Клеточная селекция растений на устойчивость к грибным болезням

Калашникова, Елена Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клеточная селекция растений на устойчивость к грибным болезням
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Клеточная селекция растений на устойчивость к грибным болезням"

На правах рукописи

КАЛАШНИКОВА Елена Анатольевна

КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ РАСТЕНИЙ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ГРИБНЫМ БОЛЕЗНЯМ

Специальность 03.00.23 — биотехнология

АВТОРЕФЕВМ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2003

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева и в Институте физиологии растений Российской Академии наук им. К.А. Тимирязева.

Научный консультант—доктор биологических наук, академик РАСХН B.C. Шевелуха.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук A.B. Поляков; доктор биологических наук, профессор A.M. Носов; доктор биологических наук И.В. Голденкова.

Ведущее учреждение—ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии.

Защита диссертации состоится октября 2003 г. в /Г часов на заседании диссертационного совета Д.220.043.10 при Московской сельскохозяйственной академии имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва И-550, ул. Тимирязевская, 49. Ученый совет МСХА

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ МСХА.

Автореферат разослан « &С » сентября 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета— кандидат биологических наук

Г.И. Карлов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Создание форм, сортов и гибридов растений, устойчивых к биотическим факторам является одним из важных направлений селекции. Это обусловлено большими потерями урожая сельскохозяйственных растений, вызванными поражением их грибными, бактериальными и вирусными болезнями и повреждением вредителями. Например, в середине 70-х годов XX века появление нового биотипа бурой ржавчины пшеницы привело к потере устойчивости популярных в то время на Северном Кавказе сортов Аврора и Кавказ; в конце 70-х годов наблюдалось массовое поражение подсолнечника белой и серой гнилями; вспышка фузариоза колоса пшеницы в 80-е годы снизила ее урожайность на 40-45%.

Данную проблему трудно решить, используя только традиционные способы защиты растений и посевов: агротехнические, химические и биологические, так как ни один из них в отдельности не обладает достаточной эффективностью.

Радикальным средством защиты растений от фитопатогенов является селекция, создание комплексно устойчивых сельскохозяйственных культур, и прежде всего, с использованием отдаленной гибридизации. Этим методом созданы многие ценные формы, сорта и гибриды сельскохозяйственных растений. Однако продолжительность такой селекции достигает 15-20 и более лет, а степень устойчивости растений к вредным организмам является недостаточной и далеко не всегда отвечает требованиям производства.

Одним из новых, перспективных путей повышения эффективности селекционного процесса является использование современных методов биотехнологии, позволяющих расширить спектр генетического разнообразия (сомаклональная вариабельность, соматическая гибридизация, индуцированный мутагенез, генетическая инженерия) и сократить сроки проведения селекции. Значительное место в решении этих задач занимает клеточная селекция, основанная на отборе клеточных популяций, устойчивых к селективному фактору, и регенерации из них целых растений.

В настоящее время в нашей стране и в мире достигнуты значительные результаты по клеточной селекции: созданы линии картофеля, устойчивые к фитофторозу; томатов - к альтернариозу; риса - к пирикуляриозу; люцерны и льна - к фузариозу; клевера - к склеротинии и др. Как правило, в качестве селективного фактора используются токсины белковой и небелковой природы, выделенные из патогенных грибов. Устойчивость растений-регенерантов, полученных в процессе клеточной селекции, не всегда коррелирует с устойчивостью растений в условиях in vivo. В связи с этим необходимо разрабатывать

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ BMMMOTtKA /- С fVrrcpeypr 2«#>К

нетрадиционные подходы, обеспечивающие повышение устойчивости растений к фитопатогенам.

Начиная с первых работ по культивированию растительных клеток, тканей и органов растений в условиях in vitro особый интерес у исследователей вызывал вопрос о том, какие изменения могут происходить в изолированных клетках, растущих на искусственных питательных средах и причины их вызывающие. Важной проблемой в исследованиях по клеточной селекции на устойчивость к биотическим факторам является выявление механизмов адаптации каллусных и суспензионных клеток к действию стрессового фактора, обусловленных изменениями на генетическом уровне, в гормональном балансе и метаболизме вторичных соединений клеток, подвергшихся стрессовым воздействиям. Изучению этой проблемы и посвящена настоящая диссертация.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является усовершенствование и разработка методов и технологий клеточной селекции пшеницы, моркови и картофеля in vitro на устойчивость к фитопатогенным грибам Septoria nodorum, Alternaria radicina, Rhizoctonia solani, а также выяснение механизмов, обеспечивающих устойчивость клеток каллусных и суспензионных культур к действию экзометаболитов исследуемых патогенов.

В соответствии с поставленной целью нами решались следующие основные задачи:

1. разработка методов клеточной селекции растений in vitro путем культивирования клеток каллусных и суспензионных культур на питательных селективных средах; оптимизация способов получения культурального фильтрата патогенов, условий проведения клеточной селекции и состава питательных сред, обеспечивающих получение растений-регенерантов, устойчивых к грибным патогенам;

2. исследование изменений в гормональном статусе клеточных линий и растений-регенерантов, прошедших селекцию in vitro на селективных средах с использованием экзометаболитов патогенов;

3. определение участия фенольных соединений в адаптации клеток каллусных и суспензионных культур к действию стресс-фактора;

4. оценка на генетическом уровне (RAPD метод) каллусных клеток, культивируемых в стандартных и стрессовых условиях, а также растений-регенерантов, полученных в результате клеточной селекции и отличающихся повышенной устойчивостью к грибным патогенам. Научная новизна работы. Впервые разработаны и предложены

методы клеточной и такневой селекции in vitro, позволяющие получать каллусные линии и растения пшеницы, моркови и картофеля, обладающие повышенной устойчивостью к фитопатогенам Septoria

nodorum, Altemaria radicina, Rhizoctonia solani. Предложенные методы основаны на культивировании каллусных или суспензионных клеточных культур на питательных средах, содержащих культуральный фильтрат (КФ) патогена в течение 8-10 пассажей.

Установлена зависимость фитотоксичности экзометаболитов возбудителей болезней в условиях in vitro от состава питательной среды. Показана целесообразность использования в качестве селективного фактора КФ патогена, полученного при выращивании изолятов грибов в течение 30-ти дней в жидкой питательной среде Чапека. В этих условиях фитотоксичность КФ в 5-7 раз превышает этот показатель при культивировании фитопатогенов на среде Мурасига и Скуга.

Экспериментально установлено, что культуральный фильтрат патогенов (Septoria nodorum, Alternaria radicina, Rhizoctonia solani) в концентрациях 10-20% стимулирует рост интактных растений, а также клеток каллусных и суспензионных культур (пшеница, морковь, картофель). Более высокие концентрации экзометаболитов оказывают ингибирующее действие на указанные объекты.

Впервые разработаны индивидуальные схемы селекции in vitro для пшеницы, моркови и картофеля и подобраны оптимальные концентрации КФ патогена. Установлено, что для каллусной ткани пшеницы целесообразно использовать 20%-ый КФ Septoria nodorum; для суспензионной культуры моркови - 30-50%-ый КФ Alternaria radicina; для каллусной и суспензионной культур картофеля - 30-40%-ый КФ Rhizoctonia solani.

Впервые, в результате клеточной селекции получены устойчивые клеточные линии и растения-регенеранты, превышающие устойчивость исходных форм к действию изучаемых патогенов на 10-35%, а для отдельных генотипов до 50%.

Выявлены изменения в гормональном статусе клеточных линий и растений-регенерантов моркови и картофеля, полученных в результате селекции к экзометаболитам патогенов. Определены различия в содержании гормонов в суспензионной культуре, длительно культивируемой в стандартных и стрессовых условиях. Установлено, что адаптация клеток к стрессовому фактору сопровождается повышением уровня цитокининов и ИУК. У растений-регенерантов моркови, полученных в результате клеточной селекции, отмечено значительное повышение содержания ауксинов, гиббереллинов и, особенно, цитокининов, по сравнению с контрольным вариантом.

накопление характерно для устойчивых к экзометаболитам клеточных культур, по сравнению с неустойчивыми. Значительная роль в этом процессе принадлежит фенольному полимеру лигнину, ограничивающему проникновение культурального фильтрата патогена в клетки за счет лигнификации клеточной стенки. В растениях-регенерантах выявлено не только повышение содержания фенольных соединений, но и изменение их качественного состава.

Установлены различия в нуклеотидных последовательностях ДНК (RAPD методом) в клеточных культурах, культивируемых на селективных и стандартных средах. Для устойчивых каллусных культур и растений-регенерантов, полученных в результате клеточной селекции, RAPD спектры ДНК отличались отсутствием или присутствием новых фрагментов размером от 330 п.н. до 1200 п.н., которые не были характерны для RAPD спектров ДНК контрольного варианта.

Практическая значимость работы. Предлагаемые в работе схемы и методы клеточной селекции, позволяют получать растения-регенеранты пшеницы, моркови и картофеля, устойчивые к фитопатогенам Septoria nodorum, Alternaría radicina, Rhizoctonia solani, соответственно. Такие растения могут быть использованы в традиционной селекции и служить основой для создания новых сортов и гибридов, обладающих повышенной устойчивостью к грибным болезням. Полученные новые данные об участии эндогенных гормонов и фенольных соединений в адаптации клеток к стрессовым условиям являются теоретической основой для более полной расшифровки механизмов устойчивости клеток к действию экзометаболитов опасных патогенов.

Результаты исследований легли в основу раздела «Клеточная и тканевая биотехнология в селекции и растениеводстве» учебного пособия и 2-х изданий учебника «Сельскохозяйственная биотехнология» (1998, 2003), изданного коллективом авторов под редакцией академика РАСХН В. С. Шевелехи.

Обоснованность и достоверность научных положений и выводов обеспечивается анализом обширного экспериментального материала, полученного в течение 10 лет, с использованием существующих современных и разработанных нами методик и статистической обработкой результатов исследований с оценкой их точности и достоверности.

Личный вклад автора. Постановка проблемы, целей и задач исследований; разработка программы и новых методов исследований; обработка, анализ и обобщение полученных результатов выполнены автором. Экспериментальные работы проведены автором и частично аспирантами под его руководством.

Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы и предложения докладывались на симпозиуме в Вашингтоне « In vitro in Biology» (1996, 1997), на Международной конференции «Молекулярная генетика и биотехнология» ( Минск, 1998), на I и II Международной конференции «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 1996, 2000), на V и VI Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 1997, 2001), на VII и VIII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда» (Москва, 1997, Саратов, 2003), на III Международной конференции, посвященной памяти Б.В.Квасникова (Москва, 2003), на ежегодных научных конференциях МСХА (Москва, 2000, 2001, 2002), а также на заседании кафедры сельскохозяйственной биотехнологии МСХА им К. А. Тимирязева.

Публикации. Основные результаты исследований по диссертации опубликованы в 48 работах, в том числе в соответствующих главах учебного пособия и в двух учебниках для вузов «Сельскохозяйственная биотехнология» под грифом Министерства образования РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения и 8 глав: обзор литературы, объекты и методы исследований, результаты и их обсуждение (6 глав), а также выводов и списка цитируемой литературы.

Материалы диссертации изложены на 270 страницах машинописного текста, содержат 55 таблиц, 55 рисунков. Библиография включает 280 источников, из которых 75 зарубежной литературы.

Глава 1. Клеточная селекция и другие проблемы современной биотехнологии

Развитие современной молекулярной биологии и генетики, методов культивирования растительных, животных клеток и микроорганизмов в условиях in vitro, технологий рекомбинантных ДНК, открыло широкие возможности для их применения в науке и производстве. Главные направления современной биотехнологии -генетическая и клеточная инженерия, получившие интенсивное развитие в 80-е годы прошлого столетия, широко используются в настоящее время во многих странах мира, в том числе и в России. Лидирующее место в этой области занимают научные учреждения США, Англии, Германии, Франции, Японии, Нидерландов, Италии. В последние годы наблюдается интенсивное развитие биотехнологических исследований в Китае, Индии и ряде других стран.

Основные задачи современной биотехнологии в области сельского хозяйства - создание генетически модифицированных объектов (растений, животных и микроорганизмов) с заранее заданными признаками и свойствами; создание высокоэффективных штаммов бактериальных препаратов, с повышенной активностью нитратредуктазы и биологического связывания атмосферного азота; уменьшение потерь органического вещества за счет контроля процессов нитрификации и денитрификации; получение регуляторов роста растений и биопрепаратов, защищающих их от болезней и вредителей; разработка приемов, позволяющих ограничить отрицательное антропогенное воздействие на биосферу в результате интенсификации сельского хозяйства и промышленности.

Современная биотехнология охватывает широкий круг методов, отраслей, объектов производства и задач, объединенных в несколько крупнейших блоков и направлений. Среди них на первое место в XXI веке в стратегическом плане выходит генетическая инженерия, главной целью которой является создание трансгенных растений (Шевелуха, 2000). Для успешного решения этой приоритетной задачи необходимо преодолеть отставание в идентификации и клонировании генов; созданию их банков; расшифровке механизмов полигенной детерминации признаков и свойств биологических объектов; созданию надежных векторных систем и обеспечению высокой устойчивой экспрессии генов. Уже сегодня во многих лабораториях мира с помощью методов генетической инженерии созданы принципиально новые трансгенные растения, животные и микроорганизмы, используемые в коммерческих целях. Созданы устойчивые формы сои и рапса к гербицидам; хлопчатника и кукурузы - к насекомым; картофеля - к колорадскому жуку и фитофторозу. Посевные площади, занятые под трансгенными сортами и гибридами сельскохозяйственных растений, достигают в мире уже 58,5 млн. га, которые за последние годы особенно резко возрасли.

Более широкое практическое применение в настоящее время получило второе важное направление современной биотехнологии -клеточная инженерия, основанная на тотипотенстности клеток, способности их регенерировать целое растение, а также синтезировать важнейшие соединения вторичного метаболизма. Работы в этом направлении носят многоплановый характер и позволяют размножать и сохранять ценные, лекарственные и исчезающие растения (клональное микроразмножение); ускорять селекционный процесс (клеточная селекция); получать неполовым путем гибриды (соматическая гибридизация), а также сохранять неполноценные зародыши (культура

изолированных зародышей) и ценные клеточные популяции (криоконсервация).

В клеточной биотехнологии также существуют острые научные проблемы, решение которых позволит значительно повысить ее эффективность. Главные трудности клеточной инженерии недостаточно высокая частота регенерации клеток и нарушение нормального онтогенеза организмов; узкий спектр сомаклональной вариабельности; слабая экспрессия генов, контролирующих важнейшие хозяйственно-ценные признаки, а также не высокий выход веществ вторичного синтеза. Несмотря на трудности, в этом направлении достигнуты значительные результаты, которые нашли свое применение в селекционном процессе, производстве и промышленности. Большое число работ проведено на пшенице, ячмене, рисе, сорго, картофеле, томатах, люцерне и других сельскохозяйственных культурах. Получены растения пшеницы, риса, картофеля, устойчивые к NaCl или Na2S04 ; растения моркови, способные синтезировать в 20 раз больше метионина, в 30 раз - триптофана, в 5 раз - лизина; растения картофеля, устойчивые к кольцевой гнили. Методом гаплопродюсера созданы первые два сорта ячменя Исток и Одесский 115, отличающиеся повышенной продуктивностью и устойчивостью к засухе и болезням (Новолоцкий, 1986). В Госреестр РФ включены (1993-1994 гг.) сорта ярового ячменя Биос 1, Рамос и Эльф, полученные с участием в скрещивании дигаплоидных линий (Неттевич, 1986).

Таким образом, два важнейших направления биотехнологии: генетическая и клеточная инженерия составляют основу нынешних и будущих приоритетов в биотехнологии Закономерное развитие этого процесса наряду с другими мерами, обеспечит решение стратегических задач России, многих государств мира и всей цивилизации -экологическую безопасность для людей; защиту человека и человечества от болезней; продовольственную безопасность государств; устойчивое экономическое развитие всех стран мира (Шевелуха, 2000, Скрябин, 2003).

Глава 2. Объекты и методы исследований.

Объекты исследований Объектом исследования служили: яровая мягкая пшеница, морковь и картофель.

Исследования с яровой мягкой пшеницей проводили на 8 генотипах, обладающих различной устойчивостью к Septoria nodorum Berk. К устойчивой группе относятся - WW-15370, Gaterin, 81S-8, 91S-10; среднеустойчивой - Московская 35, Энита; неустойчивой - Саратовская 29, Fortuna. Семена, всех изучаемых генотипов, предоставлены сотрудниками кафедры селекции и семеноводства полевых культур

МСХА им К.А.Тимирязева.

Эксперименты с морковью проводили на 6 генотипах, обладающих различной полевой устойчивостью к грибу Alternaría radicina М„ Dr et Е. К среднеустойчивой группе относятся - линии 906, 805, неустойчивой - сорт Rondo, линии 225П, 6700, 1268. Семена всех изучаемых генотипов предоставлены сотрудниками лаборатории селекции и семеноводства овощных культур Всесоюзного научно-исследовательского института овощеводства.

Исследования с картофелем проводили на 4 генотипах, обладающих различной устойчивостью к патогену Rhizoctonia solani Kíihn: Удача, Невский, Жуковский ранний, Дезире. Пробирочные растения предоставлены сотрудниками Научно-исследовательского института картофельного хозяйства.

Методы исследований Лабораторные исследования по культуре изолированных клеток, тканей и органов растений проводили в соответствии с методическими указаниями, разработанными Р.Г. Бутенко (1964) и автором, изложенных в лабораторно-практических занятиях по сельскохозяйственной биотехнологии (1996).

В работе использовали стандартную питательную среду Мурасига и Скуга, содержащую различные вещества цитокининовой и ауксиновой природы. Длительность культивирования каллусных культур составляла 28 дней, а для суспензии - 14 дней.

Культуральный Фильтрат (КФ) патогенов (Septoria nodorum, Alternaría radicina, Rhizoctonia solani) получали путем выращивания изолятов грибов в жидкой питательной среде Мурасига и Скуга, а также Чапека в колбах объемом 300 мл на качалке со скоростью вращения 100 об/мин. В каждую колбу вносили инокулюм, содержащий 108 шт. конидий гриба. Культуральный фильтрат получали путем фильтрования суспензии гриба через фильтровальную бумагу с последующим автоклавированием. Токсичность КФ определяли на 9, 14, 19, 23, 30-й день с момента выращивания патогенов в питательной среде по прорастанию семян (пшеница, морковь) или по росту пробирочных растений (картофель).

Селекиию in vitro проводили на каллусной культуре для пшеницы, на суспензионной культуре - для моркови, а также на каллусной и суспензионной культурах - для картофеля. В качестве селективного фактора использовали КФ патогена, который добавляли в питательную среду в концентрациях 10 - 50% от конечного объема питательной среды. В работе применены различные схемы селекции в зависимости от объекта исследования. Для характеристики роста и физиологического состояния каллусных и суспензионных культур использовали сырую

массу клеток, определяли жизнеспособность, степень агрегированности культур, а также ростовой индекс.

После селекции, каллусную ткань переносили на питательные среды для регенерации, а суспензионную культуру платировали в агар по методике, изложенной в методических указаниях «Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии» (1996) с целью получения микрокаллуса и растений-регенерантов.

Оценку растений-регенерантов на устойчивость к исследуемым фитопатогенам осуществляли в лабораторных условиях путем культивирования растений на питательных средах, содержащих КФ патогенов в концентрации 95-100%.

Эндогенные гормоны определяли в пробах суспензионных культур, культивируемых в стандартных и стрессовых условиях, на I, IV и VIII пассажах и растениях-регенерантах. Содержание ндолилуксусной кислоты (ИУК), абсцизовой кислоты (АБК), цитокининов (ЦК) (сумма зеатина), определяли с помощью ВЭЖХ и ИФА, а гибберелины (ГК3) -биотестированием по методу Франкленда и Уоринга (Frankland\ Wareing, ¡960). Опыты проводили в двух биологических (каждая состояла из 30 растений-регенерантов) и двух химических повторностях.

Фенольные соединения определяли в каллусных и суспензионных культурах и растениях-регенерантах. Материал экстрагировали горячим 96%-ным этанолом. В этанольных экстрактах определяли содержание суммы растворимых фенольных соединений спекггрофотометрическим методом (поглощение при 725 нм) с реактивом Фолина-Дениса (Запрометов, 1971). Калибровочную кривую строили по (п)-оксибензойной кислоте.

Хроматография. Для разделения полифенолов использовали хроматографию в тонком слое целлюлозы (Ferak, толщина слоя 0,25 мм) в системе н-бутанол - уксусная кислота - бутанол (40:12:28 по объему). Идентификацию выделенных соединений проводили на основании их флюоресценции в ультрафиолетовом свете, а также по качественной реакции с 1%-ным водным раствором железа и красной кровяной соли (Запрометов, 1985).

Изучение локализации лигнина в клетках проводили с использованием реакции с флороглюцином (Стрекова, Субботина, Загоскина, Запрометов, 1980). Препараты просматривали на световом микроскопе Ergavall (Германия) с фотоприставкой.

RAPD анализ каллусной ткани и растений-регенерантов. Выделение ДНК из каллусной ткани и растений-регенерантов, а также исходного сорта проводили по методике Edwards et al. (1991). Амплификацию ДНК проводили по стандартной методике.

Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе «Регкеп Emler» (США) для проведения реакции использовали наборы реактивов «Promega» (США). Для выявления полиморфизма использовали 9 стандартных праймеров. Ранее они использовались для выявления межсортового и внутрисортового полиморфизма у ячменя и твердой пшеницы.

Глава 3. Каллусогенез и морфогенез в культуре in vitro.

Одной из важных и сложных проблем современной биологии является регенерация целого растения из изолированной клетки, обладающей свойством тотипотентности (реализация нормального морфогенеза). В ее основе лежат процессы морфогенеза, показатели которого определяются темпом и ориентацией клеточных делений, блокированием клеточного цикла, ростом клеток и их дифференциацией. Процессы морфогенеза индуцируются изменением в экспрессии генов и закреплением этой эпигенетической изменчивости клонированием перепрограммированной инициальной клетки (Бугенко, 1994). Ценность клеточных технологий, в первую очередь, определяется возможностью восстановления целого растения. Регенерация побегов, корней и других органов в культуре in vitro является необходимым и важным условием успешного проведения разнообразных клеточных и генноинженерных экспериментов.

3.1. Пшенииа.

Клеточная и тканевая селекция растений базируется на культивировании в стрессовых условиях in vitro каллусных и суспензионных клеток. Однако клетки, прошедшие цикл селекции in vitro, как правило, частично или полностью теряют способность к морфогенезу. Поэтому изучение влияния генотипа, состояния первичного экспланта и гормонального состава питательной среды на процесс каллусогенеза и морфогенеза, является первостепенной задачей при проведении работ по клеточной селекции. Для пшеницы эти работы являются особенно актуальными, что объясняется большой зависимостью регенерационного потенциала ее клеток и тканей от генотипа и продолжительности их культивирования in vitro. Особенности каллусогенеза и морфогенеза различных генотипов. Зрелые и незрелые зародыши 8 исследуемых генотипов пшеницы культивировали на модифицированной питательной среде Мурасига и Скуга, содержащей 2,4-Д в концентрации 2 мг/л. Эта среда была выбрана в качестве базовой, универсальность которой экспериментально доказана различными авторами для получения каллусной ткани из зародышей ряда злаковых культур (Иванов, 2001).

Наши исследования показали, что под влиянием 2,4-Д клетки зрелого и незрелого зародышей неорганизованно делятся, образуя каллусную ткань, состоящую из рыхлых, оводненных и более плотных, структурированных участков с выраженными меристематическими очагами. Наибольшей способностью к каллусогенезу обладали генотипы WW-15370, Gaterin, 81S, Энита, Московская 35, Саратовская 29, для которых характерно формирование каллусной ткани в 28-32% случаев, в то время как для генотипов 91S и Fortuna этот показатель не превышал 18-20%. Установлено, что формирование морфогенного каллуса происходило с разной интенсивностью и также зависело от генотипа исходного растения. Выявлено, что Gaterin и 91S обладали низким морфогенетическим потенциалом (6% и 8,3% соответственно), в то время как для остальных генотипов этот показатель находился в пределах 11,6-20%.

Таким образом, генотипическая зависимость процессов каллусогенеза и морфогенеза варьирует в пределах от 6 до 32 %, что необходимо учитывать при подборе исходных форм в работах по клеточной селекции с этой культурой.

Каллусогенез и морфогенез различных первичных эксплантов Зрелые зародыши. Изучено влияние различных концентраций 2,4-Д (1-5 мг/л). Исследования позволили выявить ряд закономерностей, которые проявлялись в самом процессе формирования каллусной ткани. Как правило, каллусогенез начинался с дедифференцировки нижних клеточных слоев зародыша, которые находились в непосредственном контакте с питательной средой. Спустя 14 дней эти клетки полностью дедифференцировались и во всех исследуемых вариантах образовывалась рыхлая, оводненная каллусная ткань светло-желтого цвета. В зависимости от концентрации 2,4-Д в питательной среде наблюдался рост мристематической части зародыша и формирование проростка. Обнаружена обратная зависимость между темпами образования проросшов и концентрацией 2,4-Д в среде, тогда как способность зародышей образовывать каллус и интенсивность его формирования находятся в прямой зависимости от концентрации 2,4-Д и зависит от генотипа первичного экспланта. Повышенные концентрации ауксина влияют на проницаемость мембран, что и проявляется в различном действии гормона (Гамбург, Рекославская, Швецов, 1990). Зародыши сортов Московская 35, Саратовская 29, 81S, Gaterin, WW-15370 в 15-80% случаев образовывали неморфогенную каллусную ткань при всех испытанных концентрациях 2,4-Д. Для генотипов Fortuna, Энита, 91S этот показатель находился в пределах 1038%.

Результат экспериментов позволили заключить, что использование

2,4-Д в концентрациях 2 и 3 мг/л являются наилучшими для культивирования зрелых зародышей пшеницы с целью получения хорошо пролиферирующей каллусной ткани. Формирование морфогенной каллусной ткани во всех вариантах отмечалось лишь в 10% случаев.

Известно, что для сохранения морфогенетического потенциала каллусных клеток, необходимо культивировать их на средах, содержащих ауксин в сочетании с цитокинином. Исходя из этого было изучено влияние 2,4-Д в сочетании с различными цитокининами (зеатин, кинетин, БАЛ 0,5 мг/л) на процесс каллусогенеза и морфогенеза. Установлено, что на фоне постоянной концентрации цитокинина (0,5 мг/л), но с повышением концентрации 2,4-Д в питательной среде от 2 до 3 мг/л, во всех вариантах возрастает способность зародышей формировать морфогенную каллусною ткань. Причем в варианте использования 2,4-Д 2 мг/л в сочетании с цитокинином число морфогенных каллусов не превышает 2,5 - 10,6%, в то время как в варианте с 2,4-Д 3 мг/л этот показатель возрастает до 60,0%.

Из всех изученных веществ наибольшую активность проявили природные цитокинины - зеатин и кинетин. В этих вариантах наблюдалось формирование морфогенной каллусной ткани в 30 - 60% случаев, в ю время как в варианте с БАП этот показатель не превышал 16,7-28,5%.

Незрелые зародыши. Изучено влияние различных концентраций 2,4-Д на процесс формирования каллусной ткани у незрелых зародышей. Обнаружена прямая корреляционная зависимость каллусогенеза и морфогенеза от концентрации 2,4-Д в среде. Последующее культивирование первичной и пересадочной каллусной ткани в оптимизированных условиях приводило к формированию морфогенной каллусной ткани в пределах 30-52,5%, что зависело от генотипических особенностей исследуемого объекта. Каллусная ткань сортов Московская 35, Энита и Саратовская 29 имела повышенную морфогенетическую активность и через три субкультивирования этот показатель достигал 45-52,5%, в то время как для остальных генотипов он оставался на уровне 30-40%.

В целях выявления факторов повышения морфогенетической активности каллусных клеток было изучено влияние 2,4-Д в сочетании с различными цитокининами (зеатин, кинетин, БАП) на этот процесс. Установлено, что культивирование незрелых зародышей на питательной среде, содержащей 2,4-Д и один из изучаемых цитокининов, не приводило к значительному увеличению морфогенетической активности каллусной ткани. Наилучшие результаты были получены на

питательной среде, содержащей зеатин, который можно рекомендовать для получения морфогенной каллусной ткани пшеницы. Листовой эксплант. Изучена возможность получения растений-рсгенерантов из изолированных листовых эксплантов различных генотипов пшеницы, а также зависимость этого процесса от условий культивирования, размера и возраста первичного экспланта. Установлена обратная зависимость интенсивности каллусогенеза от возраста экспланта (Рис. 1).

Возраст экспланта, дни

Московская 35 ~Ф~Фортуна —Эн«та —УУУУ-15Э70 Ж ОаЛепп

Рис. 1 Зависимость интенсивности каллусогенеза ( в % от общего числа эксплантов) от возраста первичного экспланта.

Выявлена также зависимость каллусогенеза от генотипа первичного экспланта. У сортов №№-15370 и СМепп наблюдалось образование каллусной ткани из листовых сегментов, изолированных с 3 - 14-дневных проростков, в то время как для других исследуемых генотипов этот процесс заканчивался в 11 дневном возрасте первичного экспланта. Самый высокий показатель по каллусогенезу отмечен у 7-дневного листового экспланта для всех изучаемых сортов.

Изучена также зависимость каллусогенеза пшеницы от размера листового экспланта, которая находится в обратной корреляции. С увеличением размера листового экспланта от 3 до 7 мм уменьшалась их способность формировать каллусную ткань. При длине листового сегмента в 6 мм этот показатель резко снижался, при 8-10 мм формирование каллуса не наблюдалось. Оптимальным для получения хорошо пролиферирующей каллусной ткани является листовой эксплант размером 3-5 мм.

Экспериментальных данных по регенерации злаковых культур из

каллусной ткани листового происхождения пока недостаточно и они носят, в основном, поисковый характер. Не определены концентрации питательных сред для пшеницы, обеспечивающие высокую морфогенетическую активность каллусных клеток. В связи с этим нами испытано большое количество вариантов питательных сред, отличающихся друг от друга концентрацией и соотношением цитокининов и ауксинов, среди которых лучшими оказались два: 1) 2,4-Д 2 мг/л в сочетании с зеатином 0,5 мг/л; 2) НУК 0,5 мг/л в сочетании с БАП 0,5 мг/л. Культивирование каллусной ткани в этих условиях приводило к индукции образования меристематических очагов, дающих начало развитию растений, которые характеризовались интенсивным ростом, яркой окраской листовых пластинок и имели хорошо развитую корневую систему.

Суспензионная культура. Суспензионную культуру получали из хорошо пролифсрирующей, рыхлой каллусной ткани пшеницы трех генотипов: Саратовская 29, Энита и Fortuna. Исследовали влияние различных концентраций 2,4-Д в сочетании с СаСЬ на рост суспензионной культуры. Установлено, что увеличение концентрации 2,4-Д и уменьшение СаСЬ в среде значительно повышают деление клеток и формирование мелкоагрегированной суспензионной культуры. В других вариантах, как правило, суспензия состояла из клеточных агрегатов средних и крупных размеров (более 50 клеток в агрегате), что, вероятно, являлось препятствием активного деления дсдифференцированных клеток. Несмотря на различия в поведении суспензионных культур на разных питательных средах, выявлены общие тенденции в росте клеточных суспензий. С увеличением числа субкультивирований увеличивается способность клеток к делению. Максимум приходится на IV пассаж, а к концу V пассажа интенсивность деления клеток резко уменьшается. Из всех исследуемых генотипов хорошей пролиферативной способностью обладали клетки суспензионной культуры сорта Энита, промежуточное положение занимал сорт Fortuna, а Саратовская 29 отличалась низкой способностью формировать хорошо пролиферирующую суспензионную культуру. Дальнейшее культивирование суспензий на оптимизированной питательной среде в течение VI - VIII пассажей не позволило активизировать рост клеточных культур. По данным ряда авторов (Сидоров, 1990, Бутенко, 1999, Шаяхметов, 1999) это связано с потерей тотипотешности клеток и резкому снижению экспрессии генов, контролирующих этот процесс.

Влияние биологически активных веществ и других факторов на морфогенетический потенииал интактных растений и в культуре in vitro В настоящее время регуляторы роста природного и

синтетического происхождения находят широкое применение в растениеводстве, фитопатологии, селекции и в других областях науки и отраслях производства. Насчитывается более 5 тыс. соединений, полученных из растений и микроорганизмов, обладающих регуляторным действием, из которых лишь 1% используется в мировой практике.

Наряду с веществами химической природы в исследованиях стали использовать физические факторы воздействия на растительный объект: электромагнитные излучения, электрические и магнитные поля, токи высокой частоты и др. Экспериментально доказано, что все эти воздействия имеют сходный механизм действия - активация электронного комплекса молекул, их ионизация, образование свободных радикалов и т.д., что, в свою очередь, приводит к повышению интенсивности биохимических реакций, активности ферментных систем и изменению метаболизма интактных растений (Гунар, Паничкин, 1970, Станко, 1997, Ковалев, 2000). Исследования по использованию нетрадиционных факторов гормональной и негормональной природы в культуре изолированных клеток, тканей и органов растений малочисленны и нередко имеют противоречивые результаты. В связи с этим было изучено действие биологически активных веществ (крезацин, эмистим, фумаран в концентрациях 0,1100 мг/л) и физических факторов (сверх слабое электромагнитное поле: мощность 0,5 ... 1,5 Вт/м2, длина волны 200 ... 300 нм, частота волны 50 МГц, продолжительность воздействия на объект 1 мин 30 сек.) на морфогенез интактных растений пшеницы и в культуре in vitro.

Установлено, что все изучаемые биологически активные вещества проявляют схожее действие на развитие изолированных зародышей пшеницы в условиях in vitro. Показано, что с повышением концентрации веществ в питательной среде уменьшается способность зародышей формировать морфогенный и неморфогенный каллус, но при этом увеличивается морфогенетическая активность зародышей развиваться в проросток, в базальной части которого образуется каллус. Как правило, формирование нормальных по морфологии проростков отмечено лишь в вариантах с фумараном. Эти явления были характерны для всех изучаемых генотипов. Из всех веществ наибольшую активность в процессах каллусогенеза и морфогенеза проявили эмистим и крезацин (0,1 -1 мг/л), в то время как действие фумарапа было на 10-20% ниже.

Аналогичные исследования проведены и по изучению влияния сверх слабого электромагнитного поля на морфогенез изолированных зародышей Исследованию подвергались изолированные зародыши перед введением их в культуру in vitro. Экспериментально доказано, что применение физического фактора стимулирует образование

морфогенного и неморфогенного каллуса. Формирование морфогенного каллуса в этом случае происходит на 30% более интенсивно, чем при использованием эмистима и крезацина. По видимому, это связано с изменением содержания эндогенных гормонов в первичном экспланте. Нами установлено, что содержание гормонов в зародышах после воздействия на них сверх слабым электромагнитным полем изменяется: содержание эндогенных цитокининов повышается в 2-3 раза, а ауксинов снижается в 4-5 раз по сравнению с контрольным вариантом (без обработки). Это в свою очередь и повлияло на проявление большей способности клеток незрелых зародышей формировать морфогенный каллус.

3.2. Морковь.

Особенности каллусогенеза различных генотипов и первичных эксплантов. Показано, что процесс образования каллусной ткани зависит от генотипа. Сорт Rondo и линия 6700 обладали высокой способностью образовывать каллусную ткань (57 -70%), тогда как для линии 906, 805 и 225 этот показатель находился в пределах 24 - 39%. Установлено, что для изучаемых генотипов формирование каллусной ткани происходило по всей поверхности экспланта, начиная с внутренних клеточных слоев на 7-ой день с момента введения их in vitro. Выявлено, что процесс каллусогенеза зависит так же и от происхождения первичного экспланта. Наибольшей способностью к каллусогенезу обладали сегменты черешков по сравнению с сегментами корнеплодов. Поэтому, в последующих экспериментах использовали каллус, полученный из сегментов черешков. Рост суспензионных культур различных генотипов Фазы ростового цикла определяли на суспензионной культуре всех изучаемых генотипов (Рис.2). Полученные данные свидетельствуют о том, что у исследуемых сортообразцов, фазы ростового цикла наступают в разное время. Были выделены линии 225, 906 и сорт Rondo, для которых характерно одинаковое поведение клеток в суспензионной культуре. Лаг-фаза у этих генотипов длилась 7 дней, линейная фаза - 4 дня, затем наступала фаза замедления роста и его S-образная кривая выходила на плато. Для линий 6700 и 805 характерно быстрое или постепенное вступление клеток суспензионных культур в активное деление. Таким образом, экспериментально установлены генотипические различия в скорости деления клеток и роста суспензионных культур, что характеризует различный уровень регенерационного потенциала исходных форм растений моркови.

О 2 5 7 9 11 15

наблюдения, дни

Рис. 2 Характеристика роста суспензионных культур различных генотипов моркови.

Ростовой индекс. Этот показатель регенерационного потенциала определен на трех генотипах моркови(Лои^о, 906 и 805). Установлено, что наибольшую активность роста проявляет сорт Rondo, для которого Ri клеточной суспензии находился в пределах 3,5 ... 5,4, что примерно в 2 раза превышает ростовой индекс линии 906 и в 3-4 раза - линии 805.

При существенных различиях величины ростового индекса, в экспериментах были выявлены и некоторые общие закономерности в поведении клеточных суспензий в процессе культивирования. Установлено, что на IV пассаже наблюдается увеличение Ri у всех исследуемых генотипов. Причем для сорта Rondo ростовой индекс увеличивался в 1,5 раза, а для линий 906 и 805 - 1,3 и 1,1 соответственно. В конце наблюдений (VII пассаж) Ri для всех генотипов приближался к исходным показателям, имевшем место в начале культивирования суспензионной культуры (I пассаж). Вероятно, это связано с адаптационными способностями суспензионных клеток к условиям культивирования.

Жизнеспособность и степень агрегированности суспензионной культуры моркови определяли на разных пассажах (I, IV, VII) трех генотипов ( 906, 805, Rondo). Установлено, что соотношение числа живых и мертвых клеток является стабильной величиной в процессе культивирования in vitro и составляет для линия 906 9:1, для линии 805 -8:2 и для сорта Rondo - 7:3.

По степени агрегированности во всех суспензионных культурах были выделены три фракции: одиночные клетки, мелкие и крупные агрегаты. Установлено, что на I пассаже в суспензиях преобладали одиночные клетки, процент которых составлял 85-100%. На долю мелких агрегатов приходилось всего 15%, а крупные агрегаты отсутствовали вообще. На IV пассаже доля одиночных клеток снижалась до 53-70%, а соотношение мелких и крупных агрегатов было близко к единице. На VII пассаже отмечалось дальнейшее снижение числа одиночных клеток

в суспензии, но при этом возрастало число крупных агрегатов ( линия 906, сорт Rondó). Особо выделялась линия 805, для которой характерно присутствие одиночных клеток в суспензии при длительном ее культивировании.

Морфофизиологические исследования показали, что суспензия состояла из гетерогенных клеток по форме и размеру. При длительном культивировании эти показатели менялись. Для всех исследуемых генотипов на ранних пассажах отмечалось формирование клеток овально-вытянутой формы, большого размера, с крупной вакуолью и мелким ядром. При культивировании клеток в течение восьми пассажей они сохраняли овальную форму, но незначительно уменьшались в размере. Для сорта Rondo и линии 906 было характерно образование крупных агрегатов, состоящих из клеток меристематического типа, в то время как для линии 805 этих изменений не наблюдалось.

Растения-регенеранты получали из каллусной ткани, формировавшейся из клеток суспензионных культур после их платирования в агар. В качестве стимулятора морфогенеза в питательную среду добавляли БАП в концентрации 1 мг/л. В этих условиях выращивания начало морфогенеза отмечалось через 1 неделю с момента культивирования микрокаллуса в данных условиях. Формирование растений-регенерантов происходило через соматический эмбриогенез.

3.3. Картофель.

Недостаточная морфогенетическая активность клеточных культур отдельных сортов картофеля в условиях in vitro, сдерживает эффективность применения методов клеточной селекции и генной инженерии в картофелеводстве. Поэтому необходимым этапом в работах по этим направлениям является изучение в культуре in vitro генотипических особенностей морфогенеза и регенерационной активности различных типов эксплантов картофеля с целью включения их в дальнейшие исследования по клеточной селекции. Особенности каллусогенеза и морфогенеза различных генотипов и эксплантов картофеля Работа проведена на четырех сортах картофеля: Невский, Жуковский ранний, Удача и Дезире. В качестве первичного экспланта использовали сегменты междоузлий пробирочных растений картофеля.

