КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ РАСТЕНИИ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ГРИБНЫМ БОЛЕЗНЯМ

Калашникова, Елена Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ РАСТЕНИИ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ГРИБНЫМ БОЛЕЗНЯМ
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ РАСТЕНИИ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ГРИБНЫМ БОЛЕЗНЯМ"

На правах рукописи

КАЛАШНИКОВА Елена Анатольевна

КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ РАСТЕНИЙ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ГРИБНЫМ БОЛЕЗНЯМ

Специальность 03.00.23—биотехнология

АВТОРЕФЕЙЧТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2003

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии им. К А. Тимирязева и в Институте физиологии растений Российской Академии наук им К А. Тимирязева

Научный консультант—доктор биологических наук, академик РАСХН B.C. Шевелута.

Официальные оппоненты доктор биологических наук A.B. Поляков, доктор биологических наук, профессор А.М. Носов, доктор биологических наук И.В. Голденкова.

Ведущее учреждение — ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии

Защита диссертации состоится октября 2003 г в/^ часов на заседании диссертационного совета Д 220 043 10 при Московской сельскохозяйственной академии имени К А Тимирязева по адресу 127550, Москва И-550, ул Тимирязевская, 49. Ученый совет МСХА

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ МСХА

Автореферат разостан '

Ученый секретарь диссертационного совета—

кандидат биологических наук

Г.И. Карлов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Создание форм, сортов и гибридов растений, устойчивых к биотическим факторам является одним из важных направлений селекции. Это обусловлено большими потерями урожая сельскохозяйственных растений, вызванными поражением их грибными, бактериальными и вирусными болезнями и повреждением вредителями. Например, в середине 70-х годов XX века появление нового биотипа бурой ржавчины пшеницы привело к потере устойчивости популярных в то время на Северном Кавказе сортов Аврора и Кавказ; в конце 70-х годов наблюдалось массовое поражение подсолнечника белой и серой гнилями; вспышка фузариоза колоса пшеницы в 80-е годы снизила ее урожайность на 40-45%.

Данную проблему трудно решить, используя только традиционные способы защиты растений и посевов: агротехнические, химические и биологические, так как ни один из них в отдельности не обладает достаточной эффективностью.

Радикальным средством защиты растений от фитопато генов является селекция, создание комплексно устойчивых сельскохозяйственных культур, и прежде всего, с использованием отдаленной гибридизации. Этим методом созданы многие ценные формы, сорта и гибриды сельскохозяйственных растений. Однако продолжительность такой селекции достигает 15-20 и более лет, а степень устойчивости растений к вредным организмам является недостаточной и далеко не всегда отвечает требованиям производства.

Одним из новых, перспективных путей повышения эффективности селекционного процесса является использование современных методов биотехнологии, позволяющих расширить спектр генетического разнообразия (сомаклональная вариабельность, соматическая гибридизация, индуцированный мутагенез, генетическая инженерия) и сократить сроки проведения селекции. Значительное место в решении этих задач занимает клеточная селекция, основанная на отборе клеточных популяций, устойчивых к селективному фактору, и регенерации из них целых растений.

В настоящее время в нашей стране и в мире достигнуты значительные результаты по клеточной селекции: созданы линии картофеля, устойчивые к фитофторозу; томатов - к альтернариозу; риса - к пирикуляриозу; люцерны и льна - к фузариозу; клевера - к склеротинии и др. Как правило, в качестве селективного фактора используются токсины белковой и небелковой природы, выделенные из патогенных грибов. Устойчивость растений-регенерантов, полученных в процессе клеточной селекции, не всегда коррелирует с устойчивостью растений в условиях in vivo. В связи у этим ж-пКуппишг» разрабатывать

нетрадиционные подходы, обеспечивающие повышение устойчивости растений к фитопатогенам

Начиная с первых работ по культивированию раститетьных клеток, тканей и органов растений в условиях in vitro особый интерес у исследователей вызывал вопрос о гом, какие изменения могут происходить в изолированных клетках, растущих на искусственных питательных средах и причины их вызывающие Важной проблемой в исследованиях по клеточной селекции на устойчивость к биотическим факторам явгяется выявление механизмов адаптации каллусных и суспензионных клеток к действию стрессового фактора, обустовленных изменениями на генетическом уровне, в гормональном балансе и метаболизме вторичных соединений клеток, подвергшихся стрессовым воздействиям Изучению -этой проблемы и посвящена настоящая диссертация

Цель и задачи исстедовання. Целью данной работы яв шется усовершенствование и разработка методов и технологий клеточной селекции пшеницы, моркови и картофеля т vitro на устойчивость к фитопатогенным грибам Septoria nodorum Alternaría radiaría Rhizoctoma solani, а также выяснение механизмов, обеспечивающих устойчивость клеток каллусных и суспензионных культур к действию экзометаболитов исследуемых патогенов

В соответствии с поставленной целью нами решались следующие основные задачи

1 разработка методов клеточной селекции растений т xitro путем культивирования клеток каллусных и суспензионных культур на питательных селективных средах оптимизация способов получения ку льтурального фильтрата патогенов, условий проведения клеточной селекции и состава питательных сред, обеспечивающих поаучение растений-регенерантов, устойчивых к грибным патогенам,

2 исследование изменений в гормональном статусе клеточных линий и растений-регенерантов, прошедших селекцию in vitro на селективных средах с использованием экзометаболитов патогенов,

3 определение участия фенольных соединений в адаптации клеток каллусных и с> спензионных культур к действию стресс-фактора,

4 оценка на генетическом уровне (RAPD метод) каллусных клеток, культивируемых в стандартных и стрессовых условиях, а также растений-регенератов, полученных в результате клеточной селекции и отличающихся повышенной устойчивостью к грибным патогенам Научная новизна работы. Впервые разработаны и предложены

методы клеточной л такневой селекции т v,tro, позволяющие получать каллусные линии и растения пшеницы, моркови и картофеля, обладающие повышенной устойчивостью к фитопатогенам Septoria

nodorum, Alternaria radicina, Rhizoctonia solani. Предложенные методы основаны на, культивировании каллусных или суспензионных клеточных культур на питательных средах, содержащих культуральный фильтрат (КФ) патогена в течение 8-10 пассажей.

Установлена зависимость фитотоксичности экзометаболитов возбудителей болезней в условиях in vitro от состава питательной среды. Показана целесообразность использования в качестве селективного фактора КФ патогена, полученного при выращивании изолятов грибов в течение 30-ти дней в жидкой питательной среде Чапека. В этих условиях фитотоксичность КФ в 5-7 раз превышает этот показатель при культивировании фитопатогенов на среде Мурасига и Скуга.

Экспериментально установлено, что культуральный фильтрат патогенов ([Septoria nodorum, Alternaria radicina, Rhizoctonia sotaní) в концентрациях 10-20% стимулирует рост интактных растений, а также клеток каллусных и суспензионных культур (пшеница, морковь, картофель). Более высокие концентрации экзометаболитов оказывают ингибирующее действие на указанные объекты.

. Впервые разработаны индивидуальные схемы селекции in vitro для пшеницы, моркови и картофеля и подобраны оптимальные концентрации КФ патогена. Установлено, что для каллусной ткани пшеницы целесообразно использовать 20%-ый КФ Septoria nodorum; для суспензионной культуры моркови - 30-50%-ый КФ Alternaria radicina; для каллусной и суспензионной культур картофеля - 30-40%-ый КФ Rhizoctonia solani.

Впервые, в результате клеточной селекции получены устойчивые клеточные линии и растения-регенеранты, превышающие устойчивость исходных форм к действию изучаемых патогенов на 10-35%, а для отдельных генотипов до 50%.

Выявлены изменения в гормональном статусе клеточных линий и растений-регенерантов моркови и картофеля, полученных в результате селекции к экзометаболитам патогенов. Определены различия в содержании гормонов в суспензионной культуре, длительно культивируемой в стандартных и стрессовых условиях. Установлено, что адаптация клеток к стрессовому фактору сопровождается повышением уровня цитокининов и ИУК. У растений-регенерантов моркови, полученных в результате клеточной селекции, отмечено значительное повышение содержания ауксинов, гиббереллинов и, особенно, цитокининов, по сравнению с контрольным вариантом.

Изучена зависимость способности клеток суспензионных культур к синтезу фенольных соединений от генотипа, времени и условий их культивирования in vitro. Доказано участие фенольных соединений в адаптации клеток к действию стресс-фактора. Более высокое их

накопление характерно для устойчивых к экзометаболитам клеточных культур, по сравнению с неустойчивыми Значите льная роль в этом процессе принадлежит фенольному полимеру лигнину, ограничивающему проникновение кутьтурального фильтрата патогена в клетки за счет чигнификации клеточной стенки В растениях-регенерантах выявлено не только повышение содержания фенольных соединений, но и изменение их качественного состава

Установлены различия в нуклеотидных последовательностях ДНК СRAPD методом) в клеточных культурах, культивируемых на селективных и стандартных средах Для устойчивых каллусных культур и растений-регенерантов, полученных в результате клеточной селекции, RAPD спектры ДНК отличались отсутствием или присутствием новых фра1-ментов размером от 330 п н до 1200 п н, которые не были характерны дтя RAPD спектров ДНК контрольного варианта

Практическая значимость работы. Предлагаемые в работе схемы и методы клеточной селекции, позволяют получать растения-регенеранты пшеницы, моркови и картофеля, устойчивые к фитопатогенам Septana nodorum Alternaría radwina Rhizoctoma wiam соответственно Такие растения могут быть использованы в традиционной селекции и служить основой для создания новых сортов и гибридов, обладающих повышенной устойчивостью к грибным болезням Полученные новые данные об участии эндогенных гормонов и сренолышх соединений в адаптации клеток к стрессовым условиям являются теоретической основой дтя более полной расшифровки механизмов устойчивости клеток к действию экзометаболитов опасных патогенов

Результаты исследований тепи в основу раздета «Клеточная и тканевая биотехнология в селекции и растениеводстве» учебного пособия и 2-х изданий учебника «Сельскохозяйственная биотехнология» (1998, 2003), изданного коллективом авторов под редакцией академика РАСХН В С Шевелехи

Обоснованность и достоверность научных положений и выводов обеспечивается анализом обширного экспериментального материала, полученного в течение 10 лег с использованием существующих современных и разработанных нами методик и статистической обработкой результатов исследований с оценкой их точности и достоверности

Личный вклад автора. Постановка проблемы, целей и задач исследований, разработка программы и новых методов исследований, обработка, анализ и обобщение полученных результатов выполнены автором Экспериментальные работы проведены автором и частично аспирантами пот его руководством

Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы и предложения докладывались на симпозиуме в Вашингтоне « In vitro in Biology» (1996, 1997), на Международной конференции «Молекулярная генетика и биотехнология» ( Минск, 1998), на I и II Международной конференции «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 1996, 2000), на V и VI Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 1997, 2001), на VII и VIII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда» (Москва, 1997, Саратов, 2003), на III Международной конференции, посвященной памяти Б.В.Квасникова (Москва, 2003), на ежегодных научных конференциях МСХА (Москва, 2000, 2001, 2002), а также на заседании кафедры сельскохозяйственной биотехнологии МСХА им К. А. Тимирязева.

Публикации. Основные результаты исследований по диссертации опубликованы в 48 работах, в том числе в соответствующих главах учебного пособия и в двух учебниках для вузов «Сельскохозяйственная биотехнология» под грифом Министерства образования РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения и 8 глав: обзор литературы, объекты и методы исследований, результаты и их обсуждение (6 глав), а также выводов и списка цитируемой литературы.

Материалы диссертации изложены на 270 страницах машинописного текста, содержат 55 таблиц, 55 рисунков. Библиография включает 280 источников, из которых 75 зарубежной литературы.

Глава 1. Клеточная селекция и другие проблемы современной биотехнологии

Развитие современной молекулярной биологии и генетики, методов культивирования растительных, животных клеток и микроорганизмов в условиях in vitro, технологий рекомбинантных ДНК, открыло широкие возможности для их применения в науке и производстве. Главные направления современной биотехнологии -генетическая и клеточная инженерия, получившие интенсивное развитие в 80-е годы прошлого столетия, широко используются в настоящее время во многих странах мира, в том числе и в России. Лидирующее место в этой области занимают научные учреждения США, Англии, Германии, Франции, Японии, Нидерландов, Италии. В последние годы наблюдается интенсивное развитие биотехнологических исследований в Китае, Индии и ряде других стран.

Основные задачи современной биотехнологии в области сечьского хозяйства - создание генетически модифицированных объектов (растений, животных и микроорганизмов) с заранее заданными признаками и свойствами, создание высокоэффективных штаммов бактериальных препаратов, с повышенной активностью нитратредуктазы и биологического связывания атмосферного азота, уменьшение потерь органического вещества за счет контроля процессов нитрификации и денитрификации, получение регуляторов роста растений и биопрепаратов, защищающих их от болезней и вредителей, разработка приемов, позволяющих ограничить отрицательное антропогенное воздействие на биосферу в результате интенсификации сельского хозяйства и громышленности

Современная биотехнология охватывает широкий круг методов, отраслей, объектов производства и задач, объединенных в несколько крупнейших блоков и направлений Среди них на первое место в XXI веке в стратегическом тане выходит генетическая инженерия, главной целью которой является создание трансгенных растений (Шевелуха, 2000) Для успешного решения этой приоритетной задачи необходимо преодолеть отставание в идентификации и клонировании генов, созданию их банков, расшифровке механизмов полигенной детерминации признаков и свойств био югичесчлч объектов, созданию надежных векторных систем и обеспечению высокой устойчивой экспрессии генов Уже сегодня во многих тбораториях мира с помощью методов генетической ин -кенерии со ¡даны принципиально новые трансгенные растения, животные и микроорганизмы, используемые в коммерческих целях Созданы устойчивые формы сои и рапса к гербицидам, хлопчатника и кукурузы - к насекомым, картофеля - к колорадскому жуку и фитофторозу 11осевные площади, занятые под трансгенными сортами и гибридами се гьскохозяиственных растении, достигают в мире уже 58 5 млн 1а, которые за последние годы особенно резко возрасли

Более широкое практическое применение в настоящее время получило второе важное направление современной биотехнологии -клеточная инженерия, основанная на тотипотенстности клеток, способности их регенерировать целое растение, а также синтезировать важнейшие соединения вторичного метаболизма Работы в этом направлении носят многоплановый характер и позволяют размножать и сохранять пенные, шкарственные и исчезающие растения (клональное микроразмножение), ускорять селекционный процесс (клеточная селекция), получать неполовым путем гибриды (соматическая гибридизация), а также сохранять неполноценные зародыши (культура

изолированных зародышей) и ценные клеточные популяции (криоконсервадия).

