Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Использование биохимических особенностей гриба ALTERNARIA SOLANI (ELL ET MART) SOR. в клеточной селекции томатов на устойчивость к альтернариозу

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Использование биохимических особенностей гриба ALTERNARIA SOLANI (ELL ET MART) SOR. в клеточной селекции томатов на устойчивость к альтернариозу"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ

На правах рукопис.ч

МАГДИ ГАД ЭЛЬ-РАБ ЭЛЬ-САММАН

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ ГРИБА ALTERNARIA SOLANI (ELL ЕТ MART) SOR. В КЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ ТОМАТОВ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К АЛЬТЕРНАРИОЗУ

Специальность: 06.01.11 — Защита растений от вредителей

и болезней

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1992

Работа выполнена в лаборатории фитотоксикологии Научно-исследовательского института защиты растений и на факультете защиты растений Санкт-Петербургского аграрного университета.

Научные руководители: кандидат биологических наук С. Л. Тютерев; кандидат биологических наук Н. Л. Полозова.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В. И. Буренин; кандидат биологических наук Э. И. Ларина.

Ведущее учреждение — НПО «Белогорка».

^Защита диссертации состоится -<- 1992 г. в

« часов на заседании Специализированного совета Д.020.01.01 при

Всесоюзном научно-исследовательском институте защиты растений по адресу: 189620, Санкт-Петербург, Пушкин-6, шоссе Подбельского, д. 3,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института защиты растений.

ВИЗР.

Автореферат разослан «Л*»

Л/» Ъ ¿¿С^СКе"^ 1992 г.

/

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Г. А. Наседкина

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди вредоносных болезней томатов важное место занимает ранняя сухая пятнистость, возбудитель которой гриб ' Alternarla. aolaci (»11 et Kart) Joces et «гоот "or. способен К эпифитотийному развитию. В условиях эпифитотии болезнь может снижать урожай на 20-40%.

Один иа способов защиты томатов от этого заболевания - получение устойчивых сортов. Генетический контроль и характер наследования признака устойчивости к альтернариозу' у томатов изучены недостаточно. Международных линий-дифференциаторов рас возбудителя альтернариоза томатов нет. В работах последнего десятилетия преобладает мнение о полигенном контроле и расонеспецифичности устойчи-: вости томатов к альтернариозу. • ■

Наряду с традиционной селекцией томатов на устойчивость к •альтернариозу, определенные перспективы имеют методы биотехнологии. Решающую роль при отборе клеток, Несущих мутации устойчивости к болезни играет селективный.фактор. В связи с тем, что специфичных к хозяину токсинов у A.solani Cor. до настоящего времени не обнаружено, поиск селективногЬ фактора.для клеточной селекции на •устойчивость.к альтернариозу представляет определенные трудности, йавестно, что гриб продуцирует несколько фитотоксичных экзометаболитов. Работ по выяснению роли фитотокаинов в развитии' альтернариоза и возможности получения устойчивых к токсинам линий томатов с использованием методов культуры клеток не проводилось.

Цель и задачи исследований. Целью нашей работы явилось изучение способности гриба Alternarla nolani Зог.продуцировать фИТОТОК-. сичные метаболиты в зависимости от условий культивирования и воз- ■ . можности использования этих фитотоксинов в клеточной селекции тог матов на устойчивость к ранней сухой пятнистости.

. В задачи исследований входило: "

сравнить-морфолого-культуралыше характеристики различных штаммов a.aoiani . на различных типах питательных сред; • ,j

. - изучить качественный состав экзометаболитов гриба A.eolani при росте на различных питагельных средах;- ^ ■ ...

- определить фитотоксичность'метаболитов гриба A.aolani • У. продуцируемых в питательные среды;

- разработать методы определения и определить количество некоторых фитотоксинов гриба; • • , .

- выявить б экстрактах или1 культуральных фильтратах селективный фактор, пригодный.для клеточной селекции томатов на устойчивость к альтернариозу, '

- разработать методы получения максимального количества расте-ний-регенерантов в присутствии селективного фактора;

- получить растения-регенеранты томатов и установись возмож- • ность получения у. них семенного потомстваRi ; . •

- предложить схему клеточной селекции томатов на устойчивость к альтернариозу.

