Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение состава, физико-химических и иммунохимических свойств иммуноглобулинов G гипериммунных сывороток животных

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение состава, физико-химических и иммунохимических свойств иммуноглобулинов G гипериммунных сывороток животных"

На правах рукописи

Дедкова Лариса Михайловна

ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И ИММУНОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ в ГИПЕРИММУННЫХ СЫВОРОТОК ЖИВОТНЫХ

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово, 1996 г.

Работа выполнены в НИИ молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Минздравиедпрома РФ

Научный руководитель:

кандидат химических наук

В.И. Офицеров

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАН

Н.П. Мертвецов А.1. Куслий

кандидат медицинских наук

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН.

Защита диссертации состоится 10 октября 1996 г. в 9 часов утра на заседании диссертационного совета Д 074.20.01 в ГНЦ ВБ «Вектор» по адресу: 633159, п.Кольцово, Новосибирской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ «Вектор».

Автореферат разослан « » августа 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета: кандидат химических наук

Т.Н.Шубина

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В защите млекопитающих от разнообразных микроорганизмов и токсинов ключевую роль играют иммуноглобулины класса в. К этому классу принадлежит основное количество антител, образующихся в ответ на чужеродные вещества. К настоящему времени достигнуты значительные успехи в понимании структурной организации и функционирования построена модель связывания ими антигенов, основанная на принципе пространственной комплиментарное™. Показано, что человека и животных подразделяются на подклассы. Для подклассов человека выявлены отличия в аминокислотной последовательности 4-7 пептидов, расположенных в С-концевом участке молекулы, а также в количестве Б-Б связей в «шарнирной» области. Найдено, что они различаются также и по биологическим функциям.

Значительно менее изученными являются подклассы животных, хотя сыворотки иммунных кроликов, коз, баранов, лошадей и выделяемые из них антитела широко используются для решения научно-практических задач иммунологии, вирусологии, биотехнологии и медицины. Такие сыворотки гетерогенны по составу и специфичности иммуноглобулинов, и иммунизация животных даже высокоочшценными белковыми антигенами сопровождается наработкой большого количества неспецифических На разных стадиях иммунного ответа продукция их может превышать образование антител к целевым антигенам. Поэтому изучение состава и свойств подклассов ^С-фракции сывороток иммунных животных является актуальной задачей, решение которой может способствовать рациональному выбору схем иммунизации и разработке методов получения высокоактивных препаратов антител. Кроме того, изучение подклассов таких сывороток представляет теоретический интерес, связанный с исследованием реакции иммунной системы млекопитающих на длительное введение больших количеств чужеродных субстанций различной природы.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение состава и свойств подклассов в сыворотках кроликов, коз и лошадей, гиперяммунизированных вируссодержащими гомогенатами органов инфицированных мышей и морских свинок. В соответствии с целью исследования решались следующие задачи:

- разработка эффективного Метода количественного определения подклассов животных;

- сравнительный анализ состава ^в-фракции сыворотки крови иммунных и неиммунных животных;

- изучение состава и специфичности подклассов ^О сывороток коз и лошадей, иммунизированных вируссодержащими гомогената-ми органов животных;

- исследование состава подклассов в препаратах антител, полученных из гипериммунных сьтороток коз методом спиртового осаждения;

- разработка подходов к получению высокоактивных препаратов иммуноглобулинов с пониженной реактогенностью из гипериммунных сывороток лошадей против ВКЭ;

Научная новизна. В результате проведенных исследований разработан эффективный метод количественного анализа состава подклассов в сыворотках животных.

Исследование сывороток кроликов, коз, овец и лошадей с помощью разработанного метода позволило выявить общие закономерности в составе подклассов 1^0 в ходе гипериммунизации. Впервые показано, что иммунные сыворотки животных отличаются от неиммунных не только количеством иммуноглобулинов в, но и составом подклассов. В сыворотках крови гипериммунных кроликов и коз, так же как и лошадей, происходит значительное увеличение подкласса с большим отрицательным зарядом, независимо от типа используемого антигена.

При исследовании этого подкласса выделенного из сывороток гипериммунных коз, были выявлены его отличия от известных ранее подклассов 1§01 и 1ёй2 по физико-химическим свойствам, строению С-конце-вых участков молекулы и специфичности.

