Применение комбинаций сывороток крови различных видов животных для культивирования клеток и репродукции вирусов

Ганиев, Ильнур Махмутович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Применение комбинаций сывороток крови различных видов животных для культивирования клеток и репродукции вирусов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Применение комбинаций сывороток крови различных видов животных для культивирования клеток и репродукции вирусов"

На правах рукописи

003054284

ГАНИЕВ ИЛЬНУР МАХМУТОВИЧ

ПРИМЕНЕНИЕ КОМБИНАЦИЙ СЫВОРОТОК КРОВИ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ЖИВОТНЫХ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК И РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСОВ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ульяновск - 2007

003054284

Работа выполнена в лаборатории культур клеток и гибридомной технологии отдела инфекционной патологии в Федеральном государственном учреждении «Федеральный Центр токсикологической и радиационной безопасности животных» (г. Казань)

Научные руководители: доктор биологических наук

ГИЛЬМУТДИНОВ РУСТАМ ЯКУБОВИЧ

кандидат биологических наук ГУРЬЯНОВ НИКОЛАЙ ИВАНОВИЧ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

ЕЖКОВА ГАЛИНА ОЛЕГОВНА

доктор биологических наук, профессор ВАСИЛЬЕВ ДМИТРИЙ АРКАДЬЕВИЧ

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский

институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко, г. Москва

Защита состоится « 22 » февраля 2007 г. в 9Ш часов на заседании диссертационного совета Д 220.065.01 при ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия по адресу: 432980, г. Ульяновск, бульвар Новый венец, 1 тел. 44-30-58.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия».

Автореферат разослан « » января 2007 г.

Ученый секретарь „--г—-

диссертационного совета О^Р/Р^^-'-^^^Пыхтина Лидия Андреевна

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В решении современных как теоретических, так и практических проблем ветеринарной биотехнологии, значительное место занимает культивирование клеток из тканей животных и человека in vitro (77.Я. Дьяконов, В.И. Ситьков, 2000; Е.А. Рубан и др., 2000; D. Jayme et al, 1988 и др.). Они являются важным объектом при изучении канцерогенеза и дифференцировки клеток, в вирусологических, биохимических, молекулярно-генетических и других исследованиях.

В связи с этим актуальна проблема разработки условий наиболее эффективного их выращивания. Важнейшей составной частью питательных сред, содержащей факторы роста клеточных популяций, является сыворотка крови животных. Она продолжает оставаться незаменимым компонентом ростовой среды для большинства клеточных и органных культур (Р. Адаме, 1983; Д. Конки и др., 1989; Н.И. Гурьянов, 1992; Л.И. Хижняк, В.Т. Ночевный, 1994; A.JI. Рянский, 2001; W. Tayler, 1974 и др.). Значение сыворотки крови для роста клеток, выявление ее компонентов, стимулирующих их пролиферацию, являются предметом интереса многих исследователей (М.А. Андреева и др., 1996; Г.А. Костина и др., 1996; A.JI. Рянский, 2001 и др.). Несмотря на наличие ряда рецептур бессывороточных культуральных сред, последние не в полной мере обеспечивают рост и пролиферацию клеток, а также репродукцию вирусов. Эти процессы наиболее интенсивны при наличии в среде одновременно низко- и высокомолекулярных компонентов сыворотки (P. Laino, В. Mendino, 1976; А. Nemeskery et al, 1976). Чаще всего в культуральных средах используют сыворотку крови крупного рогатого скота. Из литературных источников {Л.П. Дьяконов, В.И. Ситьков, 2000; A.JI. Рянский, 2001; Е. Evege et al, 1985; D. Jayme et al, 1988 и др.) следует, что лучшей является сыворотка крови плодов крупного рогатого скота, но ее широкое использование лимитировано, прежде всего, дефицитом и высокой стоимостью. Для уменьшения расхода этого дорогостоящего компонента среды прибегают к замене ее сывороткой крови других видов животных или добавлению в питательные среды очищенных факторов роста, гормонов и белков (А.А. Нариманов, 1991; W. Cleveland et al., 1983; S. Reuveny et al., 1986; D. Velez et al, 1986), многие, из которых являются не менее дефицитными и дорогостоящими. Поиск более дешевых и доступных ростстимулирующих компонентов, перспективен. При культивировании клеток используют гомо-и гетеровидовые варианты сыворотки крови животных. Поскольку химический состав сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей и свиней отличается, можно предположить усиление, по принципу дополнения, ростстимулирующего эффекта при их комбинации на культивируемые клетки и повышение репродуктивной активности отдельных вирусов на конкретных культурах клеток за счет отсутствия или снижения концентрации в сывороточном компоненте антител к данным вирусам.

Нам известен лишь один пример (С. Hedy, К. Curry, 1986) применения комбинированных сывороток: 10 % сыворотки крови плодов коров и 90 % сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота, хотя следует отметить, что сыворотки крови, входящие в данную комбинацию, принадлежат к одному виду животных.

Цель и задачи исследований. Цель работы состояла в оптимизации сывороточной составляющей питательных сред для выращивания культур клеток и репродукции на них вирусов. Для достижения указанной цели решались следующие задачи:

-сравнительно исследовать физико-химические и биохимические показатели сыворотки крови бычков, лошадей, свиней и их комбинаций, тем самым установить наиболее существенные различия в их составе и влияние отдельных сывороточных компонентов на биологическую активность при культивировании клеток;

-изучить ростстимулирующий эффект сывороток крови бычков (СКБ), лошадей (СКЛ), свиней (СКС) и их комбинаций (СКБ + СКЛ, СКБ + СКС, СКЛ + СКС) в различных соотношениях на перевиваемые культуры клеток SPEV, MDBK и TR;

-оценить репродукцию вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и парагриппа-3 (ПГ-3) на перевиваемых линиях клеток, выращенных с использованием сред, содержащих сыворотки крови бычков, лошадей свиней и их комбинации.

Научная новизна работы. Впервые рассматривается возможность введения в практику культивирования клеток комбинаций сывороток крови разных видов животных в качестве ростстимулирующего фактора питательной среды.

Показано, что сочетание сывороток крови животных (особенно бычьей и свиной, лошадиной и свиной) в соотношении 1:1, усиливает стимулирующий эффект на пролиферацию перевиваемых культур клеток SPEV, MDBK и TR, в сравнении с моносыворотками крови этих же видов животных.

Установлено положительное влияние определенных комбинаций сывороток крови животных (бычья и свиная, лошадиная и свиная) на репродукцию вирусов ИРТ и ПГ-3 в перевиваемых культурах клеток MDBK и TR. При культивировании клеток на питательной среде с использованием комбинации сывороток крови бычков и лошадей увеличения урожая вирусной массы не обнаружено.

Практическая ценность работы. Предлагается метод снижения негативного влияния присутствия в сывороточном компоненте культуральной среды соответствующих вирусспецифических антител, путем сочетания сывороток крови различных видов животных. Использование в качестве ростстимулирующего фактора гетеровидовых сывороток крови позволяет снизить вероятность вирусной контаминации культур клеток. Применение в качестве биологически активной добавки в питательные среды комбинаций сывороток крови разных видов животных (бычков и

свиней, лошадей и свиней) улучшает рост культур клеток и, таким образом, опосредованно, увеличивает интенсивность репродукции вирусов. Комплексное позитивное влияние комбинаций сывороток дает возможность снизить себестоимость изготовления вирусных вакцин, получаемых на культурах клеток перевиваемых линий, за счет усиления репродукции вирусов и, как следствие, увеличения вирусной массы.

По результатам научных исследований разработаны методические рекомендации по использованию комбинаций сывороток крови бычков, свиней и лошадей для культивирования клеток и репродукции на них вирусов, утвержденные директором ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» г. Казань от 30.10.2006 г.

Апробация работы. Материалы, представленные в диссертации, доложены и обсуждены на международных конференциях: "Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний", посвященной 45-летию ФГУ «Федеральный Центр токсикологической и радиационной безопасности животных» (Казань, 2005); "Лекарственные средства для животных и кормов. Современное состояние и перспективы", посвященной 75-летию образования "ВГНКИ" (М., 2006); "Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных" (Ульяновск, ФГОУ ВПО «УГСХА», 2006), а также Всероссийской научно-практической конференции "Перспективы агропромышленного производства регионов России в условиях реализации приоритетного национального проекта "Развитие АПК" (Уфа, 2006); конференции "Современные проблемы клеточной биотехнологии и сохранение генетических ресурсов", посвященной 50-летию научной деятельности Дьяконова Л.П. Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (М., 2007).

Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе в Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана, а также в производственном процессе - в лаборатории культур клеток и гибридомной технологии ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» г. Казань.

Основные положения выносимые на защиту: -за счет сочетания биохимического состава сыворотки крови свиней с компонентами сывороток лошадей и бычков, биологическая активность сывороточной составляющей питательной среды усиливается;

-хорошую пролиферацию перевиваемых клеток 8РЕУ, МОВК и ТЫ из моносывороток обеспечивает сыворотка крови свиная, а ее комбинации (1:1) с сыворотками крови лошадей и бычков наиболее благоприятны для роста клеток;

-увеличение репродукции вирусов на перевиваемых культурах клеток, выращенных на среде с использованием комбинаций сывороток крови животных вследствие отсутствия или снижения концентрации в них

специфических антител к соответствующим вирусам и повышения пролиферации клеток.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.

Реализация результатов исследований. Результаты исследований используются: в учебном процессе на кафедрах микробиологии и физиологии животных Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана (г. Казань), а также в производственном процессе в лаборатории культур клеток и гибридомной технологии ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» г. Казань при культивировании перевиваемых линий животных клеток для изготовления вакцин.

Директором ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань) от 30.10.2006 г. утверждены методические рекомендации по использованию комбинаций сывороток крови бычков, свиней и лошадей для культивирования клеток и репродукции на них вирусов.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 135 страницах компьютерного текста, состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, библиографического списка литературы и приложений. Работа содержит 25 таблиц, проиллюстрирована 11 рисунками. Список использованной литературы включает 243 библиографических источника, в том числе 110 на иностранном языке.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились в лаборатории культур клеток и гибридомной технологии совместно с лабораториями вирусологии и биохимии отдела инфекционной патологии ФГУ «Федеральный Центр токсикологической и радиационной безопасности животных» (г. Казань) в период с 2003 по 2006 годы согласно государственной программе НИР (№ гос. регистрации 01.20.0202602).

Материалом для получения сыворотки служила кровь клинически здоровых животных из ОАО «Казанский мясокомбинат». Кровь брали у бычков массой от 300 до 400 кг, у лошадей - 200-500 кг и у свиней - 60-150 кг специальными системами в бутыли емкостью 10 литров. Все этапы получения сывороток крови животных осуществляли по единой методике Н.И. Гурьянова (1992).

Для оценки ростовых свойств сывороток крови in vitro использовали постоянные клеточные линии SPEV, MDBK и TR из коллекции ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань): 1. SPEV - перевиваемая линия клеток почки эмбриона свиньи, полученная КС. Куликовой (1960). 2. MDBK -перевиваемая линия клеток почки эмбриона крупного рогатого скота, полученная S. Madin, N. Darby (1958). 3. TR - перевиваемая линия трахеи эмбриона крупного рогатого скота, полученная О. Фишером (1975) (Каталог

специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых ясивотных, 2000).

Культивировали клетки по общепринятой методике Р. Адаме, (1983) в стандартных условиях монослойно в термостате при температуре 37°С. Сыворотки крови и их комбинации брали в 10 %-ной концентрации в среде Игла MEM с добавлением антибиотиков (канамицина сульфата, стрептомицина сульфата и бензилпенициллина натриевой соли) по 100 Ед/мл, а контролем служила бычья сыворотка.

Маточные культуры клеток выращивали в стеклянных матрасах и флаконах емкостью 200 и 500 мл, соответственно, а в опытах по изучению ростстимулирующей активности - во флаконах емкостью 10 мл с посевной площадью 3 см2. Кроме того, использовали пипетки объемом от 2 до 100 мл. Подсчет клеток проводился в камере Горяева с помощью микроскопа МББ -1А.

В процессе выполнения работы использованы вакцинный штамм "ТК-А(ВИЭВ)-В2" вируса инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и референтный штамм "ПТК-2" вируса парагриппа-3 (ГТГ-3) крупного рогатого скота.

Электрофорез белков сывороток крови разных видов животных и их комбинаций проводили по В. В. Меньшикову, Л.Н. Делекторской (1987) совместно с докт. биол. наук В.П. Коксиным (Республиканский Центр по профилактике и борьбе со СПИДом) на ацетатцеллюлозных фильтрах "ВЛАДИСАРТ" тип - ФМАЦ-0,45-(80х1 Ю)-11106 с размерами пор 0,45 мкм и в полиакриламидном геле (ПААГ) с науч. сотр., канд. биол. наук Н.М. Александровой.

Определение биохимических показателей сывороток крови таких как аспартатаминотрансфераза (АсАТ), аланинаминотрансфераза (АлАТ), креатинфосфокиназа (КФК), лактатдегидрогеназа (ЛДГ), щелочная фосфатаза (ЩФ), мочевина, креатинин, прямой и общий билирубин, глюкоза осуществлялось с использованием реактивов фирмы "Rendox" (N. Tietz, 1987) на приборе "Daytona Rendox" (Великобритания).

На первом этапе изучали пролиферативную активность культур клеток SPEV и TR после 72-часовой инкубации в средах с сыворотками крови перечисленных видов животных. Брали по 4 флакона емкостью 500 мл с вышеуказанными культурами, сливали культуральную среду и в каждый из флаконов наливали по 10 мл раствора трипсина-версена, а после снятия клеток - по 20 мл среды Игла MEM с антибиотиками и интенсивно встряхивали. Объединяли отдельно SPEV и TR, получали по 120 мл клеточной взвеси, после чего наливали еще по 200 мл среды Игла MEM. Взвесь клеток SPEV и TR доводили до 320 мл культуральной средой без сыворотки крови и подсчитывали клетки в камере Горяева. После этого клеточную взвесь, с вышеперечисленными культурами, встряхивали и разливали по 25 мл в каждый из 12 пронумерованных флаконов, добавляя по 2,75 мл соответствующей сыворотки крови (таблица 1).

1. Соотношение сывороток крови животных и их комбинаций в питательной среде при культивировании клеток БРЕУ, МРВК и ТЯ

№ флаконов Варианты сочетания сывороток крови животных и объем, мл

1 Бычья (2,75)

2 СКБ + СКЛ (2,065 + 0,685)

3 СКБ + СКЛ (1,375+ 1,375)

4 СКБ + СКЛ (0,685 + 2,065)

5 Свиная (2,75)

6 СКС + СКБ (2,065 + 0,685)

7 СКС +СКБ (1,375+ 1,375)

8 СКС + СКБ (0,685+ 2,065)

9 Лошадиная (2,75)

10 СКЛ + СКС (2,065 + 0,685)

11 СКЛ + СКС (1,375+ 1,375)

12 СКЛ + СКС (0,685 + 2,065)

Клеточную взвесь рассевали по 2 мл во флаконы емкостью 10 мл, которые затем помещали в термостат, выдерживали при температуре 37 °С, а подсчет клеток проводили после 48-ми и 72-х часовой инкубации. Клетки снимали со стекла раствором трипсина-версена (1:3), наливая в каждый флакон по 3 мл, и подсчитывали в камере Горяева. С каждой сывороткой 1фови и их комбинациями проведено по 9 опытов.

Далее для работы были взяты культуры клеток SPEV, MDBK и TR после 72-часового роста во флаконах емкостью 500 мл. Из 2 флаконов вышеуказанных культур клеток сливали среду и в каждый наливали по 10 мл раствора трипсина-версена. После снятия клеток в каждый флакон наливали по 20 мл культуральной среды Игла MEM с антибиотиками и интенсивно встряхивали. Объединяли отдельно флаконы с культурами и получали по 60 мл клеточной взвеси, после чего наливали еще по 100 мл среды Игла MEM. Получилось 160 мл клеточной взвеси SPEV, MDBK и TR в культуральной среде без сыворотки крови. Проводили предварительный подсчет клеток. Клеточную взвесь с вышеперечисленными культурами разливали, предварительно встряхивая, по 25 мл в 6 флаконов, а затем добавляли по 2,75 мл соответствующей сыворотки крови и рассевали по 2 мл во флаконы емкостью 10 мл, помещали в термостат, где инкубировали при температуре 37 °С 48 и 72 часа. Клетки снимали со стекла раствором трипсина-версена (1:3), наливая в каждый флакон по 3 мл, и подсчитывали в камере Горяева. С каждой сывороткой крови и их комбинациями проведено по 12 опытов.

Индекс пролиферации клеток, как показатель ростстимулирующей активности сыворотки крови, оценивали по общепринятой методике Б. И. Антонова и др., (1986).

При определении прозрачности, общего белка, свободного гемоглобина, общих липидов, в том числе общего холестерина в сыворотках крови применялся фотоэлектроколориметр КФК-2-УХЛ4.2, а при измерении

рН - иономер И-120. Оценку ростовых свойств, прозрачности, а также контроль сыворотки на возможное присутствие контаминантов - бактерий, микоплазм, вирусов проводили общепринятыми методами (Методические рекомендации по контролю качества жидкой сыворотки крови крупного рогатого скота, применяемой в медицинских и биологических целях, 1982). Общепринятыми методами определяли в сыворотке крови содержание общего белка (Инструкция по определению общего белка в сыворотке крови по биуретовой реакции, 1972), свободного гемоглобина (Инструкция по определению гемоглобина крови гемиглобинцианидным методом, 1974), общих липидов (Инструкция по определению общих липидов, 1982), рН сыворотки (Методические указания по применению физико-химических методов контроля медицинских биологических препаратов, 1977) и общего холестерина ферментативным методом по D. Young (1990).

Вирусологические исследования проводили совместно с канд. вет. наук, ст. науч. сотр. В.Г. Гумеровым.

Репродукцию вирусов ИРТ и ПГ-3 изучали на перевиваемых культурах MDBK и TR, соответственно. Клетки выращивали при посевной концентрации от 107800 ± 3278 до 132000 ± 6556 клеток/мл на культуральной среде Игла MEM с 10%-ми различных вариантов сыворотки крови бычков, лошадей и свиней.

Выявление антител к вирусу ПГ-З в опытных сериях сывороток крови бычков, лошадей, свиней и их комбинаций проводили путем постановки реакции торможения гемагтлютинации. С этой целью антигемагглютинины к вирусу ПГ-3 определяли макрометодом с использованием парагриппозного антигена типа-3, изготовленного Курской биофабрикой. При постановке реакции неспецифические ингибиторы сывороток удаляли 25%-ным раствором каолина и 10 %-ный взвесью эритроцитов морской свинки.

Антитела к вирусу ИРТ, в вышеуказанных сыворотках, выявляли в реакции нейтрализации клеточной суспензии MDBK. В качестве антигена использовали культуральную жидкость 4-5 пассажа вируса ИРТ (штамм "ТК-А(ВИЭВ}-В2") с инфекционной активностью 5,6 lg ТЦДзо/мл. Испытуемые сыворотки разводили двукратно питательной средой Игла MEM, начиная от 1:2 до 1:128 в конечном объеме 0,5 мл, после чего в каждую пробирку добавляли 0,5 мл рабочего разведения вируса. Полученную взвесь встряхивали, выдерживали 1 час при 37 °С и материалом из каждой пробирки делали высев в 4 флакона с культурой клеток в объеме 0,2 мл. Для контроля рабочей дозы вируса, использованной в реакции, из нее готовили 10-кратное разведение в 4 пробирках (lC'-lO"4) в объеме 1 мл. Из каждой пробирки заражали по 4 пробирки с культурой клеток в объеме 0,2 мл и 4 пробирки оставляли в качестве контроля (незараженная культура клеток). Все зараженные культуры клеток оставляли для контакта при комнатной температуре в течение 1 часа, затем добавляли поддерживающую среду по 1 мл и инкубировали при 37 °С в течение 5-7 суток. Учитывали реакцию после ее прохождения в контроле по появлению цитопатических изменений в культуре клеток. Титром, сыворотки считали предельное ее

разведение, сдерживающее развитие ЦПД вируса в 50 % зараженных культур клеток.

Чувствительность вирусов к сывороточному компоненту среды определяли путем заражения и титрования в культурах клеток.

Заражение культур клеток. С целью изучения чувствительности к вирусам, культуры клеток TR и MDBK, выращенные с использованием сыворотки крови различных видов животных и их комбинаций, предварительно трехкратно промывали раствором Хэнкса, чтобы удалить сывороточные антитела и ингибиторы, присутствующие в ростовой среде. Затем во флаконы вносили по 0,2 мл вирусного материала и оставляли в контакте при температуре 37 °С в течение 30-45 минут. После инкубации во флаконы с культурой клеток добавляли в объеме 0,8 мл комбинированную среду (ГЛА + MEM + 199) для TR и поддерживающую среду (Игла MEM) -для MDBK и ставили в термостат. Флаконы с зараженной культурой клеток ежедневно просматривали: TR в течение 3-4 дней и MDBK - 2-3 дней под малым увеличением светового микроскопа на наличие ЦПД.

Титрование. Репродукцию вирусов ПГ-3 и ИРТ крупного рогатого скота в культурах клеток с использованием питательных сред на основе гомо - и гетеровидовых сывороток и их комбинаций определяли путем титрования на культурах клеток TR и MDBK. С этой целью проводили 10-и кратное разведение вируссодержащей культуральной жидкости от 10"' до 10"8 комбинированной (ГЛА + MEM + 199) и поддерживающей (Игла MEM) средами.

Четыре флакона, в которые вместо вируссодержащей культуральной жидкости вносили по 1,0 мл поддерживающей среды, служили контролем. Результаты учитывали по ЦПД в течение 48-72 часов. Титр рабочего разведения вируса рассчитывали по методу L. Reed, Н. Muench (1938). Результаты титрования считали достоверными при сохранении монослоя в контроле.

Цифровой материал обработан общепринятыми методами вариационной статистики (Р.Х. Тукшаитов, 2001) с вычислением средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (ш), среднеквадратического отклонения (о), коэффициентов вариации (Cv) и корреляции (г).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Влияние сывороточного компонента питательной среды на пролиферацию культур клеток SPEV, MDBK и TR

Пролиферативную активность культур клеток изучали при добавлении в питательную среду сывороток крови бычков, лошадей, свиней и их комбинаций: СКБ+СКЛ, СКБ+СКС, СКЛ+СКС в соотношениях 3:1, 1:1, 1:3. Общие результаты проведенных исследований представлены в таблице 2.

2. Индексы пролиферации клеток вРЕУ, АГОВК и ТЫ при использовании в культуральной среде различных комбинаций __сывороток__

№ п/ п Сыворотки крови и их комбинации БРЕУ МБВК ТЯ

48 ч 72 ч 48 ч 72 ч 48 ч 72 ч

1 Бычья 3,22±0,13 3,83±0,14 4,47±0,13 5,64±0,16 3,02±0,08 3,61±0,11

2 СКБ+СКЛ(3:1) 3,41±0,13 4,10±0,14 не исследовали 3,20±0,08 3,89±0,08*

3 СКБ+СКЛ(1:1) 3,53 ±0,13 4,22±0,1* 4,52±0,13 | 5,35±0,13 3,48±0,1*** 4,27±0,1***

4 СКБ+СКЛ(1:3) 3,29±0,11 3,91±0,14 не исследовали 3,42±0,1*** 4,09±0,14**

5 Свиная 3,62±0,13* 4,38±0,1* 4,68±0,14 | 5,64±0,13 3,12±0,06 3,71±0,11

6 СКС+СКБ(3:1) 3,88±0,1*** 4,54±0,18** не исследовали 3,63±0,1*** 4,72±0,1***

7 СКС СКБ(1:1) 4,0±0,15*** 4,6440,2*** 5,01±0,14* | 6,00±0,17 3,69±0,1*** 4,85±0,1***

8 СКС+СКБ(1:3) 3,77±0,14** 4,49±0,17** не исследовали 3,58±0,1*** 4,43±0,1***

9 Лошадиная 3,И±0,12 3,74±0,16 3,99±0,11* |4,95±0,14** 2,83±0,1* 3,33±0,07*

10 СКЛ+СКС(3:1) 4,08±0,2*** 4,62±0,2*** не исследовали 4,18±0,1*** 5,26±0,1***

11 СКЛ+СКС(1:1) 4,33±0,2*** 5,3б±0,2*** 5,21±0,1***| 6,29±0,18* 4,79±0,1*** 5,78±0,2***

12 СКЛ+СКС(1:3) 4,21±0,2**» 4,99±0Д*** не исследовали 4,27±0,1*** 5,53±0,1***

Примечание: *, **, *** - уровни достоверности различия с контролем

соответственно р < 0,05; < 0,01 и < 0,001.

Из таблицы 2 следует, что максимальную пролиферативную активность культур клеток (БРЕУ, МОВК, ТЯ) из моносывороток обеспечивает свиная сыворотка (индекс пролиферации (ИП) = 4,38 ± 0,17; 5,64 ± 0,13; 3,71 ± 0,11), промежуточный уровень занимает бычья (ИП = 3,83 ±0,14; 5,64 ± 0,16; 3,61 ± 0,11) и минимальный - лошадиная (ИП = 3,74 ± 0,16; 4,95 ± 0,14; 3,33 ± 0,07), соответственно, после 72-х часовой инкубации. Таким образом, сыворотка крови свиней может использоваться в больших масштабах, по сравнению с сывороткой бычков, в качестве биологической добавки в питательные среды для увеличения пролиферации клеток. При смешивании сывороток крови пролиферативная активность клеток, повышается, что, вероятно, обусловлено сочетанием ростовых факторов моносывороток в комбинации. Максимальный индекс пролиферации отмечен при использовании комбинации сывороток крови лошадей и свиней в соотношении 1:1 у культуры клеток МБВК (ИП = 6,29 ± 0,18); ТЫ (ИП = 5,78 ± 0,15) и 8РЕУ (ИП = 5,36 ± 0,18) после 72-х часового культивирования.

3.2. Влияние сывороток в составе питательных сред на репродукцию вирусов ИРТ и ПГ-3 крупного рогатого скота

Интенсивность размножения вирусов в культуре клеток зависит от целого ряда факторов: линии клеток, скорости их пролиферации; особенностей сыворотки крови, входящей в состав питательной среды и др. Кроме того, использование гетеровидовых сывороток крови в культуральной среде повышает репродуктивную активность вирусов на культурах клеток за счет отсутствия в сывороточном компоненте культуральной среды антител к данным вирусам.

Проведено пассирование вирусов ИРТ и ПГ-3 в культурах клеток, выращиваемых на средах, содержащих вышеуказанные сыворотки и их сочетания. В дальнейшем полученный вирусный материал оттитровывался на культурах клеток МБВК и "ГО, выращенных на среде с использованием сыворотки крови бычков. Результаты опытов представлены в таблице 3.

3. Репродукция вирусов 1 1РТ и ПГ-3 на культурах клеток МБВК и ТК

Сыворотки крови и их комбинации МБВК та.

Титры вирусов ^ ТЦДзо/мл

ИРТ ПГ-3

Бычья 5,6 ±0,2 5,3 ± 0,2

Лошадиная 5,5 ± 0,1 5,1 ±0,1

Свиная 6,1 ±0,1 5,8 ±0,2**

СКБ + СКЛ(1:1) 4,8 ±0,2 5,2 ±0,1

СКБ + СКС (1:1) 6,6 ±0,1* 6,3 ±0,2**

СКЛ + СКС (1:1) 6,5 ±0,1* 6,1 ±0,1*

Примечание: ТЦДду мл - тканевая цитопатическая доза вируса; * и ** -уровни достоверности различия с контролем, соответственно р < 0,05 и < 0,001.

Анализ данных, отраженных в таблице 3 свидетельствует о том, что оптимальными для репродукции вирусов ИРТ и ПГ-3 на культурах клеток МБВК и Т11 являются комбинации свиной сыворотки крови с бычьей ТЦДзо/МЛ = 6,6 ± 0,1 и 6,3 ± 0,2) и лошадиной ТЦДи/МЛ = 6,5 ± 0,1 и 6,1 ± 0,1) в соотношении 1:1. Кроме того, репродукция вирусов на указанных культурах клеток, выращенных в средах с комбинациями сывороток, была на 0,8-1,0 ТЦД50/МЛ выше, чем при наличии в ростовой среде только бычьей сыворотки, а при использовании комбинации сывороток крови бычков и лошадей происходит некоторое угнетение инфекционной активности.

Таким образом, применение комбинированных вариантов сывороток в культуральных средах способствует повышению пролиферативной активности перевиваемых линий клеток БРЕУ, МБВК и ТК, а также репродукции выращиваемых на них вирусов ИРТ и ПГ-3, что позволяет получать вирусную массу с высокой инфекционной активностью при изготовлении диагностических и профилактических препаратов.

3.3. Биохимические и физико-химические показатели сывороток крови отдельных видов животных и их комбинаций

Различными авторами показана зависимость белкового состава сыворотки крови от возраста, породы и пола животных, их физиологического состояния, продуктивности, типа нервной деятельности, кормления, температуры окружающей среды, сезона года и др. Причем в некоторых случаях наблюдаются не только количественные, но и

качественные изменения белкового спектра сыворотки крови, которые некоторые авторы определяли как физиологически обусловленный полиморфизм (А.Г. Малахов, Т.К. Винокуров, 1973). Для биотехнологических целей сыворотки крови должны иметь определенные физико-химические и биохимические показатели, ростовые свойства и, конечно, не содержать каких-либо контаминантов.

Биохимические и физико-химические показатели сывороток крови бычков, свиней, лошадей и их комбинаций нами определены в 5 сериях. Результаты исследований приведены в таблице 4.

4. Биохимические и физико-химические показатели сывороток крови _ животных и их комбинаций_

№ п/п Сыворотки крови и их комбинации Прозрачность, ед.оп рН Общие липиды, г/л Свободный гемоглобин, мг% Общий холестерин, ммоль /л

1 Бычья 0,226±0,01 7,63±0,02 1,75±0,16 49,79±0,95 0,90 ±0,01

2 СКБ+СКЛ(3:1) 0,231±0,01 7,65±0,01 1,58±0,18 44,86±1,98 0,82±0,03

3 СКБ+СКЛ(1:1) 0,248±0,01 7,64±0,01 1,54±0,13 43,51±1,10 0,74±0,02

4 СКБ+СКЛ(1:3) 0,2б4±0,01 7,71 ±0,01 1,48±0,09 40,37±1,90 0,74±0,03

5 Свиная 0,364±0,01 7,58±0,01 1,70±0,26 44,86±1,98 0,88±0,02

б СКС+СКБ(3:1) 0,327±0,01 7,59±0,01 1,71±0,14 45,76±1,91 0,82±0,03

7 СКС+СКБ(1:1) 0,293±0,01 7,59±0,01 1,75±0,13 4б,20±1,10 0,86±0,04

СКС+СКБ(1:3) 0,252±0,01 7,59±0,02 1,74±0,07 47,10±2,52 0,83±0,04

9 Лошадиная 0,236±0,01 7,63±0,01 1,29±0,08 35,44±1,45 0,74±0,06

10 СКЛ+СКС(3:1) 0,270±0,01 7,61±0,01 1,50±0,16 39,92±2,20 0,78±0,04

И СКЛ+СКС(1:1) 0,295±0,01 7,61 ±0,02 1,44±0,13 39,02±1,91 0,75±0,05

12 СКЛ+СКС(1:3) 0,3 51 ±0,02 7,55±0,01 1,52±0,18 40,82±1,98 0,75±0,03

Из данных таблицы 4 видно, что исследованные сыворотки крови животных (бычья, свиная, лошадиная) и их комбинации по содержанию в них свободного гемоглобина, общих липидов, в том числе общего холестерина, а также по прозрачности и рН соответствуют предъявляемым требованиям к сыворотке взрослого крупного рогатого скота по ТУ 49.24682 и международной заявке №82/02900.

При электрофорезе сывороточных белков, образующиеся на фореграммах фракции, подразделяют на альбумины, а-, р~ и у-глобулины.

Результаты исследования белкового состава сывороток крови представлены в таблице 5, из которой следует, что содержание общего белка в сыворотке крови обусловлено ее видовой принадлежностью. Наименьшая концентрация его отмечена в сыворотке крови лошадей. (56,2 г/л), а максимальное количество установлено в сыворотке крови свиней (69,5 г/л).

Ростстимулирующая активность сыворотки крови разных видов животных и их комбинаций связана с альбуминовой и а -, р -глобулиновыми фракциями. Этих белков больше всего в сыворотке крови свиней.

5. Белковый состав (г/л) сывороток крови животных и их комбинаций

№ Сыворотки Общий Фракционный состав белков

п/п крови и их белок Альбу- глобулины

комбинации мины СИ- а2- 3.- В2- У-

1 Бычья 58,4 15,8 5,0 5,9 2,6 3,2 25,9

2 СКБ+СКЛ(3:1) 56,7 14,3 4,4 6,0 3,3 2,6 26,1

3 СКБ+СКЛ(1:1) 55,7 14,3 4,6 6,1 зд 3,0 24,6

4 СКБ+СКЛ(1:3) 58,2 14,2 3,8 6,7 3,5 3,0 27,0

5 Свиная 69,5 19,3 9,4 5,2 6,3 2,0 27,3

6 СКС+СКБ(3:1) 64,6 17,6 7,7 4,7 5,2 2,4 27,0

7 СКС+СКБ(1:1) 62,1 17,3 6,9 4,2 3,2 2,0 28,5

8 СКС+СКБ(1:3) 58,6 16,3 6,2 4,7 3,0 2,5 25,9

9 Лошадиная 56,2 12,6 4,6 6,5 4,8 2,3 25,4

10 СКЛ+СКС(3:1) 58,8 13,3 4,8 5,6 3,8 2,3 29,0

11 СКЛ+СКС(1:1) 63,2 16,6 7,1 5,6 5,1 2,6 26,2

12 СКЛ СКС(1:3) 64,7 16,4 7,2 5,6 5,3 2,1 28,1

Результаты исследований других биохимических показателей

сывороток крови разных видов животных и их комбинаций представлены в таблицах 6-9.

6. Ферментативный профиль сывороток крови разных видов животных

выворотки крови Ферменты, Ед/л

АлАТ АсАТ ЩФ ЛДГ КФК

Бычья 29,6±0,7 103±1,5 138±4,3 2355±59,3 867,3±28,3

Свиная 46,1±2,7 23,2±3,0 94,7±3,0 387,7±21,1 563 ±44,9

Лошадиная 66,7±0,9 1238,2±37,2 270,7±13,1 962,3±27,8 3802,7±51,6

Из таблицы 6 видно, что 4 из 5 исследованных ферментов имеют максимальные концентрации в сыворотке крови лошадей: АлАТ, АсАТ, ЩФ, КФК, соответственно, (66,7 ± 0,9 Ед/л; 1238,2 ± 37,1 Ед/л; 270,7 ± 13,1 Ед/л; 3802,7 ±51,6 Ед/л), а концентрация же ЛДГ этой сыворотки (962,3 ± 27,8 Ед/л) уступает лишь концентрации её в сыворотке крови бычков (2355 ± 59,3 Ед/л). Минимальные концентрации АсАТ, ЩФ, ЛДГ и КФК (23,2 ± 3,0 Ед/л; 94,7 ± 3,0 Ед/л; 387,7 ± 21,1 Ед/л и 563 ± 44,9 Ед/л) имеет сыворотка крови свиней; концентрация АлАТ в данной сыворотке (46,1 ± 2,7 Ед/л) несколько выше, чем в сыворотке крови бычков (29,6 ± 0,7 Ед/л). Также наши данные свидетельствуют о негативном влиянии отдельных ферментов (например, ЛДГ, повышение концентрации, которой характеризует патологию почек) на пролиферацию клеток почечных линий и, опосредованно, на репродукцию на них вирусов.

Из таблицы 7 по исследованным соединениям в сыворотках крови прослеживается следующая картина: меньше всего прямого и общего билирубина в сыворотке крови свиней (1,0 ± 0,01 и 1,0 ± 0,04 моль/л), а больше - в сыворотке лошадей (3,8 ± 0,21 и 11,5 ± 0,44 моль/л). По содержанию продуктов распада белков, в частности креатинина, сыворотки крови животных имеют приблизительно одинаковые показатели, хотя отметить несколько большую его концентрацию в сыворотке крови свиней

7. Биохимические показатели сывороток крови разных видов животных

Сыворотка крови Глюкоза, ммоль/л Билирубин, моль/л Креатинин, моль/л Мочевина, ммоль/л

прямой общий

Бычья 11,9±0,34 1,0±0,01 2,2±0,07 118,2±0,62 3,5±0,14

Свиная 5,8±0,38 1,0±0,01 1,0±0,04 145,6±5,34 4,2±0,06

Лошадиная 4,7±0,21 3,8±0,21 11,5±0,44 120,7±9,84 5,3±0,16

'145,6 ± 5,34 моль/л); больше мочевины содержит сыворотка лошадей, а меньше - бычков (5,3 ± 0,16 и 3,5 ± 0,14 ммоль/л). Что касается концентрации глюкозы, то она минимальна в сыворотке крови лошадей и максимальна в сыворотке бычков (4,7 ± 0,21 и 11,9 ± 0,34 ммоль/л). Полученные результаты данных биохимических анализов позволяют в определенной степени объяснить состояние биологической активности сывороток крови разных видов животных.

Результаты исследованных комбинаций сывороток крови разных видов животных по содержанию в них ферментов представлены в таблице 8, а по глюкозе, пигментам и продуктам метаболизма - в таблице 9. Фактические концентрации этих веществ в таблицах даны в сравнении с теоретически рассчитанными.

8. Ферментативный профиль комбинаций сывороток крови разных

видов животных

Комбинации сывороток крови Ферменты, Ед/л

АлАТ АсАТ ЩФ лд Г КФК

ф. т. ф. т. ф. т. ф. т. ф. т.

СКБ+СКЛ(3:1) 37,8 ±1,6 38,9 395,3 ±8,9 386,8 172 ±2,6 171,2 2025 ±80,2 2006,8 1599 ±38,1 1601,2

СКБ+СКЛ(1:1) 47,7 ±0,6 48,2 679,5 ±17,5 670,6 216 ±10,9 204,4 1620,3 ±82,8 1658,7 2262,7 ±21,3 2335

СКБ+СКЛ(1:3) 57,4 ±1,4 57,4 969,8 ±4,7 954,4 236,3 ±12,2 237,5 1267,3 ±19,8 1310,5 3053,7 ±319,6 3068,9

СКС+СКБ(3:1) 39,2 ±9,3 42,0 50,6 ±19,6 43,2 107,3 ±41,9 105,5 871,7 ±4,3 879,5 636 ±133,3 639,1

СКС+СКБ(1:1) 35,5 ±1,5- 37,9 54,1 ±2,8 63,1 122,7 ±1,8 116,4 1370 ±33,4 1371,4 703,7 ±15,3 715,2

СКС+СКБ(1:3) 31,5 ±2,1 33,7 83,8 ±3,7 83,1 134 ±0,7 127,2 1831,7 ±68,9 1863,2 773,7 ±15,6 791,2

СКЛ+СКС(3:1) 59,1 ±2,9 61,6 889,6 ±6,0 934,5 228,7 ±4,0 226,7 809,7 ±20,3 818,7 2968,3 ±94,1 2992,8

СКЛ+СКС(1:1) 58,2 ±4,7 56,4 625,3 ±5,3 630,7 178 ±4,4 182,7 676,7 ±27,9 675 2289 ±66,7 2182,9

СКЛ+СКС(1:3) 51,2 ±4,8 51,3 306,7 ±8,9 327 133,7 ±1,8 138,7 518,3 ±36,4 531,4 1474,7 ±15,9 1372,9

Из анализа таблицы 8 следует, что фактические концентрации АлАТ во всех комбинациях сывороток крови разных видов животных незначительно ниже, теоретически рассчитанных, кроме комбинации сывороток крови лошадей и свиней в соотношении 1:1 (фактические = 58,2 Ед/л, а теоретические = 56,4 Ед/л). По концентрации АсАТ установлено, что

часть фактических результатов комбинаций сывороток крови выше теоретических значений, а другая часть ниже. Анализируя данные по ЩФ, можно сделать вывод, что фактические и теоретические значения ее содержания по комбинациям сывороток крови, как правило, выше или равны между собой. По ЛДГ в двух случаях отмечено, что фактические ее концентрации выше теоретических СКБ + СКЛ (3:1) - 2025 ± 80,2 Ед/л и СКЛ + СКС (1:1) - 676,7 ± 27,9 Ед/л, а по остальным комбинациям эти значения ниже. Такая же ситуация наблюдается и по КФК СКЛ + СКС (1:1) - 2289 ± 66,7 Ед/л и СКЛ + СКС (1:3) -1474,7 ± 15,9 Ед/л.

9. Биохимические показатели комбинаций сывороток крови разных видов животных

Комбинации сывороток крови Глюкоза, ммоль/л Билирубин, моль/л Креатинин, моль/л Мочевина, моль/л

прямой общий

ф. т. ф. ф. т. Ф. т. Ф. т.

СКБ+СКЛ(3:1) 10±0,7 10,3 1,0±0,01 1,7 4,5±0,07 4,6 119,5±4,9 118,9 4,0±0,05 3,9

СКБ+СКЛ(1:1) 8,2±0,4 8,8 1,4±0,3 2,3 5,5±1,03 6,9 122,6±2,8 119,5 4,5±0,2 4,5

СКБ+СКЛ(1:3) 7,1±0,3 7,2 2,0±0,8 3,0 б,5±2,04 9,2 119,7±1,8 120,1 4,4±0,1 4,9

СКС+СКБ(3:1) 6,8±0,9 10,4 1,0±0,01 1,0 1,4±0,2 2,0 135,0±6,4 125,1 4,4±0,2 3,7

СКС+СКБ(1:1) 9,1±0,4 8,9 1,0±0,01 1,0 1,6±0,2 1,6 141±4,7 131,9 4,1±0,2 3,9

СКС+СКБ(1:3) 10,3±0,5 7,4 1,0±0,01 1,0 1,9±0,04 1,4 134,7±4,1 138,8 3,9±0,1 4,1

СКЛ+СКС(3:1) 6,3±1,1 5,7 1,0±0,01 3,0 3,1±0,21 8,9 125,4±1,2 126,9 4,9±0,1 5,1

CKJI+CKC(1:1) 5,9±0,4 5,7 1,2±0,2 2,0 4,2±1,12 6,3 127,9±4,7 133,2 4,5±0,2 4,8

СКЛ+СКС(1:3) 6,4±0,42 5,8 1,0±0,01 1,5 2,2±0,5 3,7 131,8±4,1 139,4 4,3±0,07 4,5

Из таблицы 9 следует, что фактическая концентрация глюкозы в четырех комбинациях ниже теоретических данных СКБ + СКЛ (3:1) - 10 ± 0,7; СКБ + СКЛ (1:1) - 8,2 ± 0,4; СКБ + СКЛ (1:3) - 7,1 ± 0,3 и СКС + СКБ (3:1) - 6,8 ± 0,9 ммоль/л, а в остальных фактические данные превышают теоретические. По концентрациям прямого и общего билирубина фактические значения, как правило, меньше или равны теоретическим. Фактическое содержание креатинина в двух комбинациях сывороток крови больше СКС + СКБ (3:1) - 135 ± 6,4 и СКС + СКБ (1:1) - 141 ± 4,7 моль/л теоретически расчитанного; в двух случаях ниже СКС + СКБ (1:3) - 134,7 ± 4,1 и СКЛ + СКС (1:1) - 127,9 ± 4,7 моль/л, а в остальных комбинациях значения равны. По концентрации мочевины в комбинациях сывороток крови, фактические значения в основном равны теоретическим.

3.4. Корреляционные отношения различных показателей при изучении сывороток крови животных и их комбинаций Корреляция не является точной зависимостью одного признака от другого, поэтому она может иметь различную степень — от полной независимости до очень сильной связи. Так, высокая прямая корреляция между индексом пролиферации культивируемых клеток и белковым составом сывороток крови отмечается при использовании комбинации сывороток крови бычков и лошадей, лошадей и свиней, а в остальных случаях имеет место слабая прямая или обратная степень связи между этими

признаками. Аналогичная картина наблюдается во взаимосвязи репродукции вирусов с биохимическим составом сывороточного компонента питательной среды, на которой выращивались клетки: высокая степень прямой корреляции отмечена при использовании в культуральной среде комбинаций сывороток бычков и лошадей, лошадей и свиней, как по общему белку, так и по а- и р-глобулинам. Своеобразно, выглядит взаимосвязь репродукции вирусов с индексом пролиферации культур клеток: высокая степень прямой корреляции (р < 0,01) отмечена лишь между репродукцией вируса ПГ-З с пролиферативной активностью клеток ТЯ выращенных на питательной среде с гетеровидовой сывороткой свиней, а по остальным корреляция не достоверна; достоверная корреляция существует между репродукцией вируса ИРТ с пролиферативной активностью культуры клеток МОВК, выращенной на среде, содержащей СКВ, СКЛ и комбинацию СКБ + СКЛ в соотношении 1:1.

4. ВЫВОДЫ

1. Впервые показана эффективность комбинаций сывороток крови разных видов животных (бычков, свиней, лошадей) в качестве биологических добавок питательной среды при выращивании перевиваемых культур клеток (на примере 8РЕУ, МОВК, ТЯ) и репродукции на них вирусов ИРТ и ПГ-З.

2. Максимальная пролиферативная активность перевиваемых клеток БРЕУ, МОВК, Т11 после 72-х часовой инкубации из моносывороток обеспечивается свиной сывороткой (индекс пролиферации (ИП) = 4,38 ± 0,17; 5,64 ± 0,13; 3,71 ± 0,11); промежуточный уровень занимает бычья (ИП = 3,83 ± 0,14; 5,64 ± 0,16; 3,61 ± 0,11) и минимальный - лошадиная (ИП = 3,74 ± 0,16; 4,95 ± 0,14; 3,33 ± 0,07).

3. Максимальная репродукция вируса ИРТ имеет место в культуре клеток МОВК, а ПГ-З - в клетках та, выращенных на среде с моносывороткой крови свиней (^ ТЦД50/МЛ = 6,1 ±0,1 и 5,8 ± 0,2), промежуточная -бычков ТЦЦ50/МЛ = 5,6 ± 0,2 и 5,3 ± 0,2), минимальная - лошадей (^ ТЦД50/МЛ = 5,5 ± 0,1 и 5,1 ± 0,1) для ПГ-З через 48-60 часов, а ИРТ - 72-96 часов после заражения культур клеток.

4. Сыворотка крови свиней в своем составе содержит больше, а сыворотка крови лошадей - меньше общего белка по сравнению с сывороткой крови бычков, а различия сывороток крови животных по фракционному составу белков: по суммарному количественному содержанию альбуминов, а-, Р~ глобулинов, которые главным образом стимулируют рост клеток, на первом месте стоит сыворотка крови свиней 42,1 г/л, а на последнем -сыворотка крови лошадей 30,8 г/л; промежуточное положение занимает сыворотка крови бычков - 32,5 г/л; содержание у_глобулинов в сыворотках крови животных почти одинаковое: меньше в сыворотке лошадей - 25,4, а больше в сыворотке свиней - 27,3, промежуточное положение занимает сыворотка бычков - 25,9 г/л.

5. Концентрации исследованных ферментов, пигментов и продуктов метаболизма максимальны в сыворотке крови лошадей и минимальны в сыворотке крови свиней, а глюкозы больше содержит сыворотка бычков и меньше - лошадей.

6. Установлено усиление пролиферативной активности перевиваемых клеток при использовании в составе питательной среды комбинаций сывороток крови животных, по сравнению с моносыворотками. Лучшими оказались комбинации сывороток животных в соотношении 1:1. Наивысший индекс пролиферации культур клеток после 72-х часового их выращивания отмечен при добавлении в питательную среду комбинации сывороток крови лошадей и свиней (для МБВК 6,29 ± 0,18; ТЯ - 5,78 ± 0,15; БРЕУ -5,36 ±0,18).

7. Выявлено увеличение репродукции вируса инфекционного ринотрахеита на культуре клеток МЕ>ВК, а парагриппа-3 - на клетках ТИ при использовании комбинаций сывороток крови бычков и свиней (1§ ТЦДзо/мл = 6,6 ± 0,1 и 6,3 ± 0,2); лошадей и свиней (^ ТЦЦ50/МЛ = 6,5 ± 0,1 и 6,1 ± 0,1) и снижение, соответственно, на 14,3 и 1,9 % при комбинации сывороток крови бычков и лошадей (^ ТЦДзо/мл = 4,8 ± 0,2 и 5,2 ± 0,1) относительно значений, полученных при использовании сыворотки крови бычков.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Сыворотку крови свиней рекомендуется использовать в больших масштабах, по сравнению с сывороткой бычков, в качестве биологической добавки в питательные среды для увеличения пролиферации клеток и репродукции вирусов на них.

2. Предлагается использование сывороток крови животных в комбинациях, что приводит к разнообразию биологических активных компонентов питательной среды и, при определенных сочетаниях, существенно увеличивает пролиферацию клеток и репродукцию вирусов на них.

3. Для улучшения пролиферативной активности клеток МОВК, ТЯ и репродукции на них, соответственно, вирусов инфекционного ринотрахеита и парагриппа-3, культивирование клеток следует проводить на среде с добавлением 10% комбинаций сывороток крови свиней и бычков, либо свиней и лошадей (1:1).

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Ганиев И.М. Стимуляция пролиферации клеток в культуре и репродукции в них вирусов комбинированием сывороток крови разных видов животных / И.М. Ганиев, Н.И. Гурьянов. Р.Я. Гильмутдинов, В.Г. Гумеров, P.P. Шарафиева // Матер. Междунар. науч.- практ. конф. "Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний", 2830 ноября 2005 г. - Казань, 2005. - Ч. 2. - С. 92-96.

2. Ганиев И.М. Эффективность комбинирования сывороток крови разных видов животных при наработке вирусной (ИРТ и ПГ-3) массы на перевиваемых культурах клеток / И.М. Ганиев, В.Г. Гумеров, Р.Я. Гильмутдинов, Н.И. Гурьянов, Р.Р. Шарафиева // Матер. Всеросс. конф. ВГНКИ "Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспектива", 14-15 февраля 2006 г. - М., 2005 - С. 26-27.

3. Ганиев И.М. Использование комбинаций сывороток крови разных видов животных при культивировании клеток / И.М. Ганиев, Н.И. Гурьянов, Р.Я. Гильмутдинов, A.C. Гизатуллина, М.В. Тертичная // Матер. Всеросс. конф. ВГНКИ "Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспектива", 14-15 февраля 2006 г. - М., 2005 -С. 24-25.

4. Ганиев И.М. Взаимосвязь интенсивности репродукции вирусов на культурах клеток с некоторыми биохимическими показателями сывороточного компонента / И.М. Ганиев, Р.Я. Гильмутдинов, Н.И. Гурьянов, В.П. Коксин // Матер. Всеросс. науч. - практ. конф. "Перспективы агропромышленного производства регионов России в условиях реализации приоритетного национального проекта "Развитие АПК", 28 февраля - 3 марта 2006 г.: Уфа, 2006. - Ч. 2. - С. 29-30.

5. Гурьянов Н.И. Взаимосвязь пролиферативной активности культуры клеток SPEV и белкового состава сывороточного компонента питательной среды / Н.И. Гурьянов, И.М. Ганиев, Р.Я. Гильмутдинов, A.C. Гизатуллина, М.В. Тертичная // Матер. Междунар. науч. конф. "Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных", 21-23 июня 2006 г., Ульяновск, ГСХА, 2006. — С. 62-64.

6. Ганиев И.М. Использование комбинаций сывороток крови разных видов животных в кулиуральных средах при выращивании клеток и репродукции вирусов / И.М. Ганиев, Н.И. Гурьянов, Р.Я. Гильмутдинов // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины Н.Э. Баумана - Казань, 2006. - т. 184. - С. 57 - 63.

7. Гильмутдинов Р.Я. Влияние комбинации сывороток крови различных видов животных на пролиферативную активность культур клеток и репродукцию вирусов / Р.Я. Гильмутдинов, Н.И. Гурьянов, И.М. Ганиев // Ветеринарная патология. - №1(20). - 2007 - С. 66 - 69.

/ о

На правах рукописи

ГАНИЕВ ИЛЬНУР МАХМУТОВИЧ

03.00.23 — биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ульяновск - 2007

Подписано в печать 15.01.2007 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная, Усл. печ. л. 1,0. Заказ № У , Тираж 100 экз. Типография ФГУ "ФЦТРБ-ВНИВИ" 420075, г. Казань, Научный городок - 2

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ганиев, Ильнур Махмутович

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1Л. Сыворотка крови - важнейший компонент культуральных питательных сред.

1ЛЛ. Сведения о физико-химическом и биохимическом составе сывороток крови разных видов животных.

1Л.2. Влияние некоторых факторов на качество и биологическую активность сывороток крови разных видов живот

1.2. Стимуляция клеточной пролиферации сывороткой крови.

1.2.1. Особенности биологической активности сывороток крови разных видов животных на культурах клеток.

1.2.2. Факторы негативного влияния сывороток крови животных на культуры клеток.

1.3. Влияние сывороток крови на репродукцию вирусов в культурах клеток.

1.3.1. Влияние специфических антител в сыворотке крови на репродукцию вирусов.

1.3.2. Видоспецифические вирусные заболевания животных и наличие в их сыворотках крови соответствующих анти

1.3.3. Влияние гомо- и гетеровидовых сывороток крови на репродукцию вирусов в культурах.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ.

2.1.1. МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИИ.

2.1.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.2.1. Влияние сывороточного компонента питательной среды на пролиферацию культур клеток.

2.2.2. Влияние сывороток в составе питательных сред па репродукцию вирусов.

2.2.3. Физико-химический и биохимический состав сывороток крови отдельных видов животных и их комбинаций.

2.2.4. Корреляционные отношения различных признаков при изучении сывороток крови животных и их комбинаций.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ

ИССЛЕДОВАНИЙ.

ВЫВОДЫ.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРЕДЛОЖЕНИЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Применение комбинаций сывороток крови различных видов животных для культивирования клеток и репродукции вирусов"

1.1. Актуальность темы. В решении современных как теоретических, так и практических проблем ветеринарной биотехнологии, значительное место занимает культивирование клеток из тканей животных и человека in vitro (Jl. 11. Дьяконов, В.If. Снтъков, 2000; Е.А. Рубсш и др., 2000; Е. Evege et al., 1985; D. Jayme et al., 1988 и др.). Они являются важным объектом при изучении канцерогенеза и дифференцировки клеток, в вирусологических, биохимических, молекулярно-генетических и других исследованиях.

В связи с этим актуальна проблема разработки условий наиболее эффективного их выращивания. Необходимо дальнейшее совершенствование методов культивирования, получение новых культур клеток, обладающих высокой чувствительностью к вирусам, создание новых клеточных систем на основе гибридизации и генетической трансформации клеток. Важнейшей составной частью питательных сред, содержащей факторы роста клеточных популяций, является сыворотка крови животных. Она продолжает оставаться незаменимым компонентом ростовой среды для большинства клеточных и органных культур (Д.Б. Голубев и др., 1976; Р. Адаме, 1983; Д. Конки и др., 1989; 11.11. Гурьянов, 1992; ЛИ. Хижняк, В.Т. Ночевный, 1994; АЛ. Рянскгш, 2001; И. Swim, R. Parker, 1957; II Pumper et al., 1960; IV. Tayler, 1974). Значение сыворотки крови для роста клеток, выявление ее компонентов, стимулирующих пролиферацию, являются предметом интереса многих исследователей (М.А. Андреева и др., 1996; Г.А. Костина и др., 1996; JLII. Дьяконов, В.И. Ситьков, 2000; Е.А. Рубан и др., 2000; A.JI. Рянскии, 2001 и др.). Чаще всего для этой цели используют сыворотку крови крупного рогатого скота (Т.Н. Дроздова и др., 1983). Из литературных источников (Е. Evege et al., 1985; D. Jayme et al., 1988 и др.) следует, что лучшей является сыворотка крови плодов крупного рогатого скота, но се широкое использование ограничивается, прежде всего, дефицитом и высокой стоимостью. Для уменьшения расхода этого дорогостоящего компонента среды прибегают к замене ее сывороткой от других животных, добавлению в питательные среды очищенных факторов роста, гормонов и белков (А.А. Нариманов, 1991; IV. Cleveland et ai, 1983; S. Reuvenv et ai, 1986; D. Velez et ai, 1986), многие, ш которых являются не менее дефицитными и дорогостоящими. Сыворотка крови плодов коров является одним из главных лимитирующих факторов при крупномасштабном культивировании клеток (Ю.А. Манцыгин и др., 1983) и поиск замены ее более дешевыми сыворотками, перспективен.

При культивировании клеток используются гомо- и гегеровидовые варианты сыворотки крови, обычно крупного рогатого скота, лошадей и свиней. Оптимальная концентрация сывороточного компонента в среде при этом составляет до 10% (Р. Адаме, 1983; Д. Конки и др., 1989; AM. Рянский, 2001 и т.д.).

Несмотря па наличие ряда рецептур бессывороточных культуральных сред, последние не в полной мере обеспечивают рост и пролиферацию клеток, а также репродукцию вирусов. На некоторых бессывороточных средах растут только гетероплоидные, тогда как первичные клетки культуры и диплоидные линии на них выращивать невозможно (К. Iliguchi, R. Robinson, 1973).

Рост и пролиферация клеток наиболее интенсивны при наличии в среде одновременно низко- и высокомолекулярных компонентов сыворотки (Р. Laino, В. Mendino, 1976; A. Nenieskery et ai, 1976). Поскольку химический состав сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей и свиней отличается, можно предположить усиление ростстимулирующего эффекта их комбинаций по принципу дополнения, на культивируемые клетки и повышения репродуктивной активности отдельных вирусов на конкретных культурах клеток за счет отсутствия или снижения концентрации в сывороточном компоненте антител к данным вирусам.

Нам известен лишь один пример (С. Hedy, К. Сипу, 1986) применения комбинированных сывороток: 10 % сыворотки крови плодов коров и 90 % сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота, хотя следует отметить, что сыворотки крови, входящие в данную комбинацию, принадлежат к одному виду животных.

1.2. Цель и задачи исследований. Цель работы состояла в оптимизации сывороточной составляющей питательных сред для выращивания культур клеток и репродукции на них вирусов. Для достижения указанной цели решались следующие задачи:

-изучить росгстимулирующий эффект сывороток крови бычков (СКБ), лошадей (СКЛ), свиней (СКС) и их комбинаций (СКБ + СКЛ, СКБ + СКС, СКЛ + СКС) в различных соотношениях на перевиваемых культурах клеток SP1ZV, MDBK и TR;

1.3. Научная новизна работы. Впервые рассматривается возможность введения в практику культивирования клеток в качестве ростстимулирующе-го фактора питательные среды комбинаций сывороток крови разных видов животных.

Установлено положительное влияние определенных комбинаций сывороток крови животных (бычья и свиная, лошадиная и свиная) на репродукцию вирусов ИРТ и ПГ-З в перевиваемых культурах клеток MDBK и TR. При культивировании клеток на питательной среде с использованием комбинации сывороток крови бычков и лошадей, увеличения урожая вирусной массы ие обнаружено.

1.4. Практическая ценность работы. Предлагается метод снижения негативного влияния присутствия в сывороточном компоненте культураль-пой среды соответствующих вирусспецифических антител, путем сочетания сывороток крови различных видов животных. Использование в качестве ро-стстимулирующего фактора гегеровидовых сывороток крови позволяет снизить вероятность вирусной контаминации культур клеток. Применение в качестве биологически активной добавки в питательных средах комбинаций сывороток крови разных видов животных (бычков и свиней, лошадей и свиней) улучшает рост культур клеток и, таким образом, опосредованно, увеличивает интенсивность репродукции вирусов. Комплексное позитивное влияние комбинаций сывороток дает возможность снизить себестоимость изготовления вирусных вакцин, получаемых на культурах клеток перевиваемых линий, за счет усиления репродукции вирусов и, как следствие, увеличение вирусной массы.

По результатам научных исследований разработаны методические рекомендации утвержденным директором ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» г. Казань от 30.10.2006 г.

1.5. Апробация работы. Материалы, представленные в диссертации, доложены и обсуждены на международных конференциях: "Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний", посвященная 45-летию ФГУ «Федеральный Центр токсикологической и радиационной безопасности животных» (Казань, 2005); "Лекарственные средства для животных и кормов. Современное состояние и перспективы", посвященная 75-летию образования "ВГПКИ" (Москва, 2006); Всероссийская научно-практическая конференция "Перспективы агропромышленного производства регионов России в условиях реализации приоритетного национального проекта "Развитие АПК"" (Уфа,

2006); Международная научно-практическая конференция "Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных" (Ульяновск, 2006); "Современные проблемы клеточной биотехнологии и сохранение генетических ресурсов", посвященной 50-летию научной деятельности Дьяконова Л.П. Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. ЯР. Коваленко (Москва, 2007).

Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана, а в производственном процессе в лаборатории культур клеток и гибридомпой технологии ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» г. Казань. 1.6. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ. 7. Основные положения выносимые на защиту: -установлено, что на биологическую активность при использовании в кульгуральной среде моносывороток животных для культивирования клеток наиболее позитивное влияние оказывают компоненты сыворотки крови свиней; данный эффект существенно усиливается при сочетаниях компонентов последней с биологически активными веществами сывороток крови лошадей и бычков;

-проведенными исследованиями показано, что лучшую пролиферацию перевиваемых клеток SPEV, MDBK и TR обеспечивает сыворотка крови свиней, а ее комбинации (1:1) с сыворотками крови лошадей и бычков наиболее благоприятны для роста клеток;

-увеличение репродукции вирусов на перевиваемых культур клеток, выращенных на среде с использованием комбинированных сывороток крови животных вследствие снижения концентрации в них специфических антител к соответствующим вирусам и повышения пролиферации клеток.

1.8. Реализация результатов исследовании. Результаты выполненных исследований используются: в учебном процессе на кафедре микробиологии и физиологии животных Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана (г. Казань) и в производственном процессе в лаборатории культур клеток и гибридомной технологии ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» г. Казань при культивировании перевиваемых линий животных клеток для изготовления вакцин.

Сыворотку крови свиней рекомендуется использовать в больших масштабах, но сравнению с сывороткой бычков, в качестве биологической добавки в питательные среды для увеличения пролиферации клеток и репродукции вирусов на них.

Утверждены директором ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань) от 30.10.2006 г. методические рекомендации по использованию комбинаций сывороток крови бычков, свиней и лошадей для культивирования клеток и репродукции вирусов.

1.9. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 138 страницах компьютерного текста, состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, библиографического списка литературы и приложений. Работа содержит 25 таблиц, проиллюстрирована 11 рисунками. Список использованной литературы включает 243 библиографических источников, в том числе 110 на иностранном языке.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Ганиев, Ильнур Махмутович

выводы

1. Впервые показана эффективность применения комбинаций сывороток крови разных видов животных (бычков, свиней, лошадей) в качестве биологических добавок в среды для выращивания перевиваемых культур клеток SPEV, MDBK, TR и репродукции на них вирусов инфекционного рипотрахеита и парагрпипа-3.

2. Максимальную пролиферативную активность клеток SPEV, MDBK, TR после 72-х часовой инкубации из моносывороток обеспечивает свиная (индекс пролиферации = 4,38 ± 0,17; 5,64 ± 0,13; 3,71 ± 0,11); промежуточный уровень занимает бычья (индекс пролиферации = 3,83 ± 0,14; 5,64 ± 0,16; 3,61 ± 0,11) и минимальный - лошадиная (индекс пролиферации = 3,74 ±0,16; 4,95 ±0,14; 3,33 ± 0,07).

3. Максимальная репродукция вируса ИРТ имеет место в культуре клеток MDBK, а ПГ-З - в клетках TR, выращенных на среде с моносывороткой крови свиней (lg Т1ЦЬо/мл = 6,1 ±0.1 и 5,8 ± 0,2), промежуточная - бычков (lg Т1ХД50/мл = 5,6 ± 0,2 и 5,3 ± 0,2), минимальная - лошадей (lg тцд50/.МЛ = 5,5 ± 0,1 и 5,1 ± 0,1) для ПГ-З через 48-60 часов, а ИРТ - 7296 часов после заражения культур клеток.

4. Сыворотка крови свиней в своем составе содержит больше общего белка, а сыворотка крови лошадей - меньше по сравнению с сывороткой крови бычков, а различия сывороток крови животных по фракционному составу белков: по суммарному количественному содержанию альбуминов, ex-, Р-глобулинов, которые главным образом стимулируют рост клеток, на нервом месте стоит сыворотка крови свиней 42,1 г/л, а па последнем - сыворотка крови лошадей 30,8 г/л; промежуточное положение занимает сыворотка крови бычков - 32,5 г/л; содержание у-глобулипов в сыворотках крови животных почти одинаковое: меньше в сыворотке лошадей - 25,4, а больше в сыворотке свиней - 27,3, промежуточное положение занимает сыворотка бычков - 25,9 г/л.

Концентрации исследованных ферментов, пиг ментов и продуктов метаболизма максимальны в сыворотке крови лошадей и минимальны в сыворотке крови свиней, а глюкозы больше содержит сыворотка бычков и меньше - лошадей.

Установлено усиление пролиферативной активности перевиваемых клеток при использовании в составе питательной среды комбинаций сывороток крови животных, по сравнению с моносыворотками. Лучшими оказались комбинации сывороток животных в соотношении 1:1. Наивысший индекс пролиферации культур клеток после 72 часового их выращивания отмечен при добавлении в питательную среду комбинации сывороток крови лошадей и свиней (для MDBK 6,29 ± 0,18; TR - 5,78 ± 0,2; SPEV-5,36 ±0,2).

Выявлено увеличение репродукции вируса инфекционного ринотрахеита на культуре клеток MDBK, а парагрипп-3 - на клетках TR при использовании комбинаций сывороток крови бычков и свиней (lg ГЦД^о/мл = 6,6 ± 0,1 и 6,3 ± 0,2) и сывороток крови лошадей и свиней (lg ТЦДя,/мл = 6,5 ±0,1 и 6,1 ± 0,1) и снижение, соответственно, на 14,3 и 1,9 % при комбинации сывороток крови бычков и лошадей (lg ТЦДзо/мл = 4,8 ± 0,2 и 5,2 ±0,1) относительно значений, полученных при использовании сыворотки крови бычков.

11 FA KTII4 ECKT1 E 11РЕДЛ0ЖК1ШЯ

1. Сыворотку крови свиней рекомендуется использовать в больших масштабах, но сравнению с сывороткой бычков, в качестве биологической добавки в питательные среды для увеличения пролиферации клеток и репродукции вирусов на них.

2. Сыворотки крови животных предлагается использовать в комбинациях, что приводит к разнообразию биологических активных компонентов питательной среды и может, при определенных сочетаниях, существенно увеличить пролиферацию клеток и репродукцию вирусов на них.

3. Для улучшения пролиферативной активности клеток MDBK, TR и репродукции на них, соответственно, вирусов инфекционного ринотрахеита и парагриппа-3, культивирование клеток следует проводить на среде с добавлением 10% комбинаций сывороток крови свиней и бычков, свиней и лошадей (1:1).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ганиев, Ильнур Махмутович, Казань

1. Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков / Р. Адаме Пер. с англ. - М.: Мир, 1983.-264 с.

2. Аль-Родан A.M. Выделение вируса иарагриппа-3 от телят с острым респираторным синдромом в откормочных хозяйствах промышленного типа / A.M. Аль-Родан // Сб. науч. тр. МВА. 1980. - т. 16. - С. 53 - 55.

3. Андреева М.А. Изучение возможности использования сывороток, обработанных полиэтиленгликолем, в производстве вирусных препаратов / М.А. Андреева, Г.А. Костина, И.Ф. Радаева, С.Б. Шмелева// Цитология. 1996. -т. 38.-№2.-С. 175 - 176.

4. Антонов Б.И. Лабораторные исследования в ветеринарии. Бактериальные инфекции: Сборник / Б.И. Антонов, В.В. Борисова, П.М. Волкова и др. -М.: Агропромиздат, 1986. 352 с.

5. Афонский С.И. Биохимия животных / С.И. Афонский 3-е изд., перераб. и дон. - М.: Высшая школа, 1970. - 612 с.

6. Баженов К.С. Распространение вирусов парагриппа 3 и респираторно-сипцитиалыюй инфекции среди телят на откорме в осенне-зимний период / К.С. Баженов // Бюл. ВНИИ экспер. вет. - М„ 1983. - № 50. - С. 6 - 8.

7. Басова Н.Ю. Респираторные болезни молодняка КРС инфекционной этиологии в условиях Северного Кавказа / Н.Ю. Басова /7 Авгореф. дне. докт. вет. наук. Краснодар, 2002. - С. 11-14.

8. Бейли П. Статистические методы в биологии / II. Бейли Пер. с англ. -М.: Изд. иностр. лит., 1962. -260 с.

9. Большая медицинская энциклопедия. Гл. ред. Б.В. Петровский. Изд. 3-е. В 30-ти т. М.: Сов. энциклопедия, 1979. т. 11. Коамид - криотерапия, 544 с.

10. Борхсениус С.II. Микоплазмы: молекулярная и клеточная биология, взаимодействие с иммунной системой млекопитающих, иатогенноегь, диагностика/ C'.Ii. Борхсениус, О.А, Чернова, В.М. Чернов, М.С. Вонскнй -СПб.: Наука, 2002.-319 с.

11. Бурдов Г.Н. Вирусные инфекции КРС / Г.Н. Бурдов, Е.И. Марасиненая, 10.Г. Крисепко // Ветеринарный врач. 2001. - № 3. - С. 38 - 39.

12. Вечеркин А.С. Антигенная совместимость вирусов нарагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита в организме телят / А.С. Вечеркин, З.Ф. Зуди-лина, II.П. Крюков // Бюл. ВНИИ экспер. вет. М., 1981. - т. 53. - С. 2628.

13. Высоконоясный А.Н. Респираторные болезни телят на Кубани / А.I I. Вы-сокоиоясный, Н.Ю. Басова, А.Г. Шахов, А.Г. Шипицын // Ветеринария. -2000. -№ 12. -С. 8- 11.

14. Вязовкина И.В. Белковые фракции сыворотки крови крупного рогатого скота для культивирования клеток / И.В. Вязовкина, С.Х Хаертынов // Науч. тр. Казан, вет. института, 1980-т. 136-С. 39-40.

15. Гаврилов В.И. Перевиваемые клетки в вирусологии / В.И. Гаврилов М.: Медицина. 1964.-268 с.

16. Гаенко Г.Н. Бессывороточное культивирование генно-инженерных клеток продуцентов ГМ - КСФ. Условия культивирования и синтез ГМ -КСФ / Т.П. Гаепко, Р.А. Алибаева // Биотехнология. - 1993. - № 11 - 12. -С. 39-41.

17. Галахарь Н.Л. Культивирование гибридом в среде, содержащей сыворотку эмбрионов овец / Н.Л. Галахарь, С.Н. Дьяченко // Цитология. 1987. -т. 29. -№9.-С. 1078.

18. Гаснаряп Г.Г. Межклеточные контакты ускоряют рост клеточных колоний в культуре клеток куриног о эмбриона / Г.Г. Гасиарян, 11.К. Саркисян, А.В. Саядян, P.M. Григорян // Цитология. 1997. - т. 39. - № 7. - С. 566 -570.

19. Гаффаров Х.З. Инфекционные болезни рогатого скота хламидийиой, ми-коилазменной и вирусной этиологии, разработка диагностических и лечебно-профилактических препаратов / Х.З. Гаффаров // Дис. докт. вет. наук. Казань, 1986. - С. 455.

20. Гильмутдинов Р.Я. Влияние степени контаминаций микоплазмами культуры клеток Г1Г1ЭС па электрофоретическую подвижность клеток / Р.Я. Гильмутдинов /7 Цитология. 1992. - т. 34. - № 9. - С. 62.

21. Гильмутдинов Р.Я. Зависимость электрофоретической подвижности клеток от их плотности в культуре / Р.Я. Гильмутдинов // Цитология. 1996. -т. 38,-№2.-С. 192-193.

22. Голубев Д.Б. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии / Д.Б. Голубев, А.А. Соминина, М.Н. Медведева Л.: Медицина, 1976.-222 с.

23. Госманов Р.Г. Ветеринарная вирусология: Учебник / Р.Г. Госманов, Н.М. Колычев. Омск: Изд-во ОмГАУ. - 1999. - 288 с.

24. Гудкова ДА Зависимость пролиферации клеток линии ЗТ 6 в полностью бессывороточной среде от эпидермалыюго фактора роста / Д.А. Гудкова, А.Б. Сорокин //1 фитология. 1987. - т. 29 -№ 2. - С. 1309 - 1313.

25. Гуненков В.В. Одновременное выделение вирусов параиифлюэцы -3 и вирусной диареи при пнсвмоэнфсерите телят / В.В. Гуненков. Ф. Кончел-лотти, Б. Стилис /У Проблемы молекулярной биологии и патологии. -1975.-т. 80.-С. 17.

26. Гуненков В.В. Свойства сыворотки крови северных оленей и результаты применения ее в вирусологии и биотехнологии / В.В. Гуненков, О.И. Сухарев, В.Ф. Сирота // Вопр. вирусологии. 2003. - №> 6. - С. 38 - 39.

27. Гуненков В.В. Вирусные и хламидозойные респираторные инфекции крупного рогатого скота / В.В. Гуненков, Г.А. Халепов, В.М. Сюрин // Животноводство и ветеринария. М, 1975 - № 8. - С. 5 - 131.

28. Гурьянов Н.И. Усовершенствование технологий получения сывороток крови кур, бычков, эмбрионов коров и изучение их свойств при культивировании клеток и вирусов / Н.И. Гурьянов // Автореф. дис. . канд. биол. наук. Казань, 1992. - 19 с.

29. Гурьянов Н.И. Качество сыворотки крови крупного рогатого скога / Н.И. Гурьянов // Ветеринария. 1997. - № 10. - С. 21 - 22.

30. Гурьянов Н.И. Поиск негативного фактора, влияющего па качество сыворотки крови животных / Н.И. Гурьянов // Ветеринарная патология. 2003. -№ 1 (5).-С. 98-99.

31. Делекторская J1.II. Унификация лабораторных методов исследования / JI.H. Делекторская. Под ред. В.В Меньшикова. - М., 1978. - № 8. - С. 83 -89.

32. Дзагуров С.Г. Проблема безопасности профилактических препаратов / С.Г. Дзагуров // Междупар. сими, по стандартизации медицинских биологических препаратов М., 1976. - С. 1 4.

33. Дроздова Т.И. Выделение, характеристика и использование росгстимули-рующпх белков сыворотки крови крупного рогатого скота /Т.И. Дроздова,

34. П.В. Бабикова, С.Г. Курумчина и др. // Цитология. 1983. - т. 25. - № 9. -С. 1082.

35. Дьяконов Л.П. Культуры клеток животных: современные аспекты биотехнологии и взаимодействие клеток с инфекционными патогенами / Л.П. Дьяконов // Цитология. 1994. - т. 36. - № 6. - С. 503 - 504.

36. Дьяконов Л.П. Методические рекомендации по культивированию первичных культур и субкультур и:з ткани легкого плодов крупного рогатого скота / Л.П. Дьяконов. Д.В. Лобунцова, Б.Г1. Асппнадзе М., 1985. - С. 8.

37. Дьяконов Л.П. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии) / Под ред. проф. Л.П. Дьяконова, проф. В.Н. Ситькова М.: Компания Спутиик+, 2000. - 400 с.

38. Жумабаев Х.Ж. Наличие антител в сыворотке крови животных к возбудителю хламидиоза и вируса парагриппа-3 / Х.Ж. Жумабаев, Р.В. Белоусова // Вопр. вет. биологии. Сб. науч. трудов М., 1992. - С. 68.

39. Закутский Н.И. Технология выращивания вакцинного штамма ТК-Л вируса инфекционным ринотрахеитом (ИРТ) крупного рогатого скота для изготовления инактивированной вакцины / Н.И. Закутский // Ветеринария. 1997. -№ 12.-С. 23-25.

40. Закутский Н.И. Разработка и совершенствование технологии изготовления инактивированной вакцины против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота / Н.И. Закутский // Автореф. дис. докт. вет. наук. Покров, 1998.-С. 10-22.

41. Зенин В.В. Зависимость пролиферации клеток ЗТ 6 от концентрации сыворотки в среде / В.В. Зенин, Н.Н. Никольский, В.И. Скоиичева, А.Б. Сорокин // Цитология. 1982. - т. 24. - № 8. - С. 947 - 953.

42. Игудин Л.И. Связь между составом сыворотки КРС и ее способностью стимулировать рост клеточных культур / Л.И. Игудин, С.Д. Орлов, II.В. Кацнельсон и др. // Цитология. 1983. - т. 25. - № 10. - С. 1216 - 1218.

43. Инструкция по определению гемоглобина крови гемнглобипцианидпым методом: Приказ Министра Здравоохранения 15.10.74. М.: 1974. - № 960.

44. Инструкция по определению общего белка в сыворотке крови биуретовой реакции: Приказ Министра Здравоохранения СССР 11.04.72. М.: 1972. № 290.

45. Инструкция по определению общих липидов в сыворотке крови: ЛАХЕМА, о.п., БРНО 1982.

46. Кармолпев Р.Х. Современные биохимические методы исследования в ветеринарии и зоотехнии / Р.Х. Кармолиев М.: Колос, 1971. - 288 с.

47. Кармолиев Р.Х. Соколов, В.Д. О дифференциации белковых веществ крови крупного рогатого скота / Р.Х. Кармолиев, В.Д. Соколов // Сб. научи. трудов Московской ветеринарной академии. 1973. - т. 65. - С. 32 -38.

48. Карпуть И.М. Влияние техногенных факторов на качество молозива и развитие болезней молодняка / И.М. Карпуть // Акт. пробл. патол. с.-х. животных: Матер. Междунар. науч.- практ. конф. Минск, 2000. - С. 483 - 486.

49. Каталог специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (СХЖ РАСХН). М.: 2000. - С. 41 - 42.

50. Кира Е.Ф. Клиника и диагностика бактериального вагиноза / Е.Ф. Кира // Акушерство и гинекология. 1994. - № 2. - С. 32 - 35.

51. Коляков Я.Б. Ветеринарная иммунология / Я.П. Коляков М.: Агронром-нздаг, 1986. - 272 с.

52. Комиссаров В.А. Биохимические показатели сыворотки крови у молодняка / В.А. Комиссаров // Ветеринария. 1979. -№2. - С. 66.

53. Кондрахин И.П. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник / Под ред. проф. И.П. Кондрахипа М.: Колосс, 2004.-520 с.

54. Конки Д. Культуры животных клеток. Методы / Д. Конки, Э. Эрба, Р. Фрелини и др. Пер. с англ. М.: Мир, 1989. - 333 с.

55. Конов П.М. Изучение различных клинических форм инфекционного ри-нотрахеита крупного рогатого скота / П.М. Конов // Тез. докл. Респ. на-учн.-техн. коиф. по проблемам ветеринарии и зоотехнии Казань, 1980. -С. 58 - 60.

56. Коиопаткин А.А. Смешанная инфекция нарагрипиа-3 и пастереллеза телят / А.А. Коиопаткин, П.А. Максимов, A.M. Аль-Родан, В.I I. Тищепко // Ветеринария. 1982. - № 5. - С. 33 - 34.

57. Костина Г.А. Изучение возможности получения и использования лимфы крупного рогатого скота для культивирования клеточных линий / Г.А. Костина, O.I I. Аверихпн, И.Ф. Радаева и др. // Биотехнология. 1991. -№4.-С. 41-42.

58. Костина Г.А. Сравнительный анализ аминокислотного состава сывороток крови различных видов животных при культивировании клеточных линий / Г.А. Костина, И.Ф. Радаева, М.А. Андреева, С.В. Шмелева // Цитология. -1994.-т. 36. -№6.-С. 559.

59. Костина Г.А. Улучшение свойств сывороток, обработанных полиэтиленг-ликолем / Г.А. Костина, И.Ф. Радаева, М.А. Андреева, С.Б. Шмелева // Цитология. 1996. - т. 38. - № 2. - С. 213.

60. Костина Г.А. Свиная сыворотка как компонент питательных среды для культур клеток / Г.А. Костина, И.Ф. Радаева, Л.Ф. Бакулипа // Биотехнология. 2001. - № 1,-С. 48-53.

61. Кравченко А.Т. Проблема контаминации живых вакцин / А.Т. Кравченко // Микробиологии. 1971. - № 5. - С. 66 - 71.

62. Красилышков А.П. Микробиологический словарь справочник / А.Г1. Красильников, Т.Р. Романовская - 2-е изд., перераб. и доп. - Минск: Асар, 1999.-400 с.

63. Красов В.М. Электрофоретические исследования белков крови животных / В.М. Красов Алма-Ата: Наука, 1969. - 235 с.

64. Круман И.И. Остановка роста клеток ВНК 21 и их стабилизация в состоянии покоя под действием сывороточных фракций / И.И. Круман, Н.Ф. Остапенко, Б.К. Гаврилкж и др. // Цитология. • - 1981. - т. 23. - № 8. - С. 934-943.

65. Круман И.И. Рост культур лимфоидных клеток линии RAJ1 в среде, содержащей низкомолекулярные компоненты сыворотки / И.И. Круман, В.В. Архипов // Цитология. 1985. - т. 27. - № 1. - С. 99 - 103.

66. Крюков Н.П. Инфекционный ринограхеит- пустулезный вульвовагинит крупного рогатого скога / 11.11. Крюков /У Игогн науки и техн. ВИНИТИ All СССР. Животноводство и ветеринария М., 1980. - т. 13. - С. 32 -113.

67. Куликова К.С. // Тезисы докл. 2-ой науч. конф. МНИИВ11, М„ 1960. С. 57.

68. Куриленко А.Н. Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных / А.Н. Куриленко, В.Л. Крупалышк М.: Колос, 2000. - С. 144.

69. Лисицин В.В. Разработка и совершенствование средств, специфической профилактики ПГ-З крупного рогатого скота / В.В. Лисицин // Автореф. дис. канд. вет. наук. -2000. С. 10-18.

70. Лукомская Н.С. // Биохимия / Н.С. Лукомская, В.К. Городецкий 1961. -т. 26. -№ 3. - С. 477 - 482.

71. Матая медицинская энциклопедия: В 6-ти т. АМН СССР. Гл. ред. В.И. Покровский М. Советская энциклопедия. - т. 1 А. Грудь - Грудной ребенок. - 1991.-560 с.

72. Малая медицинская энциклопедия: В 6-ти т. АМН СССР. Гл. ред. В.И. Покровский М. Советская энциклопедия. - т. 2. Грудь - Кюммеля болезнь. - 1991.-624 с.

73. Манцыгин 10. А. О преимуществах использования свиной сыворотки при культивировании некоторых линий клеток животных и человека / Ю.А. Манцыгин, П.В. Святухина, С.А. Павулсоне // Цитология. 1983. - т. 25. -№ 10.-С. 1197-1201.

74. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / В.В. Меньшиков, Л.Н. Делекторская, М.: Медицина, 1987. 368 с.

75. Методические рекомендации по контролю качества жидкой сыворотки крови крупного рогатого скота, применяемой в медицинских и биологических целях. М.: 1982. 25 с.

76. Методические указания по применению фтико-химических методов контроля медицинских биологических препаратов: Утверждены зам. Министра Здравоохранения СССР 05.02.77. М.: 1977. - С. 11-12.

77. Миронова Л.Л. Отечественные линии перевиваемых клеток почек теленка субстрат для биотехнологии / Л.Л. Миронова, U.K. Преображенская, Г.С. Шишкова и др. // Биотехнология. - 1998. - № 5. - С. 25 - 31.

78. Мубарак Иса. Выделение латентных аденовирусов от клинически здоровых животных / Иса Мубарак, В.В. Гуненков, К.К. Вертинская, В.П. Сюрин // Тезисы межвуз. науч. конф. по ветеринарной вирусологии М., 1973.-Ч. 2.-С. 52.

79. Нариманов А.А. Бессывороточная среда для культивирования лимфоид-ных клеток человека и миеломиых клеток мышей / А.А. Нариманов // Биотехнология. 1991. - № 1. - С. 49 - 52.

80. Новохатский А.С. Ростовые факторы сыворотки и крови. Новые возможности получения и применения / А.С. Новохатский // Цитология. 1994. -Т. 36,-№6.-С. 506.

81. Новохатский А.С. Тканевые и клеточные культуры в вирусологии и молекулярной биологии / А.С. Новохатский /У В книге: "Итоги науки и техники", Вирусология-М.: 1979.-т. 8.-С 85 -89, 156.

82. Нуриев Г.Г. Изменение некоторых биохимических свойств сыворотки крови после замораживания и огтанваиия / Г.Г. Нуриев, С.Х. Хаертынов, Э.М. Хасанова // Ученые записки Казан, гос. вег. института. 1972. - т. 112.-С. 245 -249.

83. Орлов Ф.М. Малоизвестные заразные болезни животных / Ф.М. Орлов Изд. 2-е, перераб. и доп. М.: Колос, 1973. -312 с.

84. Петрова О.Г. Острые респираторные вирусные инфекции крупного рогатого скота в Свердловской области / О.Г. Петрова, А.Т. Татарчук, I1.J1. Сапожникова и др. // Ветеринария. 2002. - № 2. - С. 11-15.

85. Петрова О.Г. Острые респираторные вирусные инфекции крупного рогатого скота в хозяйствах Свердловской области / О.Г. Петрова, А.Т. Татар-чук, Н.Л. Сапожникова, И.И. Стригалеева // Ветеринарный врач. 2000. -№ 4. - С. 86 - 90.

86. Пиле Э.Р. Обезьяны как источник вирусных заболеваний человека / Э.Р. Пилле // Вонр. вирусологии. 1985. - т. 30. - С. 138 - 144.

87. Пиле Э.Р. Современное состояние проблемы контроля биологических препаратов на отсутствие вирусов-контаминантов /' Э.Р. Пилле, С.Г. Дза-гуров // Матер, науч. конф. Гос. контрольного института им. Л.А. Тарасе-вича.-М.: 1970.-С. 129- 141.

88. Подчерняева Р.Я. Замена нативных сывороток ростстимулирующими белками при культивировании клеток млекопитающих / Р.Я. Подчерняева, Г.Н. Мельниченко, Э.П. Ко иду // Вонр. вирусологии. 1995. - № 1. - С. 39 -41.

89. Поликарпова С.И. Рост клеток в культуре в средах, содержащих сыворотки отечественного производства / С.И. Поликарпова и др.j // Цитология. -1987. т. 29. - № 9. - С. 1099 - 1100.

90. Прозоровский С.В. Медицинская мпкоплазмология / С.В. Прозоровский, И.В. Раковская. 10.В. Вульфович М.: Медицина. 1995. -285 с.

91. Радаева И.Ф. Получение и применение сывороток оленей и овец для культивирования клеточных линий / И.Ф. Радаева, Г.А. Костина, О.П. Аверихин, В. В. Шапров // Биотехнология. 1990. - № 4. - С. 36 - 38.

92. Радаева И.Ф. Исследование свойств сывороток крови различных видов животных / И.Ф. Радаева, Г.А. Костина, С.Б. Шмелева. М.А. Андреева // Цитология. 1996. - т. 38. - № 2. - С. 244.

93. Раковская И.В. Биологическая характеристика миконлазм-контаминаитов тканевых культур / И.В. Раковская // Авгореф. дис. канд. биол. наук. М., 1966. - 23 с.

94. Ревякина В.М. Иммунный ответ у животных на введение вакцины травин ВИЭВ / Е.М. Ревякина, А.Ф. Шуляк, О.В. Майджи, К.П. Юров // Ветеринария. 1998. - № 6. - С. 25 - 27.

95. Романюк Е.Н. Опыт получения препарата сыворотки крови эмбрионов коров / Е.Н. Ромашок, Г.Н. Буденая, J1.K. Шамгина и др. // Цитология. -1983.-т. 25. № 9. - С. 1093.

96. Рубан Е.А. Некоторые проблемы глубинного культивирования клеток животных в биореакторах / Е.А. Рубан, Б.В. Соловьев, М.А. Гунин // Тезисы докладов Всерос. науч. практ. конф., посвященной 30-летию института 8-9 июня 2000 г. - Шелково, 2000. - С. 290.

97. Ряпскпй A.JI. Сравнительное исследование трипсина различных фирм, используемого для получения первичной культуры клеток / А.Л. Рянский // Тезисы докл. Всерос. науч. конф. 14-15 февраля 2001 г. М., 2001. - С. 217.

98. Ряиский А.Л. Изучение ростовых свойств питательных сред фирмы H1MEDIA / А.Л. Рянский, II.С. Шевырев, О.В. Щербакова // Тезисы докл. Всерос. науч.-практ. конф., посвященной 30-летию института 8-9 июня 2000 г. Шелково, 2000. - С. 112.

99. Сергеев В.А. Размножение вирусов животных в культуре ткани / В.А. Сергеев М.: Колос, 1966. - 311 с.

100. Сергеев В.А. Репродукция п выращивание вирусов животных / В.А. Сергеев М.: Колос, 1976. - 302 с.

101. Сизов И. Изоляция на аденовирусы от бронхопневмонии телят / И. Сизов, Р. Бостанджиева // Вет. мед. науки, 1983 т. 20. - № 5-6. - С. 52 -56.

102. Сисяпш П.Н. Профилактика вирусных респираторных болезней телят / П.Н. Сисяпш, Г.Р. Рсджепова, И.В. Убитииа, Г.В. Зоткип // Мат. Между-нар. науч.- практ. конф. Акт. пробл. болезней молодняка в соврем, условиях. Воронеж, 2002. - С. 38 - 40.

103. Сметанин М.А. Особенности течения гриппа и КРС в хозяйствах Среднего Поволжья / М.А. Сметании // Казан, вет. институт. Диагп. зараз, заболев. с.-х. животных. Казань, 1982. - С. 45 -47.

104. Сорокин А.Б. Пролиферация и синтез ДНК в культуре клеток CIIO-K1 при различной концентрации сыворотки в среде / А.Б. Сорокин // Цитология. 1981. т. 23. - № 4. - С. 468 - 472.

105. Спиера Р.Г. Биотехнология клеток животных / Р.Г. Сниера, Дж. Б. Гриффите -11ер. с англ. М.: ВО Агропромиздат, 1989. - С. 112-113.

106. Сухарев О.И. Диссеминапия и персистировапие вирусов ИРТ, ПГ-З, ВД-БС в организме телят при экспериментальном заражении / О.И. Сухарев, П.II. Гладченко // Сб. науч. трудов ВГНКИ вет. препаратов М., 1981.-С. 87-92.

107. Сюрип В.Н. Парагршшозная инфекция крупного рогатого скота / В.Н. Сюрин, В.В. Гуиснков // Ветеринария. 1968. 6. - С. 109 - 112.

108. Сюрин В.Н. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самум-ленка, Б.11. Соловьев, I I.B. Фомин М.: BI1ИТИБ11, 1998. - С. 242 - 243.

109. Сюрин В.М. Частая вирусология. Справочная книга / В.М. Сюрин, Н.В. Фомина М.: Колос. - 1979. - С. 472.

110. Тищепко В.П. Аденовирусная инфекция как этиологический фактор респираторного синдрома телят в промышленных комплексах / В.П. Тищепко // Сб. науч. трудов Московской вет. академии. М., 1980. - т. 116.-С. 48-51.

111. Тукшаитов Р.Х. Основы динамической метрологии и анализа результатов статистической обработки / Р.Х. Тукшаитов Казань: Мастер Лайн, 2001.-284 с.

112. Унифицированные методы лабораторных исследований / Лаб. дело. -1976.-№6.-С. 373 -374.

113. Хаертынов С.Х. Взятие крови с целью получения сыворотки для культивирования клеток / С.Х. Хаертынов, II.К. Мамлеева // Цитология. -1982. -№ 11. С. 66-67.

114. Хижняк Л.И. Получение и изучение свойств сыворотки крови плодов овец / Л.И. Хижняк, В.Т. Ночевный // Цитология. 1994. - т. 36. - № 6. -С. 585.

115. Холод В.М. Электрофорез белков сыворотки крови крупного рогатого скота в полиакриламидиом геле / В.М. Холод // Вестник сельскохозяйственных наук. 1974. - № 2. - С. 93 - 97.

116. Цветков П. Серологични проучваня на вирусе на мукозната болеет -внруна днарея по говедита / П. Цветков, К. Петков, Д. Огнянов // Вег. мед. пауки. 1982. - т. 19. № 4. - С. 29 - 35.

117. Чечеткин А.В. Биохимия животных: Учебник для студентов зооинжи-нер. и ветеринарн. ф-тов с.-х. вузов / А.В. Чечеткин, И.Д. Головацкий, П.А. Калиман, В.И. Воронежский М.: Высшая школа, 1982. -511 с.

118. Шахов А.Г. Инфекционные заболевания КРС проявляющиеся респираторными и коп'ыонктивальиыми синдромами / А.Г. Шахов, С.И. Перпшна, М.И. Лебедев // Матер, науч.- произв. конф. по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии. -2001. Ч. 1.-С. 107- 108.

119. Юрков С.Г. Универсальная роллерная технология культивирования перевиваемых клеток животных / С.Г. Юрков, А.Н. Курносов, С.А. Витина и др. // Ветеринария. 1995. - № 9. - С. 29 - 34.

120. Ярных Е.В. Биологические свойства сухой вирусной вакцины против иарагриипа-3 крупного рогатого скота / Е.В. Ярных // Труды ВИЭВ. -1981.-т. 53.-С.21 -25.

121. Ballard F. Effects of Growth factors on protein turnover in cultured cells / F. Ballard // Hoppe-Beylefs Z. Physiol Chem. 1982. - v.363. - №9. - p. 977.

122. Barile M. Isolation of Mycoplasma arginini from commercia bovine sera its implication in contaminated cultures / M. Barile, J. Kern // Proc. Soc. Exp. Biol, and Med. 1971.-v. 138. ~№2.-p. 432-437.

123. Beran M. Serum inhibitors of in vitro colony formation: relation to haema-topoetic tissue in vivo / M. Beran // Exp. 1 lemat. 1974. - v. 2. - №1. - p. 58 64.

124. Bergman H. Isolirung and Charakterisierung boviner Parainfluenza 3 Vi-ren in der DDR / IT Bergmann, H. Lieberman // Arch. Exp. Veterinarmed. -1967. - Bd.21. - s. 1485-1497.

125. Bergmeyer И. (llrsg.) Methoden der enzymatischen analyse. VVeinheim / H. Bergmcycr // Verlag Chcmic. 1974. - Bd. 1. - s. 607-612, 769-775, 785-792.

126. Bessey 0., Lovvry, 11., Brock, M. / J. Biol. Chern. 1940. - v. 164. - p. 321.

127. Brown D. Platelets contain a peptide inhibitor of endothelial cell replication and growth / D. Brown, D. Clemmons // Proc. Nat. Acad. Sci. IJSA. 1986. -v. 83. -№ 10.-p. 3321 -3325.

128. Brownline J. Experimental production of fatal mucosal disease in cattle / J. Brownline, M. Clurke, C. Howard // Vet. Res. 1984. - v. 114. - № 22. - p. 535-536.

129. Brownline J. Bovine virus (BVDV). Pathogenesis and vaccines / J. Brownline, I. Nobiron, 1. Thompson, M. Collins // 2nd Edition Int. Vet. Vaccines and Diagn. Conf. Oxford, 2000. - p. 39.

130. Bryson D. Respiratery syncytial virus pneumonia in young calves: Clinical and pathologic findings /' D. Bryson, M. McNulty, E. Logan, P. Cuch // Amer. J. Vet. Res. 1983. - v. 44. -№ 9. - p. 1648 - 1655.

131. Buno W. Effect of cortisone on growth in vitro of femur of the chick embryo / W. Buno, H. Goyena // Proc. Soc. Exp. Biol. N. Y. 1955. - v. 89. - p. 622.

132. Burke J. Growth in retinal glial cells in vitro is affected differentially by two types of contact mediated interactions / J. Burke // Exp. Cell Res. - 1989. - v. 180. - p. 13- 19.

133. Calad de Itturi G. Effects of prolactin and growth hormone on DNA synthesis of rat mammary carcinomas in vitro / de Itturi G. Calad, C. Welsch // Expe-rientia (Basel). 1976. - v. 32. - p. 1045 - 1046.

134. Carpenter C. Patent 4473647, ivlKI3 C12 №5/00, 1/38; A61K 35/16; С 07 G 7/00. Tissue culture medium / C. Carpenter, R. Cone (USA), 1985.

135. Chan S. Inhibition of bone marrow colony formation by normal and leukemia human serum / S. Chan, D. Metcalf// Nature. 1970. - v. 227. - p. 845 -846.

136. Chang R. Macromolecular growth requirements of human cells in continuous culture / R. Chang, R. Pcnncll, W. Keller // Proc. Soc. Exp. Biol. 1959. -v. 102. -№ 1. - p. 213 -217.

137. Choi Y„ Morris G., Lee F. et al. // Connect Tissue Res. 1980. - v. 7. - № 2.-p. 105-112.

138. Cleveland W., Wood L., Erlanger B. // J. Immunol. Methods. 1983. - v. 56.-p. 221-234.

139. Collier L. Contamination of stock lines of human carcinoma cells by pleuro-pneumonialike organismus / L. Collier // Nature. 1957. - v. 180. - p. 757-758.

140. Cornman I. Selective damage to fibroblasts by deoxycorti costerone in cultures /1. Cornman // Science. 1951. - v. 113. - p. 37.

141. Eagle II. Aminoacid metabolism in mammalian cell cultures / II. Eagle // Proc. Nat. Sci. US. 1959. - v. 130. - № 3373. - p. 432 - 437.

142. Esber I I. Variability of hormone concentration and ration in commercial sera used for tissue cultures / I I. Esber, I. Payne, A. Bogden // J. Nat. Cancer Inst. -1973. v. 50. - № 2. - p. 559 - 562.

143. Eswards G., Robson R., Campbell .1. / Cell Sci. 1987. - v. 87. - № 5. - p. 657-665.

144. Evege E. Alternative serum substitutes for fetal bovine serum / E. Evege, C. Nash, M. Bodziak, D. Jayme // J. Nat. Cancer Inst. 1985. - v. 101. - № 5. -Part. 2. - p. 489-490.

145. Ferguson J. Isolation and long-term culture of diploid mammalian cell lines / J. Ferguson, A. Wansbrough // Cancer Res. 1962. - v. 22. - № 5. - Part 1. -p. 556-562.

146. Foley G. Isolation and serial propagation of malignant and normal cells in semi-defined media. Origins of CCRF cell lines / G. Foley, B. Drolct, R. McCarthy // Cancer Res. 1960. - v. 20. -№ 6. - p. 930-938.

147. Gaunt S. Cell cycle variation associated with feeder effects in cultures of Chiness hamster fibroblasts / S. Gaunt, S. Subak-Sharpe // Exp. Cell Res. -1977. -v. 109.-p. 341-348.

148. Ghram A. Bovine herpesvirus-1 and Parainfluenza-3 virus interactions: clinical and immunological response in calves / A. Ghram, P. Reddy, J. Morrill et al. // Canad. J. Vet. Res. 1989. - v. 53. - № i. - p. 62-67.

149. Gospodarowicz D., Moran, J. / Anne. Rev. Biochem. 1976. - V. 45. - p. 531-558.

150. Granstrom M. Conditions influencing inhibitors of the colony-stimulating factors (CSF) / M. Granstrom /7 Exp. Cell. Res. 1974. - v. 87. - p. 307-312.

151. Higuchi К. Studies on the cultivation of mammalian cell lines in a serum-free, chemically defined medium / K. Higuchi, R. Robinson // In Vitro. -1973.-v. 9. № 2. - p. 114-121.

152. Holmes R. Longtertn cultivation on human cell (Chang) in chemically defined medium and effect on added peptone fraction / R. Holmes // J. Biophys. and Biochem. Cytol. 1959. - v. 6 - p. 535-536.

153. Jayme D. Fetal bovine serum alternatives / D. Jayme, D. Epstein, D. Conrad // Nature. 1988. - v. 334. - № 6182. - p. 547-548.

154. KarmenA. //Clin. Invest.- 1955,- v. 34. -p. 131.

155. Klaus L. A new chemically defined, low protein conteining medium (L 41) for the permanent cultivation of a variety of cell types of different origin / L. Klaus // Eur. J. Cell Biol. 1989. - v. 48. - № 26. - p. 38.

156. Kniazeff A. // J. Methods in Enzymology. 1979. - V. 43. - p. 233-257.

157. Koves B. Parainfluenza-3 virus oktani szerepe egy gazdasag boriainak legzoszervi megbetege - desciben / B. Koves, S. Belak, J. Varga // Magyar al-latorv. Lapja. - 1983. - Bd. 38. - № 1. - s. 14-17.

158. Kubin G. Fectstellung der infektiosen Rhinotracheitis (IBR) des Rindes in Osterreieh /' G. Kubin // Wien tierarztl. Mschr. 1982. - Bd. 69. - № 5. - s. 145 - 148.

159. Laino P. Organ cultures of human corneas / P. Laino, B. Mondino // Bull. N. Y. Acad. Med. 1976. - v. 52. - № 2. - p. 216-221.

160. Leffert H. Growth control of differetiared fetal rat hepatocytes in primary monolayer culture / H. Leffert, D. Weinstein // J. Cell. Biol. 1976. - v. 70. -№ l.-p. 20-32.

161. Liebennan J. Purification of a serum protein requires by mammalian cell in tissue culture / J. Liebennan, P. Ove // Biochemica et Biophysica. Acta. 1957. -v. 25.-№2.-p. 449-450.

162. Linon P. Suites contentieuses de la vente de genisses importees et reconnues infectees de rhino-tracheite / P. Linon // Rev. Med. Veter. 1979. - v. 130. - № 8-9.-p. 1179-1192.

163. Lockwood D. Insulin-dependent DNA polymerase and DNA Synthesis in mammary epithelial cells in vitro / D. Lockwood, A. Voytovich, Y. Stockdale // Proc. Nat. Acad. Sci. (Wash.). 1967. - v. 58. - p. 658-664.

164. Macleod A. Serum quality: an analysis of its components. / A. Macleod, O. Drumond // In: Develop. Boil. Standard. 3rd General Meeting of ESACT, Oxford Basel, 1979 1980. - v. 46. - p. 17-20.

165. Madin S„ Darby N. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1958. V. 98. - p. 574.

166. Marks V // Clin. Cliim. Acta. 1959. - № 4. - v. 3. - p. 395.

167. Marsh W., Fingerhut В., Miller I I. // Clin. Chem. 1965. - v. 11. - p. 624.

168. Marshall R. Nautralizing Antibody in serum and nasi secfetions of calves exposed to Paramfluenza-3 Virus / R. Marshall, L. Frank // Amer. J. Vet. Res. -1971. v. 32.-№ 11.-p. 1699-1706.

169. Metzger O. Separation on growth promoting activity from horse serum by dialysis /' O. Metzger, M. Moscowitz // Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1960. - v. 104.-p. 363 -365.

170. Middleton J., Griffith W. // Brit. Med. J. 1957. - v. 2. - p. 1525.

171. Miyazono K. A platelet factor stimulating the proliferation of vascular endothelial cells. Partial purification and characterization /' K. Miyazono, T. Okabe, S. Ishibashi // Exp. Cell Res. 1985. - v. 159. - № 2. - p. 487-494.

172. Monlander C, Kniazeff A., Boone, C. et al. // In Vitro. 1972. - v. 7. - № 3.-p. 168-173.

173. Mozaffari-Nezhad H. Antibody appearance of parainlluenza-3 virus in cattle population in West Azerbaijan province / H. Mozaffari-Nezhad, J. Kita // Pol. Arch. Veter. 1980. - v. 21. - № 4. - p. 473-476.

174. Nemeskery A. Cell differentiation of the fetal rat interior pituitary in vitro / A. Nemeskery, A. Nemeth, С у Setalo // Cell and Tissue Res. 1976. - v. 170. -№2.-p. 263-273.

175. Ohtani J. The influence of cortisone acetate on the growth of tissues cultivated in vitro / J. Ohtani // Jap. J. Bacterid. 1955. - v. 10. - p. 145.

176. Ока М. Л serum-free defined medium for retinal pigment epithelial cells / M. Oka, R. Landers, C. Briolgcs // Exp. Cell Res. 1984. - v. 154. -№ 2. - p. 537-547.

177. Overell B. Rffects of hormones and their analogues upon uptake of glucose by mouse skin in vitro / B. Overell, S. Condon, W. Petrov // J. Pharm. 1960. -v. 12.-p. 150.

178. Paul D. 3T3 cell growth initiation and multiplication in defined medium supplemented with growth factors and hormones that replace serum / D. Paul // Horm. Defined Media: Tool Cell Biol. Berlin e. a. - 1982. - p. 79-87.

179. Price P., Gregory E. // In Vitro. 1982. - v. 18. -p. 576-584.

180. Pritchard D. Current, research on calf pneumonia / D. Pritchard // Veter. aim. (Bristol). 1980. - v. 20. - p. 189-203.

181. Puck T. Genetics of somatic mammalian cells. Long term cultivation of enploid cells from human and animal subjects / T. Puck, S. Ciecura, Л. Robinson // J. Exp. Med. - 1958. - v. 108. - № 6. - p. 945-955.

182. Pumper R. Multiplication of vaccinia virus in serum-free and serum-containing cell cultures / R. Pumper, L. Alfred, D. Sackett // Nature. 1960. - v. 185.-№4706.-p. 123-124.

183. Reed L. A simple method of estimating 50 % endpoints / L. Reed, H. Muench // Amer. J. Hygiene, 1938, v. 27. p. 493- 497.

184. Reuveny S., Velez D., Miller L., Macmillan J. // J. Immunol. Methods. -1986.-v. 86.-p. 61-69.

185. Rightsel W. Detection of latent viruses / W. Rightsel // Nat. Cancer Inst. Monogr. 1968. v. 29. p. 359-363.

186. Robinson L. Contamination of human cell cultures bi PPLO / L. Robinson. R. Wichelnansen, B. Roirman // Science. 1956. - v. 124. - p. 1 i 47-1148.

187. Sato G. Molecular growth requirements of single mammalian cell / G. Sato, I I. Fischer, T. Puck // Science. 1957. v. 126. - p. 961.

188. Sell S. Alpha-leloprotein / S. Sell, F.F. Becker // J. Nat. Cancer Inst. 1978. -v. 60.-p. 19-26.

189. Servais L. La Bclqique entname un programme d\ eradication de I. 1DR / L. Scrvais // Elcvagcs bclqcs. 1996. - № 10. - p. 9-14.

190. Sheffield L. Control of mammary gland fibroblast growth by insulin, growth hormone and prolactin / L. Sheffield, R. Anderson // Cell. Biol. Int. Repts. -1986. v. 10.-№ l.-p. 33-40.

191. Smith M. The Maemagglutinin of Echovirus SAI / M. Smith //Arch. Ges. Virusforsch. 1969. - Bd. 28. - s. 417-420.

192. Stanbridge E. Mycoplasmas and cell cultures / E. Stanbridge // Bact. Rev. -1971. v. 35 - № 2. - p. 206-227.

193. Stocker M. Density dependent inhibition of cell growth in cultures / M. Stocker, H. Rubin //Nature. - 1967. - v. 215. - p. 171-172.

194. Straub O. The IBR-IPV disease complex / O. Straub // Vet. Med. Rev. -1983. v. 2.-s. 119-131.

195. Swim H. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially / H. Swim, R. Parker // Amer. J. Hyg. 1957. - v. 66. - № 2. - p. 235-243.

196. Taketani Y. Epidermal growth factor stimulates eel! proliferation and inhibits functional differentiation of mouse mammary epithelial cells in culture / Y. Taketani T. Oka // Endocrinology. 1983. - v. 113. - № 3. - p. 871-877.

197. Tayler W. Feeding the baby serum and other supplements to chemically defined medium / W. Tayler // J. Nat. Cancer Inst. - 1974.v. 53. - p. 14491457.

198. Tietz N. Fundamentals of Clinical Chemistry / N. Tietz // 3"d Edition Philadelphia, WB Saunders Co. 1987. - p. 372.

199. Tinapp D. Rindergrippe -was ist zutum / D. Tinapp // Rinderwelt. -- 1983. -Bd. 8. № 2. - p. 48-50.

200. Tjio J. Genetics of somatic mammalian cells. 11. Chromosomal constitution of cells in tissue culture / J. Tjio, T. Puck // J. Exp. Med. 1958. - v. 108. - № 2.-p. 259-268.

201. Traian E. Patent 80263, ivlRE A6IK 35/22. Proceden de preparare a serului stimulat de cal, pentru culture celulate / E. Traian, M. Melania, M. Marin, N. Stefan (CPP), 1982.

202. Trowel 1 0. Cool. Intern / 0. Trowell // CNRS. 1961. - v. 101. - p. 237.

203. Uittenbogaal C„ Cantor Y„ Fahey J. // In Vitro. 1983. - v. 19. - p. 67-72.

204. Van Wyk J. Chemical properties and some biological effects of human so-matomedine / J. Van Wyk, L. Underwood, R. Hintz et al. // Advances in human growth hormone research. DHEW; Publ. - Baltimore. - 1973. - p. 25-45.

205. Velez D„ Reuveny S., Miller L. et al. // J. Immunol. Methods. 1986. - v. 86. - p. 45.

206. Welke G. Die Vervendung von Diploidsellinien als Vermehrungssubstrat fur die Virusimpfstoffproduction / G. Welke // Gbl. Gesamte Hyg. 1980. - Bd. 26.-p. 365-372.

207. Westermark B. Initiation of DNA synthesis of stationary human glia like cells by a polypeptide fraction from human plasma containing somatomedine activity / B. Westermark, A. Wasteson, K. Uthene // Exp. Cell Res. - 1975. - v. 96.-p. 58-62.

208. Wroblewski F., La Due J. // Ann. Intern. Med. 1956. - v. 45. - p. 801.

209. Yoshikura FI. Transient inhibition of mitotic activity by addition of calf serum /11. Yoshikura // Exp. Cell Res. 1972. - v. 74. - p. 403-406.rrl

210. Young D. Effects of Drugs on Clinical Lab. Tests / D. Young // 3 Edition, AACC Press, Washington, D.C., 1990.

211. Zamansky G., Arundel C„ Namasawa II. et al.. // J. Cell Sci. 1983. - v. 61. -p. 289-297.

Информация о работе

Ганиев, Ильнур Махмутович
кандидата биологических наук
Казань, 2007
ВАК 03.00.23

Диссертация

Применение комбинаций сывороток крови различных видов животных для культивирования клеток и репродукции вирусов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы