Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение влияния состава питательных сред и условий культивирования на биологическую активность продуцента лепидоцида

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение влияния состава питательных сред и условий культивирования на биологическую активность продуцента лепидоцида"

I ;

V >

ВСЕСОЮЗНА НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОЕКТНО-КОНСТРУКТОРСКИЙ ИНСТИТУТ

прикладной биохимии

На правах рукописи

ЛАВИИОВА ВИКТОЙШ ВИКТОРОВНА

УДК: 663.18:632.934.1 (043.3)

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПРОДУЦЕНТА ЛЕПИДОЦИДА

Специальность 03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена во Всесоюзном научно-ксследоватеяь-скоы проектно-конструкторскои институте прикладной био-хишш и в Московском технологическом институте пищевой промнвиенности.

Научные руководители: - доктор технических наук, профессор,

член-кор. МИА В.М.Кантере;

кандидат биологических наук Т.К.Крашешшникова.

0$ащяалыше оппонента: доктор технических наук

С.Е.Строгов;

кандидат биологических наук А.Г.Кольчевский.

Ведущая организация: Всесоюзный научно-исследовательский

институт прикладной микробиологии.

Защита диссертации состоится " 16 " юаня 1992 г. в 11^ часов на заседании Специализированного Совета Д 098. 09. 01 во Всесоюзном научно-исследовагельскш проектно-конструкторскш институте прикладной биолмии по адресу: 125299, г.Москва, ул. Клары Цеткин, д. 4/6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского проекгно-конструктор-ского института прикладной биохимии.

Автореферат разослан " ■и» ууъсхлх 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат йиодогических наук

И.И.Гусева

__- I -

••"г''1:! ; •.

{ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В решении таких важнейших государственных задач," как увеличение производства сельскохозяйственной продукции и ^пбвыйГб^е продуктивности лесного хозяйства, значительное место занимает использование аффективных методов защиты сельскохозяйственных культур и леса от вредителей. При втом наиболее перспективным считается акологический подход, предусматривающий рациональное сочетание современных занятных приемов и биометода. В последнее время все шире применяют микробиологические средства защиты растений, главным образом бактериальные препараты на основе кристалло-образующих бактерий ВасШиа гьиг!пваепз1з . Во многом не уступая по своей гффективносги химическим инсектицидам, они обладают таким существенным преимуществом как безвредность для человека, теплокровных животных, полезной фауны и флоры.

Однако потребности сельского и лесного хозяйства налтй страны з бактериальных СЗР еще далеко не удовлетворены. И в настоящее время объективной необходимостью является увеличение их выпуска и снижение себестоимости за счет внедрения более совершенной технологии. К перспективным направлениям интенсификации технологии получения бактериальных инсектицидов относится совершенствование процесса культивирования. Это требует решения таких вопросов, как выбор оптимальных условий культивирования, изучение питательных потребностей микроорганизмов и создание сбалансированных по компонентам субстрата в соответствии с потребностями микроорганизмов питательных сред.

Обычно основной задачей многих исследований с целью интенсификации производства бактериальных инсектицидов являлась разработка сред и условий культивирования продуцента, способствующих уве' личению концентрации жизнеспособных спор. Но, как показали исследования последних лет, для достоверного суждения о влиянии указанных факторов на качество энтомопатогенных препаратов необходимо учитывать прежде всего биологическую активность, так как основным действующим началом бактериальных препаратов на основе ВасШиа №ихДлахепа!а являются белковые кристаллы, специфичность и сила действия которых молгат меняться при изменении условий культивирования, не всегда коррелируя при этом с изменениями продуктивности культуры по спорам.

Поэтому определение путей интенсификации процесса хультивиро-вания одного из основных отечественных бактериальных инсектицидных

препаратов, лепидоцида на основе исследований влияния условий культивирования и состава питательных сред на биологическую активность является весьма 'актуальным.

Цель работы. Целью настоящей работы являлось изучение влияния состава питательных сред-и условий культивирования на биологическую активность Вас. «тгАа£1епв1в вар. кли^а.кх шт. z -52. В соответствии с целью решались следующие задачи: сравнить между собой рекомендованные для производства СЗР питательные среды по их влиянию на основной показатель качества инсектицидных препаратов - биологическую активность;

изучить-влияние различных источников углеродного и азотного питания на развитие и биологическую активность шт.а -52;

определить влияние уровня аэрации питательных сред на сингеа антоыоцидных кристаллов и их биологическую активность;

провести оптимизацию условий аэрации для разных фаз роста шт.г -52.

Научная новизна. Установлено, что биологическая активность , продуцента лелидоцида коррелирует с продуктивностью культуры по спорам и количеству белка кристаллов только при определенных ус» ловиях культивирования и составе питательной среды. Показано, что в зависимости от состава питательной среды изменяется качествен» ный и количественный состав белков кристаллов данного продуцента. Установлено, что вид источника углеродного питания, его содержание и соотношение е источником азотного питания влияют на биологическую активность культуры в большей степени, чеы на ее продуктивность.

Изучено влияние уровня аэрации на биологическую активность шт. а-52 при культивировании на разных питательных средах. Уста«» новлено, что в зависимости от состава питательной среды характер изменения биологической активности при изменении уровня аэрации разный. Показано, что для дрожкеполисахарвдной питательной среды условия аэрации, обеспечивающие достижение высокой инсектицидной активности культуральной жидкости, находятся в интервале значений объемного коэффициента кассопередачи по кислороду (К^а) от 630 до 210 ч"1. Для ацетатной питательной среды условия аерации, позволь ациа получать яультуральную амдкость с высокой инсёйтицвдноЙ ок» тивностью, находятся в более пирокоП области нзиенгтт К^а ~ о? -630 до 60 ч-1, при'мои высокая инсектицидная активность отивчает* ся при уровнях аэрации (в интервала значений К^а 1£6»60 ч"*),

вызывающих значительное замедление развития культуры.

Установлено, что степень изменения величины инсектицидной активности шт.ъ -52 при изменении состава питательной среды или условий культивирования меняется в зависимости от используемого тест-объекта.

Показано, что оптимизацию условий культивирования и состава питательной среды необходимо проводить по инсектицидной активности, определять которую следует по отношению к разным тест-насекомым.

