Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ОЦЕНКА ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА СТОЛОВОЙ МОРКОВИ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ФУЗАРИОЗУ И АЛЬТЕРНАРИОЗУ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДОВ ТРАДИЦИОННОЙ И КЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "ОЦЕНКА ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА СТОЛОВОЙ МОРКОВИ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ФУЗАРИОЗУ И АЛЬТЕРНАРИОЗУ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДОВ ТРАДИЦИОННОЙ И КЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ"



На правах рукописи

И ПАТОВ А Наталия Валерьевна

Ь

ОЦЕНКА ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА СТОЛОВОЙ МОРКОВИ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ФУЗАРИОЗУ И АЛЬТЕРНАРИОЗУ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДОВ ТРАДИЦИОННОЙ И КЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ

Специальность 06,01.05-селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Москва 2004

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте овощеводства в 1999-2002гг.

до (trop сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник Владимир Иванович Леунов.

Доктор сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник Маргарита Ивановна Федорова.

Кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник Григорий Федорович Монах ос

Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева.

Защита состоится мая 2004г. в 10 110 часов на заседании

диссертационного совета Д 006,022,01 во Всероссийском научно-исследовательском институте овошеаодсгва по адресу: 140153 Московская обл., Раменский район д, Верея, строение 500, ВНИИО

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института овощеводства.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

J

Актуальность темы. В последние годы в Нечерноземной зоне России все большее распространение получают болезни моркови (Аты-cus carota), вызываемые грибами рода Fusarium Link. Ex. Fr. Фузарим могут поражать растения моркови на всех этапах ее развития, вызывал гибель проростков моркови до 30% {Nowicki, 1992), увядшие семенников и поражение корнеплодов при хранении до 20% (Першн-на, 1994),Зараженность семян моркови фузариозом достигает 21% (Дураков,! SB 5).

В современной литературе и практической селекции не встречаются работы, в которых в полной мере были бы отражены приемы оценки и отбора (на инфекционных фонах) устойчивых к этому патогену генотипов моркови. В настоящие время нет сортов моркови с устойчивостью к фузарнозу.

В сочетании с классическими методами селекции на устойчивость к болезням, можно использовать методы биотехнология, которые ускоряют селекционный процесс и позволяют расширить спектр генетического разнообразия. В этом направлении одно из ведущих мест занимает клеточная селекция, при которой в условиях in vitro проводится отбор клеточных популяций, устойчивых к селективному фактору. Однако для фузаряоза моркови эти методики пока не разработаны.

Цель исследований - оценка исходного материала столовой моркови на устойчивость к фузариозу традиционными методами селекции н на клеточном уровне in vitro.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить уровень вредоносности фузарноза на столовой моркови в естественных условиях.

2. Оценить коллекцию моркови на устойчивость к возбудителям фуэариоза и альтернариоза {Alternaría radicina M.D. et E.) на искусственных инфекционных фонах.

3. Подобрать эффективные меаодагтжсттркс^ведгопа^ jj^rjjti^ejiejremií устойчивости столовой моркови к фуэарноэу. \ д. Тимирязева

ЦП'ó «wemi И V. -К -шоаа Фонд н£-/чнын литературы

к^ JQ - X ft

4. Изучить условия культивирования каллускоЙ ткани моркови методами in vitro с последующей оптимизацией питательной среды, обеспечивающей получение растений - регенерантов.

5. Провести клеточную селекыию на каллусной ткани моркови, отобрать клеточные популяции, устойчивые к культур альному фильтрату гриба Fusarium avenaceum,

6. Получить растения - регенераты и провести их оценку по устойчивости к фузариозу.

Научная новизна. Усовершенствована методика применения искусственного инфекционного фона для отбора устойчивых образцов моркови к фузариозу и адьтернариоэу в период вегетации. Подобраны ускоренные методы оценки коллекционного материала моркови первого года жизни на устойчивость к F, avenaceum. В результате применения этих методов из 50 изученных образцов рода Daucus выделено 5 источников признака устойчивости к фузариозу. Разработаны элементы методики проведения клеточной селекции моркови на устойчивость к грибу F. avenaceum. После проведения клеточной селекции получены растения-регенераяты, устойчивые к этому патогену.

Практическая значимость работы. Оценен уровень вредоносности фузариоза на столовой моркови в производственных условиях Московской области. Усовершенствованные методики позволяют оценить устойчивость селекционного материала в большом объеме на ранних этапах селекции. Полученные в результате исследований устойчивые формы моркови могут служить в качестве исходного материала для получения новых гибридов и сортов, обладающих повышенной устойчивостью к F. avenaceum.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на заседаниях Методической комиссии отдела селекции, на ученом совете ВНИИО, Результаты доложены и опубликованы в материалах научно-практических конференций - «Квасниковские чтения» (Москва, ВНИИО, 2001, 2003).

í

На защиту выносятся:

]. Вредоносность грибов рода Fusarium в комплексе патогенеза моркови столовой в естественных условиях Московской области.

2.Систем а методов оценки устойчивости генотипов моркови к Fusarium avenaceum,

3. Исходный материал столовой моркови устойчивый к Fusarium avenaceum полученный методом клеточной селекции.

Автор выражает глубокую благодарность ЕЛ. Калашниковой, С.Д. Сапепкиной н Т.А. Терегпонковой за консультационную помощь в процессе экспериментальных исследований И моральную поддержку.

Объем и структура работы. Работа изложена на 134 страницах компьютерного текста и состоит из введения, б разделов, общих выводов, практических рекомендаций, списка литературы, состоящего из 202 наименований, в т.ч. 58 на иностранных языкам- Текст иллюстрирован 29 таблицами и 23 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Условия, объекты ti методы проведения исследований. Работа выполнена в 1999*2003 гг. на базе отдела селекции ВНИИО, лаборатории селекции корнеплодов, в пленочных теплицах Селекцентра, производственных условиях ОПХ «Быково», на кафедре с.-х. биотехнологии МСХА.

Объектом исследования служили 50 образцов столовой моркови селекции ВНИИО, образцы иностранной селекции, а также чистые культуры грибов Fusarium avenaceum, Alternaría radicina.

Оценку устойчивости коллекции образцов столовой моркови проводили в соответствии с методикой ВИР (Сазонова, Власова, 1990). При учете болезни оценивали балл поражения и вычисляли распространенность и развитие в процентах.

В экспериментальных опытах по оптимизации системы методов искусственного заражения использовали методики ВИР (Сазонова, Власова, 1990).

Распространение болезней на корнеплодах моркови определяли визуально после окончания периода хранения. Патогены идентифицировали после выделения их в чистую культуру, используя определитель Н.М. Пидошшчко (1977).

б

Инфекционное состоя кие семян оценивали по общепринятой методике (Наумова, 1970).

При искусственном заражении дисков, изолированных с корнеплодов использовали методику, разработанную во ВНИИССОК(1988). Минимальное количество оцененных корнеплодов в сортообразце - 10 шт.

В 2002 году были заложены два инфекционных фона для оценки селекционного материала на устойчивость к Alternaria radicina и Fusarium avenaceum, (работа проводилась совместно с отделом биотехнологии ВНИИО). Патогены были выделены, из корнеплодов моркови. Дозировка инфицирования почвы задавалась через количество субстрата, на котором наработан инокулюм, т.е. 250 гр. на 0,5 м1.

Учет пораженное™ растений проводили в фазе 3-4 настоящих листьев, а также при уборке корнеплодов.

В качестве стандарта при оценке на устойчивость использовали сорт Леавдр, в качестве восприимчивого стандарта сорт REW-186.

В работе, проводимой в МСХА, использовали методики, разработанные на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии к изложенные в «Лабораторно-практические занятия по с-х биотехнологии»{ 1996,2000).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Распространение и вредоносность грибов родов Fusarium ар.» Aliernaria sp. в условиях ОПХ «Быково» Раменского района М.О.

В ходе исследований был определен видовой состав основных патогенов на различных этапах онтогенеза столовой моркови. Установлена степень распространения и уровень вредоносности грибов рода Fusarium sp. и Altemaria sp. в естественных условиях Раменского района Московской области.

На рисунке 1 представлены результаты оценки распространенности основных грибных заболеваний на семенах, корнеплодах и семенниках столовой моркови.

Распространенность основных заболеваний на столовой моркови.

(естественный инфекционный фон, 1999-2002гт.)

25 20 15

Ш альтернариоз ЕЗ фузариоз Ифомоз

ю ñ— я- а-

іЧккя

Рис. I.

