Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование свойств различных видов сывороток и разработка технологии их получения для использования в культивировании культур клеток

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Исследование свойств различных видов сывороток и разработка технологии их получения для использования в культивировании культур клеток"

МИНИСТЕРСТВО МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ СССР ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ НОЯЕКУЛЯРНОИ БИОЛОГИИ

на правах рукописи

КОСТИНА Галина Александровна

ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ СЫВОРОТОК И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КУЛЬТИВИРОВАНИИ КУЛЬТУ? КЛЕТОК

Биотехнология 03.00.23

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск, 1990 г.

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском Институте молекулярной биологии.

Научные руководители - член-корреспондент АН СССР, профессор Сандахчиев Л.е., кандидат химических наук Камший Л.П.

Официальные оппоненты - доктор медащинекях наук, профессор

ПоллерняеЕа Р.Я.

кандидат биологических наук

-Ерошкина Г.А.

Ведущая организация - Всесоюзный научно-иссдецователъ ский Институт ветеринарной вирусо легии и микробиологии

Защита диссертации состоится "21" ОPríQ1950 г.

в у часов на заседании специализированного совета во ВНИИ молекулярной биологии (пос. Кольцове, Новосибирская обл.)

Автореферат разослан H&JetP'X- 1990 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат химических наук , у #^

т.н.Шубина

Актуальность проблемы. Несмотря на дреддринимаекне исследователями усилия по разработке бессыворотэчкых питательных сред, сызоротка крови человека или животных зсг есе остается необходимым компонентом большинства питательных сред для культур клеток и зивусов.

В практике культивирования культур клеток и вирусов наиболее часто используется эффективная, но дорогостоящая сызоротка крови плодоз коровы, з основном производства зарубежных фирм.

Наиболее доступная сыворотка крови крупного рогатого скота (КРС) ' наела применение а составе питательных сред (ПС), предназначенных в оснозксм для репродукции менее чувствительных к ростовым и ингибируютда Фактооан клеточных линий. Ряд исследователей (Астахоза, 197е; Воробьев, 1972; Дроздова, 1930; Ягудик и др., 1953: Хаертыкоз. 1905) дозоль-ао всесторонне изучили свойства сыворотки КРС, однако готовый коммерческий препарат этого вида сыворотки, выпускаемый а СССР, до сиз пор не стандартизовал, характеризуется лизь по двум показателям - внешний вид и стерильность (ту49-246-75), а существующая технология его производстза ке позволяет получать стабильный по биологическим свойствам препарат для культур клеток.

Постановлением Совета Министров СССР и ЦК КПСС N307 от 25 августа 1937 г. по биотехнологии определена, з частно ст.!, задача организации в стране производства сывосоток, полученных из крови различных видов животных.

Хак показал анализ литературных данных з СССР отсутствуют современные коупномасатабные технологии получения сывороток для культур клеток, беден их ассортимент, мала изучены свойстза, а данные, хасаюеиеся различных сталиЛ технологического процесса,очень ограничены, весьма противоречивы и выполнены на лабораторном урсЕне. Кроме того следует отметить,- что многие вопросы, связанные с разработкой технологии производства сыворотки крови для культур клеток, остаются пока не изученными. 3 частности, ае освеиокы /сяозиг, влияющие на качестзо готозого препарата, не рассмотрели дри-чикы, обусловливайте ее токсичность, пе показана везмож-яоеть перехода от лабораторных исследований к спытно-промыз-леннсму произзодстзу, не изучена возможность применен«.? широкого спектса отечественных ^ильтругс;-- материалов и оборудования в производстве сыворотки.

- г -

НесСхсдхгность ПРОБелекля исследогьЕИй в направлении к:;>'1:с;г;-:я свойств сш-орсток косен расгг«гчшс: в:ц20в животные, а т- г;:.- разсаОогкл ог^тно-прсгллдлеаной технологии кх получения гктег.ала. иг залач научных воцр&здбзещай НПО "Вектор" по ьр•• г.но»:г.ссгз.0ес-и* культипгрозашсо клетог,-продуцентов к упругое.

Г;-? задача кссл.лоз'.кпч. Целью кастонщей работе быка

сусгствукеей технологии про-"ства сьгсроток крози различил: вндоз >:.:'.20т;-:ьк, изучение ^тзико-яяяпескшс, бйодккяческкх и биолотгсесккх спсйсть г стнопгпик культур клеток кл!?коЕитгвЕцО£ к насекой®:, а также ¿л'-? у сое.

В г.о:ачи исследования входило:

разработать окитко-про.-анлеккугг теллолеп:» получения сагсрсток кроьи разллчннх жкзогсгыг, пргггодяггг для крулво-касстгОного культивирования культур клеток и вирусов;

испытать отсчестБекнке {■яльтрук.-зцк нагеркадк к анвргть кгисоо.гь серспекткгные с л я осуществления стерилазуг.-цей: фильтре.:-;«: а к?/лкокасштабзок производстве спеороток ¿.¿оеп раз-зкцое клзстних;

исследоБлть возможность улучшения качества скво;-;-тки и гг-лать рекоке^задаг для олктно-прскызленнсй реализации;

изучать 203!!0*к0сть получения КК!5}Ы крупного рогатого скота л ее использования для культизпровагшя клеточпш: культур;

изучить £кзико-г:нкическне, биогккические и С-иологичес-с»сй:тлг сьзороток различных видов животных и выбрать ссь«ике критерии сценки качества готошл: препаратов;

::гучить возможность ЕРииенения сцвороток крови различ-ш:г гкдел жзстймх для культивирования широкого спектра кде-точкызг лкнкй, гиер{гс©м г; вирусов.

Еауч.чая ксы:гкз работа. Выявлено влияние различных Сактосов 'условия забора кровк, время отстаивания, метод с-т-лелекля клеточнкг элементов, испэльзогание различных филь-трукз-а кате риалов) на качество готовых греСаратов сыкорсток

кр02й.

Показана возможность отделения клеточш-гг элементов кроьи с х:аельзсвзкиои ковуг гидов об-руяозйккя:" алосх.'ог'зкйого {кльтрацискного недулх 7£К-1,5 и {-иль-тр-пресса "Ориоь".

Кзучекг гозможзость ксаользоБьягя о;-;роксго с?:..г.гра ст<?-•чест'.лч-цк ^ 11 - г т г материалов и оОор/дсьлчкя дал стер:;-

лизации скзоротки кроен, зыбракн наиболее перслгктнзгчке из них.

Установлен ¿лд Фильтругмости сьнороток кгсги различных зкдоз животных.

Разработана крупномасштабная технология долучег-гня улучшенного качества сывороток крови К~С и свиней путем счисти; их с пенсов пояпэтия-нгдлксля (ПЭГ) с последующей - дграппсй " 2 амо р ам:^ zr-тля - оттаиз алия".

проверен сразйлтель:-:!^! анализ свойств сывороток кров:; различных видов животных (плодоз коровы, плодов оsmi, новорожденных телят, телят севернкх оленей, крупного рогатого скота, свиней, сезеркнх оленей, суягдкх авед, лоаадей, морских свикок, К?С, обработанной ПЭГ, св'.п-.гй, обработанной ПЭГ) по физико-химическим (pH, осмотическое давление, прозрачность, аняокисЕотааЗ и ионный состав) я бнсхгзипг;:^-.:» (гемоглобин, сбгай белок, Фракционный состав белкоз, ' кислоты, а- и ¡Э-л'лпопротеиди) показателям для обосно?.г.гля критериев, характеризующих готовые препарата.

Изучена возможность применения С'дгороток крови различных зидоз животных для культивирования сироксго спектра клеточных линий (млекопитающих и насекомых), гибридом и еируссз, выявлены наиболее эффективные из них.

Показана возможность получения и применения симфы KFC для культивирования перевиваемых клеточных линий.

Практическая- ценность эабо-га заключается s слгдуг5?л:

Полученные экспериментальны? данные поло?-'':: в ссчоп/ опктио-дрсмнЕленной технологий производства и контроля качества широкого ассортимента скэссоток крови сазпнчн1:х в'.'-дсз животных.

Разработан опитно-промыплеяг.к': регламент на дроизеслс-тво сыворотки крови пледов корезн, спределгкы оснсан;:? показатели качества готового препарата, разоа^сгаяы a^h.-.r«-яия к фармакопейной статье (ОС 4г-ГЕС-35}, кстсрие утзерхдг-ны в фаенакопейзен комитете, организовано csinно-врежгл-ное производство данной сыворотки, а технология зезутгннд полуфабриката суворотхи крови плодов корсЕЫ внедрена на Новосибирском, Омской, Челябинском, Курганское, Лумпзх-гаскоя. Свердловском, Абаканском я Тамгнекем иясокэийаатах.

?аэработаа опытно-дрежзагани! регламент л прогкть; -иенклх Фармакопейных статей на сьзоротку креза КТО л :д:гулл

- А -

организовано опытно-прокиЕлеваое производство,а технология получения полуфабриката сыворотки крови KFC и свиней внедрена ва Новосибирском мясокомбинате,

- Разработаны проекта нормативно-технической документации на производство к контроль качества сывороток крови различных видов животных (северных оленей, плодов овец, суягных овец, госгдей, свиней,обработанных ПЭГ, северных оленей, обработанных ПЭГ, сухгныг oseij, обработанных ПЭГ, КРС, обработанных ПЭГ) и оргаякзовано^опытйо-прсгалзленное производство,

•• ~ ■ ■• что позволяет проводить яостааки этих сывороток как подразделениям НПО "Вектор", так и сторонник организациям.

Готовые препараты сывороток крови различных видов животных, производимые в НПО "Вектор", широко используют в культивировании клеточных культур и вирусов для выполнения HZ? и ОКР, предусматривающих разработку и получение вакцинных и диагкосткчеккх препаратов (тест-систс-кы ШЧ, гепатита А и В и др.), гибркдомной технологии, а также производстве других биологически активных веществ как на собственной базе, так и другими учреждениями страны (более 90 потребителей) .

Отечественные Фиг.ьтрук-сие материалы, которые внедрены в собственную практику, могут быть рекомендованы для предварительной очистки и стерилизующей фильтрации любых видов сывороток крови человека и животных, а также химически определенных питательных сред, представляй®« интерес для биотехнологии.

Апробация работы. натериалы исследований по теме диссертации доложены на отраслевом семинаре "Питательные среды для культаварования кудьтур клеток" (Новосибирск, ВНИИ KS, 8 -11 сентября 1966 г.), на 1-ой научной конференции Kilo "Зек-тор" (Новосибирск,"-3 декабре 1586 г.), на рабочем совещании по проблекак разработки и применения кенбрадного оборудования ъ биотехнологии (Ккриси, 16-18 февраля 1S88 г.), на Всесоюзной конференции "Биологические и биотехнологические проблемы создания вирусных препаратов для защиты растений" (Новосибирск, сентябрь 12S9 г.), ка отраслевом семинаре 'Технология. яслучеиия биопрепаратов" (Новосибирск, декабрь 1939 г.), кг 3 Зсесокгнон ссае-глии "Культивирование клеток жкготшас к человека" (Пуг^иао, «3-15 февраля 1990 г.), г.с

Всесоюзной конференции "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии" (Махачкала, май (990 г.), на Всесоюзном совещании "Молекулярная биология ДНК-содержащих вирусов, имеющих практическое значение для сельского хозяйства и медицины", Киев, 9-11 октября 1990 г.

Публикации. По материалам диссертациии опубликовано 12 работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на '¿5 страницах машинописного текста и состоит из введения, одной главы обзора литературы, главы "Материалы и методы", девяти глав собственных исследований, заключения и выводов.

Работа иллюстрирована 35 таблицами и 9 рисунками. Библиографический указатель содержит 304 источника советских и зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

К р о в ь от различных видов животных забирали ва мясокомбинатах: от плодов коровы - на Новосибирском, Семипалатинском, Курганском, Омском, Шунихинском, Абаканском, Тюменском, Свердловском, Челябинском, Катта-Курганском; от плодов овцы - на Небит-Дагском, Ашхабадском, Марыйсхом, Кат-та-Курганском; от крупного рогатого скота, свиней и лосадей - на Новосибирском; от северных оленей-на Яр-Салинскон убойном пункте; от новорожденных телят - в питомнике крупных лабораторных животных НПО "Вектор", с. Нороэово; от морских свинок - в питомнике мелких лабораторных животных НПО "Вектор" .

Лимфу крупного рогатого скота получали из грудного протока методом линфо-венозкого анастсноза (Алиев, 1974}.

Удаление остатков клеточных элементов из сыворотхи и лимфы проводили на охлаждаемых центрифугах типа К-70, установке "Орион" или на плоскорамном ульрафильтрационном модуле УфН-1,5.

Для стерилизуюяей фильтрации сызоротки-полуфабрикгта использовали:

- мембранные фильтры Фирмы "Ниляипср" (США) типа GSWP, HAWP, DAWP, RAWP;

- комбинированные фильтры фирмы "Зейта-фильтр-Зерке" (ФРГ) типа ¡Сонбра P-tOO;

- е- -

• - глубинные фкльток Фирмы "Эейта-Фильтр-Верке" (ФРГ) типа СУПРА-ес;

- мекбранные Фильтры "Владипор" типа НФА-МА ÍTV 6-05-•5C3-e*i, КСА-А (ТУ е-С'5-<?г*-8сь ВД (ТУ 6- С-5 -1576-84 );

- иикрокадроксвые мембранные фильтры (ТУ 15/16 ЭССР ?-е-;,.

- асбесто-целлюлозкые Фильтровальные пластины типа Сф (ГОСТ ¿60-75; ;

. - фтор ;пластовые фильт&упеие пластины МфВП-0,015, 'ТУ 5-05-171i-74;;

- кагток для предварительной фил1 грызя ?>»глогически/ жидкостей часки F'+XE (ТУ i5- "505:>; <-59 > - ;;

- г умгг» фильтровальную тип г va (ГССТ íSOU-Ui:

- элементы патронные $клгтр/»:сие типа Зф-г-ог. Пф-г-04 ÍTV £-;t-í£1-7=5-5?,.

При испытаниях меч'&анкые фильтры к преяфкл!тм> монтировали в фкльРупсие системы с держателями Фирмы "йивлнпор" марки 77 15 или с отечественной установкой УСф-253-7. глубинные или комбинированные фильтры - в фильтр-преос "Орп-ок" с с.'всдной камерой Фирмы "Зейтп-Энингер Ноль" - {ФРГ i . 3-рамный Фильтр Сф-З (СССР) или -79-рамный Фильтр Рф-7ч (СССР), элементы патронные - в установку кпг 0,4-ík-0,i или КПГ i,Е-ЗК-0,1 (СССР).

Сноктисованные системы стерилизовали-с мембранами-в автоклаве пси давлении пара t.i кгс/скг (1E1°C в течение мин, с глубинными Фильтрами - в автоклаве при давлении nap-i £.О кгс/см^ в течение 60 мин или проточным паром при его давлении 1.0 кгс/сн£ в течение 1£0 мин, с элементами патронными - в автоклаве при i . i кгс/см* или проточным паром при < .г, кгс/сн£ в течение часа; с комбинированными фильтрами - приточным паоом при его давлении i.< кгс/см^ в течение зо мин

Разнер наибольшей поры и "точку пузырька" испытуемых типов мембранных Фильтров определяли при поноси прибора *lr,tepr i test" Фирмы Киллипср" (CZS-.) . Проверку производитель -ностк мемСргн проводили по дистиллированной воде, а Фильтру-екзсть - по- максимальней» обмену исследуемой сыворотки, про-седгей через меибсанл .

Для. очистки сыворотки кр-:б;'. испсл'г; - как иуп.ртш: ГЭГ-€000 производства Фирн "Se!-, г" !С?Г; ,. '•"Il-'í" ,

так к отечественный СЗГ-ИЕ, tur .'.--.аекы* ¡'.ьаксв*.- 5рйкк-:г

заведом тонкого органического синтеза по Т/ ?~'--a£5-5í.

Кажау» серию сывороток характесизогаля по tur/.?.;. -химическим (pH, прозрачность, оеммгиче:к:~ давление. аминехис-лотньш и ионныи состав!, биохимическим 'гемоглобин, '-п;и белок, фракционный состав белков, а- и 3-лидгдсстеидн. холестерин, .«ирные кислоты1 и биологическим стерильность. токсичность, ростстимулирумаая активно;ть, виру екая и чикоп-лазменная контаминация; показателям.

Для оценки ростстии'лиоваей активности и токсичности сывороток крови различных видов животных использовали диплс-идные(Л-56, ДХ-56i дк-ci) и перевиваемые (Namalva. гКХ-;! КС -13). ЛЗЧ, Raj., vero, к-562, г IORCYj-Ag;.¿.5) клеточные линии из банка клеточных культур НПО "Beктос", Работа выполнена в сотрудничестве с с.н.с. РадаезоИ й.ф.. с.н.с. Закчдкнси Л. р., с.н.с. Немцовым ¡O.E.

Изучение возможности использования сывороток крови =аэ-личных видов животных для получение гибридом, продупирукеих монсклональные антитела, проводили на клеточных культурах мыаияои P'-Ns-1/1-A.g4. i и крысиной сЮ 'CYt-"o: . 2. 3 миелом из коллекции Онкологического центра АНН СССР. Работа выполнена в сотрудничестве с к.б.н. Разумозкм И.А.

Для изучения накопления внутриклеточного антигена вируса гепатита А (ВГА) использовали зтамм has-!5. Культивирование провопили на к'-льтур? клеток почек африканской .зеленей мартышки (линия 4647) о применением сывороток кесви различных животных. Работа заполнена s сотрудничестве с Нондасенко З.П.

исследование возможности культивирования клеток з

присутствии сывороток косей различных видов животных проводили на моноцитарнои линии ЗРК-ИРА/J. Работа выполнена э сотрудничестве о с.н.с. Мамаевой O.a.

Влияние различных сывороток на культивирование клеток насекомых изучали на перевиваемых линиях клеток ясяаса непарного вепнепряда GC'lc-i?:, яичников ¿лопкозой совка *Н-ХС 635 и МЕ-04. Работа выполнена з сотрудничестве с ч.б.з. .-го-лекольцегеи Т.Д. и к.с. Герасимовой Я.Г.

Для работы использовали питательные с о еды Згла SPM14Í0. Д>ЕМ:«!, ПСС(ЛЭЧ), ПССхЗЯХ) , Гр»аса Я ДР., изготовленные s отделе питательных сред НПО "Вектор" з соответствии о качественными zcy.азателлми, требуемыми по tа;мaroпей-

- S -

ныл статьям или другой научно-технической документации.

Все эксперименты повторены не менее 3-5 раз, данные суммировали и обрабатывали статистически с использованием Т-критерия Стьюдента с вероятностью 95х.

Разработка опытно-промышленной технологии получения сывороток крови различию видов животных. С 1984 года были начаты эксперименты по разработке технологии получения сыворо-. ток крови различных видов животных для культур клеток, В основу разработок были положены известные методы получения сывороток крови плодов коровы и крупного рогатого скота в учреждениях страны и зарубежных Фирм.

При разработке технологии отработаны режимы отдельных, влияющих на качество готового препарата стадий технологического процесса и их масштабирование. Показано влияние условий предварительной обработки посуды, предназначенной для сбора крози,на содержание гемоглобина в сыворотке и взаимосвязь данного показателя с биологическими свойствами готового препарата (ростстимулирувщая активность и токсичность).

Показано влияние времени отстаивания на физико-химические (рЕ, прозрачность, осмотическое давление) и биохимические показатели ( общий белок, гемоглобин, жирные кислоты), а также взаимосвязь данных показателей с ростстимулирующей активностью. Причиной низкой ростстимулирующей активности сыворотки ножет быть повышенное содержание в ней гемоглобина и жирных кисллот, что согласуется с данными ряда авторов (Boone et а).,1972; Игудин и др., 1983). Определено наиболее эффективнее и оптимальное время отстаивания сыворотки крови различных видов животных, которое значительно отличается от условий проведения процесса по общепринятой технологии. Основными критериями оптимизации были качество готового препарата и трудоемкость.

Кроне общеизвестных методов отделения клеточных элементов (отстаивание и . центрифугирование), была показана возможность применения глубинных фильтров СУЦРА-ВО на установке "Орион" или микрокапроновых мембран, используя отечественную ультрафильтрационную установку УФК-1,5. Показано, что применение предложенных методов отделения клеточных элементов крови не приводит к ухудшению Физико-химических, биохимических и биологических свойств сыворотки крови по сравнен«» с широко используемым общеизвестным методом

центрифугирования. Применение метопа отстаивания, по сэазгнг-нию с вышеназванными методами, приводит к псЕьпению содержания гемоглобина в сыворотке крови и снижению ее ростстимули-рующей активности.

Получены данные о -Фильтруемости сывороток, зеличина которой зависит от вида и возраста жиЕотного-дснора и от таких Факторов,как кормление животного, питьевой сежим, температура окружающего воздуха и др. Определены условия забора крови у животных-доноров и установлен ряд фильтруености сывороток в порядке ее увеличения: сзиная, морских свинок, крупного рогатого скота, кроличья, суягных овец, лошадей, северных оленей, новорожденных телят, плодов овец, плодов коровы, свиней, обработанная ПЭГ и KFC, обработанная ПЭГ. Определены пересчетные коэффициенты фильтруемости сызоооток крови различных видов животных по отношен:«) к сыворотке крови плодов коровы.

Испытание отечественных Фильтоугодмх материалов и оборудования для стерилизующей фильтрации сыворотки. Обычно для стерилизации сыворотки из отечественных фильтруксих материалов применяют глубинные фильтры типа Сф, которые имеют ряд технологических недостатков (малая пропускная способность, длительность процесса фильтрации, возможность размножения микроорганизмов внутри самого Фильтра и др.) Наиболее эффективными являются импортные мембраны фирм "ймлнпср", "Паял", "Сарториус" и др.

Установлено, что,из широкого спектра выпускаемы! о настоящее время отечественных Фильтрующих материалов и испытанных нами для мембранной фильтрации сыворотки крови, наиболее перспективными являются: в качестве стерилизуюсей нвнбраны -микрокапроновая с размером пор 0.2 мкн; з качестве фильтрующих - ацетат-целлюлозная типа НфЦ N3 и N4 или никрокадроно-вая с размером пор 0.45, 0.6 и I.= мкн; з качестве зредфидь-тров - картон Фильтровальный для биологических хидхостей (С слоя) .

3 настоящее время зарубежные Фирмы в арскьиленнсм производстве сыворогск очень вироко используют патронные яли комбинированные (сочетатоие достоинства глубинной и мембранной Фильтрации) фильтры (Soutbern, Ratz, i533; Spcx,1337). Показаны преимуцества системы стерилиз/кзей Фильтрации сызо-рстки на установке "Орион* с набором комбинированных Филь-

трое КОКИ?.1. Р-юо по сравнению с широко используемой в отечественной практике установкой Рф-79 с набором глубинных фильтров СФ {высокая надежность процесса стерилизации; при Филътрадии поверхности в 5 раз меньшей, чем с Фильтрами СФ, об-^ем профильрованной сыворотки сопоставим, время фильтрации значительно сокращено). Располагая опытными образцами нового отечественного оборудования (КП1 0.4-1К-01, КПГ 1.2-ЗК-01) и набором отечественных патронных элементов (ПФ-2-02, Пф-Е-04) , кы испытали эти более производительные, по сравнению с исковыми, системы стерилизующей фильтрации для стерилизации сыворотки крупного рогатого скота.

Применение отечественной патронной установки по сравнении с импортной установкой "Орион" с обводной камерой и набором комбинированных (КОКЕРА Р-ЮО) и глубинных (СУПРА 60) Фильтров, при сопоставимой полезной площади Фильтрации по производительности, времени Фильтрации и пропускной способности достоверных различий не обнаружено. Системы обеспечивает получение стерильного препарата. Однако препарат сыворотки крови, полученный с использованием отечественных патронных элементов, оказался токсичным для культур клеток, что связано, по-видимому, с технологическими особенностями производства патронных элементов (гофрирование материала, применение клея для закрепления мембран и т.д.), что не позволяет внедрить их в настоящее время в опытно-промышленное производство сывороток крови.

Разработка технологии получения сыворотки с улучшенными свойствами. Обработка сыворотки крупного рогатого скота по-лиэтиленгликолем приводит к эффективному удалению из нее ми-коплазм, вирусов, антител, иммуноглобулинов, липопротеиное (Шдюг ег а!., 1975; Ваггеппд, 1977; Кгудин и др., 1980; СПагЬег ег а!., 1981). Имеются данные по использованию такого способа очистки сыворотки в производстве вакцины против вируса янура (ВаггеПпд, 1977, меэятга, 1980). Однако отмечалось .(СЛагЬег е! а!., 1981), что хранение очищенного ПЭГ препарата сопровождается помутнением сыворотки, нарушением гомогенности ее состава из-за выпадения значительного количества осадка.

В данной саОоте показала возможность реализации кру'пно-касЕгтабной технологии получения улучшенного качества сывороток крсви КРС. Существенным упрощением технологического

процесса является обработка сыворотки ПЭГ уже на стадии получения полуфабриката. Последующие за обработкой полуфабриката 3-5 кратные циклы замораживания-оттаивания исключают трудоемкую стадию центрифугирования, снижают количество остаточного ПЭГ в готовом препарате, позволяют регулировать белковый состав сыворотки, а полученный препарат стабилен по состазу и биологическим свойствам не менее года. Показано, что обработка сыворотки ПЭГ приводит к снижению содержания общего белка, гемоглобина, триглицеридов, почти "полностью удаляются а- и ß-липопротеиды, незначительно повышается осмотическое давление, при этом показатель ионов водорода и аминокислотный состав практически не изменяется.

Несмотря на наблюдаемое падение концентрации общего белка с каждой последующей стадией замораживания-оттаивания (з течение 3-5 циклов), достоверных различий в ростстимули-рукяцей активности для широкого спектра перевиваемых клеточных линий (Namalva, Vero, ВЯК-21(С-13), ЛЭЧ, CV-1, ЭВК-ИРА/З) не обнаружено.

Этот модифицированный метод был с успехом применен и для обработки сывороток крови других видов животных, в частности свиней, северных оленей, суягных овец.

Изучение возможности получения и использования лимфы крупного рогатого скота для культивирования клеток. Принимая во внимание ограниченность имеющихся данных о применении лимфы в биотехнологии и возросший интерес в последние годы зарубежных исследователей к данной биологической жидкости (Бейли, Оллис, 1989), нами была показана возможность получения лимфы КРС (в условиях жизни животного, близких к нормальным^« грудного протока путем создания внешнего лимфо-веноз-ного анастомоза.

Сравнение Физико-химических и биохимических показателей показало, что для лимфы характерно более низкое содержание обаего белка (в 1.5-2 раза), у-глобулинов (в 2 раза) и ионов калия (в 3 раза) по сравнению с сывороткой КРС. По содержанию альбумина линфа сопоставима с сывороткой крови плодов коровы. Содержание аминокислот в лимФе в основном соответствует их содержанию в сыворотке КРС, за исключением фенила-ланина и аргинина, концентрация которых в лимфе значительно выше.

Показано, что лимфа не пригодна для культивирования

диплоидных клеточных линий, но может Сыть с успехом применена для культивирования перевиваемых клеточных линий типа ВНК -21 (С-13) и ЛЭЧ. Возможность же непрерывного получения лимфы в условиях жизни животного, может стать перспективным при перфузионном методе культивирования клеточных культур.

Исследование свойств сывороток крови различных видов животных и их пригодности для культивирования культур клеток. Наиболее часто используют в практике культуральных работ сыворотки крови плодов коровы и крупного рогатого скота. Свойства других сывороток мало изучены, и* пока ограниченно применяют^; в культивировании клеточных культур и вирусов. Поэтому одновременно с разработкой технологии получения сывороток крови различных видов животных проводили изучение Физико-химических, биохимических и биологических свойств готовых препаратов и их сравнительный анализ.

Установлено, что наиболее богаты по содержанию аминокислот сыворотки крови плодов коровы, плодов овцы, суягных овец и свиней (842-622 мг/л)в 1.5-2 раза беднее - сыворотки новорожденных телят, телят и взрослых северных оленей, лошадей (488-440 мг/л); минимальное количество аминокислот содержат сыворотка, плазма и лимфа КРС, а также сыворотка морских свинок (360-315 мг/л). Выявлены значительные колебания в содержании индивидуальных аминокислот в сыворотках кроги различных видов- животных.

Обработка сыворотки ПЭГ существенного влияния на аминокислотный состав сывороток не оказывает, так как достоверные различия не обнаружены.

Показано, что различия в содержании общего белка обусловлены возрастом животных и их видовой принадлежностью. Наименьшим содержанием белка характеризуются сыворотки плодов коровы и новорожденных телят до принятия молозива (40-45 г/л), максимальное содержание белка в сыворотке.крови взрослых животных, причем сыворотка крови свиней имеет более высокое содержание общего белка (85 г/л) по сравнению с сыворотками крови других видов животных (65-80 г/л).

Содержание у-глобулинов в сыворотке крови свиней и северных оленей значительно ниже;чем в сыворотке КРС. Выявлена корреляционная зависимость содержания ионов кальция и магния в сыворотке крови различных видов животных. Показано, что значительные колебания содержания ионоз калия и нат-

рия в сыворотке связаны с методом забора крови и временем отстаивания и могут служить одним из показателей оценки технологии получения полуфабриката сыворотки крови.

Показано, что сыворотка крови плодов коровы, полученная по разработанной технологии, по физико-химическим и биохимическим показателям не имеет достоверных различий, а по рост-стимулирующей активности для клеточных линий не уступает импортным аналогам производства Фирм "Gibco" и "Flow*.

Сыворотки крови плодов овцы, новорожденных телят и телят северных оленей, полученные по разработанной технологии, по ростстинупирующей активности не уступают сыворотке крови плодов коровы и могут быть использованы для культивирования диплоидных (ДК-58, Л-68, 4647) и перевиваемых клеточных линий (Vero, Namalva, Raji, к-562, 2I0RCY3-Agf.2.3 и др.).

Весьма перспективной оказалась (полученная в условиях разработанной технологии; сыворотка крови свиней для культивирования лимфоидных (Raji, к-562) и миелонных (210RCY3-Ag1. 2.3) клеточных линий, вместо традиционно используемой сыворотки крови плодов коровы, что согласуется с данными Наяци-гина с соавт. (1983).

Показана возможность суспензионного культивирования клеток ЯЭЧ в среде с уменьшенным содержанием до 5'/, сыворотки крови свиней, причем ростовые свойства ..... сравнимы с данными, характерными для сред с добавкой 10'/. сыворотки КРС, что указывает на перспективность применения сыворотки крови свиней для крупномасштабной клеточной биотехнологии.

Ксследозание влияния различных видов сывороток коови на уровень продукции антигена вируса гепатита А. При культивировании вируса гепатита А (ВГА) на среде, содержащей сыворотку крови различных видов животных>показано, что наиболее стабильные и высокие титры (2*) ВГА получены в клетках, культивируемых на среде с фетальной сывороткой (FBS) производства "Gíbco" и сывороткой крови плодов коровы , плодов овцы и суягных овец, лолученннх по разработанной технологии. В присутствии сыворотки лошади клетки нарабатывали антиген с устойчивым титром г3-5. На средах с применением сыворотки КРС, обработанной ПЭГ,или морских свинок титр, вируса неустойчив и колеблется от 22-5 до г3,5. Самые низкие титры характерны для сред с сывороткой, крови КРС (21,8).

- н -

Изучение возможности использования сывороток крови различных видов животных в гибридомной технологии. Показано, что ниеломная клеточная культура 210 КСЧз-Ад(.2.3..сохраняет высокий уровеньпролиферативнсй активности при культивировании на питательных средах с добавлением сывороток крови плодов коровы, плодов овцы и свиней, полученных по разработанной технологии (в качестве контроля .применяли пзз "С|Ьсо"). Сыворотка КРС в составе питательной среды вызывает дегенера- -цию клеточной культуры уже после 3-го пассажа.

Анализ влияния различных сывороток на эффективность клонирования (ЭК) гибридных клеток показывает, что средние значения ЭК культуры 2(0 КСУз-дд1.2.3 в случае использования

сиеоцс

испытуемых и контрольныхчГВЗ "ОЮсо" и "По«") достоверно не отличаются. Наблюдается значительный разброс значений ЭК от серии к серии сыворотки, что согласуется с литературными данными. Выявить зависимость ЭК клеточной линии от Физико-химических или биохимических показателей нам не удалось, не прослеживается зависимость данного показателя и от рост-стимулируюаей активности. Следует отметить, что максимальные значения ЭК получены на питательной среде с добавлением сыворотки плодое овцы при значительном разбросе значений ЗК различных серий данной сыворотки. Наиболее стабильные величины ЭК были выявлены при использовании свиной снворот-ки, даже при снижении ее концентрации в питательной среде з 2 Раза по сравнению с сывороткой плодов коровы.

Вполне удовлетворительные результата клонирования клеточкой культуры 210 ЯСУз-Дд1.2.3 получены при применении лимфы к?0 сочетании с сывороткой крови плодов коровы или свиней,в том числе для случаев с уменьшением концентрации последней в составе полной питательной среды.

С целью оценки злияния различных сывороток на эффективность образования гибридов проводили гибридизацию и подсчет индекса слияния (ИС). Показано, что испытуемые сыворотки (плодов коровы, плодов овцы и свиней) по своим свойствам не уступают традиционно используемой в исследованиях фетальной сыворотке зарубежных фирм. Возможно, что наиболее перспективной из изученных может стать свиная сыворотка, обнаружившая самый большой индекс слияния - 12.7.. Необходимо также отметить, что при использовании сыворотки крови плодов овцы

для получения гибридом, несмотря на наличие значительного количества гибридов, положительные ги&ридомы, секретирушие ионоклональные антитела, не были выявлены.

Установлено, что важное значение для сыворотки крови, используемой в гибридомной технологии, имеют условия ее хранения. Нами показано, что использование хранившейся сыворотки кроеи плодов коровы при температуре 4-8°С в течение 5-х месяцев приводит к снижению ЗК культуры клеток £10 ВСУз-Ад1.Е.З (более чем в А раза) по сравнению со свежеприготовленной, но на оказывает существенного влияния на ростстиму-лирующую активность для данной клеточной культуры. Хранение сыворотки крови при температуре минус го'с не приводит к снижению ЗК для клеточных культур.

Изучение возможности использования сывороток крови различны?: видов животных в культивировании кяеток-продуаентов ВИЧ-1. При испытании образцов сывороток крови различных видов жиботных в составе питательных сред в условиях роллерно-суспензионного культивирования моноцйтарной клеточкой линии ВИЧ-1 в течение 14 пассажей установлено, что сыворотка крови плодое коровы, полученная по разработанной технологии, не уступает по своим свойствам импортным аналогам. Необходимо отметить, что по данным электронной микроскопии пси культивировании клеток ЗВК-ИРА/З на средах, содержащих сыворотку КРС, обработанную ПЭГ, возрастает вакуолизация клеток в процессе пассирования. Однако уровень вир/спродукции, определяемый имкуно-Ферментным анализом (ИФА) , г.с сравнению с контролен, не снижается.

Использование различных сывороток для культивирования клеток насекомых, используемых в производстве энтомопатоген-ных препаратов. Для решения проблемы получения энтомопато-геннпх препаратов в культуре клеток насекомых решающее значение имеет наличие эффективных пита::льных сред.

Было показано, ' что скворотк- крови плодов коровы, долеченная по рзэработаннои технологни, не уступает по рост-еткмулируюаей активности для клеток насекомых импортным аналогам. наиболее перспективными для культивирования клеточных линии насекомых (501-0-135, кв-04, ив-ХС-635) являются сыворотки крови плодов короеы, плодов свцы, суягных овец и новорожденных телят, а для АеаеБ аедурь - сыворотки крови северных оленей и КРС.

Свияая сыворотка мало пригодна для культивирования клеток насекомых, так как добавление ее в питательную среду в количестве 10% вызывает гибель клеток; при уменьшении ее содержания до 2-53, хотя поддерживается рост клеток, но существенно меняется их морфология.

Сыворотки крови лошадей и КРС не пригодны для культивирования клеточных линий насекомых БСЫ. - 135,МВ-0А и МБ-ХС-665.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и внедрены в производство опытно-промышленные технологии получения сывороток крови различных видов животных (плодов коровы, плодов овцы, крупного рогатого скота, свиней, северных оленей), позволяющие существенно улучшить качество готовых препаратов за счет модификации технологических стадий подготовки посуды отбора крови, отстаивания и отделения клеточных элементов.

2. Впервые установлен ряд фильтруемостя сывороток крови различных видов животных (в порядке ее увеличения):сеииэя, морских свинок, КРС- »кроличья, суягных овец, лошадей, сеЕерных оленей, новорожденных телят, плодов . оЕец, плодов коровы, свиней, обработанная ПЭГ, КРС, обработанная ПЭГ;.Показана возможность применения широкого спектра отечественных фильтрующих материалов и оборудования для стерилизующей фильтрации сыворотки, рекомендованы и внедрены в производство наиболее перспективные.

3. Разработана оригинальная опытно-промышленная технология получения сывороток крови (КРС, свиней, оленей, овец) с улучшенными свойствами путем обработки сыворотки-полуфабриката полиэтиленгликолем. Особенностями предлагаемой технологии является введение 3-5 кратного цикла заморалзхвакия - оттаивания обработанной сыворотки, что позволило исключить трудоемкую стадию центрифугирования.

регулировать белковый состав сыворотки и получать готовый препарат, стабильный по составу и биологическим свойствам не менее года.

4. Показано,что сыворотка крови плодов коровы, полученная в условиях разработанной тэхколзпск, при культивировании диплоидных и перевиваемых клеточных линий,rî:ipi:::o;,i к вирусов не уступает импортным аналогам производства фирм "C-îboo", "Flou", "Serra". Данные исследования позволили определить требования к качеств." готового препарата и внести изменения в действующею НХД ка сыворотку крови плодов коровы (ФС 42-7ВС-85) по показателям :подлкнность, содзрясагаге . обкего белка, рН, осмотическое давление, стерильность, специфическая активность, условия хранения и срок годности.

5. Впервые проведен, сравнительный анализ сывороток кр'оеи различных зевотных (плодов коровы, плодов овцы, суягных овец, новорожденных телят, телят п взрослых оленей, КРС, свиней, логгадей", морских свинок, КРС и свияей, обработанных ПЭГ, лимфы и плазмы КРС) по физжо-хгэдаческпм (прозрачность, рН, осмотическое давление, аминокислотный и ксккый составы), биохимическим (гемоглобин, обгий белок г йакдиояный состав, гарные кислоты, и ^ -липопротепды /""и роотстямулирупцей активности для диплоидных (Л-68, ДК-58, ¿€¿7) и перевиваемых (Kaji, К-562, Samalvs ,Vsro, 210RC Y-Ag1.£-3, Л5Ч к др.) клеточных лгсэкй.Всесторонние исследования свойств сывороток крови различных «квотных позволили определить основные показатели качества готовых препаратов и использовать их при разработке НГД, выбрать наиболее еф^ективиыз сыворотки для клеточной биотехнологии и рекомендовать кх для культивирования сирского спектра культур клеток и вирусов.

6. Показана возмогвость замены сыворотки крови плодов коровы на сыворотку плодов оеиы, нсьорс^емых телят пли телят ееьерага -оленей при' культясяровачка диплокдаых (Л—63, дч-53, 4в47) и переы;взе;лых клеточных лжкй «sasкспктзвспх ШжваХгг, Vei-o, CV-1, К-56?., 210RC ï-Agi.2.3;

к насекомых (SCbd-135, M3-G4, ' MS-XC-SS5 ). Показана дэрсяэктивнссть использования сыворотки кровя свiniei для суспензионного культивирования перевиваемых клеток Л5Ч и в га5рэдс.\гасй. технологии, а сывороток крови К?С н свиней, обработанных ПЭГ, для культивирования клеток-продуцентов ЕКЧ-1.

7. Показана вссможностъ получения и применения лимфы крупного рогатого окота для культивирования перевиваемых клеточках линий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Ояытно-прсмыиленный регламент. Еа производство сызоротк;: крови плодов коровы. ОП? 64-0123-03-87.Авт. Г.А.Костина, О.П.Аверпхян, М.А.Андреевз-133о.

2. Опытно-промышленный регламент на производство сыворотки кгози крупного рогатого скота й сакней. ОП? 64-0123-Q7-53. Азт.:Г.А.Кост:с-:з, О.П.Аверпыш, -И.А.Андреева, H.S.-IypsnKCsa- 146 с.

3.Изменения N1 к <IC 42-?ЕС-а5, Сыворотка крови плодов корсви зтагсая. Азт.: Г.А.Костина, Я.Ф.РздаеЕз- 6 с.

4. Изменения N2 к ФС 42-7ЕС-35. Сыворотка крови плодов Kcposa жидкая. Авт.: Г. А.Костина, Е.Д.Дубогекой, -Т.И.Бар/ляшская- I с.

5. ПзнтедаеваН.Г., Герасимова Н.Г., Кондранн Ю.Б. Костина Г.А., Василенко С.К. Поиск сыгорстск- еожейти^:'втап разработки клеточкой технологии. производства Бирусн_;>: препаратов.- Биологические и технологические проблемы создания вирусных пр^тасатов для интегрированной заапты растений. Материалы отраслевого соз-.-цаакя. п.Кольцоео, Новосибирская обл., „6-2S сентября IS89 г., Новосибирск, 1&ЗЭ, с. 50-5.2.

6. Костика Г.А., Бокдарекко E.H., Бадаева И.'5. СыЕсроткя крови различных асшотрых для культивирования' клеток в производстве вакцинных. к диагностических препаратов.- Тезисы докладов III Всесоюзного совещании

КультныфсЕзхгке г;летсь: животных к челсьекз, Пуддсис,

7. Колс-ссльцевз Т.Д., Коот;:кз Г.Л., Герго.-з-тогг- К.Г. Кслольгсаакие рзглгспяс сывороток для культлЕогроьзхил nepebnaaeiioi; клеток касег.смих.- Тезисы докладов 1X1 Боеоокзисго совещания. Кулътиьпрсв.знхи клеток пгвстмых г человека, Пушгэс, 1990, с. Т05.

S. Кссткна Г.Д., Фурггжсва H.S., Каумсьг H.B. Опытяо-зрскгегденнгя тегеология кгггтс&к&акя свзорсткк крсхж реглгазл кпботеех даю куляхЕЕрозаккя кяеточниг куль тур. -Тезкон дупхадов коа*«ренцгя. ?'аЕра£сткг я производство препорзтсв Сйот#звологе2,

1£з0, ч.2, c.sg-s7..

Андреева М.А., Ксстлка Г.А-, Ко\:оов.з O.A., Гсрзскксга Н.Г. УлучЕегзие. cscJIcts сыворотет крутого рогатого окота и cunseS.- Тезисы доо.лодоз кгыТ-ерены;::;. ГзсузЗсгга я производство среггротсз «едагдшсксй

15'ЭО, ч.£, 3.172

10. Радаеьа К.С., Костгна Г.А., Аверсты О.П., Еггров 5.3. Получек:? и :.р:г.:еяек::е сывороток олоеоП к свец для культд5.прэг.гкдя клеточных ляеий.- Еготсхнздегпя, I85D, 4, о. C6-3S.

11. Андреева Костим Г.A., Лызхер Т.З. > Радэеза К.5>. Ергменеккз ■ отечественных ме:„:Сра1гкых фильтров для стерклпзыкп сыворотки.- Еистехнолсгхя, 1930, 4-, с. 46-43.

12. Ко;.сгк?_ -Т.П., Костина Г.А., Грачегз С.Ф. Питательные среди, рзетвтры и сыворотки для клеточной йазгехяологик..-йатзризды Есесопэ-яото ссвеазная "Г/злеку.члркзя Сксяогкя •ЗНгС-гсдер&жгпх вирусов, име. ¡sex срзкигчеокое гнзчеже для сельского х=гй5гтг.а к медапяа»", Киев, 9-II октя'рр.ДйЕ-О г.