В ходе изучения состава и свойств подклассов гипериммунных сывороток лошадей против ВКЭ было установлено, что фракция (Т) при содержании небольшого количества антивирусных антител проявляет значительную активность к растворимым антигенам мозга мыши. Выявлена также повышенная реактогенность этого подкласса, и экспериментально обоснованы ее возможные причины. На основании полученных результатов разработаны подходы к препаративному получению высокоактивных антител кВКЭ.

Практическая ценность. Результаты настоящей работы представляют несомненную практическую значимость, так как гипериммунные сыворотки животных и выделенные из них препараты антител широко используются в медицинских диагностических исследованиях, а в некоторых случаях все еще применяются для лечебно-профилактических целей. Такие антисыворотки и антитела часто используют в вирусологии, где наработка больших количеств очищенных вирусных белков для иммунизации животных

является достаточно дорогой и представляет потенциальную опасность для работающего персонала.

Апробация. Материалы диссертационной работы докладывались на следующих конференциях: «Проблемы использования целлюлозы и ее производных в медицине и микробиологической промышленности» (Ташкент, 1989); «Актуальные проблемы биотехнологии» (Кольцово, 1990); «Молекулярная сорбция биологически активных веществ» (Пенза, 1990); «Вопросы эпидемиологии и профилактики природноочатовых инфекций» (Омск, 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Объем работы. Диссертационная работа изложена на 105 страницах машинописного текста, включая 15 таблиц, 18 рисунков. Список литературы содержит 118 наименований работ: 13 на русском и 105 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Разработка метода количественного анализа подклассов 1дв в сыворотках крови животных

Из анализа литературных данных о подклассах животных следует, что они в большей степени, чем подклассы ^О человека, отличаются по суммарному заряду. Широко используемый для характеризации подклассов иммуноэлектрофорез позволяет идентифицировать их как гамма-2, гамма-1 или бета-2-глобулины. Известным методом получения животных является анионообменная хроматография на сорбентах типа ДЕАЕ-целлюлозы и ДЕАЕ-сефадекса. С помощью этого метода с высокой степенью чистоты удается получить, как правило, только один из подклассов Гцв животных, что объясняется их недостаточной эффективностью при разделении белков с близкими зарядами. Кроме того, они обладают слабой механической прочностью и изменяют объем в зависимости от ионной силы эшоента. Это затрудняет регенерацию сорбента и его многократное использование в аналитической хроматографии.

К ионообменникам нового поколения относятся композиционные сорбенты на основе пористых кремнеземов, модифицированных полимерными материалами. Они сочетают в себе высокие емкость, разрешение, стабильность и могут быть использованы как в колоночной хроматографии низкого и среднего давления, так и для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В настоящее время этот вид хроматографии приобрел большое значение для анализа сложных белковых смесей. Основными ее преимуществами являются быстрота проведения анализа и возможность количественной интерпретации результатов. Кроме того, ВЭЖХ хорошо сочетается с иммуноферментным анализом, который в случае иммуноглобулинов

О позволяет быстро определить в хроматографических пиках содержание специфичных антител.

Поэтому для разработки метода количественного анализа состава подклассов сывороток животных нами была выбрана ВЭЖХ на отечественном композиционном анионообменнике Полисил СА. Сравнение этого сорбента с ДЕАЕ-целлюлозой на примере фракционирования белков сыворотки крови овцы показало, что с помощью Полисил СА их удается разделить на шесть отдельных пиков, в то время как на ДЕАЕ-целлюлозе — только на три. На обоих сорбентах выявляются в первом пике (стартовый буфер) и во фракциях, элюирующихся при низких концентрациях соли (0,04-0,15 М). Э,то свидетельствует об отсутствии существенных отличий во взаимодействии с ионогенными группами обоих сорбентов при более высокой разрешающей споробности Полисил СА.

Селективность анионообменной хроматографии может быть дополнительно увеличена путем оптимизации процесса элюции. Хотя линейный градиент соли является наиболее распространенным элюентом, из анализа литературных данных следует, что тщательно подобранный ступенчатый градиент может улучшить разделение сывороточных белков. Мы исследовали эффективность применения ступенчатого градиента хлорид-ионов для разделения ^в-содержащих пиков на примере хроматографии белков сыворотки крови овцы. Выбор молярной концентрации каждой ступени и ее объем проводили с использованием данных элюции этих белков с Полисил СА линейным градиентом КС1. В результате проведенных исследований удалось подобрать ступенчатый градиент, который существенно улучшает разрешение белковых пиков при хроматографии.