В клеточной биотехнологии также существуют острые научные проблемы, решение которых позволит значительно повысить ее эффективность. Главные трудности клеточной инженерии недостаточно высокая частота регенерации клеток и нарушение нормального онтогенеза организмов; узкий спектр сомаклональной вариабельности; слабая экспрессия генов, контролирующих важнейшие хозяйственно-ценные признаки, а также не высокий выход веществ вторичного синтеза. Несмотря на трудности, в этом направлении достигнуты значительные результаты, которые нашли свое применение в селекционном процессе, производстве и промышленности. Большое число работ проведено на пшенице, ячмене, рисе, сорго, картофеле, томатах, люцерне и других сельскохозяйственных культурах. Получены растения пшеницы, риса, картофеля, устойчивые к NaCl или Na2SC>4 ; растения моркови, способные синтезировать в 20 раз больше метионина, в 30 раз - триптофана, в 5 раз - лизина; растения картофеля, устойчивые к кольцевой гнили. Методом гаплопродюсера созданы первые два сорта ячменя Исток и Одесский 115, отличающиеся повышенной продуктивностью и устойчивостью к засухе и болезням (Новолоцкий, 1986). В Госреестр РФ включены (1993-1994 гг.) сорта ярового ячменя Биос 1, Рамос и Эльф, полученные с участием в скрещивании дигаплоидных линий (Неттевич, 1986).

Таким образом, два важнейших направления биотехнологии: генетическая и клеточная инженерия составляют основу нынешних и будущих приоритетов в биотехнологии. Закономерное развитие этого процесса наряду с другими мерами, обеспечит решение стратегических задач России, многих государств мира и всей цивилизации -экологическую безопасность для людей; защиту человека и человечества от болезней; продовольственную безопасность государств; устойчивое экономическое развитие всех стран мира (Шевелуха, 2000, Скрябин, 2003).

Глава 2. Объекты и методы исследований.

Объекты исследований. Объектом исследования служили: яровая мягкая пшеница, морковь и картофель.

Исследования с яровой мягкой пшеницей проводили на 8 генотипах, обладающих различной устойчивостью к Septoria nodorum ' Berk. К устойчивой группе относятся - WW-15370, Gaterin, 81S-8, 91S-10; среднеустойчивой - Московская 35, Энита; неустойчивой - Саратовская 29, Fortuna. Семена, всех изучаемых генотипов, предоставлены сотрудниками кафедры селекции и семеноводства полевых культур

МСХА им К А Тимирязева

Эксперименты с морковью проводили на 6 генотипах, обтадающих различной полевой устойчивостью к грибу Alternaria radicina М, Dr et Е К среднеустойчивой группе относятся - тинии 906, 805, неустойчивой - сорт Rondo, линии 225П 6700, 1268 Семена всех изучаемых генотипов предоставлены сотрудниками таборатории сечекции и семеноводства овощных культур Всесоюзного научно-исстедоватетьского института овощеводства

Исследования с картофелем проводили на 4 генотипах, обладающих различной устойчивостью к патогену Rhizoctonia solam Kühn Удача, Невский, Жуковский ранний, Дезире Пробирочные растения предоставлены сотрудниками На\чно-исследовате1Ь^кого института картофельного хозяйства

Методы исследований Лабораторные исследования по культуре изолированных клеток, тканей и органов растений проводили в соответствии с методическими указаниями разработанными Р Г Бутенко (1964) и автором изложенных в ииораторно-iфактических занятиях по сельскохозяйственной биотехно тощи (1496)

В работе использовали стандартную питательную среду My рас ига и Скуга, содержанию разшчные вещества цитокининовой и а\ксиновой природы Длительность культивирования кал тесных кутьтур составляла 28 дней, а дтя суспензии - 14 дней

Кугьт\ рольный фильтрат (КФ) патогенов (JSeptoria nodorum Alternaría radicina Rhizoctonia solara) по чу чал и путем выращивания изолятов грибов в лсидкои питательной среде Мурасига и Скуга, а также Чапека в колбах объемом 300 мл на качалке со скоростью вращения 100 об/мин В каждую колбу вносили иноку дам содержащий 108 шт конидий гриба Кульгуральный фильтрат получали путем фильтрования суспензии гриба через фильтровальную бумагу с последующим автоклавированием Токсичность КФ определяли на 9, 14, 19, 23, 30-й день с момента выращивания патогенов в питате ,ьнои среде по прорастанию семян (пшеница, морковь) или по росту пробирочных растении (картофель)

Селекцию т vitro проводили на каллусной культуре дтя пшеницы, на суспензионной культуре - для моркови, а также на калтусной и суспензионной культурах - дтя картофеля В качестве селективного фактора использовали КФ патогена, который добавляли в питательную среду в концентрациях 10 - 50% от конечного объема питательной среды В работе применены различные схемы селекции в зависимости от объекта исследования Для характеристики роста и физиологического состояния калт*<сных и суспензионных культур использовали сырую

массу клеток, определяли жизнеспособность, степень агрегированности культур, а также ростовой индекс.

После селекции, каллусную ткань переносили на питательные среды для регенерации, а суспензионную культуру платировали в агар по методике, изложенной в методических указаниях «Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии» (1996) с целью получения микрокаллуса и растений-регенерантов.

Оценку растений-регенерантов на устойчивость к исследуемым фитопатогенам осуществляли в лабораторных условиях путем культивирования растений на питательных средах, содержащих КФ патогенов в концентрации 95-100%.

Эндогенные гормоны определяли в пробах суспензионных культур, культивируемых в стандартных и стрессовых условиях, на I, IV и VIII пассажах и растениях-регенерантах. Содержание ндолилуксусной кислоты (ИУК), абсцизовой кислоты (АБК), цитокининов (ЦК) (сумма зеатина), определяли с помощью ВЭЖХ и ИФА, а гибберелины (ГК3) -биотестированием по методу Франкленда и Уоринга (Franldand Wareing, 1960). Опыты проводили в двух биологических (каждая состояла из 30 растений-регенерантов) и двух химических повторностях.

Фенольные соединения определяли в каллусных и суспензионных культурах и растениях-регенерантах. Материал экстрагировали горячим 96%-ным этанолом. В этанольных экстрактах определяли содержание суммы растворимых фенольных соединений спектрофотометрическим методом (поглощение при 725 нм) с реактивом Фолина-Дениса (Запрометов, 1971). Калибровочную кривую строили по (п)-оксибензойной кислоте.

Хроматография. Для разделения полифенолов использовали хроматографию в тонком слое целлюлозы (Ferak, толщина слоя 0,25 мм) в системе н-бутанол - уксусная кислота - бутанол (40:12:28 по объему). Идентификацию выделенных соединений проводили на основании их флюоресценции в ультрафиолетовом свете, а также по качественной реакции с 1%-ным водным раствором железа и красной кровяной соли (Запрометов, 1985).

Изучение локализации лигнина в клетках проводили с использованием реакции с флороглюцином (Стрекова, Субботина, Загоскина, Запрометов, 1980). Препараты просматривали на световом микроскопе Ergavall (Германия) с фотоприставкой.

К APD анализ каллусной ткани и растений-регенерантов. Выделение ДНК из каллусной ткани и растений-регенерантов, а также исходного сорта проводили по методике Edwards et al. (1991). Амплификацию ДНК проводили по стандартной методике.

Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе «Perk.cn Emler» (США) для проведения реакции использовали наборы реактивов «Promega» (США) Для выявления полиморфизма использовали 9 стандартных праймеров Ранее они использовались для выявления межсортового и внутрисортового полиморфизма у ячменя и твердой пшеницы

Глава 3. Каллусогенез и морфогенез в культуре in vitro.

Одной из важных и сложных проблем современной биологии является регенерация целого растения из изолированной клетки, обладающей свойством тотипотентности (реализация нормального морфогенеза) В ее основе лежат процессы морфогенеза, показатели которого определяются темпом и ориентацией к i елочных делений, блокированием клеточного цикла, ростом клеток и их дифференциацией Процессы морфогенеза индуцируются изменением в экспрессии генов н закреп тением этой эпигенетической изменчивости клонированием перепрограммированной инициальной клетки (Bvichko 1994.) Ценность клеточных технологий, в первою очередь, определяется возможностью восстановления целого растения Регенерация побегов, корней и других органов в культуре in varo является необходимым и важным условием успешного проведения разнообразных клеточных и генноинженерных экспериментов

3 1. Пшеница

Клеточная и тканевая селекция растений базируется на культивировании в стрессовых условиях иг vitro каллусных и суспензионных клеток Однако клетки, прошедшие цикл селекции иг vitro, как правило, частично или полностью теряют способность к морфогенезу Поэтому изучение влияния генотипа, состояния первичного экспланта и гормонального состава питательной среды на процесс калчусогенеза и морфогенеза, является первостепенной задачей при проведении работ по клеточной селекции Для пшеницы эти работы являются особенно актуальными, что объясняется большой зависимостью регенерационного потенциала ее клеток и тканей от генотипа и продолжительности их культивирования in vitro Особенности калчусогенеза и морфогенеза различных генотипов Зрелые и незрелые зародыши 8 исследуемых генотипов пшеницы культивировали на модифицированной питательной среде Мурасига и Скуга, содержащей 2 4-Д в концентрации 2 мг'л Эта среда была выбрана в качестве базовой, универсальность которой экспериментально доказана различными авторами для получения каллусной ткани из зародышей ряда злаковых культур (Иванов, 2001)

Наши исследования показали, что под влиянием 2,4-Д клетки зрелого и незрелого зародышей неорганизованно делятся, образуя каллусную ткань, состоящую из рыхлых, оводненных и более плотных, структурированных участков с выраженными меристематическими очагами. Наибольшей способностью к каллусогенезу обладали генотипы WW-15370, Gaterin, 81S, Энита, Московская 35, Саратовская 29, для которых характерно формирование каллусной ткани в 28-32% случаев, в то время как для генотипов 91S и Fortuna этот показатель не превышал 18-20%. Установлено, что формирование морфогенного каллуса происходило с разной интенсивностью и также зависело от генотипа исходного растения. Выявлено, что Gaterin и 91S обладали низким морфогенетическим потенциалом (6% и 8,3% соответственно), в то время как для остальных генотипов этот показатель находился в пределах 11,6-20%.

Таким образом, генотипическая зависимость процессов каллусогенеза и морфогенеза варьирует в пределах от 6 до 32 %, что необходимо учитывать при подборе исходных форм в работах по клеточной селекции с этой культурой.

Качлусогенез и морфогенез различных первичных эксплантов. Зрелые зародыши. Изучено влияние различных концентраций 2,4-Д (1-5 мг/л). Исследования позволили выявить ряд закономерностей, которые проявлялись в самом процессе формирования каллусной ткани. Как правило, каллусогенез начинался с дедифференцировки нижних клеточных слоев зародыша, которые находились в непосредственном контакте с питательной средой. Спустя 14 дней эти клетки полностью дедифференцировались и во всех исследуемых вариантах образовывалась рыхлая, оводненная каллусная ткань светло-желтого цвета. В зависимости от концентрации 2,4-Д в питательной среде наблюдался рост мристематической части зародыша и формирование проростка. Обнаружена обратная зависимость между темпами образования проростков и концентрацией 2,4-Д в среде, тогда как способность зародышей образовывать каллус и интенсивность его формирования находятся в прямой зависимости от концентрации 2,4-Д и зависит от генотипа первичного экспланта. Повышенные концентрации ауксина влияют на проницаемость мембран, что и проявляется в различном действии гормона (Гамбург, Рекославская, Швецов, 1990). Зародыши сортов Московская 35, Саратовская 29, 81S, Gaterin, WW-15370 в 15-80% случаев образовывали неморфогенную каллусную ткань при всех испытанных концентрациях 2,4-Д. Для генотипов Fortuna, Энита, 91S этот показатель находился в пределах 1038%.

Результаты экспериментов позволили заключить, что использование

2,4-Д в концентрациях 2 и 3 мпл являются наилучшими для культивирования зрелых зародышей пшеницы с целью получения хорошо пролиферирующей каллусной ткани Формирование морфогенной каллусной ткани во всех вариантах отмечалось шшь в 10% случаев

Известно, что для сохранения морфогенетического потенциала каллусных клеток, необходимо культивировать их на средах, содержащих ауксин в сочетании с цитокинином Исходя из этого было изучено влияние 2,4-Д в сочетании с различными цитокининами (зеатин, кинетин, БАП 0,5 мг/л) на процесс каллусогенеза и морфогенеза Установлено, что на фоне постоянной концентрации цитокинина (0,5 мг'л), но с повышением концентрации 2,4-Д в питательной среде от 2 до 3 мг л, во всех вариантах возрастает способность зародышей формировать морфогенную каллусною ткань Причем в варианте использования 2,4-Д 2 мг/л в сочетании с цитокинином число морфогенных каллусов не превышает 2 5 - 10,6%, в то время как в варианте с 2,4-Д 3 мг'л этот показатель возрастает до 60,0%

Из всех изученных веществ наибольшую активность проявили природные цитокинины - зеатин и кинетин В этих вариантах наблюдалось формирование морфогенной каллусной ткани в 30 - 60% случаев, в ю время как в варианте с ЬАП этот показатель не превышал 16,7-28,5%

Незрелые зародыши Изучено влияние различных концентраций 2,4-Д на процесс формирования каллусной ткани у незрелых зародышей Обнаружена прямая корреляционная зависимость каллусогенеза и морфогенеза от концентрации 2,4-Д в среде Последующее культивирование первичной и пересадочной каллусной ткани в оптимизированных условиях приводило к формированию морфогенной каллусной ткани в пределах 30-52,5%, что зависело от генотипических особенностей исследуемого объекта Каллусная ткань сортов Московская 35, Энига и Саратовская 29 име /а повышенную морфогенетическую активность и через три субкультивирования этот показатель достигал 45-52,5%, в то время как для остальных генотипов он оставался на уровне 30-40%

В целях выявления факторов повышения морфогенетической активности каллусных клеток было изучено влияние 2,4-Д в сочетании с различными цитокининами (зеатин кинетин, БАП) на этот процесс Установлено, что культивирование незрелых зародышей на питательной среде, содержащей 2,4-Д и один из изучаемых питокининов, не приводило к значительному увеличению морфогенетической активности каллусной ткани Наилучшие результаты были получены на

питательной среде, содержащей зеатин, который можно рекомендовать для получения морфогенной каллусной ткани пшеницы. Листовой эксплант. Изучена возможность получения растений-регенерантов из изолированных листовых эксплантов различных генотипов пшеницы, а также зависимость этого процесса от условий культивирования, размера и возраста первичного экспланта. Установлена обратная зависимость интенсивности каллусогенеза от возраста экспланта (Рис. 1).