Были выделены сорта, способные интенсивно формировать каллусную ткань (Жуковский ранний и Дезире) и менее интенсивно (Невский, Удача). Эти сортовые особенности отмечались при культивировании каллусной ткани в течение пяти пассажей. При различиях интенсивности каллусогенеза было также установлено, что

максимальный прирост сырой биомассы ткани у всех изученных сортов наблюдался на 1П и IV пассажах.

Выявлена зависимость каллусогенеза у картофеля от концентраций 2,4-Д в питательной среде. Установлено, что из всех изучаемых генотипов особое мссто занимают сорта Жуковский ранний и Дезире, для которых характерен интенсивный рост каллусной ткани, независимо от концентрации 2,4-Д в питательной среде. С увеличением концентрации ауксина указанный показатель возрастал. Для сортов Невский и Удача повышение концентрации 2,4-Д не привело к увеличению интенсивности каллусогенеза. Дтя этих сортов характерно формирование каллусной ткани рыхлой консистенции, не способной к морфогенезу. Установлено, что активная пролиферация каллусной ткани происходит на среде Мурасига и Скуга, содержащей 2,4-Д в концентрации 2-3 мг/л в сочетании с кинетином 0,2 мг/л независимо от исследуемого генотипа.

Первичные экспланты по способности к каллусогенезу расположились в следующей последовательности: междоузлия > листовые сегменты > корневые сегменты > диски микроклубней. Эта же закономерность сохранялась и в способности первичных эксплантов к морфогенезу.

В целях поиска путей и методов повышения интенсивности каллусогенеза различных эксплантов картофеля, было изучено влияние веществ ауксинового типа действия (2,4-Д, ИУК, НУК, ИМК) и их концентраций (1-5 мг/л) на этот процесс. Наибольшей пролиферативной способностью обладала каллусная ткань, полученная на среде с НУК. В этом варианте прирост каллусной массы для сортов Жуковский ранний и Дезире составил 200% и более, в то время как в других вариантах этот показатель не превышал 183%. Для сортов Невский и Удача интенсивность каллусогенеза была в 2 раза ниже. Из всех исследуемых генотипов выделились сорта Дезире и Жуковский ранний, для которых характерно формирование быстрорастущей каллусной ткани, способной в дальнейшем к регенерации растений.

Особенности роста суспензионных культур различных генотипов картофеля. Суспензионную культуру получали из хорошо пролиферирующей каллусной ткани рыхлой консистенции всех изучаемых генотипов. В качестве питательной среды использовали среду МС, содержащую 2,4-Д в концентрации 2 мг/л. На первом пассаже определяли фазы ростового цикла (рис.3). Установлено, что у изучаемых сортов, фазы ростового цикла наступают в одинаковый промежуток времени. Отличия между ними отмечены лишь в активности деления клеток. Как и при каллусогенезе рост суспензионных культур сортов Дезире и Жуковский ранний

значительно превышает в линейной фазе сорта Удача и Невский. Содержание клеток в 1 мл среды у них было в 2 раза выше, чем у сортов Невский и Удача.

_ зо -

•I—i 1-1

Невский

—■—Жуковский ранний I -±—Дмире |

- л—Удача ,

дни наблюдений

Рис. 3 Характеристика роста суспензионных культур различных генотипов картофеля

Таким образом, экспериментально установленные различия в скорости роста каллусных и суспензионных культур изучаемых генотипов пшеницы, моркови и картофеля, позволяют заключить о возможном неодинаковом поведении клеток при последующем их культивировании в стрессовых условиях in vitro. Применение биологически активных веществ или физических факторов воздействия в культуре изолированных клеток, тканей и органов растений является альтернативным способом повышения регенерационной способности дифференцированных и дедифференцированных клеток, используемых в различных биоинженерных экспериментах.

Глава 4. Получение культурального фильтрата патогеных грибов и изучение его действия на интактных растениях и в культурах

in vitro.

4.1. Влияние гриба Septoria nodorum и его экзометаболитов на семена и зародыши пшеницы.

Токсичность гриба S. nodorum на изолированных зародышах. Как правило, селекцию in vitro на устойчивость растений к болезням проводят с использованием КФ гриба. Однако исследователям не всегда удается получить стерильный фильтрат. Поэтому в ряде случаев при клеточной селекции используют совместное культивирование клеток растений и патогена на твердых агаризованных питательных средах. Нами были предприняты попытки определить возможность совместного культивирования гриба и изолированных зародышей на одной

питательной среде in vitro. Результаты свидетельствуют, что с увеличением количества кусочков агара с грибом от 3 до 6 шт. в одной чашке Петри, их токсичность возрастает от 63,6 до 80,1%. Независимо от количества S. nodorum в одной чашке, резко снижается рост побегов и корней по сравнению с контролем.

Получение культуральноро фильтрата гриба S. nodorum. В наших исследованиях гриб S nodorum выращивали на агаризованной питательной среде Мурасига и Скуга (МС), а также на среде Чапека. Для получения селективного фактора - культуральный фильтрат патогена, гриб S. nodorum культивировали в жидких питательных средах на качалке. При таком способе выращивания, гифы гриба сплетались в "клубки", образуя при этом видимые визуально структуры шарообразной формы разных размеров. Питательная среда при этом изменяла цвет и становилась темно-коричневой. Через 7 дней культивирования гриба S. nodorum в жидкой питательной среде был получен культуральный фильтрат, который в дальнейшем использовали в работе по определению его фитотоксической активности на семенах и изолированных зародышах пшеницы.

Влияние экзометаболитов гриба S. nodorum на семена и изолированные зародыши

Семена пшеницы. Установлено, что КФ гриба S. nodorum в различных концентрациях оказывает в той или иной степени токсичное действие на прорастание семян пшеницы. При использовании не разведенного КФ (100%) его токсичность составила всего лишь 51,6%, а при концентрациях 25 и 50% этот показатель значительно уменьшался и составлял соответственно 1,6 и 9,7%. Последнее было обусловлено значительной стимуляцией роста стебля в этих вариантах по сравнению с контролем. Поэтому в последующей серии экспериментов был использован 14-дневный КФ в концентрации 75% (Рис. 4). Из рисунка 4 видно, что семена, испытанных генотипов пшеницы, проявили различную чувствительность к присутствию КФ гриба в среде. Сорт Московская 35 и гибрид 9IS-10 оказались устойчивыми к КФ гриба (токсичность 3,93% и 6,54%, соответственно), Fortuna, Энита, Саратовская 29, 81S-15 - средне устойчивыми (токсичность КФ 19,37 -49,18%), а сорт Gaterin и гибрид WW-15370 оказались не устойчивыми к КФ гриба. Для этих сортов токсичность фильтрата составила 71,24% и 95,3%, соответственно.

lllllll

ES®® s x|8 £ ô 2 га о g ~

5 u о и. 2 <sî

i I a

| 3

Рис. 4 Устойчивость различных i енотипов пшеницы к действию 14-дневного КФ патогена S. nodorum

Таким образом показано, что 7 и 14-дневные КФ гриба S nodorum проявили различную фитотоксическую активность на прорастание семян различных генотипов пшеницы. Причем 14-дневный КФ оказал повышенную токсичность, поэтому для проведения клеточной селекции целесообразно использовать культуральный фильтрат гриба при 14-дневном его выращивании в жидкой питательной среде. Изолированные зародыши. Установлено, что с увеличением концентрации КФ в питательной среде возрастает его токсичность. Так при 75% концентрации она достигает максимума - 87,5 - 98,0% (рис. 5).

7 дней ' 11 дней j 14 дней |

120 т

концентрация КФ,%

Рис. 5 Зависимость токсичности КФ от его концентрации и времени выращивания грнба 5. пос1огит в жидкой питательной среде.

Достаточно высокая токсичность (67,3%) наблюдалась у 14-дневного КФ даже при концентрации 25%. Наличие в питательной среде 11 и 14-

дневного КФ в концентрации 50% было также токсично для образования проростков из изолированных зародышей, а 7-дневный КФ в той же концентрации был практически нетоксичен и оказывал стимулирующий эффект на формирование более длинной корневой системы (2,9 см по сравнению с 1,9 см в контроле).

4.2. Влияние экзометаболитов гриба Alternaría radicina на прорастание семян и рост суспензионной культуры моркови.

Получение культурального фильтрата гриба Alternaría radicina осуществляли путем культивирования патогена в жидкой питательной среде Мурасига и Скуга, а также Чапека. Учитываемым фактором служила токсичность культурального фильтрата гриба, после фильтрования среды и освобождения ее от гифов патогена, которую определяли в динамике по прорастанию семян моркови сорта Rondo. Установлено, что 30-дневный КФ патогена, полученный на питательной среде Чапека оказывает свое ингибирующее действие на прорастание семян моркови в 7 раз больше по сравнению с КФ, полученным на среде Мурасига и Скуга. Это в дальнейшем было доказано на семенах других генотипов моркови, которые, проращивали на 100% культуральном фильтрате, полученном на среде Чапека. В этих вариантах наблюдалось ингибирование прорастания семян в 80 - 95% случаев.

Выявлено, что при длительном культивировании гриба Alternaría radicina в жидкой питательной среде, агрессивность данного патогена уменьшалась, что не позволяет проводить отбор клеток в более жестких селективных условиях in vitro.

Особенности прорастания семян моркови на культуральном фильтрате гриба Alternaría radicina. полученном разными способами. Изучено влияние: 1) автоклавированного и неавтоклавированного КФ гриба; 2) автоклавированного и неавтоклавированного КФ, полученного при совместном культивировании клеток суспензионной культуры моркови и патогена; 3) долго хранящегося КФ при пониженной температуре (+2° С). Установлены закономерности в токсичности КФ, полученного разными способами, на прорастание семян. При использовании неавтоклавированного культурального фильтрата всхожесть семян уменьшается по сравнению с использованием автоклавированного фильтрата. При применении КФ гриба A radicina, полученного при совместном культивировании патогена и суспензии клеток его существенное ингибирующее действие проявлялось уже при концентрации 50%. Несмотря на отмеченное ингибирующее действие фитотоксичных метаболитов патогенного гриба на всхожесть семян, выявлен некоторый стимулирующий эффект ростовых процессов в случае использования КФ в низких концентрациях (25%). Для сорта

Rondo и линии 805 в этом варианте длина проростков была больше по отношению к контролю на 12-25%. Для линии 906 этот показатель в данном варианте находился на уровне контроля. Экспериментально установлено, что использовать в качестве селектирующего фактора КФ гриба A. radicina, долго хранящегося при пониженных температурах, возможно, поскольку его токсическое действие не снижается по мере хранения КФ в холодильнике по сравнению со свежеполученным КФ. Особенности роста суспензионных культур моркови на культуральном фильтрате гриба A. radicina. Для дополнительного доказательства большей токсичности КФ, полученного на разных питательных средах, были проведены эксперименты и с суспензионной культурой. В жидкую питательную среду культуральный фильтрат гриба добавляли в концентрациях 10 - 50%. Установлено, что для всех изучаемых генотипов характерна общая тенденция поведения клеток суспензий в стрессовых условиях. С увеличением концентрации КФ в питательной среде уменьшается ростовой индекс. Однако при концентрации фильтрата 10% (полученного на среде Мурасига и Скуга) и 20% (полученного на среде Чапека) Ri заметно повышается. Увеличение концентрации КФ гриба в питательной среде до 40% снижало ростовой индекс в 3 раза при использовании фильтрата, полученного на среде Чапека и Ri находился на уровне контроля при использовании среды Мурасига и Скуга (Рис 6.). Это доказывает, что культуральный фильтрат, полученный на среде Чапека содержит больше токсинов, которые ингибируют рост и деление клеток.

♦ контроль —•—среда Чале» I

—А—среда Мурасига-Скуга

20% 30% 40% 50% Концентрация КФ, %

Рис. 6 Изменение числа клеток в суспензии моркови (сорт Rondo) в зависимости от концентрации КФ гриба A. radicina.

4.3. Влияние зкзометаболитов гриба Rhizoctonia solani на рост растений картофеля in vitro, каллусные и суспензионные культуры.

Получение кулыпуралъного фильтрата гриба R solani В работе испытывали культуральный фильтрат, полученный при культивировании патогена в жидкой питательной среде Мурасига и

Скута, а также Чапека в течение 30 дней с последующим определением его токсичности по росту пробирочных растений картофеля (сорт Жуковский ранний). Установлено, что при выращивании патогена на среде Чапека начало активного выделения экзометаболитов в питательную среду приходится на 20-й день с начала культивирования патогена. В этом случае токсичность КФ составила 59,2%. При дальнейшем культивировании гриба наблюдалось значительное повышение токсичности культуральной жидкости, которая достигала максимума на 40-й день выращивания гриба и составила 93,7%. Последующее культивирование патогена в течение 30 дней (с 40-ого по 70-й день) приводило к незначительным изменениям токсичности раствора, что свидетельствовало о прекращении выделения экзометаболитов в питательную среду.

При культивировании гриба Rhizoctonia solani па питательной среде MC, начало активного выделения токсинов наблюдалось лишь на 40-й день и токсичность фильтрата в этом случае была в 5 раз меньше по сравнению со средой Чапека и составила 27,1%. Максимальное ингибирующее действие КФ получено на 60-й день культивирования и составило 49,5%. Дальнейшее культивирование гриба на среде MC в течение последующих 10-ти дней (с 60-ого по 70-й) не приводило к увеличению токсичности КФ патогена.

Влияние культурального фильтрата гриба R. solani на рост пробирочных растений Установлено, что повышенные концентрации КФ гриба в питательной среде приводят к ингибированию ростовых процессов. Так, при концентрации КФ 90% наблюдалось уменьшение длины и массы побегов. В этом варианте формировались растения с укороченными междоузлиями, о чем свидетельствовало наличие одинакового количества листьев на побегах, культивируемых в различных стрессовых условиях. Наряду с ингибирующим действием фитотоксичных метаболитов патогенного гриба, отмечен некоторый стимулирующий эффект ростовых процессов в случае использования КФ в низких концентрациях ( 25% и 50%). В этих вариантах длина побегов была выше по сравнению с контролем в среднем на 8-12%. Влияние культурального фильтрата гриба R solani на рост каллусной ткани. При работе с каллусной культурой, основным критерием оценки влияния селективного фактора является рост каллусной ткани в стрессовых условиях, который определяется по приросту ткани в начале и конце пассажа (табл.1).

Из таблицы 1 следует, что с увеличением концентрации КФ в питательной среде снижается рост каллусной ткани. Эта закономерность характерна для всех изучаемых генотипов Интенсивность роста каллусных клеток в стрессовых условиях имеет генотипическую

зависимость. Для сорта Невский и Удача характерно значительное ингибирование ростовых процессов стрессовым фактором. Для сортов Жуковский ранний и Дезире отмечалась активная пролиферация каллусной ткани, что привело к увеличению прироста клеток на 1

питательных средах, содержащих КФ патогена в концентрации 10% и 20% в среднем на 17 - 40%. Для всех изучаемых генотипов, как и в случае с пробирочными растениями, наблюдался стимулирующий эффект низких концентраций КФ.

Таблица 1

Прирост каллусной ткани картофеля, культивируемой на селективной среде с КФ патогена ( в % к начальной массе каллуса, I пассаж).

Сорт Концентрация КФ, %

контроль 10 20 30 40 50

Невский 63,5+4,1 80,8±4,3 46,412,9 42,2±3,7 40,012,5 39,413,0

Жуковский ранний 135,5±7,0 149,7±8,5 152,3+8,8 146,518,0 140,717,9 139,8+7,2

Удача 75,2±3,8 9б,5±5,0 58,7±3,0 39,3+3,1 34,512,2 32,512,8

Дезире 132,416,1 160,518,3 173,819,4 111,4+6,2 116,316,0 71,4+4,3

Влияние культурального фильтрата гриба К. яЫат на рост суспензионной культуры. Селективный фактор добавляли в питательную среду в концентрациях 10 - 50%. Учитывали ростовой, индекс, жизнеспособность суспензионной культуры и степень ее агрегированное™.

Исследования выявили близкие реакции в поведении клеток суспензионных культур, культивируемых в течение I пассажа на питательных средах, содержащих культуральный фильтрат гриба в различных концентрациях. Установлено, что при использовании КФ патогена в низких концентрациях (10%, 20%) наблюдался стимулирующий эффект ростовых процессов. Для суспензионной культуры ростовой индекс в этих вариантах был ниже по сравнению с контролем, но выше чем в остальных вариантах. Повышение концентрации КФ гриба ( 30% - 50%) приводило к снижению ростовых процессов. Особенно это проявлялось на суспензионных культурах сортов Невский и Удача. В вариантах, где концентрация КФ патогена составляла 40% и 50%, прирост суспензионной культуры не был отмечен из-за 100%-ной гибели клеток (сорт Удача) (Рис. 7).

концентрация КФ, %

I * Дезире —И—Жуковский ранний * Невский ■ Удача

Рис. 7 Жизнеспособность суспензионной культуры различных генотипов картофеля в зависимости от концентрации КФ патогена R. solani

Наибольшей жизнеспособностью отличались клетки суспензионных культур сортов Жуковский ранний и особенно Дезире. Для этих генотипов независимо от условий культивирования (присутствие в питательной среде стресс-фактора) ростовой индекс уменьшался незначительно. Установлено, что степень arpei ированности суспензионной культуры увеличивалась с увеличением концентрации КФ в питательной среде и не зависела от исследуемого сорта.

Итак, проведенные исследования свидетельствуют, что фитотоксичность экзометаболитов возбудителей болезней S nodorum, А. radicina, R. solani в условиях in vitro в значительной мере зависит от состава и соотношения инградиентов питательной среды, способа и продолжительности культивирования патогена in vitro, а также его концентрации. Выращивание изолятов гриба в жидкой питательной среде Чапека повышает фитотоксичность КФ грибов в 5-7 раз по сравнению с КФ, полученного на среде Мурасига и Скуга. Низкие концентрации КФ оказывают стимулирующее влияние на рост интактных растений и клеток каллусных и суспензионных культур (пшеница, морковь, картофеля), высокие - ингибирующее действие. Выбор концентрации КФ патогенов, при селекции растений in vitro, должен обеспечивать 50% его токсичность и зависит от видовых особенностей исследуемых объектов.

Глава 5. Клеточная и тканевая селекция пшеницы, моркови и картофеля с использованием селективных сред на устойчивость к грибным патогенам.

5.1. Тканевая селекция пшеницы на устойчивость к патогену S. nodorum.

Исследования, проведенные на каллусной ткани, полученной из зрелых и незрелых зародышей, выявили общие особенности поведения каллусных клеток в стрессовых условиях, независимо от применяемой схемы селекции. На первом этапе селекции (I - Щ пассажи) формировался в 85%-ах случаев каллус средней плотности, ярко-желтого цвета, в котором дифференцировались меристематические клетки. К концу IV пассажа в 50%-ах случаев отмечалось образование каллусной ткани бурого цвета без признаков морфогенеза. Последующее ее культивирование на среде без селектирующего фактора (второй этап селекции) повлияло на восстановление пролиферирующей активности каллусных клеток, которые были способны к морфогенезу. Из меристематических очагов в дальнейшем формировались нормальные растения. На третьем этапе селекции (повторное культивирование каллусных клеток на среде с КФ патогена) наблюдалась гибель каллусной ткани в 40% случаев и формирование рыхлой оводненной ткани, состоящей на 70% из сильно вакуолизированных клеток. На этом этапе селекции проведена оценка каллусной ткани по приросту. Установлено, что присутствие в питательной среде КФ гриба в различных концентрациях заметно ингибирует пролиферацию каллусной ткани у всех исследуемых генотипов пшеницы. С повышением концентрации КФ уменьшается прирост каллусной ткани на 26-60%. Исключение составили генотипы 91S, Московская 35, Энита, Fortuna, для которых независимо от концентрации КФ, каллусная ткань имела стабильный прирост. Вероятно, данные генотипы обладают большей устойчивостью к грибу Septoria nodorum по сравнению с остальными исследуемыми сортообразцами. Причем для данных генотипов отмечено формирование в каллусной ткани меристематических зон, из которых в дальнейшем получены растения-регенеранты.

Культивирование каллусных клеток в селективных условиях в течение восьми пассажей позволило отобрать каллусные линии, устойчивые к КФ гриба S nodorum, которые были перенесены на питательные среды для регенерации. В качестве стимулятора морфогенеза в питательную среду добавляли зеатин в концентрации 1 мг/л. Число растений-регенерантов, полученных из каллусной ткани после ее культивирования на селективных средах, представлено в таблице 2.

