Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование методов биотехнологии в получении исходных форм моркови, устойчивых к патогенному грибу Alternaria radicina M., Dr. Et E.

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Использование методов биотехнологии в получении исходных форм моркови, устойчивых к патогенному грибу Alternaria radicina M., Dr. Et E."



На правах рукописи

РАСКАЛИЕВА ВЕЛИНА АБДРАХМАНОВНА

Использование методов биотехнологии в получении исходных форм моркови, устойчивых к патогенному грибу Alternaría radicina М., Dr. Et Е.

Специальность 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2001

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

Научный руководитель - кандидат биологических наук Е. А. Калашникова

Официальные оппоненты доктор биологических наук Н. В. Загоскина, кандидат биологических наук Л. М. Гайворонская

Ведущее учреждение - Главный ботанический сад РАН

J/íC

Зашита диссертации состоится 9 июля 2001 г. в // часов на заседании диссертационного совета Д 220 043 10 в Московской сельскохозяйственной академии им К А. Тимирязева

Адрес. 127550, Москва И-550, ул Тимирязевская, 49, Ученый Совет МСХА

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке МСХА

1 í / /1^1

Автореферат разослан « ■ LO. Vi- _2001 г

, i

Ученый секретарь диссертационного совета -кандидат биологичес ь чх наук ^ Г. И Карлов

Актуальность темы. Потери урожая корнеплодов и семян столовой моркови от грибных, бактериальных и вирусных заболеваний во время хранения корнеплодов и выращивания семенников нередко составляют 30-60%, а иногда и 100%. Существенный ущерб культуре моркови наносит альтернариоз и фомоз.

Alternaría radicina (черная гниль) - наиболее распространенный и опасный патоген у моркови. Заражение им обычно происходит при ослаблении тканей растений, особенно в дождливую осень при несколько повышенной температуре. Гриб вызывает мацерацию тканей и проявляется в побурении нижней части стебля, листовой пластинки, соцветия и семян в процессе онтогенеза растений, а также корнеплодов при их хранении. .,.-..'.■.. , --, •

■ . - ■ Наиболее радикальным средством защиты растений от фитопа-тогенов является создание устойчивых форм, а в дальнейшем и получение сортов. Однако для корнеплодов этот процесс требует больших временных затрат, поскольку для получения семян требуется два вегетационных периода. , .

В настоящее время биотехнология располагает методами, в частности, культуры изолированных клеток, тканей и органов растений, позволяющими сократить срок проведения селекции и снизить экономические затраты ручного труда. В этом направлении ведущее место занимает клеточная селекция, при которой в условиях in vitro проводят отбор клеточных популяций, устойчивых к селективному фактору, и затем регенерируют целые растения. На сегодняшний момент в этом направлении достигнуты значительные результаты: "созданы" линии „ картофеля, устойчивые к фитофторозу, томаты - альтернариозу, пшеница - септориозу, рис - пирикуляриозу и др. Исследования по клеточной селекции моркови на устойчивость к альтернариозу малочисленны и носят пока поисковый характер. Поэтому изучение влияния биотических факторов на рост клеток моркови и селекция устойчивых к болезням клеточных линий с последующей регенерацией измененных растений имеет как теоретическое, так и практическое значение.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изуче-, ние особенностей ответа клеточных популяций моркови на присутствие культурального фильтрата гриба Alternaría radicina в питательной среде. Разработать методику и провести клеточную селекцию по получению растений-регенерантов, устойчивых к данному патогену. .

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

11 tW.oHAf?

. научная'Библиотека- •

Моск. соль;::о.;эз ачадамии •им. К. A. iимиряаева

Инв. Ngj^,.—

■ получить хорошо пролиферирующую каялусную ткань и суспензионную культуру различных генотипов моркови,

■ подобрать оптимальные условия выращивания гриба Alternaría radicina, получить культуральный фильтрат патогена и определить его действие на прорастание семян,

■ изучить поведение клеточных популяций различных генотипов моркови в нормальных и стрессовых условиях культивирования;

■ разработать и провести клеточную селекцию моркови, отобрать клеточные линии, устойчивые к культуральному фильтрату гриба Alternaría radicina;

Ш изучить образование фенольных соединений в суспензионных культурах моркови в различных условиях их культивирования и растениях, полученных 1П VltTO И 1П VIVO,

■ получить растения-регенеранты и провести их оценку по устойчивости к грибу Alternaría radicina

Научная новизна. Впервые разработана методика и проведена клеточная селекция моркови на устойчивость к грибу Alternaría radicma. Показано, что в качестве селективного фактора можно использовать культуральный фильтрат гриба Alternaría radicma в концентрациях 30-50%, полученного с использованием различных методических подходов Установлено, что при совместном культивировании патогена и каллуской ткани в жидкой питательной среде, значительно повышается агрессивность патогена, что приводит к увеличению токсичности культурального фильтрата гриба Alternaría radícula. Показано, что долговременное хранение стерильного культурального фильтрата патогена, при пониженных температурах, не снижает его токсическое действие. Установлено, что использование эпина в питательной среде значительно повышает морфогенетический потенциал каллусной ткани, по сравнению с часто используемыми в культуре ткани цитоки-никами - БАП и 2ip Впервые охарактеризована клеточные суспензии различных генотипов моркови, культивируемых в присутствии биотического селективного фактора Выяснены различия в содержании фенольных соединений в растениях m vitro и m vivo, а также в клеточных суспензиях в процессе их культивирования в нормальных и стрессовых условиях Впервые получены клеточные линии и растения-регенеранты моркови, устойчивые к патогену A radiaría

Практическая значимость. Предложенная и разработанная технология получения растений, устойчивых к биотическим факторам, в частности, моркови к патогену Alternaría radicina, может быть применена и для других сельскохозяйственных культур. Полученные в результате исследований устойчивые формы моркови могут служить основой для создания новых сортов, обладающих повышенной устойчи-

востью к альтернариозу, что позволит сократить потеря урожая от воздействия данного патогена. * " , '

Апробация работы. Полученные результаты докладывались и обсуждались на симпозиуме в Вашингтоне « In vitro in Biology» (1997), на Международной конференции «Молекулярная генетика и биотехнология» ( Минск, 1998), на I и II Международной конференции «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве . и ветеринарии» (Москва, 1996,2000), на Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 2001), на'научной конференции МСХА (Москва, 2000), а также на заседании кафедры сельскохозяйственной биотехнологии МСХА им К. А. Тимирязева.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ. . Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, б глав ( обзор литературы, объекты и методы исследований, результаты и обсуждения (4 главы)), а также выводов и списка используемой литературы. Работа изложена на 103 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 27 рисунков. Список литературы включает /^наименований, в том числе на иностранных языках. - , . .. - .

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. /

Объектом, исследования служили б генотипов моркови, обла-, дающих различной полевой устойчивостью к грибу Alternaría radicina. К среднеустойчивой группе относятся - , 906, . 805, неустойчивой -Rondo, 225П, 6700. Семена всех изучаемых генотипов были любезно предоставлены сотрудниками лаборатории селекции и семеноводства овощных культур ВНИИОХ.

_ В качестве первичного экспланта использовали сегменты листовых черешков, изолированных с 2-х месячных проростков, а также диски, вырезанные из сердцевинной части корнеплодов. Сегменты черешков стерилизовали 0,1%-ным раствором сулемы в течение 8 минут, а диски корнеплодов - 35 минут,. после чего экспланты трижды про, мывали стерильной дистиллированной водой по 15 минут. Каляусную ткань получали путем культивирования изолированных эксплантов на модифицированной питательной среде Мурасига и Ску-га, содержащей 2,4-Д 1,5 мг/л, сахарозу 2% и агар 0,8%. Каллус выращивали в чашках Петри в световой комнате при постоянном освещении белыми люминесцентными лампами, температуре 25° С, относительной влажности воздуха 70%. Пассирование каллусной ткани осуществляли один раз в месяц. При этом учитывали: способность эксплантов к каллусогенезу (%), интенсивность каллусогенеза, цвет и консистентность каллусной ткани.,

Суспензионную культуру получали из хорошо пролиферирующей кап-лусной ткани и выращивали в 100 мл колбах в 20 мл питательной среде на аппарате роллерного типа со скоростью вращения 100 об/мин Пересадку суспензионной культуры осуществляли один раз в 2 недели при этом учитывали- ростовой индекс (Ш), жизнеспособность, плотность и агрегированность

Чистая культура гриба АІІегпагш гасіїсіпа была предоставлена сотрудниками ВНИИОХ. Патоген выращивали на агаризованных и жидких питательных средах, содержащих минеральные соли по прописи Мурасига и Скута, а также Чапека Культуральный фильтрат (КФ) патогена получали путем выращивания изолятов гриба в 300 мл колбах в 200 мл объеме жидкой питательной среды на качалке со скоростью вращения 100 об/мин В каждую колбу вносили по 1 кусочку агара 0,5x0,5 см, содержащий 10® шт конидий гриба. Культуральный фильтрат получали фильтрованием суспензии гриба через фильтровальную бумагу с последующим автоклавированием. Оптическую плотность (Б) КФ определяли на 9, 14, 19, 23, 30-й день с момента выращивания патогена в питательной среде и измеряли ее на фотоколориметр« КФК-2УХ 4,2. Токсичность КФ проверяли по прорастанию семян Клеточную селекцию проводили на суспензионной культуре моркови В качестве селективного фактора использовали КФ гриба, который был добавлен в питательную среду в концентрациях 10%, 20%, 30%, 40%, 50%. В работе были применены две схемы селекции. 1)4 пассажа на селективной среде, 1 пассаж без селективного фактора, 4 пассажа на селективной среде, регенерация растений, 2) культивирование суспензии клеток моркови на селективной среде с увеличением концентрации КФ от 20% до 40%, регенерация растений Поведение суспензионной культуры в стрессовых условиях определяли по ростовому индексу, жизнеспособности и степени агрегированности

После селекции, суспензионную культуру платировали в агаризо-ванную питательную среду по методике, изложенной в методических указаниях «Лабораторно-прлктические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии» (1996) Для получения растений-регенерантов микрокаллус переносили на питательную среду, содержащую различные физиологически активные вещества БАП, зеатина, 2-изопентениладенина (2ір), эпина

Определение содержания суммарных растворимых фенолъных соединений проводили с использованием реактива Фолина-Дениса Для разделения полифенолов использовали хроматографию (Залрометов, 1971)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Раздел 1. Особенности каллусогенеза в культуре ткани моркови.