С использованием интегральной квазидинамической модели определены оптимальные профили управления процессом культивирования по К^а при выращивании шт.а -52 на дрожжеполисахаридной и ацетатной питательных средах, позволяющие снизить энергоемкость процесса при сохранении инсектицидиой активности и продуктивности культуры на высоком уровне.

Практическая ценность. Реализация полученных результатов оптимизации условий культивирования и состава питательной среды по инсектицидной-активности позволит получать препарат высокого качества при более экономичном ведении процесса; Результаты проведенных исследований могут быть использованы в качестве технологических рекомендаций при совершенствовании промышленного регламента получения препарата и при выборе основных критериев стандартизации препарата, а также в дальнейшей работе по совершенствованию условий культивирования и созданию питательных сред для промышленного производства СЗР с целью достижения высокой инсектицидной активности.

, Апробация работы. Результаты исследований были доложены на заседании кафедры "Биотехнология и экологическая безопасность производства" МТИШ1 (ноябрь 1991 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, заключения, выводов й списка использованной литературы.

Работа изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит 26 рисунков и 12 таблиц. Список использованной литературы включает 254 наименования, в том числе 128 иностранных работ.

■ . МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом Исследования являлась культура энтомопатогенных бактерий Bacillua thuringiensia asp. kurstaki ¡HT.Z-52.

В работе были использованы производственные питательные среды, состав которых представлен в табл. I.

Таблица I

Состав используемых питательных сред

* среды Компоненты среды , %

!Н.уку-!иое-БВК !руз. !вая (мука (мука !Ацетатмела~1 *! . . ! j Ca J оса (ЩГХШ .^HjHP^aCI !К25 04СаС12!

1 2,5 2,5 - tm - «• м

2 2,25 0,5 2,0 т mm tm тл «• ••

3 2,8 0,5 0,8 1,5 0,2 0,1 0,1

4 2,8 2,0 0,8 - 0,2 0,1 0,1 0,25

5 2,8 1,4 - я» 1,0 3,0 Шф 0,3

#) ЩГХШ - щелочной гидролизат хлопкового шрота

Культуру выращивали в колбах вместимостью 250 мл на качалках фирмы " Hew Brunswick " (США), а такие в лабораторных ферментерах объемом 16 л фирмы цщ " £iotec " (Швеция) при температуре (29+1)°С. Величина pH в начале культивирования составляла 6,8-7,2. Скорость вращения роторов качалок, объем ааполнения колб средой и скорость вращения мешалок ферментеров изменяли в соответствии с выбранным массообменным режимом.

Питательные среды засевали посевным материалом, предварительно прогретым при температуре (80+1)°С в течение 15 минут, в количестве .1,0 % от объема среды в колбе.

В ходе исследований определяли:

концентрацию вегетативных клеток, спор, параспоральных кристаллов (билирамидальной и кубоидшй формы) - методом Вииоградского (Егоров, 1976);

концентрацию жизнеспособных спор - методом Пастера-Коха (Егоров, 1976);

морфологическое состояние культур - методом светлопольной микроскопии (Егоров, 1976);

■ форму и размеры ©нтомоцидных кристаллов » методой сканирующей микроскопии ( lintoa, 1990);

. инсектицидную активность, (I/JIK^q) - методом определения среднелетальной концентрации образца Ш%0) для гусениц непарного шелкопряда И возраста, гусениц американской белой бабочки Ш воз» рг£та и гусениц совки-гамыа II возраста (Эдельман, ХЭТ4); /

концентрацию белка кристаллов - спектрофотометрическим методом (Егоров и др.,1990);

антибактериальную активность растворов кристаллов - методом диффузии в агаре (Юдина и др., 1988);

белковый состав энтомоцидных кристаллов - методом электрофон pesa в градиентном полиаяриламидном геле (MahadiXet al, 1976); рН - потенциометрическим методом (Петрухин, 1987); аыинный азот - методом формольного титрования Зеренсена в модификации Виноградовой (Белозерский и др., 1951);

объемный коэффициент массопередачи по кислороду (К^а) -сульфитным методом (Чудинова, 1980).

Статистическую обработку полученных экспериментальных данных осуществляли по методу Стыэдента, при уровне значимости 0,95 (Грачев, 1979). Оптимизацию условий аэрации в процессе культиви» рования проводили с использованием интегральной кваэидинамической модели (Ириков и др., 1985).

РЕЗУЛЬТАТУ МСОЩОВАНИЯ

Влияние состава питательных сред на развитие и биологическую активность продуцента лепидоцида.

Анализ литературных данных показал, что основной показатель качества бактериальных энтомолатогенньгх препаратов - инсектицидная активность - во многом зависит от состава используемой для их получения питательной среды.

С целью изучения влияния состава питательных сред на развитие и биологическую активность шт. z-52 прежде всего был проведен сравнительный анализ рекомендованных для промышленного производства бактериальных СЭР питательных сред.

Культивирование осуществляли на производственных питательных средах, состав которых представлен в табл.1. Культуру выращивали в колбах на качалке в условиях аэрации, обеспечивающих высокое значение объемного коэффициента массопередачи по кислороду К^а = 420 ч""* с тем, чтобы исклочить возможность лимитации роста бактерий по кислороду. При этом температура и начальные значения рН питательных сред находились на уровне регламентных значений, определенных как оптимальные для данного продуцента: температура • (29+1)°С; рН - 6,8-7,2.

Результаты определения концентрации жизнеспособных спор в получаемой на указанных питательных средах культуральной жидкости

показали (Рис.1), что значения данного показателя были близки для дрожжеполисахаридной питательной среды (ДПС; среда» I) и сред, содержащих ацетат кальция (среды № 2 и № 3), а для среды с соевой ыукойСсреда № 4) и для поликомпонентной питательной среды (ПКС; среда # 5) - были выше по сравнении с ДОС на 20 и 40 %, соответственно.

Г, ч

30

20

10 О

С, И)9

СП ./ыл

7

6 : / /

9 / *

4 / / ■н ■а

2 / / ✓ / / X к X X к ' / / / А X х X X

✓ / / * к к / / - X ? >

,ИА,

1/%к.к.

30

20

10

питательная среда, №

Рис. I. Основные показатели развития шт.2 -52 на питательных средах регламентного состава

0 - длительность роста (Т); □ - концентрация спор (С); ЁЗ - инсектицидная активность по отношению к гусеницам непарного шелкопряда (ИА).

Продолжительность развития культуры на средах, "не содержащих ацетат кальция, составляла в среднем £5-27 часов, на питательных средах с ацетатом кальция время роста увеличивалось на 7-8 часов.

Биологическую активность культурадьной жидкости определяли не только по отношению к тест-насекомым (гусеницам непарного шелкопряда), но и по отношению к микроорганизмам ( Шсгососсив £1атгив ), так как между инсектицидной и антибактериальной активностями растворов параспоральных кристаллов установлена корреляция (Юдина н др., 1988). Действие сГ-ендотоксинов на микроорганизмы менее специфично и отражает общий потенциал биологической активности с^-эндотоксинов без учета дополнительных факторов вирулентности. Проведенные биоиспытания на гусеницах непарного шелкопряда показали, что значения инсектицидной активности для всех указанных сред находились на одном уровне. Количество синтезиро-

ванного белка кристаллов на ДПС (среда № I) и ацетатной среде (АС; среда № 2) было, практически одинаковым, на среде с соевой мукой и ацетатом кальция (среда ?? 3) - на 20 ^ ниже, а на среде с соевой мукой (среда № 4) и на ПКС (среда № 5) - на 20 % выше, чем на ДПС. Антибактериальная активность растворов параспоральных кристаллов (относит.ед/мл), учитывающая антибактериальное действие количества белка кристаллов, содержащегося в I мл образца, для АС была на 15 % выше по сравнению с ДПС, для среды, содержащей соевую муку и ацетат кальция - на 15 % ниже, чем для ДПС, а для остальных питательных сред - такая же как и для ДПС.

Микроскопические наблюдения позволили установить, что наиболее однородной по морфологическому составу к концу процесса культивирования была культура*, получаемая на питательных средах, содержащих ацетат кальция.

При сравнительной оценке разных питательных сред в качестве основного критерия рассматривалась инсектицидная активность культуральной жидкости, определенная как величина обратная летальной концентрации культуральной жидкости, вызывающей 50 %-нуп гибель тест-насекомых (ЛК^д) и выраженной в процентах разведения культуральной жидкости. Анализ результатов определения инсектицидной активности культуральной жидкости, полученной при культивировании шт.г -52 на основных питательных средах, рекомендованных для промышленного производства, показывает, что значения этого показателя для указанных питательных сред находятся на одном уровне, даже несмотря на различия в величинах концентраций спор и количества белка кристаллов. Это свидетельствует об отсутствии корреляции между продуктивностью культуры по спорам и количеству белка кристаллов и инсектицидной активностью при выращивании шт.Ъ -52 на рассмотренных питательных средах в описанных условиях культивирования, а также о том, что использование более сложных и более богатых питательных сред, таких, как. среда с соевой мукой или ПКС, хотя и приводит к увеличению продуктивности данного продуцента, но "не способствует повышению инсектицидной активности.

В связи с тем, что многие исследователи отмечали перспективность использования в составе питательных сред для производства бактериальных СЭР различных гидролизатов, особенно белок-содержа-щего сырья, было проведено изучение влияния кислотного гидролизата и автолизата кормовых дрожжей БВК в составе питательных сред на биологическую активность шт.г За основу была взята среда ДПС

регламентного состава, содержащая 2,5 $5-кормовых дрожжей БВК и 2,5 % кукурузной муки, в составе которой была осуществлена 50 замена кормовых дрожжей БВК на их кислотный гидрсшизат,

а также полная замена кордовых дрожжей БВК на их кислотный, гидро-лизат и автолизат.

Эксперименты по выращиванию шт. я -52 на этих питательных средах показали, что. развитие культуры до накопления в культуральной ид кости .8.0-90 % свободных спор й энтшоцвдных кристаллов проходило в среднем за 25-26 часов, то есть за то же время, что и на ДПС (Рис.2). По морфологическому составу культура, полученная на данных питательных средах, была к концу культивирования достаточно однородной, за исключением питательной среды, содержащей автшшзат корловых дрожжей ЕВК (среда Л 8) , на которой концентрация вегетативных клеток к концу процесса достигала 20 %.

среда, &

' Рис. 2. Основные показатели развития шт. г-52 на

питательных средах с различными источниками азотного питания

0- длительность роста (Т); О - концентрация спор (С); инсектицидная активность по отношению к гусеницам непарного шелкопряда (ИЛ)

. Для питательной среды, в составе которой была осуществлена 50 ^-ная замена кормовых дрожжей БВК на их кислотный гвдролизат Середа № 6), продуктивность культуры по спорал и инсектицидная

активность находились на уровне соответствующих показателей, определенных для ДПС, а количество белка кристаллов и антибактериальная активность были выше, чем для ДПС, на 20 и 16 %, соответственно. Полная замена кормовых дрожжей БВК кислотным гидролизатом (среда № 7) привела к снижении по сравнению с ДПС продуктивности культуры по спорам и кристаллам в среднем - на 25 %, антибактериальной активности - на 20 %, а инсектицидной активности - на 35 %.

На питательной среде, содержащей автолизат кормовых дрожжей БВК (среда № 8), конечная концентрация спор была ниже, чем на ДПС, в 2,4 paзai количество белка кристаллов уменьшилось в 2,0 раза, а инсектицидная и антибактериальная активности снизились в 2,6 раза по сравнению с ДПС.

Таким образом, полученные результаты показали, что полная замена кормовых дрожжей БВК в составе ДПС автолизатом или кислотным гидролизатом кормовых дрожжей БВК приводит к снижению биологической активности и ухудшению других показателей развития культуры, а 50 %-нел замена кормовых дрожжей БВК на их кислотный гидролизат не оказывает существенного влияния на изменение этих показателей по сравнению с ДПС.

Основным источником углеродного питания в среде ДПС является кукурузная мука. В данной работе проводили изучение блияния на развитие шт. г-52 питательных сред, содержащих вместо кукурузной муки в качестве источника углеродного питания картофельный крахмал ИЛИ глюкозу. Исходя из того, что кукурузная мука содержит 60-75 % крахмала были взяты среды, содержащие 1,5 и 1,8 % крахмала (среды » 10 и * II), а также использовали питательную среду, содержащую 1,0 % крахмала (среда № 9). В средах с глюкозой (среды * 12-14) глюкозу брали в концентрациях 0,5-1,0 %> '

Проведенные исследования показали (Рис.3), что продолжительность культивирования на средах с глюкозой, как и на ДПС, составляла в среднем 25-26 часов. Быстрее всего развитие культуры прохо» дило на питательных средах, содержащих крахмал, особенно на среде, содержащей 1,0 % крахмала,- продолжительность культивирования на которой составляла 23 часа. На среде, содержащей 1,0 % крахмала, а также на питательных средах с глюкозой, культура была наиболее однородной по морфологическому составу и к концу процесса культивирования концентрация вегетативных клеток не превышала 1-2 %.

Использование питательных сред, содержащих 1,5 и 1,8 % крахмала (среды >10 и № II), не оказало существенного-влияния на • продуктивность культуры по спорам и инсектицидную активность по

- ю -

сравнению с-регламентной ДПС, тогда как уменьшение концентрации крахмала до 1,0% на фоне 2,5 % кормовых дрожжей БВК (среда № 9) способствовало увеличению биологической активности, причем в большей степени, чем повышению продуктивности культуры по спорам и белку кристаллов. На питательной среде, содержащей 1,0 % крахмала, по сравнению с ДПС продуктивность культуры была выше в среднем в 1,3 раза, а.биологическая активность, определенная по отношению к тест-насекомым и микроорганизмам, - выше в среднем в 2 раза.

Рис. 3. Основные показатели развития шт.2 -52 на

питательных средах с различными источниками углеродного питания : ' " ,

0 ~ длительность роста (Т); О - концентрация спор {С); - инсектицидная ак- 1 ■гивность'по отношению к гусеницам непарного -шелкопряда (ИА)

, При использовании в качестве источника углеродного питания глюкозы в концентрациях 0,7 и 1,0 % (среды № 13 и № 14) продуктивность культуры по спорам находилась на уровне величины этого показателя, определенной для ДПС, а уменьшение концентрации глюкозы до 0,5 % (среда ф 12} привело к снижению конечной концентрации спо^ в среднем.на. 20 .%. Проведенные биоиспытания показали, что инсектицидная активность культуры, выращенной на среде, содержащей .0,7 % глюкозы, находилась на одном уровне с соответствующей величиной, определенной для ДПС. Повышение концентрации глюкозы до 1,0 % вызвало снижение количества белка кристаллов на 20 % по сравнению с ДПС, инсектицидная и антибактериальная активности также уменьшилисл

- и -

на 40 и 25 %, соответственно. Известно, что уровень имеющихся в среде углеводов, главным образом глюкозы, является одним из наиболее важных факторов спорообразования, так как многие ферменты стадии спорообразования находятся под глюкозо-катаболитной репрессией. Биосинтез различных вторичных метаболитов, к которым относятся и еГ-эндотоксины, может также подчиняться углерод-катаболит-ной репрессии. По-видимому, глюкоза в концентрации 1,0 % репрессировала синтез (^-эндотоксинов, не ослабляя при этом роста бактерий и спорообразования.

ТакиМ' образом, полученные результаты показали, что на синтез токсичных белков кристаллов шт.г -52 значительное влияние оказывает вид источника углеродного питания, его концентрация. По-видимому, существенную роль играет также и соотношение источников углеродного и азотного питания.

С. целью изучения влияния соотношения источников азотного и углеродного питания В составе питательной среды были проведены эксперименты по культивированию шт.2 -52 на дрожжеполисахаридных питательных средах с различным содержанием кормовых дрожжей БВК и кукурузной муки, в интервале концентраций от I до 3 %, Результаты экспериментов, приведенные на рис.4, показывают, что для большинства из рассмотренных вариантов питательных сред конечные концентрации спор находились на одном уровне, за исключением сред, содержащих 1,0 % кормовых дрожжей БВК на фоне 1,0 или 2,0 % кукурузной муки, где эта величина была ниже в среднем на 20 %. С увеличением содержания кормовых дрожжей БВК и кукурузной муки в питательной среде возрастала длительность цикла развития, а также гетерогенность культуры по морфологическому составу к концу процесса.

Использование вариантов питательных сред с соотношением кормовые дрожжи БВК : кукурузная мука, составляющим 1,0:(1,5-3,0), вызывало снижение инсектицидной активности, несмотря на высокую продуктивность культуры по спорам.. Таким образом, результаты биоиспытаний показали, что оптимальным соотношением компонентов ДПС, позволяющим получать культуральную жидкость с высокой инсектицидной активностью , является соотношение кормовые дрожжи БВК : кукурузная мука - (1,0-3,0):1,0.

Отсутствие корреляции между изменениями инсектицидной активности культуры и ее продуктивности по количеству белка кристаллов при росте на разных питательных средах, отмеченное в ряде случаев, могло быть результатом качественных и количественных изменений в

Т.ч

30 20

10 о

Т,ч

30 20 10 О

Ю О

сдоу сп./мл-

6 4 2

1/%к.ж.

30 20 10

2,5:2,5

Сбвк:Скм

9

С, 10' сп./мл

рЬ

/

/ /

/

Яг,

ХЧ 8

Я / -|

/

/ /

/

I

,ИА. 1/^к.ж.

30 20 10

1:2 2:2 3:2 2,5:2,5

Сбвк:Скм

п тп9 V» , 0.Ц

сп./мл

2,5:2,5

Кэ ДО сп./г

2 I

Кэ,

СП 2

I

Кэ ДО ./г

Сбвк:Скм

Рис. 4. Влияние соотношения источников азотного и

углеродного питания в ДОС на основные - ■

показатели развития шт. 2-52

И - длительность роста (Г); О - концентрация спор (С); 0 - инсектицидная ак- ; тивность по отношению к гусеницам непарного

шелкопряда (ИА: О - коэффициент потребления субстрата (Кэ;■отношение концентрации спор к сумме концентраций компонентов^ДПС)

составе белков кристаллов. В связи с этим был изучен белковый состав внтомоцидных кристаллов, полученных на равных питательных средах, с помоиц>ю электрофореза щ градиентной полиакриламидноа геле.

На рис.5 представлены денситограммы белковых фракций энтомо-цидных кристаллов, синтезированных на ДПС (среда № I), на среде, содержащей 1,0 % крахмала и 2,5 % кормойых дрожжей БВК (среда J> 9) и на среде, содержащей 1,0 % глюкозы и 2,5 % кормовых дрожжей БВК (среда № 14). Из рис.5 видно, что в белковом составе кристаллов, образованных на этих средах, имеются различия. Так, например, на среде ДПС не был выявлен белок с молекулярной массой 87 кД. Соотношение белков с различной молекулярной массой для указанных сред было разным (рис.5). Результаты электрофореза, полученные для других сред, танжб показали, что изменение состава питательных сред оказывает влияние на качественный к количественный состав белков

сГ-эндотоксинов шт.2 -52. При атом на большинстве исследуемых питательных сред оснойную часть от общего количества белка составляли белки с молекулярными массами 140, 120, 89 и 68 кД, а среди этих белков наибольшая доля приходилась на белок с молекулярной нассой 68 кД. :

В)

а

А

Лл0

Рис. 5. Денситограшды белковых фракций энтомоцидных кристаллов, полученных при культивировании шт. а -52 на: 'а) - ДПС; б) - среде, содержащей 1,0 % крахмала} в) - среде, содержащей 1,0 % глюкозы.

Цифрами обозначены пики, соответствующие белкам с молекулярной массой.:

I 140 кД; 2 - 120 кД; 3 - 107 }<Ц; 4 - 89 кД; 5 - В7 дД; 6 - 68 ЗД; 7 - 57 кД; 8 - 44 кД; 9 - 34 кД; 10 - 25 1Д; II - 22 кД; 12 -15 кД..

- и -

Косвенным подтверждением изменений, происходящих в составе белков сГ-эндотоксиков при выращивании шт. г -52 на разных питательных средах, могут быть "такке различия в результатах биоиспн-таний на разных- тес г-объектах: гусеницах непарного шелкопряда и американской бедой'бабочки. • Проведенные эксперименты показали, что характер изменения величины инсектицидной активности на испытанных вариантах питательных сред близок для разных тест-объектов. Однако, степень'изменения вашчшш этого показателя.меняется в зависимости от используемого тест-объекта (рис.6 ). Поэтому, при оценке качества бактериальных инсектицвдов, получадаых при выращивании культуры на разных питательных средах, необходимо проводить определение инсектицидной активности по отношению к нескольким тест-насекомым с тем, чтобы более достоверно оценить качество препарата.

1 2 3 4 5 6 7 14

Питательная среда, &

Рис. 6. Степень'измвнения инсектицидной активности культуры, выращенной на разных питательных средах

Контроль ~ среда & 4; п - порядковый номер питательной среды

В- гусеницы непарного шелкопряда; - гусеницы американской белой бабочки.

Влияние уровня аэрации питательных сред на развитие и биологическую активность продуцента лепидоцида ;

Реализация потенциальных возможностей культуры но биологачес кой активности, -при внращшвании на той или иной, питательной сред зависит от обеспечения.оптимальных условий культивирования, в чэ кости от условий аэрации питательной среды. В-данной работе было

изучено влияние уровня аэрации на биологическую активность и другие показатели развития ига.% -52 при культивировании на дрожже-полисахаридной и ацетатной питательных средах.

Культивирование осуществляли в колбах на качалке при разных объемах заполнения колб и оборотах вращения ротора качалки, что обеспечивало изменение объемного коэффициента массопередачи по кислороду от 630 до-30 ч"*^ при оценке сульфитным методом.

Анализ полученных данных показывает (рис.8-9), что в зависимости от состава питательных сред уровень'аэрации по-разному влияет на биологическую активность. .

В условиях роста на ДПС (рис.7-8) при снижений уровня аэрации среды с 630 до 210 продолжительность культивирования шт.2 -52 увеличивалась в среднем на 4 часа, концентрация спор и инсектицидная активность изменялись незначительно, антибактериальная активность уменьшалась в 1,3 раза. Снижение же уровня аэрации до 126 ч""* приводило к увеличению длительности цикла развития культуры в. 1,8 раза (на 22 часа) по сравнению с уровнем аэрации 630 при этом концентрация спор, уменьшалась в 2 раза, антибактериальная активность снижалась в 1,7 раза, инсектицидная активность по отношению к гусеницам непарного шелкопряда снижалась в 3,3 раза, а по отношению к гусеницам, американской белой бабочкй - в 2 раза. Ухудшалось и морфологическое состояние культуры. Количество синтезированного белка кристаллов в-исследуемом интервале значений К^а изменялось, незначительно.

' Иные закономерности влияния уровня- аэрации на основные показатели , развития шт. а -52 наблюдал я с ьпри' культивировании: на. ацетатной питательной среде, При- снижении уровня аэрации ацетатной среды от 630 до 210 ч-* концентрация жизнеспособных спор уменьшалась в среднем на 20 %, а при дальнейшем снижения уровня аэрации до 126 ч""* - уменьшалась на 45 %■ по сравнений с уровнем аэрации 630 ч~*(рис.7). С уменьшением уровня аэрации возрастала гетерогенность культуры по морфологическому составу. Длительность цикла развития увеличивалась при снижении уровня аэрации до 210 ч"^ в среднем на 5 часов, а при снижении до ,126 - на 14 часов (в 1,4 раза) по сравнению с исходным уровнем (630 ч"*^) (рис.7).

Однако, снижение уровня аэрации до 126 ч"** не приводило к уменьшению инсектииддной активности, а наоборот способствовало ее увеличению по отношению к гусеницам непарного шелкопряда в среднем в 1,8 раза, к гусеницам американской*белой бабочки- в 2 раза, а по отношению к гусеницам совки-гамма - в 2,9 раза (рис',9).

100 200 300 400 500

600 . Kja.4'1

Рис. 7. Влияние уровня аэрации на концентрацию спор и

длительность цикла развития nrr.z -52 на ДПС и АС

ДПС: X - концантрация спор: 2 •• длительность роста; АС: 3 - концентрация/спор; 4 - длительность poeta.

itó'*" X/ /ОЛ» Аф

20 10

О

ИА в.б.б.,

3 2 I

АА,

С <5»К. , . МЛ МГ/МЛ

IS

10 5

100 200 300 400 500 600 к^а.ч-1

Рис. 8. Влияние уровня аэрации на биологическую активное^ и количество белка кристаллов при культивировании пт.% -52 на ДПС

I, 2 - инсектицидная активность по отношению к

гусеницам непарного шелкопряда (I) и американской белой бабочки (2); 3- количество белка кристаллов; . 4 - антибактериальная активность.

АА, отн. ед. мл

Кьй,Ч

Рис. 9. Влияние уровня аэрации на биологическую активность и количество белка кристаллов при культивировании шт.2 -52 на АС

I, 2, 3 - инсектицидная активность по отношению к гусеницам неоарного шелкопряда (I), американской белой бабочки (2) и совки-гамма (3);

4 - количество белка кристаллов;

5 - антйбактёриальная активность.

Количество белка кристаллов в интервале значений К^а 630-126) ч"1 изменялось незначительно. Антибактериальная актив- ' ость при уменьшении Кьа от 630 до 210 ч"*^ увеличивалась на 39 %, . при уменьшении до 126 - была на 14 % ниже, чем при ^а * 630 ч"^ (рис.9),"'

Изучение развития культуры при значениях'К^а, меньших 126 оказало, что при уменьшении К^а до 60 Продуктивность культур о спорам снижалась в 2,8 раза, а длительность'цикла развития величивалась в 1,9 раза по сравнению с уровнен аэрации 630 ри этом количество белка .кристаллов и антибактериальная актив-ость уменьшались в значительно меньшей степени (в 1,3 раза), а нсектицидная активность, определенная по отношению к гусеницам епарного шелкопряда, снижалась по сравнению с таковой для уровней эрации среды 210 и 126 ч"*, однако, оставалась на уровне значений( слученных при максимальной аэрации ацетатной среды в данном

исперименте - 630 ч'

-I

Подсчет количества кристаллов бипирамидальной и кубоидной формы по методу Виноградского показал, что при уровнях аэрации 630210 ч"* общее количество кристаллов (бипирамидальных и кубоидных), приходящихся на одну спору, составляло 2,0-2,3 кристалла, а при уровнях аэрации 126-60 ч - 1,5 кристалла. При этом отношение кристаллов кубоидной формы к б ¡«пирамидальным для всех рассмотрен-' ных уровней аэрации находилось в пределах 0,8-0,9.

Дальнейшее снижение уровня аэрации ацетатной среды до 30 ч*"* приводило к уменьшению концентрации образующихся спор в 8 раз по сравнению с уровней аэрации 630 ч"*, при этом значительно возрастала гетерогенность культуры по морфологическому составу, инсектицидная активность по отношению к гусеницам непарного шелкопряда снижалась в 2,6 раза, а количество белка кристаллов и антибактериальная активность уменьшались в 1,6 и в 2 раза, соответственно.

Электронно-микроскопические исследования выявили, что снижение уровня аэрации способствует образованию кристаллов больших размеров, отмечалось появление крупных кристаллов, имеющих форму относительно плоских 'слабо скошенных параллелепипедов, при этом увеличивалось также и количество очень мелких кристаллов различной формы - бипирамидальной, кубоидной, овоидной. Таким образом, уменьшение аэрации ацетатной среды приводит к изменению соотношения синтезирующихся параспоральных. кристаллов разных размеров и формы. Изучение состава белкой кристаллов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле показало, что изменение уровня аэрации ацетатной среды не влияет на качественный состав белков по молекулярной массе, но отражается на их количественном соотношении. При снижении уровня аэрации до 126 увеличивалось содержание белка с молекулярной массой 68 кД.

Таким образом, проведенные исследования показали, что в зависимости от состава питательной среды характер изменения инсектицидной активности шт.Z -52 при изменении уровня аэрации среды разный. Для ДПС условия аэрации, обеспечивающие получение культу-ральной жидкости с высокой инсектицидной активностью, находятся в интервале значений íí^a - (63Ó-2I0) ч""^. Для ацетатной питательной среды условия аэрации, позволяющие получать культуральную жидкост с высокой инсектицидной активностью, находятся в более широкой области изменения К^а - (630-60) ч , при этом высокая инсектицид ная активность обмечается при уровнях аэрации (в интервале значений К^а 126-60 ч"**), вызывающих значительное замедление развития культуры.

Оптимизация условий аэрации в процессе культивирования шт. 2-52

Как показали проведенные исследования, условия аэрации оказывают существенное влияние на синтез ¿Г-эндотоксинов. Однако выбор оптимальных условий аэрации необходимо осуществлять с учетом всех фаз роста Bacillus thuringiensla , так как потребности этих микроорганизмов в кислороде могут быть неодинаковы на разных стадиях развития. В данной работе проводили определение оптимальных профилей изменения It^a при выращивании шт. Z-52 на дрожжеполисахаридной и ацетатной питательных средах. При определении оптимальных профилей аэрации воспользовались методом построения интегральной квазидинамической модели процесса культивирования. Такой подход позволил учесть влияние изменения величины Кта в течение процесса на основной конечный показатель - инсектицидную активность и достичь этого за минимальное количество опытов.

В ходе экспериментов были идентифицированы квазидинамическиа модели вида: 7*.

y«Z+AjB(r) V(r)äv

1 0

где J - значение выходного параметра процесса, определенное по

окончании культивирования с произвольным режимом изменения КLa

Jo - значение соответствующего параметра при культивировании с исходным профилем Но ;

Л - размер окрестности идентификации модели;

В(т) - функция чувствительности процесса культивирования к условиям аэрации по соответсвующему параметру;

Т1(т)- относительная вариация режима аэрации;

Tt Т - соответственно текущее время и продолжительность процесса культивирования.

В качестве выходного параметра процесса культивирования шт. 2-52 на ДПС, по которому проводилась оптимизация, были рассмотрены: летальная концентрация кульгуральной жидкости,'вызывающая 50 ^-нуго гибель гусениц непарного шелкопрйда (JIK^q); концентрация жизнеспособных спор; количество белка кристаллов; антибактериальная активность.

На первом этапе были поставлены эксперименты с заранее рассчитанными тестовыми профилями изменения К^а. Тестовые опыты проводили одновременно на двух качалках при температуре (29+1)°С и скоростях вращения роторов качалок, обеспечивающих поддержание верхнего

(420 ч"1) и нижнего (120 значений диапазона изменения К^а. На основании проведенных экспериментов вычисляли В (тг) , 30 . Для полученных параметров квазидинамических моделей процесса культивирования шт.Ъ -52 на ДПС рассчитывались оптимизационные профили культивирования с использованием градиентного метода.

Оптимизационные профили аэрации ДПС, полученные на основе таких критериев оптимальности, как величина ЛК^, концентрация спор, количество белка кристаллов и антибактериальная активность, по своему основному характеру были близки мевду собой (рис.Юа). В результате проведенных исследований было установлено, что при развитии шт.ъ ^52 на ДПС фазами, требующими более высоких уровней аэрации, являются фаза замедления роста и перехода к образованию спор и кристаллов, а также фаза образования спор и кристаллов. Полученный вывод подтвердили и данные микроскопических наблюдения проводившихся во время тестовых опытов.

а) ДПС б) АС

К^а.ч -I

г -----1

г 1 __-1 1 1

1 1 1 Л 1 <----2 I

18 27

36 Г,ч

Рис. 10. Оптимизационные профили аэрации ДПС (а) и АС (б), рассчитанные на основе разных критериев оптимальности:

I - ЛКсп; 2 - концентрация спор; 3 - количество белка кристаллов; 4 - антибактериальная активность

С рассчитанными по величине ЛКдд профилями изменения К^а бы, проведено опытное культивирование. В качестве контроля рассыагри

али режим аэрации с постоянным высоким значением К^а = 420 ч . роведенные эксперименты показали, что значения основных контро-ируемых параметров, определенные для профильного процесса и для энтрольного режима аэрации были близки (табл.2).

Таблица 2

Результаты проверки эффективности профильного процесса культивирования шт.% -52

¡Пита- ¡Концентрация

спор,

{тельная! пыта 'ппрпп ' ч

¡среда IЮ спор/мл

__1 I_

Количество¡Антибакте-!

белка {риальная 2 кристаллов{активность! мг/мл " {отн.ед./мл{

рофиль колбы)

ДПС

энтроль ДПС колбы) т ьа =420 ч"1

5,06+0,30 0,064+0,001 8,0+0,3 30,1+0,8 4,20+0,20 0,066+0,012 7,4+0,13 -27,5+0,5

рофиль рерментер)

ДПС

знтроль ДПС

ГаР'Д2Н5е^

3,85+0,18 0,056+0,013 4,07+0,15 0,051+0,010

рофиль АС колбы)

онтроль АС колбы) т 1а =420 ч*™

4,60+0,20 0,02%0,012 4,35+0,15 0,032+0,007

Результаты проверки эффективности проведения процесса по про-илю при культивировании продуцента лепидоцида на ДПС в лаборатор-ах ферментерах представлены в табл.2. Величину К^а в эксперимен-ах изменяли варьированием скорости вращения мешалки. Использование рофильного процесса позволило получить культуральнуи жидкость, нсектицидная активность и концентрация спор которой находились на ровне величин данных показателей, определенных для режима культи-ирования при постоянном высоком значении К^а = 420 при'этом нижалась энергоемкость процесса.

При определении оптимального профиля изменения К^а в процессе ультивирования шт.2 -52 на ацетатной питательной среде в качестве ритерия оптимальности рассматривали величину ЛК50 и концентрацию изнеспособных спор.

Для идентификации квазидинамических моделей процесса культи-ирования шт.г -52 на ацетатной питательной среде была поставлена зрия тестовых опытов. Опыты с тестовыми профилями-проводили по эй те схеме и при тех же условиях, которые были использованы при

оптимизации условий аэрации ДПС. На основании полученных результатов вычисляли В (т) , и рассчитывали оптимизационные профили изменения К^а (рис.Юб). .

Проведенные исследования показали, что оптимизационные профили аэрации ацетатной среды и ДПС,4рассчитанные на основе разных критериев оптимальности (ЛК^, концентрация спор, количество белка криталлов, антибактериальная активность) имели одинаковый характер.

В табл.2 представлены результаты проверки эффективности профильного .процесса культивирования шт.г -52 на ацетатной питательной среде. Значения .Шэд и концентрации сПор,: определенные для профильного процесса культивирования, находились на уровне соответствующих значений, определенных для контрольного режима аэрации (К^а =420 ч"1). Однако, такой профиль изменения К^а ограничивал возможности повышения инсектицидной активности, выявление при определенном снижении уровня аэрации ацетатной среды. Но так как снижение аэрации до уровня; приводящего к повышению инсектицидной активности, вызывало значительное увеличение длительности роста культуры, то использование таких невысоких уровней аэрации является нецелесообразным. По-видимому, достижение более высокой инсектицидной активности возможно за счет'одновременной оптимизации в процессе культивирования наряду с условиями аэрации и других фак- . торов, таких как температура, рН.

Таким образом, в результате осуществленных исследований определены оптимальные профили управления процессом культивирования по К^а при выращивании продуцента лепидоцида на дрожжеполисаха-ридной и ацетатной питательных средах. Установлено, что на стадии замедления роста и перехода к образованию спор и кристаллов, а также на стадии образования спор и кристаллов, необходимы более высокие уровни аэрации^ чем на стадии экспоненциального роста и на стадии освобождения спор и кристаллов от клеточных оболочек. Использование профильного режима аэрации позволяет получать культуральную жидкость с высокой инсектицидной активностью за тот же период культивирования, что и при постоянном режиме с высоким уровнем аэрации, и при этом снизить энергоемкость процесса.

Выводы

I. Изучено влияние состава питательных сред на развитие и биологическую активность шт.,2-52. Установлено, что биологическая, активность продуцента лепидоцида существенным образом зависит от состава питательных сред, при этап ее изменение не всегда коррелирует с изменениям« продуктивной?« культуры г,о спора» и лоличвстау

белка кристаллов.