Для каллусов, полученных из зрелых зародышей, также было характерно формирование растений-регенерантов после проведения клеточной селекции. Однако морфогенетическая активность каллусной

ткани была в 6-7 раз ниже, по сравнению с каллусами из незрелых зародышей. Единичные растения-регенеранты получены лишь для сортов Энита, Московская 35 и 91Б.

Таблица 2

Растения-регенеранты, полученные из клеток, прошедшие отбор на селективных средах с КФ патогена 5. поФ)гит (незрелые зародыши).

Генотип схема селекции всего растений, шт

Энита 4(5% КФ) 1 (0 КФ) 4(5% КФ) 3

4(5% КФ) 1 (0 КФ) 4(5% КФ) 3

Московская 35 4(10% КФ) 1(0 КФ) 4(10% КФ) 4

4(15% КФ) 1(0 КФ) 4(15% КФ) 4

Fortuna 4(5% КФ) 1(0 КФ) 4(5% КФ) 2

91S 1(10% КФ) 1(0 КФ) 1(10% КФ) 1(0 КФ) 1(10% КФ) 1(0 КФ) (10% КФ) 2

4(15% КФ) 1(0 КФ) 4(15% КФ) 3

Саратовская 29 1(5% КФ) 1(0 КФ) 1(5% КФ) 1(0 КФ) 1(5% КФ) 1(0 КФ) 1(5% КФ) 1(0 КФ) 1(5% КФ) 1(0 КФ) 1

Galerín 1(5% КФ) 1(10%КФ) 1(15% КФ) 1(20% КФ) 1(0 КФ) 1(5% КФ) 1(10% КФ) 1(15% КФ) 1(20% КФ) 2

81S 4(5% КФ) 1(0 КФ) 4(5% КФ) 3

*цифры 1,4- обозначают количество проведенных пассажей

Зерновки первого поколения были проверены в лабораторных условиях по прорастанию на устойчивость к патогену. Установлено, что проростки, полученные из зерновок растений-регенерантов, обладали устойчивостью к КФ гриба Septoria nodorum на 10-15% больше по сравнению с исходным генотипом. Для отдельных сортов (Московская 35) устойчивость повышалась до 25%.

5.2. Клеточная селекция моркови на устойчивость к патогену Alternaría radicina. Влияние экзометаболитов гриба A. radicina на рост суспензионной культуры. Изучено поведение клеток суспензий моркови при длительном их культивировании на селективных средах. Оценивали ростовой индекс, жизнеспособность и степень агрегированное™ суспензионной культуры на I, IV и VIII пассажах. Установлено, что с увеличением содержания КФ в среде снижается ростовой индекс и жизнеспособность клеток во всех вариантах в 2-3 раза по сравнению с контролем. При изучении этого показателя в динамике выявлено, что на VIII пассаже селекции, Ri увеличивался по сравнению с предыдущими пассажами, но все же оставался ниже контроля. Вероятно, это связано с адаптацией клеток к стрессовым условиям и появлением большого числа жизнеспособных клеточных агрегатов. Определена

генотипическая особенность зависимости Ri от содержания КФ гриба в среде. Для линии 906 Ri во всех вариантах был снижен в 3 раза, для линии 805 и сорта Rondo - в 2 раза. Из этого следует, что клеточную селекцию линии 906 целесообразно проводить при низких концентрациях КФ (20 - 30%), так как более высокие концентрации приводят к значительному ингибированию ростовых процессов. Экспериментально установленные условия позволяют культивировать клетки на селективных средах в течение длительного времени.

Выявлено, что на ранних этапах культивирования (I пассаж), суспензионная культура состояла из одиночных клеток (60-80%) и мелких агрегатов (20-30%). Фракция крупных агрегатов на этом этапе отмечена лишь для линии 805 и составляла 20-25%. Дальнейшее культивирование клеточных суспензий в стрессовых условиях снижало содержание одиночных клеток и мелких агрегатов и увеличивало долю крупных агрегатов, процентное число которых составляло 50% и более. Изменение степени агрегированное™ клеточных суспензий было характерно для всех изученных нами генотипов моркови.

После селекции суспензионную культуру платировали в агар с целью получения растений-регенерантов. Морфогенез индуцировали на питательных средах, содержащих различные вещества с цитокининовой активностью (БАП, зеатин, 2гр, эпин). Установлено, что эпин и все изучаемые цитокинины способны стимулировать образование соматических эмбриоидов и этот процесс зависел от применяемого гормона - стимулятора. При добавлении в питательную среду БАП начало морфогенеза отмечалось через 8-9 недель после инокуляции суспензии в агар, при добавлении 2ip - через 3 недели, а при добавлении зеатина или эпина - через 1 неделю. Это характерно только для суспензии, которая прошла цикл селекции, так как в контрольном варианте морфогенез начинался уже на первой неделе культивирования клеточных колоний после платирования, независимо от присутствия в питательной среде того или иного исследуемого вещества. Данные о числе полученных растений-регенерантов, после клеточной селекции, представлены в таблице 3.

Растения-регенеранты контрольного варианта и полученные из клеток культивируемых на селективных средах, были проверены в лабораторных условиях на устойчивость к патогену Alternaría radicina Пробирочные растения культивировали на питательной среде, содержащей КФ гриба В концентрации 95%. Установлено, что выживаемость растений-регенерантов в этих условиях, полученных после селекции in vitro выше на 30% для линии 906 и на 50% для сорта Rondo.

Таблица 3

Число растений-регенерантов моркови, полученных после культивирования клеток на питательных средах с КФ патогена А. гайкта

Генотип Схема селекции Всего растений, шт

906 3(30% КФ) 1(0 КФ) 4 (30% КФ) 50

3(40% КФ) 1(0 КФ) 4 (40% КФ) 14

3(50% КФ) 1(0 КФ) 4 (50% КФ) 10

Rondo 3(30% КФ) 1(0 КФ) 4 (30% КФ) 25

3(40% КФ) 1(0 КФ) 4 (40% КФ) 10

3(50% КФ) 1(0 КФ) 4 (50% КФ) 5

* цифры 3,1,4 - обозначают количество проведенных пассажей

5.3. Тканевая и клеточная селекция картофеля на устойчивость к патогену Rhizoctonia solani.

Тканевая селекиия картофеля на устойчивость к R. solani. Селекцию in vitro проводили на хорошо пролиферирующей каллусной ткани, полученной из стеблевых эксплантов картофеля способной к морфогенезу. В качестве стресс-фактора использовали 30-дневный культуральный фильтрат гриба Rhizoctonia solani в концентрациях 1050%. Установлены общие особенности поведения каллусных клеток картофеля, культивируемых в стрессовых условиях в течение шести пассажей. На ранних этапах селекции (I и II пассажи) показано, что низкие концентрации КФ патогена (10-20%) значительно стимулируют процесс каллусогенеза, в то время как высокие концентрации (40-50%) -оказывают ингибирующий эффект. Определены условия, необходимые для проведения клеточной селекции - наличие в питательной среде КФ патогена в концентрации 30-40%. В этих условиях наибольшей пролиферативной способностью обладала каллусная ткань сортов Дезире и Жуковский ранний, для которых характерно сохранение высокого прироста ткани (30-60%) даже в конце VI пассажа. Для сорта Невский этот показатель постепенно снижался и к концу VI пассажа составил 10%, а для сорта Удача на этом пассаже отмечалась полная гибель каллусных клеток. Вероятно, клетки каллусной ткани сорта Удача не способны адаптироваться к действию экзометаболитов гриба Rhizoctonia solani.

Клеточная селекиия картофеля на устойчивость к R. solani Культивирование суспензионной культуры в стрессовых условиях проводили в течение восьми пассажей. Установлено, что высокие концентрации КФ (40 - 50%) приводили к значительному снижению жизнеспособности суспензионных культур, за счет быстрой гибели клеток. При культивировании суспензионной культуры четырех генотипов картофеля в стрессовых условиях выявлены одинаковые реакции клеток на действие культурального фильтрата гриба. Отмечено,

что с увеличением продолжительности выращивания клеток на питательных средах в присутствии селективного фактора, заметно снижалась жизнеспособность суспензионных культур. При высоких концентрациях стресс-фактора этот показатель составил 0 - 8,3%. Выявлены генотипические особенности поведения клеток '

суспензионных культур, культивируемых на питательных средах, содержащих селективный фактор. Из всех изучаемых сортов лишь для сорта Дезире была отмечена высокая адаптационная способность клеток л

суспензионных культур к стрессовым условиям. Это проявлялось в увеличении жизнеспособности клеток и Ri. Сорт Удача оказался неустойчивым к действию культурального фильтрата гриба Rhizoctonia solani. Жизнеспособность данной суспензионной культуры на среде, содержащей КФ в концентрации 10% составила всего 3,8-28,6%. Для суспензионной культуры сорта Жуковский ранний только на II - IV пассажах наблюдался стимулирующий эффект действия вторичных экзометаболитов гриба Rhizoctonia solani (10-20%), в то время как при концентрации КФ 30% этот показатель снижался до 5-17%. Сорт Невский занимал промежуточное положение по устойчивости к изучаемому фактору, так как жизнеспособность клеток суспензионных культур постепенно снижалась и находилась в обратной корреляции от концентрации КФ в среде и числа субкультивирований.

Таким образом, селекцию in vitro растений возможно проводить на каллусных и суспензионных культурах, выбор которых зависит от видовых особенностей выбранных объектов и способности дифференцированных клеток к реализации морфогенетического потенциала. Для пшеницы оптимальный эффект в селекции in vitro достигается на каллусной ткани при ее культивировании на среде, содержащей 20% КФ S. nodorum, для моркови - на суспензионной культуре на среде с 30-50% КФ A. radicina, для картофеля - на каллусной и суспензионной культурах, на средах с 30-40% КФ R. solani

Глава 6. Участие фитогормоиов в клеточной селекции растений к

экзометаболитам патогеиых грибов. «

Известно, что процесс адаптации клеток и интактных растений к факторам абиотической и биотической природы находится под контролем гормональной системы. Однако работы, свидетельствующие о существенной роли гормонального баланса в адаптации каллусных и "

суспензионных культур, длительно культивируемых на питательных средах в присутствии экзометаболитов патогенов, малочислены, а полученные результаты противоречивы. Поэтому представляет интерес выяснения действительного участия фитогормонов в этом процессе.

Селективные условия и гормональный баланс клеток суспензионной культуры и растений-регенерантов моркови. Изучение гормонального баланса суспензионных культур, культивируемых на питательных средах, содержащих КФ в концентрации 20% (со стимулирующим эффектом) и 40% (эффект ингибирования), позволило выявить существенные различия по содержанию фитогормонов в клетках (табл. 4). При культивировании клеток суспензии на средах, содержащих 20% КФ, наблюдается увеличение содержания ИУК и цитокининов, в то время как на средах с 40%-ным КФ количество этих гормонов были значительно ниже по сравнению с контролем. Синтез же эндогенной ГК с увеличением концентрации КФ у обоих генотипов увеличивался. Это влияло на процесс растяжения клеток и проявлялось в формировании клеток крупных размеров и вытянутых форм. Абсцизовой кислоты в клеточных культурах ни в одном из исследуемых вариантов обнаружено не было.

Таблица 4

Содержание гормонов (мкг/г сух. масса) в суспензионной культуре моркови, культивируемой на среде с содержанием селективного фактора, I пассаж.

Генотип Конц. КФ, % ФИТОГОРМОНЫ

ИУК ЦК АБК ГК

Линия 906 Контроль 0,0846 261,65 - 0,3995

20 0,1083 287,91 - 0,4733

40 0,029 6,51 - 1,7905

Сорт Rondo Контроль 0,0397 13,75 - 2,6311

20 0,0528 346,98 - 2,9412

40 0,0130 7,48 - 3,1268

В дальнейшем было изучено поведение клеток суспензии моркови в присутствии 40% культурального фильтрата в течение селекции in vitro (I, IV, VIII пассажи) и их гормональный баланс (табл. 5). Результаты свидетельствуют, что процесс адаптации клеток к действию стрессового фактора происходит за счет увеличения синтеза ауксинов и цитокининов в процессе длительного их культивирования in vitro.

Установлено, что при культивировании суспензионной культуры моркови сорта Rondo в стрессовых условиях в процессе адаптации проявляется роль такого гормона как АБК, что говорит о некоторой разнице в механизмах адаптации у разных генотипов моркови. В контрольном варианте, не содержащем стресс-фактора, при длительном культивировании суспензионной культуры вне зависимости от генотипа наблюдалось снижение содержания всех гормонов-стимуляторов. По-видимому, это связано со старением культуры, а разница в

количественном уменьшении этих гормонов у линии 906 и сорта Rondo можно объяснить сортовыми особенностями.

Таблица 5

Содержание гормонов (мкг/г сух. масса) в суспензионной культуре моркови при культивировании ее в стандартных и стрессовых условиях на разных

пассажах.

№ Вариант ФИТОГОРМОНЫ

пассажа ИУК ЦК АБК гк

линия 906

I Контроль 0,0846 261,65 - 0,3995

КФ 40% 0,029 6,51 - 1,7905

IV Контроль 0,0138 128,33 - 0,2701

КФ 40% 0,102 90,69 - 0,8397

VIII Контроль 0,0083 8,91 - 0,0952

КФ 40% 0,126 92,05 - 0,8759

сорт Rondo

I Контроль 0,0397 13,75 - 2,6311

КФ 40% 0,013 7,48 - 3,1268

IV Контроль 0,0154 6,84 - 0,5390

КФ 40% 0,018 4,26 1,029 0,3251

vni Контроль 0,0106 4,92 - 0,7781

КФ 40% 0,0209 16,24 0,72 2,1055

В конце VIII пассажа из клеток, культивируемых в контрольном и опытном (после селекции от vitro) вариантах, были получены растения-регенеранты, которые в дальнейшем переносили на питательную среду, содержащую 95% КФ патогена Alternaría radicína.

Определение фитогормонов в таких растениях-регенерантах показало, что полученные в результате клеточной селекции растения содержат значительно больше ауксинов, гиббереллинов и особенно -цитокининов по сравнению с контрольным вариантом (табл. 6).

Известно, что существенную роль в адаптации к стрессовым воздействиям у растений играют такие гормоны как АБК и ЦК, а в процессах репарации после стресса - и ИУК. Доказана экспрессия генов под воздействием ЦК и АБК, которая приводит к синтезу стрессовых белков, изменению метаболизма и как результат - адаптации организма к стрессам (Дьяков, Озерецковская, Джавахия, Багирова, 2001, Тарчевский, 2002). Полагаем, что в результате стресса, каким является культуральный фильтрат патогена, начинаются модификационные изменения, которые проявляются в виде реакции устойчивости к неблагоприятным факторам, одной из которых и является изменение гормонального баланса культуры клеток моркови.

Таблица 6

Содержание гормонов (мкг/г сух. массы) в растенинх-регенерантах.

Генотип Вариант ФИТОГОРМОНЫ

ИУК ЦК АБК ГК

Линия 906 Контроль 0,1936 572,77 - 39,965

В результате селекции 0,2306 2274,58 - 550,346

Сорт Rondo Контроль 19,960 28,09 - 186,764

В результате селекции 23,264 6027,39 - 439,258

Селективные условия и гормональный баланс клеток суспензионной культуры картофеля Изучен гормональный баланс суспензионных культур картофеля двух сортов - Удача и Невский, культивируемых на питательных средах с содержанием КФ патогена 10, 30 и 40%, а также на средах не содержащих селективный фактор (контроль). Исследования выявили существенные различия по содержанию эндогенных гормонов в клетках суспензий (Табл. 8). В вариантах, где культуральная жидкость патогена оказывала стимулирующий эффект (10% для сорта Удача и 30% для сорта Невский), содержание ИУК и цитокининов было выше, а уровень АБК был на уровне или ниже контроля. С увеличением концентрации селективного фактора в среде выше оптимальной, для каждого из сортов, снижался уровень гормонов-стимуляторов - ИУК, ЦК, ГК и значительно увеличивался уровень гормона-ингибитора - АБК, что говорит о сильном стрессовом воздействии КФ патогена данных концентраций и ускоренном процессе старения клеток.

Усиление защитных реакций растений может происходить, например, за счет накопления и отложения лигнина в местах внедрения патогена. Цитокинины способны усиливать лигнификацию клеточных стенок, что делает растительную ткань менее доступной для экзометаболитов патогенов. Можно предположить, что повышенное содержание цитокининов в клетках, возможно, ведет к некоторому механическому укреплению клеточных стенок, что делает их более устойчивыми к проникновению патогена или его токсинов. Повышение устойчивости растений к фитопатогенам также связано и со стабилизацией баланса ИУК/АБК и увеличением содержания ЦК (Ярулина, Максимов, 1999). Такое соотношение фитогормонов приводит, вероятно, к активации обмена веществ в растении, в результате чего в инфицированных тканях происходит интенсивное накопление лигнина, приводящее к локализации патогена и подавлению его развития.

Таблица 8

Содержание фитогормонов (мкг/г сухой массы) в суспензионной культуре картофеля, культивируемой в стандартных и стрессовых условиях, I пассаж.

Сорт Конц. КФ патогена, % ФИТОГОРМОНЫ

ИУК ЦК ГК АБК

УДАЧА Контроль 1,05 5,47 1,98 0,36

10 0,81 12,24 0,83 0,35

30 0,69 6,25 1,45 1,68

40 0,20 2,52 2,93 3,70

НЕВСКИЙ Контроль 0,23 2,41 2,10 1,78

10 0,33 2,12 1,88 0,66

30 0,50 11,15 1,34 1,39

40 0,22 2,84 2,10 2,47

Данные свидетельствуют о том, что соотношение ИУК/АБК в клетках суспензионных культур таких сортов как Дезире и Жуковский ранний, культивируемых в стрессовых условиях (табл. 9) на протяжении восьми пассажей, величина постоянная. Для сорта Дезире она составляет 2,6-2,69, а для сорта Жуковский ранний - 0,38-0,43. Для остальных исследуемых сортов это соотношение не являлось величиной постоянной. Для сорта Удача оно изменялось от 0,22 до 0,10, а для сорта Невский - от 0,35 до 0,15. Низкая устойчивость клеточных суспензий этих сортов к стрессовому фактору была обнаружена нами в более ранних исследованиях.

Следует отметить, что в контрольном варианте соотношение ИУК/АБК было стабильным у сортов Дезире и Жуковский ранний при культивировании суспензионных культур на протяжении восьми пассажей, а для сортов Удача и Невский оно уменьшалось к VII пассажу за счет резкого увеличения уровня АБК в культуре (сорт Удача) и снижающегося уровня ИУК (сорт Невский). Более того, значительное увеличение уровня АБК в суспензионной культуре сорта Удача привело к быстрому их старению и гибели культуры.

Установлены некоторые закономерности по содержанию эндогенного цитокинина в клетках суспензионных культур, культивируемых в стандартных и стрессовых условиях. Так, для клеток, находящихся в стандартных условиях характерно уменьшение, а для клеток, находящихся в стрессовых условиях - увеличение содержания цитокининов, особенно значительное - в культурах клеток сорта Дезире и Жуковский ранний.

Таблица 9

Содержание фитогормоиов ( мкг/г сухой массы) в суспензионной культуре различных генотипов картофеля.

Сорт № пас- ФИТОГОРМОНЫ

сажа ИУК ЦК ГК АБК

стандартные условия культивирования

I 1,05 5,48 1,98 0,36

УДАЧА IV 0,56 8,73 1,00 0,54

vra 0,14 0,90 1,05 0,35

i 0,48 1,18 0,33 0,34

ДЕЗИРЕ IV 0,42 1,13 1,93 0,31

vni 0,40 0,99 2,64 0,31

I 0,22 2,41 2,10 1,78

НЕВСКИЙ IV 0,72 6,03 13,64 1,69

VIII 0,58 1,36 14,74 1,02

ЖУКОВС- I 0,61 5,23 1,77 1,59

КИЙ IV 0,43 4,40 1,28 1,70

РАННИЙ VIII 0,37 4,31 1,04 1,84

стрессовые условия культивирования

I 0,76 6,25 1,45 1,67

УДАЧА IV 0,21 1,51 2,93 2,26

VIII * - - -

I 3,88 1,17 0,86 1,46

ДЕЗИРЕ IV 3,43 1,53 0,41 1,29

vni 4,76 1,72 0,35 1,76

I 0,50 11,15 1,34 1,39

НЕВСКИЙ IV 0,28 6,63 1,65 1,87

VIII 0,52 4,94 1,91 2,59

ЖУКОВС- I 0,65 10,64 0,55 1,48

КИИ IV 0,68 17,43 0,13 1,61

РАННИИ VIII 0,70 18,11 0,183 1,85

Примечание * - культура погибла

Таким образом, адаптация дедифференцированных клеток и

повышение устойчивости растений-регенерантов к действию

экзометаболитов патогенных грибов, находится под контролем

эндогенного содержания гормонов-стимуляторов, особенно цитокининов и ауксинов, и их соотношения, что необходимо учитывать при проведении работ по селекции in vitro

Глава 7. Участие фенольных соединений в адаптации клеточных культур in vitro к действию экзометаболитов патогенных грибов.

Влияние экзометаболитов гриба Alternaría radicina на образование фепольных соединений в суспензионных культурах и растениях-регенерантах различных генотипов моркови Объектом исследования служили 20-дневныс проростки, суспензионные культуры и растения-регеперанты 2-х генотипов моркови сорта Rondo и линии 906. Установлено, что у изучаемых генотипов ответная реакция интактных растений (20-дневные проростки) на действие стресс-фактора (100% КФ патогена A radicina) различна. Установлено, что в контрольном варианте наибольшее содержание фенольных соединений отмечено у 20-ти дневных проростков сорта Rondo, в то время как для линии 906 в этом варианте их количество было на 40% ниже. Проростки, культивируемые на среде, содержащей 100% КФ патогена, характеризовались более высоким уровнем фенольных соединений по сравнению с условиями культивирования контрольного варианта. Причем для линии 906 их количество повышалось в стрессовых условиях на 50%, в то время как для сорта Rondo - лишь на 12%. Можно предположить, что для линии 906 действие КФ патогена приводит к «запуску» повышенной программируемой защитной реакции, проявляющейся в увеличении синтеза фенольных соединений. Для сорта Rondo, вероятно, уровень фенольных соединений в клетках настолько велик, что действие КФ патогена не приводит к значительным его изменениям. Это свидетельствует о том, что растения данного сорта потенциально способны выдерживать действие высоких концентраций стресс-фактора.

Суммарное содержание фенольных соединений определяли в клеточных суспензиях в динамике на I, IV и VIII пассажах селекции и в контрольном варианте. Как следует из данных, представленных на рисунке 8, на I пассаже содержание фенольных соединений в контрольном варианте сорта Rondo выше на 25% по сравнению с линией 906. Последующее культивирование клеточных суспензий в контрольном варианте не приводило к существенным изменениям количественного содержания фенольных соединений. Это свидетельствует о том, что при длительном культивировании клеток в стандартных условиях не наблюдается изменений в фснольном метаболизме. Присутствие КФ патогена в питательной среде в различных концентрациях приводило на I пассаже к уменьшению синтеза фенольных соединений в среднем на 10-12% по сравнению с контролем. Причем для линии 906 воздействие селективного фактора (50% КФ) существенно повлияло на снижение их количественного содержания (на 42%). В процессе культивирования суспензионных культур на селективных средах, способность клеток к синтезу фенольных соединений изменяется. В одних вариантах она постоянно

растет (50% КФ для сорта Rondo, 30% КФ для линии 906) в других -относительно стабильна (30% КФ для сорта Rondo, 50% КФ для линии 906). Результаты свидетельствуют о разной чувствительности клеток суспензий к действию стрессового фактора, что, возможно, проявляется и в различных механизмах устойчивости клеток к экзометаболитам патогена.

в контроль I ■ 30% i □ 50%

Рис. 8 Суммарное содержание растворимых фенольных соединений в суспензионной культуре моркови, культивируемой в стандартных и стрессовых условиях (присутствие КФ патогена A radicina): А - сорт Rondo; В -линия 906.

У растений-регенерантов, полученных после культивирования клеток на селективных средах, уровень фенольных соединений в 1,5 - 2 раза выше по сравнению с растениями контрольного варианта. Причем для растений сорта Rondo их количественное содержание превышает таковой растений линии 906 (Рис. 9). Эти результаты полностью согласуются с данными, полученными нами ранее с 20-дневными проростками и клеточными суспензиями и доказывают зависимость фенольного метаболизма от генотипических особенностей исследуемых образцов.

Одномерная хроматография показала, что у растений-регенерантов, полученных после селекции in vitro, количество фенольных соединений возрастает, вероятно, за счет изменения их качественного состава.

Рис. 9 Суммарное содержание растворимых фенольных соединений в растениях-регенератах, полученных в контрольном варианте и после культивирования клеток на селективных средах.

Влияние экзометаболитов гриба Rhizoctonia solani на образование фенольных соединений в суспензионных культурах различных генотипов картофеля. Объектом исследования служили суспензионные культуры картофеля, полученные из сегментов междоузлий пробирочных растений четырех сортов - Жуковский ранний, Удача, Невский, Дезире. Клетки культивировали на стандартных питательных средах и средах, содержащих селективный фактор. Исследована зависимость накопления растворимых фенольных соединений в клетках суспензионных культур от условий культивирования и генотипа.

Показано, что в контрольном варианте наибольшее содержание фенольных соединений характерно для суспензии сорта Удача (Рис. 10), для сорта Дезире их количество было на 20% ниже. Наименьшее

Осорт Rondo ! И линия 906 I

результате

селекции

вариант

накопление этих веществ отмечено у суспензий сортов Невский и Жуковский ранний, которые по этому показателю близки друг к другу. Следовательно различные генотипы картофеля отличались по способности к синтезу фенольных соединений. Что касается суспензионных культур, культивируемых на селективных средах, то уровень фенольных соединений у них отличался от такового контрольных вариантов. У суспензий сортов Невский и Удача содержание фенольных соединений в процессе селекции значительно снижалось (вдовое по сравнению с контролем), что в большинстве случаев коррелировало с потерей жизнеспособности клеток. Очевидно ослабление способности культур к образованию фенольных соединений является причиной гибели клеток. Известно, что фенольные соединения участвуют в иммунитете растений (Запрометов, 1993). Исходя из этого можно предположить, что их отсутствие или низкое содержание не позволяют клеткам суспензионных культур справляться с негативным воздействием на них экзометаболитов гриба. Последние в ряде случаев могут "запускать" программируемую гибель клеток (апоптоз), обусловленную в частности действием фенолкарбоновых кислот (Тарчевский, 2002).

13 2

I1 15

05 0

Удача

□ основная среда Ш основная среда + КФ I

Рис. 10 Изменения в содержании фенольных соединений у суспензионных культур различных генотипов картофеля при воздействии КФ (30%)

Для других генотипов картофеля (Дезире и Жуковский ранний) экзометаболиты гриба способствовали большему накоплению фенольных соединений в клетках (на 30% и 60%) по сравнению с контролем. Это сопровождалось не только сохранением жизнеспособности суспензионных культур, но и даже ее повышением.

Для генотипа Дезире отмечено накопление и отложение лигнина в клетках суспензионных культур. Это свидетельствует о том, что для них под влиянием экзометаболитов гриба R. solani интенсивность синтеза фенольных соединений значительно возрастала.

Таким образом, в процессах адаптации клеток in vitro к действию селективного фактора участвую! фенольные соединения, синтез которых усиливается в устойчивых клетках и растениях-регенерантах и зависит от генотипических особенностей исследуемых объектов и условий их культивирования.

Глава 8. RäPD анализ ДНК каллусных культур и растений-регенерантов пшеницы, полученных методами клеточной селекции.

ДНК полиморфизм каллусной ткани пшеницы, культивируемой в стандартных и стрессовых условиях. Для RAPD анализа тотальная ДНК была выделена из каллусной ткани, культивируемой в стандартных и стрессовых условиях. Для исследований была отобрана каллусная ткань, находящаяся на разных этапах селекции: начало (I пассаж), середина (IV пассаж) и конец (VIII пассаж). Установлено, что каждый из исследуемых образцов контрольного и опытного вариантов (I пассаж) имели определенный спектр амплифицируемых RAPD-продуктов, не отличающихся друг от друга количеством фрагментов, их размером и степенью выраженности (мажорности). Однако в процессе культивирования каллусной ткани (IV пассаж) в стандартных и стрессовых условиях in vitro были отмечены общие фрагменты, а также блоки, состоящие из нескольких фрагментов. Кроме того было выявлено изменение RAPD спектра ДНК. Изменения обнаружены лишь для каллусной ткани, культивируемой на селективных средах. Дальнейшее культивирование каллусной ткани (VIII пассаж) в условиях in vitro привело к более выраженному полиморфизму ДНК ткани опытного варианта (присутствие в питательной среде КФ патогена). RAPD паттерн каллусной ткани, культивируемой на питательных средах содержащих селективный фактор, характеризовался как отсутствием ряда фрагментов, например, 1800 н.п., 850 н.п. (оба амплифицированы с праймером OPD14), 900 и 930 н.п., а также ряда минорных фрагментов (с праймером 0PD6), которые присутствовали в RAPD спектрах ДНК, экстрагированной из каллусной ткани, полученной в стандартных условиях культивирования, так и присутствием новых фрагментов 330 п.н., 440 п.н. (праймер OPA 15), 800 п.н. и 250 п.н. (праймер OPD6), 1200 п.н. (праймер OPD14). Результаты исследований, вероятно, не могут связывать напрямую наличие или отсутствие полосы спектра в

каллусной ткани полученной в разных условиях культивирования, но отражают на молекулярном уровне их различия.

Помимо молекулярного анализа различных типов каллуса пшеницы, представляло интерес сравнить RAPD спектры растений-регенерантов различных сортов пшеницы контрольного варианта. Установлено, что подавляющее число амплифицированных фрагментов были мономорфны, то есть присутствовали в RAPD спектрах всех анализируемых растений-регенерантов. Однако, при амплификации с праймерами OPD3, ОРА15 и OPD14 в спектрах регенерантов детектировались полиморфные фрагменты ДНК.

Полученные нами результаты по RAPD анализу изменений, возникающих в ДНК регенерантах пшеницы, совпадают с данными других авторов о геномном полиморфизме морфологически не различимых сомаклонов риса, гороха, пшеницы, сахарной свеклы и ряда древесных культур.

RAPD анализ растений-регенерантов пшенииы. полученных после клеточной селекции При RAPD анализе растений-регенерантов пшеницы, полученных в результате действия культурального фильтрата патогена, уровень детектируемого полиморфизма ДНК регенератов пшеницы значительно повышался. Из 81 RAPD фрагментов, амплифицированных при использовании праймеров OPD14, OPD3, ОРА15 и OPD6, 5 были полиморфными, то есть присутствовали не во всех спектрах анализируемых растений. Следует отметить, что наиболее полиморфными были RAPD спектры растений сорта Московская 35. По мнению ряда исследователей, появление новых, отсутствующих в родительских линиях, ампликонов у регенерантов, связано с тем, что в геноме растений есть специфические районы, предрасположенные к мутациям, которые возникают в ответ на условия культивирования и приводят к формированию различных клонов в культуре in vitro (Bohanec, Jakse, Ihan, Jovorik, 1995, Al-Zahim, Fotd-Lloyd, Nembury, 1999). Ранее в работах Богани был проведен RAPD анализа уровня полиморфизма у длительно культивируемых суспензионных линий и различных сомаклонов томата, полученных при регенерации их на средах с различным содержанием фитогормонов, а также в присутствии стрессового фактора. Был показан высокий уровень изменений как непосредственно в нуклеотидной последовательности, так и в уровне метилирования ДНК, возникающий в культуре клеток и у растений-регенерантов томата (Bogani et al, 1995,1996).

Таким образом, культивирование каллусных клеток на селективных средах in vitro приводит к формированию гетерогенной ткани, способной реализовывать морфогенетический потенциал в виде сомаклональных вариантов. Для них характерно появление отдельных

признаков, которые закрепляются на генетическом уровне. Методами молекулярного маркирования эти изменения легко установить и доказать их наличие по появившимся фрагментам ДНК, нехарактерным для контрольных образцов.

Заключение

Современная биотехнология охватывает широкий круг методов, среди которых центральное место занимает генетическая и клеточная инженерия. Данные исследования направлены на создание генетически модифицированных объектов, широко используемых в различных областях науки и производства.

Клеточная биотехнология позволяет значительно расширить спектр генетического разнообразия; получать формы растений, обладающих повышенной устойчивостью к абиотическим и биотическим факторам окружающей среды; сократить сроки проведения селекции. Однако в этом направлении исследований существуют острые проблемы, и в частности, недостаточная регенерационная способность культивируемых клеток и отсутствие эффективных методов отбора in vitro устойчивых к заболеваниям регенерантов, особенно с комплексной устойчивостью к нескольким патогенам. Поэтому поиск методов, повышающих морфогенетическую активность клеток in vitro и разработка нетрадиционных селективных систем являются актуальными проблемами.

Разработанные и предложенные в диссертации схемы и методы клеточной селекции, позволяют получать формы растений пшеницы, моркови и картофеля, обладающих повышенной устойчивостью к действию фитопатогенных грибов. Применение предлагаемых технологий для других сельскохозяйственных растений возможно лишь после дополнительного проведения экспериментов с ними с учетом видовых и сортовых особенностей клеток; типа и возраста первичного экспланта; продолжительности культивирования клеток в условиях in vitro и компонентов питательной среды.

Экспериментально доказано, что в устойчивых каллусных линиях и растениях-регенерантах усиливается синтез эндогенных гормонов, особенно гормонов, обладающих стимулирующим эффектом, и фенольных соединений, которые могут приводить к изменениям экспрессии генов; появлению неспецифических белков, синтезу ферментов, укреплению клеточной стенки и др. Признак повышенной устойчивости может быть обусловлен генетическими изменениями на уровне ДНК. Наши исследования показали, что в клеточных культурах, культивируемых на селективных средах с использованием

культуральной жидкости патогенов, происходят изменения в нуклетотидных последовательностях, что является свидетельством генетических изменений.

Таким образом, результаты работы подтверждают перспективность использования методов клеточной селекции для создания устойчивых к болезням форм растений. В то же время, надо иметь ввиду, что предложенные схемы и методы не обеспечивают 100%-ного получения более устойчивых форм, а лишь способствуют отбору популяции, обогащенной потенциально устойчивыми растениями.

Выводы

1. Впервые для пшеницы, моркови и картофеля разработана схема и методы тканевой и клеточной селекции, позволяющие получать формы растений, обладающие повышенной устойчивостью к фитопатогенным грибам Septoria nodorum, Alternaria radicina, Rhizoctonia solani, соответственно. Основой метода является культивирование каллусных и суспензионных клеточных культур на питательных средах, содержащих токсичный селективный фактор -культуралышй фильтрат патогена (КФ).

2. Фитотоксичность экзометаболитов возбудителей болезней в условиях in vitro в значительной мере зависит от состава и соотношения инградиентов питательной среды. При выращивании изолятов гриба в жидкой питательной среде Чапека фитотоксичность экзометаболитов в 5-7 раз превышает этот показатель, полученный при культивировании патогена на среде Мурасига и Скуга.

3. Культуральный фильтрат патогенов (Septoria nodorum, Alternaria radicina, Rhizoctonia sotaní) в концентрациях 10-20% оказывает стимулирующее влияние на рост интактных растений и клеток каллусных и суспензионных культур (пшеница, морковь, картофель). При более высоких концентрациях он оказывает на них ингибирующее действие. Оптимальный эффект в селекции in vitro достигается на каллусной ткани пшеницы при 20%-ом КФ Septoria nodorum, на суспензионной культуре моркови при 30-50%-ом КФ Alternaria radicina, на каллусной и суспензионной культурах картофеля при 30-40%-ом КФ Rhizoctonia solani.

4. Растения-регенеранты, полученные на селективных средах с указанным содержанием КФ, обладают повышенной устойчивостью (на 10-35%) к действию патогенов по сравнению с регенерантами контрольного варианта. Для отдельных генотипов (сорт Rondo) устойчивость повышается до 50%.

5. Выявлены существенные различия в содержании эндогенных гормонов в клетках суспензий моркови и картофеля, длительно культивируемых на контрольных и селективных средах. Адаптация клеток к селективному фактору сопровождается повышением уровня цитокининов и ИУК. У растений-регенерантов моркови, полученных из клеток, отселектированных на питательных средах с КФ, происходит значительное повышение ауксинов (в 2 раза), цитокининов (в 4-20 раз) и гиббереллинов (в 3-12 раз) по сравнению с контрольным вариантом.

6. Выявлено положительное влияние фенольных соединений на адаптацию клеток к действию селективного фактора. Они в большем количестве накапливаются в клетках, устойчивых к действию селективного фактора. Значительная роль в этом процессе принадлежит фенольному полимеру лигнину, ограничивающему проникновение культурального фильтрата патогена в клетки.

7. В клеточных культурах, выращенных на селективных. средах с использованием КФ патогенов происходят изменения в нуклеотидных последовательностях, выявленные ЯАРБ методом. Для устойчивых каллусных культур и растений-регенерантов, полученных в результате клеточной селекции, КАРИ спектры ДНК отличались отсутствием или наличием новых фрагментов размером от 330 п.н. до 1200 п.н., которые не были характерны для ПАР О спектров ДНК контрольного варианта, что является прямым доказательством, возникающих в опытных вариантах изучаемых объектов, генетических изменений.

8. Предлагаемая схема и методы клеточной селекции растений на основе отбора адаптированных клеток на селективных средах и получения из них растений-регенерантов с повышенной устойчивостью к опасным грибным болезням в условиях ограниченного применения трансгенных технологий являются существенным дополнением к ней для получения измененных форм растений с указанными признаками и свойствами.

9. Процессы каллусогенеза, пролиферации и морфогенеза, выработанные и генетически закрепленные у растений в процессе эволюции, является закономерной ответной реакцией на нарушение целостности многоклеточного растительного организма, а степень их реверсии характеризует величину важнейшего свойства клетки - их тотипотентности.

Список опубликованных работ

Учебно-методическая литература

1. Сельскохозяйственная биотехнология: Учебное пособие, М,:МСХА,

1995, с 310. (под редакцией академика РАСХН В.С.Шевелухи, в соавторстве Дегтярев C.B., Артамонова Г.М. и др.)

2. Сельскохозяйственная биотехнология: Учебник, М.: Высшая школа, 1998, 416 с. ( под редакцией академика РАСХН В.С.Шевелухи, в соавторстве Дегтярев C.B., Ковалев В.М. и др.)

3. Получение посадочного материала древесных, цветочных и травянистых растений с использованием методов клеточной и генной инженерии: Учебное пособие. Издание 2, испр. и доп., М.:МГУЛ, 2001,73 с. ( в соавторстве Родин А.Р.)

4. Сельскохозяйственная биотехнология: Учебник, М.:Высшая школа, 2003, с.470. (под редакцией академика РАСХН В.С.Шевелухи, в соавторстве Воронин Е.С., Ковалев В.М. и др.)

Основная литература

5. Методы культуры тканей: перспективы использования.// Лесное хозяйство, 1995, № 3, с. 9-11. (в соавторстве Родин А.Р.)

6. Использование методов биотехнологии в селекции пшеницы на устойчивость к септориозу. // Тез. конф. «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии»,

1996, с. 22. ( в соавторстве Джое Л.)

7. Влияние гриба Septoria nodorum и его метаболитов на прорастание семян пшеницы. // Известия ТСХА, 1996, вып. 4, с. 1-7. ( в соавторстве Джое Л.)

8. Клеточная селекция моркови на устойчивость к альтернариозу. // Тез. I Между нар. конф. «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 1996, с.47. ( в соавторстве Намбудри Н., Раскалиева В.А.)

9. Использование методов биотехнологии в клеточной селекции моркови на устойчивость к альтернариозу. // Известия ТСХА, 1996, вып. 4, с. 163-165. ( в соавторстве Намбудри Н., Раскалиева В.А.)

10. Влияние гормонального состава питательной среды на морфогенез пшеницы. // Тез. докл. IV Международной конф. «Регуляторы роста и развития растений», Москва, 1997, с. 304. ( в соавторстве Джое Л.)

11. Изучение морфогенетической активности изолированных листовых эксплантов пшеницы в условиях in vitro. //Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: Тез. Докладов VII Междунар. конф., Москва, 1997, с. 147. ( в соавторстве Пиллай Р., Джое Л.)