1.1. Зависимость каллусогенеза от генотипа и первичного эксппанта.

В проводимых опытах, по получению каллусной ткани различных генотипов моркови, изучали зависимость этого процесса от первичного экспланта: сегменты листовых черешков и диски сердцевинной части корнеплодов. Установлено, что изучаемые генотипы одинаково реагируют на состав питательной среды. Во всех вариантах каллусная ткань начинала образовываться на 7-ой день с момента посадки эксплантов in vitro и формировалась по всей поверхности изолированных тканей, начиная с внутренних клеточных слоев. Показано, что процесс формирования каллусной ткани зависит от исследуемого генотипа. Так, генотипы Rondo и 6700 обладали высокой способностью образовывать каллусную ткань ( 57% -70%), а для генотипов 906, 805 и 225 этот показатель находился в пределах 24% - 39% в случае получения каллуса из сегментов черешков. Для сегментов корнеплодов эта закономерность была так же характерна. Однако интенсивность каллусогенеза была ниже по сравнению с использованием в качестве первичного экспланта сегментов черешков.'Исходя из этого, в последующих экспериментах использовали лишь каллус, полученный из сегментов черешков.

1.2.Характеристика суспензионной культуры различных - . . . генотипов моркови. Фазы ростового цикла определяли на суспензионной культуре всех изучаемых генотипов (Рис.1). ! . ...

Полученные данные свидетельствуют о том, что у изучаемых генотипов, фазы ростового цикла наступают в разное время. Были выделены линии ( 225, 906, Rondo), для которых характерно одинаковое поведение клеток в суспензионной культуре. Лаг-фаза у этих генотипов длилась 7 дней, линейная фаза - 4 дня, затем наступала фаза замедления роста и кривая выходила на плато. - *

Иная картина наблюдалась у линии 6700 и 805,' для которых характерно быстрое или постепенное вступление клеток в активное деление. Таким образом, экспериментально установленные различия скорости роста суспензионной культуры, позволяют заключить о возможном неодинаковом поведении клеток при последующем культивировании их в стрессовых условиях. . -:..''-*

Рис.1 Ростовые кривые различных генотипов моркови в суспензионной культуре.

Ростовой индекс Эти исследования проводили на трех генотипах (Rondo, 906 и 805). Результаты представлены в таблице 1

Таблица 1

Ростовой индекс суспензионной культуры моркови на разных пассажах (НСР „ = 0,53)._

Генотип Номер пассажа

I IV VII

805 1,6 1,87 1,54

906 2,68 3,5 2,8

Rondo 3,5 5,4 4.3

Результаты таблицы I свидетельствуют о том, что из всех трех изучаемых генотипов наибольшую активность проявляет сорт Rondo, для которого прирост клеточной суспензии находился в пределах 3,5-5,4 , что примерно в 2 раза выше по сравнению с линией 906. Для линии 805 этот показатель не превышал 1,54 - 1,87.

Несмотря на такие значимые различия в ростовом индексе изучаемых генотипов, все же нами были выявлены некоторые закономерности в поведении клеточных суспензий в процессе культивирования Установлено, что на IV пассаже наблюдается увеличение Ri у всех исследуемых генотипов Причем для сорта Rondo ростовой индекс увеличивался в 1,5 раза, а для линий 906 и 805 - 1,3 и 1,1 соответственно В конце наблюдений (VII пассаж) Ri для всех генотипов приближался к показателям в начале культивирования суспензионной культуры ( 1 пассаж) Это, вероятно, связано со способностью суспензионных клеток привыкать к условиям культивирования

Жизнеспособность и степень агрегированности суспензионной культуры моркови. Основными характеристиками любой суспензионной культуры являются: жизнеспособность и степень агрегированности. Эти показатели были так же определены для суспензионных культуры моркови трех генотипов ( 906, 805, Rondo ) на разных пассажах (I, IV,

Получено, что соотношение числа живых и мертвых клеток стабильная величина и составляет 9:1 (линия 906), 8:2 (линия 805) и 7:3 (сорт Rondo). Причем этот показатель не изменялся в процессе культивирования.

По агрегированности во всех суспензионных культурах были выделены три фракции: одиночные клетки, мелкие и крупные агрегаты. Установлено, что на I пассаже в суспензиях преобладали одиночные ■клетки, процент которых составлял 85-100%. На долю мелких агрегатов приходилось всего 15%, а крупные агрегаты отсутствовали вообще. Иная картина наблюдалась на более поздних пассажах. Так, на IV пассаже снижалась доля одиночных клеток (до 53-70%), а соотношение мелких и крупных агрегатов было близко к единице. На VII пассаже отмечалось дальнейшее снижение числа одиночных клеток в суспензии, но при этом возрастало число крупных агрегатов ( линия 906, сорт Rondo) (Рис. 2). Особо выделялась линия 805, для которой характерно присутствие одиночных клеток в суспензии при длительном ее «культивировании., . > .. .

Таким образом, полученные суспензионные культуры характеризовались высокой жизнеспособностью и мелкоагрегированностью, что является необходимым условием для проведения. последующих экспериментов по клеточной селекции. . - •

■ "Yl^ ' Г

„ ео М

70 ____

и лЛ

•HtIÍ

- ~ I пассаж IV пассаж VID пассаж

иомар пассажа

Рис. 2 Агрегированного» суспензионной культуры моркови на разных пассажах ( сорт Rondo).'

Раздел 2. ВЛИЯНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНОГО ФИЛЬТРАТА ГРИБА

■ одиночны« «пепси

■ мелкие »грогаы О крупные урагты

ALTERNARIA RADICINA НА ПРОРАСТАНИЕ СЕМЯН РАЗЛИЧНЫХ ГЕНОТИПОВ МОРКОВИ.

Интерес исследователей к фитотоксичным метаболитам патогенных грибов в последнее время возрос в связи с развитием нетрадиционных методов повышения устойчивости растений к возбудителям грибных болезней - клеточной селекции, где в качестве селектирующего агента в большинстве случаев используется культуральный фильтрат ( суммарный токсин) гриба Использование же неочищенного культурального фильтрата в клеточной селекции объясняется, с одной стороны, желанием исследователя охватить весь спектр фитотоксич-ных метаболитах, действующих на растение в естественных условиях, хотя в этом случае нельзя установить роль отдельных токсинов в патогенезе, поскольку неизвестен сам селектирующий агент. С другой стороны, в настоящее время нет доступных, хорошо растворимых в питательной среде культивирования индивидуальных токсинов Методы их выделения и очистки весьма трудоемки, связаны с многократным использованием органических растворителей и переосаждением и не исключает артефактов 2 1 Способы получения культурального фильтрата гриба Alternaría

radicina

Получение культурального фильтрата гриба Alternaría radicma осуществляли путем культивирования патогена в жидкой питательной среде. В качестве сред были использованы среды Мурасига и Скуга, а также Чапека. Учитываемым фактором служила оптическая плотность культурального фильтрата гриба, после фильтрования среды и освобождения ее от гифов патогена, которую определяли в динамике При выращивании гриба Alternaría radicma на разных питательных средах было обнаружено, что выделение токсинов в питательную среду происходило больше в случае использования среды Чапека (Рис 3)

9 14 19 23 30

наблюдения, дни

Рис. 3 Оптическая плотность культурального фильтрата гриба АНегпаНа га<Яс1пя, полученного на разных питательных средах

Как видно из рисунка 3, на 30-ый день культивирования патогена в питательной среде Чапека оптическая плотность культурального фильтрата составила 1,4 D , что в 7 раз выше по сравнению со средой Мурасига и Скуга. Следует отметить, что КФ гриба на среде Чапека имел характерную темно-коричневую окраску среды, что свидетельствовало о более высоком накоплении токсинов в фильтрате. Это в дальнейшем было доказано на семенах, проращиваемых на 100% хульту-ральном фильтрате, полученном на среде Чапека, В этом варианте наблюдалось максимальное ингибирование прорастания семян, по сравнению со средой МС. . - ^ . V .

