наготовлены» смеси солей производили в шаровой нельннце, используя круговой я реверс явный способы измельчения и перемешивания солей.

Отбор гндролизатош ФГНС и [ДА проводили я соответствии с гребованнлмн ТУ 46-1220-80 н дополнительному перечил показателей, установленному в ходе экспериментов.

Образцы гндролиэагоа ([ДА,.+СНС) и сухую смесь солей состава Хеикса фасовали во флаконы 10-20 мл в расчете на 400 мл питательной среды, тщательно перемешивали, укупоривали и стерилизовали в НИФХ им. Д.Я. Карпова гамма облучением в дозах от 2,5 до 6,5 Нрад.

Фианко-хнмическнй контроль ССО. ♦лаконы со ССО растворяли в деминерализованной воде с электропроводностью не более 0,5 нкснн. Питательные среды, полученные из ССО-*ГНС и ССО-СЛА подвергали фиэико-хихическону контролю в соответствии с гре-бованиями 'Методических реномекдацнй по контролю качества вирусологических питательных сред* (Москва, 1985 г.)

Биологический контроль питательных сред и сиаоротки крови животных. В сравнительной аспекте оценивали эффективность следующих методов контроля ВПС и СК животных:

- контроль ростобеснечивающих свойств ГПС и СК животных

I

яа первичных культурах клеток ФЭК, ФЭП, ТВ, ПЭК, ПТ, ПЭС и перевиваемых линия* клеток ПТ-ао и СЛЭВ по урожаю клеток (УК), индексу пролиферации (ИП) я морфологической характеристике;

- количественный метод биологического контроля ГПС и СК животных по включению в растущие клетки 3И-тинндина в соответствии с требованиями "Методических рекомендаций по контролю вирусологических питательных сред" (И., 1985 г.). Исследования проводили совместно с Д.И. Игудинын в ГИСК им. Л .Б. Тарасовича .;

- количественный метод биологического контроля качества ВПС и СК животных с применением культур клеток ФЭК я ФЭП в концентрациях 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,2 я 0,1 иди/на.

Культуры цлеток. В работе использовали первичные культуры клеток ФЭК, ФЭП, ПЭС, ТВ, ПТ и перевиваемые линия клеток ПТ-80 К СЯЗВ, изготовленные общепринятыми методами.

Осветление и очистка трнпсиносодержащей жидкости. Очистку трипсиносодержащей жидкости яэ ткани поджелудочных желез КРС производили иа стадиях экстрагирования и высаливания с помощью фильтрующих элементов из нержавеющей сетки саржевой (ЯСС) с размером пор 700, 500, 300, 200 и 20 ПКи (ГОСТ 231-6176-65) и порошков гягаиа (ПТ) с размером пор 7, 5, 3 и 1 мки (ГОСТ 2316176-85). Контролен служил трипсин, полученный по ТУ ОКП 921.828.1500 и трипсин фирмы "Дифко*.

Контроль протеолнтической цкхчрностк ГРЮТСТГЯД- Активность экперинентальяых я контрольных образцом трипсина оценивали по методу Шоу-Петякояас, основанном иа турбонетричесжои определения определенного количества нерасщеплаапого казеина, после

«.jo инкубации с трипсином в строго регламентированных условиях.

Дрнгрол^ диспергирующей активности трипсина. Готовили 0,25t стерильные экспериментальные и контрольные раствори трипсина и использовали их для трехкратного диспергирования тканая куриных эмбрионов в течение 30 нин. Результаты контроля оценивали по выходу клеток с 1 г ткани куриных эмбрионов, урожае клеток' (УК) и индексу полнферации (ИП) в монослойной культуре.

МЕТОДУ рысуияванил трипсина. Испытывали распылительный, сублимационный и кондуктивнчй методы высушивания трипсина. Контролем слуяял высол фермента, полученный из цеха медпрепа-рлгов Рижского мясоконсервного комбината (РМКК). Распылительное я сублимационное высушивание производили в оптимальных режимах в НТЛ ВГНКМ ветпрепаратов совместно с О.Я. чернецкнм. Сухае препараты оценивали по внешнему виду, массовой доли влага, растворимости, прозрачности, диспергнрувцей и протеолнтн-ческой активности.

Статистическая обработка, результатов, Статистическую обработку результатов производили с использованием общепринятых методов (Я.Я. Ашмарня, A.A. Воробьев, 1962; B.C. Бессмертные, 1967).

Для обработки экспериментальных данных также был использован рандомизированный анализ. Дрн оценке результатов не учитывались предпосылки однородности и нормальности ошибок наблюдений (С.Н. Ермаков я др., 1987).

Рандомизированный анализ экспериментальных данных по сравнительной оценке эффективности методов контроля tac и CK животных и при поиске объективного показателя оценки качества питательных сред проводился совместно с к.ф.м.н. A.C. Габелко.

- 9 -

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Разработка количественного метода контроля биологических свойств ВПС и СК животных

I

В основу негода положен общеизвестный биологический принцип, согласно которому потребности клеточных культур значительно возрастает при уменьшения посадочных концентраций клеток (Я.В. Богоров, 1972). Данную закономерность реализовали при разработке количественного ивгода контроля.

Схема постановки метода (Таблица 1) предусматривала использование суспензия клеток ФЭК или ФЭП а концентрациях 0,1,' 0,2; 0,3; g,4; О,S и 0,6 нлн/ял. Из каждого образца суспензия выращивали стационарно, бег смены среды по 4 пробирочных культуры. Объем инокуяята составил 1 мл суспензии клеток. Росто-беспечявающяе свойства ПС я СК животных оценивали ежедневно а течении 7 суток наблюдений, путем микроскопирования образцов пробирочных культур в сравнении с контролем. В 1, 2, 3 и 4 балла оценивали пробирочные культуры, имеющие соответственно 25, 50, 75 и 100\ монослоя. Общая сумма баллов во всех пробирочных культурах указывала уровень ростовой активности (РА) ПС я СК животных, токсичность которых одновременно оценивали по срокам формирования я сохранения монослоя, норрояогнн клеток и ИП образцов оптимальной посадочной концентрация клеток 0,6 млн мл/.

По предложенной схеме одновременно контролировали до 20 серий ГЛС или СК животных. При контроле ГПС использовали различные серии ГПС я 2• контрольной СК; при контроле серий СК животных применяли контрольную питательную среду яа основе ССО -фгнс и ССО-ГЛА.

- 10 -

Коммерческие серии ГПС и СК яшвотних, также к&к я контроль считали нетоксичными, если они обеспечивали образование мояослойяых тест-культур клеток ФЭК или ФЭП не позже 48 часов инкубирования и с ИП не менее 0,5. Кроме того, монослойяые культуры ФЭК или ФЭП должны сохраняться без смены среди в течение 7 суток культивирования, без признаков дегенерации клеток .

Серии ГПС и СК, не обеспечивающие образование мояослойных культур в течение 48 часов или не способствующие сохранение чонослоя в течение 7 суток наблюдений браковали как токсичные.

Учет результатов испытания РА коммерческих серий ГПС или СК животных проводили в том случае, если контрольная среда обеспечивала рост тест-культуры ФЭК при посевной концентрации 0,1-0,3 нлн/нл н оценивалась не менее 64 баллов.

По уровню РА нетоксичные серия ГПС я СК животных условно делили на 3 класса. К 1, 2 и 3 классу относили серии ГПС и СК животных, ростовая активность которых оценивалась 64-96, 33-63 и 16-32 баллами. Серии сред и сывороток животных, оцениваемые ниже 16 баллов, браковали, как неактивные.

Достоверность н перспективность оценки качестве ГПС и СК животных в баллах была доказана после обработки экспериментальных данных с использованием рандомизированного анализа. Данный раздел работ проводили совместно с к.ф.н.н. А.С. Габел-уо. План и анализ результатов биологического контроля ГПС на трех партиях культуры ФЭК представлены в таблице 2.

Дня оценки качества ГПС и СК были выбраны следующие показатели:

- У1 - минимальная посадочная концентрация клеток, при ксто/'ой во всех 4-х пробирках образуется 100% но>>ослоП:

- 42 - общая сумма баллов во всех 24 пробирочных культу-

- И -

Схема постановки и учета результатов биологического контроля серий гидролизатных питательных сред

Состав ПС

:Посев-:ная

Показатели контроля

:3акдю-:чение

Яаиие- :Найме-:концен- г Токсичность Ростовая актив- :о ка-

но ва- :иоаа- }рация г ность, РЛ (баллы) :честве

нн» ¡иле :клеток :Сроки:Мор- : (У2) :среды

ГПС :СХ :млн/мл :фор- ;фо- :(класс)

: : :ииро-:ло- Оценка Оценка ка :

! } ¡ваиыя:гия ИП роста чесгяа :

(в) : (X) • гконо-: культуры: среды :

• : •.слоя,: 4 в пробир: (баллы) :

•* : час : ках •

Серия 1 0,6 24 Н 0,67 4444

♦ГНС 0,5 4444

0,4 4444

0,3 4444

0,2 4444 ВО 1

0,1 0000

Серия 5 Конт 0,6 72 А 0,32 4444

Ш роль - 0,5 3322

иая СК 0,4 1111

0,3 1100 32 Брак

0,2 0000

0,1 0000

Серия 0,6 24 И 0,70 4444

ССО- 0,5 4444

*ГНС 0,4 4444

конт- 0,3 4444 •

роль 0,2 4444

0,1 2222 88 1

И т.д. до 20 серий среды

Обозначения: 3 - зерностость клеток в культуре;

Д - дегенерация клеток в культуре; Н - отсутствие зернистости и дегенерации клеток в культуре; ИП - индекс пролиферации при оптимальной посадочной концентрации клеток 0,6 млн/мл

План н результаты биологического контроля питательных сред ГЯА на культуре клеток ФЭК

Сьрия t ПКК Г ¡1С : или/ял

. t i (

; >

Партия культуры клеток

Показателя контроля f iYj' Ют:Ул : f 10^: г ¡f ¡Y^x

1 (Sj)

i <S.)

3 'V

0,6 4444 4444 4444

0,5 4444 4444 4444

0,4 4444 4,о 4444 4.0 4444

0,3 4433 4443 4444

0,2 3222 71 3322 74 3433

0,1 0000 1000 1100

0,6 4444 4444 4444

0,5 4444 4444 4444

0,4 4444 4444 4444

0,3 4444 3,0 4444 3,0 4444

0,2 4320 73 4432 4432

0,1 0000 1000 78 1100

0,6 4444 4444 4444

0,5 4444 4444 4444

0,4 4444 4,0 4444 4,0 4444

0,3 4433 4433 4433

0,2 3333 3221 70 4333

0,1 U11 78 0000 2100

3,0

79

3,0

7 a

4,0

78

Обозначение: S

U

10

ПКК

v:

Sj - серия rnci

*3 - партия культуры клеток ♦ЭК;. наименьшая посадочная концентрация клеток »ЭК, при которой образуется 1001 монослоя;

- общая сунне баллов во всех пробирках с культурой клеток ФЭК

- посадочная концентрация клеток ФЭК

- 13 -

рях, определят** уровень РА ГПС и СК животных.

Остальные показателя, в частности качество посуды, условия трипсиннзации я многие другие, влияющие на рост культуры ФЭК поддерживали на уровнях близким к оптимальным.

Результаты рандомизированного анализа экспериментальных данных по сравнительной оценке эффективности методов контроля при поиске объективного показателя РА ГПС н СК животных показали, что метод У2, определяющий уровень РА в баллах является предпочтительнее по сравнению с показателем У1 с точки зрении статистической надежности результатов.

2.2.2. Выбор тест-культуры

Выбмрадя клеточные культуры, пригодные для использования в качестве моделей для контроля качества ГПС я ск животных.

Использовали простые по технике изготовления, доступные, широко применяемые для вирусологических целей культуры клеток ФЭХ.и -РЭП.

Испытуемые кудьтуральиые модели оказались практически равноценными для оценки РА ГПС я СК животных. Культуры клеток ФЭК я ФЭП адекватно• реагировали на действие ростовых факторов исследуемых образцов сред с различным уровнен' ростовой активности. Различия а уровне РА были незначительными и достигали 9,73I, поэтому допустимо использование обеих клеточных культур с целью биологического контроля ГПС и СК животных.

2.2.3. Сравнительное изучение методов биологического контроля ГПС и СК животных

В сравнительном аспекте оценивали перспективность и дос--

товарность количественного яетода биологического контроля (У2) с традиционными негоден* контроля ГПС и СК животных на первичных культурах ПЖ, ПЭС, ФЭК, ТВ я перевиваемой линии клеток СПЭВ.

Испытывали серии ГПС я СК животных различные по уровня ростовой активности. Анализ полученных данных показал, что ростовая активность ГПС я СК животных в баллах коррелирует с урожаем клеток к ЯП первичных культур клеток ПЭК, ПЭС, ТВ. Перевиваемая линия клеток СПЭВ оказалась менее чувствительной я воздействие ростовых факторов ГПС и СК животных. При использовании сред с различным уровнем РА (60-в9) ростовые свойства культуры СПЭВ по МП колебались в течения 5 пассажей 3,9-4,0.

Достоверность количественного метода биологического контроля также была оценена а сравнительных опытах на культур« клеток ФЭК с добавлением в питательные среды радиоактивных предяеста«.(никое (ЗН-тимидииа) нуклеиновых кислот. Полученные результаты свидетельствовали о прямой зависимости между уровнем РА (баллы} СПС ш СК животных с величиной аккумулирования ЗН -тямидина пролифернрувчини клетками. В то ж« время индекс пролиферации не отражал ростоОеспечивлюяшх свойств ГПС и СК животных и не всегда коррелировал с показателем У2 н данными регистрации включения ЭН-тимиднна в ДНК клеток.

Таким образом, в результате сравнительных исследований показано, что количественный метод биологического контроля объективно отражает уровень РА СПС и СК животных. С учетом экономичности, простоты исполнения и регистрации результатов, метод оценки качества сред по показателю У2 следует признать достаточно объективным, простым в исполнении, доступным и перспективным.

- IS -

2.2.4. Разработка способа получения и изучение свойств реферейс-препаратов ГПС

Применение количественного> метода биологического контроля ГПС и СК животных предполагает параллельное пспитаяне коммерческих серия сред с референс-препаратом (РП), обладавшими максимальными ростобеспечивающиии свойствами и стабильностью в процесса хранения. Создание сухих стандартных образцов ГПС обладающих высокой ростовой активностью способствует целям стандартизации питательных срзд.

Разработка РП предусматривала отбор и подготовку образцов гидролизатов, буферных систем, спешивание, расфасовку, стерилизацию я контроль готового продукта.

На первой этапе исследований отбирали образцы гидролизатов ФГМС и ГДА (контроль), пригодных для создания ССО ГПС. Исследовали 11 серий образцов гидролизатов ФГМС отечественного производства.и 2 серии ГЛА фирмы 'Дифко*.

Установили, что исследуемые серии *ГМС и ГЛА по физико-химическим свойствам соответствовали требованиям ТУ 46-1220 -80, но в то же время отличались по ростоОеспечивающин свойствам.

Яри отборе гидролизатов были введены дополнительные показатели контроля, которые позволяли получать высококачественный препарат с хорошим товарный видом. Такики критериями оценки явились: массовая доля влаги - не более 2t, что позволяло предотвратить радиолиз воды при стерилизации гамма-лучами я появление токсичных продуктов для клеток; растворимость не более

г

20 мин.; показатель мутности не более 6,5 х 10 1/си> pH при растворении в растворе Хеикса в пределы 7,0-7,4.

Отбор гидролизатов по биологическим свойствен производили

по урожаю клеток, ИП, срокам образования и сохранения мояослоя первичными клетками ФЭК, ПЭК, ПЭС, ТВ и перевиваемыми линиями клеток СПЭВ и ПТ-ВО.

Из 11 серий ФГИС в 2 серий ГЛА только одна серия ФГНС (7) и одна серия ГЛА (1) фирмы "Дифко" соответствовали предъявляемый требованиям и были использованы в качество белковой основы ссо Г ПС.

Для изготовления сухой солевой основы рефереис-препаратов использовали набор неорганических солей, входящих в состав Хенкса. Соля я другие ингредиенты, выпускаемые промышленностью не предназначены специально для получения культуральиых питательных сред, содержат дополнительное неконтролируемое количество влаги я требуют специальной подготовки для их дальнейшего использования в составе ССО.

Сухую солевую основу для ссо получали путем высушивания отдельных компонентов состава Хенкса в оптимальных режимах, затем состав ингредиентов измельчали и перемешивали в шаровой мельнице, используя реверсивные способ перемешивания (20 нин 3 часа), позволяющий получать достаточно однородную массу со~ лей СрЯ б,в: электропроводность 15 иксии; буферная емкость 1,0 -1,2). Полученные гидролизаты И смесь солей фасовали во флаконы, перемешивали и стерилизовали гамма-лучами.

2.2.5. Стерилизация рефереис-препаратов ГПС при помощи ионизирующего облучения

Стерилизацию ССО производили при помощи гамма-облучения в дозах 2,5:3,5 и 6,5 Нрад. Эффективность облучения оценивали по внешнему виду, стерильности, суммарному количеству и качественному содержанию аминокислот и ростобеспечивающим свойствам,

- J -

по урожаю клеток, ЯП, РА. Препараты, облученные в дозе 3,5 и 6,5 Нрад обеспечивали полную стерильность ССО, в то же время при дозе облучения 2,5 Ирад - 7,5» флаконов с ССО были не стерильны. При всех испытанных дозах облучения ССО не изменяли внешнего вида и суммарного содержания аминокислот. Более жесткое облучение, в дозе 6,5 Нрад достоверно (О,02*Р>0,01) снижало уровень РА ПС на основе ССО с 82,75±1,2 до 70,25±2,1 баллов. Оптимальная доза облучения 3,5 Нрад позволяла получать стерильный препарат, не изменяя его РА (82,75 ± 1,2 балда).

2.2.6. Физико-химические и биологические свойства референс-препаратов ГПС

Было изготовлено по однов опытно-промышленной серии (по 250 образцов) ССО-ФГНС и ССО-ГДА, стерилизацию которых осуществляли гамма-лучами в дозе 3,5 Нрад. В качестве контролен использовали среды аналогичного состава, но изготовленные традиционными методами и стерилизованные методом фильтрования.

Выборочный контроль образцов ССО-ФГНС (п-7) и ССО-ГЛА (п= 7) .показал, что ССО-ФГНС и ССО-ГДА были стерильны, представляли собой тонкодисперсный порошок, хорошо растворимый в воде (15-20 мин.)/ содержали допустимые нормы хлоридов (0,8*0,06%), глюкозы (lOQiO,2 мг%), аминного азота (ССО-ФГНС, 23,в±0,1; ССО -ГДА, 33,0±.0,1 мг%). Среды, изготовленные основе ССО, были прозрачными, с буферной емкостью 1,2-1,3 ил, рЯ 7,0*0,1.

Первичные культуры клеток ПЭК, ПЭС и ТВ, выращенные на средах ССО-ФГНС и ССО-ГДА формировали монослой на 3-5 сутки, с урожаем клеток соответственно 0,32*0,02; 0,22t0,01; 0,13±0,01 и 0,Э4±0,04; О,23+0,1; 0,1В£0,91 млн/мл. Перевиваемая линия клеток ПТ-80 также успешно культивировалась на средах ССО-ФГМС

- 18 -

Среди, изготовленные на основе ССО-ФГМС и ССО-ГЛА не оке зываяи существенного влияния на уровень накопления в клетка вирусов болезни Ауески (7,5±0,1 и 7,5±0,1 Lg ТЦД si>^ ), аде новнруса (5,39+0,06 н 5,39+0,2 Lg ТЦДю/*м )> инфекциоииог ринотрахента (7,2в±0,15 и 7,22±0,11 Lg ТЦД SO/M4 ) я вирус диареи (6,39+0,20 я 6,39±0,06 Lg ТЦД so/mu, ).

Полученные результаты свидетельствовали, что ГПС на осно ве ССО—ФГМС и ССО-ГЛА характеризовались высокими ростобеспе чивасщими свойствами и могут быть использованы при контроя коммерческих серий ГПС в качестве референс-препаратов.

2.2.7. Сроки хранения референс-препаратов ГПС

Научали сроки и условия хранения референс-препаратов. Ре ф&ренс-препараты на основе cCO-ttHC я ССО-ГЛА сохраняли исход ныв фязико-хямические я биологические свойства после двух ле-храиеяия пря температуре 20£*°С я обеспечивали получение пер внчиых культур клеток ПЭК, ПЭС, тБ. РА ССО-ФГНС и ссо-глл оставалась без изменений после двух дет хранения я составила 81 7Ц,5 я 80,0±2,Э балла соответственно (Таблица 3).

2.2.8. Испояьзование коянчестванного метода биологического контроля я референс-препаратов пря оценке качества конмерческнх серий ГПС я СК животных

Яа закявчнтельнон этапе были поставлены задачи охарактеризовать качество коммерческих серий ГПС и СК животных, выпускаемых отечественной промышленностью. Было проконтролировано-t серий ГXX, производства ЯЯиВЭ и ВНИИВПг 8 серя» ГСБН, производства НИВВС я ВГНКИ я 8 серий ТИС производства Яокровскогс биозавода. И также были исследованы по 5 серий СК КРС, плодох

Влияние сроков хранения на ростобеспечивающие свойства референс-препарагов ГЯС на различных культуральиых моделях

Гаимвнова- : Сроки Клеточные культуры

гяв првиа- : храяв-

мга : ни я, пэк пэс ТВ ФЭК

г нес. t(0,6Мли/ил) : (0,биян/ня): (0,4млн/мл) :(0,6-0,1нлн,'и

Показатели контроля

m ип ИП : Баллы

0

2СО-ФГНС контроль 0 , 30iJ3 ,05 0,55±0,03 0,70±.0,0В SO,5±5, 1

12 0,30±0,02 0,53±0,03 о,бв±о,оа

24 О, 3oto,01 0,56±0,06 0,73+0,05 81,7+1,5

0,5 0,5 0,5 0,5

CCO-Ü1A 0 контроль a,3i±o,os 0 ,58±,0 ,06 0,73±0,03 78,0+2,0

12 0,36±0,01 0,65±0,02 0,68±0,08

24 0,33±0,03 0,-61±О,О4 0,70±0,05 80,6±2,3

Р О,5 0,5 0,5 0,5

овец, суягных овец, северных оленей я телят. Для сравнительной оценки использовали ССО—РГМС и ССО-ГМЛ.

Среди контролируемых серий ГПС количественный негодом были выявлены токсичные серии ГЯЛ и ФГМС, которые оценивались в 42-67 баллов, ио вызывали дегенерация клеток в культуре ФЭК на 5 сутки культивирования. Были определены серия сред ГСБН с низкими ростоОеспечивающини свойствами (Ю-12 баллов) и были выбракованы как■неактивные. Уровень РА ССО-ФГНС и ССО-ГМЛ составил 83-80 баллов. Питательные среды ГЛА, *гмС и ГСБН уровень РА которых определялся 60-80 баллани, были реконендоваиы для производства первичных культур клеток.

Количественный контроль качества СК животных подтвердил, что наиболее высокими ростобеспечивающими свойствами характеризовались СК плодов хоров (84-92 балла), телят (78-92 балла), а серии СК КРС (52-84), суягны* овец (53-84 балла) я северных оленей (64-90) не стандартны по качеству и характеризовались различный уровнен РА.

Таким образом, количество баллов, характеризующих качество ГНС и СК животных, адекватно отражало их ростобеспечивающие возможности.

2.2.9. Изучение свойств трипсина в зависимости от условий получения.

Активность и токсичность трипсина при получении клеточных культур зависит от способов очистки и высушивания фермента.

Изучали свойства трипсина при очистке его от баластных веществ через фильтрующие элементы из нержавеющей сетки саржевой (НСС) с разивpott пор 500, 300, 200 и 20 нг и порошков титана (ПТ) с размером пор 7, 5, 3 я 1 мкн. Контролен служили

фильтр-аластнни фирн и Мнллшюр и фильгровалкнан буя-иа. и,, пользование в качестве фильтров фильтровальной бумаги и филы; -пластин позволяло получать достаточно чистый н активный прч парат с оптической плотностью (О,27±0,001; О,11±0,02 £Э) и аь тивностыо (467±39; 47 4±23 ЕД), но их применение бесперспектич но, вследствие низкой производительности методов фильтрации Оптимальным вариантом для осветляющей очистки трипснносодьржх щих жидкостей является двухэтапная очистка с помощью нее с дн аметром пор 200-300 мкм и ТП с размером пор 3-5 нкм. очистка позволяла освободить трипсин от баластных вец&сгв и получать препарат с активностью не менее 467±33 £Д.

Сухие формы трипсина в наименьшей степени подвержены ,лъ толиэу и сохраняют исходную активность в течение многих лег . Изучали протеолитические и диспергирующие свойства трипсина ь зависимости от способа и режимов высушивания фермента. В раба то использовали высолы трипсина с активностью 532±29,7 кд свойства трипсина изменяется в зависимости от способа ьисулл вания (распылительное, сублимационное и кондуктивное). оити мальными условиями для сохранения ферментативной и диспоргнру вдев активности трипсина является распылительное высушивании при температуре теплоносителя 130-140 аС на входе и 60-75 "с на выходе. Применяемый способ высушивания трипсина позволил получать препарат активность» 470±20,в ЕД и содержанием влаги не более 3*.

После серии опытов по отработке оптимальных усаовип очистки и высушивания трипсина удалось получить экспериментальные образцы трипсина. Сравнительный анализ показан, что трнпени, подученный экспериментальным путем, обладал активностью не менее 256 ЕД и не уступал по ферментативной актив-нчг.-ги и биологическим свойствам (выход клеток из 1 г куриных

эмбрионов составил 140t3,3 млн/мл) образцам трипсина фирмы "Дифко" и значительно превосходил образцы трипсина (Р<0,01), полученного по ТУ ОКП 921 828 1500, где выход клеток составил 56,«±2,24 идя/ял с 1 г куриных эмбрионов.

ВЫВОД ы

1. Разработай способ получения рьференс-препаратов ГОС в виде сухих стандартных образцов (ССО) СПС на основе фермента-тивиого гидролизата мышц (ССО-* ГНС) и гидродизата дактальбумина (ССО-ГЛЛ), включающий:

- отбор и высушивание содей/

- отбор гндролизатов соответствующих ТУ 46 1220-80, растворимости, влажности, прозрачности и рН раствором;

- снашивание, расфасовку, укупорку, этикетнровлные я стерилизация гамма-лучами в дозе 3,5 Нрад.

2. Определен перечень и оптимальные значения критериев оценки качества рефереис-препаратов, включающие контроль¡

- стерильности, влажности, растворимости, рН среды, буферной емкости, осмоточности, содержания хлоридов, углеводов, аминного азота/

- количественную оценку ростовой активности я токсичности препарата на тест-культурах *ЭК и *ЭП.

3. Питательные среды на основе РП пригодны для получения первичных культур клеток ПЭК, ПЭС, ПТ, ТВ и поддержания перевиваемых линий клеток СПЭВ и ПТ-вО. Первичные культуры кдеток, выращенные в средах на основе ССО сохраняли чувствительность к аденовирусу (5,39t0,06 Lg ТЦД^Л ), вирусам диареи (6,2В±0,15 Lg TMjcfH*. )> инфекционного рннотрахеига (7,28ЦЗ,15 Lg ТЦД, и вирусу болезни Ауескн {1,44±0,06 Lg TUAsc^„a ).

- 23 -

4. Референс-лрепараты ГПС сохраняют пря температуре 18+6 еС исходные фиэико-хинические , я ростобеспечивающие свойства в

течение 2-х лег хранения Серо* наблюдения).

5. Разработай количественный метод биологического контроля (У2) ростовой активности (баллы} я токсичности коннерческих серий ГПС и СК животных с использованием референс-препарата, контрольной сыворотки телят, крупного рогатого скота или плодов коровы с ростовой активностью в пределах 64-80 баллов и тест-культур ФЭК или ФЭП.

6. Количественный метод биологического контроля позволяет в течении 7 дней дифференцировать по уровня РА я токсичности до 20 серий ГПС и СК животных и оценивать перспективность их применения в производстве культур клеток.

7. Установлена прямая зависимость уровня РЛ коннерческих серий ТПС я СХ животных в баллах с величиной аккумулирования радиоактивного предшественника нуклеиновых кислот з1Г-тниядина пролнферирующями клетками тест-культуры.

8. Экспериментальные образцы трипсина обладали влажностью не более 31, хорошей растворимостью, активностью ие менее 256 ЕД и обеспечивали высокий выход клеток 100-140 идя на 1 г ткани куриных эмбрионов пря поэтапной очистке .трипснносодержащей жидкости через фильтрующие элементы из нержавеющей сетки с диаметром пор 200-300 мкм я порошков титана с диаметром пор 3-5 мкм я использования оптимальных 130-140"с на входе я 60-75 'с на выходе режимов распылительного высушивания.

1 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

2. Разработанный количественный метод биологического контроля ГПС и СК животных я методические указания могут быть использованы научно-исследовательскими учреждениями и предприятиями.

производящими'коммерческие серии ГПС я СК животных

2. Данные по изучению свойств трипсина для вирусологических целей были использованы для разработки научно-технической документации и опытно-промышленного производства фернента.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Башашкина H.A., Ночевиый В.Т., Игудни Д.И. Биологический контроль качества культуральных питательных сред на основе гидролизатов //Тез. докл. 11 Вссовзн. со вещ.: "Культивирование клеток животных и человека" (ноябрь 1965), Пущино, - 1985. -С. 120-121.

2. Башашкина H.A. Количественный метод контроля ростсти-мулнрующих свойств питательных сред и сыворотки крови животных //Дел. во ВНИИТЭИагропрома W 221 ВС-90.-9 е.. Реф. Ветеринария. - Н 8. - 1990. - С. 6.

3. Качество гидролнзатных питательных сред в зависимости от условие и сроков хранения (С.П. Сергеева, А.П. Простяков, H.A. Башашкииа и др.//В кн.; Контроль качества химиотерапевтических препаратов. - 1987. - С7 48-53.

4. Некоторые аспекты получения и контроля сывороток крови животных/В.Г. Ночевиый, Я.И. Игудни, H.A. Башашкина и др.//Нат. Всесоюзн. научи, конф.': "Актуальные вопросы биотехнологий (январь 1987), г. Ленинград. - 1987. - С. 129-130.

5. Способ получения трипсина/В.Г. Ночевиый. Д.*. Осидзе, А.Я. Гуславский, H.A. Башашкииа, А.Г. Почтаренко, Г.В. Диваро-ва, Ю.П. Чернецкий, Е.Э. Школьников, В.И. Качалов//Авторское свидетельство Н 1628256. - от 15.10.1990.

Печатный цех ШИИВСГЭ, 1994, Москва 123022, Звенигородское ш. 5, тираж BÖ экз., эак. 2312/10