12. Клеточная селекция пшеницы на устойчивость к септориозу. // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: Тез. Докладов VII Междунар. конф. 1997, с. 317. ( в соавторстве Джое JI.)

13. Utilization of biotechnological methods in selection of stability to Sept or ia //Congress on «In vitro biology» USA, 1997. /Hot topics, p. 15.

14. Morfogénesis of cerrot in vitro // Congress on «In vitro biology» USA,

1997. /Hot topics, p. 17.

15. Состояние и перспективы развития информационных технологий в сельском хозяйстве. // Известия ТСХА, 1998, вып. 3, с. 36-42. ( в соавторстве Ковалев В.М., Белов Д.В.)

16. Разработка методов клеточной селекции пшеницы на устойчивость к Septoria nodorum. // Междунар. конф. «Молекулярная генетика и биотехнология», Минск, 1998, с. 221-222. ( в соавторстве Пиллай Р., Джое Л.)

17. Использование методов биотехнологии в селекции моркови на устойчивость к грибу Alternaría radicina. // Междунар. конф. «Молекулярная генетика и биотехнология», Минск, 1998, с. 251-252. ( в соавторстве Раскалиева В.А.)

18. Влияние генотипа и условий культивирования зародышей яровой пшеницы на процесс каллусогенеза и морфогенеза. // Известия ТСХА,

1998, вып. 3, с. 94-99. ( в соавторстве Джое Л.)

19. Cellular selection of wheat resistance to glume blotch disease. // Congress on «In vitro biology» USA, 1998. /Hot topics, p. 16.

20. Влияние 2,4-Д на каллусогенез эксплантов, изолированных из микроклубней картофеля в условиях in vitro. // Материалы Международной научно-практической конференции: Молодые ученые возрождению сельского хозяйства России в XXI веке. Брянск, 2-5 октября 2000, с. 22-24. (в соавторстве Вапьдеррама А.)

21. Морфогенез в культуре первичного каллуса картофеля. // Материалы Международной научно-практической конференции: Молодые ученые возрождению сельского хозяйства России в XXI веке. Брянск, 2-5 октября 2000, с. 31-33. (в соавторстве Вальдеррама А.)

22. Влияние культурального фильтрата гриба Alternaría radicina на суспензионную культуру моркови.// Тез. II Междунар. конф. «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2000, с.65. ( в соавторстве Раскалиева В.А.)

23. Целесообразность использования культурального фильтрата гриба Rhizoctonia solani в селекции картофеля на устойчивость к ризоктониозу.// Тез. II Междунар. конф. «Актуальные проблемы

биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2000, с.204-205 (в соавторстве Вальдеррама А.)

24. Клеточная селекция пшеницы на устойчивость к септориозу. // Сельскохозяйственная биотехнология. Избранные труды. Под редакцией Шевелухи В.С., М.: Евразия +, 2000, т. 1, с. 16-21. ( в соавторстве Джое JI.)

25. Influence cultural fíltrate offungí Alternaría radicina on cell suspensión of carrots. // Viet Nam «International Workshop on Biology», 2001.

26. Влияние факторов гормональной и негормональной природы на морфогенетический потенциал интактных растений пшеницы и в культуре in vitro. //Сельскохозяйственная биотехнология. Избранные труды. Под редакцией Шевелухи В.С., М.: Евразия +, 2001, т. 2, с. 7180.

27. Использование методов биотехнологии в получении форм моркови, устойчивых к альтернариозу. //Сельскохозяйственная биотехнология. Избранные труды. Под редакцией Шевелухи В.С., М.: Евразия +, 2001, т. 2, с. 81-91. (в соавторстве Раскалиева В.А.)

28. Действие метаболитов гриба Alternaría radicina на рост суспензионной культуры моркови. // Труды IV Международного симпозиума: Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования, М.: изд-во РУДН, 2001, с. 250-253.

29. Влияние культурального фильтрата гриба Alternaría radicina на рост суспензионной культуры моркови. // Доклады ТСХА, М.: МСХА, 2001, вып. 273, с. 28-32. ( в соавторстве Раскалиева В.А.)

30. Влияние регуляторов роста на адвентивное побегообразование на корня картофеля в культуре in vitro. Н Материалы Всероссийской научно-практической конференции: Молодые ученые возрождению сельского хозяйства России в XXI веке. Санкт-Петербург 2001, с. 1820. (в соавторстве Вальдеррама А.)

31. Влияние метаболитов гриба Rhizoctonia solani на рост изолированных клеток и тканей картофеля in vitro. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции: Молодые ученые возрождению сельского хозяйства России в XXI веке. Санкт-Петербург 2001, с. 50-52. (в соавторстве Нгуен Тхи Ли Ань, Сысоева В.М.)

32. Влияние биологически активных веществ и факторов физического воздействия на морфогенетический потенциал интактных растений пшеницы и в культуре in vitro. // Тез. докл. VI Международной конф. «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях», Москва, 2001, с. 161.

33. Влияние веществ цитокининовой активности на получение растений-регенерантов моркови после клеточной селекции. // Тез.

докл. VI Международной конф. «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях», Москва, 2001, с. 162. ( в соавторстве Раскалиева В. А.)

34. Метод управления гормональным статусом интактных растений и изолированных органов при их культивировании in vivo - in vitro на основе воздействия энерго-информационным полем (ЭИП). // Материалы II Международной научно-практической конференции (36 декабря 2001 г., г. Горки), Горки:БГСХА, 2002, с. 185-189. ( в соавторстве Ковалев В.М., Белов Д.В., Сальникова Е.И.)

35. Растения-регенеранты, полученные после клеточной селекции моркови на устойчивость к Alternaria radicina М, Dr. et Е. II Научные труды ВНИИО (Овощеводство: состояние, проблемы, перспективы),

2002, т. 2, с. 95-99.

36. Адаптационная способность пробирочных растений, каллусных и суспензионных культур картофеля к стрессовым условиям культивирования. // Доклады ТСХА, М.: МСХА, 2002, вып. 274, с. 105-108.

37. Влияние вторичных метаболитов гриба Fusarium avenacium на рост каллусной ткани моркови. // Научные труды ВНИИО (Овощеводство: состояние, проблемы, перспективы), 2002, т. 2, с. 100-103 (в соавторстве Ипатова Н.В.)

38. Особенности морфогенеза картофеля in vitro при использовании цитокининов.// Сельскохозяйственная биология, 2002, № 1, с. 88-90. ( в соавторстве Ковалев В.М., Глушкова Т.Н.)

39. Получение растений-регенерантов после клеточной селекции моркови на устойчивость к патогенному грибу Alternaría radicina М, Dr. etE. //Биотехнология, 2003, № 2, с. 65-68.

40. Роль фитогормонов в адаптации клеток к биотическому стрессу в культуре in vitro.ll Физиология растений и экология на рубеже веков: Материалы Всероссийской научно-практической конференции / Яросл. гос. ун-т - Ярославль, 2003, с. 204. ( в соавторстве Карсункина Н.П., Скоробогатова И.В., Захарова Е.В.)

41. Морфофизиологические особенносш клеточной селекции моркови на устойчивость к патогенам. // Селекция, семеноводство и биотехнология овощных и бахчевых культур : Доклады III Международной конференции, посвященной памяти Б.В. Квасникова,

2003, с. 212-215.

42. Влияние веществ с цитокининовой активностью и первичного экспланта на процесс регенерации растений моркови. // Селекция, семеноводство и биотехнология овощных и бахчевых культур : Доклады III Международной конференции, посвященной памяти Б.В. Квасникова, 2003, с. 513-514. ( в соавторстве Ипатова Н.В.)

43. Регуляторная роль фитогормонов при адаптации растительных клеток к стрессовым условиям in vitro. //Аллоцитоплазматическая пшеница и некоторые аспекты биотехнологии растений / Под редакцией Рейес Матаморос Х.М., М.: Компания Спутник +, 2003, с.84-90. ( в соавторстве Карсункина Н.П., Скоробогатова И.В., Захарова Е.В.)

44. Особенности каллусогенеза листовых эксплантов картофеля, культивируемых на среде с 2,4-Д in vitro. // Аллоцитоплазматическая пшеница и некоторые аспекты биотехнологии растений / Под редакцией Рейес Матаморос Х.М., М.: Компания Спутник +, 2003, с.66-73. ( в соавторстве Вальдеррама Ромеро A.C., Чередниченко М.Ю., Высоцкая М.В,, Рейес Матаморос Х.М.)

45. Морфо-физиологические особенности пробирочных растений, каллусной ткани и суспензионной культуры картофеля, обусловленные действием экзометаболитов гриба Rhizoctonia solani. II Биотехнология, 2003, № 3, с. 36-41.

46. Влияние стрессовых условий культивирования на гормональный баланс клеток суспензионных культур и растений-регенерантов моркови. // Биотехнология, 2003, № 4, с. 51-56. ( соавторстве Карсункина Н.П., Скоробогатова И.В., Захарова Е.В.)

47. Биологические основы клеточной селекции растений. // Доклады ТСХА, М.: МСХА, 2003, вып. 275 , с. 113-116.

48. Клеточная селекция растений на устойчивость к биотическим факторам. // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: Тез. Докладов VIII Междунар. конф. 2003 ( 913 сентября, Саратов).

Объем 3,25 п л._Зак. 438_Тираж 100 экз.

AHO «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

РНБ Русский фонд

2006-4 28462

09 OKI 2003

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Калашникова, Елена Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Достижения и проблемы традиционной селекции растений применительно к изучаемым объектам.

1.2. Биотехнология - центральное звено современной науки.

1.3. Селекция растений in vitro.

1.4. Генетические, эпигенетические и морфофизиологические изменения клеток при селекции in vitro.

1.5. Клеточной селекции растений на устойчивость к болезням

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 .Объекты исследований.

2.1.1 .Культура клеток и ткани яровой пшеницы.

2.1.2.Культура клеток и ткани моркови.

2.1.3.Культура клеток и ткани картофеля.

2.2. Методы исследований.

2.2.1. Получение фитотоксичных экзометаболитов из грибов Septoria nodorum, Alternaria radicina, Rhizoctonia solani.

2.2.2.Схемы клеточной и тканевой селекция изучаемых растений:. а) Пшеница (Triticum aestivum) б) Морковь (.Daucus carota) в) Картофель (Solanum tuberozum)

2.2.3.Биохимические и молекулярные методы исследований каллусных, суспензионных культур и растений-регенерантов. а) Определение суммы растворимых фенольных соединений в каллусных культурах и растениях-регенерантах. б) Определение содержания гормонов в каллусных и суспензионных культурах и растениях-регенерантах. в) RAPD анализ каллусной ткани и растений-регенерантов

2.2.4.Статистическая обработка результатов исследований.

ГЛАВА 3. КАЛЛУСОГЕНЕЗ И МОРФОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ in vitro

3.1. Пшеница.

3.1.1.Особенности каллусогенеза и морфогенеза различных генотипов.

3.1.2.Каллусогенез и морфогенез различных первичных эксплантов.

3.1.3. Суспензионная культура

3.1.4. Влияние биологически активных веществ и других факторов на морфогенетический потенциал интактных растений и в культуре in vitro.

3.1.5. Способы получения растений-регенерантов и их адаптация к почвенным условиям.

3.2. Морковь.

3.2.1 .Особенности каллусогенеза различных генотипов и первичных эксплантов.

3.2.2. Рост и развитие суспензионных культур различных генотипов.

3.2.3.Технология получения и адаптации растений-регенерантов к почвенным условиям.

3.3. Картофель

3.3.1.Особенности каллусогенеза и морфогенеза различных генотипов и эксплантов

3.3.2.Особенности роста суспензионных культур различных генотипов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клеточная селекция растений на устойчивость к грибным болезням"

В соответствии с поставленной целью нами решались следующие основные задачи:

Научная новизна работы. Впервые разработаны и предложены методы клеточной и такневой селекции in vitro, позволяющие получать каллусные линии и растения пшеницы, моркови и картофеля, обладающие повышенной устойчивостью к фитопатогенам Septoria nodorum, Alternaria radicina, Rhizoctonia solani. Предложенные методы основаны на культивировании каллусных или суспензионных клеточных культур на питательных средах, содержащих культуральный фильтрат (КФ) патогена в течение 8-10 пассажей.

Изучена зависимость способности клеток суспензионных культур к синтезу фенольных соединений от генотипа, времени и условий их культивирования in vitro. Доказано участие фенольных соединений в адаптации клеток к действию стресс-фактора. Более высокое их накопление характерно для устойчивых к экзометаболитам клеточных культур, по сравнению с неустойчивыми. Значительная роль в этом процессе принадлежит фенольному полимеру лигнину, ограничивающему проникновение культурального фильтрата патогена в клетки за счет лигнификации клеточной стенки. В растениях-регенерантах выявлено не только повышение содержания фенольных соединений, но и изменение их качественного состава.

Практическая значимость работы. Предлагаемые в работе схемы и методы клеточной селекции, позволяют получать растения-регенеранты пшеницы, моркови и картофеля, устойчивых к фитопатогенам Septoria nodorum, Alternaria radicina, Rhizoctonia solani, соответственно. Такие растения могут быть использованы в традиционной селекции и служить основой для создания новых сортов и гибридов, обладающий повышенной устойчивостью к грибным болезням. Полученные новые данные об участии эндогенных гормонов и фенольных соединений в адаптации клеток к стрессовым условиям являются теоретической основой для более полной расшифровки механизмов устойчивости клеток к действию экзометаболитов опасных патогенов.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Калашникова, Елена Анатольевна

Выводы

3. Культуральный фильтрат патогенов (Septoria nodorum, Alternaria radicina, Rhizoctonia solani) в концентрациях 10-20% оказывает стимулирующее влияние на рост интактных растений и клеток каллусных и суспензионных культур (пшеница, морковь, картофель). При более высоких концентрациях он оказывает на них ингибирующее действие. Оптимальный эффект в селекции in vitro достигается на каллусной ткани пшеницы при 20%-ом КФ Septoria nodorum, на суспензионной культуре моркови при 30-50%-ом КФ Alternaria radicina, на каллусной и суспензионной культурах картофеля при 30-40%-ом КФ Rhizoctonia solani.

7. В клеточных культурах, выращенных на селективных средах с использованием КФ патогенов происходят изменения в нуклеотидных последовательностях, выявленные RAPD методом. Для устойчивых каллусных культур и растений-регенерантов, полученных в результате клеточной селекции, RAPD спектры ДНК отличались отсутствием или наличием новых фрагментов размером от 330 п.н. до 1200 п.н., которые не были характерны для RAPD спектров ДНК контрольного варианта, что является доказательством, возникающих в опытных вариантах изучаемых объектов, генетических изменений.

8. Предлагаемая схема и методы клеточной селекции растений на основе отбора адаптированных клеток на селективных средах и получения из них растений-регенерантов с повышенной устойчивостью к опасным грибным болезням при ограниченном применении трансгенных технологий являются существенным дополнением к ней для получения измененных форм растений с указанными признаками и свойствами.

9. Процессы каллусогенеза, пролиферации и морфогенеза, выработанные и генетически закрепленные у растений в ходе эволюции, являются закономерной ответной реакцией на нарушение целостности многоклеточного растительного организма, а степень их реверсии характеризует величину важнейшего свойства клетки - их тотипотентности.

Заключение

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Калашникова, Елена Анатольевна, Москва

1. Аветисов В. А. Биотехнологические основы расширениягенетического разнообразия картофеля.// Автореф. доктора биол.наук, М., 1997, 46 с.

2. Аветисов В.А., Давыдова Ю.В., Мелик-Саркисов О.С. и др. Получение резистентных к гидролитическим ферментам клеточных клонов и регенерантов картофеля к повышенной устойчивостью к фитофторозу.//Биотехнология, 1992, № 1. С. 18-22.

3. Аветисов В.А., Мелик-Саркисов О.С. Индуцированный in vitro морфогенез у сортов картофеля Янтарный, Львовянка и Повировец.// Исследования по клеточной селекции картофеля, 1984, с. 89 94.

4. Аврова А.О. Физиолого-биохимические особенности взаимодействия томатов с Alternaria solani и селекция in vitro на устойчивость к альтернариозу// Автореф. диссерт. к.б.н., ВИЗР, 1994, 18 с.

5. Аврова А.О. Методы культуры in vitro в селекции томатов на устойчивость к грибным заболеваниям. // В кн. Защита растений в условиях формирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность. С.-Пб., 1995, с. 150-151.

6. Александров О.Т., Иванюк В.Г. Внутривидовая неоднородность возбудителя ризоктониоза картофеля.// Актуальные проблемы современного картофелеводства, 1997, с. 28-31.

7. Алимов К.Г., Кашуба О.В. Защита яровой пшеницы от септориоза при интенсивной технологии возделывания. // Научн. Техн. Бюлл. ВАСНИЛ, Сиб. Отдел., 1988, вып. 3, с. 14-18.

8. Балашова Н.Н., Даркова О.Б., Гордей Н.Е., Суржиу А.И. Токсины фузариума в культуре in vitro Л Изв. АН МССР Сер. Биол. и хим. наук, 1986, № 5, с. 3-6.

9. Ю.Беккужина С.С. Экспериментальный андрогенез и клеточная селекция пшеницы на устойчивость к стрессам. // Автореф. . канд. биол. наук, М., 1993, 23 с.

10. П.Белякова Г.А., Ермолинский Б.С., Свиридов С.И. и др. Токсичность КФ грибов, вызывающих пятнистость на хлопчатнике.// Вестник Московского ун-та, сер. № 16, 1991, № 4, с.56-61.

11. Берестецкий О.А. Определение фитотоксической активности культур микроскопических грибов. // В кн. «Методы экспериментальногой микологии». Киев, 1973, с. 165-175.

12. Билай В.И. и др. Микроорганизмы возбудители болезней растений. Киев:Наукова Думка, 1988, 550 с.

13. Богдан Г.П. Природа защитной реакции растений. Киев: Нукова Думка, 1981, 120 с.

14. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза, М., 1964.

15. Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений. М: Наука , 1975. 51с.

16. Бутенко Р.Г. Дифференцировка и морфогенез тканей, клеток и протопластов.// Биология развития растений, М., 1975, с. 48 65.

17. Бутенко Р.Г. Культура клеток и тканей растений в практической генетике и селекции. //Докл. ВАСХНИЛ, 1982, т. 7, с. 12-26.

18. Бутенко Р.Г. Перспективы использования культивируемых клеток растений в биотехнологии. // В кн. Биотехнология, М.:Наука, 1984, с. 239-247.

19. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии в селекционном процессе.// Мат. Всесоюзной конф. «Состояние и развитие с/х биотехнологии», Москва, 1986, с. 29-38.

20. Бутенко Р.Г. Биотехнология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.:ФБК Пресс, 1999, 159 с.

21. Бутенко Р.Г., Джардемалиев Ж.К., Гаврилова Н.Ф. Каллусообразующая способность эксплантов из разных органов различных сортов озимой пшеницы. //Физиология растений, 1986, т.ЗЗ, вып.2, с. 350-355.

22. Васецкая М.Н., Борзионова Г.И. Возбудители септориоза пшеницы.// Вестн. С/х наук Казахстана, 1987, № 3, с. 45-47.

23. Васецкая М.Н., Чигирев С.Н. Септориоз пшеницы.// Защита растений, 1986, №6, с. 17-18.

24. Васильев С.В. Практические аспекты применения достижений биотехнологии в растениеводстве. //Рекомбинационная селекция растений Сибири. Новосибирск, 1989, с. 92-100.

25. Васюкова Н.И., Чаленко Г.И., Переход Е.А., Озерецковская О.Л., Тльина А.В., Варламов В.П., Албулов А.И. Производные хитина и хитозана как элиситоры фитофторустойчивости картофеля.// Прикладная биохимия и микробиология. 2000, т. 36, № 4, с. 433-438.

26. Вальдеррама Ромеро Антонио Саломон Изучение процессов регенерации и клонирования некоторых перуанских видов картофеля в культуре in vitro. Автореф.канд. биол. наук. Москва, 2002, 23 с.

27. Вердеревский Д.Д. Пути использования иммунитета растений.// Селекция и семеноводство, 1968, № 3, с. 12.

28. Витанова 3., Влахова М., Денчев П. И др. Сомаклональная изменчивость. // Физиология и биохимия культурных растений. 1990, т. 22, № 5, с. 419-426.

29. Волощук А.Д., Волощук С.И. Клеточная селекция сельскохозяйственных растений: достижения и перспективы.// Технология возделывания зерновых колосовых культур и проблемы их селекции. Мироновка, 1990, с. 46-65.

30. ГапоненкоФ.К., Мутин М.А., Маликова Н.И. Регенерация растений различных генотипов пшеницы Triticum aestivum L. in vitro. 11 Докл. АН СССР, 1984, т. 278, №5, с. 1231.

31. Генкель П.А. Физиология устойчивости растительных организмов.// Физиология с/х растений. М.гМосковский университет, 1967, т. 3, 325 с.

32. Германович С.Т. Отбор клеточных линий клевера лугового, устойчивых к КФ Fusarium oxysporum.ll Материалы конф. Молодых ученых и аспирантов «Новые идеи в растениеводстве, и пути их реализации», М., 1991, с. 90-91.

33. Гиренко М.М., Муханова Ю.И., Цели и методы селекции зеленых и пряно-вкусовых овощных культур.// Бюллетень ВИР, 1985, вып. 48,с.17-19.

34. Гирко B.C., Волощук К.Г., Оценка устойчивости к действию КФ грибного патогена в культуре незрелых зародышей.// С.-х. биология, сер. Биология растений, 1993, № 9, с. 62-70.

35. Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений. Киев:Науков думка, 1984, 159 с.

36. Гостимский С.А. Генетическая изменчивость клеток растений при культивировании.// Успехи современной генетики, 1977, № 14, с. 4863.

37. Гросс O.K. Эффективность обеззараживания клубней картофеля от ризоктониоза.// Бюлл. ВНИИ защиты растений, 1984, № 57.

38. Гунар И.И., Паничкин А.А. О передаче электрического возбуждения у растений. //Известия ТСХА, 1970, вып. 5, с. 3-9.

39. Гэлстон А., Девис П., Сэттер Р. Жизнь зеленого растения. М.:Мир, 1983, 550 с.

40. Дементьева М.И., Выгонский М.И. Болезни овощей, плодов и картофеля при хранении. М.: В.О.Агропромиздат, 1988, 231 с.

41. Диас Ф.Т. Клеточная селекция яровых твердых и мягких пшениц на устойчивость к засолению. // Автореф. . канд. Биол. наук, М., 1994, 22 с.

42. Дмитриев А.П. Фитоалексины и их роль в устойчивости растений. Киев, 1999, 207 с.

43. Догонадзе М.З. Регуляция покоя клубней картофеля и их устойчивости к болезням с помощью физиологически активных соединений.// Автореф.канд. биол. наук, М., 1992, 21.

44. Долгих Ю.И., Китлаев Г.Б., Бутенко Р.Г. Физиологическое действие электрического тока на культуру клеток кукурузы in vitro. II Докл. РАН, 1994, т. 335, № 3, с. 393-395.

45. Долгих Ю.И., Шамина З.Б. Современные представления о причинах и механизмах сомаклональной изменчивости. // Молекулярные механизмы генетических процессов. М.:Наука, 1991, с. 123-127.

46. Дорожкин Н.Л., Соколова Л.Н. Возбудители черной гнили./ В кн. «Интегр. система защиты урожая с/х культур от вредных организмов», Воронеж, 1983, с. 23-24.

47. Дорожкин Н.А., Соколов Л.И. Черная гниль моркови и борьба с ней сельского хозяйства Белоруссии. 1985, № 12, с. 24.

48. Дудка И. А., Вассер С.П. и др. Методы экспериментальной микологии./ Под ред. Билай В.И., Киев:Наукова думка, 1982, 364 с.

49. Дьяков В.М., Корзинников Ю.С., Матыченков В.В. Экологически безвредные регуляторы роста мивал и крезацин. // В кн. «Регуляторы роста растений», М.: ВО «Агропромиздат», 1990, с. 52-62.

50. Дьяков Ю.Т. О болезнях растений. М.:Агропромиздат, 1985,

51. Дьяков Ю.Т., Озерецковская О.Л., Джавахия В.Г., Багирова С.Ф. Общая и молекулярная фитопатология: Учеб. пособие, М.:Общество фитопатологов, 2001, 302 с.

52. Еаттатхоттам Д. Д. Клеточная селекция яровой пшеницы на устойчивость к стрессам. // Автореф. . канд. биол. наук, М., 1991, 22 с.

53. Евстратова Л.П., Груздева Л.И., Матвеева Е.М. О получении чистой культуры гриба Rhizoctonia solani. //Вести Рос. Акад. С/х Наук, 1995, № 4, с. 47 49.

54. Егоров И.С. Биотехнология, проблемы, перспективы. М.:Высшая школа, 1987, 160 с.

55. Жук И.П. Устойчивость соматических клонов томата к вирусу табачной мозаики.// Микробиол. Журнал, 1993, т.55, № 6, с. 41-46.

56. Иванов М.В. Биотехнологические основы создания исходного материала ярового ячменя. С.-Пб., 2001, 206 с.

57. Иванова Н.Г. Разработка селективного фактора для проведения клеточной селекции на устойчивость к Corynebanium sepedorium.ll Использование клеточной технологии в селекции картофеля, М., 1987, с. 26-28.

58. Иванова О.С. Клеточная селекция на инфекционном фоне для получения фузариозоустойчивых форм томатов.// Материалы Всесоюз. конф. по с/х биотехнологии, Целиноград, 1991, с. 97-98.

59. Иванюк В.Т., Свиридов А.В. Бурая пятнистость листьев моркови.// Изв. АН БССР, сер. С/х наук, 1990, 3 9 с. 66-80.

60. Иванюк В.Т., Свиридов А.В. Виды родов Alternaria и Stemfhilium -возбудителей болезней моркови в Беларуссии.// Науч. докл., высш. шк. библ. Науки, 1989, № 5, с. 72-74.

61. Иванюк В.Т., Свиридов А.В. Особенности культивирования Phoma rostrupii и Alternaria radicina возбудителей серых гнилей моркови.// Микология и фитопатология, 1988, т,22, вып. 2, с. 553-560.

62. Ильина П.Р. Повышение устойчивости селекционных сортов льна-долгунца к фузариозу в процессе первичного семеноводства.// Труды ВНИИЛ, 1958, вып. 5, с.ЗЗ.

63. Ильинская Л.И., Горенбург Е.В., Чаленко Г.И., Озерецковская О.Л. Участие метилжасмоната в индуцировании устойчивости картофеля к возбудителю фитофтороза.// Физиология растений, 1996, т. 43, № 5, с. 713-720.

64. Калашникова Е.А. Влияние метаболитов гриба Rhizoctonia solani на рост пробирочных растений, каллусной ткани и суспензионной культуры картофеля. // Биотехнология, 2003, № 3.

65. Карпухина A.M., Долгова Е.М., Кузьмина Н.Н., Юшкина Л.Л. Создание источников стойкости ярового ячменя к грибным заболеваниям методом клеточной селекции. // Материалы междунар. конф. «Молекулярная генетика и биотехнология», Минск, 1998, с. 192 194.

66. Карсункина Н.П., Скоробогатова И.В., Захарова Е.В., Яшина И.М. Изучение гормонального баланса сомаклонов картофеля сорта Жуковский ранний.// Сельскохозяйственная биотехнология. Избранные работы. М.:Воскресенье, 2000, т. 1, с. 135-142.

67. Кирай 3., Барабаш 3. Результаты и перспективы использования биотехнологии в растениеводстве и защите растений. // Междун. Агропром. Журнал, 1990, №. 3, с. 7-10.

68. Кирьян И.Г., Мазин В.В. Клеточная селекция клевера лугового на устойчивость к фузариозу. // в сб.: Биотехнология растений и молекулярная биотехнология. 1991, с. 18-19.

69. Кобыльский Г.И., Алипбеков О.А., Герцог Н.М. Биосинтез индолилуксусной кислоты фитопатогенным грибом Septoria nodorum. // Вестн. С/х науки Казахстана, 1990, № 8, с. 37-39.

70. Кобыльский Г.И., Ахметов А. А. Гидролитические ферменты фитопатогенного гриба Septoria nodorum. Рост, споруляция и содержание белка в культуре гриба. // Вопросы защиты с/х растений и животных от болезней. Часть 1, Алма-Ата, 1989, с. 61-68.

71. Кобыльский Г.И., Бочарова Е.В. Изучение токсинообразования у различных изолятов гриба Septoria nodorum. II Вопросы защиты с/х растений и животных от болезней. Часть 1, Алма-Ата, 1989, с. 75-80.

72. Кобыльский Г.И., Бочарова Е.В. Фитотоксины гриба и их возможная роль в патогенезе септороиза пшеницы. // Вестн. С/х науки Казахстана, 1989, № 7, с. 40-41.

73. Ковалев В.М. Теоретические основы оптимизации формирования урожая, М.:МСХА, 1997, 284 с.

74. Ковалев В.М. Теоретические основы оптимизации формирования урожая (теория урожая). 2-е издание, переработанное и дополненное, М.-.МСХА, 2000, 326 с.

75. Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Болтененков Е.В., Лауве JI.C. Сомаклональная изменчивость Iris pseudacorus L. по данным RAPD- и цитогенетического анализов.// Биотехнология, 2003 ( в печати).

76. Койшибаев М.К., Исмайлова Э.Т., Жаманбаланова JI.A. Септориоз пшеницы и меры борьбы с ними. // Аналитический обзор, Алма-Ата, 1990, 35 с.

77. Койшибаев М.К., Темиргалиев Е.Е. Эффективность новых протравливателей семян ячменя. // Вестн. С/х науки Казахстана, 1986, № 12, с. 32.

78. Кокаева З.Г., Боброва В.К., Вальехо-Роман К.М., Гостимский С.А., Троицкий А.В. RAPD-апалш сомаклональной и межсортовой изменчивости гороха // ДАН. 1997, т. 355, № 1, с. 134 136.

79. Коновалов Ю.Б. Селекция растений на устойчивость к болезням и вредителям. М.:Колос, 1999, 136 с.

80. Копертех JL, Бутенкл Р.Г. Нативные фитогормоны экспланта и морфогенез пшеницы in vitro. // Физол. Растений,, 1995, т. 42, вып. 4, с. 115-118.

81. Кукушина Л.Н., Дорошенко А.А. Изучение и оценка регенерантов картофеля по устойчивости к фитофторе in vivo и in vitro.// Использование клеточных технологий в селекции картофеля. М., 1987, с. 52-56.

82. Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии. Методические указания.М/.МСХА, 1996, 90 с.

83. Леонова Н.С., Шалдеева Е.М., Гуркин Д.А. Современные методы селекции и семеноводства картофеля. // Повышение эффективности селекции и семеноводства сельскохозяйственных растений. Доклады и сообщения, Новосибирск, 2002, с. 72-77.

84. Лети Джое Получение форм пшеницы ( Triticum aestivum) устойчивых к грибу Srptoria nodorum в условиях in vitro.// Автореф. .канд.биол.наук, М., 1998, 22 с.

85. Лети Джое, Калашникова Е.А. Влияние гриба S. Nodorum и его метаболитов на прорастание семян пшеницы.// Известия ТСХА, 1996, вып. 4, с. 150-155.

86. Лети Джое, Калашникова Е.А. Клеточная селекция пшеницы на устойчивость к септориозу.// Сельскохозяйственная биотехнология. Избранные работы, М.:Воскресенье, 2000, т.1, с.61 71.

87. Литвинов С.С. Состояние и перспективы развития овощеводства в России. // Докл. III Междун. Конф., посвященной памяти Б.В.Квасникова, 2003, с. 3-15.

88. Лихачев А.Н. Использование жидких питательных сред для получения моноспоровых культур грибов.// Микология и фитопатология, 1994, т. 28, вып. 5, с. 14-16.

89. Лопухина Г.П., Сычева Л.В. Устойчивость моркови к возбудителю черной гнили./ В кн. Интегр. система защиты урожая с/х культур от вредных организмов. Воронеж, 1983, с. 23-27.

90. Лукьянюк С.Ф., Овсюк Т.Н. Методы in vitro для отбора люцерны на фузариозоустойчивость.// Методы биотехнологии в селекции с/х растений. Одесса, 1992, с. 39-48.

91. Лукьянюк С.Ф., Игнатова С. Получение гаплоидов ячменя с помощью гаплопродюсеров. Методические рекомендации, Одесса, 1983, с. 21.

92. ЮО.Лутова Л.А. Биотехнология высших растений. С.-Пб. университет, 2003, 228 с.

93. Магди Гад Аль-Раб К созданию селективных питательных сред на основе КФ Alternaria solani.ll Защита растений от вредителей и болезней в условиях экологидизации с/х производства, Сп.б., 1992, с.63-66.

94. Максимова Н.И., Мерзляк М.Н., Гусев М.В. Культура клеток и тканей в изучении взаимоотношений патогена и растения-хозяина.// Биол. Науки, 1990, № 2, с. 6-21.

95. Юб.Манешина Т.В., Обухович Е.М., Курицова Н.А. Отбор токсиноостойчивых каллусов в культуре зародышей ячменя.//Между н. Конф. Клеток и биотехнология. Тез. докл., Новосибирск, 1988, ч. 1, с. 179.

96. Масленников С.Е. Методы культуры каллусов и клеток в создании форм люцерны, устойчивых к фузариозу./ Автореф. диссертации к.б.н., М.:ТСХА, 1994, 15 с.

97. Масленников С.Е. Получение устойчивых к корневым гнилям растений люцерны с использованием методов культуры каллусов и клеток.// Соврем. Достижения биотехнологии. Ставрополь, 1995, с. 24-25.

98. Меерсон Ф.З. Общий механизм адаптации и роль в нем стресс-реакции, основные стадии процесса адаптации.// Физиология адаптивных процессов. М.:Наука, 1986, с. 77-123.

99. Ю.Мезенцева О.Н. Получение клеточных линий пшеницы, устойчивых к токсинам фузариоза.// Доклады научно-практич. Конф. «Ученые Нечерноземья развитию сельского хозяйства», М., 1991, с. 179-183.

100. Ш.Мезенцева О.Ю. Использование тканевых и клеточных культр в селекции на устойчивость к фитопатогенам. // Селекция и семеноводство, 1990, № 4, с. 59-62.

101. Мезенцева О.Ю. Создание исходного селекционного материала люцерны и пшеницы, устойчивого к фузариозу, методом клеточной селекции. // Автореф. . канд. Биол. наук, М., 1992, 21 с.

102. Мелькумова Е.А. Закономерности устойчивости злаковых и плодово-ягодных культр к септориозу. // Автореф. . доктора биол. наук, М., 1996,34 с.

103. И.Метлицкий Л.В., Озерецковская О.Л. Как растения защищаются от болезней. М.:Наука, 1985, 192 с.

104. Методы клеточной инженерии растений. // Под редакцией Момот В.П., Киев, 1988, 78 с.

105. Мироненко Н.П., Булат С.А. ПНР диагностика грибных патогенов картофеля: проблемы и перспективы. // Микология и фитопатология, 1997, т. 31, с. 72 - 85.

106. Мироненко Н.П., Гусева Н.Н. Методы молекулярной биологии и биотехнологии в селекции растений на болезнеустойчивость. // С\Х биология, 1987, 3 11, с. 87-90.

107. Монастырский О.А. Токсины фитопатогенных грибов.// Защита и карантин растений, 1996, № 3, с. 5-7.

108. Муромцев Г.С. Регуляторы роста растений и урожай. // Вестник с.-х. науки. 1984, №7, с. 75-83.

109. Муромцев Г.С. Регуляторы роста растений и урожай.// Вестник с.-х. науки. 1984, № 7, с. 75-83.

110. Нгуен Тхи Ли Ань Повышение устойчивости яровой пшеницы к абиотическим стрессам методами биотехнологии. // Автореф. . канд. с/х наук, М., 1995, 22 с.

111. Нгуен Хонг Минь Селекция in vitro на устойчивость к Fusarium oxysporum f. Sp. Lycopersici у томатов.// Автореф. . кенд.биол.наук, Минск, 1991,21 с.

112. Неттевич Э.Д. Культура поля и селекция. // Зерновые поля Нечерноземья. М.Московский рабочий, 1986, с. 22-38.

113. Никуленко Т.Р. Токсины фитопатологических грибов и их роль в развитии растений. М.:Агропромиздат, 1987.

114. Никуленко Т.Ф., Чкаников Д.И. Токсины фитопатогенных грибов и их роль в развитии болезней растений. М.ВИНИТИ, 1987, 52 с.

115. Новолоцкий В. Д. Направления и перспективы использования гаплоидии в селекции ячменя. // Бюл. ВСГИ, 1986, т. 3, № 61, с. 14-18.

116. ИЗ.Осипова Е.А., Кокаева З.Г., Троицкий А.В., Долгих Ю.И. и др. RAPD-шшт сомаклонов кукурузы.// Генетика, 2001, т. 37, № 1, с. 9196.

117. Основные результаты научной деятельности ВНИИ фитопатологии за 1996-200 гг., Голицино, 2000, 189 с.

118. Пересыпкин В.Ф. Сельскохозяйственная фитопатология. М.:Колос, 1974, 560 с.

119. Пересыпкин В.Ф. Сельскохозяйственная фитопатология. 4-е изд. перераб. и допол., М.:Агропромиздат, 1989, 480 с.

120. Плащев В.М. Клеточная селекция клевера и люцерны на устойчивость к фузариозному увяданию.//Гаметофитная и защитная селекция растений, Кишенев, 1987, с. 176-178.

121. Плащев В.М., Высоцкая Р.И. Биотехнологические методы в селекции растений на устойчивость к болезням. // Теор. основы иммунитета растений к болезням, Л., 1988, с. 73-82.

122. Плащев В.М., Гусева Н.Н. Клеточная селекция устойчивых форм. // Защита растений, 1986, № 8, с. 28.

123. Плетнева Т.В. Клеточная селекция ярового ячменя на устойчивость к полосатой пятнистости. // Тез. докл. «Новые идеи в растениеводстве и пути их реализации», 1991, с. 93-94.

124. Полякова Е.Н. Выделение, идентификация и количественная оценка содержания индолилуксусной кислоты и некоторых других индольных веществ. // Методы определения фитогормонов и фенолов в семенах, Л., 1979, с. 12-29.

125. НЗ.Попкова К.В. Общая фитопатология. М.:Агропромиздат, 1989, 399 с.

126. Попкова К.В. Учение об иммунитете растений. М.:Колос, 1979, 272 с.

127. Попкова Л.И., Шнайдер Ю.И., Воловик А.С., Шмыгля В.А. Ризоктониоз (черная парша клубней). // Болезни картофеля. М.:Колос, 1980, 304 с.

128. Поплетаева Е.Б., Чкаников Д.И. Накопление эргостерина и полиолов в листьях сортов пшеницы с различным уровнем устойчивости к септориозу. // Микология и фитопатология, 1994, вып. 2, т. 28, с. 50-53.

129. Постон Т., Стюард Ф. Теория катастроф. М.: Мир, 1980, с. 505-513.

130. Пролетова Н.В. Повышение устойчивости растений льна-долгунца к фузариозному увяданию методами клеточной селекции. // 1 съезд микологов, М., 2002, с. 134.

131. Простакова Ж.Г., Бронштейн А.И., Показаньева Л.Н. Воздействие токсина Fusarium oxysporum на прорастание пыльцы сои.// Труды МСХА, 1992, с.78-87.

132. Прохоров М.Н., Чернова Л.К., Филин-Колдаков Б.В. Выращивание ткани пшеницы на культуре и восстановление целого растения.//Докл. АН СССР, 1974, Т.214, №.1,2,3. С.472.

133. Пыжикова Г.В., Санина А.А. Септориоз зерновых культур. // Защита растений, 1987, № 6, с. 15-16.

134. Пыжикова Г.В., Тушинский Г.Ю. Для снижения вредоносностисепториоза. // Защита растений, 1985, 3 9, с. 15-16

135. Раскалиева В.А., Калашникова Е.А. Использование методов биотехнологии в получении форм моркови, устойчивых к альтернариозу.// Сельскохозяйственная биотехнология. Избранные работы, М.:Воскресенье, 2001, т.2, с.81 -91.

136. Рассадина Г.В., Хромова Л.М. Эффективность клеточной селекции на устойчивость к кольцевой гнили картофеля. Использование клеточных технологий в селекции картофеля.// Труды НИИКХ, 1987, с. 57-65.

137. Рассадина Г.В., Хромова Л.М., Бутенко Р.Г. Клеточная селекция на устойчивость к кольцевой гнили картофеля. // Тез. Междунородной конференции «Биология культивирования клеток и биотехнология», Новосибирск, 1988,ч. 1,с. 167-168.