Было замечено, что при длительном культивировании гриба Alternaría radicina в суспензионной культуре, агрессивность данного патогена уменьшалась. Это ие дает возможность проводить отбор клеток в более жестких селективных условиях с использованием неограниченно долгое время постоянно свежего фильтрата патогена. л . .

Для повышения агрессивности культурального фильтрата гриба Alternaría radicina, был апробирован способ совместного культивирования патогнена и каллусных/суспешионных клеток.

2.2.Влияние метаболитов гриба Alternaría radicina, полученными разными способами на прорастание семян моркови.

Кульгуральный фильтрат гриба,A. radicina был получен разными способами. Было изучено влияние автоклавированного и неавтоклави-рованного КФ гриба; автоклавированного и неавтоклавированного КФ, полученного при совмесном культивировании суспензионной культуры и патогена, а также долгохранящегося КФ при пониженной температуре на прорастание семян моркови трех генотипов (805,906, Rondo) (Табл.2,3). 7'. •

i- * '< - - • Таблица2 • . Нлннине кулыуралммгп фильтрат гриба Alternarla radicina, полученного разными способами, на прорастание семян моркови (линия 805) - ■ • : " _ (НСР„**8,73).__

Генотип ' . Всхожесть, % Длина проростков в % к контролю

КОНЦЕНТРАЦИЯ КУЛЬТУРАЛЬНОГО ФИЛЬТРАТА, % •

0 25 50 75 100 25. . 50 75 100

автоклав. КФ 86,0 79,0 74,0 72,0 71,0 114,0 85,8 75,0 57Д

автоклавиров. КФ+ каллус 86,0 72,0 67,0 51,0 45,0 85,8 , 60,8. 53,7. 43,0

неавтоклав.КФ 86,0 87,0 70,0 67,0 61,0 125,0 92,9 67,9 59,3

неавтоклав. КФ+ каллус 86,0 74,0 41,0. 24,0 23,0 100 46,5 31,8 29,0

Проведенные эксперименты позволили выявить некоторые закономерности в токсичности КФ по прорастанию семян, полученного разными способами. Так, при использовании в работе неавтоклавиро-ванного КФ гриба, всхожесть семян уменьшалась по сравнению с использованием автоклавированного фильтрата. В случае применения КФ гриба A radicina, полученного при совместном культивировании патогена и суспензии клеток, то его существенное ингибирующее действие проявлялось уже при концентрации 50%.

В случае использования КФ в низких концентрациях (25%), был отмечен некоторый стимулирующий эффект ростовых процессов Так, для сорта Rondo и линии 805 в этом варианте средняя длина проростков была выше по отношению к контролю в среднем на 12-25% Для линии 906 этот показатель в данном варианте находился на уровне контроля Аналогичные результаты были получены на пшенице при работе с патогенными грибами Bipolans sorokimana, Fusanum ох-ysporum, а также Septana nodorum Возможно, среди метаболитов гриба в КФ могут присутствовать и различные фитогормоны.

Показано, что токсичное действие КФ не снижалось по мере хранения его в холодильнике по сравнению с контролем ( Табл. 3)

Таким образом, установлено, что при проведении работ по отбору устойчивых клеток или растений к патогенным грибам, целесообразно использовать в качестве селективного фактора автоклавированного или неавтоклавированного КФ, агрессивность которых можно сохранять путем совместного культивирования патогена и клеточных культур

Таблица 3

Влияние культуралъного фильтрата гриба Alternarla radlcina, хранившемся в течение 60 дней при пониженных температурах, на прорастание семян

моркови (НСРИ ■= 6.46).

Генотип Всхожесть, % Длина проростков в % к контролю

КОНЦЕНТРАЦИЯ КУЛЬТУРАЛЬНОГО ФИЛЬТРАТА, %

0 25 50 75 100 25 50 75 100

906 89,0 83,0 83,0 79,0 77,0 96,5 75.8 60,7 46,7

805 86,0 80,0 78,0 75,0 65.0 92.8 92,8 85,7 67,9

Rondo 87.0 71,0 57,0 55,0 51.0 84,0 80,0 76.0 32.0

Раздел 3. КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ МОРКОВИ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ПАТОГЕНУ Alternaría radlcina З I Влияние фитотоксичных метаболитов патогенного гриба

А radlc^na на рост суспензионной культуры моркови Для дополнительного доказательства большей токсичности КФ, полученного на разных питательных средах, был проведен опыт с суспензионной культурой моркови В жидкую питательную среду культу-

ральный фильтрат гриба добавляли в концентрациях 10%, 20%, 30%, 40%, 50% Результаты исследований представлены на рисунках 4, 5, б, из которых следует, что для всех изучаемых генотипов характерна общая закономерность в поведении клеток суспензии в стрессовых условиях. Так, с увеличением концентрации КФ в питательной среде уменьшался ростовой индекс Однако следует отметить, что при концентрации фильтрата 10% (полученного на среде МС) и 20% (полученного на среде Чапека) заметно повышался ростовой индекс по сравнению с контролем Вероятно, что культуральный фильтрат в малых концентрациях стимулировал ростовые процессы Полученные данные полностью совпадают с ранее полученными нами результатами по стимулирующему эффекту низких концентраций КФ на прорастание семян Повышенные концентрации КФ гриба ( 50% ) в питательной среде снижали ростовой индекс в 3 раза по сравнению с контролем в случае использования фильтрата, полученного на среде Чапека и находился на уровне контроля в случае использования среды МС. Это еще раз подтверждает, что культуральный фильтрат, полученный на среде Чапека содержит больше токсинов, которые ингибируют рост и деление клеток Из всех изучаемых генотипов наиболее ярко выделялся сорт Rondo, для которого ростовой индекс выше по сравнению с другими генотипами Последующая работа по клеточной селекции проводилась только с КФ гриба, полученного на среде Чапека

-КОНТРОЛЬ I

. I ■ сред* Малек»

29 30 40 50 I I

среда Мурасмга-1 Концентрация КФ % Í Скуга ¡

Рис. 4 Ростовой индекс суспензионной культуры моркови ( сорт Rondo), культивируемой в присутствии КФ гриба A. radlcin»

-контроль

,' ; J.

-среда Чапека

• _ сред* Мураснга-Скугв

" Концантрвцмя КФ, Ч .

Рис. S Ростовой индекс суспензионной культуры моркови, (линия. 805), культивируемой в присутствии КФ гриба A. radlcina

-контроль

- члдр Чапека

- • - среда Мурасига-Скуга

Концентрация КФ, %

Рис. 6 Ростовой индекс суспензионной культуры моркови (линия 906), культивируемой в присутствии КФ гриба А. га<Нс!п»

В дальнейшей работе было изучено поведение клеток суспензии моркови в присутствии культурального фильтрата в течение селекционного процесса.. , .

Исходя из полученных данных следует отметить, что для всех изучаемых генотипов характерны некоторые закономерности в поведении клеток суспензии моркови, в присутствии различных концентраций КФ в питательной среде. Так, с увеличением содержания КФ в среде < снижался ростовой индекс во всех вариантах в 2-3 по сравнению с контролем. Но при изучении этого показателя в динамике установлено, что на VII пассаже селекции Ш увеличивался по сравнению с предыдущими пассажами, но все таки оставался ниже контроля. Вероятно

это связано с привыканием клеток к стрессовым условиям и появления большого числа жизнеспособных клеточных агрегатов

Показано, что у линии 906 Ri на всех концентрациях фильтрата был снижен в 3 раза, а у линий 805 и сорта Rondo - в 2 раза Из этого следует, что клеточную селекцию линии 906 целесообразно проводить при более низких концентрациях культурального фильтрата (20 - 30%), так как более высокие приводят к значительному угнетению ростовых процессов, что не дает возможность проведения более длительной клеточной селекции

Для более полной характеристики поведения клеток в стрессовых условиях была определена жизнеспособность суспензии. Культу-ральный фильтрат использовали в концентрациях 30%, 40%, 50%, так как более низкие концентрации не приводили к гибели клеток суспензии С увеличением концентрации КФ в питательной среде снижалась жизнеспособность суспензионной культуры и при концентрации 50% этот показатель имел значение 25-40% Следует отметить, что независимо от концентрации КФ в среде отмечалось изменение числа живых клеток в зависимости от времени культивирования суспензионной культуры Снижение числа живых клеток отмечалось на IV пассаже и увеличение этого показателя при последующем культивировании клеток в стрессовых условиях Эти закономерности были характерны для всех 3-х генотипов. Это еще раз подтверждает наше предположение об адаптации клеток к условиям культивирования в присутствии метаболитов гриба A. radicma

Суспензия в стрессовых условиях была нами так же охарактеризована по степени агрегированности Определено, что на ранних этапах культивирования ( I пассаж), суспензионная культура состояла из одиночных клеток ( 60-80%) и мелких агрегатов ( 20-30%). Фракция крупных агрегатов на этом этапе была отмечена лишь для линии 805 и составляла 20-25% ( Табл 4), При дальнейшем культивированием клеточных суспензий в стрессовых условиях отмечалось снижение доли оди

Таблица 4

Агрегированность (%) суспензионных культур различных генотипов моркови, культивируемых в стрессовых условиях (присутствие культурального фильтрата гриба в различных концентрациях).