Научная новизна работы. Из культуральных фильтратов гриба •i.soiaci выделены и идентифицированы метаболиты, фитотоксичные ■ для проростков, ингибирующив рост каллусов и органогенез у томат • тов. Разработаны методы.препаративного выделения альтерсолано-лов А и В, макросцорина, цинниола и других фитотоксинов из куль- ■ туральных фильтратов,- с помощью жидкостной хроматографии высокого давления изучена зависимость образования альтерсоланола' А от условий культивирования гриба. Определена активность'ферментов по- ■ лифенолоксидазы и хинонредуктазы в мицелии гриба. На основе полученных 'экспериментальных данных высказано предположение о том, . что обнаруженные'в культуральных фильтратах гриба ,л.во1ип1 . антрахиноновые пигменты с различным количеством фенольных зеыед-тителей в молекуле и разной степенью окисленности-восотановленнос-. ти способны восстанавливаться до фенолов и окисляться до хинонов ферментативный путем, а также кеферментативно-с участием радика- . . лов кислорода и НАДЙ. Обладая антиокисдительными свойствами, эти-соединения смещают конкурентные отношения свободнорадикального и ферыентдтивнрго ркисления в пользу ферментативного, тем самым регулируя количество свободных радикалов-и рост клеток. При.зараже- ■ нии растений томатов патогенами функционирование регудяторной буферной системы.гриба поддерживается за счет восстановителей растительной клетки, что снижает ее'энергетический, потенциал. Впервые • поликетидные фитотоксины гриба . A.eoiáni использованы для кле- -' точной селекции-томатов на устойчивость ,к альтернариозу.

Практическая ценность работы..Разработаны методы препаративного- -выделения фитотоксинов гриба A.eoiani из культуральных фильтратов. Выделенные фитоЮксины могут быть использованы при совершенствовании методов клеточной сёлевдии томатов fia устойчивость к альтернариозу. Разработаны селективные среды, позволяющие отбит-' ¡ рать мутации устойчивости к.фитотоксинам гриба A.soiaui при со-■ хранении высокой регенерационной способности зксплантов томатов.

Публикации, ilo материалам диссертационной работы написаны 2 статьи, которые находятся в печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация представлена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы, содержит 24 таблицы и 16 рисунков. Список литературы включает 155 работ, из них 50 па русском и 105 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы. В главе I "Систематика, биология возбудителя ранней сухой пятнистости i.ooiani и методы селекции томатов на устойчивость к болезни" обобщен материал.по систематике возбудителя, морфолого-культуральным признакам, условиям слороно-шения, фитотоксичным метаболитам,' условиям заражения, физиолого-биохимическим изменениям в растениях томатов после заражения аль-тернариозом, методам традиционной и клеточной селекции на устойчивость к болезни. Возбудитель ранней сухой пятнистости томатов ' гриб A.aoiani является факультативным паразитом с многоядерны^ ми клетками мицелия и спор и вследствие этого значительно измен-; чив по морфологическим, физиологическим признакам и вирулеятноо-ти. Клеточная селекция на устойчивость томатов к альтернариозу затруднена отсутствием у гриба специфичных к хозяину токсинов,

■ поэтому создание селективных сред, позволяющих отбирать клетки-, устойчивые к селективному фактору, и растения-регенеранты, устойчивые к болезни,имее! определенныё трудности.

■ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ .

2. Объекты и методы исследований. Исследования проводили в течение.1989-1991 гг. в лаборатории фитотоксикологии института защиты растений и на факультете защиты растений Санкт-Пзтербург-ско'го аграрного Университета. г.Пушкин. Объектами исследований служили три штамма гриба Alternarla aolani (ail et Hart) sort Ленинградский, Московский и Литовский, полученные из коллекции типовых-культур микроорганизмов института сельскохозяйственной уикроо'иолОгии, г.Санкт-Иетер'бург, Всесоюзной коллекции типовых

. культур микроорганизмов, г.Москва и Вильнюсского института ботаники, г.Вильнюс, а также сорта томатов Ьуоорегэ1отеп esouientna

•МП : Сибирский ранним, Талалихин и Белый налив. Для морфолого-кулмуральных и биохимических исследований грибу выращивали на

жидких и агаризованных средах4Мурасиге-Скуга, Чапека, Ричарда, кальций-сахарозной для споруляции , картофзльно-сахарозной и т-8. Грибы культивировали на агаризованных средах в чашках Петри диа- . метром 100 ми с 20 ил среды.и в жидких .средах - в литровых кача-дочных колбах с 200-300 ил среды при 23-25°. Рассев грибов проводили суспензией конидий в стерильной дистиллированной доде или кусочками мицелия на агаре 5 ци в диаметре, взятыми с активно растущей 3-5-дн'евной культуры гриба в чашках Петри. Споры гриба получали на среде для споруляции, содержащей 30 г СаСО^, 20 г сахарозы и 20 г агара на I л воды. Для получения моноспоровых культур определяли титр спор подсчетом их в камере Горяева и высевали 0,1 мл суспензии с трчно определённый содержанием спор (80-100). на агаровую среду, содержащую 0,01$ Тритона Х100,в чашки Петри, распределяли суспензию стерильным шпателем по поверхности агара. •.

Фитотоксическую -активность культуральных фильтратов определяли методом биопроб на проростках томатов (Берестецкий', 1973). Вирулентность штаммов гриба определяли, опрыскивая растения томатов в стадии бутонизации суспензией конидий (1Ср/т). При появлении признаков альтернариоза проводили учеты количества пораженных . растений и интенсивности поражения листовой поверхности в баллах • по методу Иванюк В.Г. (1980).

Полифёколоксидазу (К .Ф Л. 10.3.1 О-дифенил^-оксидоредукта-зу) в мицелии и культуральных фильтратах гриба определяли с хло-рогеновой кислотой,в качестве субстрата спектрофотометрическим ' методом. Хинонредуктазу (К.Ф.1.6.5.1 НАДН.:.хинонредуктазу) в мицелии и культуральных фильтратах гриба: определяли по окислению НАДН в присутствии фермента и субстрата п-бензохинона'.'

В работе изучали следующие .поликетидные пигменты и метаболиты гриба а.зо1»и1 - альтернариевую кислоту, макроспорин, альтер-ооланол А.и В, семихинон альтёрсоланола В, цинниол^ альтерпорри-ол А. Соединения выделяли.из культуральных фильтратов препаративной экстракцией и идентифицировали на. основе хроматогра$ических й спектральных характеристик. Разработана схема выделения, очистки и идентификации я культуральных фильтратах гриба иоликетидкых ае-. таболмтов (рио.1)'. Алмерсоланол А получен в кристаллическом виде, для количественного его определения 'разработан метод высокоэффективной жидкостной хроматографии на жидкостном хроматографе (ЧССР) ' с абсорбционным УФ/ВВД детектором"(254, 405/436 нм) с СН50Н-Н20 в качестве подвижной фазы на колонке р зерьгос 5 ыкм, 150 мм длины и 4 ,0 мм внутренний диаметр. Чувствительность определения 2-5нг.

Культуралышй фильтрат, pH 6,5

Экстракция генсеком 1/2 от объема фильтрата

йодный слой

• Экстракция зтилацетатом трижды по 1/3 от объема водного слоя

|Ойьединеш:ий этилацетатяый экстракт]

Экстракция 5% ЯаНС03 и водой по 1/5 от объема экстракта , •

Гексаиовый слой] отбрасывается

Окрашенный-сухой остаток

Этилацетатный экстракт

Á_

Водная фааа

Отгонка растворителя под вакуумом .

Кристаллы альтерсо-ланола А Сухой остаток

1

Подкисление-2П HCl до pH 3,5. •■ Экстракция трижды хлороформом по 1/2 от объема водной фазы

i

- отгонка-растворителя досуха

Суммарная фракция экзоме-таболитов гриба, содержащая альтерсоланолы А, В, макрослорин, дактилариол, цинниол, алмернариевую кислоту и др.

Экстракция CHCIjCHjOH. у (9:1) и Н20 \

|Хлороформный экстракт[

Сухой остаток (семихинон альтерсола-нола В

Хлороформная Ьаза

Водная

Отгонка растворителя

-L

Сухой остаток -риевая кислота

альтерна-

Отгонка растворителя хроматографирование-

в тонком слое ' /

макроспорин, альтер-соданол в, др. пигменты, цинниол_

• Идентификация по' Ув-сиектрам и '1СХ

' Экстракция .-зтилацетатом до обесцве-

чив ания _

| Этилацетатный экстракт) ■ Отгонка растворителя '

А. '

jАльтерсолакол А

Рис.1. Схема фракционирования, культуральных фильтратов при определении зкзоыетаболитов гриба Alternaría aol&nl (ell et.jiartJ jones et-r?rout sorccerT -

Клеточную селекцию тоиаТов на устойчивость к культуральным фильтратам и фитотоксинам гриба проводили^ получая экспиаити сеип-долей и гипокотилей проростков, индуцируя у них каллусогенез на • селективных средах и последующую регенерацию побегов. Укореняли регенеранты на безгормональной срсде, выраедвали в пробирках до стадии настоящих листьев и высаживали в почву (рис.2)« для полу-' чения эксплантов .использовали. сегмента семядолей и гииокотилей IQ-12-дневных стерильных проростков. Эксплакты помещали на среду Ыурасиге-Скуга для каллусогенеза, а которую вводили селектирующий фактор (культу рал ышй фильтрат или фитотоксин). Оценку морфог генеза проводили по скорости каплусообразования, массе каллуса, интенсивности побегообразования.'

3. Сравнительная характеристика биологических особенностей штатов гриба Alternbrib во1ьп1 (Ell et Mart) зог. . выращенных на различных питательных средах. Сравнение радиального роста трех штаммов гриба на четырех питательных средах показало, что наиболее существенное влияние на характер,роста оказывает состав питательной среды, а между штаммами различия по скорости роста на одной и той же орёде незначительны (рис.3). Все три штамма гриба лучше росли.на картофельно-сахарозной агаре;.«а среде Чапека рост' ' был в 1,5-1,7 раза, а на среде Ричарда - в 2,7 раза медленнее," чем на картофельно-сахарозной среде. Аналогичная зависимость скорости роста гриба A.eoleni от состава среды сохранилась и для жидких сред. Накопление сухой массы мицелия определяли на 21 сутки роста гриба, т.е; в стационарной фазе роста. Масса сухого мицелия в расчете на 1.мл среды при росте.на картофельно-сахарозной среде составила 7,8 мг у Ленинградского, 9,1 мг у Московского и 9,2 мг - у Литовского штаммов гриба. На жидких средах различии в скорости роста гриба "были сильнее, чем'на агаризованных. Сравне- ; ние массы, сухого мицелия на 21 сутки роста 10 моноспоровых культур Ленинградского штамма.гриба на среде Чапе.ка-Докса показало,' что монаспоровые культуры гриба, одного штамма различаются по скорости рЬста. На- агаризованных средах различия по скорости радиального роста моноспоровых культур гриба одного штамма меньше, чей ■ •на жидких средах. Все моноспоровые культуры быстрее росли на кар,-гофельно-сахарозной и Y-8 средах. Можно предположить, что лучший рост на'питательных средах, содержащих экстракты картофеля и томатов, объясняется присутствием в таких средах разнообразных орга-..' нических веществ, окисляя которые гриб получает дополнительную анергию, а на полностью синтетических'бродах, содержащих только'

растение-регенераты

Микроклональное размножение

"^^^Выоадка в почву

Получение семенного •потомства яj

Рис.2. Схема опытов по селекции томатов in vitro на устойчивость к культуральныи фильтратам и фракциям культуральных фильтратов гриба Alternarla eolanl («11 et Mart) 3or»n«rJ

Диаметр колоний, мм 90 Т.

80

70 ■60

50 40 30 20 , Ю

.' о

2 ' 3

Варианты опыта'

Рис.3. Диаметр колоний на десятый день.роста Ленинградского, Московского и Литовского штаммов грибов А.*с1е.й1 на четырех питательных средах. .

I - к$рто£ельно-сахарозная среда; 2.--среда- т-8; '

■ 3 - Чапека-Ддкса; - Ричарда.' □ - Московский штамм;

Ш - Ленинградский; £3 - Литовский.

минеральные соли, единственным источником энергии является сахар. Установлено, чю фильтраты культуральных сред гриба после роста его на средах Мурасиге-Скуга и Ричарда стимулируют рост гриба на этих же средах, что можно объяснить обогащением синтетических сред органическими экзометаболитами гриба, среди которых мало иди нет антибиотиков, В то же время фильтраты картофельно-сахарозной среды ингибировали рост гриба в концентрации 30-50;а, при этом среди моносноровых культур, выделенных из Ленинградского штамма гриба,отмечена изменчивость по характеру роста в присутствии культуральных фильтратов гриба. Очевидно в фильтрате гриба при росте его на картофельной среде присутствуют антибиотические вещества. Известно что некоторые фитотоксийы гриба A.soienj являются антибиотиками (Cuemitsu at al. ,1988).

Так как одна из основных целей работы - создание селективных сред для клеточной селекции томатов на основе культуральных филь-' тратов гриба, проведенная работа позволила сделать вывод о том, что для сравнения степени фитотоксичности культуральных фильтратов и стандартизации их по массе мицелия нужно учитывать, -что в одинаковых объемах картофельно-йахарозной среды мицелия гриба • накапливается в 20-22 раза больше, среды "7 -8 - в 9-15 раз больше и среды Чапека - в 2-4 раза больше, чем в среде Ричарда.

4. Фитотоксичные метаболиты трех штаммов гриба Alterneria aoiani (Eli et t:»rt) зог. Целью этого раздела наших исследований было изучить фитотоксичность культуральных фильтратов при выращивании Ленинградского, Московского и Литовского штаммов гриба A.soibni на различных питательных средах, а также идентификаций' некоторых фитотоксинов. При добавлении культуральных фильтратов после 21 суток роста на различных' средах Ленинградского', Московского и Литовского штаммов гриба к среде Мурасиге-Скуга прорастание семян томатов сорта Белый_налив ингибировалось в 3,7-3,9 раза. Бысокую токсичность для сорта томатов Сибирский ранний проявили культуральные фильтраты Ленинградского штамма гриба при росте его на среде с повышенным содержанием сахарозы и высоким отношением С:К (табл.1). Наиболее фитотоксичны культуральные-фильтраты после. 21 и 28 дней роста гриба. Экстракты культуральных фильтратов концентрировали, разделяли в тонком слое сипикага'ля (пластинки силуфол-УФ25^) и лосяе элюир'ования с хроматограмм определяли фитотоксичность отдельных фракций в биотестах по ингибиро-ванию роста корней томатов"сортов Талалихин, Белый налив.- Максимальное количество токсичных для томатов фракций - (■ - обнаружено

Таблица I

Прорастание семян томатов сорта Сибирский ранний на среде Мурасиге-Скуга в присутствии вультурального фильтрата (среда tel) после 15, 21 и 28 суток роста на. ней Ленинградского штамма грибаA.eoXact

Концентрация кулыурального фильтрата в среде мурасиге-Сцуга (объемные %) -

•Количество проростков на чашку.при Мурасиге-Скуга с добавлением кульп тоз из среды № I после роста на не!

росте их на среде ральных филира-; гриба в течение:

15 суток

21 суток

28 суток

ia К " % К

X' ,штук конт- Х__ ,штук конт-' роли ср' " . рошо

% ÎC

ХЛТ) ,штук ■ конт-■ ролю

контроль - среда Мурасиге-Скуга без кулыурального фильтрата .

•20

■ ' .. • зо .

• 40 • '.' -

I0,f2 100,-0 9,50 100,0 . 9,25

8,00

■6,87 2,25

'75,3 .8,20 ' 64,7 5j55 .21,2 • О/,О

88,1. 59,6 M

б, 67 2,80 0,90

100,0

72,1 30,5 9,7

0

1 -

НСР,

0,96

0,67

0,90.

в культуральных филыратах гриба при его росте на картофельной 'среде. В куяьтуральных фильтратах гриба при ¿го росте на среде 4 V-8 обнаруживается 3-4 фитотонсичных фракции, в щидьт^атах среды Чапека - 2 и Ричарда - I.

• При экстрагировании куяьтуральных фильтратов этилацетатом, хроматографировании сконцентрированных этилацетатных экстрактов в тонком слое силинагеля были обнаружены келтые и оранжевые пигменты с различной х р ом а т о гра фи ч е с яо И подвижностью. Jipa концентрировании зтилацетатного экстракта культуральной жидкости получили 200 мг кристаллического пигмента. .СПектрофотометрирование раство-. ра соединения в 96^-ном эталоне показало присутствие 4 максимумов поглощения в УФ-области при длинах волн 219, 240, 268 и 285 им и 'одного максимума в видимой области при длине волны 422 нм. Били получены следующие значения, коэффициентов молярной зкстщщии для максимумов поглощения: 219 нм - 37200, 240 нм - 9100, 268 нм -, 14000, 285 км - 6900 и 422 нм - 4500, что хорошо согласует'^ с известными в литературе данными для альтерсоланола А. Для количественного определения альтерсоланола А был разработан метод ш-.сокозффентивной жидкостной хроматографии. Состав питательной среды существенно влияет на накопление альтерсоланола А ноносноролы-ми.культурами гриба, Ленинградский штамм ¿..soled (табл.2). Накопление альтерсоланола А было максимальным в картофельно-гдюкоз-' 'ной среде, а в среде [Дурасиге-Скуга пигмент не обнаруживается. 5 •агаризованной. среде, у-8 альтерсоланола А содержится в среднем в Количестве 11,4 мкг. 'в среде Ричарда - 5 мкг/ал. Альтерошшнол А фитотоксичен для проростков томатов. ' •• •

Кроне альтерсоланола из культуральных фильтратов были выделены' ма'крослорин', алмерпо'рриол А, дактилариол, альгереоланол В и другие пигменты. Суммарная .этилацетатная фракция экзоме'таболитов подавляла при 0,01^-ной концентрации прирост корней томатов за 24 часа на I00/¿ в сравнении о контролем. Альтернариевую кислоту Получить в кристаллическом йзде не удалось. Отсутствие "свидетеля" (эталонного кристаллического соединения) не позволило разработать . более .чувствительный метод определения алиернариевой кислоту.

Обнаруженные в куяьтуральных фильтратах.гриба ан-

трахиноновые пигмента с различным количеством фенольных заместителей в молекуле и разной степенью окисленности способны восстанавливаться до оксигидроантрохпнонов", "'окисляться до хшюнов ферментативным путем о'помощью хинонредуктазы а -полифеполоксндазы оба эти фермента обнаружены'в мицелии гриба, а такие» нефернента-

Таблица 2

Влияние состава питательной среды на* накопление в ней • альтер1,соланола А грибом А»эо1ап11

Содержание альтерсоланола А в среде (мкг/мл)

- Номер моноспорового ■ изолята

7,-8

Чапека- .

Картофельно- Докса (мо- Мурасиге-ггшкозный агар дийициро- Скуга -ванная) • •

Ричарда

I- - 5,2+0.16 90,5 + 2,89 103,8+3 ,14 ■ ,

5 10,510,35 100,2 + 2,91 ' 135,6+3,36--—- . 8,3+0,28

8 ,14,9+0,49 ■ 143,8 + 4,53 149,7+4,75 " 5,6+0,18

10 16,5+0.53 159,6 ±4,72 _ 130,5н4,01 . .4*3+0,13

14 ' 10,3+0,34 173 ,8+5 ,17 160,9+4,89 - 2,5+0,07

15 12,0+0,43 '140,2- +4,21.-" 115,8+3,34. 3,4+0,10

16. . 8,4+0.23 160,1 + 4,65 ■ .145,4+4^,26 - • -

18 7,5±0,19 115;2 ±3,70 123 ,2+3 ,55 -

25 ' 12,1+0,43 .175,6 ± 5 ,09 160,9+4,72 7,4+0,23

28 17,3+0,61 190,4 + 5,50 • 205 ,2+6,25 . 18,6±0.74

го I

х)1не обнаружено при чувствительности метода определения 0,3 мкг/мл.

тивно - с участием радикалов кислорода и восстановителя НАДН. Обладая антлокислительными свойствами, оти соединения смеэдют кон, "курентные отношения свободнорадикального и ферментативного окисления в пользу ферментативного, тем самым регулируют количество свободных радикалов и рост клеток. Можно предположить, что при заражении растений томатов функционирование регуляторной буферной системы гриба поддерживается за счет восстановителей'растительной клетки, -ч'хо снижает ее энергетический потенциал.

'Установлено, что изучаемые штаммы гриба патогенны для растений томатов сортов Белый налив, ТалЬлихин, Сибирский ранний. Не. значительное различия мемду штаммами по способности заракать три сорта тощуов в'целом коррелируют с одинаковой способностью всех штаммов гриба синтезировать значительные количества оксиантрахи-нонов. В большей степени подтверждает предположение о роли этих фитотоксинов гриба в его патогенного! для.растений высокая сте- . . пень корреляции между максимальным количеством этих соёдин'Лий, продуцируемым на картофельной среде всеми штаммами гриба, и максимальной фитотоксичностью культуральных фильтратов г^пба после .роста его на картофельной среде во всех биотестах.

5. Клеточная селекция томатов на устойчивость к альтс-рнарио-зу. В качестве эксплантов использовали сегменты семядолей и г;шо-котилей. 10-15-дневных стерильных проростков томатов сортов Белый ' налив,'Талалихин, Сибирский ранний. Учет результатов-проводили по ■каллусообразованию ла семядольных и гипокотилышх зксплантах '¡~> ■ 6т общего количества'высеянных эксплантов) и весу каллуса. Каллу- •

сообразование начинается на 5-7-й день. Развитие каллуса'наиболее . интенсивно происходит в течение 3-4-недель, после чего начинается его старение.и отмирание, если он не переходит к органогенезу. Учитывая это,' каллус, если проводили-дальнейшую работу'с.ним, пассировали в течение месяца.

Число семядолей, способных образовывать каллус, было высоким • у растений томатов всех'изученных сортов - 89,^-100,0^, а масса каллуса зависела от сорта и соотношения гормонов.ауксииового и ци-токинииового типов в питательной среде. Регенерационная способность (;!аллусообразование и органогенез) у растений томатов сортов Белый налив, Талалихин, Сибирский ранний наиболее полно роализует-, ся при соотношении гормонов цитокшншового и ауксияового типа, приближающемся к единице для каллусогенеза и 40 - для побегообразования..В этих условиях 89-100;'и эксплантов всех сортов способны образовывать каллус и Г4'-85# каллусов образовывали пийогп. ира

Таблица -3

Масса каллусов растений томатов сорта Белый налив через 30 дней роста на среде Мурасиге-Скуга 5 присутствии культуральных фильтратов•различных штампов, граба д.во1ав1

Питательная, среда, на ко-■ торой выращивали гриб

Концентрация кулыурального

фильтрата гриба в среде Мурасиге-Скуга . (объемные %)

Масса ЗО-дкевных каллусов при добавлении к среде Мурасиге-Скуга культуральных фильтратов штаммов:

Московского

Лен.гаградского.

7Г

'ШТОВСКОГО

в % к

в мг . конт-

' роди

в % к

в мг ■ конт-..

.._ролю

в -мг

.. В Ч'о к контролю

Картофельная

Чапека

Ричарда

О 78,9 + 9,20 100,0

'.40 . 15,6 ± 0,97 19,8

50 ' : 12*4 ± 0,77.. 15,7

О 78,9 ± 9 ,20 100,0

40 - 34,5 + 4,19 ' 43,7

50- 25,4 + 1,71 32,1

. 0: ' 56,1 ± 3,59 100,0.

40 12,8 + 3,20 . 22,8

50 . 32,3 ± 4,06 57,5

. О 56,1 + 3,59- 100,0

40 43,3 ±16,52 77,1.

50 36,8 ±3,07- .65,5

79,9 + 9,20- 100,0 15,6 ± 0^65— 19,5 12,3 £ 0,66 15,3' 78,9 + 9,20 100,0 30,0 ±"0,54 ,_38,0

31.5 + 1,44 39,9 56,1+±3.,59 100,0

28.3 ±3,30 • 50,4

20.6 ± 1,98 36,7 56,1- + 3,59. 100,о'

41.4 ± 2,10 73,6 32,8 ±1,31 58,4

78,9 + 9,20 100,0

19.3 + 1,45 -24,5 15,7+1,01 19,8 .78,*9 + 9,20 100,0

18.4 + 1,50 23,3 19 ,4 ± 1,34 . 24,5 56,1. ± 3,59 ЮО-.О.

23.5 + 2,57 41,8 11,1 + 1,28 19,7 56,1 + 3,59 100,0 32,0 ± 6 ,18 57,0 22,4- ±4,21 39,9

I I

Таблица 4 '

Способность 'каллусов разных сортов томатов к органогенезу - в- прясугсгвш! хультуральных фильтратов Ленинградского шгамиа а,во1ап1

Концентрация ' % каллусов. образуют побеги

Питательная культурального-—

среда, на ко- фильтрата семядольные эксплантк г^иа&от-ййыда зьсиданты

торой зыра^- гриба ь среде ■ ■ ■ -

•вали гриб - Мурасиге-Скуга Тйлязшэтн БелыП Сибирский 7ЯЛЯшт!н Белый Сибирский (объемные %) ¿алалих.ы налш, раныий ^алалихин налЕ2. раН1-2

— 0 (контроль -без фильтрата) 6Т,Г . 73 ,3. ■ 82.9 5? ,0 .80,3 76,4

Картофельная .. 40 ■ 20,4 25,1 . 31,7 ■ 22,0 24,9 28,3

• - .50 ; 18,9' 23,1 26,9 19 ,5 . 16 ,3 ' 25,2

- т.-в 40" - 36 л 39,4 37,5 • . 39 ,1 30,5

-50 ■ 22|,3 • > .30,7 34,8 50,1 •28,2

Чапека : 40 37,4 . .40,1 36,3 . 39,9 . 45,4 - 35 .'7

- . 50. . 35,2 ' 33,9 30,1 . 32,3 40,2 25,6

Ричарда 40 . 43,1 41,5 .32,1 37Д •53,4 30,5

50 39,4. 37,1 31,4 • • 30,3 42,9 ■ 22,1

- нс%'' 4 * ' ' 3,8 ' 4,5-' 5,6 4,9 '. 5,2

~ го -

введение в питательные среды селективных факторов (культуральные фильтраты Ленинградского, Московского и Литовского штаммов гриба, этклацетатная фракция фитотоксинов, альтерсолакол А.) каллусообра-эование. подавлялось на 50г84$,.а образование побегов - на (табл.З, 4).,Но фитотоксичности для каллусных клеток томатов сорта Белый налив культуральные .фильтраты-всех штаммов гриба'можно, расположить в последовательности: картофельная > v-8 > Чапека у Ричарда. Способность каллусов к побегообразовании была больше на средах, содержащих менее фитотоксичные культуральные фильтраты гриба (фильтраты культур .гриба на среде Ричарда: > Чапека > v-8 > картофельной. Побеги томатов хорошо укоренялись на среде Мура-сиге-Скуга без гормонов. Полученные на селективных сре'дах.с фито-токсинаыи i.zoiz.nl растения-регенеранты томатов Имеют нормальную морфологию и фертильность.1от растений-регенерантов получено семенное потомство Rj , которого проверяется на'устойчивость к • арьтернариозу. Таким образом, подобраны среды, которые содержат оптимальные соотношения гормонов и фитотоксинов, их использование позволяет полу'чать устойчивые к фитотоксинам растения-регенеранты. ■

ВЫВОДЫ - :

1. Разработан метод индукции споруляции для трех неспорули-*-, руюйшх в обычных условиях штаммов гриба Alternarla coiani.' , позволяющий получать достаточное количество спор патогена для заражения растений томатов. Штаммы гр'иба - Ленинградский, Московский и Литовский - патогенны для растений томатов сортов Талалихин,. Белый налив, Сибирский-ранний.

2. При росте Ленинградского, .Московского-и Литовского штаы-'мор. гриба a.sotaní _иа различных по составу питательных средах -картофельной, v-8, Чапека, Ричарда и среде с повышенным содер- ■ ааниеи сахарозы - накапливаются-метаболиты, фитотоксичные для растений. томатов. , ■ • .

3. Разработаны методы выделения,'очистки и идентификации в культуральных фильтратах'гриба поликетидных метаболитов, в том числе оксяантрахиноновых пигментов --ал'ьтерсоланола А, В.' макро-спорцна, биантрахинона альтерпорриола А. Айьтерсоланол А получен

в кристаллическом виде, для-количественного его определения раз-' . рабоган метод вырокоэффективной жидкостной хроматографии С чувст-1 . вительноогью определения 0,3 мкг/мл.

А. Обнаруженные в культуральных'фильтратах метаболиты-гриба

д.eoie.nl оксиантрохиноны способны восстанавливаться до антро-«гидрохинонов и вновь окисляться до антрахшюнов ферментативным "путем с участием полифенолоксидазы и хинонредуктазы и пефериента-тивиым - с участием радикалов кислорода и НАДН. Такая буферная окислптбльно-восстановителышн система регулирует ьиличост^о свободных радикалов и рост клеток.

Подобраны оптимальные.для каллусо- и органогенеза растений томатов питательные среды, содержащие селектииный фактор и ■ повзоляющие получать растения-регенеранты томатов, устойчивые к фитотоксинам гриба, которые сохраняют нормальную морфологию и . фертильность.

б. Предлоаена схема клеточной селекции растении томатов на 'устойчивость к альтернариозу. Отдельные этапы этой схемы включают получение мутантных линий томатов, устойчивых к фитотоксцческому действию культуральных фильтратов штаммов гриба a.eoIüiií , фрак. циям культуральных фильтратов и выделенным фитотоксинам. ',»

Список опублнковцнных работ по теме диссертации:

1. Эль-Самман Магди, Т.А.Евстигнеева, Н.Л.Полозова, Биосинтез альтерсоланола А Грибом. Alternarla eoli.nl (Sil et Kart) So-raüer при различных условиях культивирования. Бюл.БИЗР, 1991 (в .печати). '

2. Эль-Самиан Магди. К созданию селективных пи.мтелышх сред . ija основе культуральных фильтратов Aiternarit soiani . Сборник научных трудов СДГАУ, 1992 (в-печати), .