Наибольшую вредоносность представляют грибы рода Alternaría. Зараженность ими семян моркови составляет 9%, корнеплодов 20% и семенников -15%. Грибы рода Fusarium также занимают одно из ведущих мест в комплексе патогенов, паразитирующих на моркови. Зараженность семян этим патогеном составляет - 7,4%, поражение корнеплодов этими грибами при хранении составляет - 9,2%, процент поражения семенников - 11,5%. Таким образом, инфицирование столовой моркови грибами рода Fusarium и обусловленные этим потери, происходят на всех этапах онтогенеза моркови. Поэтому селекция на устойчивость моркови к грибам рода Fusarium актуальна и своевременна.

Устойчивость образцов моркови к фузариозу в условиях есте-

В период с 1999-2002 гг. коллекции моркови выращивали для изучения полевой устойчивости к грибам рода Fusarium. В период вегетации распространенность болезни составляла от 13 до 50%, а при уборке корнеплодов от 6,3 до 40%. Наибольшую устойчивость к этому патогену в условиях естественного заражения проявил гибрид Fi Олимпиец, количество пораженных растений у него было существенно ниже сорта стандарта - сорта Леандр н составляло 6,3% против 13%. Коллекция образцов моркови была разделена на пять сортотипов. Оценка устойчивости сортотипов к фузариозу позволила выявить диф-

ствеиного заражения.

ференциацию по этому признаку. При оценке моркови в фазу 3-4 настоящих листьев наибольшее число устойчивых образно» было в сор-тотипе Парижская каротель: поражено растений 22%. Пораженность образцов сортотипов Амстердамская, Нантская и Берликум грибами рода Fusarium составила 29,2%, 31,1% и 30,4%, соответственно.

При уборке корнеплодов наибольшую устойчивость проявили образцы сортотипа Натекая: распространенность фузарноза -19,8%. У других сортотипов поражение корнеплодов в образцах было выше и в среднем составило от 243% до 29,6%

Как известно, основной вред моркови накосят пэтогены, развивающиеся в период хранения. Условия хранения 2002-2003гг. были не благоприятны для хранения корнеплодов- температура воздуха колебалась от -5°С до +8°С. Из данных таблицы I, в которой представлена часть коллекционных образцов, с четко прослеживающимися симптомами поражения различными патогенами, витою, что до 98% корнеплодов в образцах поражены болезнями «хранения». Часто на одном корнеплоде было идентифицировано по 2-3 возбудителя, в некоторых случаях нам не удавалось установить, что же являлось первичной инфекцией. Оранжевоо крашеные образцы поражались в меньшей степени, чем желтоокрашениые корнеплоды: средний процент пораженных корнеплодов составил 80% и 913%, соответственно. Наибольшую вредоносность в условиях хранения 2002-2003гг. - представлял фомоз. Поражение корнеплодов грибами родов Fusarium и Alternaria составило, в среднем, по всем исследованным образцам 15,5% и 15,3% соответственно. Наибольшее количество пораженных корнеплодов «болезнями хранения» было у сорта REW -186- 100%, гибрида Топаз Fj и линий 690П — 98%, 8В — 90%. Наименьшую восприимчивость к этим болезням проявил гибрид Fi Олимпиец - 52%. На уровне стандарта (Леандр) были поражены корнеплоды сортов Riesen verbesserte wersse №220 - 70%, Zong White M14I4 - 69%(имеюшие желтую окраску корнеплодов) и линии 225В-62%.

Таблица. 1

Пораженпость корнеплодов коллекционных образцов моркови после хранения

( При естественном їараженшї, 2002-2003гг.)

Степень развития болезни, %

Я 'S В т.ч.

1 8 W £ Ii Общая А * « А р § ^ 8 і © £ (1 •в § 5 S £ І Г w

Леандр st. 64 93,2 24,2 20,0 29,0 - - 20

Нзнтская 4 82 79,4 21,6 22,1 24,1 11,6 - -

НИИИОХ 336 70 82,0 7,8 13,6 18,9 21,7 12,0 8,0

Нюанс 96 77,8 15,1 18,1 16,6 3,0 6.0 19

REW-J86 100 99,9 16,6 20,4 23,3 - 30,6 9

Топаз F| 100 79,9 10,7 12,4 11,6 24,7 20,5 -

Олимпиец Fj 52 68,6 7.6 8,2 7,7 18,9 19,4 6,8

среднее 80 83,7 14,2 17,0 20,0 11,7 IV 8,8

Riesen verbesserte weisse J&220 ж 70 95,8 4.7 5,9 4,7 50,4 12,5 17,6

Zong Whjte№i414»t 69 81,6 10,4 13,5 38,4 - 20,6 18,7

Голландская желтая 78 86,2 17,6 14,5 17,8 13,4 14,7 8,2

Местная Nä23S6 ж 82 95,7 12,4 11,7 19,7 20,5 - 21,4

Местная №2368 ж 86 91,9 10,7 10,4 11,7 25,4 23,7 -

среднее 91,9 93,2 13,6 12,3 12,8 18,8 20,1 16,6

1238П 94 89,8 24,2 20,0 26,0 6,0 7,6 6,0

690П 98 98,7 20,9 17,6 17,0 V 26,6 9,2

SB 90 91,7 22,7 25,6 18,5 11,3 13,6 -

2 ООП 76 93,5 19,0 26,2 30,0 9,3 - 9,0

1238В 100 66,4 7,5 14,0 20,0 8,3 16,6

225В 62 80,0 12,0 11,7 11,4 20,6 - 243

HCPW 9,0

Примечание: ж- желтая окраска корнеплода.

Использование различных методов искусственного заражении для оценки устойчивости образцов моркови столовой к фузариозу.

Для оценки и отбора исходного материала устойчивость образцов целесообразно проверять при использовании методов искусственного заражения. Нами была проведена работа по подбору и оценке

этих методов, а именно: использование искусственных инфекционных фонов, метод оценки проростков в лабораторных условиях, оценка сегментов, изолированных с корнеплодов.

Последние два - лабораторные экспресс-методы оценки устойчивости - позволяют оценить большое количество исходного материала и провести отбор устойчивых биотипов в неоднородных по этому признаку растительных популяциях.

При использовании различных методов инфицирования растений столовой моркови грибами рода Fusarium, необходимо сравнить оценки устойчивости, полученные этими методами между собой и с уровнем поражения растений при естественных условиях (Таб.2). За эталон приняты оценки устойчивости, полученные при естественном заражении.

Таблица 2

Поражение образцов столовой моркови фузариозом при заражении различными методами

Образец Поражено растений, %

Естественный инфекционный фон Искусственный инфекционный фон Искусственное заражение в лаб, условиях Диски, изолированные с корнеплода

Леандр st. 18 24,1 38 40

REW-186 воспр st. 34 76,1 100 76

НИИОХЗЭ0 20 52,3 54 49

Нюанс 20 31,2 34 60

Топаз F] 30 56,0 53 70

1238В 23 25,6 26 70

225В 28 37,2 40 50

1585В 31 35,0 39 76

Коэф. корреляции +0,76 +0,82 +0,63

Коэффициент корреляции при сравнении лабораторного метода с естественным инфекционным фоном достаточно высок и составляет +0,82, а при сравнении оценки устойчивости в условиях инфекционного фона, с условиями заражения в естественных условиях - коэффициент корреляции равен +0,76. При инфицировании дисков изолированных с корнеплода коэффициент корреляции равен +0,63. Следовательно, эти методы заражения моркови грибами рода Fusarium можно ис-

Ii

пользовать при оценке растений моркови на устойчивость к этим патогенам.

Оценки устойчивости образцов, полученные при использовании экспресс- методов, несколько завышены в сторону восприимчивости по сравнению с результатами, полученными на искусственном инфекционном фоне в теплице. Это вполне естественно т.к. в лабораторных условиях поддерживаются более благоприятные условия для развития гриба. По иммунологической характеристике, устойчивость оцененных в лаборатории образцов распределяется так же, как в условиях искусственного инфекционного фона (Таб.4).

Результаты испытания различных методов оценки и отбора, устойчивых образцов моркови позволили сформировать систему методов оценки (Таб. 3). Использование згой системы позволяет ускорить селекционный процесс на ранних этапах и проводить оценку исходного материала в удобное для селекционера время.

Таблица 3

Система методов оценки я отбора, образцов столовой моркови на устойчивость к грибам рода Fusarium.

Метод Сроки использования Решаемые задачи

Лабораторная оценка проростков бинокулированной почве В течение всего года Предварительная оценка коллекционного материала

Оценка проростков на инфекционном фоне Период вегетации Оценка и отбор

Оценка дисков изолированных с корнеплода В течение всего года Выделение устойчивых корнеплодов из образца

Оценка корнеплодов во время хранения Осень- весна Оценка на устойчивость и лежкосгь

В таблице 4 представлены результаты оценки коллекционных образцов полученные в условиях искусственного инфекционного фона, созданного в условиях теплицы селекцентра ВНИИО. При использовании этого метода оценку проводили в 2 срока*, а период вегетации на 50-е сутки, после всходов и при уборке корнеплодов.

Таблица4

Оценка образцов моркови на устойчивость к фузаркозу на искусственном инфекционном фоне.

(в теплице селекцентра, 2001-2002)

Образец Поражено растений,. % Степень устойчивости по шкале СЭВ (1-9 баллов)

Фаза 3-4 настоящих листьев, А Корнеплоды при уборке, Б

А Б

Леандр st. 24,1 48,6 7 5

REW-186 в. st 76,1 100 1 1

НИИОХ- 336 52,3 56,7 3 3

Нантская 4 30,0 30,0 7 5

Нюанс 32,0 53,6 5 3

Олимпиец Fi 13,1 12,5 9 7

Riesen verbesserte wersse №220 ж 20,0 32,1 7 5

Zong White №1414 ж 0,0 24,0 9 7

Голландская желтая №1382 15,7 23,3 7 7

Белая №1425 15,3 22,0 7 7

МестнаяЛа2368 ж 23,6 20,0 7 7

Местная№337ж 25,0 23,5 7 7

Местная 20,0 25,0 7 7

Местная №17б6ис 25,0 25,0 7 7

8В 32,8 23,8 5 7

1238В 25,6 25,0 7 7

НСР к 6,1 6,9

Примечание: ж- желтая окраска корнеплода.

№ данных таблицы 4 следует, что сорт REW-186 был поражен на 76%, у сорта-стандарта (Леавдр) поражение растений составило -24,1%, и он по иммунологической характеристике относится к устойчивым сортам. Достоверно на уровне стандарта был устойчив сорт Нантская 4 (распространенность 25%), и все образцы, имеющие желтую окраску корнеплодов. К высокоустойчивым образцам можно отнести гибрид F [Олимпиец, имеющий 13,1% пораженных растений и образец Zong White №1414, у которого на период оценки не было поражено патогеном ни одного растения. Все остальные образцы относятся к восприимчивым с различным процентом пораженных растений.

В период уборки заражение не проявилось в высокой степени или носило скрытый характер. Из линейного материала выделились в этот период две линии - 8В, 1238В - со степенью устойчивости по шкале СЭВ 7 баллов, у которых количество пораженных растений составляло: 23,6%, И 25,0%, соответственно.

Восприимчивость образцов моркови к Alternarla radicina.

В 1 999-2002 гг. проводшш оценку 50 образцов моркови на устойчивость к альтернариозу, т.к. эта оценка необходима в целях корректировки хода селекционного процесса при селекции на устойчивость к фузариозу. По результатам оценки коллекции 55% образцов было отнесено к средневосприимчивым, 32% - к устойчивым, 13% - к силь невосприимчивым образцам.

В таблице 5 представлены устойчивые образцы, из них максимально устойчивы: Олимпиец Fi.Zong White №1414, Riesen verbesserte wersse №220, которые можно использовать в качестве исходного материала при создании устойчивых к этому патогену сортов.

Таблица 5

Оценка коллекционных и селекционных образцов столовой моркови на устойчивость к Alternaría radicina.

образец Количество пораженных растений % Степень развигия болезни % Степень устойчивости по шкале СЭВ (1-9 баллов) иммунологическая Характеристика

Леандр st 50 20 7 устойчивый

Олимпиец Fi 15,4 25 7 устойчивый

Riesen verbesserte wersse J&220 52,3 17,6 7 устойчивый

Zong White №1414 22,8 22,8 7 устойчивый

Голландская желтая Xsl382 24,4 24,4 7 устойчивый

Местная №2418 43,7 21,4 7 устойчивый

Местная №2368 40,9 22,1 7 устойчивый

69011 34,4 24 7 устойчивый

HCPn* „„„,„■, 6,3 6,8

Применение клеточной селекции в оценке и отборе устойчивых к Fusarium avertaceum клеточных популяции » получение растений - регенерантов.

Кроме традиционных методов оценки и отбора мы использовали клеточную селекцию, при которой в жестких селективных условиях выживает лишь определенный мутздггный тип клеток. Для проведения работ по селекции растений in vitro в качестве объекта исследований мы использовали каллусную культуру, так как она представляет собой легко доступный материал и на протяжении ряда субкультивн-рований не утрачивает способность к регенерации.

При получении каллусной ткани изучали зависимость каллу со ге-неза от генотипа и используемого первичного экспланта, в качестве которых использовали сегменты листовых черешков, гипокотильные сегменты и диски, изолированные из сердцевидной ткани корнеплода (Рис. 2).

Способность, первичного экспланта к каплусогенезу.

□Диски корнеплода

И гипокотильные

сегменты □ Сегменты черешков__

Рис.2.

Из рисунка видна зависимость между каллусообразованием и типом первичного экспланта. Наиболее интенсивный каллусогенез наблюдали у эксплантов изолированных с пшокотильных сегментов. Причем этот процесс не зависел от исследуемого генотипа. Это, вероятно, обусловлено тем, что гипокотили состоят из пзренхимных клеток и тканей проводящей системы, клетки которых способны хорошо переходить в дедиферияшгрованиое состояние.

и

Интенсивность образования каллусной ткани можно определить по приросту сырой биомассы каллуса (Рис.3). Масса каллусной ткани сорта Витаминная 6 и линии 200П составила соответственно 256,8мг и 294,4мг, а для линий 1585В и ЗВ и сортов Леанзр И Нюанс - 786,9мг, 724,3мг, 75б.бмг, 778,1мг, соответственно. Причем при культивировании каллусной ткани генотипов Витаминной б и линии 200П в течение последующих 3-х пассажей наблюдалось снижение активности роста.

Сырая биомасса каллусной ткани в конце пассажа.

□ Витаминная 6

□ 200П

□ 1585В

□ 8В

□Леандр ■ Нюанс

генотип

Рис. 3.

В качестве селективного фактора использовали куль тур альный фильтрат (КФ) гриба Fusarium avenaceum.

Получение КФ гриба осуществляли путем культивирования патогена в жидкой питательной среде Чапека.

В работе испытывали влияние 5-ти разных концентраций культураль-ного фильтрата на пролиферацию халлусных клеток, и подбирали концентрацию, при которой клеточная селекция на устойчивость к патогену эффективна (Таб.б). Контролем служила питательная среда, не содержащая КФ патогена.

Из таблицы 6 видно, что культур альный фильтрат в низких концентрациях не оказывал существенного ингибирования на рост и развитие каллусной ткани. Повышенные концентрации КФ гриба (40% и 50%) в питательной среде снижали жизнеспособность каллусной ткани в 3 раза по сравнению с контролем. Из 4-х изучаемых генотипов самая достоверно наименьшая жизнеспособность и наименьший прирост

каляусной ткаки наблюдался у линии 8В. При культивировании кал-лусной ткани на питательной среде, содержащей КФ в концентрации 30%, жизнеспособность составила 42,2%, а прирост каллусной ткани по отношению к контролю — 55,9%. В этом варианте лучшие показатели были отмечены • для сорта Леандр.

Таблица6

Прирост и жизнеспособность каллусной ткани при различных концентрациях кулътурального фильтрата гриба Fusarium avenaceum

Образец Концентр эацияКФ.'Л

0 10 20 30 40 50

1585В 96,2*5 85,6±3,5 68,3 ±4,6 46,3+4.9 21 ¿±4 20,3+2,9

SB 89,6+3 80,0+4 61,8+4,8 42,2+4,9 19,6i3,9 I4,3±3,2

Леандр 95,9+1,9 86,2 ±3,4 70,3±4,5 49,4±4,9 20.713,9 18,8+3,9

Нюанс 94,3+1,9 82,4+3,8 67,2+4,6 45,4+4,9 20,8t3,9 17,1+3,9

Выявленные экспериментально концентрации КФ были нами использованы в дальнейшей работе по клеточной селекции, которая предусматривает следующие этапы.

1. Культивирование каллусной ткани на селективной среде (концентрация КФ 30%, 40%) в течение 3-х месяцев.

2. Культивирование каллуса в течение одного пассажа на среде без КФ.

3. Культивирование каллусной ткани на селективной среде в течение 3-х месяцев (концентрация КФ 30%, 40%).

После проведения клеточной селекции, выжившие популяции клеток пересаживали на питательную среду для морфогенеза. В качестве индуктора морфогенеза использовали физиологически активные вещества б-БАП, 2ip, ПУК. В результате проведенного эксперимента наблюдалось образование адвентивных почек или соматических эмбрно-идов (Таб.7), Установлено, что только у линия 1585В, при добавлении в питательную среду щггокинина б-БАП происходило образование соматических эмбриоидов, в 95% случаев при использований в качестве первичного экспланта гипокотильных сегментов. Дня остальных гено-

типов морфогенетический потенциал реализовывался только через образование адвентивных почек.

Таблица 7

Влияние различных цнтокннинов на морфогенез каллусной

тканн моркови.

Генотип Вариант среды Первичный экспяант Тип морфогенеза, %

Адвентивные почки Соматический эмбриогенез

Леандр МС+6-БАП гипокотиль 50 -

сегменты корнеплода 45 -

МС+2ІР+ИУК гипокотиль 47 -

1585В МС +6-БАП гипокотиль 5 95

сегменты корнеплода 62 -

МС+2ІР+ИУК гипокотиль 60 -

Для формирования полноценных растений, меристематнческие ткани были перенесены в пробирки на жидкую питательную среду. В этих условиях выращивания наблюдался рост побегов и формирование растений с нормальной морфологией. В таблице 8 представлены данные о числе полученных растений регенерантов после клеточной селекции.

Таблица 8.

Число растений- регенераитов моркови, полученных после кле-

точной селекции.

Генотип Схема селекции Количество растений, шт.

1585В 3(30%КФ) 1{0КФ)4{30%КФ)* 125

3(40%КФ) 1(0КФ)4(40%КФ) ПО

8В 3(30%КФ) !(ОКФ>4(30%КФ) 40

3(40%КФ) 1(0КФ>4(40%КФ) 25

Леандр 3(40%КФ) 1{0КФ)4<40%КФ) 104

3(30%КФ) КОКФ)4(ЭО%КФ) 98

Нюанс 3(40%КФ) 1 (ОКФ)4(40%КФ) 112

3(30%КФ) 1(0КФ)4(30»/оКФ) 106

Примечание* 3,1,4, число пассажей, 40%,30% - концентрация КФ.

Выбранные схемы селекции способствовали получению расте-ний-регенерантов. Причем наибольшей способностью к регенерации

Ii

растений из каллусной ткани обладала линии 1585В, для которой была характерна высокая морфогенетическая активность клеток на всех этапах селекции in vitro,

Растения-регенеранты полученные из каллусной ткани, прошедшей отбор клеток в селективных условиях, были проверены на устойчивость к патогену, т.к устойчивость клетки не всегда эквивалентна устойчивости интактного растения. Для оценки растения-регенераты культивировали на питательной среде, содержащей КФ патогена в концентрации 80%(Таб. 9).

Таблица 9

Сравнительная оценка устойчивости растеннй-рсгенерантов на питательной среде, содержащей КФ Fusarium avenaceum, в концентрации 80%. rt=100.

(схема селекции 3(40%КФ) 1 (0КФ)4(40%КФ))

Образец Поражено растений, % Степень поражения растений, %

Линия 3585В

Исходное растение 100 82,3

Контроль Rq 80,0 66,5

Roc 50,0 30,0

Леандр

Исходное растение 90,0 80,1

Контроль Ro 78,3 60,0

Rie 48,2 32,4

Ro- растения-регенеранты контрольного варианта.

Roc - растен ця-регенеранти после селекции in vitro.

Данные таблицы 9 свидетельствуют о том, что растения после клеточной селекции обладают устойчивостью к токсинам гриба Fusa' rium avenaceum, по сравнению с исходным генотипом.

Растения-регшеранты после лабораторной оценки, а также исходные растения (выращенные из семян), были высажены в вегетативные сосуды с почвой отобранной на инфекционном фоне. В этих условиях их выращивали в течение 2-х месяцев. На протяжении этого пе-

риода отмечалась гибель растительного материала, полученного в условиях in vitro, в 20% случаев. В то время как в контрольном варианте гибель растений составляла 40-50%.

Оставшиеся, устойчивые расгения-регенеранты после яровизации были высажены в теплицу и впоследствии помещены под индивидуальные изоляторы. В результате самоопыления были получены семена. Таким образом, в результате селекции in vitro, были получены растения — регенераты моркови, обладающие повышенной устойчивостью к экзометаболитам гриба Fusarium avenaceum в 20-25% случаев, по отношению к исходному генотипу,

Выводы.

1. Установлено, что грибы рода Fusarium в производственных условиях ОПХ «Быково» Рамепского района занимают одно из ведущих мест по распространенности и вредоносности в патогенезе семенных растений моркови до 11,7%, заражение семян составляет 7,4%. При хранении маточников процент поражения корнеплодов равен 9,2%.

2. Установлено, что в период вегетации наибольшую устойчивость к фузариозу проявляют образцы сортотипа Парижская каротель, а при уборке корнеплодов - образцы сортотипа Нантская.

3. В результате оценки при искусственном заражении из 50 образцов столовой моркови выделены три источника устойчивости к фузариозу и альтернаришу (Олимпиец Fj, Zong White Xa 1414, Riesen verbesserte wersse №220), а также к фузариозу -2 устойчивые линии 1238П и 8В, а к альтернариозу линия 906.

4. Усовершенствованная система методов оценки устойчивости, сочетающая 2 экспресс-метода и оценку на искусственном инфекционном фоне, на устойчивость моркови к Fusarium avenaceum, позволяет проводить предварительную оценку и отбор устойчивых образцов в удобное для селекционера время.

5. Установлено, что оценка образцов на устойчивость к фузариозу с помощью экспресс-методов на проростках моркови, коррелирует с соответствующими показателями, полученными на искусственном инфекционном фоне (г= +0,82) и с оценкой устойчивости при заражение в естественных условиях(г= +0,76). При оценке дисков

изолированных с корнеплодов коэффициент корреляция составляет +0,62.

6. Установлено, что культивирование каллусной ткани моркови на питательной среде, содержащей КФ гриба Fusarium avenaceum в концентрации. 30-40%, позволяет получить растения-регенеранты с1 повышенной устойчивостью к экзометаболитам этого патогена.

7. Проверка растений-регенерантов сорта Леандр и линии 1585В, на искусственном инфекционном фоне показала их повышенную устойчивость К Fusarium avenaceum в 20-25% случаев, по сравнению с исходным генотипом.

Практические рекомендации.

1. Выявленные образцы столовой моркови устойчивые к фуза-рпозу и альтсрнариозу рекомендуются для использования в селекции на устойчивость к этим патогенам.

2. Гибрид F¡Олимпиец, проявивший высокую устойчивость к фу-зариозу при различных условиях заражения, рекомендуется использовать для выращивания в хозяйствах, где фузариоз моркови является экономически значимым заболеванием.

3. Представленная в работе система экспресс-методов оценки исходного материала моркови (оценка проростков моркови и сегментов, изолированных с корнеплода) рекомендуются для использования в научных учреждениях, занимающихся селекцией столовой моркови.

4. Разработанные элементы методики клеточной селекции моркови на устойчивость к Fusarium avenaceum, позволяют получать исходный материал моркови устойчивый к этому патогену, который может использоваться для дальнейшей селекционной работы.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Платова 113. Калашникова Е.А. Влияние веществ с цитокини-новой активностью и первичного экспланта на процесс регенерации растений моркови // Доклады третьей международной конференции посвященной памяти Б.В. Кваснккова. — М-2003,. С. 513-514.

2. Ипатова H.B. Основные вилы патогенов на столовой моркови и распространение фузариоза //Доклады третьей международной конференции посвященной памяти Б.В. Квасиикова. ВНИИО. - М-2003,. С. 208-209.

3. Лебедева Т.Н., Ильченко О.В., Ипатова Н.В., Поляков A.B. Оценка генотипов моркови различного географического происхождения на устойчивость к фуэариозу и альтернариозу в условиях искусственного инфекционного фона // Современные системы защиты растений и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии/ материалы Всероссийского совещания. Голн цино-2003С.61-63.

4. Калашникова Е.А., Ипатова Н.В. Влияние вторичных метаболитов гриба Fusarium aveweeum на рост каллусной ткани моркови // Овощеводство: состояние, проблемы, перспективы /научн. тр. ВНИИО,- М-2001, Т.-2.- C.-100-I03.

5. Леунов В.И., Клыгина Т.Э., Сапелкина С.Д., Ипатова Н.В. Изучение физиологически активных веществ при гибридном семеноводстве моркови // Материалы докладов международной научной конференции молодых ученых-овощеводов. ВНИИО.- М-1999,- С. 67-74.

6. Ипатова Н.В. Основные болезни моркови н меры борьбы с ними// Картофель и овощи. - 2002.- № 8.- С.26-27.

7. Клыгина Т.Э., Леунов В.И., Ипатова Н.В. Новые подходы в селекции и семеноводстве моркови. // Приоритетные направления в селекции и семеноводстве с.-х. растений в 21 веке. /сб. тр. ВНИИССОК.-М.-2003.- С.-203.

Уел, печ. л. Цб Зак. 182 Тираж ЮОэкз.

AHO «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44