2. Исследовано влияние автолизата и кислотного гидролизата кормовых Дрожжей БВК в составе питательных сред на биологическую активность шт.г-52. Показано, что полная замена кормовых дрожжей БВК в составе дрожжеполисахаридной питательной среды автолизатом или кислотным гидролизатом кормовых дрожжей БВК приводит к.снижению биологической активности, а 50 %-ная замена кормовых дрожжей' ■ БВК на их кислотный гидролизаТ не оказывает существенного влияния■ на изменение биологической активности.4

3. Изучено влияние крахмала и глюкозы, содержащихся в питательных средах, на биологическую активность шт. Z -52. Установлено, что синтез энтомоцидных кристаллов; культуры зависит от- вида источника углеродного питания, его концентрации и соотношения источников 'углеродного и азотного питания. Показано, что, глюкоза в кощен» трации 1,0 % на фоне 2,5 %■ кормовых дрожжей БВК вызывает снижение биологической активности,, а использование питательной среды, содержащей 1,0 % крахмала и 2,5 % кормовых дрожжей БВК, приводит к ее. повышению (в 2 раза) по'сравнению с ДПС регламентного состава.

4. Исследовано влияние соотношения источников азотного и углеродного питания на инсектицидную активность шт. z-52 на примере дрожжеполисахаридной питательной среды; Показано,'что оптимальным соотношением компонентов ДПС, позволяющим получать культуральную жидкость с высокой инсектицидной активностью, является соотношениэ кордовые дрожжи БВК : кукурузная мука - (1,0-3,0): I

5. Изучен белковый состав энтомоцидных кристаллов, полученных при культивировании шт. z-52 на разных'питательных- средах. Установлено,- что качественный и количественный достав, белков кристаллов шт. Z-52 изменяется в. зависимости от. состава используемой питательной среды. На-большинстве из исследованных питательных сред основную часть от общего количества белка составляли белки с молекуляр» ной.массой 140, 120, S3 и 68 кД, а среда этих белков наиболыйая доля приходилась на белок с молекулярной, массой 68 кД.

6. Изучено влияние уровня аэрации на развитие и биологическую активность ит. 2-52 при культивирований на дрожжеполисахаридной питательной среде. Установлено-, что условия аэрации ДПС, обеспечивающие получение кулыуральной жидкости с высокой инсектицидной активностью, находятся в. интервале значений объемного коэффициента массоперодачи по кислороду (К^а) от 630 до 210 ч"1. При значениях: К^а менее 210 ч"* продуктивность культуры по спорам, ннсектицидная и антибактериальная активности снижаются, а количество"белка крис-

таллов остается на одном уровне.

7. Изучено влияние уровня аэрации на основные показатели раз вития шт. z-52 на ацетатной питательной среде. Установлено, что уменьшение величины К^а от 630 до 126 ч-^ приводит к уменьшению продуктивности культуры по спорам и увеличению длительности роста. При этом количество белка кристаллов и антибактериальная активност изменяются незначительно, а инсектицидная активность повышается. Снижение К^а до 60 ч-* вызывает дальнейшее уменьшение концентрации спор и увеличение длительности роста. При этом количество белка кристаллов и антибактериальная активность уменьшаются в значительн меньшей степени, а инсектицидная активность снижается до уровня величины,определенной для режима аэрации с KLa = 630

8. Установлено, что степень изменения величины инсектицидной активности шт. Z-52 при изменении состава питательной среды или условий культивирования меняется в зависимости от используемого тест-объекта. Показано, что оптимизацию условий культивирования и состава питательной среды необходимо проводить по инсектицидной активности, определять которую следует по отношению к разным тест-насекомым.

9. С использованием интегральной квазидинамической модели определены оптимальные профили управления процессом культивировали по К^а при выращивании шт. z-52 на дрожжеполисахаридной и ацетатно питательных средах, предусматривающие обеспечение более высоких уровней аэрации на стадиях замедления роста и образования спор и кристаллов. Использование профильного режима аэрации позволяет chi зить энергоемкость процесса при сохранении инсектицидной активное! и продуктивности культуры на высоком уровне.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лаврикова В.В., Крашенинникова Т.К., Кантере В.М., Рогатых Н.П., Юдина Т.Г., Егоров Н.С., Михайлов A.M., Базаренко И. Количественное определение ^эндотоксина Bacillus thuringienais asp. kuxstaki с помощью высокоэффективной жидкостной хроматограф! // П симпозиум стран-членов СЭВ по микробным пестицидам. Тезисы докладов.-М.-1990.-с.170.

2. Лаврикова В.В., Крашенинникова Т.К., Юдина.Т.Г., Егоров Н, Кантере В.М. Влияние аэрации на развитие и биологическую активное! Bacillus thuringiencia asp.kurstbkx шт. Z-52. // Деп. НПО "Медбио-экономика". Библиографический.указатель депонированных научных работ.-199Г.-Л- 7. с.69,

3. .Лаврикова B.B., Крашенинникова Т.К., Юдина Т.Г. Влияние аэрации на развитие и биологическую активность Bacillus thuringiehsis asp. kurataki шт.2 -52 при культивировании на, ацетатной среде.// Деп. НПО "Медбиоэкономика". Библиографический указатель депонированных научных работ.-1992.-№ I.

4. Лаврикова В.В., Ириков В.А., Юдина Т.Г., Крашенинникова Т.К., Кантере В.М. Оптимизация условий аэрации в процессе культивирования Bacillus tburingienais aap. kurataki шт.Z -52 с использованием интегральной квазидинамической модели.//Биотехнология.-1992.-ДО 2-е.61-66.

5. Юдина Т.Г., Лаврикова В.В., Крашенинникова Т.К., Олехно-вич Е.В. Изменение биологической активности параспоральных кристаллов при развитии Вас. thuringienaia на питательных средах различного состава.//Биологические науки.-1992 (в печати).

JIABPIKOBA ВИЕСТОРЩ ВИКТОРОВНА

ИЗУЧЕН®. ВЛШН1Я СОСТАВА ШГГАТЕ1ШЖ СРЕД и УСЛОВИЙ КУЛЪТШИРОВАНШ НА БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПРОДУЦЕНТА Л1ПВД0ЩА

/Автореферат/

Подписано к печати 16,04,52 Формат 60x90 I/I6 п.л. 1,7

Уч.нзд.л.Г.б Тираз 100, Заказ 210 _

Ротапринт МАСИ/ВТУЗ-ЗШГ/, 109280,Москва,Авгозаводсшая,16