Возраст экспланта, дни —Московская 35 —»—Фортуна —Энита —-Иг-УУУ\М5370 ■ ж ' Оа'енп ^

Рис. 1 Зависимость интенсивности каллусогенеза ( в % от общего числа эксплантов) от возраста первичного экспланта.

Выявлена также зависимость каллусогенеза от генотипа первичного экспланта. У сортов У¥ТУ-15370 и СМегт наблюдалось образование каллусной ткани из листовых сегментов, изолированных с 3 - 14-дневных проростков, в то время как для других исследуемых генотипов этот процесс заканчивался в 11 дневном возрасте иервичного экспланта. Самый высокий показатель по каллусогенезу отмечен у 7-дневного листового экспланта для всех изучаемых сортов.

Изучена также зависимость каллусогенеза пшеницы от размера листового экспланта, которая находится в обратной корреляции. С увеличением размера листового экспланта от 3 до 7 мм уменьшалась их способность формировать каллусную ткань. При длине листового сегмента в 6 мм этот показатель резко снижался, при 8-10 мм формирование каллуса не наблюдалось. Оптимальным для получения хорошо яролиферирующей каллусной ткани является листовой эксплант размером 3-5 мм.

Экспериментальных данных по регенерации злаковых культур из

каллу сной ткани аистового происхождения пока недостаточно и они носят, в основном, поисковый характер Не определены концентрации питательных срел для пшеницы, обеспечивающие высокую морфогенетическую активность ьаллусных клеток В связи с этим нами испытано большое количество вариантов питате :ьных сред, отличающихся друг от друга концентрацией и соотношением цитокининов и ауксинов, среди которых лучшими оказались два 1) 2,4-Д 2 мг/л в сочетании с зеатином 0,5 мг'л 2) НУК 0,5 мг/л в сочетании с БАП 0,5 мг/т Культивирование каллуснои ткани в этих условиях приводило к индукции образования меристематических очш ов дающих начало развитию растений, которые характеризовались интенсивным ростом, яркой окраской листовых пластинок и имели хорошо развитую корневую систему

С\спензиочная к\ птура Суспензионную ку-ьтуру получали из хорошо пролифсрируюшей, рыхлой калтусной ткани пшеницы трех генотипов Саратовская 29, Энита и Fortuna Hccieдовали влияние различных концентраций 2,4-Д в сочетании с CaCI на рост суспензионной культуры Установлено, что увеличение концентрации 2,4-Д и уменьшение СаСЬ в среде значительно повышают де 1ение клеток и формирование ме жоагрегированной суспензионной культуры В других вариантах, как правию, суспензия состояла из клеточных агрегатов средних и крупных размеров (бо^ее 50 клеток в агрегаге) что вероятно, являлось препятствием активного деления дсдкфферыщированных клеток Несмотря на различия в поведении суспензионных культур на разных питательных средах, выявлены обшие тенденции в росте клеточных суспензий С увешчением числа су оку хьтивировании увеличивается способность клеток к делению Максимум преходится на IV пассаж, а к концу V пассажа интенсивность деления клеток резко уменьшается Из всех исследуемых генотипов хорошей пролиферативной способностью обладали клетки суспензионной культуры сорта Энита, промежуточное положение занимал сорт Fortuna, а Саратовская 29 отличалась низкой способностью формировать хорошо пролиферирующую суспензионную кушгуру Дальнейшее ку льтлвирование суспензий на оптимизированной питательной среде в течение VI - VIII пассажей не позволило активизировать рост клеточных культур По данным ряда авторов (Сидоров, 19ОД, Бутенко, 1994, Шаяхметов, 1999) это связано с потерей тотипотетности клеток и резкому снижению экспрессии генов контролирующих этот процесс

Влияние биопогически активных веществ и дрхгих факторов на •аорфогенетическии потенциал интактных растений и в кхльтуре т vitro В настоящее время регуляторы роста природного и

синтетического происхождения находят широкое применение в растениеводстве, фитопатологии, селекции и в других областях науки и отраслях производства. Насчитывается более 5 тыс. соединений, полученных из растений и микроорганизмов, обладающих регуляторным действием, из которых лишь 1% используется в мировой практике.

Наряду с веществами химической природы в исследованиях стали использовать физические факторы воздействия на растительный объект: электромагнитные излучения, электрические и магнитные поля, токи высокой частоты и др. Экспериментально доказано, что все эти воздействия имеют сходный механизм действия - активация электронного комплекса молекул, их ионизация, образование свободных радикалов и т.д., что, в свою очередь, приводит к повышению интенсивности биохимических реакций, активности ферментных систем и изменению метаболизма интактных растений (Гунар, Паничкин, 1970, Станко, 1997, Ковалев, 2000). Исследования по использованию нетрадиционных факторов гормональной и негормональной природы в культуре изолированных клеток, тканей и органов растений малочисленны и нередко имеют противоречивые результаты. В связи с этим было изучено действие биологически активных веществ (крезацин, эмистим, фумаран в концентрациях 0,1100 мг/л) и физических факторов (сверх слабое электромагнитное поле: мощность 0,5 ... 1,5 Вт/м , длина волны 200 ... 300 нм, частота волны 50 МГц, продолжительность воздействия на объект 1 мин 30 сек.) на морфогенез интактных растений пшеницы и в культуре in vitro.

Установлено, что все изучаемые биологически активные вещества проявляют схожее действие на развитие изолированных зародышей пшеницы в условиях in vitro. Показано, что с повышением концентрации веществ в питательной среде уменьшается способность зародышей формировать морфогенный и неморфогенный каллус, но при этом увеличивается морфогенетическая активность зародышей развиваться в проросток, в базальной части которого образуется каллус. Как правило, формирование нормальных по морфологии проростков отмечено лишь в вариантах с фумараном. Эти явления были характерны для всех изучаемых генотипов. Из всех веществ наибольшую активность в процессах каллусогенеза и морфогенеза проявили эмистим и крезацин (0,1 - 1 мг/л), в то время как действие фумарана было на 10-20% ниже.

Аналогичные исследования проведены и по изучению влияния сверх слабого электромагнитного поля на морфогенез изолированных зародышей. Исследованию подвергались изолированные зародыши перед введением их в культуру in vitro. Экспериментально доказано, что применение физического фактора стимулирует образование

морфогенного и неморфогенного каллуса Формирование морфогенного каллуса в этом случае происходит на 30% более интенсивно, чем при использованием эмистима и крезапина По видимому, это связано с изменением содержания эндогенных гормонов в первичном экспланте Нами установлено что содержание гормонов в зародышах после воздействия на них сверх слабым электромагнитным полем изменяется содержание эндогенных цитокининов повышается в 2-3 раза, а ауксинов снижается в 4-5 раз по сравнению с контрольным вариантом (без обработки) Это в свою очередь и повлияло на проявление большей способности клеток незрелых зародышей формировать морфогенный каллус

3.2. Морковь.

Особенности каллусогенеза разтчных генотипов и первичных экстантов Показано, что процесс образования каллусной ткани зависит от генотипа Сорт Rondo и линия 6700 обладали высокой способностью образовывать каллусную ткань (57 -70°'о) тогда как для линии 906, 805 и 225 этот показатель находился в пределах 24 - 39% Установлено, что для изучаемых генотипов формирование каллусной гкани происхо шло по всей поверхности экспланта, начиная с внутренних клеточных слоев на 7 ои день с момента введения их т \itro Выявлено, что процесс каллусогенеза зависит так же и от происхождения первичного экспланта Наибольшей способностью к каллусогенезу обладали сегменты черешков по сравнению с сегментами корнеплодов Поэтому, в последующих эксперимешах использовали каллус, полученный из сегментов черешков Рост схспензионных ку птур разтчных нотичов

Фазы ростового цикла определяли на суспензионной культуре всех изучаемых генотипов (Рис 2) Полученные данные свидетельствуют о том, что у исследуемых сортообразцов, фазы ростового цикла наступают в разное время Были выделены линии 225, 906 и сорт Rondo, для которых характерно одинаковое поведение клеток в суспензионной культуре Лаг-фаза v этих генотипов длилась 7 дней, линейная фаза - 4 дня, затем наступала фаза замедления роста и его S-образная кривая выходила на плато Для линий 6700 и 805 характерно быстрое или постепенное вступление клеток суспензионных культур в активное деление Таким образом экспериментально установлены генотипические различия в скорости деления клеток и роста суспензионных культур, что характеризует различный уровень регенерационного потенциала исходных форм растений моркови

Рис. 2 Характеристика роста суспензионных культур различных генотипов моркови.

Ростовой индекс. Этот показатель регенерационного потенциала определен на трех генотипах моркови(Лол£/о, 906 и 805). Установлено, что наибольшую активность роста проявляет сорт Rondo, для которого Ri клеточной суспензии находился в пределах 3,5 ... 5,4, что примерно в 2 раза превышает ростовой индекс линии 906 и в 3-4 раза - линии 805.

При существенных различиях величины ростового индекса, в экспериментах были выявлены и некоторые общие закономерности в поведении клеточных суспензий в процессе культивирования. Установлено, что на IV пассаже наблюдается увеличение Ri у всех исследуемых генотипов. Причем для сорта Rondo ростовой индекс увеличивался в 1,5 раза, а для линий 906 и 805 - 1,3 и 1,1 соответственно. В конце наблюдений (VII пассаж) Ri для всех генотипов приближался к исходным показателям, имевшем место в начале культивирования суспензионной культуры (I пассаж). Вероятно, это связано с адаптационными способностями суспензионных клеток к условиям культивирования.

Жизнеспособность и степень агрегнроваяности суспензионной культуры моркови определяли на разных пассажах (I, IV, VII) трех генотипов ( 906, 805, Rondo). Установлено, что соотношение числа живых и мертвых клеток является стабильной величиной в процессе культивирования in vitro и составляет для линия 906 9:1, для линии 805 -8:2 и для сорта Rondo - 7:3.

По степени агрегированности во всех суспензионных культурах были выделены три фракции: одиночные клетки, мелкие и крупные агрегаты. Установлено, что на I пассаже в суспензиях преобладали одиночные клетки, процент которых составлял 85-100%. На долю мелких агрегатов приходилось всего 15%, а крупные агрегаты отсутствовали вообще. На IV пассаже доля одиночных клеток снижалась до 53-70%, а соотношение мелких и крупных агрегатов было близко к единице. На • VII пассаже отмечалось дальнейшее снижение числа одиночных клеток

в суспензии, но при этом возрастало чисто крупных агрегатов ( линия 906, сорт Rondo) Особо выделялась линия 805, для которой характерно присутствие одиночных клеток в суспензии при длительном ее культивировании

Морфофизио логические исследования показали, что суспензия состояла из гетерогенных клеток по форме и размеру При длительном культивировании эти показатели менялись Для всех исследуемых генотипов на ранних пассажах отмечалось формирование клеток овально-вытянутой формы, большого размера с крупной вакуолью и мелким ядром При ку льтивировании клеток в течение восьми гассажей они сохраняли овальную форму, но незначительно уменьшались в размере Для сорта Rondo и линии 906 было характерно образование крупных агрегатов, состоящих из клеток меристематического типа, в то время как для линии 805 этих изменений не наблюдалось

Растения регенеранты получали из каллусной ткани, формировавшейся из клеток суспензионных культур после их платирования в агар В качестве стимулятора морфогенеза в питательную среду добавляли БАП в концентрации 1 мг л В этих условиях выращивания начало морфогенеза отмечалось через 1 неделю с момента культивирования микрокаллуса в данных условиях Формирование растений-регенерантов происходило через соматический эмбриогенез

3.3. Картофе.1ь

Недостаточная морфогенетическая активность клеточных культур отдельных сортов картофеля в условиях т vitro сдерживает эффективность применения методов клеточной селекции и генной инженерии в картофелеводстве Поэтому необходимым этапом в работах по этим направлениям является изучение в кульгуре in vitro генотипических особенностей морфогенеза и регенерационной активности различных типов эксплантов картофеля с целью включения их в дальнейшие исследования по клеточной селекции Особенности каллусог^неза и морфогенеза различных генотипов и эксплантов картофечя Работа проведена на четырех сортах картофеля Невский, Жуковский ранний. Удача и Дезире В качестве первичного экспланта использовали сегменты междоузлий пробирочных растений картофеля

Были выделены сорта способные интенсивно формировать каллусную ткань (Жуковский ранний и Дезире) и менее интенсивно (Невский, Удача) Эти сортовые особенности отмечались при культивировании каллусной ткани в течение пяти пассажей При различиях интенсивности каллусогенеза было также установлено, что

максимальный прирост сырой биомассы ткани у всех изученных сортов наблюдался на III и IV пассажах.

Выявлена зависимость каллусогенеза у картофеля от концентраций 2,4-Д в питательной среде. Установлено, что из всех изучаемых генотипов особое место занимают сорта Жуковский ранний и Дезире, для которых характерен интенсивный рост каллусной ткани, независимо от концентрации 2,4-Д в питательной среде. С увеличением концентрации ауксина указанный показатель возрастал. Для сортов Невский и Удача повышение концентрации 2,4-Д не привело к увеличению интенсивности каллусогенеза. Для этих сортов характерно формирование каллусной ткани рыхлой консистенции, не способной к морфогенезу. Установлено, что активная пролиферация каллусной ткани происходит на среде Мурасига и Скуга, содержащей 2,4-Д в концентрации 2-3 мг/л в сочетании с кинетином 0,2 мг/л независимо от исследуемого генотипа.

Первичные зкспланты по способности к каллусогенезу расположились в следующей последовательности: междоузлия > листовые сегменты > корневые сегменты > диски микроклубней. Эта же закономерность сохранялась и в способности первичных эксплантов к морфогенезу.

В целях поиска путей и методов повышения интенсивности каллусогенеза различных эксплантов картофеля, было изучено влияние веществ ауксинового типа действия (2,4-Д, ИУК, НУК, ИМК) и их концентраций (1-5 мг/л) на этот процесс. Наибольшей пролиферативной способностью обладала каллусная ткань, полученная на среде с НУК. В этом варианте прирост каллусной массы для сортов Жуковский ранний и Дезире составил 200% и более, в то время как в других вариантах этот показатель не превышал 183%. Для сортов Невский и Удача интенсивность каллусогенеза была в 2 раза ниже. Из всех исследуемых генотипов выделились сорта Дезире и Жуковский ранний, для которых характерно формирование быстрорастущей каллусной ткани, способной в дальнейшем к регенерации растений.

Особенности роста суспензионных культур различных генотипов картофеля. Суспензионную культуру получали из хорошо пролиферирующей каллусной ткани рыхлой консистенции всех изучаемых генотипов. В качестве питательной среды использовали среду МС, содержащую 2,4-Д в концентрации 2 мг/л. На первом пассаже определяли фазы ростового цикла (рис.3). Установлено, что у изучаемых сортов, фазы ростового цикла наступают в одинаковый промежуток времени. Отличия между ними отмечены лишь в активности деления клеток. Как и при каллусогенезе рост суспензионных культур сортов Дезире и Жуковский ранний

чначитечьно превышает в линейной фазе сорта Удача и Невский Содержание клеток в 1 мл среды у них было в 2 раза выше, чем у сортов Нечский и Удача

_ 30

0 ^

1 *5 Г 4- i

дни наблюдении

Рпс 3 Характеристика роста о сиеизиоциых kv ibivp раз тачных геногкпов картпфетя

Таким образом экспериментально установленные различия в скорости роста кал ivcHbx и суспензионных культур изучаемых генотипов пшеницы, моркови и картофе 1я, позволяют заключить о возможном неодинаковом поведении к-еток при последующем их культивировании в стрессовых усювиях at vitro Применение биологически активных веществ или физических факторов воздействия в культуре изолированных клеток, тканей и органов растений является альтернативным способом повышения регенерационнои способности дифференцированных и дедишференцированных клеток, используемых в различных биоинженерных экспериментах

Глава 4 Пол>ченне культурального фильтрата патогеных грибов и изучение его действия на ннтактных растениях и в Kv.ib rvpjx

in vitro.

4.1. Влияние гриба Septoria nodorum и его жзометаболитов на семена и зародыши пшеницы

Токсичность гриба 9 nodorum hi шотрованных зародышах Кач правило, селекцию т vitro на устойчивость растении к болезням проводят с использованием КФ гриба Олнако исследователям не всегда удается получить стерильный фильтрат Поэтому в ряде случаев при клеточной селекции используют совместное культивирование клеток растений и патогена на твердых агаризованных питательных средах Нами были предприняты попытки определить возможносхь совместного ку "ьтивирования гриба и изолированных зародышей на одной

питательной среде in vitro. Результаты свидетельствуют, что с увеличением количества кусочков агара с грибом от 3 до 6 шт. в одной чашке Петри, их токсичность возрастает от 63,6 до 80,1%. Независимо от количества S. nodorum в одной чашке, резко снижается рост побегов и корней по сравнению с контролем.

Получение культурального фильтрата гриба S. nodorum. В наших исследованиях гриб S. nodorum выращивали на агаризованной питательной среде Мурасига и Скуга (МС), а также на среде Чапека. Для получения селективного фактора - культуральный фильтрат патогена, гриб S. nodorum культивировали в жидких питательных средах на качалке. При таком способе выращивания, гифы гриба сплетались в "клубки", образуя при этом видимые визуально структуры шарообразной формы разных размеров. Питательная среда при этом изменяла цвет и становилась темно-коричневой. Через 7 дней культивирования гриба 5. nodorum в жидкой питательной среде был получен культуральный фильтрат, который в дальнейшем использовали в работе по определению его фитотоксической активности на семенах и изолированных зародышах пшеницы.

Влияние экзометаболитов гриба S. nodorum на семена и изолированные зародыши.

Семена пшеницы. Установлено, что КФ гриба S. nodorum в различных концентрациях оказывает в той или иной степени токсичное действие на прорастание семян пшеницы. При использовании не разведенного КФ (100%) его токсичность составила всего лишь 51,6%, а при концентрациях 25 и 50% этот показатель значительно уменьшался и составлял соответственно 1,6 и 9,7%. Последнее было обусловлено значительной стимуляцией роста стебля в этих вариантах по сравнению с контролем. Поэтому в последующей серии экспериментов был использован 14-дневный КФ в концентрации 75% (Рис. 4). Из рисунка 4 видно, что семена, испытанных генотипов пшеницы, проявили различную чувствительность к присутствию КФ гриба в среде. Сорт Московская 35 и гибрид 91S~10 оказались устойчивыми к КФ гриба (токсичность 3,93% и 6,54%, соответственно), Fortuna, Энита, Саратовская 29, 81S-15 - средне устойчивыми (токсичность КФ 19,37 -49,18%), а сорт Gaterin и гибрид WW-15370 оказались не устойчивыми к КФ гриба. Для этих сортов токсичность фильтрата составила 71,24% и 95,3%, соответственно.

|'ис 4 Устойчивость различных 1сногппов пшеницы к действию 14-тисвною КФ патогена5 пойогит

Таким образом показано что 7 и 14-дневные КФ гриба 5 пос1игит проявили различную филтоксическую активность на прорастание семян разтичных генотипов пшеницы Причем 14-тневный КФ оказал повышенную токсичность поэтому для проветения клеточной се 'екции целесообразно использовать культуральный (рильграт гриба при 14-дневном его выращивании в жидкой питате 1ьнсй среде Изолированные зародыши Установлено, что с увеличением концентрации КФ в питательной среде возрастает его токсичность Так при 75% концентрации она достигает максимума - 87,5 - 98,0% (рис 5)

—•— 1 ¿нем

И 11 дней

-л— 14 дней

концентрация КФ

Рис 5 Зависимость токсичности КФ от его концентрации и времени выращивания гриба 5 пш/огит в жилкой питательной среде.

Достаточно высокая токсичность (67,3%) наблюдалась у 14-дневного КФ даже при концентрации 25% Наличие в питательной среде 11 и 14-

дневного КФ в концентрации 50% было также токсично для образования проростков из изолированных зародышей, а 7-дневный КФ в той же концентрации был практически нетоксичен и оказывал стимулирующий эффект на формирование более длинной корневой системы (2,9 см по сравнению с 1,9 см в контроле).

4.2. Влияние экзометаболитов гриба Alternaría radicina на прорастание семян и рост суспензионной культуры моркови.

Получение культурального фильтрата гриба Alternaría radicina осуществляли путем культивирования патогена в жидкой питательной среде Мурасига и Скуга, а также Чапека. Учитываемым фактором служила токсичность культурального фильтрата гриба, после фильтрования среды и освобождения ее от гифов патогена, которую определяли в динамике по прорастанию семян моркови сорта Rondo. Установлено, что 30-дневный КФ патогена, полученный на питательной среде Чапека оказывает свое ингибирующее действие на прорастание семян моркови в 7 раз больше по сравнению с КФ, полученным на среде Мурасига и Скуга. Это в дальнейшем было доказано на семенах других генотипов моркови, которые, проращивали на 100% культуральном фильтрате, полученном на среде Чапека. В этих вариантах наблюдалось ингибирование прорастания семян в 80 - 95% случаев.

Выявлено, что при длительном культивировании гриба Alternaría radicina в жидкой питательной среде, агрессивность данного патогена уменьшалась, что не позволяет проводить отбор клеток в более жестких селективных условиях in vitro.

Особенности прорастания семян моркови на кулъгтуаяъном фильтрате гриба Alternaría radicina, полученном разными способами. Изучено влияние: 1) автоклавированного и неавтоклавированного КФ гриба; 2) автоклавированного и неавтоклавированного КФ, полученного при совместном культивировании клеток суспензионной культуры моркови и патогена; 3) долго хранящегося КФ при пониженной температуре (+2° С). Установлены закономерности в токсичности КФ, полученного разными способами, на прорастание семян. При использовании неавтоклавированного культурального фильтрата всхожесть семян уменьшается по сравнению с использованием автоклавированного фильтрата. При применении КФ гриба A. radicina, полученного при совместном культивировании патогена и суспензии клеток его существенное ингибирующее действие проявлялось уже при концентрации 50%. Несмотря на отмеченное ингибирующее действие фитотоксичных метаболитов патогенного гриба на всхожесть семян, выявлен некоторый стимулирующий эффект ростовых процессов в случае использования КФ в низких концентрациях (25%). Для сорта

Rondo и линии 805 в -этом варианте длина проростков была больше по отношению к контролю на 12-25% Для линии 906 этот показатель в данном варианте находился на уровне контроля Экспериментально установлено, что использовать в качестве селектирующего фактора КФ гриба A radicina долго хранящегося при пониженных температурах, возможно, поскольку его токсическое действие не снижается по мере хранения КФ в холодильнике по сравнению со свежеполученным КФ Особенности роста суспензионных кучьтур моркови на к\ гьтхральном фильтрате гриба 1 radicma Для дополнительного доказательства большей токсичности КФ, полученного на разных питательных средах, были проведены эксперименты и с суспензионной ку 1ьтурой В жидкую питательную среду культуральный фильтрат гриба добавляли в концентрациях 10 - ;0% Установлено, что для всех изучаемых генотипов характерна общая тенденция повеления клеток суспензии в стрессовых условиях С увеличением концентрации КФ в питательной среде уменьшается ростовой индекс Однако при концентрации фильтрата 10% (полученного на среде Чу рас и га и Скуга) и 20% (полученного на среде Чапека) Ri заметно повышается Увеличение концентрации КФ гриба в питательной среде ло 40% снижало ростовой индекс в 3 раза при использовании сри"ырата полученного на среде Чапека и Ri находился на уровне контроля при использовании среды Мурасига и Ск>га (Рис 6) Это доказывает, что ку льтурхтьный фильтрат, полученный на среде Чаиска содержит больше токе.шов, которые ингибируют рост и деление члеток

кекгрогь

среда Чапека -oej;a Муса^ига Скуга

Рис 6 Изменение числа клеток в tvcnemim моркови (сорт Rondo) в ¡аиисимости от концентрации КФ i риба A. radicina

4.3. Влияние жзо метаболитов гриба Rhizoctonia sotaní на рост растений картофеля w vitro, каллусные и суспензионные кучыпуры

Попхчение кугътурально^о фильтрата <.риба R solam В работе испытывали кутьтуральный фильтрат, полученный при культивировании патогена в жидкой питательной среде Мурасига и

"0% 40°!, 5С°, Концентрация КФ %

Скуга, а также Чапека в течение 30 дней с последующим определением его токсичности по росту пробирочных растений картофеля (сорт Жуковский ранний). Установлено, что при выращивании патогена на среде Чапека начало активного выделения экзометаболитов в питательную среду приходится на 20-й день с начала культивирования патогена. В этом случае токсичность КФ составила 59,2%. При дальнейшем культивировании гриба наблюдалось значительное повышение токсичности культуральной жидкости, которая достигала максимума на 40-й день выращивания гриба и составила 93,7%. Последующее культивирование патогена в течение 30 дней (с 40-ого по 70-й день) приводило к незначительным изменениям токсичности раствора, что свидетельствовало о прекращении выделения экзометаболитов в питательную среду.

При культивировании гриба Rhizoctonia solani на питательной среде MC, начало активного выделения токсинов наблюдалось лишь на 40-й день и токсичность фильтрата в этом случае была в 5 раз меньше по сравнению со средой Чапека и составила 27,1%. Максимальное ингибирующее действие КФ получено на 60-й день культивирования и составило 49,5%. Дальнейшее культивирование гриба на среде MC в течение последующих 10-ти дней (с 60-ого по 70-й) не приводило к увеличению токсичности КФ патогена.

Влияние культт'ралъного фильтрата гриба R. solani на рост пробирочных растений. Установлено, что повышенные концентрации КФ гриба в питательной среде приводят к ингибированию ростовых процессов. Так, при концентрации КФ 90% наблюдалось уменьшение длины и массы побегов. В этом варианте формировались растения с укороченными междоузлиями, о чем свидетельствовало наличие одинакового количества листьев на побегах, культивируемых в различных стрессовых условиях. Наряду с ингибирующим действием фитотоксичных метаболитов патогенного гриба, отмечен некоторый стимулирующий эффект ростовых процессов в случае использования КФ в низких концентрациях ( 25% и 50%). В этих вариантах длина побегов была выше по сравнению с контролем в среднем на 8-12%. Влияние купътуралъного фильтрата гриба R. solani на рост каллусной ткани. При работе с каллусной культурой, основным критерием оценки влияния селективного фактора является рост каллусной ткани в стрессовых условиях, который определяется по приросту ткани в начале и конце пассажа (табл.1).

Из таблицы 1 следует, что с увеличением концентрации КФ в питательной среде снижается рост каллусной ткани. Эта закономерность характерна для всех изучаемых генотипов. Интенсивность роста каллусных клеток в стрессовых условиях имеет генотипическую

зависимость Для сорта Невский и Удача характерно значительное инпибирование ростовых процессов стрессовым фактором Для сортов Жуковский ранний и Дезире отмечалась активная пролиферация каллусной ткани, что привело к увеличению прироста клеток на пита'ге льных средах, содержащих КФ пато1ена в концентрации 10% и 20% в среднем на 17 - 40% Для вссч изучаемых генотипов как и в случае с пробирочными растениями, наблюдался стимулирующий эффект низких концентрации КФ

Таблица 1

Прирост каллуснои ткани картофеля, kv.ii. гшшр\ечой на се1ективнои ерем с КФ патогена ( в % к начальной массе каллуса, I пассаж)

Сорт Концентрация КФ %

контроль 10 20 30 40 | 50

Невский 63 5+4 1 80 8±4 3 46 4±2 9 42 2±3 7 40 0±2 5 39 4+3 0

Ауковский равнии 135 5±7 0 149 7+8 5 1^2 ?+Ч8 1 146 5+8 0 140 7±7 9 134 8+7 2

V 7* 2+* 8 46 ^ о «7±}0 | ^3+3 1 Ч <¡=2 2 32 5+2 8

Де-шре И"1 4+6 1 | 160 <4-8 • 17~ 8±9 4 1 1114+6 2 116 3+6 0 ! 71 4+4 3

Влияние куьтуральни^о фильтрата гриба К чо1ат на рост суспензионной к\ тьтуры Селективный фактор добавляли в питательную среду в концентрациях 10 - ^0% Учитывали ростовой индекс, жизнеспособность суспензионной ку ¡ьгуры и степень ее агрегированности

Исс~едования выявили близкие реакции в поведении клеток суспензионных культур, культивируемых в течение I пассажа на питательных средах, содержащих ку илуральныи фильтрат гриба в различных концентрациях Усыновлено что при исполыовании КФ патогена в низких концентрациях (10° о 20%) наблюдался стимулирующий эффект ростовых процессов Для суспензионной культуры ростовой индекс в этих вариантах был ниже по сравнению с контролем, но выше чем в остальных вариантах Повышение концентрации КФ гриба ( 10° о - 50° о) приводило к снижению ростовых процессов Особенно это проявлялось на суспензионных культурах сортов Невский и Удача В вариантах где концентрация КФ патогена составляла 40% и 50%, прирост суспензионной культуры не был отмечен из-за 100%-ной гибели клеток (сорт Удача) (Рис 7)

5s 100

концентрация КФ %

< Дезире ~а—Жуковский ранний —л—Невскии - - Удача

Рис 7 Жизнеспособность суспензионной кулыуры различных 1енотипов картофе in в зависимости от концентрации КФ патогена R sotaní

Наибольшей жизнеспособностью отличались клетки суспензионных культур сортов /Куковскии ранний и особенно Дезире Для этих генотипов независимо от условий кмьтивирования (присутствие в питательной среде стресс-фактора) ростовой индекс уменьшался незначительно Установлено что степень агрег ированности суспензионной культуры увеличивалась с увеличением концентрации КФ в питательной среле и не зависела ог исседуемого сорта

Итак, проведенные исследования свидететьствуют, что фитотоксичность экзометаболитов возбудителей болезней S noJorum Л r^d^inu R sol^m в Условиях in vitro в значительной мере зависит от сосыва и соотношения инградиентов питательной среды, способа и продолжительности культивирования патогена м vitro а также ею концентрации Выращивание изолятов гриба в жидкой питательной среде Чапека повышает фитотоксичность КФ грибов в 5-7 раз по сравнению с КФ полученного на среде Мурасига и Скуга Низкие концентрации КФ оказывают стимулирующее влияние на рост интактных растений и клеток каллусных и суспензионных культур (пшеница морковь, картофе ш), высокие - ингибирующее действие Выбор концентрации КФ патогенов, при селекции растений in vitro должен обеспечивать 50% его токсичность и зависит от видовых особенностей исследуемых объектов

Глава 5. Клеточная и тканевая селекции пшеницы, моркови и картофеля с использованием селективных сред на устойчивость к грибным патогенам.

5.1. Тканевая селекция пшеницы на устойчивость к патогену S. nodorum.

Исследования, проведенные на каллусной ткани, полученной из зрелых и незрелых зародышей, выявили общие особенности поведения каллусных клеток в стрессовых условиях, независимо от применяемой схемы селекции. На первом этапе селекции (I - III пассажи) формировался в 85%-ах случаев каллус средней плотности, ярко-желтого цвета, в котором дифференцировались меристематические клетки. К концу IV пассажа в 50%-ах случаев отмечалось образование каллусной ткани бурого цвета без признаков морфогенеза. Последующее ее культивирование на среде без селектирующего фактора (второй этап селекции) повлияло на восстановление пролиферирующей активности каллусных клеток, которые были способны к морфогенезу. Из меристематических очагов в дальнейшем формировались нормальные растения. На третьем этапе селекции (повторное культивирование каллусных клеток на среде с КФ патогена) наблюдалась гибель каллусной ткани в 40% случаев и формирование рыхлой оводненной ткани, состоящей на 70% из сильно вакуолизированных клеток. На этом этапе селекции проведена оценка каллусной ткани по приросту. Установлено, что присутствие в питательной среде КФ гриба в различных концентрациях заметно ингибирует пролиферацию каллусной ткани у всех исследуемых генотипов пшеницы. С повышением концентрации КФ уменьшается прирост каллусной ткани на 26-60%. Исключение составили генотипы 91S, Московская 35, Энита, Fortuna, для которых независимо от концентрации КФ, каллусная ткань имела стабильный прирост. Вероятно, данные генотипы обладают большей устойчивостью к грибу Septoria nodorum по сравнению с остальными исследуемыми сортообразцами. Причем для данных генотипов отмечено формирование в каллусной ткани меристематических зон, из которых в дальнейшем получены растения-регенеранты.

Культивирование каллусных клеток в селективных условиях в течение восьми пассажей позволило отобрать каллусные линии, устойчивые к КФ гриба S. nodorum, которые были перенесены на питательные среды для регенерации. В качестве стимулятора морфогенеза в питательную среду добавляли зеатин в концентрации 1 мг/л. Число растений-регенерантов, полученных из каллусной ткани после ее культивирования на селективных средах, представлено в таблице 2.

Для каллусов, полученных из зрелых зародышей, также было характерно формирование растений-регенерантов после проведения клеточной селекции. Однако морфогенетическая активность каллусной

ткани была в 6-7 раз ниже, по сравнению с каллусами из незрелых зародышей Единичные растения-регенерашы получены лишь для сортов Энита, Московская 35 и 9/5

1аблица 2

Растсния-регенерапты, цолученные и$ клеток, прошедшие отбор на селективных средах с КФ патогена 5 поЛогит (незрелые зародыши)

Генотип схема селекции всего растенин, шт

Энита 4(3% КФ) 1 (0 КФ) 4(^% КФ) 3

4(<% КФ> 1 (Ü КФ) КФ) я

Московская 35 4(10°а КФ) 1(0 КФ) 4(10% КФ) 4

4(1*%КФ) 1(0 КФ)4( 15% КФ) 4

F¡. "¡una 4(<% КФ) 1(0 КФ) 4(5% КФ) л

1(10% кф) цо кф) н:о°оКФ) ко КФ) 1(10% КФ) 1(0КФ)(10% КФ) 2

4(14»о КФ) 1(0 ЧФ)4(И%кФ> <

Саратовская 29 ЦУоКФ) ЦОКФ) К^'оКФ) 1(0 КФ) 1(3° о КФ) 1(0 КФ) 1(^% КФ) 1(0 КФ) 1(5% КФ) 1(0 КФ) 1

Ualtrm 1(5% КФ) 1(10%КФ) 1(15% КФ) К:О%КФ) 1(0 КФ) 1<<;%КФ) 1(ю% КФ) 1(И°«кФ> t(2o%toi -

Ч S 4С5%КФ1 1(0 КФ)4(<;%КФ> 3

•цифры 1,4- обозначают количество проведенных пассажей

Зерновки первого поколения были проверены в лабораторных условиях по прорастанию на устойчивость к. патогену Установлено, что проростки, полученные из зерновок раС1ений-регенерантов, обладали устойчивостью к КФ гриба Septana nodorum на 10-15% больше по сравнению с исходным генотипом Для отлельныч сортов (Московская 35) устойчивость повышалась до 25° о

5.2. Клеточная селекция моркови на устойчивость к патогену Alternaría radicina. Влияние экзометабочитов puóa Л radiaría на рост суспензионной кх гытры Изучено поведение клеток суспензий моркови при длительном их культивировании на селективных средах Оценивали ростовой индекс, жизнеспособность Л степень агрегированное™ суспензионной культуры на I IV и VIII пассажах Установлено, что с увеличением содержания КФ в среде снижается ростовой индекс и жизнеспособность клеток во всех вариантах в 2-3 раза по сравнению с контролем При изучении этого показателя в динамике выявлено, что на VIII пассаже селекции, Ri увеличивался по сравнению с предыдущими пассажами, но все же оставался ниже контроля Вероятно, это связано с адаптацией клеток к стрессовым условиям и появлением большого чиста жизнеспособных клеточных агрегатов Определена

генотипическая особенность зависимости Ri от содержания КФ гриба в среде. Для линии 906 Ri во всех вариантах был снижен в 3 раза, для линии 805 и сорта Rondo - в 2 раза. Из этого следует, что клеточную селекцию линии 906 целесообразно проводить при низких концентрациях КФ (20 - 30%), так как более высокие концентрации приводят к значительному ингибированию ростовых процессов. Экспериментально установленные условия позволяют культивировать клетки на селективных средах в течение длительного времени.

Выявлено, что на ранних этапах культивирования (I пассаж), суспензионная культура состояла из одиночных клеток (60-80%) и мелких агрегатов (20-30%). Фракция крупных агрегатов на этом этапе отмечена лишь для линии 805 и составляла 20-25%. Дальнейшее культивирование клеточных суспензий в стрессовых условиях снижало содержание одиночных клеток и мелких агрегатов и увеличивало долю крупных агрегатов, процентное число которых составляло 50% и более. Изменение степени агрегированности клеточных суспензий было характерно для всех изученных нами генотипов моркови.

После селекции суспензионную культуру платировали в агар с целью получения растений-регенерантов. Морфогенез индуцировали на питательных средах, содержащих различные вещества с цитокининовой активностью (БАП, зеатин, 2гр, эпин). Установлено, что эпин и все изучаемые цитокинины способны стимулировать образование соматических эмбриоидов и этот процесс зависел от применяемого гормона - стимулятора. При добавлении в питательную среду БАП начало морфогенеза отмечалось через 8-9 недель после инокуляции суспензии в агар, при добавлении 2ip - через 3 недели, а при добавлении зеатина или эпина - через 1 неделю. Это характерно только для суспензии, которая прошла цикл селекции, так как в контрольном варианте морфогенез начинался уже на первой неделе культивирования клеточных колоний после матирования, независимо от присутствия в питательной среде того или иного исследуемого вещества. Данные о числе полученных растений-регенерантов, после клеточной селекции, представлены в таблице 3.

Растения-регенеранты контрольного варианта и полученные из клеток культивируемых на селективных средах, были проверены в лабораторных условиях на устойчивость к патогену Alternaría radicina. Пробирочные растения культивировали на питательной среде, содержащей КФ гриба в концентрации 95%. Установлено, что выживаемость растений-регенерантов в этих условиях, полученных после селекции in vitro выше на 30% для линии 906 и на 50% для сорта Rondo.

Таблица 3

Число растении регенерантов моркови, полученных после культивирования клеток на питательных среда* с КФ патогена Л гаЛста

Генотип Схема сетскшш Всего растений, шт

430%КФ) 1(0 КФ)4(^0%КФ) so

906 3(40° о КФ) 1(0 КФ") 4 (40% КФ) 14

1(^0°у КО» 1(.) КФ) 4 (Wo КФ) 10

"00% КФ) ДО КФ) 4 (40% КФ) 25

Rondo 440% КФ) 1 (0 КФ) 4 (40° о КФ) 10

Я<0% КФ) 1(0 КФ> (<¡0% КФ) 5

* цифры 3, 1« 4 - обозначают количество проведенных пассажей

S.J Тканевая и клеточная селекция картофеля на устойчивость к патогену Rhizoctonia solam.

Тканевая селекция к^гртофе^я на устойчивость к R yolam Селекцию т vitro проводили на хорошо яролиферирующей калтусной ткани, полученной из стеблевых эксп""антов картофеля способной к морфогенезу В качестве стресс-фактора использовали 30-дневный культуральный фильтра^ гриба Rhizoctonia solam в концентрациях 10-500/о Установлены общие особенности поведения калтусных клеток картофеля ку хьтивируемых в стрессовых усювиях в течение шести пассажей На ранних этапах селекции (I и II пассажи) показано что низкие концентрации КФ патогена (10 200/а) значительно стимулируют процесс каллусогенеза, в то время как высокие концентрации (40-50%) -оказывают ингибирующии хЬфекг Опреде ¡ены условия, необходимые для проведения клеточной се 1екиии - наличие в питательной среде КФ патогена в концентрации 30-40° о В этих условиях наибольшей протшферативной способностью обладала каллусная ткань сортов Дезире и Жуковский ранний, для которых характерно сохранение высокого прироста тканл (30-60%) даже в конце VI пассажа Для сорта Невский этот показатель постепенно снижался и к концу VI пассажа составил 10%, а для сорта Удача на j гом пассаже отмечалась полная гибель каллусных клеток Вероятно клетки калтусной ткани сорта Удача не способны адаптироваться к действию экзометаболитов гриба Rhizoctonia solam

Клеточная сьлекция картофеш на устойчивость к R solam Культивирование сусгензионной культуры в стрессовых условиях проводили в течение восьми пассажей Установлено, что высокие концентрации КФ (40 - 50%) приводили к значительному снижению жизнеспособности суспензионных культур, за счет быстрой гибели клеток При кутьтивировании суспензионной культуры четырех генотипов картофеля в стрессовых условиях выявлены одинаковые реакции клеток на действие ку ьтурального фильтрата гриба Отмечено,

зз

что с увеличением продолжительности выращивания клеток на питательных средах в присутствии селективного фактора, заметно снижалась жизнеспособность суспензионных культур. При высоких концентрациях стресс-фактора этот показатель составил 0 - 8,3%. Выявлены генотипические особенности поведения клеток суспензионных культур, культивируемых на питательных средах, содержащих селективный фактор. Из всех изучаемых сортов лишь для сорта Дезире была отмечена высокая адаптационная способность клеток суспензионных культур к стрессовым условиям. Это проявлялось в увеличении жизнеспособности клеток и Ri. Сорт Удача оказался неустойчивым к действию культурального фильтрата гриба Rhizoctonia solani. Жизнеспособность данной суспензионной культуры на среде, содержащей КФ в концентрации 10% составила всего 3,8-28,6%. Для суспензионной культуры сорта Жуковский ранний только на II - IV пассажах наблюдался стимулирующий эффект действия вторичных экзометаболитов гриба Rhizoctonia solani (10-20%), в то время как при концентрации КФ 30% этот показатель снижался до 5-17%. Сорт Невский занимал промежуточное положение по устойчивости к изучаемому фактору, так как жизнеспособность клеток суспензионных культур постепенно снижалась и находилась в обратной корреляции от концентрации КФ в среде и числа субкультивирований.

Таким образом, селекцию in vitro растений возможно проводить на каллусных и суспензионных культурах, выбор которых зависит от видовых особенностей выбранных объектов и способности дифференцированных клеток к реализации морфогенетического потенциала. Для пшеницы оптимальный эффект в селекции in vitro достигается на каллусной ткани при ее культивировании на среде, содержащей 20% КФ SI nodorum, для моркови - на суспензионной культуре на среде с 30-50% КФ A. radicina, для картофеля - на каллусной и суспензионной культурах, на средах с 30-40% КФ R. solani.

Глава 6. Участие фитогормонов в клеточной селекции растений к экзометаболнтам патогеных грибов.

Известно, что процесс адаптации клеток и интактных растений к факторам абиотической и биотической природы находится под контролем гормональной системы. Однако работы, свидетельствующие о существенной роли гормонального баланса в адаптации каллусных и суспензионных культур, длительно культивируемых на питательных средах в присутствии экзометаболитов патогенов, малочислены, а полученные результаты противоречивы. Поэтому представляет интерес выяснения действительного участия фитогормонов в этом процессе.

Сегективные хс-овия и гормональный батане клеток суспензионной к\1ът\ры и растений-регенерантов моркови Изучение гормонального баланса суспензионных культур, культивируемых на питательных средах, содержащих КФ в концентрации 20% (со стимулирующим эффектом) и 40% (эффект ингибирования), позволило выявить существенные различия по содержанию фитогормонов в клетках (табл 4) При культивировании клеток суспензии на средах, содержащих 20% КФ, наблюдается увеличение содержания ИУК и цитокининов, в то время как на средах с 40%-ным КФ количество этих гормонов были значительно ниже по сравнению с контролем Синтез же эндогенной ГК с увеличением концентрации КФ у обоих генотипов увеличивался Это влияло на процесс растяжения клеток и проявлялось в формировании клеток крупных размеров и вытянутых форм Абсцизовой кислоты в клеточных ку штурах ни в одном из исследуемых вариантов обнаружено не было

Таблица 4

Содержание гормонов (мкг/1 с\\ масса) в с\спензионной культуре моркови, культивируемой на среле с содержанием селективного фактора, I пассаж.

Генотип Кони КФ, Ф И Т О Г О Р м о н ы

"'о ИУК ЦК \БК ГК

Контро ь 0 0846 :ы б^ - 0 3945

Личия 40б :о 0 1083 287 41 0 4733

40 0 029 бЧ | 1 79(><

Сорт Контре "Ь 0 0j47 Р 7< - 2 6311

Rondo 20 0 0328 346 98 2 4412

40 ООРО 7 48 - 3 1268

В дальнейшем было из\чено поведение клеток суспензии моркови в присутствии 40% кулыурального фильтрата в течение селекции in vitro (I, IV, VIII пассажи) и их гормональный баланс (табл 5) Результаты свидетельствуют, что процесс адаптации клеток к действшо стрессового фактора происходит ¡а счет увеличения синтеза ауксинов и цитокининов в процессе длительного их культивирования т vitro

Установлено, что при культивировании суспензионной культуры моркови сорта Rondo в стрессовых условиях в процессе адаптации проявляется роль такого гормона как АБК, что говорит о некоторой разнице в механизмах адаптации у разных генотипов моркови В контрольном варианте, не содержащем слресс фактора, при длительном культивировании сусгензионной культуры вне зависимости от генотипа наблюдалось снижение содержания всех гормонов-стлмуляторов По-видимому, это связано со старением культуры, а разница в

з*

количественном уменьшении этих гормонов у линии 906 и сорта Rondo можно объяснить сортовыми особенностями.

Таблица 5

Содержание гормонов (мкг/г сух. масса) в суспеизиоинон культуре моркови при культивировании ее в стандартных и стрессовых условиях на разных

пассажах.

JNj Вариант ФИТОГОРМОНЫ

пассажа ИУК ЦК АБК гк

линия 906

I Контроль 0,0846 261,65 - 0,3995

КФ 40% 0,029 6,51 - 1,7905

Г/ Контроль 0,0138 128,33 - 0,2701

КФ 40% 0,102 90,69 0,8397

VIII Контроль 0,0083 8,91 - 0,0952

КФ 40% 0,126 92,05 - 0,8759

сорт Rondo

I Контроль 0.0397 13,75 - 2.6311

КФ 40% 0,013 7,48 - 3,1268

IV Контроль 0,0154 6,84 - 0,5390

КФ 40% 0,018 4.26 1,029 0,3251

VIII Контроль 0,0106 4,92 - 0,7781

КФ 40% 0,0209 16,24 0,72 2,1055

В конце VIII пассажа из клеток, культивируемых в контрольном и опытном (после селекции ш vitró) вариантах, были получены растения-регенеранты, которые в дальнейшем переносили на питательную среду, содержащую 95% КФ патогена Alternaría radicina.

Определение фитогормонов в таких растениях-регенерантах показало, что полученные в результате клеточной селекции растения содержат значительно больше ауксинов, гиббереллинов и особенно -цитокининов по сравнению с контрольным вариантом (табл. 6).

Известно, что существенную роль в адаптации к стрессовым воздействиям у растений играют такие гормоны как АБК и ЦК, а в процессах репарации после стресса - и ИУК. Доказана экспрессия генов под воздействием ЦК и АБК, которая приводит к синтезу стрессовых белков, изменению метаболизма и как результат - адаптации организма к стрессам (Дьяков, Озерецковская, Джавахия, Багирова, 2001, Тарчевский, 2002). Полагаем, что в результате стресса, каким является культуральный фильтрат патогена, начинаются модификационные изменения, которые проявляются в виде реакции устойчивости к неблагоприятным факторам, одной из которых и является изменение гормонального баланса культуры клеток моркови.

Таблица 6

Содержание гормонов ( мкг/г сух массы) в растениях-регенерантах

Генотип Вариант ФИТОГОРМОНЫ

ИУК ЦК АБК ГК

Линия Контроль 0 1936 572 77 - 39 965

906 В рез\льтате селекции 0Г06 2274 58 - 1^0

Сорт Контроль 14 960 28 09 | 186 764

Rondo В результате селекции 23 264 6027 39 439 258

Сегективные условия и юрмональный баланс к1етрк суспензионной ку 1ътуры картофеля Изучен гормональный баланс суспензионных культур картофеля двух сортов - Удача и Невский, культивируемых на питательных средах с содержанием КФ патогена 10, 30 и 40%, а также на средах не содержащих селективный фактор (контроль) Исследования выявили существенные различия по содержанию эндогенных гормонов в клетках суспензии (Табл 8) В вариантах, где культуральная жидкость патогена оказывала стимулирующий эффект (10% для сорта Удача и 30% для сорта Невский), содержание ИУК и цитокининов было выше, а уровень АБК быт на уровне или ниже контроля С увеличением концентрации селективного фактора в среде выше оптимальной, для каждого из сортов, снижался уровень гормонов-стимуляторов - ИУК ЦК ГК и значительно увеличивался уровень гормона-ингибитора - АБК, что говорит о сильном стрессовом воздействии КФ патогена данных концентраций и ускоренном процессе старения клеток

Усиление защитных реакций растений может происходить, например, за счет накопления и отложения лигнина в местах внедрения патогена Цлтокинины способны усиливать лигнификапию клеточных стенок, что делает растительную ткань менее доступной для экзометаболитов патогенов Можно предположить что повышенное содержание цитокининов в клетках, возможно, ведет к некоторому механическому укреплению клеточных стенок, что девает их более устойчивыми к проникновению патогена или его токсинов Повышение устойчивости растений к фитопатогенам также связано и со стабилизацией баланса ИУК/АБК и увеличением содержания ЦК (Ярулина, Максимов, 1999) Такое соотношение фитогормонов приводит, вероятно, к активации обмена веществ в растении, в результате чего в инфицированных тканях происходит интенсивное накопление лигнина, приводящее к локализации патогена и подавлению его развития

Таблица 8

Содержание фитогормонов (мкг/г сухой массы) в суспензионной культуре картофеля, культивируемой в стандартных и стрессовых условиях, I пассаж.

Сорт Конц. КФ патогена, % ФИТОГОРМОНЫ

ИУК ЦК ГК АБК

УДАЧА Контроль 1,05 5.47 1,98 0,36

10 0,81 12,24 0.83 0,35

30 0,69 6,25 1,45 1,68

40 0,20 2,52 2,93 3,70

НЕВСКИЙ Контроль 0,23 2,41 2,10 1,78

10 0,33 2,12 1,88 0,66

30 0,50 11,15 1,34 1,39

40 0,22 2,84 2,10 2,47

Данные свидетельствуют о том, что соотношение ИУК/АБК в клетках суспензионных культур таких сортов как Дезире и Жуковский ранний, культивируемых в стрессовых условиях (табл. 9) на протяжении восьми пассажей, величина постоянная. Для сорта Дезире она составляет 2,6-2,69, а для сорта Жуковский ранний - 0,38-0,43. Для остальных исследуемых сортов это соотношение не являлось величиной постоянной. Для сорта Удача оно изменялось от 0,22 до 0,10, а для сорта Невский - от 0,35 до 0,15. Низкая устойчивость клеточных суспензий этих сортов к стрессовому фактору была обнаружена нами в более ранних исследованиях.

Следует отметить, что в контрольном варианте соотношение ИУК/АБК было стабильным у сортов Дезире и Жуковский ранний при культивировании суспензионных культур на протяжении восьми пассажей, а для сортов Удача и Невский оно уменьшалось к VII пассажу за счет резкого увеличения уровня АБК в культуре (сорт Удача) и снижающегося уровня ИУК (сорт Невский). Более того, значительное увеличение уровня АБК в суспензионной культуре сорта Удача привело к быстрому их старению и гибели культуры.

Установлены некоторые закономерности по содержанию эндогенного цитокинина в клетках суспензионных культур, культивируемых в стандартных и стрессовых условиях. Так, для клеток, находящихся в стандартных условиях характерно уменьшение, а для клеток, находящихся в стрессовых условиях - увеличение содержания цитокининов, особенно значительное - в культурах клеток сорта Дезире и Жуковский ранний.

Таблица 9

Содержание фитогормонов ( мкг/r cvxoii массы) в суспензионной культуре различных I енотипов картофе ш

Сорт Л» пас- Ф II Т О Г О Р \1 О II ы

сажа ИУК ЦК гк АБК

стандартные условия культивирования

I I 05 5 48 I 98 0 36

УД \ЧА Г\ 0 <6 8 73 1 00 0 54

VIII 0 14 0 40 1 05 0 3«;

I 0 48 1 18 0 33 0 34

ДЕЗИРЕ IV 0 42 1 13 1 93 031

VIII 0 40 0 94 2 Ь4 031

I 0 22 241 2 10 1 78

1№ВСКИИ IV 0 72 6 05 13 64 I 69

VIII 0 58 1 36 14 "Ч 1 02

жуконс: I 061 5 23 1 77 1 59

КИЙ IV 0 43 4 40 I 28 1 70

Н\ННИЙ VIII 0 37 431 1 04 1 84

стрессовые vc ловив стль гивировапия

I 0 76 6 2* I 4< 1 67

IV 0 21 1 Ч 2 93 2 26

VIII - - -

I 3 88 1 17 0 86 1 46

дьзирн IV 3 4j 1 53 041 1 29

VIII 4 7 Ь 1 72 0 35 1 76

I 0 s0 11 15 1 j4 1 39

НЕВСКИЙ IV 0 2S ь 6' 1 6< 1 87

VIII 0 4 94 1 41 2 59

AV КОВС I 0 6^ 10 64 0 « 1 48

, КИИ IV 0 68 17 43 0 13 1 61

| РАННИИ VIII ОТ) 18 II 0 183 1 85

Примечание * kv -iLivpa погибла

Таким образом, адаптация дедифференцированных клеток и

повышение устойчивости растений-регенерантов к действию

экзометаболитов патогенных i рибов, находится под контролем

эндогенного содержания гормонов-стимуляторов, особенно

цитокининов и ауксинов, и их соотношения, что необходимо учитывать при проведении работ по селекции иг vitro

Глава. 7, Участие фенольных соединений в адаптации клеточных культур т \itro к действию экзометаболитов пато! енных грибов.

Влияние экзометаболитов гриба Alternaría radicina на образование фенольных соединений в суспензионных культурах и растениях-регенерантах различных генотипов моркови. Объектом исследования служили 20-дневные проростки, суспензионные культуры и растения-регенеранты 2-х генотипов моркови сорта Rondo и линии 906. Установлено, что у изучаемых генотипов ответная реакция интактных растений (20-дневные проростки) на действие стресс-фактора (100% КФ патогена A. radicina) различна. Установлено, что в контрольном варианте наибольшее содержание фенольных соединений отмечено у 20-ти дневных проростков сорта Rondo, в то время как для линии 906 в этом варианте их количество было на 40% ниже. Проростки, культивируемые на среде, содержащей 100% КФ патогена, характеризовались более высоким уровнем фенольных соединений по сравнению с условиями культивирования контрольного варианта. Причем для линии 906 их количество повышалось в стрессовых условиях на 50%, в то время как для сорта Rondo - лишь на 12%. Можно предположить, что для линии 906 действие КФ патогена приводит к «запуску» повышенной программируемой защитной реакции, проявляющейся в увеличении синтеза фенольных соединений. Для сорта Rondo, вероятно, уровень фенольных соединений в клетках настолько велик, что действие КФ патогена не приводит к значительным его изменениям. Это свидетельствует о том, что растения данного сорта потенциально способны выдерживать действие высоких концентраций стресс-фактора.

Суммарное содержание фенольных соединений определяли в клеточных суспензиях в динамике на I, IV и VIII пассажах селекции и в контрольном варианте. Как следует из данных, представленных на рисунке 8, на I пассаже содержание фенольных соединений в контрольном варианте сорта Rondo выше на 25% по сравнению с линией 906. Последующее культивирование клеточных суспензий в контрольном варианте не приводило к существенным изменениям количественного содержания фенольных соединений. Это свидетельствует о том, что при длительном культивировании клеток в стандартных условиях не наблюдается изменений в фенольном метаболизме. Присутствие КФ патогена в питательной среде в различных концентрациях приводило на I пассаже к уменьшению синтеза фенольных соединений в среднем на 10-12% по сравнению с контролем. Причем для линии 906 воздействие селективного фактора (50% КФ) существенно повлияло на снижение их количественного содержания (на 42%). В процессе культивирования суспензионных культур на селективных средах, способность клеток к синтезу фенольных соединений изменяется. В одних вариантах она постоянно

растет (50% КФ для сорта Rondo, 30% КФ для линии 906) в других -относительно стабильна (30% КФ д ш сорта Rondo, 50% КФ для линии 906) Результаты свидетельствуют о разной чувствительности клеток суспензий к действию стрессового фактора, что, возможно, проявляется и в различных механизмах устойчивости клеток к экзометаболитам патогена

I (Ч V

N9 пассажа

I IV \ I I

№ пассажа

Рис 8 Суммарное содержание растворимы* фенольиых сосишенпй в с\ спстионпон культуре моркови, культивируемой в стандартных и стрессовых условиях (присутствие КФ патогена Л газета) А - сорт Ноп<1о, В -линия 906

У растений-регенерантов, полученных после культивирования клеток на селективных средах, уровень фенольных соединений в 1,5 - 2 раза выше по сравнению с растениями контрольного варианта. Причем для растений сорта Rondo их количественное содержание превышает таковой растений линии 906 (Рис. 9). Эти результаты полностью согласуются с данными, полученными нами ранее с 20-дневными проростками и клеточными суспензиями и доказывают зависимость фенольного метаболизма от генотипических особенностей исследуемых образцов.

Одномерная хроматография показала, что у растений-регенерантов, полученных после селекции in vitro, количество фенольных соединений возрастает, вероятно, за счет изменения их качественного состава.

контроль в

результате селекции

вариант

Рис. 9 Суммарное содержание растворимых фенольных соединений в растениях-регенерантах, полученных в контрольном варианте и после культивирования клеток на селективных средах.

Влияние экзометаболитов гриба Rhizoctonia solani на образование фенольных соединений в суспензионных культурах различных генотипов картофеля. Объектом исследования служили суспензионные культуры картофеля, полученные из сегментов междоузлий пробирочных растений четырех сортов - Жуковский ранний, Удача, Невский, Дезире. Клетки культивировали на стандартных питательных средах и средах, содержащих селективный фактор. Исследована зависимость накопления растворимых фенольных соединений в клетках суспензионных культур от условий культивирования и генотипа.

Показано, что в контрольном варианте наибольшее содержание фенольных соединений характерно для суспензии сорта Удача (Рис. 10), для сорта Дезире их количество было на 20% ниже. Наименьшее

накопление этих вешеств отмечено у суспензий сортов Невский и Жуковский ранний, которые по этому показателю близки друг к другу Следовательно различные генотипы картофеля отличались по способности к синтезу фенольных соединений Что касается суспензионных культур культивируемых на селективных средах, то уровень фенольных соединений у них отличался от такового контрольных вариантов У суспензий сортов Невский и Удача содержание фенольных соединений в процессе селекции значительно снижалось (вдовое по сравнению с контролем), что в большинстве случаев коррелировало с потерей жизнеспособности клеток Очевидно ослабление способности кульгур к образованию фенольных соединений является причиной гибели клеток Известно, что фенольные соединения участвуют в иммунитете растений (Запрометов, 1993) Исходя из этого можно предположить, что их отсутствие или низкое содержание не позволяют клеткам суспензионных культур справляться с негативным воздействием на них экзометаболитов гриба Пос хедние в ряде случаев могут ¡any екать программируемую шбель клеток (апоптоз), обусловленную в частности действием фенолкарбоновых кислот (Тарчевский, 2002)

Навекии Удача Дезире Жуковский

ранний

П основная соеда ■ основная среда * КФ

Рис 10 Изменения в содержании фенольных соединений у суспензионных к\льтур различных генотипов картофеля при воздействии КФ (30%)

Для других генотипов картофеля (Дезире и Жуковский ранний) экзометабо шты гриба способствовали большему накоплению фенольных соединений в клетках (на 300,о и 60%) по сравнению с контролем Это сопровождалось не только сохранением жизнеспособности суспензионных культур, но и даже ее повышением

Для генотипа Дезире отмечено накопление и отложение лигнина в клетках суспензионных культур. Это свидетельствует о том, что для них под влиянием экзометаболитов гриба R. solani интенсивность синтеза фенольных соединений значительно возрастала.

Таким образом, в процессах адаптации клеток in vitro к действию селективного фактора участвуют фенольные соединения, синтез которых усиливается в устойчивых клетках и растениях-регенерантах и зависит от генотипических особенностей исследуемых объектов и условий их культивирования.

Глава 8. RAPD анализ ДНК каллусных культур и растеннй-регенерантов пшеницы, полученных методами клеточной селекции.

ДНК полиморфизм каллусной ткани пшеницы, культивируемой в стандартных и стрессовых условиях. Для RAPD анализа тотальная ДНК была выделена из каллусной ткани, культивируемой в стандартных и стрессовых условиях. Для исследований была отобрана каллусная ткань, находящаяся на разных этапах селекции: начало (I пассаж), середина (IV пассаж) и конец (VIII пассаж). Установлено, что каждый из исследуемых образцов контрольного и опытного вариантов (I пассаж) имели определенный спектр амплифицируемых A-lPD-продуктов, не отличающихся друг от друга количеством фрагментов, их размером и степенью выраженности (мажорности). Однако в процессе культивирования каллусной ткани (IV пассаж) в стандартных и стрессовых условиях in vitro были отмечены общие фрагменты, а также блоки, состоящие из нескольких фрагментов. Кроме того было выявлено изменение RAPD спектра ДНК. Изменения обнаружены лишь для каллусной ткани, культивируемой на селективных средах. Дальнейшее культивирование каллусной ткани (VIII пассаж) в условиях in vitro привело к более выраженному полиморфизму ДНК ткани опытного варианта (присутствие в питательной среде КФ патогена). RAPD паттерн каллусной ткани, культивируемой на питательных средах содержащих селективный фактор, характеризовался как отсутствием ряда фрагментов, например, 1800 н.п., 850 н.п. (оба амплифицированы с праймером OPD14), 900 и 930 н.п., а также ряда минорных фрагментов (с праймером OPD6), которые присутствовали в RAPD спектрах ДНК, экстрагированной из каллусной ткани, полученной в стандартных условиях культивирования, так и присутствием новых фрагментов 330 п.н., 440 п.н. (праймер ОРА15), 800 п.н. и 250 п.н. (праймер OPD6), 1200 п.н. (праймер OPD14). Результаты исследований, вероятно, не могут связывать напрямую наличие или отсутствие полосы спектра в

каллусной ткани полученной в разных условиях культивирования, но отражают на молекулярном уровне их различия

Помимо молекулярного анализа различных типов калтуса пшеницы, представляло интерес сравнить RAPD спектры растений-регенерантов различных сортов пшеницы контрольного варианта Установлено, что подавляющее число амплифицированных фрагментов были мономорфны, то есть присутствовали в RAPD спектрах всех анализируемых растений-регенерантов Однако, при амплификации с гграймсрами OPD3, ОРА15 и OPD14 в спектрах регенерантов детектировались полиморфные фрагменты ДНК

Полученные нами результаты по RAPD анализу изменений, возникающих в ДНК регенерантах пшеницы, совпадают с данными других авторов о геномном по шморфизме морфологически не различимых сомаклонов риса, гороха, пшеницы, сахарной свеклы и ряда древесных культур

RAPD анализ растений-регенерантов пшеницы, поточенных посче клеточной селекции При RAPD анализе растений-регенерантов пшеницы полученных в результате действия ку льту рального фильтрата патогена уровень детектируемого полиморфизма ДНК регенератов пшеницы значительно повышался Из 81 RAPD фрагментов, амплифицированных при использовании праймеров OPD14 OPD3. ОРА15 и OPD6, 5 были полиморфными, то есть присутствовали не во всех спектрах анализируемых растений Следует отметить, что наиболее полиморфными были RAPD спектры растении сорта Московская 35 По мнению ряда исследователей, появление новых, отсутствующих в родительских линиях, ампликонов у регенерантов связано с тем, что в геноме растений есть специфические районы, предрасположенные к мутациям, которые возникают в ответ на условия культивирования и приводят к формированию различных клопов в культуре in vitro (Bohanec Jakse Ihan Jovorik 1995 Al-Zahim Fotd Lloyd Nembury 1999) Ранее в работах Богани был проведен RAPD анализа уровня полиморфизма у длительно культивируемых суспензионных линий и различных сомаклонов томата, полученных при регенерации их на средах с различным содержанием фитогормонов, а также в присутствии стрессового фактора Был показан высокий уровень изменений как непосредственно в нуклеотидной последовательности, так и в уровне метилирования ДНК, возникающий в культуре клеток и у растений-регенерантов томата (Bogani Ual 1995,1996)

Таким образом, культивирование каллусных клеток на селективных средах in vitro приводит к формированию гетерогенной ткани, способной реализовывать морфогенетическии потенциал в виде сомаклональных вариантов Для них характерно появление отдельных

признаков, которые закрепляются на генетическом уровне. Методами молекулярного маркирования эти изменения легко установить и доказать их наличие по появившимся фрагментам ДНК, нехарактерным для контрольных образцов.

Заключение

Современная биотехнология охватывает широкий круг методов, среди которых центральное место занимает генетическая и клеточная инженерия. Данные исследования направлены на создание генетически модифицированных объектов, широко используемых в различных областях науки и производства.

Клеточная биотехнология позволяет значительно расширить спектр генетического разнообразия; получать формы растений, обладающих повышенной устойчивостью к абиотическим и биотическим факторам окружающей среды; сократить сроки проведения селекции. Однако в этом направлении исследований существуют острые проблемы, и в частности, недостаточная регенерационная способность культивируемых клеток и отсутствие эффективных методов отбора in vitro устойчивых к заболеваниям регенерантов, особенно с комплексной устойчивостью к нескольким патогенам. Поэтому поиск методов, повышающих морфогенетическую активность клеток in vitro и разработка нетрадиционных селективных систем являются актуальными проблемами.

Разработанные и предложенные в диссертации схемы и методы клеточной селекции, позволяют получать формы растений пшеницы, моркови и картофеля, обладающих повышенной устойчивостью к действию фитопатогенных грибов. Применение предлагаемых технологий для других сельскохозяйственных растений возможно лишь после дополнительного проведения экспериментов с ними с учетом видовых и сортовых особенностей клеток; типа и возраста первичного экспланта; продолжительности культивирования клеток в условиях in vitro и компонентов питательной среды.

Экспериментально доказано, что в устойчивых каллусных линиях и растениях-регенерантах усиливается синтез эндогенных гормонов, особенно гормонов, обладающих стимулирующим эффектом, и фенольных соединений, которые могут приводить к изменениям экспрессии генов; появлению неспецифических белков, синтезу ферментов, укреплению клеточной стенки и др. Признак повышенной устойчивости может быть обусловлен генетическими изменениями на уровне ДНК. Наши исследования показали, что в клеточных культурах, культивируемых на селективных средах с использованием

кульгуральной жидкости патогенов, происходят изменения в нуклетотидных последовательностях, что является свидетельством генетических изменений

Таким образом, результаты работы подтверждают перспективность использования методов клеточной селекции для создания устойчивых к болезням форм растений В то же время, надо иметь ввиду, что предложенные схемы и методы не обеспечивают 100%-ного получения более устойчивых форм, а лишь способствуют отбору популяции, обогащенной потенциально устойчивыми растениями

Выводы

1 Впервые для пшеницы, моркови и картофеля разработана схема и методы тканевой и клеточной селекции, позволяющие получать формы растений, обладающие повышенной устойчивостью к фитопатогенным грибам Septana nodorum Alternaría radicina Rhizoctonia solani, соответственно Основой метода является культивирование каллусных и суспензионных клеточных культур на питательных средах, содержащих токсичный селективный фактор -культуральный фильтрат патогена (КФ)

2 Фитотоксичность экзометаболитов возбудителей болезней в условиях in vitro в значительной мере зависит от состава и соотношения инградиентов питательной среды При выращивании изолятов гриба в жидкой питательной среде Чапека фитотоксичность экзометаболитов в S-7 раз превышает этот показатель, полученный при культивировании патогена на среде Мурасига и Скуга

3 Ку (ыуральный фильтрат патогенов (Septana nodorum -ilternaria radicma Rhizoctonia solani) в концентрациях 10-20% оказывает стимулирующее влияние на рост интактных растений и клеток каллусных и суспензионных культур (пшеница, морковь, картофель) При более высоких концентрациях он оказывает на них ингибируюшее действие Оптимальный эффект в селекции in xitro достигается на каллуиюй ткани пшеницы при 20%-ом КФ Scptoria nodorum, на суспензионной культуре моркови при 30-50%-ом КФ Alternaría radicina на каллусной и суспензионной культурах картофеля при 30-40%-ом КФ Rhizoctonia solani

4 Растения-регенеранты, полученные на селективных средах с указанным содержанием КФ, обладают повышенной устойчивостью (на 10-35%) к действию патогенов по сравнению с регенерантами контрольного варианта Для отдельных генотипов (сорт Rondo) устойчивость повышается до 50%

5. Выявлены существенные различия в содержании эндогенных гормонов в клетках суспензий моркови и картофеля, длительно культивируемых на контрольных и селективных средах. Адаптация клеток к селективному фактору сопровождается повышением уровня цитокининов и ИУК. У растений-регенерантов моркови, полученных из клеток, отселектированных на питательных средах с КФ, происходит значительное повышение ауксинов (в 2 раза), цитокининов (в 4-20 раз) и гиббереллинов (в 3-12 раз) по сравнению с контрольным вариантом.

6. Выявлено положительное влияние фенольных соединений на адаптацию клеток к действию селективного фактора. Они в большем количестве накапливаются в клетках, устойчивых к действию селективного фактора. Значительная роль в этом процессе принадлежит фенольному полимеру лигнину, ограничивающему проникновение культурального фильтрата патогена в клетки.

7. В клеточных культурах, выращенных на селективных. средах с использованием КФ патогенов происходят изменения в нуклеотидных последовательностях, выявленные ПАРИ методом. Для устойчивых каллусных культур и растений-регенерантов, полученных в результате клеточной селекции, 11АРП спектры ДНК отличались отсутствием или наличием новых фрагментов размером от 330 п.н. до 1200 п.н., которые не были характерны для КАРО спектров ДНК контрольного варианта, что является доказательством, возникающих в опытных вариантах изучаемых объектов, генетических изменений.

8. Предлагаемая схема и методы клеточной селекции растений на основе отбора адаптированных клеток на селективных средах и получения из них растений-регенерантов с повышенной устойчивостью к опасным грибным болезням ПРУ ограниченном) применения трансгенных технологий являются существенным дополнением к ней для получения измененных форм растений с указанными признаками и свойствами.

9. Процессы каллусогенеза, пролиферации и морфогенеза, выработанные и генетически закрепленные у растений в ' УО^с. эволюции, является закономерной ответной реакцией на нарушение целостности многоклеточного растительного организма, а степень их реверсии характеризует величину важнейшего свойства клетки - их тотипотентности.

Слисок опубликованных работ

Учебно-методическая литература

1 Сельскохозяйственная биотехнология Учебное пособие, VI, МСХА,

1995, с 310 (иод редакцией академика РАСХН В С Шевелухи, в соавторстве Дегтярев С В , Артамонова Г VI и др )

2 Сельскохозяйственная биотехнология Учебник, М Высшая школа, 1998, 416 с ( под редакцией академика РАСХН В С Шевелухи, в соавторстве Дегтярев С В , Ковалев В М и др )

3 Получение посадочного материала древесных, цветочных и травянистых растений с использованием методов клеточной и генной инженерии Учебное пособие Издание 2, испр и доп, М -МГУЛ, 2001, 73 с ( в соавторстве Родин А Р )

4 Сельскохозяйственная биотехнология Учебник, М Высшая школа, 2003, с 470 (под редакцией академика РАСХН В С Шеветухи, в соавторстве Воронин Е С , Ковалев В М и др )

Основная литература

5 Методы культуры тканей перспектилы использования// Лесное хозяйство, 1495, Xo 3, с 9-11 (в соавторстве Родин АР)

о Использование методов биотехнологии в селекции пшеницы на устойчивость к септориозу / Тез конф «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии»,

1996, с 22 ( в соавторстве Джое Л )

7 Влияние гриба Septoria nodorum и его метаболитов на прорастание семян пшеницы Ч Известия ТСХА, 1996, вып 4, с 1-7 ( в соавторстве Джое Л )

8 Клеточная селекция моркови на устойчивость к альтернариозу // Тез I Междунар конф «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 1996, с 47 ( в соавторстве Намбудри Н , Раскалиева В Л )

9 Использование методов биотехнологии в клеточной селекции моркови на устойчивость к альтернариозу И Известия ТСХА, 1996, вып 4, с 163-165 ( в соавторстве Намбудри Н , Раскалиева В А )

10 Влияние гормонального состава питательной среды на морфогенез пшеницы // Тез докл IV Международной конф «Регуляторы роста и развития растений», Москва, 1997, с 304 (в соавторстве Джое Л )

11 Изучение морфогенетической активности изолированных листовых эксплантов пшеницы в условиях ш vitro 'Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда Тез Докладов VII Междунар конф , Москва, 1997, с 147 (в соавторстве Пиллай Р, Джое Л)

12. Клеточная селекция пшеницы на устойчивость к септориозу. // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: Тез. Докладов VII Междунар. конф. 1997, с. 317. ( в соавторстве Джое Л.)

13. Utilization of biotechnological methods in selection of stability to Septoria. // Congress on «In vitro biology» USA, 1997, /Hot topics, p. 15.

14. Morfogénesis of cerrot in vitro. // Congress on «In vitro biology» USA,

1997./Hot topics, p. 17.

15. Состояние и перспективы развития информационных технологий в сельском хозяйстве. // Известия ТСХА, 1998, вып. 3, с. 36-42. ( в соавторстве Ковалев В.М., Белов Д.В.)

16. Разработка методов клеточной селекции пшеницы на устойчивость к Septoria nodorum. // Междунар. конф. «Молекулярная генетика и биотехнология», Минск, 1998, с. 221-222. ( в соавторстве Пиллай Р., Джое Л.)

17. Использование методов биотехнологии в селекции моркови на устойчивость к грибу Alternaría radicina. И Междунар. конф. «Молекулярная генетика и биотехнология», Минск, 1998, с. 251-252. ( в соавторстве Раскалиева В.А.)

18. Влияние генотипа и условий культивирования зародышей яровой пшеницы на процесс каллусогенеза и морфогенеза. // Известия ТСХА,

1998, вып. 3, с. 94-99. ( в соавторстве Джое JI.)

19. Cellular selection of wheat resistance to glume blotch disease. // Congress on «In vitro biology» USA, 1998. /Hot topics, p. 16.

20. Влияние 2,4-Д на каллусогенез эксплантов, изолированных из микроклубней картофеля в условиях in vitro. Ч Материалы Международной научно-практической конференции: Молодые ученые возрождению сельского хозяйства России в XXI веке. Брянск, 2-5 октября 2000, с. 22-24. (в соавторстве Вальдеррама А.)

21. Морфогенез в культуре первичного каллуса картофеля. // Материалы Международной научно-практической конференции: Молодые ученые возрождению сельского хозяйства России в XXI веке. Брянск, 2-5 октября 2000, с. 31-33. (в соавторстве Вальдеррама А.)

22. Влияние культурального фильтрата гриба Alternaría radicina на суспензионную культуру моркови.// Тез. II Междунар. конф. «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2000, с.65. ( в соавторстве Раскалиева В.А.)

23. Целесообразность использования культурального фильтрата гриба Rhizoctonia sotaní в селекции картофеля на устойчивость к ризоктониозу.// Тез. II Междунар. конф. «Актуальные проблемы

биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2000, с 204-205 ( в соавторстве Вальдеррама А )

24 Клеточная селекция пшеницы на устойчивость к септориозу // Сельскохозяйственная биотехнология Избранные труды Под редакцией Шевелухи В С, М Евразия \ 2000, т 1, с 16-21 ( в соавторстве Джое )

25 Intluance cultural fíltrate offun%¡ Alternaría radicina on cell suspensión of carrots " Viet Nam «International Workshop on fíiology л 2001

26 Влияние факторов гормональной и негормональной природы на морфогенетический потенциал интактных растений пшеницы и в культуре m vitro //Сельскохозяйственная биотехнология Избранные труды Под редакцией Шеветухи В С , М Евразия +, 2001, т 2, с 71-

8о"

27 Использование метотов биотехнологии в получении форм моркови, устойчивых к ольтернариозу / Сельскохозяйственная биотехнология Избранные труды Под редакцией Шевелухи В С , М Евразия +, 2001 т 2, с 81-91 ( в соавторстве Раскалиева В А )

28 Действие метаболитов гриба alternaría radicina на рост суспензионной культуры моркови '/ Труды IV Между народного симпозиума Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования М изд во РУДН, 2001, с 250-253

24 Влияние к\льтурального фильтрата гриба Alternaría radicina на рост суспензионной культуры моркови Ч Доклады ТСХА, М МСХА, 2001, вып 273, с 28-32 ( в соавторстве Раскалиева В А )

30 Влияние регуляторов роста на адвентивное побегообразование на корня картофеля в культуре т \itro Ч Материалы Всероссийской научно-практической конференции Молодые ученые возрождению сельского хозяйства России в XXI веке Санкт-Петербург 2001, с 1820 (в соавторстве Вальдеррама А )

31 Влияние метаболитов гриба Rhizoctoma sotaní на рост изолированных клеток и тканей картофеля in vitro h Материалы Всероссийской научно-практической конференции Молодые ученые возрождению сельского хозяйства России в XXI веке Санкт-Петербург 2001, с 50-52 (в соавторстве Нгуен Тхи Ли Ань, Сысоева ВМ)

32 Влияние биологически активных вешеств и факторов физического воздействия на морфогенетический потенциал интактных растений пшеницы и в культуре т Mtro h Тез докл VI Международной конф «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях», Москва, 200 Г, с 161

33 Влияние веществ цитокининовои активности на получение растений-регенерантов моркови после клеточной сетекции // Тез

докл. VI Международной конф. «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях», Москва, 2001, с. 162. (в соавторстве Раскалиева В.А.)

34. Метод управления гормональным статусом интактных растений и изолированных органов при их культивировании in vivo - in vitro на основе воздействия энерго-информационным полем (ЭИП). // Материалы II Международной научно-практической конференции (3^ 6 декабря 2001 г., г. Горки), Горки:БГСХА, 2002, с. 185-189. ( в соавторстве Ковалев В.М., Белов Д.В., Сальникова Б.И.)

35. Растения-регенеранты, полученные после клеточной селекции моркови на устойчивость к Alternaría radicina М., Dr. et Е. // Научные труды ВНИИО (Овощеводство: состояние, проблемы, перспективы),

2002, т. 2, с. 95-99.

36. Адаптационная способность пробирочных растений, каллусных и суспензионных культур картофеля к стрессовым условиям культивирования. // Доклады ТСХА, М.: МСХА, 2002, вып. 274, с. 105-108.

37. Влияние вторичных метаболитов гриба Fusarium avenacium на рост каллусной ткани моркови. // Научные труды ВНИИО (Овощеводство: состояние, проблемы, перспективы), 2002, т. 2, с. 100-103 (в соавторстве Ипатова Н.В.)

38. Особенности морфогенеза картофеля ш vitro при использовании цитокининов.// Сельскохозяйственная биология, 2002, № 1, с. 88-90. ( в соавторстве Ковалев В.М., Глушкова Т.Н.)

39. Получение растений-регенерантов после клеточной селекции моркови на устойчивость к патогенному грибу Alternaría radicina М., Dr. et Е. // Биотехнология, 2003, № 2, с. 65-68.

40. Роль фитогормонов в адаптации клеток к биотическому стрессу в культуре in vitro.// Физиология растений и экология на рубеже веков: Материалы Всероссийской научно-практической конференции / Яросл. гос. ун-т - Ярославль, 2003, с. 204. ( в соавторстве Карсункина Н.П., Скоробогатова И.В., Захарова Е.В.)

41. Морфофизиологические особенности клеточной селекции моркови на устойчивость к патогенам. // Селекция, семеноводство и биотехнология овощных и бахчевых культур : Доклады III Международной конференции, посвященной памяти Б.В. Квасникова,

2003, с. 212-215.

42. Влияние веществ с цитокининовой активностью и первичного экспланта на процесс регенерации растений моркови. // Селекция, семеноводство и биотехнология овощных и бахчевых культур : Доклады III Международной конференции, посвященной памяти Б.В. Квасникова, 2003, с. 513-514. ( в соавторстве Ипатова Н.В.)

43 Регуляторная роть фитогормонов при адаптации растительных клеток к стрессовым условиям in vitro //Аллоцитоплазматическая пшеница и некоторые аспекты биотехнологии растений / Под редакцией Рейес Матаморос ХМ, М Компания Спутник 2003, с 84-00 ( в соавторстве Карсункина Н П, Скоробогатова И В , Захарова ЕВ)

44 Особенности калл\согенеза листовых эксплантон картофеля, культивируемых на среде с 2,4-Д in vitro h Ахлоцитоплазматическая пшеница и некоторые аспекты биотехнологии растений / Под редакцией Реиес Матаморос X М, М Компания Спутник +, 2003, с 66-73 ( в соавторстве Вальдеррама Ромеро А С, Чередниченко М Ю , Высоцкая VIВ , Рейес Матаморос X М )

45 Морфо-физиологические особенности пробирочных растений, каллусной ткани и суспензионной ку ьтуры картофеля, обусловленные действием экзометаболитов гриба Rhizoctoma solum Ч Биотехнология, 2003, -V» 3, с 36-41

46 Влияние стрессовых условий культивирования на гормональный баланс клеток суспензионных ку гьтур и растений-регенерантов моркови Биотехнология, 2003, .V« 4, с 51-56 ( соавторстве Карсу нкина Н П Скоробогатова И В , Захарова ЕВ)

47 Биологические основы клеточной селекции растений // Доклады ТСХА, М МСХА, 2003, вып 275 , с 113-116

48 Клеточная селекция растений на устойчивость к биотическим факторам / Био гогия клеток растений in vitro биотехнология v сохранение генофонда Гез Докладов VIII Междч нар конф 2003 ( 913 сентября, Саратов)

Объем 3.25 п.л.

Зак. 438

Тираж 100 экз.

АНО «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

Информация о работе

Калашникова, Елена Анатольевна
доктора биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.23

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ РАСТЕНИИ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ГРИБНЫМ БОЛЕЗНЯМ ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ РАСТЕНИИ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ГРИБНЫМ БОЛЕЗНЯМ"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ РАСТЕНИИ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ГРИБНЫМ БОЛЕЗНЯМ
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология