Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Физиолого-биохимические особенности взаимодействия томатов с Alternaria Solani (Ell. et Mart.) Sor. и селекция in vitro на устойчивость в альтернариозу

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-биохимические особенности взаимодействия томатов с Alternaria Solani (Ell. et Mart.) Sor. и селекция in vitro на устойчивость в альтернариозу"

ВСЕРОССИИСКШ НАУШО-ИСаВДОВАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИИ

РГ8 ОД На правах рукописи

ш5 т

АВРОВА Айна Олеговна

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМКЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ГОАШОДЕИСТВИЯ ТОМАТОВ С ALTEHNARIA SOLAN1 (ELL. ET HART.) SOB. И СЕЛЕКЦИЯ IN VITRO НА УСТОЙЧИВОСТЬ К АЛЬТЕРНАРИОЗУ

Специальность: 06.01.11 - Защита растении от вредителей

и болезней

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1994

Работа выполнена в лаборатории фитотоксикологии Всероссийского научно-исследовательского института зашиты растении и в лабораторий биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им.Н.И.Вавилова. •

1

Научные руководители: кандидат биологических наук С.Л.Тютерев и кандидат биологических наук О.Г.Козырева.

Официальные оппоненты; член-корреспондент РАСХН, доктор биологических наук, профессор М.М.Левитин и кандидат биологических наук Л.В.Прелхж •

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургский Государственный Аграрный Универоигет

Защита диссертации состойся ^.-гг^г^г 1004 г. в

"¿¿>и часов на заседании Специализированного совета Д.020.01.01. во Всероссийском ваучно-исследовательскон институте защиты растения по адресу: 180630, Санкт-Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, 3.

О диссертацией можво ознакомиться в библиотеке ВИВР.

Автореферат разослан и/<?и

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

^ 1994 г.

Г.А.Наседкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Методы•культуры тканей ширико используются в селекции болезнеустойчивых сельскохозяйственных растении. Применение этих методов позволяет индуцировать генетическую изменчивость и ускоренно отобрать Формы с необходимыми свойствами, сохраняя при этом генотишческую основу сорта. Выявление таких Форм обеспечивается использованием селективного Фактора, правильный выбор которого требует предварительного изучения механизмов взаимодействия патоген-хозяин. Это особенно важно в случае необли-гатных патогенов, it которым относится возбудитель рэннея сухой пятнистости томатов Alternaria aolani (Ell. et Hart.) Sor. У НеГО не обнаружено хозпино-спешФичных токсинов, на Фоне которых можно было бы проводить отбор устойчивых Форм. Кулътуральные Фильтрата этого гриба, как и других патогенов, способных к сапрофитному способу существования, содержат большое количество метаболитов, но связанных с процессом патогенеза. Все это указывает на актуальность изучения физиолого-биохимических особенностей патогенеза . и разработки на их основе методов отбора Форм томата, устойчивых к возбудителям грибных заболеваний, и, в частности, к A.soiani.

Цель и задачи исследовании. Цель работы состояла в изучении биохимических особенностей взаимодействия томатов с A.soiani и проведению! селекции in vitro на устойчивость к альтернариозу. Для осуществления этой цели предстояло решить следующие задачи: 1) дать сравнительную характеристику коллекционных штаммов и ■ изо-лятов A.eoiani по культуральным, биохимическим и Фитопатолсгиче-ским признакам» 2) изучить биохимические особенности взаимодействия томата и A.eoianii 3) разработать способ восстановления агрессивности коллекционных штаммов A.soiani после их длительного культивирования на искусственных питательных средах; 4) получить Фактор отбора в культуре in vitro, обладающий высокой стошнью фитотоксичности и специфичности действия на ткани растении томата; 5) проверить действие селективного Фактора на известных сортах с разной степенью восприимчивости к A.soianij 6) разработать метод отбора регенерантов томата, устойчивых к альтернариозуг 7) провести отбор в культуре in vitro Форм томатов, устойчивых к A.Bolanij 8) получить семенное потомство 'растений-регенерантов и провести оценку по устойчивости к использованному селективному Фактору in vitrot 9) оценить семенное потомство регенерантов по' устойчивости к патогену общепринятыми Фитопатологическими методами. .•

Научная новизна работы заключается в использовании комплекса методов, в том числе культуры in vitro для изучения биохимических особенностей взаимодействия томатов с A.soiani. Впервые предложен метод культивирования A.soiani в стандартных условиях на каллуснои ткани томата, приводящий к значительному усилению синтеза грибом шготоксичных поликетидных пигментов и существенному повышению агрессивности патогена, которую он постепенно утрачивал при росте на искусственных питательных средах. Благодаря высокой изменчивости свойственной этому грибу выращивание на каллусной ткани томата позволило на основе одного коллекционного штамма получить 7 изоля-тов, по своим свойствам соответствующих различным группам, составляющим природную популяцию патогена. На основании проведенных исследований разработана схема отбора и последующей оценки в культуре in vitro Форм томата, УСТОЙЧИВЫХ к A.soiani. СвЛбЩИЮ ПРОВОДИЛИ на фоне автоклавирсванного гомогената мицелия гриба с остатками каллусной ткани, на которой он выращивался. Специфичность действия этого Фактора в культуре in vitro проверена на известных сортах томата с различной степенью восприимчивости к A.eoiani. В результате селекции на основе восприимчивого сорта Талалихин-188 получены Формы томата, устойчивые к действию комплекса метаболитов патогена, участвующих в процессе патогенеза. Показано сохранение этой устойчивости в 1-м и 2-м семенном потомстве от самоопыления расте-ний-регхшерантов. В результате оценки в( и кг на устойчивость к A.soiani стандартными Фитопатологическими методами отобраны отно-' синельно устойчивые к этому патогену семьк. Впервые в результате изучения биохимических особенностей процесса патогенеза A.soiani на томатах установлена корреляция уровня индукции грибом активности растительной г'-глюкозидазы со степенью восприимчивости сорта, Эта закономерность сохранилась и у семенного потомства полученных расгении-ретнерантов.

Практиктическая значимгсть. На основании результатов исследовании разработана схема отбора и предварительной оценки в культуре -in vitro Форм томата, устойчивых к A.soiani. Предлагается биохимический тест для оценки устойчивости сортов томата к A.soiani по уровню активности /J-глюкозидазы, индуцируемой в тканях листьев при инокуляции патогеном. Разработан метод поддержания и быстрого восстановления агрессивности изолятоэ и коллекционных штаммов A.soiani путем выращивания их на каллусной ткани томата.

Апробация работа. Результаты работа были представлены на Кон-»орзнции аспирантов и молодых научных сотрудников ВИР им. Н.И.Ва-

вилова (1092. 1993), Годичном общем собрании Отделения защиты растения РАСХН 17.02.93; и Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1993) и и Международной конференции "Биология к: тьтивируемых клеток растений и биотехнология" (Алма-Ата, 1993).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, Б работ находятся в печати.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 14,9 страницах машинописного текста и состоит из введения, кости глав, выводов, рекомендации и списка литературы. Работа иллюстрирована 22 рисунками и 25 таблицами. Библиография включает 200 источников, БО из них на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2. Объекты и методы исследования. Исследования проводили в течение 1991-1993 гг. в лаборатории фитотоксикологии Всероссийского института запиты растений и в лаборатории биотехнологии Всероссийского института растениеводства им. Н.И.Вавилова.

В исследования были включены 12 сортов томата с различной восприимчивостью к A.soiani из коллекции ВИР им Н.И.Вавилова; 3 быстрорастущие каллусные линии томата Lycoperaicon peruvianum Mill.J 3 коллекционных штамма гриба Alternarla solani (Ell^ et Mart.) sor. из коллекций типовых культур микроорганизмов ВНИИСХМ (Ст.-Петербург), института физиологии и биохимии микроорганизмов (Москва) и института ботаники АН Литвы (Вильнюс), и изоляты, выделенные из листьев растения картоФвля в Ленинградской области.

Грибы выращивали на агаризованных картоФельно-сахарозаои среде, среде v-8 и среде Чапека в чашках Петри в темноте при 24-26°С. Споры A.soiani получали ПО МОТОДУ Шахина (Shahin et al.,1979). Каллусные линии томата выращивали в чашках Петри на модифицированной среде ЕМС в темноте при 24-28°С (Козырева и др.,1989). Пересов и инокуляцию калдусов проводили на 20-е сутки в конце экспоненциальной Фазы роста.

Агроссивность штаммов И изолятов A.soiani определяли по модифицированному нами методу Воллмана (Wcllman,1943) с 13-ти бэлльпоя шкалой. Оценку проводили на 6-е сутки после инокуляции.

Аналогично оценивали агроссивность A.soiani, выращенного на кэллусной ткани томата, и Фитотоксичоскую активность гомогоната мицелии зтого гриба и ого t-ракцин. При определении Фитотоксическои активности иродгмричолыю повреждали листики методом укола.

\

; 4 Активность /з-глкжооицазы в экстрактах определяли с использованием п-нитрофбщин'-глюкошфанозида (Scbl«saer, 1977 ). КОЛИЧЕСТВО высвобождаемого из субстрата п-нитроФенола определяли спектрофото-метрически при 430 нм. Удельная активность фермента выражена в мкмоль/мин/мг белка.

Грубы© препараты внеклеточных липидов получали по методу АЙЗИНОЯ (1977), а ПОЛЯрНЫХ ПОЛИКеТИДОВ ПО ШТОЗССЛУ (Stoessl, 1968), Фракции метаболитов разделяли методами тонкослойной хроматографии на пластинках "Силуфол УФ954" в системе хлороформ : метанол : 90 Ж-ная муравьиная кислота '(65:5:2 по объему) и высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенно-фазным сорбентом Хаипорсил ОДС Фирмы Шзндон Саутерн, подвижной Фазой метанол : вода (0:1), Идентификацию соединении проводили по спектрам поглощения и коэффициентам молярной экстинкции б сравнении с известными из литературы данными.

Отбор устойчивых к альтернариозу Форм томата проводили в культуре первичных оксплантов на среде МС для регенерации, содержащей 1,5 мг/л кинетина и 0,2 мг/л ИУК.

Статистическую обработку результатов проводили стандартными методами дисперсионного и корреляционного анализа по Рокицкому (1667), Воробьеву (1989) и с использованием пакета программ

St&tgraphicb vere.3.

3, Сравнительная характеристика культуральных. биохимических и.ч'ш'опатолдгичорких свойств колтакдаонвы?. штаммов и иэрлятрв Aiternaria aoiahi. В результате проведения A.soiani (Ленинградскии штамм) через каллусную ткань томата было получено 7 реизолятов, отличающихся по своим культуральным и Физиологическим свойствам: в частности, окраске колоний и среды (Табл.1)» По этим признакам ре-изоляты и штаммы можно разделить на 3 группы: 1)пигментированные, выделяющие 6 среду краено-оранжэвЫо пигменты» 2)темноокрашенные, fie выделяющие в среду пигментыi 3)неокрашенные, с непигментирован-нои средой. Коллекционные штаммы Ленинградский, Московский и вильнюсский входят в группу 2. Существенных различии в скорости роста штаммов и реизолятов обнаружено не было. Полученные реизоляты По описанию соответствуют МорФотипаМ, составляющим естественную популяцию A.soiani, характеристика которых Приводится в работах Дмитриевой (1988) и Ивэнюка (1991).

По своим культуральным признакам выделенные из листьев картофеля изоляты соответствовали реизолятэм Ленинградского штамма, полученным при пассаже через'каллусы томата. Их отличала лишь интен-

Таблица 1

Культуральные признаки коллекционных штаммов и изолятов л.ао1вп1

Споруляция

Штаммы и Окраска колонии Окраска среда на агаризо-

изоляты ваннои сре-

де Чашка

Коллекционные штаммы

Ленинградский серая свинцово-серэя отсутств,

Московский

ВИЛЬНЮССКИЙ ^ ч

Реизоляты Ленинградского штамма, полученные при пассаже через каллусы томата

К 1 розовато-Фиолетовая темно-красная ' К 2 розовато-серая каштановая -"К 3 серая оранжевая К 4 -"- свинцово-серая К Б- серовато-фиолетовая серовато-Фиолетовая -"К 8 серая оливково-серая -"К 7 белая не окрашена. ;

Изоляты, выделенные из пораженных листьев картофеля

Л 1 белая ' не окрашена слабая* Л 2 розовато-Фиолетовая темно-красная интенсива? Л 3 серая свинцово-серап Л 4 серая оранжевая Л б розовато-серая свинцово-серэя • -"Л 6 бурая розовато-Фиолетовая -"-

Реизолят Вильнюсского штамма

ар 1 черный погружен- темно-коричневая постоянная

ныя мицелия интенсивн.

* в течение 4-х пересевов после выделения из листьев картофеля

сивнал споруляция на агаризованной среде Чапека, сохранявшаяся в течение 4-х пересевов.

В процессе развития A.soiani образует широкий спектр полике-тшшых соединении, из которых идентифицированы альтерсолэнолы А и D, дактилариол, макроспорин. Выделенные в чистом виде альтерсолэнолы А и В составляли до 87 % от массы грубого препарата полике-тидных пигментов A.aolani. Их количество и соотношение во многом определяло окраску питательной среды, на которой выращивался гриб.

Культивирование гриба на каллусной ткани томата вызывало .переключение его метаболизма с синтеза липкцов на синтез фитоток-сичных галинетвдаых пигментов, (табл.2). Реизоляты -Ленинградского штамма К 1, К 2, К 3, К 5, К 6 сохранили способность выделять в среду Чапека большое количество пигментов. Среди них реиэолят К 1 образует 170-200 мг, а реизолят К 2 - 150-170 мг пигментов на чашку Петри, что более, чем в 500 раз превосходит продуктивность исходного штамма. Количество пигментов у этих реизолятов превосходит количество липидов в 140-160 раз.

Отмеченные изменения метаболизма A.soiani сопровождались существенным усилением его агрессивности. Степень поражения листьев томата возросла с 4,1 до 12,3 баллов по 13-ти балльной шкале. Очень сильное'поражение листьев вызывали пигментированные изоляты A.soiani независимо от их происхождения. Все они оказались почти в 3 раза агрессивнее Ленинградского коллекционного, штамма. Неокрашенный изолят Л 1, выделенный из листьев картофеля, оказался сов-' сек. не агрессивным. Степень поражения инокулированных им листьев составила О,4-балла. Это хорошо согласуется с данными других исследователей, отмечавших значительно большую агрессивность окрашенных культур a.soiani(Thomas,1943: Дмитриева,1988» Иванюк,1991).

Возможность быстрого восстановления агрессивности имеет большое значение для культур Факультативных патогенов, поддерживаемых в лабораторных условиях на искусственных питательных средах. Болео агрессивные штаммы гриба представляют интерес для использования как в- селекции на устойчивость к этому патогену, так и при оценке уже имеющихся сортов и вновь получаемых Ферм томата.

Alternaría soiani: изучение роли 0-глюкозидазы в процессе патогеНеза. Но основании существенного различия температурных оптимумов /1-глюкозидаз растительного и грибного происхождения установлено, что при заражении листьев томата a.solar i наблюдалась индукция Феркента растения-хозяина. Растительная природа /э-глюкозидэзы под-

Таблица 2

Образование экзометаболитов штаммами и изолятами д.зо1агп

Штаммы и изоляты гриба

Цвет пигмента,выде- Содержание,в мг на чашку Петри

ляемого в среду --

грубого препа- грубого препарата пигментов рата лштидов

Ленинградский

Московский

Вильнюсский

Гриб (Ленинградский штамм), выращенный на каллусах томата

Каллуснвя ткань (контроль)

нет пигментации

темно-красный

нет пигментации

Л 3 Л 4 Л в

нет пигментации оранжевый

0,49 + 0,002 86,6 + 2,7

0,61 0,003 80,9 ± 2.3

0,37 ± 0,001 93,1 V»

64,7 + 2,4* 5,9 ± 0,2

К 1 темно-красный 171,8 ± 5,2

К 2 каштановый 145,9 4,1

К 3 оранжевый 63,8 * 2,2

К б Фиолетовый 43,3 + 2,0

К в оливковый 51,4 + 2,1

К 7 нет пигментации 0

Л 1 0

Л 2 темно-красный 115,6 + 3,6

0,91 ± 0,06 36,4 ± 1,2

розовато-Фиолетовый 20,6 ± 0,7

2,4 ± 0,07

1.2 ± 0,04 0,9 ± 0,04

1.3 ± 0,05

3.4 ± 0,16 2,6 ± 0,11

4.0 ± 0,18 3.8 ± 0,16 3,2 ± 0,13

8,9 ± 0,39

4.1 ± 0,17 3,1 ± 0,14

* - содержание пигментов и липидов в 100 г сырой каллуснои массы с мицелием гриба. Содержание сухого вещества в быстрорастущих каллусах томата - 2,89 ± 0,11 % ; в гомогенэте мицелия гриба и остатков каллусов, на которых он выращивался - 3,74 • 0,31 % ! в содержимом 1 чашки Потри - 1,25 + о,06 г

твершдается ещо и тем, что обработка листьев томата автоклавиро-ваннои суспензией мицелия а.зо1ап1 также вызывала в них индукцию этого Фермента, хотя и в меньшой степени (табл.3). В данном случае со стороны гриба мы фактически имеем дело о индуктором г»-глюкозидазы, но никак не о самим Ферментом. Кроме того, индукция ¿э-глюкозвдазы наблюдается не только в зоне поражения, но и в удаленной от этой зоны ткани листьев томата без симптомов поражения, где гриб отсутствует.

При атом уровень индукции активности этого Фермента коррелировал со степенью восприимчивости сорта: активность (?-глюкоэидазы сильнее индуцировалась в листьях томата более восприимчивых к воздействию патогена сортов (табл.4). В листьях томата менее восприимчивых сортов уровень ^-глюкозидазнон активности несколько повышался при заражении и переставал изменяться с прекращением развития патогена, Следовательно, в данном случае повышение активности ^-глхжозидазы связано с чувствительностью к возбудителю заболевания. Для восьми исследованных оортов установлен достоверно-значимый коэффициент корреляции этих двух величин, равный 0,668 (Ро=0,007), На основании полученных данных эти сорта были разделены на 3 группы по степени их восприимчивости к А.воЛаш (табл.4). Устойчивая связь степени поражения листьев А.яо1ап1 и уровня индуцируемой в них ^-глюкозидазнои активности позволяет предложить использование етого метода в качестве теста на устойчивость.

Выращивание л.во1пп1 на каллуснои ткани томата значительно увеличивает его агрессивность и способность индуцировать активность /1-глюкозвдаэы по сравнению о культивированием на картофельной среде, во время которого снижается и агрессивность гриба (табл.3). Таким образом, агрессивность гриба связана о уровнем индуцируемой им /»-глюкоэидаэы, Это подтвердила и способность более агрессивных штаммов.А.во1аь1 сильнее индуцировать активность атого Фермента,

На основании результатов Изучений способности различных Фракции БАВ из мицелия А.во1ап1 индуцировать Р-глюкозидазную актив-■ ность в тканях томата и, принимая во внимание достаточно высокую активность, сохраняемую рядом Фракции после автоклавированш), можно предположить, что индуктором образования ^-глюкозидавы служит полисахарвдно-белковый комплекс гриба, хорошо растворимый в воде (табл.3). Один из компонентов итого комплекса отличается термостабильностью.

Таблица 3

Степень поражения лиотьев томата сорта Талалихин-186 и Г'-глюкоон-дазная активность в них при обработке различными Фракциями БАВ из мицелия А.яо1ап!

N

п/п

фракция

Степень Глюкозилазная активно мкмоль мин мг

поражения, активность, балл мкмоль ю -3

1 Контроль (дистиллированная вода) О 3.6 + 0.3

3 а Расторгай мицелии гриба, выращенный ъ

на жидкой картофельной среде 4,9 + 1,3 4,8 + 0,3

б мицелий после автоклавирования 2,9 + 0,6 2,9 + 0,2

? Диски мицелия гриба с агаризованнои

картофельной среды 6,9 + 1.1 9,2 + 1.1

4 а Расторгая мицелия гриба, выращенный

на каллуснои ткани томата 11,7 £ 2,7 24,0 ± 1.9

б Фильтрат,полученный из гомогената

мицелия 8,4 + 1.6 10,8 + 3,3

в осадок,полученный при Фильтровании

гомогената мицелия 7,3 + 2,6 . 10,3 + 1.8

г осадок,полученный при водной

, экстракции гомогената мицелия 3,8 + 0,8 3,8 + 0,2

д гомогенат мицелия после автокла-

вирования 9,4 + 1.3 0,3 + 0,1

е водный(экстракт гомогената мицелия 3,8 + 1.6 6,5 + 0.7

Ж спиртовой экотракт гомогената мицел. 1.7 + 0,9 4,2 + 0,3

з хлороФорменныи экстракт гомогената

мицелия, переведенный в воду 5,7 • + 1.0 5,3 ± 0,6

и водная Фракция гомогената мицелия,

доведенная до исходной концентраций 9,7 + 1.4 10,3 1.«

Б Фильтрат, полученный из гомогената

мицелия, после автоклавирования 7,7 V 1.8 Б, в + 0,3

6 Осадок, полученный при Фильтрован.

гомогенэтэ мицелия, после автоклав. 5,3 + 1.3 ьл 0,2

Таблица 4

Степень поражения листьов томата различных сортов и /?-глюкозвдаз-ная активность В НИХ при инокуляции А.ео1ап1

Сорт \ Число Степень Глюкозицазная активность,

листьев поражения ,(мкмоль/мин/мг белка) 10 "

1 балл в незаражен-ных листьях в зараженных листьях

1.Слабовосприимчивый

Devon surprise 30 2,0 2,4 2,5

2.Средневосприимчивые:

Campbcll-33 20 3,2 2,7 3,5

Кросс-525 20 3,3 3,7 4,2

Среднее ( • 3,25 3,2 3,8

3.Сильновосприимчивые:

Черный принц 20 4*2 4,6 6,2

Вировскии скорасп. 20 4,4 2,8 6,1

Талалихин-18в 30 5,2 2,6 7,1

Бычье сердце 30 5,8 3,7 6,3

Белый налив 30 5,8 2,4 5,6

Среднее 5,0 . . 3,2 6,2

НСР0,9Б 1,3 0,7 1,5

Б. Селекция ln vi tro томатов на УСТОЙЧИВОСТЬ К Alternarla aoiani. Гомогенат, полученный из мицелия A.soiani через в суток выращения на каллусной ткани томата, вносили в среду для регенерации перед автоклавированием. Высаживая акспланты томата на среду с различными концентрациями гомогената мицелия, исследовали его влияние на рост и морфогенез тканей сортов, проявивших различную чувствительность к патогену при инокуляции листьев интактных растений. Установлено, что даже невысокие концентрации селективного Фактора (СФ) (до 0,5 % в расчете на сырую массу мицелия) подавляли

и каллусогеиез и регенерацию эксплэнтов всех сортов томата. Лишь немногие из помещенных на среду с СФ экспланты давали начало единичным регенерантам, в то время как каллусы, полученные из эксплэнтов на исходной среда, отличались множественной регенерацией. С увеличением концентрации гомогената мицелия A.soiani в среде замедлялся и полностью прекращался процесс калдусообрэзованил и регенерации. на эксплзнтэх появлялись некрозы. При этом в рэспредэ-лении сортов по чувствительности к воздействию СФ в культуре in vitro наблюдалась та ко закономерность, что и при инокуляции листьев интактных растении: экспланты болое восприимчивых к д.яо-lani сортов томата сильнее реагировали на воздействие СФ (рис.1.).

Концентрация селективного Фактора в среде, в % по сыроя массе мицелия

Ркс.1. Зависимость регенерации из каллусов семядолей от концентрации селективного Фактора в среде' Сорта томата:

а—а - Devon surprise. т « - Campbell-ЗЭ,

л—л - Белый налив, *—* - Талалихин-186

I - доверительный интервал (Р0 - 0,05)

Таким образом, полученный нами Фактор обладает необходимой для проведения отбора фитотоксичностью. и специфичностью действия, которая мотет бьггь использована в условиях культуры in vitro. Это связано с тем, что развиваясь на каллусной ткани томата, a. eolani синтезирует и экокретирует оольшинство вторичных метаболитов, образуемых им при поражении растении томата. Поэтому, используемый нами СФ содержит метаболиты a.eolani, участвующие в процессе патогенеза, и Фитотоксичные вторичные метаболиты растения-хозяина, конститутивно присутствующие в клетках растения и вырабатывающиеся в ответ на заражение. Все это приближает клетки эксплантов, погруженных в среду 0 СФ, к условиям,в которых они находятся in vivo при заражении растения томата этим патогеном.

Селекцию in vitro на устойчивость к A.soiuni проводили в соответствии со схемой, представленной на рисунке 2. Исходным материалом служил высокоурожайный районированный сорт Талалихин-186, известный из литературы как чувствительный к л.eolani. В наших экспериментах этот сорт также проявил высокую восприимчивость к патогену при использовании всего комплекса методов оценки. Отбор устойчивых Форм проводили в каллусной культуре.первичных эксплантов по их способности к регенерации в присутствии СФ.

. В качестве СФ использовали гомогенат каллусной ткани томата с мицелием A.soinni, взятой через 2, 4, и Б суток после инокуляции. Контролями служили исходная среда и среда, содержащая гомогенат неинокулированной каллусной ткани томата. Было получено 364 расте-пиа-регекеранта. Многие из них имели морфологические дефекты. Иногда клэткискаллуса давали начало отдельным листьям, а не целому растению. Полученные на контрольных средах и на Фоне перечисленных СФ 60 растений без видимых морфологических отклонении высадили в почву. Из этих растений 39 -успешно прошли стадию адаптации. Развитие растений проходило нормально. Никаких .отклонении по морфологии от исходного сорта не наблюдали. Получено жизнеспособное семенное потомство Bj. к2 и н3 от самоопыления растении-регенерантов.

■р. Опенка сохранности признака устойчивости в потомстве растений -рогенорантов . При-оценке sj на Фоне наиболее фитотоксичного Фактора наблюдалось значительное увеличение доли эксплантов с регенерацией в контроле (у потомства растений, полученных без использования СФ) -(табл.5). Таким образом, почти двукратное повышение устойчивости к селективному Фактору,rio сравнению с исходным сортом (с 28,8 до 51,1 % ) может являться следствием сомаклональ-ное изменчивости. Показано превышение в сравнении с контролем ус-

-— Семена томата

I

Стерилизация (30 % Н-,0о > Проращивание на МСО

Вычленение эксплантов из семядолей и ггоокотилеи проростков

проросток

Помещение эксплантов на среду МС для регенерации, содержащую селективный Фактор (автоклавированныи гомогенат, полученный из мицелия А.зо1ап1, выращенного на каллусной ткани томата)

окспланты

Получение растения-регенерантов к

рогенеранты

Подращивание и укоренение на МСО

Микроклональноо размножение

Высадка в почву'

Получение семенного потомства н^ п2>

Проверка Rj и r2 in vitro на устойчивость к селективному Фактору

Оценка в) и п2 на устойчивость к А.во1ап1 стандартными Фитопатологическими мотодами

Рис.2.Схема использования методов культури тканой в солоккии томатов на устойчивость к а.чо1пп1

тойчивости к СФ потомства регенерантов, отобранных на его Фоне.

СелоктивЬый Эффект обнаружен и при использовании менее фито-токсичного фактора (автоклавированного гомогената мицелия гриба, полученного на 4-е сутки выращивания на каллуснои ткани томата). Поскольку доля эксплантов с регенерацией на исходной среде колебалась от 80 до 65 % для разных вариантов, имеет смысл рассматривать увеличение процента регенерировавших эксплантов относительно контрольного значения для этого варианта (табл.5).

Особый интерес представляет посемейный анализ потомства, показавший, что у большинства проверенных растения-регенерантов устойчивость к селективным Факторам является наследуемой. Помимо этого, потомство некоторых регенерантов проявило устойчивость к фактору более Фитотоксичному, чем использованный при отборе.

В первом поколении выявлено 17 семей, у которых более 70 % (относительно контроля) эксплантов, дали начало регенерантам на среде с наиболее фототоксичным СФ (табл.6). Такие семьи встречались во всех грушах, однако с увеличением фитотоксичности Фактора, использованного при отборе. Частота появления устойчивых Форм возрастала о 37,5 % в группе семей регенерантов, полученных на исходной среде, до 75 Ж в группе семей регенерантов, отобранных на Фоне наиболее фитотоксичного Фактора.

В r2 в из 9 исследованных семей . сохранили высокую устойчивость к комплексу метаболитов. При индивидуальной оценке потомства каждого го 4-х растений н^ относящихся к семье НО, потомство 3-х растений проявило абсолютную устойчивость к Фактору отбора (100 % эксплантов дали начало регенерантам), а потомство четвертого растения оказалось веоьма чувствительным (всего 47,4 % , относительно контроля, эксплантов дали, начало регенерантам).

После предварительной проверки в культуре in vitro отобранные Формы оценили по устойчивости к самому патогену. В Первом поколении из 17-ти проверенных семей» отличающихся высокой степенью устойчивости К воздействию Фактора отбора in vitro, 12 оказались значительно более устойчивыми к воздействию самого патогена, чем исходный сорт (табл.6). У растений этих сеМеи наблюдалось снижение среднего балла поражения листьев, по меньшей мере в 2 раза. У растений еще двух семей степень поражений листьев составляла 65-70 % от уровня исходного сорта. Листья растения# принадлежащих к остальным трем семьям» поражались в той же мере, что и исходный сорт.

Таблица 5

Устойчивость к селективному Фактору*семенного потомствз (н ) рего-нерантов томата и исходного сорта Талалихин-186

Фактор,исполь- Исходная среда Среда с Фактором Число реге-

зованныи при «контроль)_ отбора норировав-

otöodg к ЧИСЛ0 ЧтЛ0 РС'~ ЧИСЛ0 ЧИСЛ0 Р°- ших пкгп.лян-

uroope Ho эксплан- генериро- эксплан- генериро- ших зксплан

tob и вавших тов н вавших тов, % к

эксплан- t эксплан-,, KrmTnnnn **

TOB, Di" тов, в % контролю

Контроль 1 114 87,7 79 25,3 28,0

(исходами

сорт) (83,3-89,5) (21,7-31,3) (24,8-34,8)

Контроль 2 230 92,4 239 47,2' 51,1

(без Фактора

отборэ) (89,9-93,4) (44,0-50,4) (47,9-54,3)

Гомогенат ' 242 93,2 243 55,7 59,8 .

каллуснои

тлани томата (90,9-94,1) (52,4-58,9) (56,5-62,8)

Гомогенат 132 94,2 113 52,9 5G.2

каллуснои (48,2-57,4) (49,7-60,6)

ткани с ми- (00,8-95,0)

целием гриба

через 2 суток

после инокул.

Гомогенат 117 80,4 117 51,9 64,0

каллуснои (47,3-56,4) (59,8-68,5)

ткани с ми- (7G,8-82,0)

целием гриба

через 4 суток

после инокул.

Гомогенат 242 94,7 215 67,1 70,9

каллуснои (63,6-70,7) (67,4-73,6)

ткани с ми- (92,5-95,4)

целием гриба

через 6 суток

после инокул.

« Гомогенат каллуснои ткани с мицелием гриба чорез 6 суток после инокуляции

** В скобках приведены доверительные интервалы при Р0 = 0,05

Гаолша 6

Оценка семенного потомства растенш-рогонерантов сорта Талалихин-18(3 ПО устойчивости к A. so J an i

Тест в культуоо Фитопатологическая ИСХОДНЫЙ сорт '-1ИСЛО про- in vitro " OUOHKQ

и поколения аналиаиро----------

рогенерантов ванных Число Уровень Число Степень

семей устоичи- усгоичи- устоичи- поражения

вых семой вости, % вых семей листьев,

баллы

Талалихин-186 21 - 27 8.2 - 9.0

Ri 30 17 72 - 100 ' 12 0,4 п ty

О 5.3 - 0,0

К2 26 9 95 - 1U0 7 ■Ц п О г «-* - G.4

Данные Фитопатологическои оценки подтвердил и /э-глмкозадззныя тост: слабому поражению листьев растения билее устойчивых семей соответствовало и незначительное изменение активности растительной /'-глкжозидзоы при инокуляции A.soinni. Эта зависимость характеризуется коаФФШиентом корреляции 0,840, достоверным при .уровне значимости больше 0,05.

Проверка сохранности признака устойчивости к a.solani в к„ некоторых регенерантов позволила выявить пять относительно устойчивых СОМОЙ. Кроме ТОГО, В Н„ УСТОЙЧИВОСТЬ К А.solani проявилась' еще в двух семьях.

Посколы{у изучаемый СФ представляет собой комплекс метаболитов. образующихся при взаимодействии патоген-хозяин, отобранные растения могут иметь различные механизмы устойчивости. В дальнейшем, на основании разработанного комплекса методов, возможно изучение роли отдельных компонентов в процессе патогенеза с целью выявления веществ, устойчивость к которым определяла оы устойчивость к возбудите.™ заболевания.

вывода

1. При выращивании на наллуснои ткани томата на основе одного коллекционного штамма гриба a.solani с гетерокариотическим типом мицелия подучены Формы, по своим свойствам соответствующие основным монотипам, составляющим природную популяцию патогеиа.

2. Плцобрэны условия поддержания и оыстрого восстановления агрессивности КОЛЛРКШОШ1ЫХ штаммов A.soinni после длительного

культивирования их на искусственных питательных средах. ..о достигается путем выращивания гриба на быстрорастущих каллусах томата.

3. Выращивание A.soiani на каллуснои ткани томата способствует переключению биосинтеза с образования грлбом свободных липидов, в частности эргостерина, на синтез фитотоксичных поликетидных пигментов, в основном альтерсоланолов А и В, содержание и соотношение которых определяет окраску колоний и среды. Накопление этих фито-токсинов приводит к усилению агрессивности гриба.

4. Обнаружена высокая корреляция степени чувствительности растений томата различных сортов к A.soiani с .уровнем активности /э-глюкозидазы, индуцируемой в листьях при заражении. Онэ^ выражается в повышении активности отого Фермента в процессе патогенеза у восприимчивых и сохранении низкого уровня его активности о тканях относительно устойчивых растений. На основании этого разработан биохимический тест на УСТОЙЧИВОСТЬ К A.soiani.

5. Показаны высокая фитотоксичность и специфичность действия гомогената мицелия A.soiani на ткани растений томата. Большинство содержащихся в нем фитотоксичных соединений водорастворимы и термостабильны. Установлена специфичность действия гомогената мицелия на регенерацию в культуре in vitro первичных эксплантов сортов томата с различной восприимчивостью к A.soiani.

6. Разработан метод отбора и предварительной оценки в культуре in vitro Форм томатов, устойчивых к A.soiani, с использованием гомогената мицелия с остатками каллуснои ткани томата, на которой выращивали гриб.

7. В результате селекции in vitro на основе высокочувствительного к A.soiani сорта Талалихин-186 получены Формы томата, устойчивые к использованным Факторам отбора. Показано сохранение устойчивости к этим Факторам в 1-м и 2-м потомстве от самоопыления растений-pie генерантов.

8. В результате оценки семенного потомства растония-регенерантов томата на устойчивость к A.soiani отобраны Формы более устойчивые к этому патогену по сравнению с исходным сортом.

РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Предлагается метод отбора и предварительной оценки в культуре in vitro Форм томата, УСТОЙЧИВЫХ К A.soiani, С ИСПОЛЬЗОванием гомогената мицелия этого патогена с остатками каллуснои ткани томата, на которой он выращивался.

2. Предлагается биохимический тост для характеристики степени

чувствительности сортов томата К A.solani по уровню активности /ч-глюкозидазы, индуцируемой в тканях растений при заражении этим патогеном. •

3. Предлагается метод поддержания и быстрого восстановления агрессивности коллекционных штаммов a.soianí после длительного их культивирования на искусственных питательных средах путем выращивания в асептических условиях на каллуснои ткани томата.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Аврова А.О. Активность глнжозидаэы в растениях томата с .-.различной чувствительностью к Alternaria solani Hill.et Mart . I

sor. // Микология и Фитопатология.- Л.- 1903.- T.27Í n 3.- С.20-31.

2. Аврова А.О. Глюкозвдазная активность при взаимодействии томатов с Alternaría solani // Научно-технический бюллетень ВИР.-Л.- 1993,- N 230.- С.76-81.

3. Аврова А.О..Тютерев С.Л..Евстигнеева I.A..Козырева 0.Г. Селекция томатов in vitro на устойчивость к Alternarla solani // и Российский симпозиум "Новые метода биотехнологии растений".-Пущино.- 1093.- С.105.

4. Тютерев С.Л..Козырева 0.Г..Евстигнеева I.A..Аврова А.О. Изучение ВЗаИМОДеИСТВИЯ томатов С ФИТОТОКСИНаМЙ ГрИба Alternarla, solani (Ell. et Mart.) Sor. В КуЛЬТурв ir. vitro II 11 РОССИЙСКИЙ

симпозиум "Новые методы биотехнологии растения".- Пущино.- 1993,-С.174.

5. Аврова А.О.,Тютерев С.Л..Евстигнеева I.A. Отбор Форм томата (L.vcopersicon esculent.um Mill.) Hö' УСТОЙЧИВОСТЬ К Alternaria

solani // и Международная конференция "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология".- Алма-Ата.- 1993.- С.80.

G. Тютерев С.Л., Евстигнеева I.A., Аврова А.О. Селекция растопил томата in vitro на устойчивость к гербициду // и Международная конференция "Биология ■ культивируемых клеток растении и биотехнология".- Алма-Ата.- 1093.- 0.97.

,7. Аврова А.0.,Тютерев С.Л..Евстигнеева Т.А..Козырева О.Г. Методы отбора в культуре in vitro Форм томата, устойчивых к Alternaría solani (Ell. et. Mart.) Sor. // МИКОЛОГИЯ И ФИГОПЭТОЛО-гия.- Л.- 1993.- Т.27, N 6.- С.52-56.

Í0,i4,94r. Зак 302-1^0,РТП ИХ СИНТЕЗ , ."осковокпй пр. 25