Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культивирование клеток млекопитающих с различными видами сывороток и заменителями сывороток

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Культивирование клеток млекопитающих с различными видами сывороток и заменителями сывороток"

российская академия медицинских наук нии вирусологии имени д. и. ивановского

На правах рукописи

ГАСАНОВА Барият Саидовна

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ С РАЗЛИЧНЫМИ ВИДАМИ СЫВОРОТОК И ЗАМЕНИТЕЛЯМИ СЫВОРОТОК

03.00 . 06. — вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1993

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Р. Я. Подчерняева

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Л. Л. Фадеева

доктор биологических наук, профессор Л. П. Дьяконов

Ведущее учреждение—ГИСК им. Л. А. Тарасевича

Защита диссертации состоится 1993 г.

в « час. на заседании специалиЗ-пров;}йного совета

Д 001.20.02. в НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН (Москва, 123098, ул. Гамалеи, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН

Автореферат разослан /МЛдрЯ 1993 г.

/

Ученый секретарь специализированного совета старший научный сотрудник кандидат медицинских наук

А. М. Жуковский

- з -.

Актуальность проблемы. Возрастающие масштабы использования разнообразных клеточных культур в качестве субстратов для создания и производства биологически активных препаратов требуют эффективных и экономически выгодных питательных сред широкого ассортимента. Как известно, сыворотка до сих пор остается необходимым компонентом для культивирования клеток. В практике культивирования широко используется эффективная, но дорогостоящая эмбриональная телячья сыворотка /ЭТС/ и сыворотка крупного рогатого скота /КРС/. Свойства других видов сывороток изучены сравнительно мало . / Мусаев, Сафонов, 1987; Слесарева, Щебанова, 1991; Костина, 1991 / и их применение для биотехнологических работ пока ограничено. В связи с - этим представлялось актуальным исследование возможности применения сывороток крови различных видов животних / телят, северных, оленей, суягных овец и плодов овцы,-тюленей, морских " котиков / и изучение их 'ростстимулирующих свойств на ряде клеток млекопитающих.

Сыворотка, оставаясь необходимым компонентом питательной среды для культивирования клеток, все же обладает рядом существенных недостатков.' Основными недостатками использования сыворотки являются: ее возможная цитотоксичность, нестандартность / состав снвороток варьирует- от серии к серии /, контаминация' посторонними агентами / вирусами, микоплазмами и т.п. /. За рубежом, и в последнее время в нашей стране, ведутся активные исследования по использованию комплекса ростовых факторов, 'выделяемых из сывороток и способных заменить ее в качестве компонента питательной среды / ¡Шс&И., 1964, . 1966; Дроздова, 1980 /, или конструированию полностью синтетических бессывороточных сред на основе подбора идентифицированных ростовых факторов сывороточной и несывороточной

1 природы / /¿ДЛ2_ 1983; ^СЫОЦ, 1987 /.

В связи с вышеизложенным представлялось весьма. актуальным провести исследования по использованию ростового протеина, представляющего собой комплекс рос те табулирующих белков, и выделяемого из сывороток крови различных видов животных, и по применению синтетической бессывороточной среды на основе идентифицированных импортных и отечественных ростовых ингредиентов.

' Цель и задачи исслаттования. Целью настоящей работы являлось культивирование клеток млекопитающих при использовании :

сывороток крови различных видов животных / телят, северных оленей, суягных овец и плодов овцы, тюленей, морских котиков / ;

ростовых протеинов, выделенных из сывороток крупного рогатого скота, суягных овец, свиней, северных оленей ; синтетической бессывороточной среды ка основе идентифицированных ростовых инградиентов / инсулина, трансферрина, селенита натрия, этаноламина, бычьего сывороточного альбумина, гидрокортизона, фактора роста эпидермиса /.

Исходя иа этого были поставлены задачи: " .' •• •"

1. Изучение . рост стимулирующе й активности сывороток крови различных видов животных, при культивировании клеток млекопитающих. Определение возможности замены дорогостоящей эмбриональной телячьей сыворотки на более дешевые отечественные виды сывороток.

2. Исследование ростстилулирущей активности ростовых протеинов, вще.!яе:.:цх из сывороток различиях видов глвотнж, и возмслп'осгп ::х использования б качеств-.? компонента питатель-

' ной среды.

3. Изучение возможности использования ростовых протеинов

в качестве заменителей сыворотки при крупномасштабном культивировании с использованием отечественных микроносителей /ГШ/.

4. Исследование возможности культивирования клеток млекопитающих на бессывороточных средах с использованием отечественных инграциентов / инсулина, трансферрина и ростового протеина, выделенного из сыворотки свиней, взамен альбумина /.

Научная новизна работы.

Изучена ростстимулирунцая активность нативных сывороток крови различных видов животных / телят, суягных овец и плодов овцы:, северных оленей, тюленей, морских котиков / на ряде клеток млекопитающих и выявлена наибольшая ростовая активность телячьих сывороток, которые могут быть использованы для большого _числа . кчеток взамен дорогостощей ЭТС. Проведено сравнительное изучение пролиферативной активности ростовых протеинов, выделенных из сыворотки двумя различными

этиленгликоля /ПЭГ/. Показано, что ростовой протеин, выделенный из сыворотки КРС /РП КРС/ с использованием менее трудоемкого метода с помощью ПЭГа не уступает по своей ростовой активности РП, выделенному из телячьей сыворотки с помощью сульфата аммония. Впервые установлено, что РП 1СРС могут применяться для культивирования клеток МТ-4 и Шс&- 4, чувствительных к ВКЧ-инфекции. Впервые проведено исследование ростстимулирующей активности РП, выделение . из сывороток свиней и северных- оченей. Показана возможность использования РП свиней и РП оленей взамен эмбриональных телячьих оывороток. Впервые показана возможность использования РП при/ крупномасштабном зультивировании клеток на

способами: с помощью сульфата аммония

и поли-

'отечественных микроносителях Цитолар-2 и Цитогель. Впервые проведены исследования по культивированию перевиваемой клеточной линии Нт-о на бессывороточной среде, содержащей основные ростовые факторы. Показана возможность замены до-рогостощего импортного альбумина ростовым протеином, выделенным из сыворотки свиней.

Практическая ценность.

1. В результате проведенных исследований показанаг возможность использования более дешевых видов сывороток / телят, северных оленей, тюленей, морских котиков / взамен ЭТО при культивировании перевиваемых, диплоидных и суспензионных культур.

2. Определена возможность замены нативных сывороток на ростовой протеин, выделяемый из сывороток КРС, свиней, северных оленей, в качестве более стандартизированного компонента питательной среды.

3. Показана возможность использования ростовых протеинов КРС, свиней, северных оленей в качестве. компонента среды, взамен сывороток, при крупномасштабном культивировании клеток на отечественных микроносителях.

4. Исследована возможность культивирования кчеток на синтетической бессыворото'чной среде, состоящей из отечественных и импортных . идентифицированных ростовых факторов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Применение сывороток телят, овец:, северных оленей, тюленей взамен ЭТС экономически более выгодно и способствует увеличению объема бйотехнологических исследований.

2. Ростовой протеин, выделяемый из сывороток крови различных видов животных, как более стандартизированный компо-

' нент питательной среды, может быть использован при культивировании широкого спектра клеток млекопитающих, взамен нативных сывороток КРС и ЭТС.

3. Ростовой протеин может быть использован в качестве компонента питательной среды ■ при крупномасштабном культивировании клеток на отечественных микроносителях.

4. Возможность культивирования клеток млекопитающих в бес-сивороточной среде с использованием как импортных, так и отечественных инградиентов.

АптаЬбаиия работы:

Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены:

- на Всесоюзной конференции "Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток", 1991 г. / г. Новосибирск /;

- на конференции "Разработка и производство медицинской био- 4 технологии", 1992 г. /г. Махачкала /;

- на конференции "Актуальные проблемы инфекционной патологии. Иммунология и биотехнология", 1993 г. / г. Санкт-Петербург /;

- на конференции молодых ученых в НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского, 1993 г. / г. Москва /;

- на заседании Экспертного Совета предварительной вксперти-зы диссертационных, работ по медицинской вирусологии при НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского 21 октября 1993 г.

, V. , '

/ г. Москва /.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатных-работы и выпущены Методические рекомендации.

Объем и структура диссертагтшт. Диссертация изложена на %

страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4".глав собственных исследований,

'обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 196 работ, из которых 82 отечественных авторов, 114 зарубежных. Экспериментальные данные иллюстрированы 6 рисунками и 29 таблицами.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал- и методы

В работе было использовано 26 клеточных культур : первичных / ФЭК /, диплоидных / ЛЭЧ-240, ЛЭЧ-Т, ФЭЧ, М-22, 91 /, суспензионных / {/сыги>-Ьга-. , &ty¿ , Х63-А 8.653, Н-9, ЩоИ -4, МТ-4, Н9 111 В /, перевиваемых / ВДСК, СГОВ,

YlXO , ВНК-21, МЦВК, 4647, СУ-1, 4184, ПО-2, 1 - 929, ТЭВ, Hela, Нер-2 /. Клеточные линии получены из коллекции лаборатори культур тканей Института вирусологи им.Д.И.Ивановского. Диплоидная линия М-22 получена из Института полиомиелита и вирусных' .энцефалитов.

ростовые среды; 199, 199 с 0,5$ гидролизата лактальбумина, Игла ВМЕ, Игла МЕЛ, Игла ДМЕМ, среда Хэма ? 12, ЕРМ1-1640 / все среды отечественные, производства Института полиомиелита • и вирусных энцефалитов РАМН /.

Сыворотки; Крупного рогатого скота - КРС / производства Московского мясокомбината /, эмбриональная телячья сыворотка -•■ ЭТО / производства Института Гамалеи и БелНИИЭиМ г. Минск /, постнатальная телячья и новорожденных телят / производства Прикладного центра биотехнологии Эстонии, г. Лылва /, плодов овец и суягных овец из Среднеазиатского филиала ВНИЯИ, северных оленей / Курская биофабрика /, сыворотки тюленей и морских котиков / НИЛБАВ гидробионтов г. Москва /.

Ростовые протеины /РП/; Ростовой протеин из татачьей сыворотки, полученный с использованием сульфата а\смония / произ-

Родства Чехословакии /; ростовые протеины, полученные с использованием ПЭГ / метод разработан в ГИСКе им.Л.А.Тарасовича, г. Москва / - РП из сыворотки КРС, РП свиней, РП северных оленей, РП суягных овец.

Заменители сыворотки /ЗС/ двух типов ЗС1 и ЗС2, в состав которых входят идентифицированные ростовые факторы : инсулин, трансферрия, этаноламин, селенит натрия, бычий сывороточный альбумин /ЕСА/, гидрокортизон, фактор роста эпидермиса. Оба типа заменителя предоставлены ' Институтом Цитологии РАН г. Санкт-Петербурга, из отдела клеточных культур.

Микроносители: Цитолар-2 / НПО "Биолар" г. Олайне /, Цитогель - / НПЦ медицинской биотехнологии ЮР /.

Клетки культивировали в стандартно-монослойных условиях, в суспензии и применяли псевдосуспензионный метод с использованием микроносителей. Высевали клетки в посевной дозе от 50 до 200 тыс ' кл/мя индивидуально для каждой клеточной культуры. При пассировании клетки снимали с поверхности стекла матрасов или микроносителей раствором версена /0,02 % / с химопсином. Клетки пассировали через 3-5 суток соответственно кратности рассева клеточной, культуры. Подсчет клеток проводили в камере Горяева. ■

При псевдосуспензионном культивировании с МН использовали силиконированные. сосуды- фирм " fotffcp* и " 'ftchheUt а также сосуды с подвешанными мешалками, работающими по принци-. пу АСА-системы. Процент адгезии на МН определяли путем-подсчета клеток, -снятых с микроносителя, к общему числу посеянных клеток.

Подготовку РП в качестве компонента питательной среды . осуществлял! по схеме, подробно изложенной в Методических рекомендациях по "Использованию ' ростовых протеинов для куль-

тивирования различного типа клеток" / Москва, 1993 г. /.

Определение ростстимулирующей активности сывороток и РП осуществляли на уровне пяти последовательных пассажей с подсчетом индекса пролиферации и процента' жизнеспособности по стандартной методике.

Определение микоплазмы в клеточных культурах осуществляли оливомициновым экспресс-методом / A.c. JS 1044630 от 01.06.83. /.

Общий белок в сыворотках и РП определяли с биуретовым реактивом по методике, изложенной в Сборнике инструкций, утвержденном приказом Минздрава СССР от 13.01.83. , используя спектрофотометр ' СФ-26 или Спекол-10.

Фракционный состав белков определяли с помощью электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы по унифицированному методу, согласно' приказу Минздрава СССР "Об унификации клинических лабораторных методов исследования" от 21.11.79. Jê 1175. Содержание остаточного ПЭГ в РП определяли колориметрически / Игудин и др., МР 123, 44. 006-88 /.

Карио логическое и морфологическое доследование культуры проводили по методу Мурхеда //fter/ied iZ cdL ., 1960/ с окрашиванием азурэозином по,Романовскому* и- с использованием смеси

Буэна и окрашиванием гематоксилинэозином.

При статистической обработке результатов определяли' А средние показатели и квадратичные отклонения. Достоверность различий в величинах показателей оценивали с помощью критерия Стыодента.

Результаты и обсуждение.

1. Изучение ростети;.тулируго:".ей активности нативных сывороток тазличннх внпов животных

Как известно, суворотка крови различных видов животных

;до сих пор остается незаменимым компонентом в составе питательных сред, используемых для культивирования клеток млекопитающих. На сегодня наиболее часто используемыми в практике культивирования являются сыворотки плодов коровы - эмбриональная телячья /ЭТС/ применение которой в крупномасштабном культивировании весьма ограничено из-за дефицита исходного сырья и высокой стоимости готового препарата, а также сыворотка крупного рогатого скота /1СРС/, обладающая рядом существенных недостатков. В связи с этим в последние годы активизируются исследования возможности использования более доступных, дешевых видов' сывороток / Волкова, Поликарпова, Хижнякова и др., 1987; Михайлова, Подчерняева, 1990; Костина, 1991 /.

Проведенные нами исследования по изучению ростстимулирующей активности сывороток крови различных ввдов животных / постнатальных телячьих - до первого кормления, новорожденных телят - до 2-х недель жизни, суягных овец и плодов овцы, северных оленей, тюленей, морских котиков / выявили следующие особенности. Так, при проверке ростстимулирующей активности . телячьих сывороток / 60 . серий постнатальных и 40 серий новорожденных телят / на диплоидных клетках ЛЭЧ /легкое эмбриона человека/ было установлено, что пролиферативная активность различных серий варьировала в достаточно широких пределах - в случае постнатальной телячьей сыворотки индекс пролиферации /ИП/ варьировал от 1,2 до' 3,5, для сыворотки новорожденных телят от 1,0 до 3,9. В случав постнатальных телячьих сывороток количество серий с более высоким уровнем этого показателя - 21,6.5?, а количество серий с более низким уровнем Ш - 13,4 %„ в то' время как для сывороток новорожденных телят - соответственно 15 и 15 %, Эти данные свидетельствуют о том, что постнатальйые телячьи сыворотки обладают ~<снесколько более высоким уровнем ростстимулирующей активности, чем сыворотки новорожденных телят.

'в то же время необходимо отметить, что достаточно широкие пределы варьирования ИП указывают на нестандартность исследуемых видов сывороток. Однако, отдельные серии сывороток обладали достаточно высокой ростстимулирующей активностью / 3,5 - 3,9 ИП /, не уступающей активности эмбриональной телячьей сыворотки, что позволяет сделать заключение о том, что дорогостоящая ЭТО вполне успешно может быть замененна на менее дорогие виды сывороток, такие как постнатальная телячья и новорожденных телят.

Определение ростстимулирующей активности сывороток крови . суягных овец и плодов овцы при культивировании суспензионных линий (¿сипА-СтгЦ, Н-9, Н9/111 В и диплоидной линии ЛЭЧ-240 выявило достаточно низкую ростовую активность исследованных серий сывороток, а также их нестандартность. Лишь отдельные серии сывороток отвечали стандартным требованиям - индекс пролиферации и процент жизнеспособности соответствовали контрольным показателям / в качестве контроля использовали ЭТС производства БелНИИЭкМ г. Шнека /. Необходимо отметить, что серии сывороток, давдие низкие значения ИП, как правило, были в той или иной степени гемолизированными. Известно, что даже незначительные следы гемолиза обусловливают увеличение содоржания свободных жирных кислот в сыворотке крови. Концентрация последних исполнзуется как биохимический тест, который обратно пропорционален ростстимулирующей активности. Интересно при этом'отметить, что сыворотки плодов овец и плодов КРС близки по основным физико-химическим и биохимическим показателям /Мусаев, Сафонов, 1987 /.При этом низкая ростстимулкруюшаяя активность исследованного вида сыворотки возможна обусловлена низким качеством изготовления выпускаемого продукта.

Ввиду того, что'сыворотка'крови взрослых северных оленей обладает рязом преиглулеств по сравнению'с сывороткой крови крупного рогатого с:-:ота / более постоянный состав, отсутствие алт;:~

- ;з -

! тел к ряду .вирусов, неспецифических ингибиторов / Бадаева, 1987; Костина, 1990 / представлялось интересным изучить ее ростстиму-лирующие свойства. В качестве тест-культуры была использована диплоидная линия ЛЭЧ-240. Установлено, что из 12 серий только две серии обладали достаточно высокой рост с тиадулирующе й активностью / ИП на уровне контроля с 10 % ЭТО /. В данном случае снова имеет место нестандартность сыворотки, которая является существенным недостатком при использовании ее в качестве компонента питательной среды.

• Результаты проверки пролифзративной активности скворотки тюленей для суспензионной культуры ^(ЩтМ-Е/ЬИ— также выявили этот существенный недостаток исследуемого вида сыворотки. Из 10 проверенных серий только 4 отвечали стандартным требованиям.

При сравнительном исследовании сывороток различных видов • . животных / телят, овец, северных оленей, тюленей, морских.котиков / на диплоидных клетках ЛЭЧ была отмечена наибольшая рост-стимуллругощая активность телячьих сывороток. Интересно отметить, что достаточно высокой оказалась ростстимулиругацая активность довольно экзотических видов сывороток тюленей и морских котиков - ИП незначительно отличался от контрольных показателей с ЭТО / 2,0 - 3,0 /, соответственно - 2,1 - 2,4; 2,1 - 2,5.

Таким образом, результаты проверки ростстимулируицей активности сывороток крови различных видов животных выявили следующие особенности. Свойства сывороток меняются от серии к серии и варьируют в достаточно широких пределах - от полной их непригодности • для роста клеток, да показателей, отвечающих стандартным требованиям. В то же время необходимо отметить, что возможность использования различных видов сывороток / оленей, овец и др. / взамен дорогостоящей эмбриональной телячьей сыворотки, весьма перспек-' тивна.

2. Использование различных виттов ростовых протеинов в качест-ре заменителей сыворотки

Следующим этапом наших исследований было определение возможности использования ростовых протеинов /РП/, выделяемых из сывороток КРС, свиней, северных оленей, суягных овец, в качестве компонента питательной среды. Как было отмечено выше, сыворотка обладает рядом существенных недостатков : нестандартностью, возможной цитотоксичностью, наличием неспецифических ингибиторов и контаминирующих агентов. В связи с этим представлялось важным изучение ростстимулирующей активности РП, как более стандартизированного компонента питательной среды. .

В исследованиях были ирпользованн РП, выделенные из сыворотки двумя различными способами : .методом осаждения белковых фракций с помощью сульфата аммония / ftUcAJL, 1966 / и способом, предложенным Игудиным / 1990 / - осаждением с помощью полиэтиленгликоля / ПЭГ - м.м. 6000 Д / отечественного производства.

При сравнительном исследовании ростстимулирующей активности РП, выделенных двумя различным! способами из сыворотки КРС и телячьей сыворотки, на ряде клеточных культур, не было выявлено существенной разницы в показателях ростовой активности клеток. Однако, пролиферативная активность клеточных линий ..при использовании РП КРС оказалась не одинаковой. Для клеточных линий ЭДВК / почка КРС / и ТЭВ / клетки тестикул эмбриона быка / ИП оказался на уровне контроля / с 10 % ЭТС или КРС /, тогда как для клеток Veto , ВНК-21, СПЭВ, ФЭК он оказался несколько ниже; для диплоидной ку.льтуры ЛЭЧ-240 и ЗДСК РП КРС выделенные с использованием ПЭГ оказались непригодны.

Интересные результаты были получены нами при использовании РП KFC, полученных с использованием ПЭГ для культивирования клеточных л::!:!;?;, чувствительных к ВМЧ-г^фекции. Так, для кле-

точной культуры МТ-4 использование среды с 2 % ЗТС и 2 % РП КРС / по объему / привело к снижению ИП к 7-му пассажу почти вдвое, тогда как для другой клеточной линии той-4 ИП оказался достаточно высокий и даже превысил контрольный показатель / контроль с 15 % ЗТС /, соответственно 7,1 и 4,1. Таким образом, результаты исследований позволяют сделать вывод о видоспецифической потребности клеточных культур при использовании РП КРС в качестве ростового компонента.

Еыли проведены исследования по изучению влияния условий хранения РП КРС на 'перевиваемых клеточных линиях 1ЩВХ и ТЭВ. Показано, что РП в жидком виде, хранившиеся при - 20° С, сохраняли свои ростовые свойства дольше / 1 год / , чем РП, хранившиеся при + 4° С /6 мес.' /; в то время как, РП, высушенные путем лиофилизадии не утрачивают своей ростовой активности спустя 2 года хранения при + 4° С..

Как уже отмечалось ранее, сыворотка может содержать различного рода контаминирующие агенты : вирусы, микоплазш и др. Проведенные наш исследования выявили снижение содержания микоплазмы в культурах при использовании РП КРС, в качестве компонента среды по сравнению с сывороткой КРС. Это явление можно объяснить торможением размножения микоплазмы и подавлением их роста и развития в присутствии ростовых протеинов при отсутствию: дополнительных источников заражения в процессе • культивирования клеток.

Ростстимулируктеая активность РП, виде тешгых из сывороток крови различных видов животных / свиней, северных оленей, суягных овец / была изучена в сравнительном аспекте на широком спектре клеток млекопитающих.

Гчла изучена 0,2 % концентрация ?П .в ростовой среде / конечная концентрация по сухой навеске РЛ - 2 г/л / с добавление:.? 2 с!. • / по объему / натнв'.оП счвог.отк:: DTC птя.

'КРС в зависимости от клеточной культуры. Добавление 2, % нативной сыворотки оказалось оптимальным для ростовой ¿ктив-ности следующих клеточных культур - с РП свиней - для 'СПЭВ, Нер-2, МДВК, ЦЦСК; с РП северных оленей - для СПЭВ, 1 - 929, ЭДВК, • ВДСК; с РП овец - для Vcio, Hdla.' Интересно отметить, что для клеточной культуры VttO Ш о РП свиней и РП осеней оказался таким же, как в контроле с 10 % ЭТС, даже "без добавления в среду 2 % нативной сыворотки.

В экспериментах было выявлено, что' наибольшей ростстиму-

лируюцей активностью обладали РП свиней, а наименьшей РП

■л

суягных овец.*

Далее нами проводилась отработка оптимальных концентраций в среде с РП оленей и РП свиней, как обладающих' наибольшей ростстимулирующей активностью. Увеличение концентрации РП до' 0,5 % в ростовой среде -привело к незначительному повышению пролиферативной активности ряда клеточных культур. С РП свиней - для клеток L - 929 с 2,8 до 3»2, для клеток Hela с 3,7 до 4,1; с РП оленей - для Hela с 3,4 до 3,9, для 1- 929 о 3,0 до 3,5, для клеток Нер-2 с 3,0 до 4,3. Для клеточных культур ЗДВК и ЗДСК • 0,5 % концентрация РП в ростовой среде оказалась • оптимальной и равнялась контролю с 10 % .ЭТС. Добавление 1 % нативной сыворотки в ростовую среду с 0,5 % РП приводило к увеличению ИП выше контрольных значений;для большинства клеточных культур.

При биохижческом исследовании РП Vi нативных сывороток были определены такие параметры, как содержание общего белка в сыворотках и в РП'/ полученном в сухом и жидком БИ-. де /, процентное содержание остаточного' ПЭГа в РП и фракционный состав- сывороток- и РП. Как известно, сыворотка

' содержит •■'в значительной степени глобулиновую фракцию / 25 - 35 % /. При обработке ее раствором ПЭГа процентное содержание глобулиновой фракции снижается до 3 - 5- % пли полностью отсутствует. Существенное отличие ростового протеина от сыворотки -заключается в значительном снижении ' содержания глобулиновой фракции иАНее отсутствии. В РП существенно увеличено процентное содержание альбумина. Как было установлено в результате исследований, наибольшая рост-стимулирующая активность отмечалась у РП свиней и РП оленей, в которых отмечено и наибольшее %-оч содержание альбумина, что указывает на возможную корреляцию между содержанием альбумина в протеине и его ростстимулирумцей активностью. Как известно, альбумин в качестве белка-переносчика является одним из ростовых факторов, способным заменить сыворотку 1980 / в составе бессывороточной среды.

I

Однако, он выполняет свою функцию не самостоятельно, а в комплексе с другими ростовыми факторами. Помимо альбуминов в РП содержится ^ - глобулиновая фракция, в состав которой входит трансферрин - переносчик железа, который также является одним из основных ростовых факторов, и в сочетании ' с альбумином и другими ростовыми фактора'®' способен полностью или частично заменить сыворотку при культивировании

клеток животных и человека./ 1982; Фрелни.

1989 /.

Интересные данные получены, нами по влишшю содержания остаточного ПЭГа на проли-$ератквную активность клеток. С этой цблыо на клетках СПЭВ бита исследованы 5 вариантов с различным /1,0; 0;5; 0,25; С,1 и 0,05 $ / содерглнкем . ПОГа в питательной среде. В результате было выявлено снижение ростовой активности ктеточнчх ку.тьтур при выратава'^:;: их в среде, с 1 % и 0,5 5 содер-анпе:.т ПОГа, что поззотя-зг

сделать вывод, если не о цитотоксичном, то о некотором отрицательном . воздействий этих концентраций ПЭГа на проли-феративную активность клеточных культур. То лее влияние отмечено и при морфологическом и криологическом исследовании клеточной культуры. Но, так как процентное содержание остаточного ПЭГа в питательной среде с РП обычно не превышает 0,1 %, то молено говорить об отсутствии влияния остаточного ПЭГа в РП на пролиферативную активность клеточных линий.

3. Крупномасштабное культивирование клеток с использованием < отечественных микроносителей и РП в качестве

замените чей очтахта

Одним иа перспективных направлений для решения проблемы крупномасштабного культивирования клеток млекопитающих ввиду все возрастающих потребностей биотехнологии и вирусологических исследований является использование шпфоносителей /МН/. В нашей стране разработка новых МН привела к созданию нескольких видов этих препаратов. Наиболее изученными из них оказались Цитолар-1, Цитолар-2, Цитопол, Цитогель / Краснова, Нагиева и др., 1983; Подчерняева, Исаченко и др.» 1990; Шубина и др., 1992 /.. .

Целью наших собственных исследований явилось крупно- : масштабное культивирование с использованием МН. Цитолар-2 и Цитогель и ростовых протеинов, ввделэнкых из сывороток КРС, свиней, северных оленей, в качестве компонента питательной среды., взамен 'нативной сыворог/я ЭТО. ..При культивировании клеток с. РП было отмечено снижение адгезивной способности клеток "- по . сравнению с контролем с 10 % ЭТС. Наименьшая адгезивная способность •отмечена в . случае использования РП. свиней. Аналогичные результаты были получены й в случае монослойного культивирования на

' матрасах. Йак отмечают Тарасов / 1975 / и Костина / 1990 / присутствие свиной сыворотки в питательной среде приводит к значительному снижению адгезивных свойств клеток. В . данном случае, по-видимому, имеет место корреляция между адгезивными свойствами И1 свиней и свиной сыворотки.

При исследовании пролиферативной активности клеточной культуры СУ-1 более высокие показатели ростовой активности наблюдались в случае использования РП свиней в качестве заменителя сыворотки,- и пористого !,М Цитогель по сравнению с Цитолар-2 - соответственно : контроль - 4,8 -■ 4,0; РП КРС - 4,4 - 3,3; РП свиней - 5,3 - 4,4; РП оленей -- 4,6 - 3,8. Большая пролиферативная активность клеток в случае использования пористого МН Цитогель- по сравнению с Цитолар-2, по-видимому, связана с возможностью прин крепления клеток к большей площади поверхности, а следовательно и более высоким приростом клеток. Для Цитогеля отмечена и более высокая степень адгезии клеток по сравнению с Цитолар-2. Все это указывает на преимущества использования МН Цитогель.

Результаты исследований по крупномасштабному культивированию с использованием РП, выделенных из' сывороток различных видов животных, позволяют сделать заключение, что ростовые протеины могут быть- успешно использованы взамен . эмбриональной телячьей сыворотки при крупномасштабном культивировании с использованием отечественных Ш.

4.- Применение бессывороточных сред для культивирования клеток млекопитающих

В последнее . время большое распространение в практике культивирования клеток млекопитающих находят полностью синтетические бесснвороточнне среды /Ноип. , 1983;

JcLfctu , 1987; ( 1Э89 д Использование

сред химически-определенного сотава с идентифицированными факторами сывороточной и несывороточной природы- представляется весьш актуальным для вирусологических исследований.

Нами было изучено 2 вида заменителей сызоротки ЗС1 и ЗС2, различающиеся по составу и содержащие следующие ростовые факторы - в составе ЗС1 / инсулин, трансферрин, этаноламин, селенит натрия, бычий , сывороточный альбумин - БСА /) в составе ЗС2 / инсулин, гидрокортизон-, этаноламин, фактор роста эпидермиса, БСА /. Проведенные исследования с использованием -2-х типов заменителей на двух, клеточных культурах i/ùlû / почка зеленой мартышки / - перевиваемая линия и ФЭЧ / фибробласты эмбриона человека / - диплоидная линия, выявили видоспецифическую потребность данных клеточных культур в ростовых факторах. Пролиферативная активность клеток ФЭЧ в случае использования заменителя сыворотки 2-го типа оказалась выше, чем для ктеток \VtlD . Тогда как в случае использования ЗС1 / в составе которого присутствует такой ростовой фактор,.как трансферрин / индекс пролиферации клеток j/t-tO . оказался на уровне контроля с 10 % ЭТС. . .

Так как использование импортных компонентов в составе заменителя сыворотки ЗС представляется весьма дорогостоящим, нами была исследована возможность замены наиболее важных в функциональном отношении ростовых факторов, импортных инсулина и трансферрина на отечественные препараты. При этом наблюдалось некоторое снижение пролифера- . тивной активности клеток V^-tO соответственно 7,2 и 6,0. При замене наиболее дорогостоящего компонента в составе ЗС - . бычьего сывороточного альбумина на РП свиней отечественного производства наблюдалось не..

только не понижение, но некоторое повышение ростовой активности меток соотвественно 7,2 и 8,5 .

Результаты исследований представляют большой интерес., т.к. использование бессывороточных сред на основе отечественных компонентов ведет к значительному удешевлению среды, а также ее стандартизации, что весьма актуально для вирусологических исследований.

ВЫВОДЫ

. 1. Установлено, что нативные сыворотки различных видов животных / телят, овец, северных оленей, тюленей, морских котиков / могут быть рекомендованы для культивирования . ряда клеток млекопитающих . после предварительного определения у них пролиферативной активности.

г

2. Не выявлено существенной разницы в пролиферативной активности ростовых протеинов /РП/, выделенных из сыворотки крупного рогатого скота двумя различными способами. -

с помощью сульфата аммония и нетоксичного биологического полимера полиэтиленгликоля /пзг /- как жнее -трудоемкого способа .

3. Установлено, что содержание .остаточного ПЭГа в питательной среде с РП в количестве 0,05 - 0,1 % не .оказы- • вает влияния на морфологию, кариологию клеточной культуры и ее пролиферативнуга активность.

4. Впервые показано, что РП КРС могут применяться для культивирования клеток ГЛТ-4 и BoU -4, чувствите тьных к ВИЧ-инфекции. При этом отмечена различная видоспеци-фическая потребность клеточных культур в РП, в качестве компонента среды.

'Б. Впервые изучена роететимулирующая активность РП, выделенных из .сывороток свиней и северных оленей, и установлена большая пролиферативная активность клеток мле-' копитающих при культивировании с РП свиней. Показана возможность использования РП свиней и РП оленей взамен на-тивных сывороток.

6. Определены .оптимальные концентрации РП свиней и РП оленей / 2 г/л и 5 г/л /в питательной среде о добавлением

1 или 2 % / по объему / нативной сыворотки для культивирования различных перевиваемых клеточных линий млекопитающих.

7. Впервые ¿оказана возможность использования ростовых протеинов в качестве заменителей сыворотки при крупномасштабном культивировании клеток на отечественных микроносителях Цитолар-2 и Цитогель.

8. Впервые 'проведены исследования по культивированию перевиваемой клеточной линии tfLC0 на бессывороточной среде с заменителями сыворотки, содержащими основные ростсвые факторы / инсулин, трансферрин, этаноламин, селенит натрия, бычий сывороточный альбумин /. Показана возможность замены импортного альбумина ростовым протеином, выделенным из ск- ■ воротки свиней.

и

Считаю своим приятным. долгом выразить признательность и огромную благодарность своему научному руководителю -профессору, доктору медицинских наук Р.Я.Подчерняевой, за постоянное внимание, всестороннюю помощь и поддержку при выполнении диссертационной работы.

Глубокую признательность выражаю научному сотруднику Е.И.Мельниченко, старшим научным сотрудникам Г.Р.Михайловой, В.А.Исаченко, младшему научному сотруднику Е.В.Таланцевой за помощь в выполнении научных исследований.

Глубокую благодарность выражаю Г.Р.Михайловой,; старшему научному сотруднику, доктору биологических наук Л.М.Селимо-вой, доктору медицинских наук Н.В.Шалуновой, кандидату биологических наук Э.И.Конду / ГИСК им.Л.А.Тарасовича /, кандидату биологических наук Г.В.Корнилаевой за ценные советы по оформлению .диссертации и помощь в выполнении научных исследований.

Искреннюю признательность выражаю коллективу лаборатории культуры тканей за оказанную всестороннюю помощь в работе. Особую признательность выражаю лаборанту Н.К.Пимакиной за постоянное, содействие в работе.

С-пчсов, работ. .оптб.лйкрвашш ..до. тегге, дксэртадад.

и

1. Р.Я.Подчерняева, Е.И.Мельниченко, Б.С.Гасанова. Применение ростовых факторов сывороток для культивирования клеток млекопитающих" • Тезисы Всесоюзной конференции "Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток". Новосибирск,1991 г. стр. 58.

2. Б.С.Гасанова, Е.И.Мельниченко, Н.В.Шадуиова, Э.И.Конду, Р.Я.Подчерняева, Г.В.Корнилаева. "Ростстнмулирукше белки,

I заменители натквных сывороток животных для разработки биотехнологических препаратов". Тезисы конференции "Разработка и производство медицинской биотехнологии"., Махачкала, 1992 г. стр. 126-127.

3. Б.С.Гасанова, Е.И.Мельниченко, Э.Я.Концу, Р.Я.Подчернлева "Протеины различных видов сывороток как факторы роста клеток млекопитающих". Цитология, 1992, т.34, ¡Ь 9, стр. 61-62.

4. Р.Я.Подчерняева, А.А.Лазарешсо, Б.С.Гасанова, Е.И.Мельниченко, И.О. Киколаенко. "Репродукция -вирусов простого герпеса в клетках в'бессывороточных средах". Тезисы конференции "Актуальные проблемы инфекционной патологии, ч. 3. Иммунология и биотехнология"., Санкт-Петербург, 1993 г. стр.86.

5. Методические рекомендации по "Использованию ростовых протеинов для культивирования различного . типа клеток"., Москва, 1993 г., Ю с.

подписано в печать //■ 199¿т.

малое предприятие «петит«

зак. тир. {('о