Эффективность хроматографического разделения иммуноглобулинов О, очевидно, могла бы дополнительно возрасти после предварительного удаления из исходного образца сывороточных белков, не относящихся к Мы осуществили подбор оптимального способа предварительного фракционирования сыворотки д ля хроматографического анализа. Подготовка образца сыворотки для хроматографии должна обеспечивать получение фракции с высоким выходом, быть легко воспроизводимой и не требовать много времени.

Наиболее соответствующей предъявляемым требованиям оказалась предварительная обработка сывороток каприловой кислотой. Сывороточные белки, за исключением при добавлении каприловой кислоты агрегируют с образованием нерастворимых комплексов, которые легко отделить от растворимой фракции белков центрифугированием или фильтрацией. При оптимизации этого метода было установлено, что максимальный выход и гомогенность иммуноглобулинов в достигается при концентрации кислоты в интервале 40-60 мг/мл и водородном показателе раствора в интервале рН 6-7.

На рис. 1 представлен профиль разделения иммуноглобулинов в сыворотки овцы анионообменной ВЭЖХ после осаждения балластных белков каприловой кислотой в подобранных условиях. Анализ фракций электрофорезом в 1 % агарозном геле показал, что иммуноглобулины класса в элюировались в первых трех пиках и по данным электрофореза в 1 %-ном агарозном геле принадлежали к гамма-2-глобулинам (первый пик) и к гамма-1-глобулинам (второй и третий пики). Именно к этим группам сывороточных белков относятся подклассы 1^2 и 1 овец. Аналогичные результаты были получены и при анализе сывороток других животных.

0.2 -

3 4 5 6 7

О 10

50 мин

Рис.1. Разделение иммуноглобулинов С? сыворотки овцы анионообменной ВЭЖХ после осаждения остальных белков каприловой кислотой.

А. Профиль хроматографии сывороточных белков: 1-5 — отобранные для электрофореза фракции.

Б. Электрофореграммы: 1— исходная сыворотка; 2- центрифугат после обработки каприловой кислотой; 3-7 - хроматографические фракции 1-5.

2. Исследование состава и свойств иммуноглобулинов класса в в гипериммунных кроличьих сыворотках

С помощью разработанного нами метода был проведен анализ 24 образцов сывороток, полученных от иммунных и неиммунных кроликов в возрасте до 2 лет. Сравнение соответствующих им профилей элюции белков выявило определенную закономерность в составе (рис. 2).

Рис.2. Разделение иммуноглобулинов С сывороток кроликов.

Колонка с сорбентом Полисил СА-500; 3,5x50 мм. Ступенчатый градиент хлорида калия (0; 0,04; 0,08; 0,12; 0,16, 0,24 М) в 0,01 Мфосфате калия рН 6,5. Скорость хроматографии - 2 мл/мин. а-в — неиммунные сыворотки; г-з - иммунные сыворотки.

На хроматограммах всех исследованных образцов сывороток неиммунных кроликов присутствовал один основной 1§0-содержащий пик со временем выхода 5-6 минут (рис. 2а-в). В иммунных сыворотках было обнаружено два дополнительных пика антител со временем выхода в интервале 9-11и13-15 минут (рис. 2г-ж). Они наиболее выражены на хроматограммах образцов сывороток кроликов иммунизированных вируссодержащими го-могенатами органов инфицированных животных. С помощью ВЭЖХ и ИФА была исследована динамика накопления антивирусных антител в сыворотках кроликов в процессе иммунизации неочищенными вирусными антигенами (гомогенатами печени морской свинки, инфицированной вирусом Марбург, и мозга белых мышей, инфицированных вирусом ВсЭЛ) (таблица 1).

Таблица 1. Состав и иммунохимические свойства сывороток кроликов, иммунизированных сложными антигенами

Хроматографические пики, время выхода

5-6 мин 9-11 мин 13-15 мин

Вид Циклы Кол-во Антитела Кол-во Антитела Кол-во Антитела

антигена иммуни- белка, % к вирус- белка, % к вирус- белка, % к вирус-

зации от сум- ным ан- от сум- ным ан- от сум- ным ан-

марного тигенам, марного тигенам, марного тигенам,

количес- титры количес- титры количес- титры

тва ИФА тва ИФА тва ИФА

Гомогенат 0 83,Oi2,5 6,8±1,5 1,2±0,8

печени 1 52,8±1,2 1:40 28,5±5,6 <1:10 9,5±0,6 <1:10

м/свинки 2 43,2±7,7 1:120 38,4±3,3 1:20 10,2±0,7 <1:10

инфиц. 3 32,5±0,8 1:320 42,4±8,2 1:80 15,4±0,6 1:20

вирусом 4 41,5±1,6 1:640 45,6±5,7 1:80 14,6±2,5 1:10

Марбург 5 51,9±2,3 1:1080 36,2±2,3 1:60 12,8±2,2 1:10

Гомогенат 0 79,5±1,9 5,4±1,8

мозга мы- 1 48,6±3,5 1:160 31,4±7,8 1:80 6,8±1,8 <1:10

ши, инфиц. 2 38,6±2,7 1:480 52,4±3,3 1:120 15,3±2,3 1:20

вирусом 3 43,3±3,4 1:640 41,9¿5,6 1:180 12,6±0,9 1:40

ВсЭЛ 4 48,6±6,4 1:1280 39,4±4,7 1:240 13,5±1,1 1:20

Как видно из результатов, приведенных в таблице 1, в этих группах кроликов уже после первого цикла (трехкратное введение антигена в течение месяца с интервалом в одну неделю) происходит резкое увеличение содержания в хроматографических пиках с временами выхода 9-11 минут и 13-15 минут. Однако при иммуноферментном анализе в этих пиках антитела к вирусным антигенам были обнаружены лишь в незначительных количествах.

Для сравнительного изучения фракционного состава был также проведен анализ сывороток трех кроликов, иммунизированных очищенными препаратами вируса Марбург. Основное количество антивирусных антител при хроматографии выходит в первом пике. В этих сыворотках содержание белка в 1§0-содержащих пиках пропорционально количеству выявляемых в них антивирусных антител, что свидетельствует о возрастании удельной активности антител при использовании для иммунизации животных очищенных вирусных антигенов.

3. Подклассы иммуноглобулинов С гипериммунных сывороток коз Целью настоящего раздела работы было изучение подклассов ^О козьих сывороток, полученных при иммунизации животных гомогенатами печени морских свинок, инфицированных вирусом Эбола. С помощью разработанного метода анализа был определен состав сывороток коз до и после нескольких циклов иммунизации. При сравнении профилей элюции гиперииммунных сывороток и сывороток неиммунных животных обнаружен дополнительный пик с временем выхода 35-40 минут (рис. 3). Причем количество белка в нем возрастает по мере увеличения циклов иммунизации.

Рис.3. Разделение иммуноглобулинов С сывороток коз.

Колонка с сорбентом Полисил СА-500; 3,5x50мм. Ступенчатый градиент, хлорида калия (0; 0,04; 0,08; 0,12; 0,16, 0,24 М) в 0,01 Мфосфате калиярН 6,5. Скорость хроматографии - 2 мл!мин. Нанесено 2-3 мг й-содер-жащего центрифугата, полученного после обработки сывороток каприло-вой кислотой.

А. Сыворотка неиммунной козы.

Б. Сыворотка козы после 6 циклов гипериммунизации 10 % гомогенатом -печени морской свинки, инфицированной вирусом Эбола.

10 •: ... V - ■ ■

Белок исследуемого пика был идентифицирован как иммуноглобулин класса в на основании данных электрофореза в ПААГ, в 1 %-ном агарозном геле, и иммунодиффузии. Он имел ту же молекулярную массу, что и ^02, а при восстановлении 2-меркаптоэтанолом все три образца образовывали два полипептида с молекулярными массами 50 ООО и 20 ООО, характерными для легкой и тяжелой цепей (рис. 46). Электрофоретическая подвижность этого белка в агарозе соответствовала гамма-1-глобулину и лишь незначительно отличалась по подвижности от ^01 (рис. 4а). При иммунодиффузии он образовывал четкие полосы преципитации только с антисывороткой к (Н).

Мол. масса

-160 ООО

- 43 ООО

- 38 ООО

- 17 000

Рис.4. Анализ белкового состава ¡^-содержащих фракций, полученных из сыворотки гипериммунной козы.

Электрофорез в 1% агарозном (А) и 7,5 % полиакриламидном (Б) гелях. А: 1 - исходная сыворотка; 2-3 - /^(7- содержащие фракции. Б: 1-3 - фракции с 1% БйБ; 4,5 — маркеры молекулярных весов; 6-8 - фракции ¡¿С с 1 % БИБ и.5% 2-меркаптоэтанолом.

На основании этих данных было предположено, что исследуемый белок является третьим подклассом козы. По номенклатуре, применяемой для обозначения подклассов морской свинки, крысы и мыши, мы назвали его 16, а присутствующий в неиммунных сыворотках подкласс с аналогичным гамма-1-изотипом тяжелых цепей —

Для подтверждения этого предположения было проведено сравнения структуры Рс'-фрагмента обнаруженного нами подкласса ^016 с соответствующими фрагментами других подклассов методом аминокислотного анализа (таблица 2). Установлено, что ^01 а и 1|*01б имеют лишь небольшие отличия по составу аминокислот, но оба они по содержанию глицина, треонина, пролина и лизина отличаются от

12 3 4

1 2 3 4 5 6 7 8

гамма 2 гамма 1 бета 2 бета 1 альфа 2 альфа 1 альбумин

Таблица 2. Аминокислотный состав Fc'-фрагментов IgG коз

Аминокислота Подклассы IgG м/свинки* Подклассы IgG козы

IgG2 IgGl IgG2 IgG la IgG lb

THR 8,0 8,0 7,75 8,25 8,44

SER 13,0 13,0 11,29 11,59 12,97

GLU 9,0 6,0 11,77 11,14 12,49

PRO 9,0 12,0 5,08 8,32 8,37

GLY 4,0 5,0 8,8 10,0 10,76

ALA 6,0 6,0 7,44 7,48 7,14

VAL 10,0 10,0 9,35 9,73 9,66

MET 2,0 2,0 1,88 1,88 1,52

ILE 7,0 7,0 4,93 4,6 3,59

LEU 6,0 7,0 7,75 7,81 6,63

TYR 4,0 4,0 4,29 4,19 »> 3,69

РНЕ 3,0 5,0 3,59 3,46 3,54

HIS 3,0 2,0 2,09 2,39 2,67

TRP 2,0 2,0 1,7 9 1,81 1,83

LYS 10,0 8,0 7,68 6,44 6,59

ASP 14,0 11,0 9,59 9,02 8,92

ARG 3,0 5,0 4,04 4,46 4,21

CYS 2,0 2,0 не опр. не опр. не опр.

* по данным Melamed M.D. ( Immunochemistry. - 1976. - V. 13, N 3. - P. 271-279.)

Дополнительная информация о структуре Рс'-фрагментов подклассов коз была получена при пептидном картировании их триптического гидролгоага, проведенном с помощью обращеннофазовой хроматографии. Как видно из рис. 5, пептидные карты Рс'-фрагмеотов подклассов, несмотря на общий характер, имеют отличия. Так, на хроматограмме гидролизата Рс'-фрагмента ^016 отсутствует пик пептида со временем выхода 13 минут, имеющийся на пептидных картах других, подклассов. Вместо него на пептидной карте присутствует пик со временем выхода 11 минут. На пептидных картах 1 а и 1 б имеется пик со временем выхода 19 минут, отсутствующий у

Специфичность подклассов выделенных из сывороток коз после 6 циклов иммунизации вируссодержащим гомогенатом печени морской свин-

ки, исследовали в реакции нейтрализации in vivo, методами ИФА и имму-ноблотганга. Как следует из полученных результатов, приведенных в таблице 3, при одинаковой концентрации белка препарат, содержащий IgG2, был более активен в нейтрализации вируса Эбола. Антитела, относящиеся к этому подклассу, имели также наибольший титр при взаимодействии с антигенами очищенного вируса в ИФА. Антитела подкласса IgG16 были наиболее активны при связывании с антигенами печени.

Рис. 5. Пептидные карты Рс'-фрагментов иммуноглобулинов С козы с использованием обращеннофазовой ВЭЖХ.

Колонка КР-18; 3,5x120 мм. Градиент ацетонитрила (0-70 %) в 0,1 % трифторуксусной кислоте.

A. ^02. Б. 1ф1а.

B.

Таблица 3. Антивирусные свойства подклассов из гипериммунных сывороток коз против вируса Эбола

Подклассы ^С ИФА, обратные титры Реакция нейтрализации*, индекс нейтрализации

вирус печень

1&02 ,. : 1620±800 750±200 . 3,75±0,75

760±360 2800±1200 1,75±0,5

ДО 16 680±120 8500±2100 1,05±0,25

* работа проведена совместно сКудояровой Н.М.

Дополнительные данные по специфичности подклассов были получены методом иммуноблоттинга (рис. 6). Антитела подкласса 1§02 взаимодействовали в большей степени, чем 1§С1а и 16 с высокомолекулярными белками вируса Эбола, которые по литературным данным являются поверхностным шикопротеином и нуклеокапсидным белком (молекулярная масса 125 ООО и 104 ООО, соответственно).

Мол. масса

116 000

92 ООО

68 ООО

43 ООО 38 ООО 30 000 24 000

17 000

1 2

1 2 3 4 5

»л —

£ * , ! ;

л ! ' щ и > \

* } ; , *

1 1 й • ? к Г V, г к * 1„ 1, 1

Рис. 6.Иммуноблоттинг сыворопюк коз, гипериммунизированиых 10 %

гомогенатом печени морской свинки, инфицированной вирусом Эбола.

А. Электрофореграммы: 1 — белки очищенного вируса Эбола; 2 - маркеры . молекулярных весов.

Б. Нитроцеллюлозные мембраны, содержащие белки вируса Эбола, после инкубации с неиммунной козьей сывороткой (1), сывороткой гипериммунных коз после 6 циклов введения антигена (2) и очищенными из нее препаратами (3-5).

Поскольку до настоящего времени наиболее распространенным способом препаративного получения иммуноглобулинов является спиртовое фракционирование сывороток, мы провели изучение состава подклассов козы в препаратах антител, полученных из гипериммунных сывороток коз против вирусов Эбола, Марбург и Мачупо этим методом. Установлено, что состав подклассов 1§0 в них существенно отличается от исходных сывороток, и.наиболылий выход (свыше 80 %) при фракционировании сывороток этанолом имеет 1§С2, а наименьший (около 30 %) — ^01 б. .1

4. Подклассы гипериммунных сывороток лошадей Известно, что гамма-глобулины, полученные из гипериммунных лошадиных сывороток, часто вызывают у людей анафилактические реакции, поэтому их ограниченно используют в медицинской практике, лишь в случаях, когда недоступны аналогичные препараты из плазмы крови человека. Изучение состава и свойств подклассов гипериммунных сывороток лошадей может дать перспективные подходы к их совершенствованию.

В настоящем разделе работы был изучен состав и свойства подклассов гипериммунной лошадиной сыворотки против ВКЭ. Препараты антител были получены с помощью препаративной анионообменной хроматографии на Полисиле СА.

3 4

Мол. масса

- 116 000

- 92 000 68 000

43 000 38 000 Ь 24 000

Рис. 7. Анализ препаратов подклассов /§С, выделенных из гипериммунной

лошадиной сыворотки против ВКЭ, электрофорезом в 7,5 % полиакрил амидном геле.

1-3 - препараты /£(7 с 1 % 5"£>>?; 4,5 - маркеры молекулярных весов;1 6-8 - препараты с 1 % 505 и 5% 2-меркаптоэтанолом.

Их чистота, определенная с помощью ВЭЖХ и электрофореза в ПААГ, составила более 98 % для фракции ^ва + ^СЬ, 90 % — для ^вс и 80 % — для (Т). Как видно из рис. 7, иммуноглобулины подкласса (Т) имеют большую массу тяжелых цепей, чем остальные подклассы, что определяет и большую массу молекулы (Т) в целом.

Антивирусная активность подклассов иммуноглобулинов в лошади, была изучена методами ИФА и РТГА (таблица 4).

Таблица 4. Специфичность подклассов IgG гипериммунной лошадиной сыворотки против ВКЭ

Исследуемые препараты Концентрация белка, мг/мл Антитела к антигенам ВКЭ, обратные титры Антитела к антигенам мозга мыши, обратные титры ИФА

ИФА РТГА суммарные миелин

Сыворотка 78,0±2,5 44000±2500 2560±1280 27000±6200 24000±8500

IgGa + IgGb 19,6±3,1 80000±4200 1280±640 4600±480 400±120

IgGc 18,0±1,5 27000±1200 320±80 840±180 2000*1500

IgG(T) 15,0±0,2 9200±320 80±20 24000*8400 21000±6000

Основное количество антител, способных подавлять гемаггаютини-рующую активность вируса клещевош энцефалита, находится во фракции IgGa + IgGb. При одинаковой концентрации белка активность IgGc и IgG (Т) была ниже в 4 и 16 раз, соответственно. Наибольший титр антител к вирусным антигенам в ИФА также был обнаружен во фракции, содержащей IgGa и IgGb. Подклассы IgG были также проанализированы методом ИФА на содержание антител к миелину и суммарным растворимым белкам мозга мыши, которые входят в состав препарата, используемого для иммунизации лошадей. Наибольший титр антител как к суммарным антигенам мозга мыши, так и к миелину наблюдался во фракции IgG (Т).

Реактогенность подклассов IgG лошади была изучена в экспериментах ш vivo на морских свинках после сенсибилизации животных суммарными белками лошадиной сыворотки (таблица 5). При одних и тех же разрешающих дозах подкласс IgG (Т) вызывал наибольшее количество случаев тяжелой анафилаксии у морских свинок, приводивших к гибели животных. Следовательно, реактогенность гамма-глобулина против ВКЭ связана не только с тем, что он представляет собой смесь чужеродных для человека антигенов, но также обусловлена присутствием в нем иммуноглобулинов подкласса IgG (Т), обладающих повышенной сенсибилизирующей активностью.

Таблица 5. Сравнение сенсибилизирующей активности подклассов лошади* (в числителе — количество погибших животных, в знаменателе — взятых в опыт)

Препарат Разрешающие дозы препарата, мг

50 25 12 6 3 1,5

Сыворотка 4/4 4/4 2/4 3/4 2/4 0/4

ДОа + ДОЬ 2/4 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4

ДОС 3/4 2/4 1/4 1/4 ' 1/4 0/4

ДО(Т) 4/4 4/4 4/4 2/4 3/4 1/4

*работа выполнена совместно с Михайловой Т.В.

Явление анафилаксии у людей после введения гетерологичных иммуноглобулинов связано с гиперчувствительностью немедленного типа, первой стадией которой является сенсибилизация лимфоцитов. Известно, что иммуноглобулины, не проявляющие заметной сенсибилизирующей активности, при агрегации начинают активировать лимфоциты. Даже гомологичные для человека иммуноглобулины, полученные из донорской плазмы спиртовым методом, при внутривенном введении вызывают иногда серьезные анафилактические реакции, обусловленные содержащимися в них агрегатами причем способность подклассов человека к агрегации различается. Мы исследовали способность к агрегации подклассов лошади при различных температурных режимах. Найдено, что наибольшее количество агрегатов при одинаковых условиях образуется в препарате (Т).

На основании изложенных выше данных о свойствах подкласса (Т) было предположено, что его удаление может существенно снизить реакго-генные свойства препарата гамма-глобулина против ВКЭ. С этой целью была использована хроматография на анионообменном сорбенте Полисил СА. Было изучено три варианта применения хроматографии. В первых двух она использовалась для замены одной из стадий фракционирования сыворотки этиловым спиртом, в третьем — на сорбенте Полисил СА была проведена хроматография исходной сыворотки, предварительно разбавленной в 10 раз стартовым элюенгом. Антитела с максимальной удельной активностью были получены при третьем варианте. Фракционирование сыворотки этанолом перед хроматографией приводило к существенному снижению удельной активности выделенных иммуноглобулинов (на 23 % и 45 % в зависимости от кратности осаждения белков).

выводы

1. Разработан эффективный метод анализа состава иммуноглобулинов в гипериммунных сывороток животных, основанный на ВЭЖХ.

2. Изучена динамика изменения состава подклассов в сыворотках кроликов, коз и лошадей в процессе иммунизации различными вирусными антигенами. Выявлена общая тенденция к увеличению количества подклассов с большим отрицательным зарядом.

3. При изучении сОстаииммуноглобулинов й гипериммунных козьих сывороток против вируса Эбола выявлен третий подкласс отличающийся от^в1 и строением С-концевого Бс'-фрагмента, и изучены его физико-химические и иммунохимические свойства.

4. Изучена специфичность подклассов в сыворотках крови животных, для иммунизации которых применяли неочищенные вирусные препараты. Установлено, что антитела к вирусным антигенам принадлежат преимущественно к подклассам с гамма-2 изотипом тяжелых цепей.

5. Определен выход каждого из подклассов при спиртовом фракционировании козьих сывороток. Он максимален для 1§в2 — 80 % и составляет менее 30 % для 1§С1Ь.

6. Исследованы свойства подклассов в гипериммунной лошадиной сыворотке против вируса клещевого энцефалита. Установлено, что

(Т), обладая пониженной по сравнению с другими подклассами антивирусной активностью, имеет максимальный титр к антигенам мозга мышей, повышенную сенсибилизирующую активность и коррелирующую с ней способность к тепловой агрегации.

7. Разработан подход к препаративному получению высокоактивных иммуноглобулинов в против вируса клещевого энцефалита, не содержащих реактогенного (Т) и других белковых примесей, основанный на использовании анионообменной хроматографии на сорбенте Полисил СА.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ястребов С.И., Дедкова Л.М., Офицеров В.И. Хроматография белков и фрагментов ДНК на ионообменных сорбентах из модифицированных кремнеземов и целлюлозы. / Тез. докл. всесоюзной конф. «Проблемы использования целлюлозы и ее производных в медицине и микробиол. промышленности». -Ташкент, 1989. - С. 31-32.

2. Дедкова Л.М., Ястребов С.И., Юркина ЭЛ., Фролова СБ., Офицеров В.И. Лошадиный гамма-глобулин против вируса клещевого энцефалита высокой удельной активности. / Деп. в ВИНИТИ № 5060-В 14.09.90.

3. Дедкова Л.М., Ястребов С.И., Фролова С.Б., Офицеров С.И. Способ получения иммуноглобулина G. / A.C. СССР№ 15161685, заявл. 30.06.88, опубл. 3.01.90.

4. Дедкова Л.М., Ястребов С.И., Кизимов Н.В., Кудоярова Н.М. Хроматография гипериммунных сывороток коз. Антитела к вирусам Марбург и Эбола. / Тез. докл. второй отраслевой конференции «Актуальные проблемы биотехнологии». -Кольцово, 1990. -С. 42-43.

5. Дедкова Л.М., Фролова С.Б. Анионообменная хроматография белков сывороток животных на Полисил CA. / Тез. Докл. Конференции «Молекулярная сорбция биологически активных веществ». - Пенза, 1990. -С. 10-11.

6. Ястребов С.И., Дедкова Л.М., Фролова С.Б., Офицеров В.И. Анионообменная хроматография белков на модифицированных полиэтиленими-ном кремнеземных сорбентах. / Биотехнология. -1991. - № 3. - С. 43-46.

7. Дедкова Л.М., Ястребов С.И., Офицеров В.И. Антитела гипериммунных сывороток животных. 1. Активность подклассов IgG, выделенных из лошадиной сыворотки против вируса клещевого энцефалита. / Известия СО РАН. - 1992. - № 3. - С. 21-24.

8. Дедкова Л.М., Кудоярова Н.М., Шапров В.В., Сабиров А.Н., Офицеров В.И. Антитела гипериммунных сывороток животных. 2. Подклассы иммуноглобулинов G в нормальных и гипериммунных сыворотках коз. / Известия СО РАН. -1993. - Jfe 6. - С. 8-13.

9. Дедкова Л.М., Кудоярова Н.М., Чепурнов A.A., Офицеров В.И. Состав и иммунохимические свойства козьих иммуноглобулинов против вируса Эбола. / Вопросы вирусологии. - 1994. - Т. 39, № 5. - С. 229-232.

'¿Ш