Агрегированность суспензии ( пассаж IV пассаж VIII пассаж

30% | 40% ( 50% 30% | 40% | 50% 30% | 40% j 50%

линия 906

одиночные клетки 70 68 80 41 29 75 43 21 64

мелкие агрегаты 30 32 20 20 12 25 10 19 9

крупные агрегаты 0 | 0 | 0 . | 39 | . 59 0 47 | 66 | 27

сорт Rondo •

одиночные клетки 70 41 69 24 39 66 И 12 50

мелкие агрегаты 30 44 31 46 18 20 24 11 5

крупные агрегаты 0 15 0 30 43 14 65 77 45

линия805 •

одиночные клетки 66 .60 74 36 33 . 44 28 15 43

мелкие агрегаты 4 15 26 24 42 21 18 29 29

крупные агрегаты 20 25 0 40 25 35 54 . 56 28

ночных клеток и мелких агрегатов и увеличение крупных агрегатов, процентное число которых составляло 50 и более процентов. Такое состояние клеток в стрессовых условиях было характерно для всех изученных нами генотипов моркови. Следует предположить, что появление крупных агрегатов в суспензии зависит от присутствия в питательной среде не только метаболитов гриба А. гасПста, но и таких гормонов как АБК. Можно предположить, что крупные агрегаты, полученные нами в работе являются предшествующей стадией соматического эмбриогенеза.

3.2. Получение растений-регенерантов моркови после • ' '- клеточной селекции.

После клеточной селекции суспензию клеток платировали в агар с целью получения каллусной ткани, из которой необходимо регенерировать растения. Морфогенез добивались на питательных средах, содержащих различные физиологически активные вещества: БАП, зеатин, 21р, эпин. Показано, что все изучаемые вещества способны стимулировать образование соматических эмбриоидов и во всех вариантах были получены растения-регенеранты (Табл. 5). Следует отметить, что процесс регенерации зависел от применяемого вещества. ■ * ' Установлено, что при добавлении в питательную среду БАП • начало морфогенеза отмечалось через 8-9 месяцев после платирования суспензии в агар, при добавлении Ир ~ через 3 месяца, а при добавлении зеатина или эпина - через I месяц. Это было характерно только д ля суспензии, которая прошла цикл селекции, так как в контрольном вари

Таблица 5

Эффективность применения разных физиологически активных веществ для получения растений-регенерантов после платирования (НСРИ » 5,1).

Генотип - Вариант Начало морфогенеза (№ пассажа) ' Морфогенный каллус, %

■■"> ; - контроль селекция контроль селекция

Г 9 , 43 22

Rondo 2 1 3 79 65

3 I 2 75 43

4 1 9 96 93

1 1 8 98 46

906 2 1 3 88 66

3 1 9 90 63

4 і 9 69 59

Примечание 1 - БАЛ, НУК, 2 - 2ір, 3 - зеатин; 4- эпин

анте морфогенез начинался уже на первом месяце культивирования клеточных колоний после платирования.

Для формирования полноценных растений, соматические эмбрио-иды были перенесены в пробирки на жидкую питательную среду. В этих условиях выращивания наблюдался рост побегов, формирование листьев и корней В таблице 6 представлены данные о числе полученных растений-регенерантов после клеточной селекции.

Таблица б

Число растений-регенерантов моркови, полученных после

клеточной селекпии.

Генотип Схема селекции Число растений.шт

906 3(30% КФ) (0 КФ) 4 (30% КФ) 50

3(40% КФ) (0 КФ) 4 (40% КФ) 14

3(50% КФ) (0 КФ) 4 (50% КФ) 10

Rondo 3(30% КФ) (0 КФ) 4 (30% КФ) 25

3(40% КФ) (0 КФ) 4 (40% КФ) 10

3(50% КФ) (0 КФ) 4 (50% КФ) 5

Раздел 4 СОДЕРЖАНИЕ РАСТВОРИМЫХ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК МОРКОВИ, РАСТЕНИЙ-

РЕГБНЕРАНТАХ И В ИНТАКТНЫХ РАСТЕНИЯХ. Известно, что устойчивость растений к поражению тем или иным патогеном часто корреяируется с высоким содержанием фенсшь-ных соединений. Было определено суммарное содержание растворимых фенольных соединений в течение селекционного процесса суспензии моркови на I, IV, VII пассажах, в растениях-регенерантах и в ин-тактных растениях m vivo (Табл 7,8 )

Таблица 7

Суммарное содержание растворимых фенольных соединений в суспензнон-ной культуре моркови в процессе клеточной селекции (НСРМ » 0,05)._

Генотип Вариант 1 пассаж IV пассаж VII пассаж

Rondo контроль 0,230 0,176 0,100

25% КФ 0,196 0.176 0,192

50% КФ 0,180 0,168 0,550

контроль 0,172 0,179 0,180

906 25% КФ 0,165 0,345 0,400

50% КФ 0,100 0,110 0,090

.' " Таблица 8 Суммарное содержание растворимых фенольных соединений в интактных ..... растениях моркови (НСРМ - 0,1).

Вариант Генотип беї КФ с КФ ( 100%)

Растения из 906 0,360 0,581

семян т vivo Rondo 0,540 0,605

Растения-реге 906 0,820 1,481

неранты m vitro Rondo 0,900 1,720

Установлены различия в содержании фенольних соединений в клеточных суспензиях в процессе их культивирования в нормальных и стрессовых условиях. Для сорта Rondo в конце селекции ( VII пассаж 50% КФ) содержание фенольных соединений в 5 раз больше по сравнению с контролем, а для линии 906 - на уровне контроля. В то время , как у растений-регенерантов этот показатель выше контроля в 2 раза. .

Одномерная хроматография показала различия в качественном составе фенолов у растений in vitro и in vivo. Так, у растений, полученных из семян на КФ и без него обнаружено 1 -3 фенольных соединений, . а у растений-регенерантов - 2-6. Эти различия свидетельствуют об из- : менениях в их фенольном метаболизме, что является, по-видимому, следствием клеточной селекции. ~ ~ і . - - . ,

„ Выводы.

1. Впервые разработана, методика и проведена клеточная селекция моркови на устойчивость к грибу Alternaría radicina, в результате которой получены устойчивые клеточные линии и растения-регенеранты. ...

2. Показано, что различные генотипы моркови характеризуются неодинаковой интенсивностью формировть каллусную ткань и имеют различия в продолжительности фаз ростового цикла суспензионной культуры. Генотипы 6700, 225, Rondo характеризуются близкими показателями.

3. Для проведения клеточной селекции моркови на устойчивость к па-тагену Alternaría radicina целесообразно использовать культураль-ный фильтрат данного гриба, полученного на среде Чапека в концентрации 30-50%. Установлено, что на среде Чапека выделение токсичных метаболитов гриба в 7 раз выше по сравнению со средой Мурасига и Скуга. ■ ; .

4. Для поддержания агрессивности патогенного гриба Alternaría radicina, при длительном его культивировании, целесообразно проводить совместное выращивание данного патогена и каллусной или суспензионной культур моркови

5 Изучение поведения клеток суспензионной культуры различных генотипов моркови в нормальных и стрессовых условиях, а процессе культивирования, выявило некоторые сходства и различия по жизнеспособности клеточных популяций, степень агрегированное™ и ростовому индексу суспензионных культур Показано, что повышение концентрации культурального фильтрата в питательной среде и длительное культивирование клеточных суспензий в стрессовых условиях приводит к снижению всех учитываемых показателей

6 Выяснены различия в содержании фенольных соединений у растений m vivo и in vitro, а также в клеточных суспензиях, культивируемых в нормальных и стрессовых условиях У интактных растениях количество этих веществ ниже, чем у растений-регенерантов, что свидетельствует об изменениях в их фенольном метаболизме, являющемся, по-видимому, следствием клеточной селекции

7 Установлено, что использование эпина для морфогенеза каллусной ткани моркови после клеточной селекции, приводит к быстрому получению высокого числа морфогенных структур, которые способны в дальнейшем развиваться в нормальные растения-регенеранты.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1 Намбудри Н., Раскалиева В А., Калашникова Е.А. Клеточная селекция моркови на устойчивость к апьтернариозу // Тез I Международ конф «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва 1096

2 Калашникова Е А , Намбудри Н , Раскалиева В А. Использование методов биотехнологии в клеточной селекции моркови на устойчивость к альтернариозу // Известия ТСХА. 1996 вып. 4. с. 163-165

3 Raskalieva V А , Kalashmkova Е A Morfogénesis of cerrot in vi tro7/ Congress on « In vitro biology» USA 1997 / Hot topics P. 17.

4 Раскалиева В А , Калашникова Е А. Использованием методов биотехнологии в селекции моркови на устойчивость к альтернариозу. // Тез Междунар. конф «Молекулярная генетика и биотехнология» Минск 1998 с. 251-252

5. Раскалиева В А, Калашникова Е А Влияние культурального фильтрата гриба Alternaría radícula на суспензионную культуру моркови // Тез II Международ конф «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва 2000

6. Kalashnikova E.A., Raskalieva B.A. Influence cultural filtrate of fungi Alternaría radicina on cell suspension of carrotsy/Viet Nam « International Workshop on Biology». 2001.

Объем печ л

Зак ЗЛҐ

Тираж 100 экз

АНО «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул Тимирязевская, 44

I

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Раскалиева, Велина Абдрахмановна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Литературный обзор.

1.1 .Вредоностность возбудителя черной гнили - Alternaria radicina.

1.1.1. Внешние симптомы альтернариоза.

1.1.2.Эколого-генетические особенности проявления устойчивости моркови к альтернариозу.

1.2.Физиолого-биохимические реакции корнеплодов моркови на ранних этапах заражения.

1.2.1 .Изменение активности NADPH-оксидазной и пероксидазной функции пероксидазы.л.;^Ц./.41',^.'.

1.2.2. Динамика активности каталазы при заражении корнеплодов моркови на протяжении периода хранения.

1.2.3.Изменение уровня перекисного окисления липидов.

1.2.4.Активность глутатион редуктазы при заражении моркови возбудителем Альтернариоза.

1.2.5. Фенольные соединения при поражении растений патогенами.

1.3.Клеточная селекция растений.

1.3.1.Использование патогенов в клеточной селекции растений на устойчивость к болезням.

1.3.2.Селекция растений к патотоксинам.

1.4.Клеточная и тканевая селекция растений на устойчивость к альтернариозу в условиях in vitro.

ГЛАВА 2. Материал и методы исследований.

2.1. Характеристика исходного объекта.

2.2. Методы исследований.

ГЛАВА 3 ОСОБЕННОСТИ КАЛЛУСОГЕНЕЗА

И МОРФОГЕНЕЗА В КУЛЬТУРЕ ТКАНИ МОРКОВИ.

3.1. Зависимость каллусогенеза от генотипа и первичного экспланта.

3.2.1. Фазы ростового цикла.

3.2.2. Ростовой индекс.

3.2.3. Жизнеспособность и агрегированность суспензионной культуры моркови.

ГЛАВА 4. Влияние культурального фильтрата гриба Aiternaria radicina на прорастание семян различных генотипов моркови.

4.1. Способы получения культурального фильтрата гриба Aiternaria radicina.

4.2.Влияние метаболитов гриба Aiternaria radicina, полученных разными спсобами, на прорастание семян моркови.

ГЛАВА 5. Клеточная селекция моркови на устойчивость к патогену Aiternaria radicina.

5.1. Влияние метаболитов патогенного гриба Aiternaria radicina на рост суспензионной культуры моркови.

5.2.Получение растений-регенерантов моркови после клеточной селекции.

ГЛАВА 6. Содержание фенольных соединений в суспензионной культуре, растениях-регенерантах и интактных растениях моркови.

6.1. Суспензионная культура.

6.2. Растения-регенераты и интактные растения.

6.3. Качественный состав фенольных соединений в растениях in vitro и in vivo.

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование методов биотехнологии в получении исходных форм моркови, устойчивых к патогенному грибу Alternaria radicina M., Dr. Et E."

Потери урожая корнеплодов и семян столовой моркови от грибных, бактериальных и вирусных заболеваний во время хранения маточников и выращивания семенников нередко составляют 30-60%, а иногда и 100%. Существенный ущерб культуре моркови, особенно в системе семеноводства, наносит альтернариоз и фомоз.

Alternaria radicina (черная гниль) - наиболее распространенный и опасный патоген у моркови. Заражение им обычно происходит при ослаблении тканей растений, особенно в дождливую осень при несколько повышенной температуре. Гриб вызывает мацерацию тканей и проявляется в побурении нижней части стебля, листовой пластинки, соцветия и семян в процессе онтогенеза растений, а также корнеплодов при их хранении. Источником инфекции черной гнили могут служить зараженные семена, остатки пораженных растений и пораженные корнеплоды, высаженные в почву на семенники.

Наиболее радикальным средством защиты растений от фитопатогенов является создание устойчивых форм, а в дальнейшем и получение сортов. Однако для корнеплодов этот процесс требует больших временных затрат, поскольку для получения семян требуется два вегетационных периода.

В настоящее время биотехнология располагает методами, в частности культуры изолированных клеток, тканей и органов растений, позволяющими сократить срок проведения селекции и снизить экономические затраты ручного труда. В этом направлении ведущее место занимает клеточная селекция, при которой в условиях in vitro проводят отбор клеточных популяций, устойчивых к селективному фактору, и затем регенерируют целые растения. На сегодняшний момент в этом направлении достигнуты значительные результаты. Например, созданы линии картофеля, устойчивые к фитофторозу (45), томаты -альтернариозу (1), пшеница - септориозу (48), рис - пирикуляриозу (17) и др. Исследования по клеточной селекции моркови на устойчивость к альтернариозу малочисленны и носят пока поисковый характер. Поэтому изучение влияния биотических факторов на рост клеток моркови и селекция устойчивых к болезням клеточных линий с последующей регенерацией измененных растений имеет как теоретическое, так и практическое значение.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение особенностей ответа клеточных популяций моркови на присутствие культурального фильтрата гриба Alternaria radicina в питательной среде. Разработать методику и провести клеточную селекцию по получению растений-регенерантов, устойчивых к данному патогену.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: получить хорошо пролиферирующую каллусную ткань и суспензионную культуру различных генотипов моркови; подобрать оптимальные условия выращивания гриба Alternaria radicina, получить кулмуральный фильтрат патогена и определить его действие на прорастание семян; изучить поведение клеточных популяций различных генотипов моркови в нормальных и стрессовых условиях культивирования; разработать и провести клеточную селекцию моркови, отобрать клеточные линии, устойчивые к культуральному фильтрату гриба Alternaria radicina; изучить образование фенольных соединений в суспензионных культурах моркови в различных условиях их культивирования и растениях, полученных in vitro и in vivo; получить растения-регенеранты и провести их оценку по устойчивости к грибу Alternaria radicina.

Научная новизна. Впервые разработана методика и проведена клеточная селекция моркови на устойчивость к грибу Alternaria radicina. Показано, что в качестве селективного фактора можно использовать культуральный фильтрат гриба Alternaria radicina в концентрациях 3050%, полученного с использованием различных методических подходов. Установлено, что при совместном культивировании патогена и каллусной ткани в жидкой питательной среде, значительно повышается агрессивность патогена, что приводит к увеличению токсичности культурального фильтрата гриба Alternaria radicina. Показано, что долговременное хранение стерильного культур ального фильтрата патогена, при пониженных температурах, не снижает его токсическое действие. Установлено, что использование эпина в питательной среде значительно повышает морфогенетический потенциал каллусной ткани, по сравнению с часто используемыми в культуре ткани цитокининами -БАЛ и 2ip. Впервые охарактеризовав клеточные суспензии различных генотипов моркови, культивируемых в присутствии биотического селективного фактора. Выяснены различия в содержании фенольных соединений в растениях in vitro и in vivo, а также в клеточных суспензиях в процессе их культивирования в нормальных и стрессовых условиях. Впервые получены клеточные линии и растения-регенеранты моркови, устойчивые к патогену A. radicina.

Практическая значимость. Предложенная и разработанная технология получения растений, устойчивых к биотеческим факторам, в частности моркови к патогену Alternaria radicina, может быть применена и для других сельскохозяйственных культур. Полученные в результате исследований устойчивые формы моркови могут служить основой для создания новых сортов, обладающих повышенной устойчивостью к 8 альтернариозу, что позволит сократить потери урожая от воздействия данного патогена.

Апробация работы. Полученные результаты докладывались и обсуждались на VII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда» (Москва, 1998), на симпозиуме в Вашингтоне « In vitro in Biology» (1998), на Международной конференции «Молекулярная генетика и биотехнология» ( Минск, 1998), на II Международной конференции «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2000), на Международных конференциях «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 1999, 2001), на научной конференции МСХА (Москва, 2000), а также на заседании кафедры сельскохозяйственной биотехнологии МСХА им К. А. Тимирязева.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Раскалиева, Велина Абдрахмановна

Выводы.

1. Впервые разработана методика и проведена клеточная селекция моркови на устойчивость к грибу Alternaria radicina, в результате которой получены устойчивые клеточные линии и растения-регенераты.

2. Показано, что различные генотипы моркови характеризуются неодинаковой интенсивностью формировать каллусную ткань и имеют различия в продолжительности фаз ростового цикла суспензионной культуры. Генотипы 6700, 225, Rondo характеризуются близкими показателями.

3. Для проведения клеточной селекции моркови на устойчивость к патагену Alternaria radicina целесообразно использовать культуральный фильтрат данного гриба, полученного на среде Чапека в концентрации 30-50%. Установлено, что на среде Чапека выделение токсичных метаболитов гриба в 7 раз выше по сравнению со средой Мурасига и Скуга.

4. Для поддержания агрессивности патогенного гриба Alternaria radicina, при длительном его культивировании, целесообразно проводить совместное выращивание данного патогена и каллусной или суспензионной культур моркови.

5. Изучение поведения клеток суспензионной культуры различных генотипов моркови в нормальных и стрессовых условиях, в процессе культивирования, выявило некоторые сходства и различия по жизнеспособности клеточных популяций, степени агрегированности и ростовому индексу суспензионных культур. Показано, что повышение концентрации культурального фильтрата в питательной среде и длительное культивирование

75 клеточных суспензий в стрессовых условиях приводит к снижению всех учитываемых показателей.

6. Выявлены различия в содержании фенольных соединений у растений in vivo и in vitro, а также в клеточных суспензиях, культивируемых в нормальных и стрессовых условиях. У интактных растениях колличество этих веществ ниже, чем у растений-регенерантов, что свидетельствует об изменениях в их фенольном метаболизме, являющемся, по-видимому, следствием клеточной селекции.

7. Установлено, что использование эпина для морфогенеза каллусной ткани моркови после клеточной селекции, приводит к быстрому получению высокого числа морфогенных структур, которые способны в дальнейшем развиваться в нормальные растения-регенеранты.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Раскалиева, Велина Абдрахмановна, Москва

1. Аврова А.О. Физиолого-биохимические особенности взаимодействия томатов с Aiternaria solani и селекция in vitro на устойчивость к альтернариозу// Автореф. диссерт. к.б.н., ВИЗР, 1994, 18 с.

2. Апарцин М.С., Саксонов М.Н., Стом Д.Н. К вопросу о механизме действия пирокатехина и п-бензохинона на клетки кителл// Докл. АН СССР, 1979, т. 244, № 2, с. 510.

3. Байтматова Б.К. Культурально-морфологические особенности некоторых видов рода Aiternaria Nees.// Автореф. диссерт. к.б.н., Алма-Ата, 1972, 18 с.

4. Белякова Г.А., Ермолинский Б.С., Свиридов С.И. и др. Токсичность КФ грибов, вызывающих пятнистость на хлопчатнике.// Вестник Московского ун-та, сер. № 16, 1991, № 4, с.56-61.

5. Берестецкий О.А Определение фитотоксичной активности культур микросеопических грибов. // В кн.: Методы экспериментальной микологии. Киев, 1973, с. 165-175.

6. Биотехнология растений: культура клеток / Под редакцией Р.Г.Бутенко. М.:Агропромиздат, 1989.

7. Бутенко Р.Г., Гусев М.В., Киркин А.Ф. и др. Клеточная инженерия, Биотехнология, 3 книга, М.: Высшая школа, 1987, 128 с.

8. Бутенко Р.Г. Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986.

9. Винцунас Т.С. Полевая устойчивость подвидов и разновидностей моркови к грибным болезням.// Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции, 1980, т. 66, вып. 2, с. 84-90.

10. Генетические основы селекции растений на иммунитет. М. .Наука, 1973.

11. Германович С.Т. Отбор клеточных линий клевера лугового, устойчивых к КФ Fusarium oxysporum.// Материалы конф. Молодых ученых и аспирантов «Новые идеи в растениеводстве, и пути их реализации», М., 1991, с. 90-91.

12. Гирко В.С., Волощук К.Г., Оценка устойчивости к действию КФ грибного патогена в культуре незрелых зародышей.// С.-х. биология, сер. Биология растений, 1993, № 9, с. 62-70.

13. Гришкова В.П., Виневцев B.C., Хандобики JI.M. Физиологическая роль ряда фенольных соединений, образующихся в тканях моркови под воздействием гриба Phoma rostrupil.// Научные доклады высш. Биол. школы, 1984, №6, с. 63-67.

14. Гумбатова Р.И., Раджабова А.А. Синтез липидов Alternaria.// Известия АН Аз СССР, сер. Биол. наук., 1988, №5, с. 117-122.

15. Гумбатова Р.И., Раджабова А.А. Синтез липидов грибами Alternaria.// Известия АН Аз СССР, Сер. Биол. наук, 1989.

16. Данлади Дада Кута Маркеры сортовой устойчивости к пирикуляриозу в каллусной культуре риса./ Автореф. диссерт. к.б.н., М., 2000, 21 с.

17. Дементьева М.И., Выгонский М.И. Болезни овощей, плодов и картофеля при хранении. М.: В.О.Агропромиздат, 1988, 231 с.

18. Дмитриев А.П., Ковтун А.В. Роль конститутивных фенольных веществ лука в устойчивости к патогенам.// Физиология и биохимия культурных растений, 1988, т, 20, № 9, с. 29-34.

19. Дорожкин Н.А., Соколов Л.И. Черная гниль моркови и борьба с ней сельского хозяйства Белоруссии. 1985, № 12, с. 24.

20. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта ( с основами статистической обработки результатов исследований ). М.:Агропромиздат, 1985, 351 с.

21. Дьяков Ю.Г. Физиолого-биохимические механизмы устойчивости растений к грибным болезням.// Итоги науки и техники, сер. Защита растений, ВИНИТИ, т. 3, 1983.

22. Дорожкин Н.Л., Соколова JI.H. Возбудители черной гнили./ В кн. «Интегр. Система защиты урожая с/х культур от вредных организмов», Воронех, 1983, с. 23-24.

23. Жук И.П.,Рассока С.Н. Регенерация и отбор соматических клонов томата на устойчивость к ВТМ.// Докл. РАСХН, 1992, № 11-12, с. 18-21.

24. Жук И.П. Устойчивость соматических клонов томата к вирусу табачной мозаики.// Микробиол. Журнал, 1993, т.55, № 6, с. 41-46.

25. Закиян JI. Грибы из рода Alternaria и Stemphylium в Армении и некоторые их биологические особенности./ Автореф. диссертации к.б.н., Ереван, 1982, с.20.

26. Запрометов М.Н. Образование и функции фенольных соединений в высших растениях.// Журнал общей биохимии, 1970, т.31,№ 2, с. 170-198.

27. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. М.:Высшая школа, 1974, 214 с.

28. Запрометов М.Н. Фенольные соединения растений: биосинтез, превращения и функции.// Новые направления в физиологии растений, м.:Наука, 1985, с. 143-162.

29. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях. М.:Наука, 1993, 272 с.

30. Запрометов М.Н. Специализированные функции фенольных соединений в растениях.// Физиол. Раст., 1993, т. 46, с. 291.

31. Запрометов М.Н. Фенольные соединения и их роль в жизни растения. М,-.Наука, 1996,45 с.

32. Иванова Н.Г. Разработка селективного фактора для проведения клеточной селекции на устойчивость к Corynebanium sepedorium.// Использование клеточной технологии в селекции картофеля, М., 1987, с. 26-28.

33. Иванова О.С. Клеточная селекция на инфекционном фоне для получения фузариозоустойчивых форм томатов.// Материалы Всесоюз. Конф. По с/х биотехнологии, Целиноград, 1991, с. 97-98.

34. Иванюк В.Т., Свиридов А.В. Виды родов Alternaria и Stemfhilium возбудителей болезней моркови в Беларуссии.// Науч. доки, высш. шк. библ. Науки, 1989, № 5, с. 72-74.

35. Иванюк В.Т., Свиридов А.В. Особенности культивирования Phoma rostrupii и Alternaria radicina возбудителей серых гнилей моркови.// Микология и фитопатология, 1988, т,22, вып. 2, с. 553-560.

36. Иванюк В.Т., Свиридов А.В. Бурая пятнистость листьев моркови.// Изв. АН БССР, сер. С/х наук, 1990, 3 9 с. 66-80.

37. Исееков В.П. О патогенных свойствах грибов рода Alternaria на интодуцентах в Крыму.// Бюлл. Гл. Бот. Сада, 1991, вып. 159, с. 81-85.

38. Казакова А.С., Логашев Ю.Е. Изучение фенольных соединений в кульутре ткани сорго всвязи с проблемами клеточной селекции.// Тез. докл. Конф. « Применение биотехнологий в животноводстве, растениеводстве и ветеринарной медецине», М., 1988, с. 207-208.

39. Калинин Ф.Л. и др. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев: Наукова думка, 1980.

40. Кирай 3., Клемент 3. Методы фитопатологии. М.:Колос, 1974.

41. Кононенко Т.П., Поправко С.А., Соколова С.А. Бисинтез и превращения птерокарианов и изофлаванов при взаимодействии бобовых растений с паразитическими грибами.// Обзор.- Прикладная биохимия и микробиология, 1984, т. 20, вып. 6, сс. 723-732.

42. Кошникович В.И. Вредоностностъ и некоторые биологичсекие особенности возбудителя черной гнили моркови в Новосибирской области. В кн.: Вредители и болезни культурных растений. Новосибирск, 1981, с. 49-57.

43. Кукушина JI.H., Дорошенко А.А. Изучение о оценки регенерантов картофеля по устойчивости к фитофторе in vivo и in vitrro.// Использование клеточных технологий в селекции картофеля. М., 1987, с. 52-56.

44. Купрашвили Т.Д. Выявление микрофлоры культурных зонтичных растений и изучение биоэкологии гриба -возбудителя черной пятнистости моркови в Грузии./ Автореф. диссерт. к.б.н.,Тбилиси, 1973,21 с.

45. Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии. Методические указания.М.:МСХА, 1996, 90 с.

46. Лети Джое Получение форм пшеницы ( Triticum aestivum) устойчивых к грибу Srptoria nodorum в условиях in vitro./ Автореф. диссерт. к.б.н., М., 1998, 22 с.

47. Лети Джое, Калашникова Е.А. Влияние гриба S. Nodorum и его метаболитов на прорастание семян пшеницы.// Известия ТСХА, 1996, вып. 4, с. 150-155.

48. Лихачев А.Н. Использование жидких питательных сред для получения моноспоровых культур грибов.// Микология и фитопатология, 1994, т. 28, вып. 5, с. 14-16.

49. Лопухина Т.П., Сычева Л.В. Устойчивость моркови к возбудителю черной гнили./ В кн. Интегр. Система защиты урожая с/х культур от вредных организмов. Воронеж, 1983, с. 23-27.

50. Лукьянюк С.Ф., Овсюк Т.Н. Методы in vitro для отбора люцерны на фузариозоустойчивость.// Методы биотехнологии в селекции с/х растений. Одесса, 1992, с. 39-48.

51. Магди Гад Аль-Раб К созданию селективных питательных сред на основе КФ Alternaria solani.// Защита растений от вредителей и болезней в условиях экологидизации с/ производства, Сп.б., 1992, с.63-66.

52. Максимов В.Н., Многофакторный эксперимент в биологии, М.:МГУ, 1980, 150 с.

53. Манешина Т.В., Обухович Е.М., Курицова Н.А. Отбор токсиноостойчивых каллусов в культуре зародышей ячменя.//Междун. Конф. Клеток и биотехнология. Тез. докл., Новосибирск, 1988, ч. 1, с. 179.

54. Маруненко И.М., Кучко А.А. и др. Клеточная селекция картофеля на устойчивость к патогенам.// Междунар. Конф. «Биология культивируемых клеток и биотехнология», Новосибирск, 1988, ч. 1, е. 169.

55. Маруненко И.М. и др, Отбор генотипов, устойчивых к мокрым гнилям картофеля, методами клеточной селекции.// Создание и использование исходного материала в селекции картофеля, Киев, 1992, с. 62-70.

56. Масленников С.Е. Методы культуры каллусов и клеток в создании форм люцерны, устойчивых к фузариозу./ Автореф. диссертации к.б.н., М.:ТСХА, 1994, 15 с.

57. Масленников С.Е. Получение устойчивых к корневым гнилям растений люцерны с использованием методов культуры каллусов и клеток.// Соврем. Достижения биотехнологии. Ставрополь, 1995, с. 24-25.

58. Мезенцева О.Н. Получение клеточных линий пшеницы, устойчивых к токсинам фузариоза.// Доклвды научно-практич. Конф. «Ученые Нечерноземья развитию сельского хозяйства», М., 1991, с. 179-183.

59. Метлицкий Л.В., Озерецковская О.Л. Фитоалексины. М.:Наука, 1973.

60. Метлицкий Л.В. Иммунологический контроль в жизни растений.// 45-е Тимирязевские чтения. М.:Наука, 1987.

61. Метлицкий Л.В. Фитоиммунитеты, молекулярные механизмы.// 31-е Баховские чтения. М.:Наука, 1976.

62. Методы клеточной инженерии растений.// Под редакцией МомотВ.П., Киев, 1988.

63. Минаева В.Г. Флавоноиды в онтогенезе растений и их практическое использование. Новосибирск:Наука, 1978, 225 с.

64. Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Прокофьев М.И. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. М.:Агропромиздат, 1990,384 с.

65. Мохамед Али-Абдельхамед Али Физиологические изменения в культуре клеток моркови при соматическом эмбриогенезе./ Автореферат диссерт. к.б.н., М., 1997, 18 с.

66. Никуленко Т.Р. Токсины фитопатологических грибов и их роль в развитии растений. М.:Агропромиздат, 1987.

67. Нгуен Хонг Минь Селекция in vitro на устойчивость к Fusarium oxysporum f. Sp. Lycopersici у томатов./ Автореферат диссерт., к.б.н., Минск, 1991, 21с.

68. Плащев В.М. Вьщеление вирулентных клонов Alternaria radicina.// Бюл. ВИР, 1982, вып. 118, с.61-62.

69. Плащев В.М. Клеточная селекция клевера и люцерны на устойчивость к фузариозному увяданию./УГаметофитная и защитная селекция растений, Кишенев, 1987, с. 176-178.

70. Попкова К.В. Учение об иммунитете растений. М.:Колос, 1979, 272 с.

71. Попкова К.В. Общая фитопатология. М.:Агропромиздат, 1989, 399 с.

72. Родева В., Станчева И. Биологичен эфект на културални филтрати от различии изопати на Alternaria solani върху растение доматени растение in vitro.// Биотехнология, 1990, т. 4, № 3/4, с.27-30.

73. Родин М.Н. Общая фитопатология. М.:Высшая школа, 1978.

74. Рубин Б.А., Архиховская Е.В., Аксенова В.А. Биохимия и физиология иммунитета растений, М.:Высшая школа, 1975.

75. Рукшенайте-Берецкене С. Грибные болезни моркови в Литовской ССР и биологические свойства возбудителей альтернариоза./ Автореферат диссерт. к.б.н., Вильнюс, 1971, 20 с.

76. Сельскохозяйственная биотехнология: Учебник ( под редакцией В.С.Шевелухи), М.:Высшая школа, 1998, 416 с.

77. Семенов Л.Д. Питательные среды. М., 1994,210 с.

78. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция. Киев:Наукова Думка, 1990, 360 с.

79. Сидукова Е.В., Свиридов А.В. Источники инфекции моркови возбудителем бурой пятнистости листьев.// Экол.экон. основы усовершенствования интегр. Систем защиты растений от вредителей, болезней и сорняков. Минск, 1996, ч. 2, с. 42-43.

80. Соколова Т.Д. Физиолого-биохимические реакции корнеплодов на ранних этапах заражения возбудителя Alternaria в процессе хранения./ Автореферат диссерт. к.б.н., ВИЗР, Сп.б., 1998, 19 с.

81. Солодкая JI.A., Новоселова Е.Ю. Методы создания форм клевера лугового с повышенной устойчивостью к раку.// Сборн. Науч. Трудов ВНИИ кормов, 1989, вып. 42, с.57-65.

82. Таганов Б.О. Разработка лабораторной технологии получения андрогенных растений моркови in vitro ./ Автореферат диссерт. к.б.н., М„ 1991,22 с.

83. Тимина JI.T. Эколого-генетические особенности проявления устойчивости моркови к Alternaria.// Научн. Тр. По семеноводству овощных культур, 1995, т. 1, с. 147-152.

84. Тимина JI.T., Василевский В.А. Устойчивость моркови к альтернариозу при селекции на гетерозис.// Гетерозис с/х растений, 1997, с. 158-160.

85. Угарова С.В., Тесля А.А. Селекция моркови с применением биотехнологических методов.// Тез. докл. «Пробл. Совета по растениеводству, селекции, семеноводству с/х культур Сибири», Новосибирск, 1994, с.23-24.

86. Федоренко Е.И. Изучение коллекционного разнообразия моркови по устойчивости к Aiternaria.// Научн.-технич. Бюл. ВИР, 1983, вып. 130, с. 64-66.

87. Фитоалексины./ Под ред. Бейли Д.А. и Мансфильда Д.В., Киев:Наукова Думка, 1985.

88. Хандобина JI.M., Гришкова В.П.,Вишвецев B.C. Изменение состава фенольных соединений в тканях моркови при поражении грибом Phoma rostrupii.// Научн. Докл. Высш. школы биол. науки, 1982, № 9, с.85-89.

89. Хотин Ю.А., Полякова Т.М. Сохранение инфекционных свойств возбудителя ризоктониоза риса при культивировании на искусственных питательных средах.// Микология и фитопатология, 1991, т. 25, вып. 1, с.80-84.

90. Черненко Е.А. Распространение устойчивости к болезням среди разнообразия вида Daucus carrota.// Проблемы селекции овощных культур. Минск, 1997, с.40-41.

91. Шапова А.С. Альтернариоз помидоров в условиях Узбекистана и меры борьбы с ними./ Автореферат диссерт. к.б.н., Ташкент, 1966, с.20.

92. Шаяхметов И.Ф. Культура клеток и тканей пшеницы in vitro и соматический эмбриогенез./ Автореф. диссерт. Д.б.н., 2001, 45 с. „ ■

93. Шаяхметов И.Ф. идр Клеточная селекция яровой пшеницы на устойчивость к корневым гнилям.// Генетика, 1994, т. 30, с. 181.

94. Шевелуха B.C. Новая биотехнология в селекции и растениеводстве.// Вестник с/х науки, 1986, № 2, с. 25-31.

95. Шевченко Д.Н. Изменчивость линий-регенерантов ячменя по признакам устойчивости к болезням, морфологии и продуктивности./ Автореферат диссерт. к.б.н., 1994, 18 с.

96. Яковлева Т.А. и др. Негативный отбор in vitro самоклонов картофеля, устойчивых к парше обыкновенной.// II Междунар. Конф. «Биология культивируемых клеток растений и биотехнология», Алма-Ата, 1993, с. 136.

97. Allicchoi R., Bioni М., Ghedini R. Jsozymatic varition in potato plants regenerstion cells resistant tofungab toxin.// Atti| Assoc. Gent. Ital. 1989, v. 35, p. 9-70.

98. Arcioni S. Et al. Thea. Appl. Gen., 1987, v. 74, p. 700-705.

99. Austin S et. al. Thea. Appl. Gen., 1986, v. 71, p. 682-690.

100. Baranski R., Nowak E. et. al. Development of carrot callus in the presence of the crude extract from Erwinia carotovora culture.// J. appl. Genet., 1997, v. 38 A, p. 91-99.

101. Boiteux L.S. Heritabity estimate for resistance to Alternaria dancu carrot.// Boite. Seed Sc. Technol., 1993, v. 110, 1 2, p. 37248.

102. Bomme U., Daniel G. Erste untersuchungsergebrisse zun Auslesezuchtung fei Arnica montana. L. Unter Einberichung der in vitro kulter.// Vortr. Fur Pflanzen zuchtung. Bjnn., 1993, v. 26, s. 92-108.

103. Bruemmer J.H., White J.M. Bse of phytoalexin production in carrot cell cultures to evaluate leaf blight susceptibility.// Proc. Fborida state Hortic. So hake Afred, Fia, 1987, v. S.9, p. 156-157.

104. Brunok., Smolka S. Production of zinnib by Alternaria dauciana its.//Ann. Agr. Sc., 1981.

105. Chawa H.S., Wenzel G. Thea. Appl. Gen., 1987, v. 74, p. 841845.

106. Coxon D.T., Heill T.M., Mansfield J.M. et. al. Identification of three hydroxyflavan phytoalexins from daffodil bulbs.// Phytochemistry, 1980, v. 19, p. 889.

107. Daub M.E. Tissue culture and the selection of resistance to patogens.// Ann. Rev. Phitopathol., 1986, v. 24, p. 156-186.

108. Deadon W.R., Keyes G.J., Collins G.B. Expressed resistance to black shankamong tobacco callus cultures.// Theer. And Appl. Genet., 1982, v. 63, p. 65-70.

109. Fish N., Gones M. Plant today, 1988, v. 2, p. 47-49.

110. Foroughi Wehr В., Stalle K., Nachr D. Pflanzenshuts., 1985, v. 37, p. 170-173.

111. Harborre J.B. Do natural plants phenols play a role in ecology.// Acta hort., 1994,1 381, p. 36-43.

112. Herrandez M.M., Kowalski В., Orizu Electividaddel empleode filtrados Alternaria solani Ellij. Y Mantienen la selecci on in vitro deformas resistees en papa (Solanum tuberosum L.).// Cultuvost гор., 1991, v. 12,1 2, p. 48-50.

113. Hartman C.L. et. al. Plant Sc. Let., 1984, v. 34, p. 151-158.

114. Hunold R. In vitro selection for gerstl and resistens gegen toxinevon Drechslera tores (Sacc.) sholmaker.// Vortr. Fur О Pflanzenzuchtung. Bonn., 193{p. 8-30.

115. Hunold N. Toxin sensibilitat von kalluskulturen cinigen sommer gersten mit unterschiedlicher resistens gegenuben Drechslera teres (Sacc.) shvem.// Arch. Phytopathol. Pflanzenschuts03$ h. 3, p. 267-276.

116. Kaltschmidt B. In vitro selection fur bakterienbrandresistens in genotypen der susshifsche orste ergebnisse mit einer neuenznfections method.// Vont. Fur Pflanzenzuchtung Bonn, 1991, h. 19, p. 213-214.

117. Kasenberg T.R., Traguair J.A. Effectis of phenolics on growth of fusurium oxysporum f. Sp. Radicis- Lycopersici in vitro.// Can. J. Bot., 1988, v. 66,1 6, p. 1174-1177.

118. Kurusaki P., Amin M., Nishi A. Induction of phytoalexin production and accumulation of phenolic compounds in cultured carrot cells.// Physiol. Molec. Plant. Pathol., 1986, v. 28, 1 3, p. 359-370.

119. Kurusaki P., Tashiro N., Nishi A. Secretion of chitinase^ from cultured carrot cell treated wiht fungal myceliae walls.// Physiol. Molec. Plant. Pathol., 1987, v. 31,1 2, p. 211-216.

120. Leon J., Shulaev V., Lauton et. al. Benzoic acid 2-hidroxulase a putative cytochrome P-450, catalizes the biosynthesis of salicilic acid.// Plant Physiol., 1994, v. 105, p. 15.

121. Le-Wis N. G., Yamamot O.E. Lignin occarence, biogenesis and biodegradation.// Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Boil., 1990, v. 41, p. 339.

122. Lynn D.G., Chang M. Phenolic signalis cohabitation: Implications for plant development.// Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Boil., 1990, v. 41, p. 497.

123. Melis A., Nemson J.A., Yarrison M.A. Damongetofunctional components and pantial degradation of photosystem II reaction center ptoteins upon chloroplast exposure to ultraviolet В radiation.// Bioch. Et biophys. Acta, 1992, v. 110, p. 312.

124. Miklas P.N., Grafton K.F., Secor G.A. Use of patho gen filtrate to differentiale physiological resistance of dry bean to white molddisease.// Crop. Sc., 1992, v. 32,1 2, p. 310-312.

125. Moerschbucher В. Lignin biosynthesis and rsistance of wheat to stem rust.//Phytoparasitica, 1998, v. 16, p. 153.

126. Muller H. Unter suchung zur bildung von 3-methyl -6-melhoxy hugroxy-3,4-dihidroisocumerin bei den moohmenlagerund.// Phytopatol., 1976, r. 93, h. 3, p. 241-248.

127. Nascaril J., Broggio M. Studies on Alternaria solani tuberosum in vitro interactions.// Riv. Agr. Subtrom. Trop., 1990. A. 84, N 3, p. 445-499.

128. Olsson K., Svensson A. Are carrot phenols and polyacety lenes in fluenity susceptilicity. 1997, v. 38A, p. 219-223.

129. Rizk A.M., Hammouda F.M. Phytoalexins produced by Daucus carota infected with some fungi.// Ann. Agri. Sc., 1983, v. 28, N 1, p. 23-31.

130. Srivastava O.L., Van Huystee R.B. Interections among phenolic oxidase activities of peanut peroxidase isozymes .// Phytochem., 1997., v. 16. N. 10. P. 1527-1530.

131. Toyoda Y., et. al. Phytopathol. Soc. Janan., 1984, v. 50, p. 538540.

132. Tylkowska K. Stadies toxines Alternaria alternata isolaten from carrot seeds and seedling.//Szczeshag, 1974, s. 877-879.

133. Tylkowska K. Toxinogenicity of Alternaria altemana isolates from carrot seeds and seedlings.// Seed Sc. Technol, 1995, v. 23, N. 3, p. 877-879.

134. Jensen R.A. The shikimate/arogenate pathway: Link between carbohydrate metabolism and secondary metabolism.// Physiol. Plant., 1986, v. 66, p. 164.

135. Wagner A.M., Wagner M.J. Measurement of in vivo ubiqionone reduction levels in plant cell.// Plant Physiol., 1995;vv. 108, p. 277.

136. Weissenbock G., Plesser A., Trinks H. Flavonoid gekalt und enzymaktivitaten isolienten Hafechloroplasten (Avenasatival.).// Ber. Dt. Bot. Gen., 1976, v. 89, p. 457.

137. Weissenbock G., Tevini M., Re2nic H. Uber das vokommenvon flavonoiden in cliloroplasten von Jmpatens balsamina L.// Ztschr., Pflaztnphysiol., 1971, v. 64, p. 274.

138. Wadholm J.M. Selection and characterization a Daucus carota L. Cell line resistant to four aminoacidd analogues.// J. Exp. Bot., 1978, v. 29, p. 1111-1116.

139. Wadholm J.M. Selection of plants cell lines which accumulate compound.// Plant Tissue Culture, 1980, p. 99-114.

140. Wadholm J.M. Differential expression of amino acid biosynthetic control isoenzymes in plants and cultured cells.// Plant Tissue Culture, 1980, p. 157-159.

141. Wieland T. Poisonous principles of mushruums of the genus Amanita.// Science, 1968, p. 946-052/

142. Wild J.R., Kerns H.A. Amplification of dihydrofolatt reductase in tesponse to stepwise increases in folate analogue concentration in cotton tissue culture.// Abstr. Plant Mol. Biol., 1983, p. 23.

143. Wong J.R., Sussex J.M. Isolation of abscisic acid risistant variants from tobacco cell cultures.// Planta, 1980, p. 97-102/

144. Wray J.L. The molecular genetics of highen plant nitrate assimilation.// A genetic approach to plant biochemistry, 1986, p. 101-151.

145. Wright W.E., Hayflick L. Use of biochemical lesions for selection of human cells with hybrid cytoplasms.// Proc. Nat> Acad. USA, 1975, p. 1812-1816.