138. Регуляторы роста и развития растений, 5-ая Международная конференция, М., 1999.

139. Родева В., Станчева И. Биологичен эфект на културални филтрати от различии изопати на Alternaria solani върху растение доматени растение in vitro.!! Биотехнология, 1990, т. 4, № 3/4, с.27-30.

140. Родин М.Н. Общая фитопатология. М.:Высшая школа, 1978.

141. Родина Н.А., Родин Е.А., Ефрамова З.Г. Использование биотехнологии в селекции на устойчивость к болезням. //Тез. докл. «Проблемы селекции зерновых культур на устойчивость к болезням и неблагоприятным условиям среды№, М., 1990, с. 118.

142. Санина А.А., Анциферова Л.М., Супрун Л.М. Septoria tritici -возбудитель пятнистости листьев пшеницы. // Микология и фитопатология, 1986, № 20, с. 4.

143. Семенов А.Я., Федорова Р.Н. Инфекция семян хлебных злаков. М.-.Колос, 1984, 94 с.

144. Сидоров В. А. Битехнология растений.Клеточная селекция. Киев:Наукова Думка, 1990, 360 с.

145. Сидоров Н.В., Моргун В.В., Логвиненко В.Ф. Особенности каллусо-и морфогенезза в культуре незрелых зародышей разных генотипов мягкой озимой пшеницы. // Физиология и биохимия культурных растений, 1988, № 4, с. 3490353.

146. Сидукова Е.В., Свиридов А.В. Источники инфекции моркови возбудителем бурой пятнистости листьев.// Экол.экон. основы усовершенствования интегр. Систем защиты растений от вредителей, болезней и сорняков. Минск, 1996, ч. 2, с. 42-43.

147. Скоробогатова И.В., Захарова Е.В., Карсункина Н.П., Курапов П.Б., Соркина ГЛ., Кислин Е.Н. Изменение содержания фитогормонов впроростках ячменя в онтогенезе и при внесении регуляторов, стимулирующих рост.// Агрохимия, 1999, № 8, с. 49-53.

148. Созинов А.А. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции. М.:Наука, 1985, 272 с.

149. Станко С.А. Световая и гормональная активация растений и мутагенез. // Автореф.доктора биол. наук, Москва, 1997, 106 с.

150. Стрекова В.Ю. Субботина Г.А., Загоскина Н.В., Запрометов М.Н. О возможных причинах нарушения процесса лигнификации в культуре ткани чайного растения // Физиология растений. 1980. Т.27. В. 6. С. 1192-1200.

151. Тарчевский И. А. Метаболизм растений при стрессе. 2001, Казань:Фен, 448 с.

152. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений. 2002. М. :Наука, 294 с.

153. Тетеревникова-Бабаян Л.Н. Обзор грибов рода Septoria. Ереван, 1987, 479 с.

154. Трошина Н.Б., Асфандиярова P.P., Максимов И.В. Заселение клеток каллуса растений пшеницы при совместном культивировании с грибами Fusarium graminearum schwabe и Septoria nodorum Berk. II Микология и фитопатология, 1998, т. 32, вып. 5, с. 76-78.

155. Угарова С.В., Тесля А.А. Селекция моркови с применением биотехнологических методов.// Тез. докл. «Пробл. Совета по растениеводству, селекции, семеноводству с/х культур Сибири», Новосибирск, 1994, с.23-24.

156. Удовенко Г.В. Механизмы адаптации растений к стрессам.//Физиология и биохимия культурных растений, 1979, т, 11, № 2, с.99.

157. Уильяме У. Генотипические основы и селекция растений.// Генотипические основы устойчивости к болезням у растений. М., 1969, с. 359-414.

158. Усманов P.P., Васильева Д.В., Васильев И.П. Методические указания по планированию и статистической обработке экспериментов в научной агрономии с использованием ЭВМ. Москва, из-во МСХА, 1993, 131 с.

159. Федоренко Е.И. Изучение коллекционного разнообразия моркови по устойчивости к Alternaria./7 Научн.-технич. Бюл. ВИР, 1983, вып. 130, с. 64-66.

160. Фоменко Т.И., Малюш М.К. Активность морфогенеза и регенерация побегов в культуре in vitro у различных сортов картофеля.// Материалы Междунар. научно-практической конф. «Сельскохозяйственная биотехнология», Горки, 1998, с. 166 167.

161. Хайрулин P.M., Шакирова Ф.М., Максимов И.В. и др. Изменение содержания лектина, абсцизовой и индолилуксусной кислот в растениях пшеницы, инфицированных Septoria nodorum. II

162. Физиология и биохимия культурных растений, 1993, т. 25, № 2, с. 138-144.

163. Хотин Ю.А., Полякова Т.М. Сохранение инфекционных свойств возбудителя ризоктониоза риса при культивировании на искусственных питательных средах.// Микология и фитопатология, 1991, т. 25, вып. 1, с.80-84.

164. Чибиряев С.В. Влияние длительного культивирования in vitro а морфофизиологические характеристики и генетическую стабильность линий каллусной ткани солодки голой.// Автореф. . канд. биол. наук, 2002, Уфа, 24 с.

165. Шаяхметов И.Ф. Культура клеток и тканей пшеницы in vitro и соматический эмбриогенез. // Автореф. . доктора биол. наук, 2001, 45 с.

166. Шаяхметов И.Ф., Иштерякова Ф.К., Хабирова М.М. Особенности каллусообразования и регенерация растений в культуре незрелых зародышей яровой твердой пшеницы. // Сельскохозяйственная биология, 1988, № 4, с. 125-130.

167. Шаяхметов И.Ф., Асфандиярова P.P. Влияние фитотоксичных метаболитов Bipolaris sorokiniana на рост каллусной ткани и регенерацию растений пшеницы. // Физиология растений, 1991, № 2, с. 399-405.

168. Шаяхметов И.Ф. и др. Клеточная селекция яровой пшеницы на устойчивость к корневым гнилям.// Генетика, 1994, т. 30, с. 181.

169. Шаяхметов И.Ф., Мулюкова Г.Х. Активация соматического эмбриогенеза под действием абсцизовой кислоты в условиях клеточной селекции на устойчивость к фитотоксичным метаболитам патогенных грибов.// Сельскохозяйственная биотехнология, 2001, № 1, с. 78-83.

170. Шевелуха B.C. Результаты и проблемы биотехнологии в селекции зерновых культур. // Тез. докл. «Сельскохозяйственная биотехнология», Целиноград, 1991, с. 3.

171. Шевелуха B.C. Рост растений и его регуляция в онтогенезе. М.:Колос, 1992, 594 с.

172. Шевелуха B.C. Современные проблемы гормональной регуляции живых систем и организмов.// Регуляторы роста и развития растений: Тез. Докл. 3-й конф., М., 1997, с. 3-4.

173. Шевелуха B.C. Проблемы, приоритеты и масштабы сельскохозяйственной биотехнологии в XXI веке.// Сельскохрзяйственная биотехнология. Избранные работы, М.:Евразия+, 2000, т.1, с. 3-14.

174. Шевелуха B.C., Калашникова Е.А., Воронин Е.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология: Учебник, 2-ое изд., перераб. и доп., М.:Высшая школа, 2003, 469 с.

175. Шевченко Д.Н. Изменчивость линий-регенерантов ячменя по признакам устойчивости к болезням, морфологии и продуктивности./ Автореф.канд.биол.наук, 1994, 18 с.

176. Ярулина Л.Г., Максимов И.В. Влияние индукторов устойчивости на содержание фитогормонов и накопление лигнина в растениях пшеницы при корневых гнилях. // Тез.докл. 5-ой Междунар. Конф. «Регуляторы роста и развития растений», 1999, с. 143.

177. A1-Zahim М.А., Fotd-Lloyd B.V., Nembury H.J.// Plant Cell Reports, 1999, v. 18, p. 473-477.

178. Arcioni S., Pezzotti M., Damiani F In vitro selection of alfalfa plants resistant to Fusarium f. Sp. Medicaginis. II Theoritical and applied Genetics, 1987, vol. 74, N 6, p. 700-705.

179. Bohanec В., Jakse M., Ihan A., Jovorik В.// Plant Sci., 1995, v. 104, p.215-224.

180. Brown P., Godwin I D, Saangduen N, Kunanuvatchaidash R, Piperidis Gand Adkin S W. Rapid polymorphism among variant and phenotypically normal rice Oryza sativa indica somaclonal progenies.// Plant Cell Reports, 1991, v. 16, p. 320-324.

181. Brunok, Smolka S. Production of zinnib by Alternaria dauciana its.//Ann. Agr. Sc., 1981.21 l.Caetano-Anolles G. Amplifying DNA with arbitrary oligonucleotide primers. // PCR Methods and Applications, 1992, v.3, p.85-94.

182. Carlson J. E., Tulsieram L. K., Glaubitz J. C., Luk V. W. K., Kauffelt C., Rutledge R. Segregation of random amplified DNA markers in F1 progeny of conifers//Theor.Appl.Genet., 1991, v. 83, p. 194-200.

183. Chawa H.S., Wenzel G. Thea. Appl. Gen., 1987, v. 74, p. 841-845.

184. Chawala H.S., Wenzel G. In vitro selection for fusaric acid resistanc barley plants. // Plant Breed, 1987, N 2, p. 159-163.

185. Chawala H.S., Wenzel G. In vitro selection of barley and wheat for resistance against Helminthosporium sativum. II Theoritical and applied Genetics, 1987, vol. 74, N 6, p. 841-845.

186. Chawala H.S., Wenzel G. Resistant wheat plant against Helminthosporium sativum from embryo derived callus cultures. // Publ. / Kihara Inst. Biol. Res. Wheat Inform. Serv. Jokohama, 1989, N 69, p. 812.

187. Daub M.E. Tissue culture and the selection of resistance to patogens.// Ann. Rev. Phitopathol., 1986, v. 24, p. 156-186.

188. Davis D. Fusaric acid in selective pathogenecity of Fusarium oxysporum. //Phytopathology, 1969, vol. 59, N 10, p. 1391-1395.

189. Deadon W.R., Keyes G.J., Collins G.B. Expressed resistance to black shankamong tobacco callus cultures.// Theer. And Appl. Genet., 1982, v. 63, p. 65-70.

190. De-Klerk G. J. How to measure somaclonal variation. // Acta Bot. Neerl., 1990, v. 39, №2, p. 129-144.

191. D'Ovidio R.? Tanzarella O. A. Porceddi E. Rapid and efficient detection of genetic polymorphism in wheat through amplification by polymerase chain reaction. // Plant Mol. Biol., 1990, v. 15, p. 169-171.

192. Evenar D., Pressman E., Benyephet Y., Rappaport L. Somaclonal variation in celery and selection by coculturing toward resistance to Septoria apicola. II Plant Cell tissue and organ culture, 1994, N 39, p. 203210.

193. Farr D.E., Bill S.G., Chamuris G.P., Rossman A.Y. Fungi on plants and plant production in the United States. 1989, 1252 p.

194. Fish N., Gones M. Plant today, 1988, v. 2, p. 47-49.

195. Foroughi Wehr В., Stalle K., Nachr D. Pflanzenshuts., 1985, v. 37, p. 170-173.

196. Frank J.A., Leach S.S. Comparison of tuberborne and soilborne inoculum in the Rhizoctonia disease of potato.// Phytopath. Vol. 70, p. 51 -63.

197. Godwin I. D., Sangduen S. W., Kunanuvatchaidash R., Piperidis G., Adkins S. W. RAPD polymorphisms among variant and phenotypically normal rice (Oryza sativa var. indica) somaclonal progenies. // Plant Cell Rep., 1997, v. 16, p. 320-324.

198. Hammerschlag F. A. Resistance responses of plants regenerated from peach callus cultures to Xanthomonas campestris pv. pruni. //J. Amer. Soc. Hortic, Sci. 1990, vol. 115, N 6, p. 1034-1037.

199. Hartman C.L. et. al. Plant Sc. Let., 1984, v. 34, p. 151-158.

200. Genet., 1987, vol. 74, p. 439-444/

201. Hofferbert W., Orth H., Putlits G. Unsere arbeiten zur Rhizoctonia -frage bei der kartoffel.//II Z. Pflanzenkrankh, 1953, p.385 -397.

202. James W.C., Mc Kenzie A. R. The effect of tuber-borne sclerotia of Rhizoctonia solani on potato crop.// Am. Potato J., 1972, vol. 49, p.296 -301.

203. Kasenberg T.R., Traguair J.A. Effectis of phenolics on growth of Fusurium oxysporum f. Sp. Radicis- Lycopersici in vitro.// Can. J. Bot., 1988, v. 66, №6, p. 1174-1177.

204. Katiyar R.K., Chopra V.L. Somaclonally induced in a Brassica juncea germplasm accession with field resistance to important diseases. // Plant Breed., 1990, vol. 104, N 3, p. 262-264.

205. Keller В., Winzeler H., Wunzeler M., Fried P. Differential sensitivity of wheat embryos against extracts containing toxins of Septoria nodorum. II Phytopathology, 1994, vol. 141, N 3, p. 233-240.

206. Klein-lankhorst R. M., Vermunt A., Weide R., Liharska Т., Zabel P. Isolation of molecular marker of tomato (Lycopersicon esculentum)using random amplified polymorphic DNA (RAPD). // Theo.Appl.Genet., 1991, v. 83, p. 108-114.

207. Lu Z, Reighard G. I., Baird W. V., Abbott A. G., Rajapaksi S. Identification of peach rootstock cultivars by RAPD markers. // Hort. Sci., 1996, v. 31, p. 127-129.

208. Martin G. В., Williams J. G. K., Tanksly S. D. Rapid identification of markers linked to a Pseudomonas resistance gene in tomato by using random primers and near isogenic lines with arbitrary primers. // Proc.Natl.Acad.Sci., 1991, v. 88, p. 2336-2340.

209. Martines M.D., Reyes M.J.M. La plasticidad de los cultivos agricolas.// VESTNIK de la Universidad Rusa de la Amistad de los Pueblos., 2001, p. 55 65.

210. Mc Coy T. Tissue culture selection for resistant plants. // Lowa state j. Res, 1988, N4, p. 503-521.

211. Mc Hughen A. Rapid regeneration of wheat in vitro J/ Ann. Bot, 1983, V.51, No. 6. P. 851.

212. Michal E, Ronald E, Kathleen T, Robert R Screening hibrid poplars in vitro for resistanse to leaf spot caused by Septoria musiva. II Plant disease, 1988, v. 72, N6, p. 491-499.

213. Miklas P.N, Grafton K.F, Secor G.A. Use of patho gen filtrate to differentiale physiological resistance of dry bean to white molddisease.// Crop. Sc., 1992, v. 32, № 2, p. 310-312.

214. Munthali M.T, Newbury H.J,Ford-Lloyd B.v. The detection of somaclonal variants of beet using RAPD. // Plant Cell Repts.l996.v.l5. No 7.P.474 478.

215. Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth andbioassaya with tobacco tissue cultures. // Physiologia Plantarum, 1962, vol. 15, N3, p. 473-497.

216. Nascaril J., Broggio M. Studies on Alternaria solani tuberosum in vitro interactions.// Riv. Agr. Subtrom. Trop., 1990. A. 84, N 3, p. 445-499.

217. Pauwert P. Les septorioses phytoma Def. Cult. 1984, vol. 363, p. 21-22.

218. Quiros C. F., Hu G., This P., Chense A. M., Delseny M. Development of chromosomal localization of genome by specific markers by polymerase chain reaction in Brassica. II Theor. Appl. Genet., 1991, v. 82, p. 627-632.

219. Reinert J., Morphogenese und ihre Kontrolle an Gewebekulturen aus Carotten.//Naturwissenschaften, 1958, Bd. 45, s. 344-345.

220. Reyes M.J.M., Martines M.D Introduccion a la ecofisiologia de cultivos. 2001,79 р.

221. Sacristan M. Resistance responses to Phoma lingam of plants regenerated from selected cell and embruogenic cultures of haploid Brassica napus. II Theoretical and Applied Genetics, 1982, vol. 61, N 3, p.193.200.

222. Sebby С., Harvey В.М. The influence of composition of the basal medium on the growth and morphogenesis of cultured sitka sprucea (Picea sitchensis) tissues. // Ann. Bot., 1990, vol. 65, N 4, p. 395 407.

223. Semal J., Viseur J., Anceau C. In vitro cultures of producing pathogen-free plants and selecting disease resistant genotupes. // Bull. Rech. Agron. Gembroux, 1988, vol. 23, N 3, p. 261-269.

224. Shoyama Y.,Zhu X.X.,Nakai R.,Shiraishi S.,Kohda H. Micropropagation of Panax notoginzeng by somatic embryogenesis and RAPD analysis of regenerated plantlets. // Plant Cell Repts.,1997, v.16, N 7, p.450 453.

225. Simons S.A., Gilligan C.A. Relationships between stem canker, stolon canker, black scurf {Rhizoctonia solani Kuhn.) and yield of potato {Solanum tuberosum) under different agronomic conditions.//Plant Pothol, 1997, vol 46, N5, p. 651-658.

226. Sjodin C., Glimelius K. Transfer of resistance against Phoma lingam Brassica napus by asymmetric somatic hybridization combined with toxin selection. // Theoretical and Applied Genetics, 1989, vol. 78, N 4, p. 513520.

227. Spencer D., Fox R.A. Pathogenicity of Rhizoctonia solani to potato leaflets.//Pot. Res. 1978, vol. 21, p. 9- 14.

228. Steward F. Growth and organized development of cultured cells. Ill Internation of the growth from free cells to carrot plants.// Amer. J. Bot., 1958, v. 45, p. 709-713.

229. Taylor P.W.J., Geijskes J.R., Ко H.L., Henry R.J., Birch R.G. Sensitivity of random amplified polymorphic DNA analysis to detect genetic change in sugarcane during tissue culture. // Theor. Appl. Genet., 1995, v.90, p. 1169-1173.

230. Thanutong P., Furusava I., Ymamoto M. Resistance tobacco plants fromprotoplasts derived calluses selected for their resistance to Pseudomonas and Alternaria toxins. // Theoretical and Applied Genetics, 1983, vol. 66, N3/4, p. 209-215.

231. Toyoda H. Selection of disease resistant plant through tissue culture. // Karaky to scibucu, 1990, vol. 28, N 1, p. 12-19.

232. Toyoda H., Hajashi H., Ymamoto K., Hirai T. Selection of resistant tomato calli to fusaric acid. // Ann. Phytopathol. Soc. Japan, 1984, vol. 50, N5, p. 538-540.

233. Trione E.J., Jones L.E., Matzger R.J. In vitro culture of somatic wheat callus tissue. // Amer. J.Bot., 1968, V.55, P.529.

234. Tylkowska K. Stadies toxines Alternaria alternata isolaten from carrot seeds and seedling. // Szczeshag, 1974, s. 877-879.

235. Tylkowska K. Toxinogenicity of Alternaria alternana isolates from carrot seeds and seedlings. // Seed Sc. Technol, 1995, v. 23, N. 3, p. 877879.

236. Warburton M. L. and Bliss F. A. Genetic diversity in peach (Pronus persica L. Batsch) revealed by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers and compared to inbreeding coefficients. // J. Amer. Soc. Hort. Sci., 1996, v. 121, p. 1012-1019.

237. Weining S. and Langridge P. Identification and mapping of polymorphisms in cereals based on the polymerase chain reaction. // Theor. Appl. Genet., 1991., v. 82, p. 209-216.

238. Welsh J. McClelland M. Fingerprinting genome using PCR arbitrary primers. // Nucl. Acid Res., 1990, v. 8, No. 24, p. 7213-7218.

239. Williams G. J. K, Kubelir A. R., Livak K. J., Rafalski J. A., Tingey S.V. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful genetic markers. // Nucl.Acid Res., 1990, v. 18, p. 6531-6535.

240. Yang X. and Quiros C. Identification and classification of celery cultivars with (RAPD) markers. // Theor. Appl. Genet., 1993, v. 86, p. 205212.

241. Zachman R. Untersuchungen uber die variabilitat von Rhizoctonia solani im hinblick auf die resistenzzuchtung der kartoffel. 1972, 189 p.

242. Zamora A.B., Scott K.J. Callus formation and plant regeneration from wheat leaves.//Plant Sci.Hett., 1983,V.29, №.2,3. P. 183.

Информация о работе

Калашникова, Елена Анатольевна
доктора биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.23

Диссертация

Клеточная селекция растений на устойчивость к грибным болезням - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы